JPH06502993A - 人工遺伝子からの構造タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 人工遺伝子からの構造タンパク質 発明の背景 本発明の分野 本発明は、バクテリア中に人工遺伝子をクローニングしそしてバクテリア中で発 現させることによる構造タンパク質の製造に関する。本発明により製造されたタ ンパク質は、紡糸可能繊維として有用である。

技術文献 バクテリア中に特定のＤＮＡ配列をクローニングすることができることは、バク テリアによる新規なタンパク質の生産の可能性を開いた。生産することができる 種々のタンパク質は、科学者の想像及び生産性バクテリアのまだ理解されていな い限界によってのみ限定される。

バクテリア中に合成りＮＡをクローニングすることによりいくつかの新規なタン パク質が生産された。これらの最初の試みは、天然に存在するタンパク質の所望 の特性によく似たタンパク質を生産することであった。これは、多数のタンパク 質及び遺伝子の配列情報が広く入手可能になったことにより可能となった。

ＷＯ３８１０３５３３は、合成遺伝子をクローニングすることの背景を極めて包 括的に検討しておりそして反復オリゴマーＤＮＡ配列（ｇａｇａｓ）の合成遺伝 子中への組込み、バクテリア中への遺伝子のクローニング及びいくつかの絹状の タンパク質、エラストマー状タンパク質及びこれら２つの混合物の製造を開示し ている。この文献はここに川魚することにより本明細書に加入する。

ヨーロッパ特許出願０２９４９７９は、反復ＧＡＧＡＧＳ単位をエンコードして いるＤＮＡ配列を含んで成る人工遺伝子をクローニングして絹繊維のタンパク質 フィブロインをベースとする絹状構造タンパク質を製造することを開示している 。

Ｄｏｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、８ 　（２０）：４５７５−４５９２　（１９８０）は、ジペプチド、アスパルチル −フェニルアラニンをエンコードしている反復ＤＮＡ配列を有する２つの合成ド デカヌクレオチドの大腸菌中でのクローニング及びその後の発現を開示している 。約９００塩基対のクローニングされたＤＮＡ配列に対する見かけのサイズ限界 がある。

Ｇｕｐｔａ　ｅｔ　ａｌ、、ＢｉｏｔｅｃｈｎｏＪｏｇｙ　Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ 　１９８３：６０２−６０９は、ドデカヌクレオチドの反復から成るＤＮＡ配列 のクローニングを開示している。彼らは、挿入配列（ｉｎｓｅｒｔ）が１２０塩 基対を越えたとき生成物を得るのに成功しなかった。彼らは、大腸菌において１ ２０塩基対より大きい挿入配列に対する選択があったか又はクローニングされた 合成りＮＡの一部を欠失させる切り出し事象があることを述べている。

Ｋｅｍｐ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ　３９：２３９−２４５（１９８５）は、合 成遺伝子の多重コピー（ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｏｐｉｅｓ）の高い収率を得るた めのベクター系を開示している。著者は、１ａｃＺ遺伝子に融合した５コピーの 合成ＳＰ遺伝子を利用している。各コピーは、Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ −Ｇｉｎ−Ｇｉｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ２の製造を コード化している。

Ｇｏｌｄｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｉ、、Ｇｅｎｅ、８０　：　３０５−３１４（１９ ８９）は、コラーゲン類似体；ポリ（Ｇ　１　ｙ−Ｐ　ｒ　ｏ−Ｐ　ｒ　ｏ）の ための合成遺伝子の大腸菌中のクローニング及び大腸菌中でのその後の発現を開 示している。著者は、それらの最大ＤＮＡ挿入配列のサイズが約４５０塩基対で あることを指摘している。著者は、更に、高度に反復したＤＮＡの大きいセグメ ントは、ｒｅｃＡ突然変異の存在においてすら大腸菌中では不安定でありうるこ とを指摘している。彼らは、４１℃におけるコラーゲン状ペプチドの８０％が約 ４０分で劣化したことも見いだした。

Ｃｈａｔｅｌｌａｒｄ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ、８１：２６７−２７４　（１ ９８９）は、２型ヒト・アデノウィルスのトリマー繊維タンパク質をエンコード している遺伝子の大腸菌中でのクローニング及び発現を開示している。彼らは、 バクテリオファージＴ７　ＲＮＡポリメラーゼに基づく遺伝子発現系を使用した 。繊維タンパク質は、全宿主タンパク質の約１％の程度製造されたが、バクテリ アの増殖に対する繊維タンパク質の毒性効果があり、これは、培地へのグルコー スの添加及び７以上ｐＨを維持することにより減少した。生成物は、洗剤又は尿 素の不存在下では水性塩溶液及び緩衝液に不溶性であった。著者は、タンパク質 繊維生成物が正しく折りたたまれていなかったと考えるべき理由を指摘している 。

２型アデノウイルス繊維遺伝子は、Ｈｅｒｉｓｓｅ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、９：１２２９−１２４０＆４ ０２３−４０４２　（１９８１）により配列決定された。

Ｇｒｅｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　２（８）：１３ ５７−１３６５　（１９８３）は、２型アデノウイルス繊維タンパク質の配列を 分析することにより、１５−残基セグメントが約３００残基より多くにわたり反 復することを報告した。彼らは、各１５残基セグメントが２つの短いβ−ストラ ンド（β−５ｔｒａｎｄｓ）及び２つのβ−ベンド（β−ｂｅｎｄｓ）を含有す ることを示す。

ＭｃＧｒａｔｈ　ｅｔ　ａｌ、、Ａ　ＣＵＭＩＲＰ　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　Ｒｅｐ ｏｒｔ、Ｊｕｌｙ１５．１９８９．ＧｅｎｅｔｉｃａｌｌｙＣｏｎｔｒｏｌｌｅ ｄ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｎｏｖｅｌ　Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ　Ｍａｔｅｒ ｉａｌｓ、は、遺伝子のクローニング及び発現によりアミノ酸配列を生成する。

Ｋｌｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｌａｓｍｉｄ３．８８−９１　（１９８０）は、 制限酵素分析に好適な組換えプラスミドＤＢＡの単離のための迅速で微小スケー ルな技術を述べている。

Ｓ、Ｃ，５ｔｉｎｓｏｎ、Ｃ＆ＥＮ、ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＰｒｏｖｉｄ ｉｎｇ　Ｓｐｒｉｎｇｂｏａｒｄ　ｔｏ　Ｎｅｗ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｍａ ｔｅｒｉａｌｓ、Ｊｕｌｙ１６，１９９０．ｐｐ。

２６−３２は、細胞増殖研究及び医学及び歯科医術の要求に有用なポリマーを製 造するのに反復アミノ酸配列の使用を記載している。

Ｈｕａｎｇ、Ｆｒａｎｋ　Ｆ、、ａｎｄ　Ｃｈｏｋｙｕｎ　Ｒｈａ。

Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｆｉｂｅｒ ｓ−Ａ　Ｒｅｖｉｅｗ、Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ａｎｄ　５ ｃｉｅｎｃｅ、Ｆｅｂｒｕａｒｙ、１９７４．Ｖｏｌ。

Ｎｏ、２．は、繊維形成に関係したタンパク質の生化学及び立体化学を述べてい る。

本発明の要約 本発明は、ＤＮＡ配列、及び、ベクター中に作用的に連結されそして形質転換さ れたバクテリア中で発現される、５ＫＬＳ　ＬＦｌｆｌＧＰ　ＸＴＶＳＤ　。

ＧＡＩＴ工ＧＮ’ＫＮＤＤＫＬτＬ亡Ｐ。

から選ばれたペプチド又はペプチドの組み合わせの１４乃至５２配列マルチプル （配列多重体）（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ　ｍｕｌｔｉｐｌｅｓ）から成る前記Ｄ ＮＡ配列によりコードされたタンパク質に関する。

本発明は、 第１アミノ酸がＧ、　Ｓ又はＤであり、第２アミノ酸かに、　Ａ、　Ｔ、又はＮ であり、第３アミノ酸が１又はしてあり、 第４アミノ酸がＳ、　Ｔ又はＧであり、第５アミノ酸がＶ、Ｉ、又はＬであり、 第６アミノ酸がＱ、　Ｔ、　Ｎ、　Ｈ又はＡであり、第７アミノ酸がＴ又はＶで あり、 第８アミノ酸がＳ又はＴであり、 第９アミノ酸がＡ、Ｐ又はＧであり、 第１０アミノ酸がＰ又はＧであり、 第１１アミノ酸がＬ又はＩであり、 第１２アミノ酸がＴ、　Ｙ又はＨであり、第１３アミノ酸がＶ又はＴであり、 第１４アミノ酸がＳ、　Ｔ又はＡであり、第１５アミノ酸がり、　Ｑ、　Ｎ又は Ｓである、１５のアミノ酸残基から成る群より選ばれたペプチド又はペプチドの 組み合わせの１４乃至５２配列マルチプルから成り、ベクター中に作用的に連結 されそして形質転換されたバクテリア中で発現されるＤＮＡ配列にも関する。

本発明は、更に、 第１アミノ酸がＮ、　Ｔ又はＧであり、第２アミノ酸がＡ又はＳであり、 第３アミノ酸がり、Ｉ又はＭであり、 第４アミノ酸がＲ又はＩであり、 第５アミノ酸がＩ、Ｌ又はＴであり、 第６アミノ酸がＫ又はＤであり、 第７アミノ酸がり、　Ｖ、　Ｈ，Ｅ、　Ｄ、Ｃ又１１Ｙテア’）、第８アミノ酸 がＧ又はＤであり、 第９アミノ酸がＳ又はＧであり、 第１０アミノ酸がＧ、　Ａ又はＰであり、第１１アミノ酸がＬ又はＩであり、 第１２アミノ酸がり、　Ｒ又はＮであり、第１３アミノ酸がり、　Ｆ又はＹであ り、第１４アミノ酸がＱ、　Ｄ又はＮであり、第１５アミノ酸がＫ又はＮである 、 １５のアミノ酸残基から成る群より選ばれたペプチド又ｉｔペプチドの組み合わ せの１４乃至５２配列マルチプルから成るＤＮＡ配、’ｆｉｌｌこ関する。

