JPH06503647A - ヒトホスホリパーゼ活性化タンパク質および慢性関節リウマチの診断の方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトホスホリパーゼ活性化タンパク質および慢性関節リウマチの診断の方法 発明の分野 本発明は慢性関節リウマチを診断する方法の分野に関する。より詳しくは、本発 明はイムノアッセイを使用して慢性関節リウマチを診断する方法に関する。

発明の背景 慢性関節リウマチは、世界中の多数の患者に影響を与える、関節の病気の最もよ （知られた形態である。それは免疫担当細胞による関節および内部の器官の進行 性炎症および進行性病的状態および死亡を生ずる関節軟骨の破壊により特徴づけ られる。増加した量のエイコサノイドは器官および細胞培養物の両者におけるリ ウマチの関節滑液により生産され、そしてリウマチ滑液（ｒｈｅｕｍａｊｏｉｄ 　ｓｙｎｏｖｉｕｍ）の中においておよび影響を受けた患者の末梢血球から増大 したレベルで見いだされる。臨床的証拠は、早期の診断および細胞障害性および 免疫変調剤との介在はこの病気の過程を変更するために必須であることを示唆す る。

ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）は、脂肪分解であり、グリセロリン脂質の２− アシル脂肪酸エステルを加水分解し、こうしてアラキドン酸を解放する。アラキ ドン酸はある数の生物学的に活性な化合物に転化であることか示された。Ｐ　Ｌ 　Ａ　ｔは偏在し、そしていくつかの異なる遺伝子生産物の中に存在することが 示された。この酵素の膜結合形態および可溶性の形態の両者は記載されてきてい る。可溶性ＰＬＡ２の細胞外の分泌は１９８０年に最初に記載された。循環する ＰＬＡ２はエンドトキシンのショックに関係し、そしてそれ以来急性および慢性 の炎症反応に関係づけられた。

現在、慢性関節リウマチは患者の生理学的発現および制限された数の実験室の試 験に基づいて診断される。これらの試験のほとんどは一般化された情報を示し、 そして診断は累積的結果に基づいてのみ強化される。

より特異的であるように設計された実験室の試験のうちで、リウマチ因子の存在 はりウマチ因子の存在は真性の慢性関節リウマチの場合のほぼ７５％と相関関係 をもつことが示され、そして他の炎症の病気と区別する基準としてリウマチ因子 を確立する試みがなされてきている。しかしながら、リウマチ因子に基づくりウ マチ病の不正確な診断は、肝炎、サルコーシスおよび感染、ならびに他の炎症性 関節の病気、例えば、ライター症候群とともに起こる。さらに、６５歳を越えた 病気をもたない個体の少な（とも５％はリウマチ因子の存在について陽性と試験 される。

さらに、増大または抑制されたレベルはリウマチ病の再発または緩解のよく対応 しない。明らかなように、リウマチ因子は慢性関節リウマチの診断または予後に ついて感受性または特異的ではなく、そしてこの病気の診断および過程の追跡の ためのより感受性かつ特異的な方法が必要である。

こうして本発明の目的はこのような方法を提供することである。また、本発明の 目的は、この病気をもつ人における慢性関節リウマチを診断またはその過程を追 跡するための試験キットおよび試薬を提供することである。本発明の他の目的は 、慢性関節リウマチを診断またはその過程を追跡するために有用な核酸配列、ポ リペプチドおよび抗体を提供することである。なお他の目的は、慢性関節リウマ チの処置において有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび他の物質を提供 することである。

発明の要約 本発明は、新規なヒトホスホリパーゼＡ２活性化タンパク質（Ｐ　Ｌ　ＡＰ）を 提供する。本発明の新規なホスホリパーゼＡ２活性化タンパク質は、真性の慢性 関節リウマチを表す患者の滑液から分離された。本発明は、また、慢性関節リウ マチを診断またはその過程を追跡する方法、キット、および試薬を提供する。本 発明は、さらに、ＰＬＡＰをコードする核酸配列を提供する。

変形性関節症、プロトタイプの炎症性リウマチ病をもつ患者の滑液の中に見いだ されるレベルを越えた慢性関節リウマチの患者におけるこのタンパク質のレベル の増大の相関関係は８７％より大きい。さらに、このタンパク質のレベルはこの 病気の緩解および再発に相当するようである。対照的に、炎症性関節病の他の形 態、例えば、ライター症候群、および偽性通風または強直性を椎炎はＰＬＡＰレ ベルの増大を示さない。

ＰＬＡＰのアッセイは肝炎、サルコイド−シス、またはほとんどの感染により影 響を受けないようである。こうして、滑液および多分血清の中のＰ　Ｌ　Ａ　Ｐ のレベルは、リウマチ因子に関連する困難および不確実性なしに、慢性関節リウ マチの診断および監視のために使用することができる。

本発明は添付した請求の範囲の中によりとくに指摘されており、そして次の説明 においてその好ましい実施態様で記載する。

図面の簡単な説明 第１図は、ＰＬＡ！刺激活性について試験したＰＬＡＰ断片の実施例を示す。

第２図はＰＬＡＰのｃＤＮＡの配列を示す。最大のオーブンリーディングフレー ムの予測されたアミノ酸配列を、また、示す。予測されたアミノ酸配列は１（下 線が引かれているＡＴＧ）で開始する。メリチンとの最大の相同性を有する領域 は強調されかつ下線が引かれている。表８．９および１０において使用した相補 的アンチセンスＤＮＡは、ＡＴＧ後のコドン、１であるメチオニンで開始する２ 本の矢印の間でエンコードされる領域を使用して合成された。

第３図は、ヒト滑液からのＰＬＡＰの精製の間に抗メリチン親和クロマトグラフ ィーから集められたＰＬＡＰの分画のＰＬＡ２活性のグラフを示す。

第４図は、ヒト滑液からのＰＬＡＰの精製の間に大きさ排除カラムから集められ たＰＬＡＰの分画のＰＬＡｔ活性のグラフを示す。

第５図は、ヒト末梢血液の単球からの［３Ｈ］−アラキントン酸の代謝物質のＰ ＬＡＰ誘発された解放を示す。

発明の詳細な説明 本発明は、慢性関節リウマチを診断またはその過程を追跡するアッセイにおいて 有用な新規なヒトホスホリパーゼＡ２活性化タンパク質（ＰＬＡＰ）を提供する 。

本発明は、また、慢性関節リウマチを有することが疑われる人からの体液または 組織の試料を準備し、前記試料をホスホリパーゼＡ２活性化タンパク質に対して 特異的な抗体と接触させ、こうして前記抗体は前記試料の中のホスホリパーゼＡ ！活性化タンパク質と結合し、そして前記抗体を検出し、これによりホスホリパ ーゼＡ２活性化タンパク質の存在を示し、ここで慢性関節リウマチをもたない人 の中に見いだされるレベルと比較して前記試料の中のホスホリパーゼＡ２活性化 タンパク質のレベルの増加は、前記人における慢性関節リウマチの存在を示す、 工程からなる、慢性関節リウマチを有することが疑われる人の中のホスホリパー ゼＡ、活性化タンパク質のレベル増加を検出し、これにより前記人における慢性 関節リウマチの存在を示す方法を提供する。

本発明の他の実施態様は、ホスホリパーゼＡ！活性化タンパク質をコードする実 質的に精製された核酸配列を提供する。ウシ細胞から分離されたホスホリパーゼ Ａ２活性化タンパク質をコードする核酸配列は第２図に示されている。ＰＬＡＰ の予測されたアミノ酸配列がまた示されている。

本発明の他の実施態様は、ａ）体液または組織を固体の支持体に結合した抗メリ チン抗体または抗ホスホリパーゼＡ２活性化タンパク質抗体と接触させ、ここで 前記体液または組織の中のホスホリパーゼＡ２活性化タンパク質は前記抗メリチ ン抗体または抗ホスホリパーゼＡ２活性化タンパク質抗体と結合し、ｂ）結合し たホスホリパーゼＡ２活性化タンパク質を前記固体の支持体から溶離し、Ｃ）工 程すからの溶離されたホスホリパーゼＡ２活性化タンパク質を大きさ排除カラム に通過させ、そしてｄ）精製されたホスホリパーゼＡ２活性化タンパク質を集め る、工程からなる、体液または組織からヒトホスホリパーゼＡ２活性化タンパク 質を精製する方法を提供する。好ましい固体の支持体はシリカである。

溶離工程は好ましくは酢酸ナトリウムの緩衝液を使用して実施する。

本発明の他の実施態様は、哺乳動物の体液の試料をホスホリパーゼＡ２活性化タ ンパク質に対して特異的な抗体と接触させ、ここで前記抗体は前記体液または組 織の中のホスホリパーゼＡ２活性化タンパク質に結合し、そして前記抗体を検出 し、これにより前記体液または組織の中のホスホリパーゼＡ、活性化タンパク質 の存在を示す、工程からなる、哺乳動物の体液または組織の中のホスホリパーゼ Ａ２活性化タンパク質を検出する方法を提供する。検出工程は、さらに、結合し たホスホリパーゼＡ２活性化タンパク質に対して特異的な抗体を、前記結合した 抗体と結合可能な検出可能に標識した抗体と接触させ、そして前記検出可能な標 識を検出する、ことからなる。好ましい実施態様において、検出可能な標識はペ ルオキシダーゼであり、そして前記検出可能な標識の検出は前記ペルオキシダー ゼをＯ−フェニルジアミン基質と接触させ、そして基質生産物の光学密度を決定 することからなる。

本発明は、また、慢性関節リウマチおよび哺乳動物の体液または組織の中のホス ホリパーゼＡ２活性化タンパク質を検出する試薬およびキットを提供する。本発 明の試薬はホスホリパーゼＡ、活性化タンパク質に対して特異的な抗体および担 体または希釈剤からなる。本発明のキットは、ホスホリパーゼＡ２活性化タンパ ク質に対して特異的な抗体をその上に結合してを有する固体の表面、ホスホリパ ーゼＡ２活性化タンパク質に対して特異的な抗体および担体または希釈剤からな る少なくとも１種の試薬、および前記抗体を検出する手段、からなる。

本発明は、さらに、哺乳動物細胞をホスホリパーゼＡ２活性化タンパク質のホス ホリパーゼＡ２活性化タンパク質合成抑制配列をコードするアンチセンスの核酸 配列と接触させ、ここで前記アンチセンスの核酸配列はホスホリパーゼＡ２活性 化タンパク質の合成を抑制する、からなる、哺乳動物細胞の中のホスホリパーゼ Ａ２活性化タンパク質の合成を抑制する方法を提供する。アンチセンス配列はＤ ＮＡまたはＲＮＡとして調製することができる。

本発明の他の実施態様は、哺乳動物にＰＬＡＰの少なくとも一部分をコードする アンチセンスの核酸配列のＰＬＡＰ合成抑制量を投与することからなる、哺乳動 物、好ましくはヒトの慢性関節リウマチを処置する方法を提供する。

関節」―の慢性関節リウマチの破壊的作用は、アラキドン酸から誘導されるエイ コサノイドの生産の増大に関連する。増加した量のエイコサノイドは器官および 細胞培養物の両者におけるリウマチ滑液により生産され、そしてリウマチ滑液の 中においておよび影響を受けた患者の末梢血球から増大したレベルで見いだされ る。

現在、慢性関節リウマチを有する人はエイコサノイドの生産を抑制する非ステロ イドの抗炎症性薬物で処置される。エイコサノイドの生合成における速度制限段 階は、ホスホリパーゼ酵素により膜のリン脂質からのアラキドン酸の解放である ので、ＰＬＡＰによるアラキドン酸の解放の活性化はその生合成の前駆体を利用 可能とすることによってエイコサノイドの合成を効果的に増加するであろう。こ うしてＰ　Ｌ　Ａ　Ｐは慢性関節リウマチの効果の重要な仲介因子であるように 思われる。

ＰＬＡＰはエイコサノイドの解放および関節の炎症の刺激を誘発することを出願 人は発見した。エイコサノイドの解放のＰＬＡＰの誘発を証明するために、標識 したアラキドン酸で前以て負荷した正常のヒト末梢血液の単球をＰＬＡＰで刺激 した。アラキドン酸の代謝物質の有意の解放が観察された。非標識細胞の特定の 代謝物質のラジオイムノアッセイは、解放される主要な代謝物質としてプロスタ グランジンＥ、を示した。

ＰＬＡＰは、また、ロイコトリエンＢ４およびプロスタグランジンＥ２の解放を 刺激した。

炎症性関節形成の応答のＰＬＡＰの刺激は、精製されたＰＬＡＰのウサギの膝関 節の中への注射により検査した。ＰＬＡＰは、細胞の浸潤および関節破壊を伴う 炎症性関節症の仲介において投与量一応答の関係を有することが発見された。

ヒト関節において見いだされるＰＬＡＰの細胞源を決定するために、慢性関節リ ウマチまたは変形性関節症の患者から中手指節関節および膝関節の検体を入手し 、そして抗ＰＬＡＰ抗体を使用する免疫組織化学的染色を実施した。試験したす べての６人の慢性関節リウマチの患者は強い染色を示した。変形性関節症の患者 から入手した検体では染色は観察されなかった。顕微鏡検査は、滑液の単球、マ クロファージ、および多核化巨細胞の高度のの染色明らかにし、脈管の平滑筋お よび内皮細胞の多少の追加の染色があった。同様な結果はりウマ千小節において 観察された。変形性関節症の滑液は、顕微鏡検査下でさえ、ＰＬＡＰの染色を明 らかにしなかった。免疫前の抗血清を使用していずれの検体の型においても染色 は観察されなかった。

慢性関節リウマチ病の存在および段階の関数としてＰ　Ｌ　Ａ　Ｐの存在を定量 するために、慢性関節リウマチの患者、正常の健康なボランティア、および他の 型の関節炎または関節病の患者から抜き出した滑液試料の広いスペクトルについ てＥＬＩＳＡアッセイを実施した。慢性関節リウマチの患者からの検体は、健康 な滑液または変形性関節症の患者からの滑液の平均４．３倍のＰＩ、ＡＰレベル の増加を示した。アッセイの検出限界内で、慢性関節リウマチの患者の滑液の８ ７％は増大したＰＬＡＰレベルを示した。ＰＬＡＰレベルの増大は慢性関節リウ マチの患者において検出され、そして活性化タンパク質のレベルの増加は病気の ひどさに関連した（ｐ＜０．０５）。