上記配列において、下記の文字は、下記のアミノ酸を表す：Ａ＝アラニン、Ｃ＝ システィン、Ｄ＝アスノぐラギン酸、Ｅ＝グルタミン酸、Ｆ＝フェニルアラニン 、Ｇ＝ニブリシンＨ＝ヒスチジン、Ｉ＝イソロイシン、Ｋ＝リジン、Ｌ＝ロイシ ン、Ｍ＝メチオニン、Ｎ＝アス／くラギン、Ｐ＝ニブロリンＱ；グルタミン、Ｒ ＝アルギニン、Ｓ＝セＩＪン、Ｔ＝）レオニン、■＝バリン、Ｗ＝）リブトファ ン、Ｘ＝０ずれ力Ａ即ち未知、Ｙ＝チロシン。

本発明で使用される好ましいポリペプチド配列は、５ＧＬＤＦ’ＤＮＮＡＬＲＩ ＫＬＧ、及びＬＳＶＱＴＳＡＰＬＴＶＳＤＧＫ。

である。

本発明の第１の目的は、自発的にフィブリル構造に組織化する（ｏｒｇａｎｉｚ ｅ）定められた配列のポリペプチドを製造することである。

本発明の他の目的は、合成遺伝子を製造すること及び遺伝子工学的手段により、 それらを使用してクロス−βシート（ｃｒｏｓｓ−β−５ｈｅｅｔｓ）を形成す るタンパク質を製造することである。

更なる目的は、該タンパク質を液晶として使用しそして独特の繊維を製造するこ とである。

本発明の詳細な説明 本発明のＤＮＡ配列もタンパク質も天然には存在しない。“ポリペプチド”及び “タンパク質”という用語は、本明細書では相互に交換可能に使用される。タン パク質は、１）リーダー配列、２）１４乃至７５反復の合成オリゴヌクレオチド 及び３）ターミネータ−配列を含んで成る合成オリゴヌクレオチド構築物により エンコードされた生成物であり、該構築物は、プロモーターに作用的に連結され ておりそしてバクテリアにおいて発現される。上記のように、本発明の第１の目 的は、自発的にフィブリル構造に組織化する定められた配列のポリペプチドを製 造することである。合成されたままのポリペプチド鎖は、最初一時的に柔軟性ポ リマーとして存在するが、そのアミノ酸配列の特殊な特徴の結果として、各ポリ マーは、ポリペプチド主鎖のアミド基間に形成された水素結合により安定化され た、正常な、鎖が折りたたまれた（ｃｈａｉｎ−ｆｏｌｄｅｄ）クロスβシート に自発的に折りたたまれると考えられる。

この中間体シートは、次いで結合して（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）クロスβシートの 多重の整列したコピー（ｍｕｌｔｉｐｌｅ、ａｌｉｇｎｅｄｃｏｐｉｅｓ）から 構成される集合体（ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）になり、剛性のミクロフィブリルを 形成する。これらの剛性分子の溶液が濃縮されると、それらは、リオトロピック 液晶相を形成する（非等方性を示すこのような特徴の周知された特性）。リオト ロピック液晶はミクロフィブリルの比較的大きな整列した集合体を含有するので 、このような溶液は、紡糸されて高度の分子配向により特徴付けられた繊維を生 成することができる。このような物質は、高度の分子組織化を導入して有用な物 理的特性を付与する（例えば非線形光学的特性）ことから利益が得られる用途に おいて繊維又は他の材料としての有用性が見いだされる。本発明の合成配列によ りエンコードされたポリペプチドはこのような構造を形成する。これらのタンパ ク質の可能性のある用途には、生物適合性医用移植片のための剛性高モジユラス 繊維補強材としての使用、及び、それらは中心に対して非対称性（ｎｏｎ−ｃｅ ｎｔｒｏｓｙｍｍｅｔｒｉＣ）材料であるので、光学的、電気的又は磁気的信号 伝達及び処理装置のための構成部品としての使用が含まれる。

本発明を実施する有効な方法を、以下に説明する。所望の合成タンパク質のアミ ノ酸配列を、最初に決定する。次いで、これらのアミノ酸をエンコードしている オリゴヌクレオチドを合成する。オリゴヌクレオチドを合成する方法は、当業者 には周知されている。アミノ酸のためのＤＮＡコードは縮重性（ｄｅｇｅｎｅｒ ａｔｅ）であるので、オリゴヌクレオチドを構成するように選ばれたコドンは、 大腸菌の高度に発現されたタンパク質において現れるコドンである。オリゴヌク レオチドはまた、オリゴヌクレオチドが相補性オリゴヌクレオチドにハイブリダ イゼーションされるとき、得られる二本鎖分子の末端が一本鎖であり且つ非パリ ンドローム性であるようにされる。次いで、所望の配列のオリゴヌクレオチド及 びその相補体（ｃｏｍｐ　］　ｅｍｅｎｔ）を合成し、精製しそして慣用の方法 を用いてハイブリダイゼーションさせる。該オリゴヌクレオチドを、次いで、ポ リヌクレオチドキナーゼを使用する適当な反応によってそれらの５′末端でホス ホリル化する（マニアチス等、モレキュラー・クローニング、実験室マニュアル 、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、ニューヨーク、コールドス プリングハーバ−、ボックス１００）。得られるホスホリル化され、ハイブリダ イゼーションされたＤＮＡオリゴヌクレオチドを、次いでＴ４リガーゼと共にイ ンキュベーションし、それにより相互に連結させて種々の長さのコンカテマーを 形成する。オリゴヌクレオチドの末端は非パリンドローム性であるので、オリゴ ヌクレオチドは、お互いに関して頭−尽力式で結合される。種々の長さの得られ るコンカテマーは、Ｕ接りローニングすることができるか、又はそれらは、最初 にクローニングされる前に異なる長さのコンカテマーに分離させることができる 。

精製されたコンカテマーオリゴヌクレオチドは、次いで、ｐＲＨＦ−１及びｐＲ ＨＦ−４のような、アンピシリンの如き選択性物質に対する耐性をコードしてい る遺伝子を含有する適当な発現ベクターに連結される。ベクターは、（１）バク テリオファージλＰＬプロモーター又はバクテリオファージエフ遺伝子１０プロ モーターのような、制御された条件下に高いレベルの発現を指向するための合成 遺伝子の上流の強い条件付きプロモーター（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ　ｐｒｏｍ ｏｔｅｒ）、（２）合成遺伝子の翻訳開始のために必要なシグナルを含有するで あろう前記プロモーターの下流の配列、（３）翻訳が所望のアミノ酸配列を有す るタンパク質を生じるような正しい方向と正しい読み枠においてコンカテマーオ リゴヌクレオチドの挿入を可能とする翻訳開始点の下流のユニーク制限部位を含 んで成る。

適当なベクターへのオリゴヌクレオチドの連結に続いて、得られる構築物を、適 当なＣａＣ１，処理したバクテリア宿主菌株中に形質転換させる（マニアチス等 、モレキュラー・クローニング、実験室マニュアル、コールド・スプリング・ハ ーバ−・ララボラトリー、ニュウヨーク、コールドスプリングハーバ−、ボック ス１００）。Ｔ７プロモーターからの発現が望まれないならば、宿主は、ｒｅｃ Ａ遺伝子に欠陥のある（ｒｅｃＡ−″）大腸菌株であることができる。ｒｅｃＡ ″″欠陥は、宿主の相同性組換え系を不活性化し、かくして組換えによるオリゴ ヌクレオチドの縦列反復コピーの損失に対して保証する。ＤＨ５Δｌａｃ及びＪ ＭＩ０９のような大腸菌株が適当であろう。Ｔ７プロモーターからの条件付き発 現のために、ベクターは、Ｉａｃプロモーターの制御下にＴ７ＲＮＡポリメラー ゼ遺伝子の染色体コピーを含有する大腸菌株ＢＬ２１又はその誘導体中に形質転 換されなければならない（Ｓｔｕｄｉｅｒ　ｅｔａｌ、、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ 、１８９：１１３−１３０（１９８６））。

バクテリオファージλＰＬプロモーターが使用されているベクターについては、 ベクターは、λ　ｃ　Ｉ　８５７リブレレツサー遺伝子を有するノくクチリア菌 株中に常に形質転換されなければならない。このような菌株の例は、０Ｒ１２６ ５である。プロモーターはリプレッサーを不活性化させる４２℃に細胞の温度を 上昇させることにより活性化される。

それらの形質転換に続いて、バクテリアは、１５０μｇ／ｍ！アンピシリンを含 む培地で平板培養される。上記ベクターのすべては、β−ラクタマーゼを発現す る遺伝子を含むので、プラスミドを受け入れるこれらの細胞のみがアンピシリン 耐性でありそしてアンピシリンの存在下に増殖する。オリゴヌクレオチドを挿入 されたベクターに富ませるために、ベクターは、連結の前に仔つシ腸ホスファタ ーゼにより処理される（マニアチス等、前記文献）。アルカリホスファターゼに よる処理は、ベクターの５′末端からＰＯ４を除去し、かくして、オリゴヌクレ オチド挿入配列（ｉｎｓｅｒｔ）なしのベクターのりクロージヤー（ｒｅｃｌ。

５ｕｒｅ）を排除する。何故ならばＰＯＪなしの５′末端はＴ４　ＤＮＡリガー ゼのための基質ではないからである。

どの形質転換体がオリゴヌクレオチド挿入配列を有するかを見いだすために、多 数の異なる形質転換されたコロニーを、培養物が増殖の定常期に達するまで、１ １００ｕ／ｍｌアンピシリンを含むルリアブロス（Ｌｕｒｉａ　Ｂｒｏｔｈ）（ ＬＢ）中で増殖させる。次いで、各培養からのプラスミドＤＮＡをＨｏ１ｍ５　 ｅｔ　ａｌ、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１１４　：１９３　（１９８１）の方 法により回収された細胞から抽出する。プラスミドＤＮＡは、１％アガロースゲ ルでの電気泳動によりサイズに従って分離される（マニアチス、前記文献）。よ り大きいプラスミド（即ち、大きい挿入配列を有するこれらのプラスミド）が選 ばれる。各プラスミドにおけるＤＮＡ挿入配列のサイズは、挿入配列内ではなく て挿入配列の境界近くで開裂する制限酵素によりＤＮＡを開裂する（供給者の教 示に従って）ことにより評価される。このＤＮＡを、次いで、適当な分子量標準 を有するポリアクリルアミドゲル（即ち、５％）上で電気泳動させて、挿入配列 のサイズを決定することができる。