Ｐ　Ｌ　Ａ　Ｐは、多分５ｎ−２脂肪酸としてアラキドン酸を好むメリチンのよ うに、ホスファチジルコリンの脂肪分解について選択的なＰＬＡ。

活性のサブセットに対して生化学的親和性を有することを、出願人は発見した。

事実、ＰＬＡＰの特異性はとくに慢性関節リウマチに関係する。

なぜなら、ホスファチジルコリンおよびリソホスファチジルコリンは炎症性滑液 および慢性関節リウマチの患者から吸引された滑液の中の主要なリン脂質である からである。

１０００００ＰＬＡＰ単位の注射に関連する広範な組織の壊死および出血は、メ リチンの注射で他の実験系において観察されたものに類似する（Ｋｕｒｉｈａｒ ａ　Ｃｅ１ｌ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｒｅｓ、（１９８６））。

４０００００単位を越えるＰＬＡＰが慢性関節リウマチの患者からの１０ｍ１程 度に少ない滑液から回収することができたので、病理生理学的濃度のＰ　Ｌ　Ａ 　Ｐがこの病気において重要な役割を演することは明らかである。

Ｉ製されたヒトＰ　Ｔ−Ａ　Ｐは、ＳＤＳゲル電気泳動により決定して、約２８ ．０００の見掛けの分子量を有する。ＰＬＡＰは、ヒト滑液またはこのタンパク 質を含有する他のヒト体液または組織から固定化された抗メリチン抗体またはＰ ＬＡＰに対して特異的な抗体を使用する親和クロマトグラフィーおよび引き続く 大きさ排除ゲル、好ましくはシリカゲルを使用する高圧液体クロマトグラフィー （ＨＰＬＣ）　、または任意の他の普通の方法、または実質的に精製されたＰＬ ＡＰを生ずるタンパク質の分離法の組み合わせにより、精製することができる。

ヒト滑液からＰＬＡＰを分離する好ましい方法は、実施例において詳細に記載す る。ＰＬＡＰは好ましくは慢性関節リウマチの患者の関節滑液から分離される。

なぜなら、ＰＬＡＰのレベルはこれらの人においてより高いからである。

しかしながら、慢性関節リウマチではない人からの滑液も適当であるが、慢性関 節リウマチでない人の滑液の中のＰＬＡＰの量は比較的少ないので、大量の滑液 を必要することがある。タンパク質を分離する親和クロマトグラフィー、高圧液 体クロマトグラフィーおよび他の方法はこの分野における科学文献および標準の テキオ、例えば、５ｃｏｐｅｓ、Ｒ。

第２版、Ｐｏｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、＝ニーヨーク州−ユーヨーク、１９ ８７の中に見いだされる。

天然源からの精製に加えて、ＰＬＡＰはまた組み換えＤＮＡ技術を使用して得る ことができる。ＰＬＡＰをコードする核酸配列は、哺乳動物細胞から、次のよう にして得るすることができる。ＰＬＡＰの開始または末端部分の配列を有する核 酸プライマー（ヒトまたは他の種）およびポリメラーゼ連鎖反応の手順を使用し て核酸を増幅し、次いで増幅された核酸をクローニングベクター、例えば、ラム ダｇｔｌｌの中に挿入し、引き続いて増幅された配列を発現ベクターおよび宿主 細胞の中に挿入し、モしてＰ　Ｌ　Ａ　Ｐに対して特異的な抗体を使用してＰＬ ＡＰをコードする配列についてスクリーニングする。ＰＬＡＰをコードする核酸 配列は、また、哺乳動物細胞からのＤＮＡライブラリー（ゲノムまたはｃＤＮＡ ）を、次の後のに記載されているように、配列について、あるいは−緒になって Ｐ　Ｌ　Ａ　Ｐの全体の配列をコードする短い配列についてスクリーニＬ３１戊 −四、ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　 Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、＝ニーヨーク州コールド・ スプリング・ハーバ−１１９８９，ＰＬＡＰｔ−コードする核酸配列を分離する 好ましい方法は実施例の中に記載されている。ＰＬＡＰの分離のために好ましい 細胞系はＢＣ３Ｈ１であり、これはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ ョン（Ａｍｅ　ｒ　ｉ　ｃ　ａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔ ｉｏｎ）から入手することができるネズミ平滑筋様脳腫瘍細胞系である（受は入 れ番号ＣＲＬ１４４３）。ＢＣ３Ｈ１細胞系の代替物として、他の型の哺乳動物 細胞および細胞系、例えば、ヒト細胞および細胞系をＰＬＡＰをコードする核酸 配列の分離のために使用することができる。任意の源から分離されたＰＬＡＰを コードする核酸は本発明の範囲内であり、そしてここに記載する本発明の目的に 適する。

免疫原活性またはＰＬＡ２刺激活性を有するＰＬＡＰの断片または下位部分は、 また、本発明の範囲内である。免疫原活性を有するＰＬＡＰの断片は、担体のタ ンパク質に接合されているか否かにかかわらず、ＰＩ、ＡＰに対して特異的な抗 体の生産のための抗原として働くことができる任意の大きさのＰＬＡＰの断片を 包含する。ここにおいて使用するとき、ＰＬＡ２活性化活性、ＰＬＡ２刺激活性 および同様な用語は、ここに記載するＰ　ＬＡ２活性化アッセイにおいて対照の 中に見いだされる内因性ＰＬＡ２活性のレベルより上のレベルにＰＬＡ２活性を 増加することを呼ぶことを意図する。こうして、ＰＬＡＰのＰＬＡ、刺激または 活性化部分は、ＰＬＡ２の活性を内因的見いだされるものより上のレベルに刺激 する部分である。

ＰＬＡＰの断片は、ＰＬＡＰより少ないアラキドン酸を有するポリペプチドまた はペプチドを包含する。ＰＬＡＰの好ましい断片は約６〜約３０アミノ酸の長さ 、より好ましくは約２６アミノ酸の長さである。ＰＬＡＰの断片は、好ましくは 、断片のアミノ酸配列がメリチンと相同性の配列の少なくとも一部分を含有する ように選択される。メリチンは、ホスホリパーゼ活性化活性を有する蜂の毒液の 中に見いだされる２６アミノ酸を含有する低分子量のペプチドである。

ＰＬＡＰのアミノ酸配列は、アミノ酸１３１および１３２、アミノ酸１９１−１ ９３、およびアミノ酸２６０−２８０付近の領域においてメリチンとの有意の配 列の相同性を示す。メリチンのアミノ酸配列およびＰＬＡＰの予測されたアミノ 酸配列は、ライスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）データベースのソフトウェア （ＧＣＧ）を使用して比較された。

メリチンのアミノ酸配列およびＰＬＡＰのアミノ酸２６０−２８０の比較は表１ に示されている。現在、これらの領域の１つの中にアミノ酸配列の少なくとも一 部分を含有するように選択したＰＬＡＰの断片は好ましく、より好ましくは断片 はこれらの領域の１つの中にアミノ酸の少なくとも半分ないしすべてを含有する 。断片は出発点として前述の相同性領域の１つを使用腰そしてアミノ酸の所望の 数についてＰＬＡＰのアミノ末端またはカルボキン末端のいずれかに向かって進 行し、そして対応するアミノ酸配列を有する断片またはペプチドを構成すること によって選択することができる。変化する長さのペプチドの例は表１の中に見い だすことができる。これらのペプチドはメリチンとの相同性を有するＰＬＡＰの 領域から選択した。この区域から選択した断片（またはペプチド）は表２に示す ようにＰＬＡ２刺激活性を有することを、出願人は発見した。また、現在、好ま しい断片はＰＬＡ２刺激活性の最大量を有するものである。ＰＬＡ、刺激活性を 有する前述の区域の外側で選択されたＰＬＡＰの断片は、また、本発明の範囲内 である。ＰＬＡＰのアミノ末端またはカルボキシ末端の配列を有する２６アミノ 酸の長さのペプチドを試験したが、ＰＬＡ、刺激活性をもっこは発見されなかっ た。

Ｐ　Ｌ　Ａ　Ｐの断片は、化学的合成、組み換えＤＮＡ技術、およびＰＬＡＰの 消化を包含する、任意のペプチドの調製方法により調製することができる。断片 またはペプチドの化学的合成は、調製の便利さのために、現在好ましい。断片ま たはペプチドは、ペプチドまたはタンパク質を合成する任意の便利な方法により 合成することができる。

表１ 表２ ペプチド　ホスホリパーゼＡ２活性化活性＋＋は対照のほぼ５倍のＰＬＡ２刺激 活性を示す：＋は対照と比較したときＰＬＡ、活性のほぼ２〜５倍の刺激を示す ：士および士士はＰＬＡ。

刺激活性について確定しない結果を示す；−はＰＬＡ！刺激活性の不存在を示す 。

ここに記載するようにネズミＢＣ３Ｈ１細胞系から分離されたＰＬＡＰをコード する核酸配列は、第２図に示されている。担体のタンパク質に接合されているか 否かにかかわらず、ＰＬＡＰに対して特異的な抗体の生産のための抗原として働 くすることができるＰＬＡＰの断片、部分または誘導体をコードするか、あるい はＰＬＡＸ刺激活性を有するＰＬＡＰの部分をコードする、配列からの断片、サ ブ配列、塩基の付加および欠失は、また、本発明の範囲内に包含される。

慢性関節リウマチを診断しかつその過程を追跡するために、滑液を慢性関節リウ マチを有することが疑われる患者の少なくとも１つの影響を受けた関節から取り 出す。次いで滑液を試験して、慢性関節リウマチを意味するＰ　Ｌ　Ａ　Ｐのレ ベルの増大の存在について検出する。滑液は、本発明他の実施態様において、こ こに記載するイムノアッセイを使用して試験する。本発明のイムノアッセイは患 者の他の症状と組み合わせて使用して、この病気を診断することができる。一般 に、医師が人を検査しそ１７てその人がその生理学的症状に基づいて慢性関節リ ウマチを有すると推測した後、イムノアッセイは医師または他の訓練された医学 的人員により実施されるであろう。慢性関節リウマチの症状は医師にとってよ（ 知られている。いったん医師がその人が慢性関節リウマチを有すると推測したと き、本発明のイムノアッセイを実施してその人における病気の存在を受けいるか 、あるいは除外することができる。慢性関節リウマチの生理学的発現は、時には 、他の病気、例えば、変形性関節症、偽性通風、および血清反応陰性を椎関節症 と区別することが困難である。本発明のイムノアッセイを使用すると、医師はこ の病気を正しく診断し、そして適当な処置を処方することができるであろう。こ うして、本発明のイムノアッセイは、また、この病気を有することが疑われる人 における慢性関節リウマチの存在を除外するために有用である。

正常のヒト、および他の哺乳動物の滑液はＰＬＡＰを含有するので、Ｐ　Ｌ　Ａ 　Ｐのレベルの増大を決定するために、ＰＬＡＰの基線またはバックグラウンド を決定し、そして慢性関節リウマチをもたない健康な人におけるＰ　Ｌ　Ａ　Ｐ の存在を考慮して本発明のイムノアッセイの特定の実施態様を目盛り定めするこ とが必要であろう。例えば、慢性関節リウマチをもたない人の試料中のＰ　Ｌ　 Ａ　Ｐの濃度を決定し、そして慢性関節リウマチを有することが疑われる人から の試料の中に見いだされるＰＬＡＰの量と比較するために使用する。慢性関節リ ウマチを有することが疑われる人からの試料の中のＰＬＡＰの量が健康の人にお いて見いだされる基線またはバックグラウンドのレベルより大きい場合、増加し た量はその人における慢性関節リウマチの存在を示すであろう。同様に、ＰＬＡ Ｐのレベルの増大についての値を慢性関節リウマチを有することが知られている 人を試験することによって目盛り定めして、本発明のイムノアッセイの特定の実 施態様のためのＰＬＡＰの増大したレベルを決定することができる。例えば、普 通に使用されている検出可能な標識、例えば、酵素は、異なる波長における分光 分析により検出される、種々の比色基質を使用する。結果は典型的にはある波長 における光学密度として読まれる。こうして、Ｐ　Ｌ　Ａ　Ｐの基線の量は、健 康な人の滑液を試験するとき存在する光学密度として確立されるであろう。レベ ルの増大は同様な方法において確立される。いったん基線のレベルおよび増大し たレベルが確立されると、患者の結果の意味は日常的に確立される。慢性関節リ ウマチを有することが疑われる人からの試料の中のＰ　Ｌ　Ａ　Ｐのレベルはを 本発明のイムノアッセイを使用して決定し、そして結果を基線、および可能なら ばイムノアッセイの増大したレベルと比較する。試料が増大したレベルのＰＬＡ Ｐを含有する場合、その人は慢性関節リウマチを有する可能性が非常に高い。レ ベルが増大したレベルと基線のレベルとの間に入る場合、慢性関節リウマチの診 断は可能ではなであろう。特定の型のイムノアッセイのために目盛り定めするこ とに加えて、特定の型の組織についてＰＬＡＰの基線および増大したレベルを確 立することが必要であることがある。すべてのこのような操作は本発明の範囲内 に包含される。

慢性関節リウマチの患者からの滑液は、正常の患者の関節からの滑液と比較する か、あるいは慢性関節リウマチの患者からの血清と比較したときでさえ、非常に 高いレベルのＰＬＡＰ活性を含有する。対照的に、炎症した変形性関節症の関節 からの滑液は、わずかに増大したレベルのホスホリパーゼ活性を示すだけである 。

また、本発明のイムノアッセイを使用して、慢性関節リウマチの過程を追跡する ことができる。慢性関節リウマチは現在治癒しない長期間の慢性病であるので、 この病気を処置するとき使用する治療剤の有効性を決定し、そして可能ならば症 状の再発または緩解を決定するアッセイを有することは有用であろう。したがっ て、本発明のイムノアッセイを前取て決定した間隔で、あるいは必要に応じて医 師または患者が実施して、この病気を有する人の滑液の中のＰＬＡＰのレベルを 決定することができる。滑液の中のＰＬＡＰのレベルはこの病気の状態を示すで あろう。

滑液または他の体液または組織は、本発明のイムノアッセイの実施を妨害しそし て使用前に除去することが必要である成分を含有することがある。滑液はイムノ アッセイにおける使用前に好ましくは遠心し、そして清浄にした滑液を使用する 。同様に、体の組織を使用するとき、組織を好ましくは小片に、例えば、ブレン ダー内で粉砕し、次いで遠心して組織片を分離し、モして」二澄み液を本発明の イムノアッセイにおいて使用する。

本発明のイムノアッセイは普通のイムノアッセイのフォーマット、例えば、抗体 の捕捉、抗原の捕捉、または２抗体のサンドイッチアッセイを使用して実施する ことができる。イムノアッセイのフォーマットは標ｕａｌ）、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ。