より大きい挿入配列サイズ（元のオリゴヌクレオチドの約１４乃至２６反復単位 を有すると計算される）を有するこれらのプラスミドが選ばれる。

より大きい挿入配列を有するものとして同定されるプラスミドは、ＣａＣ１２処 理した大腸菌株ＢＬ２１又はＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有する大腸菌株 中に形質転換される。形質転換体は、１５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ Ｂ寒天プレート上で細胞を平板培養することにより選択される。単一のコロニー を選択し、そして培養物が０．５の光学密度（ＯＤ６゜。）に達するまで１００ μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢジブロス中増殖させる。イソプロピルチオ− β−ガラクトシド（ＬＰＴＧ）を加えて０．５ｍＭの最終濃度として、Ｔ７ＲＮ Ａポリメラーゼ遺伝子を誘発させる。これは、合成遺伝子のプロモーターがＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによってのみ認識されるので合成遺伝子の発現に導く。合成 遺伝子の条件付き発現は、遺伝子生成物がそれらを生産する大腸菌に対して毒性 であると思われるので、必要である。細胞を、ＩＰＴＧの存在下に３７℃で２− ４時間増殖させる。この誘導期間に続いて、細胞を遠心分離により集める。合成 遺伝子生成物の生産は、誘導されたバクテリアの試料からのタンパク質を１２． ５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分析しくＬａｅｍｍｌ　ｉ、Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、１１４　：１９３　（１９８１）　）そしてそれらをクーマシ ー・ブルー染料で染色することにより監視される。合成タンパク質は、遺伝子を 含んで成るオリゴヌクレオチド挿入配列の数を計算することから予想されるサイ ズに対応して移動する。本発明のクローニングされた合成遺伝子によりエンコー ドされた得られるタンパク質は、慣用の手段、好ましくは遠心分離及びセファロ ースゲルでのクロマトグラフィーにより回収及び精製することができる。得られ るタンパク質は、当業者には知られている慣用の紡糸方法により繊維とすること ができる。一般に、ポリペプチドは、限られた数の溶媒に可溶性であり、そして 典型的には酸の溶液から紡糸される。加熱は、成る種の溶媒にポリペプチドを溶 解させるのに必要なことがある。しかしながら、長い側鎖を有するポリペプチド は、しばしば有機溶液から紡糸される。合成ポリアミド及びポリペプチドの精製 用の溶媒としてのへキサフルオロイソプロパツール（ＨＦ　Ｉ　Ｐ）の使用は、 Ｔｅ　ｔ　ｔ、米国特許第３，６９６，０５８号及びハヤシ、米国特許第４゜５ ９４．４０９号に開示されているが、ＨＦＩＰはポリペプチドのための紡糸溶媒 として有用であることが今回見いだされた。紡糸するための溶媒として、ＨＦＩ Ｐは、ポリペプチドが測定可能な劣化を受けないようなポリペプチドの安定な溶 液を形成させるという利点を有する。

溶媒へキサフルオロイソプロパツール中の繊維形成性ポリペプチドの溶液は、湿 式紡糸、エアギャップ紡糸及び乾式紡糸方法により紡糸して繊維とすることがで きる。２０，０００より大きい分子量を有するポリペプチドは、本発明において 有用である。

湿式紡糸、エアギャップ紡糸及び乾式紡糸方法は当業界では知られている。湿式 紡糸及び乾式紡糸の説明は、Ｂｉ　Ｉ　Ｉｍｅｙｅｒ、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ 　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９５７．３８８−３９５頁に示され ている。エアギャップ紡糸方法の例は、ＤｅＬｕｃｃａ、ｅｔ　ａｌ、、米国特 許第４，８５７．４０３号に開示されている。エアギャップ紡糸は、典型的には 、物理的特性の改良が達成される場合に湿式紡糸に代わって使用される。これは 、典型的には、紡糸溶液が、結晶性ドメインの整列がエアギャップにおける溶液 の細化（ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）中に起こるような液晶溶液を含んで成るよう な場合である。

本発明に従えば、紡糸溶液は、溶媒へキサフルオロイソプロパツール（ＨＦ　Ｉ 　Ｐ）中に約５−３０重量％のポリペプチドを溶解させることにより調製される 。尿素（０，５−２５％）を加えて、ＨＦＩＰ中のポリペプチドの紡糸特性を高 めることができる。紡糸溶液は、典型的には、室温で調製される。しかしながら 、ＨＦＩＰ中へのポリペプチドの溶解は、溶液が僅かに加熱されている場合には より早い。

湿式紡糸方法では、紡糸溶液は凝固浴に直接押し出される。使用した凝固剤は、 ＨＦＩＰ溶媒が可溶性であるが、ポリペプチドは不溶性であるいかなる溶媒であ ってもよい。有用な凝固剤の例には、水、メタノール、エタノール、イソプロピ ルアルコール及びアセトンが含まれる。一般に、メタノールは、成る種のポリペ プチド紡糸溶液の好ましい凝固剤であることが見いだされた。しかしながら、ア セトンは、本発明のポリペプチドのいくらかのための好ましい凝固剤であること が見いだされた。

成る場合には、得られる繊維を乾燥させ、次いで熱延伸して物理的特性の改良を 達成することができる。ポリペプチドが熱延伸を受けにくい場合には、凝固剤で まだ湿っている間に繊維を冷延伸することが好ましいことが見いだされた。繊維 を冷延伸の前に乾燥させると、限定された延伸が起こりそして繊維は破断する傾 向を有する。

エアギャップ紡糸方法では、紡糸溶液凝固浴に入る前にエアギャップにおいて細 くされる。リオトロピック紡糸溶液については、エアギャップで起こる延伸は、 凝固浴で配向した配列で凍結される結晶ドメインの整列を生じることがあり、こ れは、しばしば湿式紡糸された繊維にまさる改良された引張特性をもたらす。エ アギャップ紡糸方法で有用な凝固剤は、湿式紡糸で有用な凝固剤と同じである。

乾式紡糸方法では、凝固浴中への紡糸の代わりに、例えば熱風中に紡糸すること により溶媒を蒸発させる。

５ＧＬＤＦＤＮＮＡＬＲＩＫＬＧのマルチマーを含んで成るタンパクだ。それら は、 各オリゴヌクレオチド（２μｇ）を、５０ｍＭ）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５） 　、１０ｍＭＭｇＣｌ、、５ｍＭβ−メルカプトエタノール、０゜１ｍＭスペル ミジン、０．１ｍＭＮａ、ＥＤＴＡ及びｌ、ｍＭＡＴＰを含有する反応容積１０ μＬ中の１０単位のポリヌクレオチドキナーゼ（４６２５０インデイアナ州、イ ンディアナポリス、Ｐ、ＣＬ　Ｂｏｘ５０４１４のベーリンガー・マンハイム、 ）と共にインキュベーションした。

ポリヌクレオチドキナーゼは、ＰＯ４をオリゴヌクレオチドの５′末端に移す。

オリゴヌクレオチドは、その後の段階でＤＮＡリガーゼのための基質として働く ために５’　ＰＯ４をもたなければならない。３７℃で１時間に続いて、２つの 反応を組み合わせ、そして得られる混合物を７０℃で１０分間加熱することによ り更なる酵素活性を終了させた。次いで混合物を室温にゆっくりと冷却させ、そ の際オリゴヌクレオチドは互いにハイブリダイゼーションした。

ベクターｐＲＨＦ−４を、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ Ｍｇ　Ｃｌ　２．５ｍＭＮａＣ１中で制限酵素Ｂａｎ１Ｉで消化した。この制限 酵素ＢａｎＩＩはベクターの独特の部位で切断しそれによりベクターを線状化す る。この消化に続いて、反応系をフェノールで抽出して、制限酵素及び他のタン パク質からプラスミドＤＮＡを分離し、次いでエタノールによる沈殿によりＤＮ Ａを集めた。／％イブリダイゼーショコンれリン酸化されたオリゴヌクレオチド （０，２μｇ）及びＢａｎ１ｌで線状化されたベクター（〜２０ｎｇ）を、５０ ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）　、１０ｍＭＭｇＣＩ２．５ｍＭスペルミ ジン、０゜１ｍＭＮａｚＥＤＴＡ、１ｍＭＡＴＰを含有する反応容積２０μｍ中 で１６℃で一夜一緒にインキュベージコンした。７０℃で１０分間反応混合物を 加熱することにより連結反応を終了させた。次いで、混合物を使用して、当業者 には知られているＣａＣ］２処理によりコンピテントにされた大腸菌（菌株ＤＨ ５Δ１ａｃ）１００μｌを形質転換した。次いで形質転換したバクテリアを１５ ０ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するルリアブロス（ＬＢ）寒天上で平板培養 した。バクテリア含有寒天プレートを、３７℃で一夜インキユベーションした。

ｐＲＨＦ−４はアンピシリンに対する耐性遺伝子を有するので、プラスミドで形 質転換されたこれらのバクテリアのみが、アンピシリンの存在下に増殖するであ ろう。１８の形質転換されたコロニーを、選択し、そして個々に、１００μｇ／ ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢＢａス１０ｍ１中で増殖させた。培養物が約 ０８の吸光度（ＯＤ６゜。で）に達すると、クロラムフェニコールを加えて最終 濃度１００μｇ／ｍｌとし、培養物を更に３７℃で一夜インキユベーションした 。プラスミドＤＮＡを、各培養物のバクテリアから抽出しくＫｌｅｉｎ　ｅｔ　 ａｌ、Ｐｌａｓｍｉｄ　３：８８−９１　（１９８０））そしてｌＱｍＭ）リス −ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）、１０　ｍＭＭ　ｇ　Ｃ１＊及び５０ｍＭＮａＣｌ中 で３７℃で１時間制限酵素ＨａｅＩＩＩで消化した。消化したＤＮＡを５％ポリ アクリルアミドゲル上で電気泳動した。我々は、制限断片のサイズを決定し、そ して挿入されたオリゴヌクレオチドのサイズを計算した。クローン５及び９は、 それぞれ、モノマーオリゴヌクレオチドの２及び５コンカテマーマルチブルを含 有していた。これらのプラスミドは、それぞれ、ｐＲＨＦ−５及びｐＲＨＦ−６ ’であった。