ｒｙ、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク州、１９８８、の中の見 いだすすることができる。好ましいイムノアッセイにおいて、ＰＬＡＰを含有す ることが疑われる滑液はマルチ−ウェルのマイクロタイタープレートの中に入れ る。次いで、Ｐ　Ｌ　Ａ　Ｐに対して特異的な抗体を、存在する場合ＰＬＡＰを 含む、滑液の成分と接触させる。次いで、結合した抗体をＰＬＡＰに対して特異 的な抗体と結合することができる第２の検出可能に標識した抗体と接触させ、そ して検出可能な標識を検出し、これにより滑液の中のＰＬＡＰの存在を意味づけ る。あるいは、抗ＰＬＡＰ抗体をマイクロタイタープレートのウェルの中に入れ 、そして滑液をその抗体と接触させ、ここで滑液の中のＰＬＡＰは入れられた抗 体に結合するであろう。次いで、結合したＰＬＡＰは、検出可能に標識した抗Ｐ ＬＡＰ抗体を結合したＰＬＡＰに結合させ、引き続いて検出可能な標識を検出す ることによって検出することができる。他のイムノアッセイは、前述の分野にお ける標準のテキストを参照することによってＰＬＡＰを検出するように容易に設 計することができる。ここにおいて使用するとき、用語の抗体は抗体、およびＰ ＬＡＰに結合することができる抗体の断片または部分を意味することを意図する 。

イムノアッセイは、また、組織、例えば、関節の組織の中のＰＬＡＰの存在をそ の場で検出するために使用できる。組織の検体は組織を準脩する普通の方法に従 い獲得しそして調製することができる。次いで、ＰＬＡＰに対して特異的な抗体 を調製した組織と接触させ、ここで抗体は組織の中のＰＬＡＰを結合する。次い で、結合した抗体を検出する。

本発明のイムノアッセイにおいて使用するために適当な検出可能な標識は、酵素 、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼ、 放射性標識、例えば、１２３７および３２Ｐ１およびビオチン系、ラテックス粒 子、電子の密な物質、例えば、フェリチン、光散乱性物質、例えば、金を包含す る。本発明のイムノアッセイにおける中に見いだすことができる。検出可能な標 識の検出に適当な方法は、シンチレーションカウンティング、オートラジオグラ フィー、蛍光の測定、比色測定、または光放射の測定を包含する。

こうして、標識は次のものからなることができる・放射性標識（例えば、１４ｃ 、３２ｐ、３Ｈなど）、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファ ターゼまたは酸性ホスファターゼなど）、バクテリアの標識、蛍光性標識、抗体 （これは二重抗体系において使用することができる）、抗原（標識した抗体とと もに使用する）、小さい分子、例えば、ビオチン（アビジン、ストレプトアビジ ン、または抗ビオチン系とともに使用する）、ラテックス粒子（浮遊またはラテ ックスの凝集系において使用する）、電子の密な化合物、例えば、フェリチン（ 電子顕微鏡検査とともに使用する）、または光散乱粒子、例えば、コロイド状金 、またはそれらの任意の組み合わせまたは序列。

本発明のイムノアッセイの実施が容易であるように、イムノアッセイはキットの 形態で準備することができる。本発明のキットは、固体の表面、例えば、マルチ −ウェルのタイタープレート、ニトロセルロースのストリップ、組織培養プレー トまたはＰＬＡＰまたは抗ＰＬＡＰ抗体を含有するか、あるいは結合するための 他の装置、およびＰＬＡＰを検出するための１種または２種以上の試薬からなる 。キットは、また、標準または対照のための１種または２種以上の試薬からなる ことができる。

例えば、好ましい実施態様において、キットは滑液の試料を入れるためのマルチ −ウェルのプレート、ＰＬＡＰに対して特異的な抗体からなる試薬、ＰＬＡＰに 対して特異的な抗体と結合可能な酵素標識した抗体からなる試薬、および酵素の ための基質からなる試薬からなることができる。本発明のキットは、ＰＬＡＰの 検出に使用するイムノアッセイのフォーマットに従い変化するであろう。イムノ アッセイを液体の中で実施する場合、キットはこのアッセイを実施する１または ２以上の容器、およびＰＬＡＰを検出する１または２以上の試薬からなることが できる。

本発明の試薬はＰＬＡＰまたはそのＰＬＡＩ刺激部分に対して特異的な抗体およ び担体または希釈剤からなる。適当な担体または希釈剤は水、生理的食塩水また は他の緩衝液を包含する。試薬は、また、保存剤または安定剤を含むことができ る。本発明の試薬は、例えば、試薬を凍結乾燥した場合におけるように、担体ま たは希釈剤を使用しないで供給することができる。次いで、適当な量の担体また は希釈剤を試薬の使用前に添加する。

ＰＬＡＰまたはＰＬＡＰの断片に対して特異的なポリクローナル抗体およびモノ クローナル抗体は、この分野における標準の技術、例えば、の分野における他の 標準のテキストの中に見いだすことができる技術により調製することができる。

ポリクローナル抗体を調製するために、精製したＰＬＡＰ、組み換えＤＮＡ技術 により生産されたＰＬＡＰ　（ｒＰＬＡＰ）または精製したＰＬＡＰまたはｒＰ ＬＡＰの断片を動物、例えば、ウサギ、またはマウスに注射する。次いで、ＰＬ ＡＰまたは断片に対して応答して動物により生産された抗体を動物のドメインか ら精製する。精製されたＰＬＡＰまたはｒＰＬＡＰの形成のあるものは動物にお いて強い免疫応答を生産するために十分に大きくないことがあるので、それらは 担体のタンパク質、例えば、キーホールリンベットヘモシアニンまたはウシ血清 アルブミンの接合した後動物に注射することができる。

モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉ　ｌ５ｔｅｉｎＳＮａｔｕｒｅ 　λ１旦・４９５−４９７　（１９７５）の方法を使用するが、あるいはこの分 野における標準のテキスト、例えば、Ｈａｒｌｏｗおよび実験 材料および方法 放射性材料はニュー・イングランド・ニュークリアー（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ 　Ｎｕｃｌｅａｒ）（マザチュセソツ州ボストン）から購入した。組織培養培地 および血清はへイゼルトン（）（ａ　ｚ　ｅ　ｌ　ｔ　ｏｎ）（ペンソルベニア 州デンバー）から購入した。組織培養プレート、プロテアーゼインヒビターおよ びデオキシコレートはシグマ（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）（ミゾリー州セントルイス）か ら購入した。薄層クロマトグラフィーのプレートはアナルテク（Ａｎａｌｔｅｃ ｈ）（プラウエア州ネヮーク）から購入した。真性のリン脂質の標準はアバンチ ・リピッヅ（Ａｖａｎｔｉ　Ｌｉｐｉｄｓ）（アラバマ州バーギンガム）がら購 入した。タンパク質の決定はバイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の指示（カリフォ ルニア州すッチモンド）に従いブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）の方法に 従い実施した。ペルオキシダーゼ接合ヤギ抗つサギＩｇＧ抗体はカッベル（Ｃａ ｐｐｅｌ）（ペンシルベニア州マルバーン）から購入した。

抗アクチン抗体はアマ−ジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）（イリノイ州アーリントン ハイソ）から購入した。シンチレーション流体およびシリカに基づく親和性支持 体はベックマン・インスッルメンツ（Ｂ　ｅ　ｃ　ｋｍａ　ｎＩｎｓｒｕｍｅｎ ｔｓ）（カリフォルニア州フラートン）から購入した。合成メリチンはペンスッ ラ・ラボラトリーズ（Ｐｅｎｎｉｎｓｕｌａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（カ リフォルニア州ベルモント）から購入した。ヨード−ビーズはピアース（Ｐｉｅ ｒｃｅ）（イリノイ州ロンクフォード）から購入した。

患者 すべての慢性関節リウマチの患者は、アメリカン・リウマチズム・アソシエーシ ョン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ　Ａｓｓ。

ｃ　ｉａｔ　１ｏｎ）（Ｒｏｐｅｓ　（１９６８）Ｂｕｌ　１．Ｒｈｅｕｍ、Ｄ ｉ　ｓ、９　：　１７５−１７６）により規定された明確なまたは古典的な症状 を表した。病気の程度は、５ｔｅｉｎｂｒｏｃｋｅｒら（１９４９）ＪＡＭＡ　 １４０：６５９−６６２の標準のレントゲン写真および臨床的基準により評価し た。慢性関節リウマチの進行は、レントゲン写真の検査で破壊の変化なしの基準 で段階１または早期として定めた。段階２または中程度の病気は、関節の変形な しのオステオポローシスのレントゲン写真の証拠として定めた。段階３または重 度の病気は、関節の変形を伴う軟骨および骨の破壊のレントゲン写真の証拠に基 づいて定めた。

段階４または終末の病気は線維または骨性強直に基づいて定めた。機能的能力は 完全な機能的能力をもつクラス１として定め、クラス２は不快なまたは制限され た移動性にかかわらず正常の活動の実施に適切な機能的能力として定め、そして クラス３は仕事または通常の生活の日常の仕事に関連する活動をほとんどあるい はまった〈実施することができないとして定めた。クラス４は完全の不動化とし て定め、患者は寝たきりか、あるいは車椅子の拘束された。変形性関節症（非炎 症性関節炎）および他の関節症の対照の患者は、また、アメリカン・リウマチズ ム・アソシエーション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ　Ａｓ５ｏｃ ｉａｔｉｏｎ）の基準（Ｈｕｔｈ　（１９８６）Ａｎｎ、Ｉｎｔｅｒｎ、Ｍｃｄ 、１０２：５５３、を満足した。正常のボランティアをまた使用し、そして処方 または他の薬物を与えられなかった。

表３は慢性関節リウマチの屯者の臨床的特性を示す。

年齢（年）　５３．５±１４．１ 性　２８人の男性、２８人の女性 病気の期間（月）　１１０．６±１１３．７滑液ＷＢＣ（細胞／ｍｍ３）　２４ ．６２０±６６３３ＮＳＡＩＤ　Ｓ３あり Ｉ）ＭＡＲＤ　３７あり プレドニゾン　１８あり Ｗｅｓｔｅｒｇｒｅｎ沈降速度　５４．５±３９リウマチ因子（力価）　１　： １４０５Ａ　Ｃ，Ｒ，基準の数　８．１±１．１進行の段階　２．２±０．８ 機能のクラス　２．５±０．６ ＊５６人の患者からの滑液試料を検査した。略号はＮ５ＡＩＤ（非ステロイド抗 炎症薬物）　、ＤＭＡＲＤ　（病気変更抗リウマチ薬物）およびＡＣＲ（Ａｍｅ ｒｉｃａｎ　ＣｏＣｏ１１ｅ　ｏｆ　Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ）である。プレ ドニゾンのすべての患者は１０ｍｇ／日以下であった。１４人の患者はリウマチ 因子が陰性であった。リウマチ因子が存在した患者における平均のリウマチ因子 の力価は１：６４０であったが、すべての陽性の患者の平均は１　：１４０５で あった。Ａ、Ｃ，Ｒ，の基準および進行の段階および機能のクラスは前述した通 りであった。

滑液 滑液はアルトリチス・センター・クリニカル・ラボラトリーズ（Ａｒｔｈｒｉｔ ｉｓ　Ｃｅｎｔｅｒ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔ。

ｒｉｅｓ）（Ｖｅｔｒｔａｎｓ　Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉｃａ ｌ　Ｃｅｎｔｅｒ、ペンシルベニア州フィラデルフィア、およびＲｈｅｕｍａｔ ｏｌｏｇｙ　ＤｉｖｉｓｏｎｌＢｏｗｍａｎ　Ｇｒｅｙ　５ｃｈｏｏｌ　ｏｆ　 Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、ノースカロライナ州つィンストンーサレム）から、白血球の 計数、ダラム染色法、および偏光顕微鏡検査後に、入手した。滑液を遠心して細 胞を除去し、そして−７０℃で貯蔵した。

Ｐ　Ｌ　Ａ　Ｐ活性の定義 親和クロマトグラフィーまたは他のクロマトグラフィーの工程の間に集められた 分画を、Ｃ１ａｒｋ　Ｍ、Ａ、ら（１９８７）Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、λ６２　：　４４０２−４４０６　（その開示の全体をここに引用に よって加える）に記載されているようにアッセイした。各分画の２０μｍのアリ コートを、３回の反復実験において、ヒトＵ９３７細胞不含超音波処理物の中で 内因性ホスホリパーゼＡ２　（Ｐ　ＬＡｔ）およびホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ） の活性について、および対照より上にＰＬＡ２活性を刺激する能力についてアッ セイした。Ｐ　Ｌ　Ａ　Ｐ刺激活性は、細胞不含超音波処理物で観察された活性 と各個々の分画について観察された内因性活性との間の差として定義した。刺激 活性の１単位は、Ｕ９３７細胞不含超音波処理タンパク質の１ｍｇ当たりの測定 されたＰＬＡ２活性の２倍増加を生成するために要求されるＰＬＡＰの量として 定義した。

滑液から精製されたＰＬＡＰは、−７０℃において数週間安定であり、そして活 性の損失なしに３回凍結および融解することができた。

ホスホリパーゼのアッセイ ホスホリパーゼＡ？　（Ｐ　ＬＡ２）およびホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）の活性 を、次の文献に記載されているようにして放射能測定的に定量した：ＣＩａｒｋ 　Ｍ、Ａ、ら（１９８７）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６２１０７１３−１０７ １８；Ｂｏｍａｌａｓｋｉら（１９８５）Ｊ。

ｒｋら（１９８６）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、λ６１　：１０７１３−１０７１ ８、それらの開示の全体をここに引用によって加える、ただし反応を２００ｍＭ のトリスｐＨ９，０で緩衝化したことを除く。ＰＬＡ。

およびＰＬＣについて、それぞれ、リソリン脂質の形成およびジグリセリドの発 生を測定した。

ＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイ ２０μｌ／ウエルの滑液をマイクロタイタープレートのウェルの中に入れ、次い で各ウェルを２０％の胎児仔ウシ血清を含有するリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）で容 量に充填する。次いでプレートを４℃において一夜インキユベーションした。ウ サギ抗メリチンまたは抗ＰＬＡＰ　（組み換えまたは精製したタンパク質または その断片）抗体をＰＢＳの中で１−１０００に希釈し、そして５０μｌ／ウエル を添加した。対照実験について、抗アクチン抗体を１−１０００に希釈して抗メ リチン抗体または抗Ｐ　Ｌ　Ａ　Ｐ抗体の代わりに使用した。抗アクチン抗体ま たは免疫前の抗血清のいずれも、正常のボランティアまたは関節炎の患者からの 滑液と免疫陽性反応を示さなかった。抗体との一夜インキュベーション後、プレ ートをさらに室温において１時間インキュベーションし、次いでＰＢＳで３回（ 各々５分）すすいだ。次いで５０μＩのペルオキシダーゼ接合ヤギ抗ウサギ抗体 （ＰＢＳ中で１−５０００に希釈した）を各ウェルに添加し、次いで室温におい て１時間インキュベーションし、そして３回洗浄（各々５分）した。０−フェニ レンジアミン（ペルオキシダーゼの基質）を添加しく０．１Ｍのクエン酸塩緩衝 液、ｐＨ４，５，０，１２％の８２０２溶液の中の１ｍｇ／ｍｌの１００μｌ） そして１０分間反応させた。各ウェルに２５　ｔｔ　ＩのＮａＦ　（０，１Ｍ） の添加により反応を停止させた。各についての吸収をタイターチク・マルチスキ ャン（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ　Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ）ＭＣ型（フィンランド国ヘルシ ンキ）ＥＬＩＳＡプレートのリーダーで４８９０ｎｍにおいて決定した。