プラスミドｐＲＨＦ−５（１５μｇ）を、２００μｍ反応容積中で３７℃で２時 間制限酵素ＢａｎＩＩにより消化した。消化されたＤＮＡをフェノール抽出によ り他のタンパク質から分離しそしてエタノールでそれを沈殿させることにより集 めた。得られるＤＮＡを８％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動しそしてＤＮ Ａをエチジウムプロミドで染色した後可視化した。ＢａｎＩＩ消化の結果として 、クローニングされたオリゴヌクレオチドはモノマーに開裂された。ＤＮＡのこ のバンドを、電気溶出によりゲルから集めそしてエタノール沈殿により濃縮した 。単離されたＤＮＡを、上記のような連結反応に付した。連結混合物のインキュ ベーションを３０分間進めたとき、Ｂａｎ１ｌにわり線状化されたｐＲＨＦ−４ からのＤＮＡを、混合物に加えそしてインキュベーションを一夜続けた。前記と 同様に、連結反応は、７０℃で１０分間混合物を加熱することにより終了させた 。得られるＤＮＡ混合物を使用して、前記と同じようにコンピテント大腸菌（Ｄ Ｈ５１ａｃ）を形質転換した。前記と同じように、得られるバクテリアを、１５ ０μｇのアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上で平板培養した。３０つの 形質転換体を、各々、１５０μｇのアンピシリンを含有するＬＢ１ｍｌ中に接種 した。

各培養物のプラスミドＤＮＡを得、１％アガロースゲル上で電気泳動しそしてエ チジウムプロミドで染色した。クローン３．　８．　９及び２３がモノマー挿入 配列のより大きいマルチプルを有すると思われる。クローン３．　８．　９及び ２３のより大きい培養物を、調製しそして各々からのプラスミドＤＮＡが得られ た。各プラスミドＤＮＡを、制限酵素ＨａｅＩＩＩで消化し、そして消化された ＤＮＡを３．５％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させた。クローン３及び ９は、最も大きい挿入されたＤＮＡ断片を有すると思われた。クローン３　（ｐ ＲＨＦ−７）及び９（ｐＲＨＦ−８）におけるモノマーオリゴヌクレオチドのコ ンカテマーマルチブルの数は、それぞれ、１８及び２３であった。

プラスミドＤＮＡｐＲＨＦ−７及びｐＲＨＦ−８を、コンピテント大腸菌株Ｂｌ 、２１／ＬｙｓＥ　ｒｅｃＡ及びＢＬ２１／ｌｙｓ　Ｓ　ｒｅｃＡ中に形質転換 した。形質転換されたバクテリア菌株の各々の単一コロニーを、培養物が約０３ のＯＤ、。。に達するまで、１５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ中 で増殖させた。バクテリア細胞の試料（誘導されていない）を、この時点で取り 出し、遠心分離によりペレットにし、そしてドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ） 添加緩衝液中で５分間煮沸した。各培養物の残りに、ＩＰＴＧ（イソプロピルチ オ−β−ガラクトシド）を加えて９．５ｍＭの最終濃度とし、続いて３時間イン キュベーションを更に行った。次いで、バクテリア細胞（誘導された）の試料を 取り出し、遠心分離によりペレットにしモしてＳＤＳ添加緩衝液中で５分間煮沸 した。誘導されていないバクテリア培養物及び誘導されたバクテリア培養物の両 者から得られたタンパク質を１２．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気 泳動させた。タンパク質をクーマシーブルーにより染色することによりゲル上で 可視化した。ｐＲＨＦ−７で形質転換された誘導されたバクテリアからのタンパ ク質の見かけの分子量は、約３０キロダルトンであったが、ｐＲＨＦ−８で形質 転換された誘導されたバクテリアからのＤＮＡのそれは約４２キロダルトンであ った。

この後、このタンパク質を４０，０００ダルトンタンパク質と呼ぶ。ｐＲＨＦ− ８中のＤＮＡン挿入配列のより正確なサイズの決定は、制限酵素Ｄｄｅｌにより そのプラスミドからのＤＮＡを消化しそしてＤＮＡを３．５％ポリアクリルアミ ドゲル上で電気泳動させることによりなされた。挿入されたＤＮＡの断片は、誘 導されたタンパク質の分子量と一致するモノマーオリゴヌクレオチドの２６コン カテマーマルチブルから成ることが見いだされた。

４０．０００ダルトンタンパク質の大規模生産形質転換された大腸菌株ＢＬ２１ ／ｐＲＨＦ８、ｐＬｙｓＳを含有する寒天プレートから選択されたコロニーを、 下記に組成が示された培養培地Ａ３ｍ１中で６時間別々の培養物として増殖させ た。各得られる培養物を、やはり下記に組成が示されている培地Ｂ中に１：１希 釈し、次いで凍結しそして一７０℃で保存した。凍結の前に、各培養物からのア リフォートを培地Ａ４０ｍ１中に入れ、１．　０　（ＯＤ、。０における）の濁 度となるまで３６℃で増殖させ、次いで４０ｍｇの（ＩＰＴＧ、ベーリンガー・ マンハイム、４６２５０インデイアナ州、インディアナポリス）を加えることに より誘導した。誘導された培養物を更に２．５時間インキュベーションし、次い で１ｍｌのアリフォートを遠心分離した。

ペレットを５ＤＳ−ＰＡＧＥでのレーザー走査デンシトメトリーを使用すること により４０，０００ダルトンの分子量を有するタンパク質生成物の量についてア ッセイした。５ＤＳ−ＰＡＧＥは、ゲルがドデシル硫酸ナトリウムを含有するポ リアクリルアミドゲル電気泳動を意味する。

最も多（のタンパク質を生産した培養物を選択した。

その対応する凍結された培養物からの接種物（約５０μ■）を使用して、それを １５ｍ１の管中の培地Ａ３ｍ１に加えそして得られる培養物を６時間インキュベ ーションすることにより新しい培養を開始した。この培養物のアリフォート（０ ，５ｍ１）を２リツトルフラスコ中の培地Ａ３００ｍ１に加えそして得られる培 養物を３６℃で約１４時間インキュベーションし、その際培養物が２．７の濁度 （ＯＤ６゜。）に達するまで、１５０ｒｐｍで連続的に回転させた。この濁度で 、細胞タンパク質の濃度は０．９ｇ／］であった。５００ｍ１培養物は、接種物 として使用されそして培地Ａ９．５リットルを含有する１６リツトルの発酵槽に 無菌状態で加えた。１０リツトルの培養物を約１５の濁度（ＯＤｓｏ。）（細胞 タンパク質３．５ｇ／ｌ）となるまで、３６℃で５時間インキュベーションした （ｐＨ７，１酸素６０％ａｔｍを溶解した）。培養物をＩＰＴＧ１２ｇを加える ことにより誘導し更に３５時間インキュベーションし、次いで９℃に急冷した。

培養物を４℃で遠心分離し、得られるバクテリアのペーストを回収しそして一７ ０℃で保存した。遠心分離の前に、培養物中の細胞タンパク質の濃度は４．１ｇ ／ｌでありそして濁度（ＯＤ６゜。）は２９であった。５ＤＳ−ＰＡＧＥクーマ シー染色ゲルをデンシトメトリー走査することにより、この工学的に作り出され た４０゜０００ダルトンタンパク質は全細胞タンパク質の９．７％に相当するこ とが決定された。更なる計算は、得られるバクテリアのペーストが４０゜０００ ダルトンタンパク質約３．９ｇを含有することを示した。４０゜０００ダルトン タンパク質の評価は控えめである。何故ならばこのタンパク質はクーマシーによ り十分には染色されないからである。

４０．０００ダルトンタンパク質の精製細胞ペースト（３００ｇ）を、ｌＱｍＭ の濃度のエチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）　、１ｍＭの濃度のフ ェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）及び１００ｍＭＮａＣ１を含 有するｐＨ８゜０のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液３リツトル 中に懸濁させ、そして均一な懸濁液が得られるまで室温で撹拌した。次いで、リ ゾチーム１．５グラムを懸濁液に加えそしてそれを更に３０分間撹拌することに より、バクテリア細胞を溶解した。

細胞が溶解したとき、懸濁液は放出されたＤＮＡの故に粘性になった。

故に、懸濁液を、５０ｍＭＭｇＣ１ｔの存在下にデオキシリボヌクレアーゼＩ　 （１５ｍｇ）と共に３０分間撹拌し、そうすると懸濁液の粘度は減少した。懸濁 液を、２時間２５．０００Ｘｇでの遠心分離により清澄化した。得られるペレッ トを、最初に、洗剤溶液（５９ｍＭ）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、 ５ｍＭエチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）　、１ｍＭフェニルメチ ルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、２％トリトンｘ−ｉｏｏ、ｐＨ８，０ ）で２回洗浄し、次いで４Ｍ尿素の溶液で洗浄することにより封入体を製造した 。ＰＭＳＦは各回倒用のすぐ前に加えた。４Ｍ尿素溶液は、ｐＨ８，０の５Ｑｍ Ｍリン酸ナトリウムで緩衝された調製したばかりの９．６Ｍストック溶液から作 った。

ペレットを次いで３リツトルの洗剤溶液に懸濁させ、そして室温で２時間撹拌し 、次いで懸濁液を２５．０００ｘｇで２時間遠心分離した。

上記のような洗剤洗浄を得られるペレットにかんして繰り返した。ペレットは重 量１３２グラムであった。

１３２グラムのペレットを、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８，０で緩衝され た４Ｍ尿素１．３２リツトルに懸濁させ、室温で２時間撹拌した。懸濁液を、上 記のような遠心分離により清澄化させそして得られるペレットを回収した。ペレ ットを再懸濁させそして丁度説明したように再遠心分離した。この第２の洗浄の 後、ペレットの重量は９０グラムであった。

ペレットの大部分（８０グラム）を、ｐＨ８，０の５０ｍＭ）リスで緩衝された ６Ｍグアニジン塩酸塩８００ｍ１に懸濁させ、室温で一夜撹拌した。次いで懸濁 液を１０℃で２時間２５．ＯＯＯｘｇで遠心分離した。上澄液流体を６リツトル のバイオラッド（Ｂ　ｉ　ｏ−Ｒａｄ）　Ｐ−６ＤＧゲル脱塩カラム（９Ｘ９４ ．３ｃｍ）を用いてｐＨ６，０の２０ｍＭ２−　（Ｎ−モルホリノ）エタンスル ホン酸（ＭＥＳ）で緩衝された６Ｍ尿素に交換された。８００ｍ１の試料を、１ １／ｈの流速で脱塩カラムにポンプにより通した。最初の２リツトルを捨てた。

空隙容積を含んだ次のリットルを集め、再び１０℃で２時間２５，０００Ｘｇで 遠心分離することにより清澄化した。上澄液を２１／ｈの流速で２リツトルのＱ ＦＦセファロースカラム（９Ｘ３１．４ｃｍ）に通した。多量の（１゜６リツト ル）の流出液を集め、４℃で蒸留水に対して徹底的に透析した。

透析された試料をシェル凍結させ（ｓｈｅ　Ｉ　１　ｆ　ｒｏｚｅｎ）そして凍 結乾燥した。凍結乾燥した試料の重量は５．５グラムであった。

試料のアリフォートの５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動は、約４０．０００ダルトンの 分子量を有する１つの主要なバンドを示した。タンパク質は、この基準により汚 染タンパク質に対して９５％より良好な純度であると判定された。４０．０００ ダルトンのタンパク質の凍結乾燥した試料中に有意な量の尿素が存在しているこ とに気づいた。アミノ酸組成は、実験誤差の範囲内で、クローニングされたＤＮ ＡのＤＮＡ配列から決定されたアミノ酸組成と一致していた。Ｎ末端配列は、Ｎ 末端メチオニンが失われていることを除いては、予想された配列と完全に一致し ていた。

培地 培地Ａ （化学薬品ダラム） 溶液Ａ ＫｚＨｐＯ＜　１９．５ ＮａＨｚＰＯｎ　１０．３ 脱イオン水０．５リツトル中、オートクレーブ処理溶液Ｂ ＣａＣ１ｚ　Ｏ，２５ グルコース２００（フラスコ及びチューブ）又は３００（醗酵槽）脱イオン水１ リツトル中、オートクレーブ処理溶液Ｃ （ＮＨ４）２Ｓ　０４　３．　Ｏ Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４４、５ プロリン　３．７ クエン酸Ｎａ−ＨｚＯＯ，４３ Ｆｅｓｏ＜−ＨｚＯＯ，２５ チアミン　０．３０ 痕跡元素　１０ｍ１ ＰＰＧ２０００　５ｍｌ カザミノ酸　１００ｇ　（チューブ及びフラスコ）又は２００ｇ　（醗酵槽）、 すべて脱イオン水８リツトル中カーボイ又は醗酵槽中オートクレーブ処理 痕跡元素溶液（ｇ／１） ＺｎＳ０４　４．５ ＣｕＳＯ４２，２５ Ｍｎ　Ｓ　Ｏ４２，２５ ＣＯＣｌ２　０．０３０７ ＮＨ４ＭＯＯ４０，０９０ Ｈ３ＢＯ４０，１５ オートクレーブ処理 冷却すると、溶液Ａ、Ｂ、Ｃ及び痕跡元素溶液を一緒にしそしてフィルター無菌 化アンピシリン溶液を加えて５０ｍｇ／ｌアンピシリンの濃度とする。

培地Ｂ（ｇ／Ｉ　２Ｘ濃度に対して） Ｋ２ＨＰＯ４１３，６ ＫＨ，Ｐｏ、　３．６ クエン酸Ｎａ３・Ｈ，ＯＯ，９ Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏａ・７Ｈｔ０　０．１８（ＮＨ４）　！Ｓ　０４　１．８ グリセロール　８８．０ オートクレーブ処理し、次いで４℃で保存。

４０．０００ダルトンタンパク質の非等方性の証明４０．０００ダルトンのγタ ンパク質の凍結乾燥した調製物１９．１％及び尿素５．５％を含有する溶液を、 ヒートシールしたポリエチレン容器中で０．０７６０ｇの全固形分と０．２３３ ０ｇのＨＦＩＰを一緒にすることにより調製した。間欠的に激しく混合し、続い て室温で一夜放置することにより、剛性の、ペースト状の、非流動性のしかし変 形可能な（降伏応力又はビンガム塑性挙動）乳白半透明な（ｏｐａｑｕ、ｅ。

ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｔ）溶液を生じた。外観及びコンシスチンシーは、実験室 ガラス器具を組み立てるのに使用されるコック用グリース又は高真空グリースの それに匹敵していた。溶液の試料を、光学顕微鏡の光学的トレインにおける直交 偏光フィルター（９０°離してセットした）間に配置し、そして生じる暗視野に おいて検査した。試料は、強く複屈折性であり、試料を顕微鏡のステージの面内 で回転させにつれて明るくなったり暗くなるゾーンを示し、粒状の、サンドペー パー状の組織（ｔ　ｅｘｔｕｒｅ）を持っていた。溶液は、そのレオロジー、全 体の外観及び光学的特性に基づいて非等方性（液晶）であると特徴付けられた。

４０．０００ダルトンのγタンパク質の凍結乾燥した調製物９．９％及び尿素２ ，９％を含有する溶液を、ヒートシールしたポリエチレン容器中で領　０７８０ ｇの全固形分とｏ、５３１５ｇのへキサフルオロイソプロパツール（ＨＦ　Ｉ　 Ｐ）を−緒にすることにより調製した。間欠的に激しく混合し、続いて室温で一 夜放置することにより、ペースト状の、乳白半透明な（ｏｐａｑｕｅ、ｔ　ｒａ ｎｓ　１ｕｃｅｎｔ）溶液を生じた。

調製されたままで、溶液は滑らかでありそして混合が容易であるが、それは、明 白な降伏応力（ビンガム塑性）レオロジー（成る最小の力が加えられるまで流れ ず、その後円滑な流れ、溶液自身の重量より大きい流れるための最小の力）を示 した。溶液の試料を、光学顕微鏡の光学的トレインにおける直交偏光フィノータ −（９０＠離してセットした）間に配置し、そして生じる暗視野において検査し た。試料は、強く複屈折性であり、試料を顕微鏡のステージの面内で回転させる につれて明るくなったり暗（なるゾーンを示し、剛性の、ロッド状分子の非等方 性（液晶）溶液の特徴的組織を有していた。

ＨＦＩＰ中に４０．０００ダルトンのγタンパク質の凍結乾燥した調製物３．７ ％及び尿素１．０％を含有する溶液を、ヒートシールしたポリエチレン容器中で ０．０５２４ｇの全固形分と１．０６７７ｇのＨＦＩＰを一緒にすることにより 調製した。間欠的に激しく混合し、続いて室温で一夜放置することにより、薄い 、容易に注入しつる透明な溶液を生じた。溶液の試料を、光学顕微鏡の光学的ト レインにおける直交偏光フィルター（９０°離してセットした）間に配置し、そ して生じる暗視野において検査した。試料は光学的に不活性であり、暗視野では 見ることができなかった。溶液は、そのレオロジー、全体の外観及び光学的特性 に基づいて等方性であると特徴付けられた。

再び室温に一夜放置すると、ＨＦＩＰ中の４０．０００ダルトンのγ−タンパク 質の透明な３．７％溶液は濁りそして不透明となった。しかしながら、暗視野顕 微鏡における溶液の外観の変化及び溶液レオロジーの有意な変化はなかった。溶 液は等方性のままであった。濁りの発生は、溶液中のタンパク質ポリマーの凝集 （自己集合）に帰された。

４０．０００ダルトンタンパク質による繊維形成（Ａ）ＨＦＩＰ中の４０．００ ０ダルトンのポリペプチドの凍結乾燥された調製物７．５％（重量）十尿素２． ２％（重量）の溶液を、ヒートシールされたポリエチレンパケット中で乾燥成分 に溶媒を加え、パケットを手で混練することにより完全に混合し、混合物を室温 で一夜放置した。溶液は、半透明な、乳白光外観及び液晶溶液の特徴である降伏 応力レオロジーを示した。溶液の試料を、光学顕微鏡の光学的トレインにおいて ９０＠離してセットされた直交偏光フィルター間に置き、そして試料を生じる暗 視野で検査した。試料は、強く複屈折性であり、そして試料を顕微鏡ステージの 面内で回転させるにつれて明る（なったり暗（なったりするゾーンを示すことが 見いだされた。

溶液を、湿式紡糸のための注射器に入れる前に、５０．３２５及び５０メツシユ （メツシュはＡＳＴＭ標準Ｅ−１１−６１に従うランデのハンドブック・オブ・ ケミストリー、第１３版、１１及び１２頁参照）のスクリーンから成るステンレ ス鋼製スクリーンバックを通してろ過した。

注射器にキャップをかぶせそして遠心分離して溶液中にトラップされた気泡を解 放した。次いで注射器ポンプを使用して、溶液を注射器からステンレス鋼製取り 付は部品の０．００５インチ直径×領　０１０インチ長さのオリフィスを通して 直接室温のアセトンの容器中に送った。注射器ポンプ速度は、０．００３４ｍ１ ／分の溶液を送るように設定した。

溶液がアセトン中に押し出されるにつれて形成されたフィラメントを、自由に落 下させそしてアセトン充填容器の底部でそれ自身に螺旋状に巻き付かせた（ｃｏ ｉｌ）。

アセトン中での少なくとも１０分の凝固の後、フィラメントを取り出しそして室 温で空気中で乾燥させて、０．４ｇｐｄの強力、３４％の伸び及び１６ｇｐｄの 初期モジュラスを有する１８デニールの繊維を製造した。

別の実験では、別法として、湿式フィラメントを、それがアセトンから取り出さ れるにつれてその元の長さの２倍まで延伸した。元の長さの１．５倍までの湿式 延伸、それに続く空気乾燥により、１．５ｇｐｄの強力、１６％の伸び及び４５ ｇｐｄの初期モジュラスを有する５デニールの繊維を製造した。

上記の方法に従って製造された乾燥した繊維を、２００℃のホットビンの上を通 しながらその元の長さの２−３倍に延伸して、２．６ｇｐｄの強力、１５％の伸 び及び４４ｇｐｄの初期モジュラスを有する５デニールの繊維を製造した。