抗メリチン抗体または抗ＰＩ、ＡＰ抗体は、相補的カスケード成分を含む、他の 分子と交差反応しなかった。

慢性関節リウマチ病の存在および段階の関数としてＰＬＡＰの存在を定量するた めに、慢性関節リウマチの患者、正常の健康なボランティア、および他の形態の 関節炎または関節病の患者から抜き出した滑液の試料の広いスペクトルについて ＥＬＩ　ＳＡアッセイを実施した。このデータを表４に要約する。示すように、 慢性関節リウマチの患者からの検体は、健康の滑液または変形性関節症の患者か らの滑液を越えたＰＬＡＰのレベルの平均４．３倍の増加を示した。このアッセ イの検出限界内で、慢性関節リウマチの患者の滑液の８７％はＰＬＡＰのレベル の増大を示した。Ｐ　Ｌ　Ａ　Ｐのレベルの増大は慢性関節リウマチの患者にお いて検出され、そして活性化タンパク質のレベルの増加はこの病気の程度に関連 下（ｐ＜０．０５）。

リウマチ様　３２　１．８８±１．１９　−−変形性関節症　１２　０．４４± ０．６２　０．０５偽性通風　５　０．２０士１尋４　０．０５血清反応陰性 を椎関節症　５　０．２８＋０．６８　０．０５＊光学密度（ｏ、ｄ、　）とし て表した。

ＢＣ３Ｈ１平滑筋細胞を使用する実験のために、細胞を９６ウエルのプレートの 中で７５％のコンフルエンシーに２〜３日かけて増殖させ、そして４回の反復実 験においてロイコトリエンＤ４（１μＭ）で変化する時間の間処理した。３％Ｖ ／Ｖの最終濃度にホルマリンを添加して、反応を停止させた。細胞を領　０５％ のツイーン２０で透過性とし、そして抗メリチン抗体（１−１００に希釈した） と１時間の間反応させた。

製造業者のインストラクションに従いペルオキシダーゼ接合した第２抗体（Ｍａ 　ｌ　ｌａｙ　Ｌａｂｓ）を使用して、結合した抗体の定量を実施した。

滑液およびリウマチ小節組織の中のＰＬＡＰの局在明確なまたは古典的慢性関節 リウマチの６人の患者および完全な関節の置換をした変形性関節症の６人の患者 からの滑膜の組織および古典的な病気の２人のリウマチの患者からの皮下の小節 を、病理学的検査のために日常的な組織学的方法により処理した。骨の検体を清 浄にし、そしてカルシウム除去した。抗メリチン抗体または抗ＰＬＡＰ抗体を使 用して、ＰＬＡＰの免疫学的局在を実施した。

ヒト滑液からのＰＬＡＰの分離 ヒト滑液からのＰＬＡＰを本質的にＣ１ａｒｋ　Ｍ、Ａ、ら（１９８の全体をこ こに引用によって加える）に記載されているように実施した。

ＰＢＳＯ中の親和精製した抗メリチン抗体を活性化されたシリカの支持体−Ｌに 固定化し、モしてカラムをプロテアーゼインヒビターのフェニルメチルスルホニ ルフルオライド（１０μＭＬバシトラシン（１００μｇ／ｍｌ）、ベンズアミジ ン（１，ｍＭ）　、ダイズトリブシンインヒビタ−（５ｇ／ｍｌ）およびツイー ン２０　（０，０５％）を含有するＰＢＳと平衡化した。クロマトグラフィーの 前に、滑液を１３，０００Ｘｇで１０分間遠心した。生ずる上澄み液をＰＢＳで １：１に希釈し、そしてソリ力のカラムに室温において０．１ｍｌ／分の流速で 適用した。カラムを５分間（２ｍｌ／分）ＰＢＳで洗浄し、そして５０ｍＭの酢 酸ナトリウムｐＨ３，１（０，５ｍｌ／分）で溶離した。ＰＬＡＰ活性を含有す る分画をプールし、モして０．０５％のツイーン２０を含有するＰＢＳで領　５ ｍｌ／分の流速で平衡化したＴＳＫ３００ｓｗＨＰＬＣカラムを使用するＨＰＬ Ｃ大きさ排除クロマトグラフィーによりさらに精製した。１５％丁ゲルを使用す るＳＤＳポリアクリルアミドゲルの電気泳動を実施して、タンパク質の純度を評 価した。電気泳動のための試料を、製造業者のインストラクションに従い１２５ ■およびヨードビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してヨウ素化した。

カブトガニのアミボサイト（ａｍｂｏｃｙｔｅ）アッセイ（検出限界０．１５％ ｇ／ｍｌ）により測定してｉｎ　ｖｉｖｏ試験のために使用した精製された■〕 ＬΔＰ分画において、リポ多糖の汚染物質は観察されなかった。

ノリカ固定化抗メリチン抗体を使用する親和クロマトグラフィーによるヒト滑液 からのＰ　Ｌ　Ａ　Ｐの精製を第３図に示す。シリカに基づく太きさ排除カラム を使用する均質性へのＰＬＡＰの精製は第４図に示されている。分画をここに記 載するようにＰ　Ｌ　Ａ　Ｐ活性についてアッセイした。

プールしそして濃縮した分画のアリコートをｌＨ７を使用してヨウ素化し、モし てＳＤＳポリアクリルアミドゲルの電気泳動にかけた。２８０００分子量におけ る単一のバンドが電気泳動ゲルのオートラジオグラフィーで観察された。大きさ 排除カラムからのタンパク質の推定された分子の大きさく４３０００の分子Ｉ） は、洗浄剤またはＰＬＡＰについてのオリゴマーの貯蔵の存在のために人工物を 反映ことかある。抗ｒＰＬＡＰ抗体を使用して同様な結果が得られたが、シリカ はより低い試料の希釈のために固定化に好ましい支持体である。

ヒト滑液から分離されたＰＬＡＰのホスホリパーゼ特異性ＰＬＡＰのホスホリパ ーゼ特異性を、表５に記載する主要なリン脂質を使用して検査した。リウマチの 滑液のＰＬＡＰはＰＬＡ、を好むホスファチジルコリンに対して特異的であるこ とが発見され、そしてホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルイ ノシトールの活性に影響を与えなかった。ＰＬＣ活性はＰＬＡＰにより影響を受 けなかった。

これらの結果は他の哺乳動物源から分離されたＰＬＡＰと同様に定量的である（ Ｃ１ａｒｋ　Ｍ、Ａ、ら（１９８７）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