（Ｂ）ＨＦＩＰ中に約４０，０００ダルトンのポリペプチドの１１゜９重量％及 び尿素４０％を含有する溶液を、ヒートシールされたポリエチレンパケット中で 乾燥成分に溶媒を加えることにより調製した。室温で５日間の間欠的な激しい混 合（手による混線）により、液晶溶液の降伏一応力レオロジー特性を有する濃厚 な（ｔｈｉｃｋ）半透明溶液を生成した。

溶液を、５０，３２５，３２５及び５０メツシユスクリーンを備えた注射器に移 した。注射器にキャップをかぶせそして遠心分離して溶液中にトラップされた気 泡を解放した。次いで注射器ポンプを使用して、溶液を、スクリーンバックを通 しそして注射器からステンレス鋼製取り付は部品のｏ、ｏｏｓインチ直径Ｘ０． ０１０インチ長さのオリフィスを通して送った。注射器ポンプ速度は、０．０６ ８ｍ１／分の溶液を送るように設定した。注射器、注射器ポンプ及び鋼製取り付 は部品は、オリフィスから出てくる溶液のジェットが０．　５インチのエアギャ ップを通って室温のアセトンの槽（ｐ　ａ　ｎ）中に下方に移動するように配列 されていた。アセトン中でのジェットの凝固により生成したフィラメントを、モ ーター駆動式巻き取り装置のボビンに巻き取ることにより１２フィート／分の速 度で集めそして室温で空気中で乾燥させた。室温で空気中で乾燥させた後、繊維 を、ボビンから取り出しそして該繊維は１．　２ｇｐｄの強力、９％の伸び及び ５８ｇｐｄの初期モジュラスを有し、１５゜６デニールであることが見いだされ た。

（Ｃ）（Ｂ）で述べたポリマー溶液を、オリフィスから出てくる溶液のジェット が、約１８インチの長さのエアギャップ（このエアギャップを横切って室温の空 気が流れてＨＦＩＰを蒸発させる）を通って落下するように配列された注射器、 注射器ポンプ及び鋼製取り付は部品により、乾式紡糸方法で紡糸した。注射器ポ ンプ速度は、０．００６８ｍ１／分の溶液を送るように設定された。ギャップの 底部で部分的に乾燥されたフィラメントを、メタルメツシュボビンに巻き取り、 そして室温で空気中で完全に乾燥させた。乾燥繊維は、０．１ｇｐｄの強力、３ ７％の伸び及び１．５ｇｐｄの初期モジュラスを有し、２４デニールであった。

紡糸されそして後延伸された繊維をＸ線回折に付した。回折パターンは、配向し た繊維の観察された回折パターンがモデルのそれに対応するという点で、配向し たクロス−βシートフィブリルの存在と合致していた。

実施例２ ＬＳｖＱＴＳＡＰＬＴｖＳＤＧＫのマルチマーを含んで成るタンパク質を生産す るベクターの創造 ＬＳＶＱＴＳＡＰＬＴＶＳＤＧＫのマルチマーを含んで成るタンパク質を製造す るために、下記のオリゴヌクレオチド、Ｓ’　ＡＧＣＴＴＡＣＣＧＴＣＧＧＡＡ ＡＣＧＧ’ｌ”ＣＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴＧＧＴＣＴＧＡＡＣＡＧＡＣ３’を合 成した。

各ストランドのオリゴヌクレオチド（２μｇ）を、１．ＯｍＭＡＴＰ。

５０ｍＭ）リス−ＨＣ１（ｐＨ７，５）　、１０ｍＭＭｇＣＩ、、５ｍＭβ−メ ルカプトエタノール、Ｑ、１ｍＭスペルミジン及びＱ、１ｍＭＮａ　ｔ　Ｅ　Ｄ 　Ｔ　Ａを含有する反応容積１０μｌ中の１０単位のポリヌクレオチドキナーゼ （４６２５０インデイアナ州、インディアナポリス、Ｐ。

０、Ｂｏｘ５０４１４のベーリンガー・マンハイム、）と共にインキュベーショ ンした。反応を、３７℃で３時間インキュベーションし、次いでＯ，ＯＩＭ）リ ス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）２０μｌ及びフェノール４０μｍの添加により終了 させた。フェノール抽出に続いて水性相を、次いで、Ｏ，０１Ｍトリス−ＨＣｌ 　（ｐＨ７，５）と平衡化された１、０ｍｌセファデックスＧ−２５カラムに加 えた。オリゴヌクレオチドは４９μｌの容量で溶離した。これから８μｍを取り 出し、ＤＮＡ連結のために使用した。連結反応は、オリゴヌクレオチド、１．Ｑ ｍＭＡＴＰ。

５ＱｍＭ）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）　、１０ｍＭＭｇＣ１ｔ、５ｍＭβ− メルカプトエタノール、Ｑ、１ｍＭスペルミジン、０．１ｍＭＮａ！ＥＤＴＡ、 ４０％ポリエチレングリコール（ＭＷ８．０００）及び４ｏｏ、ｏｏｏ単位のＴ ４ＤＮＡリガーゼ（０１９１５マサチユーセツツ州、ビバリー、３２トザーロー ドの二ニー・イングランド・バイオラプス）から成っていた。反応を、室温で３ ０分間インキュベーションし、次いでＳＤＳゲル停止溶液を、０．８％アガロー スゲルに試料を加える前に加えた。電気泳動に続いて、ゲルをエチジウムプロミ ドで染色し、１−２ｋｂサイズ範囲のオリゴヌクレオチドマルチマーを、ゲルか ら切り出した。ＤＮＡを含有するゲルスライスをフェノール中で破砕し、抽出さ れたＤＮＡをエタノール沈殿により濃縮した。次いでＤＮＡを領０１Ｍトリスー ＨＣｌ２Ｏμｌ中に再懸濁させた。

ベクターｐＲＨＦ−１（２，４μｇ）を、５０ｍＭ）リス−ＨＣＩ（ｐＨ７，５ ）及び１０ｍＭＭｇＣ１ｘを含有する反応容積２０μｌ中で制限酵素Ａｃｃｌで 消化した。反応を３７℃で２時間インキュベーションし、次いで、仔ウシアルカ リホスファターゼ（４６２５０インデイアナ州、インディアラポリス、Ｐ、０． Ｂｏｘ５０４１４、のベーリンガー・マンハイム）の１：５０希釈物２μｌと共 に更に１時間インキュベーションして、ベクターの末端から５’　−ＰＯ４を除 去した。次いで、反応を等容量のフェノールの添加により終了させてタンパク質 を除去し、次いでＤＮＡをエタノール沈殿により濃縮した。次いで、濃縮したＤ ＮＡを０．０１Ｍトリス−ＭＣＩ　（ｐＨ７，５）５０μｌの容積中に再懸濁さ せた。　オリゴヌクレオチドマルチマー及びベクターＤＮＡを次いで、１５μｍ のオリゴヌクレオチドマルチマー、２．５μｌのｐＲＨＦ−ＩＡｃｃｒ線状化ベ クターＤＮＡ、１．ＯｍＭＡＴＰ、５０ｍＭ）リス−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）　 、１０ｍＭＭｇＣＩ、、５ｍＭβ−メルカプトエタノール、０．１ｍＭスペルミ ジン及び０．　１　ｍ　Ｍ　Ｎ　ａ　ｔ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａを含有する２５μｌの 反応混合物中で相互に連結させた。反応を、１６℃で一夜インキユベーションし た。７０℃で１０分間反応を加熱することにより連結反応を終了させた。次いで 、この混合物を使用して、当業者には知られているＣａＣ１，処理によりコンピ テントにされた大腸菌（菌株ＤＨ５１ａｃ）１７５μｍを形質転換した。次いで 形質転換したバクテリアを１５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ寒天 上で平板培養した。次いでこれらのプレートを、３７℃で一夜インキユベーショ ンした。２４の形質転換されたコロニーを選択し、そして個々に、１００μｇ／ ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢプロスｌＱｍｌ中で増殖させた。培養物が〜 領　８の吸光度（ＯＩ）ｓｅｅで）に達すると、クロラムフェニコールを各々に 加えて最終濃度１００μｇ／ｍｌとし、培養物を更に３７℃で一夜インキユベー ションした。プラスミドＤＮＡを、各培養物のバクテリアから抽出しくＫｌｅｉ ｎ　ｅｔ　ａｌ、Ｐｌａｓｍｉｄ　３：８８−９１（１９８０））そして１０ｍ Ｍ）リス−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）　、１０ｍＭＭｇＣＩｔ及び１００ｍＭＮａＣ ＋中で３７℃で１時間制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した。次いで制限消化物を１％ アガロースゲル上で電気泳動させ、そしてエチジウムプロミドで染色することに よりＤＮＡを検査した。ｐＲＨＦ−１１と名付けられたクローン１１は、約７１ ０ｂｐの見積もられた挿入配列サイズを有していた。

ｐＲＨＦ−１１ＤＮＡを、コンピテント大腸菌株ＢＬ２１／ＬｙｓＥｒｅｃＡ及 びＢＬ２１／ｌｙｓ　Ｓ　ｒｅｃＡ中に形質転換した。形質転換されたバクテリ ア菌株の各々の単一コロニーを、培養物が約０゜３の吸光度（ＯＤｓｏｏ）に達 するまで、１５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ中で増殖させた。バ クテリア細胞の試料（誘導されていない）を、この時点で取り出し、遠心分離に よりペレットにし、そしてドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）添加緩衝液中で５ 分間煮沸した。

各培養物の残りに、ＩＰＴＧ（イソプロピル千オーβ−ガラクトシド）を加えて ０．５ｍＭの最終濃度とし、続いて３時間インキュベーションを更に行った。次 いで、バクテリア細胞（誘導された）の試料を取り出し、遠心分離によりペレッ トにしモしてＳＤＳ添加緩衝液中で５分間煮沸した。誘導されていないバクテリ ア培養物及び誘導されたバクテリア培養物の両者から得られたタンパク質を１２ ．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させた。タンパク質をクーマ シーブルーにより染色することによりゲル上で可視化した。２０，０００ダルト ンの分子量を有する形質転換されたバクテリアからの誘導されたタンパク質が観 察された。今後このタンパク質は、２０，０００ダルトンタンパク質と呼ぶ。

大腸菌株Ｂ５５８３Ｆ”／ｐＲＨＦ−１１を、Ｍ１３ファージＩＲ−１で感染さ せて、Ｚａｇｕｒｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ２７：１８３−１９１　（１ ９８４）の方法に従って一重鎖ブラスミドＤＮＡを生成させた。−重鎖ＤＮＡは 、Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ７４　：５４６３−５４６７　（１９ ７７）のチェーンターミネータ−法を用いてＥｃｏＲＩプライマー（前記のニュ ー・イングランド・バイオラプス）を使用して配列決定された。

配列決定は、ｐＲＨＦ−１１が元のオリゴヌクレオチドの１４配列マルチプルを 含有することを示した。

２０．０００ダルトンタンパク質の大規模生産ｐＲＨＦ−１１で形質転換された 大腸菌の培養物からの接種物（約５Ｑｕｌ）を、５ｍｌの培地Ｂに加え、１５ｍ １の試験管内で３６℃で約６時間インキュベーションした。この時点で、この第 １の培養物０．　５ｍｌを、２リツトルのフラスコ中で５００ｍ１の培地Ｂに加 えそして２゜５の濁度（ＯＤｓ＊ｅ）まで１５Ｏｒｐｍで連続的に回転させなが ら、３６℃で約１６時間インキュベーションした。次いで５００ｍ１培養物を、 ９．５リツトルの培地Ｃが入った１６リツトルの発酵槽に加え、得られる培養物 を、１．１の濁度（ＯＤｓ。。）まで、３６℃で５時間インキュベーションした （ｐＨ７，２、溶解酸素６０％気圧）。この濁度で、細胞タンパク質の濃度は、 １．８ｇ／ｌであった。ＩＰＴＧ　（２，５ｇ）を加えた。さらに１時間のイン キュベーションの後、更に７．５ｇのＩＰＴＧを加え、続いて更に２時間インキ ュベージコンした。次いで、培養物を急冷水の通過により１８℃に急冷し、４℃ で遠心分離し、得られるバクテリア細胞のペーストを一７０℃で保存した。培養 物を遠心分離する直前に、バクテリアタンパク質の濃度は２．５ｇ／ｌであった 。培養物の濁度（ＯＤ６゜。）は１５６であった。２０，０００ダルトンタンパ ク質は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ、クーマシー染色及びその後のレーザーデンシトメト リーにより決定して全細胞タンパク質の２．２％に相当した。

計算によると、全細胞ペースト中には２０．０００ダルトンタンパク質０．６４ ｇがあったが、精製した２０，０００ダルトンタンパク質の後の定量は、それは クーマシーにより約２５％効率でしか染色されなかったことを示した。かくして 、この方法は、存在するタンパク質の真の量を評価していなかった。

培地Ｂ　（ｇ／リットル）ニ ドリプトン　１０ 酵母抽出物　５ ＮａＣ１１０ グルコース　１０ （別々にオートクレーブ処理し、そして冷却されると加えた）フィルター無菌化 アンピシリンを加えて５０ｍｇ／ｌとした。

培地Ｃ（醗酵槽について（ｇ／１０リットル））：溶液Ａ Ｎ　ａ　ｔ　ＨＰ　Ｏ４７０ ＫＨ！ＰＯ４３Ｏ ＮａＣ１５ ＮＨ４Ｃ１１０ ＨｚＯ５００ｍ１中、オートクレーブ処理溶液Ｂ グリセロール　２００ ＣａＣＩｚ　１０ｍ１　ｏｆ　ＩＭ Ｈ，０１リツトル中、オートクレーブ処理溶液Ｃ カザミノ酸　４０ ペプトン　３０ 酵母抽出物　２０ Ｍｇ５０４　１０ｍ１　ｏｆ　１Ｍ ＰＰＧ２０００　５ｍｌ　； Ｈ２Ｏ８リツトル中、醗酵槽中、オートクレーブ処理。

冷却されると、溶液ＡＳＢ及びＣを醗酵槽中で無菌状態で一緒にする。

２０．０００ダルトンタンパク質の精製バクテリア細胞（２００ｇ）の凍結した ペーストを、１０ｍＭエチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）及び１ｍ Ｍフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を含有したｐＨ８，０の ５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液２リツトルに懸濁させ た。

次いで、この懸濁液を、均一になるまで室温で撹拌した。バクテリア細胞を、続 いて、１グラムのリゾチームを懸濁液に加えそしてそれを更に３０分間撹拌する ことにより、溶解させた。

細胞が溶解したとき、懸濁液は放出されたＤＮＡのために粘性になった。故に、 懸濁液を、５０ｍＭＭｇＣｌ、の存在下にデオキシリボヌクレアーゼＩ　（１０ ｍｇ）と共に３０分間撹拌し、そうすると懸濁液の粘度は減少した。懸濁液を、 ７，０００Ｘｇで４５分間遠心分離により清澄化した。

遠心分離から得られるペレットを、ｐ）（ｓ、Ｏの５ＱｍＭ）リスで緩衝された ８Ｍ尿素中で抽出した。尿素は、その使用の直前に新たに脱イオン化した。尿素 抽出物を、等容量の蒸留水で希釈しそして室温で硫酸アンモニウムにより２３％ 飽和に至らしめた。沈殿したタンパク質を、７．０００Ｘｇで４５分間遠心分離 により取り出した。

清澄化した上澄液を、ｐＨ４，０の２０ｍＭピペラジン及び４Ｍ尿素の溶液に対 して、４℃で一夜透析することにより低ｐＨ沈殿に付した。

ＣＨＡＰＳ　（３−［（コラミドプロピル）−ジメチルアミノコ−１−プロパン スルホネート）を５ｍＭの濃度で透析物に加えた。沈殿したタンパク質を、４℃ で７，０００Ｘｇで４５分間懸濁液を遠心分離することにより除去した。

清澄化した上澄液を、４℃の硫酸アンモニウムにより２３％飽和に至らしめた。

沈殿したタンパク質を、上記のような遠心分離により再び除去した。得られるベ レットを、ｐＨ７，０の２０ｍＭビス−トリス　プロパン（１，２−ビス［トリ ス（ヒドロキシメチル）−メチルアミノ］−プロパン）及び６．０Ｍ尿素から成 る溶液１００ｍ１に室温で溶解した。得られる溶液をポンプで送って１．８１／ ｈの流速で３リツトル（９Ｘ４７ｃｍ）ＱＦＦセファロースカラムに通して、組 換えタンパク質（γ−タンパク質）をＱＦＦセファロース（強いアニオン交換樹 脂）に結合させた。しかしながら、組換えタンパク質は結合せず、それ故それは カラムを通って流れた流体中に回収された。しかしながら、他のバクテリアタン パク賀は結合し、かくして相当な精製が達成された。

γ−タンパク質は、最初尿素を４Ｍに希釈し、次いで硫酸アンモニウム１７０ｇ ／ｌの濃度に加えることにより、溶離液中に濃縮した。沈殿したγ−タンパク質 を、室温であることを除いては、前記と同じく遠心分離することにより集めた。

得られるペレットを、蒸留水に対して徹底的に透析しそして凍結乾燥した。γ− タンパク質の収量は０．７４ｇであった。

γ−タンパク質は、約２２．０００ダルトンの分子量を有するタンパク質のポリ アクリルアミドゲル電気泳動で１つの主要なバンドを与える。

タンパク質の凍結乾燥された調製物は、この基準により、汚染性タンパク質に対 して、純度が９５％より大であると判定された。２２．０００ダルトンγ−タン パク質のアミノ酸組成は、既知のＤＮＡ配列から計算されたアミノ酸組成と、実 験誤差の範囲内で、一致していた。５サイクルにわたり精製された２２，０ＯＯ ＤＮＡγ−タンパク質のＮ末端配列はＡＳＭＴＧであり、モしてＮ末端メチオニ ンが失われていることを除いては、予想された配列と完全に一致している。

２０．０００ダルトンタンパク質の非等方性の証明ＨＦＩＰ中に２２．０００ダ ルトンγ−タンパク質４．７％及び９゜６％を含有する溶液を、ヒートシールさ れたポリエチレン容器中でポリマー及び溶媒を一緒にすることにより調製した。

間欠的に激しく混合し、続いて室温で一夜放置して、僅かな青又は紫の色合いを 持った薄い、透明な、容易に注入し得る溶液を生成した。これらの溶液の試料は 、暗視野光学顕微鏡において見ることはできない。これにもとづいて、溶液は等 方性であると特徴付けられた。

ヒートシールしたポリエチレン容器中でポリマー０．２５８２ｇ及び溶媒１．　 ５１４９　ｇヲ−ｉ！＋、：スル、ニド４．：ヨリ、ＨＦＩＰ中＋７）２２．０ ００ダルトンγ−タンパク質１４．６％を含有する溶液を調製した。間欠的に激 しく混合し、続いて室温で一夜放置することにより、殆ど透明であるが僅かに半 透明な溶液が生成した。この溶液は、降伏一応力レオロジーのいくらかの徴候を 示すが、試料は、暗視野光学顕微鏡において明るさを示さなかった。これに基づ いて、溶液は、非等方性のための臨海的濃度に近い等方性として特徴付けられた 。

先に調製した２９．５％溶液を追加の溶媒で希釈することにより、ＨＦＩＰ中の ２２．０００ダルトンγ−タンパク質１５．４％を含有する溶液を調製した。間 欠的に激しく混合し、続いて室温で一夜放置することにより、降伏一応力レオロ ジー及びかすかな青又はラベンダーの色合いを持った半透明なペースト状溶液を 生成させた。溶液の試料を、暗視野光学顕微鏡で検査しそして複屈折性であるこ とが見いだされ。すなわち、試料を顕微鏡ステージの面で回転させるにつれて、 明るくなったり暗くなったりするゾーンを示す。そのレオロジー、全体的外観及 び光学特性に基づいて、この溶液は、非等方性（液晶）であると特徴付けられた 。　ヒートシールしたポリエチレン容器中でポリマー０．３０７０ｇ及び溶媒１ ．２６７８ｇを一緒にすることにより、ＨＦＩＰ中の２２゜０００ダルトンγ− タンパク質１９．５％を含有する溶液を調製した。

間欠的に激しく混合し、続いて室温で４日放置することにより、顕著な降伏一応 力（ビンガム塑性）レオロジーを有する濃厚なペースト状の半透明溶液が生成し た。この溶液の試料を暗視野で光学顕微鏡で検査しそしてこの試料は、複屈折性 であり、試料を顕微鏡ステージの面で回転させるにつれて、明るくなったり暗く なったりするゾーンを示すことが見いだされた。そのレオロジー、全体的外観及 び光学特性に基づいて、この溶液は、非等方性（液晶）であると特徴付けられた 。

２０．０００ダルトンタンパク質による繊維の製造ヒートシールされたポリエチ レンパケット中で乾燥ポリマーに溶媒を加え、手で混練することにより完全に混 合し、次いで４日間間欠的に混合することによって、ＨＦＩＰ中の２２，０００ ダルトンγ−タンパク質１９．５重量％を含有する溶液を調製した。得られる溶 液は、半透明な、乳白色の（ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｔ、ｏｐａｌｅｓｃｅｎｔ） 外観及び非等方性溶液と関連した降伏一応力（ビンガム塑性）レオロジーを示し た。溶液の試料を、光学顕微鏡の光学トレインの直交偏光フィルター（９０″′ 離してセットした）間に置きそして得られる暗視野で検査した。試料は、複屈折 性であり、試料を顕微鏡ステージの面で回転させるにつれて、明る（なったり暗 くなったりするゾーンを示した。そのレオロジー、全体的外観及び光学特性に基 づいて、この溶液は、非等方性（液晶）であると特徴付けられた。

溶液を、相次いで５０，３２５，３２５及び５０メツシユのスクリーンを備えた 注射器に加えた。注射器にふたをしそして遠心分離して溶液中にトラップされた 気泡を解放した。次いで、注射器ポンプを使用して溶液を、スクリーンバックを 通しそして注射器からステンレス鋼製取り付は部品の０．００５インチ直径×領 　０１０インチ長さのオリフィスを通して室温メタノールのビーカーに直接送っ た。注射器ポンプ速度は、０．００３４ｍ１／分の溶液を送給するように設定し た。溶液をメタノール中に押し出すにつれて形成された白色の不透明なフィラメ ントを、自由に落下させそしてビーカーの底部でそれ自身に螺旋状に巻き付かせ た（ｃｏ　ｉ　１）。

少なくとも１時間のメタノール中での凝固の後、フィラメントを取り出しそして 室温の空気中で乾燥させて、０．３０ｇｐｄの強力、２％の伸び及び１５．５ｇ ｐｄの初期モジュラスを有する８０デニール繊維を製造した。

別法として、メタノール中で１時間の凝固の後、フィラメントをメタノールに浸 漬させている間にその元の長さの２．５倍に延伸し、次いで室温の空気中で乾燥 させて、０．４０ｇｐｄの強力、２．５％の伸び及び２０ｇｐｄの初期モジュラ スを有する４５デニール繊維を製造した。

２０．０００ダルトンのタンパク質のクロスβシートミクロフィブリル構造 試料のタンパク質を水に溶解しそして流延させ（ｃａｓｔ）でフィルムを製造し た。流延させたフィルムからの試料をＸ線粉末回折分析に付した。結果は、ポリ ペプチドが形成することが予想される構造に対応する回折パターンを示した。半 径方向平均化は、もしもクロスβシート又はミクロフィブリルが表面で配向しな いでいたとしたならば、予想されるであろうところのものに相当した。

本発明の多くの異なる態様は本発明の精神及び範囲から逸脱することな（なされ 得るので、本発明は、下記請求の範囲により定義された以外は例示された特定の 態様に限定されるものではない。

平成５年５月２７日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 【配列があります】 及び 第１アミノ酸がＧ，Ｓ又はＤであり、 第２アミノ酸がＫ，Ａ，Ｔ，又はＮであり、第３アミノ酸がＩ又はＬであり、 第４アミノ酸がＳ，Ｔ又はＧであり、 第５アミノ酸がＶ，Ｉ，又はＬであり、第６アミノ酸がＱ，Ｔ，Ｎ，Ｈ又はＡで あり、第７アミノ酸がＴ又はＶであり、 第８アミノ酸がＳ又はＴであり、 第９アミノ酸がＡ，Ｐ又はＧであり、 第１０アミノ酸がＰ又はＧであり、 第１１アミノ酸がＬ又はＩであり、 第１２アミノ酸がＴ，Ｙ又はＨであり、第１３アミノ酸がＶ又はＴであり、 第１４アミノ酸がＳ，Ｔ又はＡであり、第１５アミノ酸がＤ，Ｑ，Ｎ又はＳであ る、１５のアミノ酸残基から成る群及び 第１アミノ酸がＮ，Ｔ又はＧであり、 第２アミノ酸がＡ又はＳであり、 第３アミノ酸がＬ，Ｉ又はＭであり、 第４アミノ酸がＲ又はＩであり、 第５アミノ酸がＩ，Ｌ又はＴであり、 第６アミノ酸がＫ又はＤであり、 第７アミノ酸がＬ，Ｖ，Ｈ，Ｅ，Ｄ，Ｃ又はＹであり、第８アミノ酸がＧ又はＤ であり、 第９アミノ酸がＳ又はＧであり、 第１０アミノ酸がＧ，Ａ，又はＰであり、第１１アミノ酸がＬ又はＩであり、 第１２アミノ酸がＤ，Ｒ又はＮであり、第１３アミノ酸がＬ，Ｆ又はＹであり、 第１４アミノ酸がＱ，Ｄ又はＮであり、第１５アミノ酸がＫ又はＮである、 １５のアミノ酸残基から成る群、 より選ばれた１種又は１種より多くのペプチド又はペプチドの組み合わせの１４ 乃至５２配列マルチプルを含有して成るタンパク質をエンコードしている合成Ｄ ＮＡ配列。 ２．前記１種又は１種より多くのペプチド又はペプチドの組み合わせが、 【配列があります】 から選はれる、請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列。 ３．ベクター中に作用的に連結されそして形質転換されたバクテリアのポリペプ チド発現生成物として発現される、請求の範囲第１項又は２項記載のＤＮＡ配列 。 ４．ベクターがｐＲＨＦ−１又はｐＲＨＦ−４である、請求の範囲第３項記載の 配列。 ５．ベクターが、 （ａ）合成遺伝子の上流の強い条件付きプロモーター、（ｂ）合成遺伝子の翻訳 開始に必要なシグナルを含有する前記プロモーターの下流の配列、及び、 （ｃ）翻訳が所望のアミノ酸配列を有するタンパク質を生じるような正しい方向 及び読み枠で、コンカテマーオリゴヌクレオチドの挿入を可能とする前記翻訳開 始点の下流の制限部位、を含む、請求の範囲第３項記載の配列。 ６．請求の範囲第３項記載のポリペプチド発現生成物。 ７．正常な鎖の折りたたまれたクロスβシートの形態にある請求の範囲第６項記 載のポリペプチド発現生成物。 ８．クロスβシートの多重の整列したコピーの集合体の形態にある、請求の範囲 第６項記載のポリペプチド発現生成物。 ９．請求の範囲第６項記載の生成物の溶液。 １０．ヘキサフルオロイソプロパノール、ヘキサフルオロイソプロパノール／尿 素、ジクロロ酢酸、ギ酸、ギ酸／塩化リチウム及びトリフルオロ酢酸から成る群 より選はれた溶媒中、請求の範囲第９項記載の溶液。 １１．溶媒が、ヘキサフルオロイソプロパノール及びヘキサフルオロイソプロパ ノール／尿素から選ばれる、請求の範囲第１０項記載の溶液。 １２．フイルムとして使用される、請求の範囲第９項記載の生成物。 １３．非線形光学装置において使用される、請求の範囲第６項記載の生成物。１ ４．繊維として使用される請求の範囲第６項記載の生成物。 １５．（ａ）宿主バクテリアを請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列を含んで成る ベクターで形質転換し、 （ｂ）形質転換された宿主バクテリアを培養し、そして、（ｃ）タンパク質を回 収する、 ことを含んで成る所望のタンパク質を製造する方法。 １６．工程（ｂ）の後培養したバクテリアに誘導物質を加えることを含んで成る 、請求の範囲第１５項記載の方法。 １７．ベクターが、 （ａ）合成遺伝子の上流の強い条件つきプロモーター、（ｂ）合成遺伝子の翻訳 開始をシグナルするための手段を含有する前記プロモーターの下流の配列、及び 、 （ｃ）翻訳が所望のアミノ酸配列を有するタンパク質を生じるような正しい方向 及び読み枠で、コンカテマーオリゴヌクレオチドを挿入することを可能とする翻 訳開始点の下流の制限部位、を含有するｐＲＨＦ−１又はｐＲＨＦ−４である、 請求の範囲第１５項記載の方法。 １８．条件つきプロモーターが、バクテリオファージλＰＬプロモーター及びバ クテリオファージＴ７遺伝子１０プロモーターから選ばれる、請求の範囲第１７ 項記載の方法。 １９．宿主バクテリアが大腸菌株である、請求の範囲第１７項記載の方法。 ２０．宿主が、ｒｅｃＡ遺伝子について欠陥がある大腸菌である、請求の範囲第 １９項記載の方法。 ２１．宿主が、ＤＨ５Δｌａｃ及びＪＭ１０９から選ばれる、請求の範囲第２０ 項記載の方法。 ２２．宿主が、大腸菌株ＢＬ２１又はその誘導体である、請求の範囲第１７項記 載の方法。 ２３．プロモーターが、バクテリオファージλＰＬプロモーターである、請求の 範囲第１８項記載の方法。 ２４．宿主が、■ｃｌリプレッサー遺伝子を含有する、請求の範囲第２３項記載 の方法。 ２５．宿主が、大腸菌株ＯＲ１２６５である、請求の範囲第２４項記載の方法。 ２６．請求の範囲第６項記載の生成物の溶液。 ２７．請求の範囲第７項記載の生成物の溶液。 ２８．請求の範囲第８項記載の生成物の溶液。 ２９．液晶として使用される請求の範囲第２７項記載の溶液。