分離されたｒＰＬＡＰはホスホリパーゼ刺激活性を欠いていた。

表５：ＰＬＡＰのボスホリバーゼ基質特異性ホスファヂノルコリン　７．９±０ ．２　８Ｇ　１６．１±１．９＊ホスフアチジルエタ ノールアミン　２．５±０．５　８Ｇ　２．０±０．３ホスフアチジルイノ ントール　＜０．１　ＢＧ　＜Ｑ、ｌ ホスホリパーゼＣ ホスファチジルコリン　１．９±０．３　８Ｇ　２．１±０．２ホスフアチジル イノ ントール　Ｏ１６±０．２　８Ｇ　Ｏ，６±０．１＊ｐＬＡ４の源としてＵ９３ ７単球を使用して生産された生産物のピコモル／ｍｇの細胞タンパク質として表 す。１単位のＰＬＡＰは、Ｕ９３７細胞のタンパク質のＩｍｇ当たり見いだされ た観察されたホスホリパーゼＡ２活性の２倍の増加を生成するために要求される ＰＬＡＰＯ量として定義し、そして１０ｍ１の緩衝液当たり１単位のＰＬＡＰの 最終体積に希釈した。沸騰したＰＬＡＰはＰＬＡ２刺激活性をもたなかった。

＊水スチューデント式テストにより超音波処理単独と比較してｐ〈０゜０５゜ 細胞の培養 ヒト単球Ｕ９３７はワイスター研究所（Ｗｉｓｔａｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）（ ペンシルベニア州フィラデルフィア）のギオルギオ・トリンキエリ（Ｇｉｏｒｇ ｉｏ　Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ）博士からの贈り物であるか、あるいはアメリカン ・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔ ｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）（マリイランド州ロックビレ）受は入れ番号Ｃ ＲＬ１５９３から購入し、そして１０％の加熱不活性化した胎児仔ウシ血清を補 充したＲＰＭＩＩ６４０の中で維持した。ＢＣ３Ｈ１ネズミ平滑筋細胞およびＣ ＰＡＥウシ内皮細胞系は、また、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ ン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉＯｎ）、 それぞれ、受は入れ番号ＣＲＬ　１４４３および受け入れ番号ＣＲＬ２０９から 入手した。細胞は２０％の胎児仔ウシ血清を含有するダルベツコの変性最小必須 培地の中で９５％の空気、５％のＣＯ２＋７）中テ増殖させた。

ＰＬＡＰおよびＰＬＡＰ誘導合成ペプチドのウサギ関節の中への注射体重３〜４ ｋｇの雄のニューシーラント白ウサギ（３／群）を麻酔し、そして標準のプロト コルに従い外科のために準備した。ウサギの膝関節に１ｍｌの無菌のピオゲン不 含の精製した滑液のＰＬＡＰ　（、生理的食塩水の中に３０００〜１０００００ ｕｒを含有する）を注射し、そして反対側の膝に等しい体積のピオゲン不含生理 的食塩水または０．１５％ｇ／ｍｌのリポ多糖または１０μｇ／ｍｌのアクチン を含有するピオゲン不含生理的食塩水を注射した。追加の対照は、ＰＬＡＰまた は沸騰変性したＰＬＡＰ調製物のように濃縮および処理したプールした大きさ排 除ＨＰＬＣのＰＬＡＰ活性を欠く分画であった。注射は横の膝の関節色を通して 行って、膝蓋下の脂肪パッドを避けた。注射後２４時間に、ウサギを剖検し、そ して両方の膝を２ｍｌのピオゲン不含生理的食塩水で洗浄した後、開いた。洗浄 液をバクテリアについて培養し、そして合計および示差的細胞の計数を決定した 。洗浄液のアリコートを遠心し、そして上澄み液を凍結しそして一７０℃におい て貯蔵し、次いでラジオイムノアッセイのキットにニュー・イングランド・ニュ ークリアー（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）、マサチュセッツ州ボス トン）を指示にに従い使用してプロスタグランジンＥ２およびロイコトリエンｃ ４についてラジオイムノアッセイした。各関節からの膝蓋下の脂肪パッドの部分 をまた切除し、そしてホルマリンの中で固定し、そして日常的組織学のためにパ ラフィンの中に埋め込んだ。滑液のバクテリアの培養物は陰性であった。

精製したＰＬＡＰをウサギ膝関節の中に注射することによって、炎症性関節形成 応答のＰＬＡＰ刺激を検査した。生理的食塩水、沸騰した（変性した）ＰＬＡＰ ならびに前述のタンパク質の対照を中央横の関節の中に注射した。細胞の浸潤お よび関節の破壊を伴う炎症性関節症の仲介におけるＰＬＡＰの投与量一応答関係 を表６に要約する。（３０００〜５００００ＰＬＡＰ単位）の注射後２４時間に 、滑脱洗浄液の合計の細胞計数は顕著に増加した。存在する炎症細胞の大部分は 多形核白血球（９５％のＰＭＮ）であったが、同様によく単球炎症細胞の絶対的 増加が存在した。３ＯＯＯＰＬＡＰ単位を注射後２４時間に、より少ないＰＭＮ およびより多い単球が観察された。

組織学的に、５００００ＰＬＡＰ単位まででは、主として滑脱の内層の真下およ びその内部に位置する膝蓋下の脂肪パッドの投与量に関係する炎症細胞の浸潤が 存在した。１００ＯＯＯＰＬＡＰ単位の注射後、炎症細胞の浸潤は顕著に減少し た。この減少は出血、壊死および滑脱内層細抱の損失に関連し、そしてさらに多 病巣性壊死および中膜小動脈の出血を伴った。これらのデータが証明するように 、ＰＬＡＰは投与量に依存して全体の組織の損傷に対する炎症を穏やかにして、 滑脱の白血球増加症および炎症性関節症を仲介することがでる。

ＰＧＥ２のレベルを５００００ＰＬＡＰ単位の注射後の洗浄液の中で測定したと き、対照（０，１ｎｇ／ｍｌ）を越えたわずかの増加が観察された。ＬＴＣ４は 検出されなかった。対照実験において、組織の損傷または炎症細胞の浸潤は観察 されなかった。

表６＝ウサギにおける滑脱の白血球増加症の誘発＊注射した化合物　ＷＢ　Ｃ（ ｘ　１０　”）／ｍ　Ｉアクチン（１０ｕｇ／ｍｌ）　１．１±０．２Ｌ　Ｐ　 Ｓ（０，１５ｎｇ／ｍｌ）　９．１±０．１ＨＰＬＣ溶離液　１２．３±２．１ 沸騰したＰ　Ｌ　Ａ　Ｐ　（６０，０００単位／ｍｌ）　１０．８±０．８Ｐ　 Ｌ　Ａ　Ｐ　（３，０００単位／＋＋１）　３８．６±１５．４＊＊Ｐ　Ｌ　Ａ 　Ｐ　（６，０００単位／ｍｌ）　５１．２±ｇ、ｌ＊＊Ｐ　Ｌ　Ａ　Ｐ　（２ ５，０００単位／■ｌ）　６８．３±１６．４＊＊Ｐ　Ｌ　Ａ　Ｐ　（５０，０ ００単位／ｍｌ）　７３．５±１３．５＊＊Ｐ　Ｌ　Ａ　Ｐ　（１００，０００ 単位／ｍｌ）　６．２±２゜９＊ＨＰＬＣゲル濾過から分離したＰＬＡＰをウサ ギの膝関節の中に注射した。対照の関節にアクチン、ＬＰＳまたはＨＰＬＣゲル 濾過溶離液を注射した。注射したＬＰＳの物質はこのアッセイにより検出可能な 量であった。ＰＬＡＰ活性を含まない）（ＰＬＣ分画からの溶離液を注射前に１ ６倍に濃縮した。２４時間後、ウサギは壊死し、そして膝の滑脱空洞を２ｍｌの リン酸塩緩衝液で洗浄した。

＊　＊　ＨＰ　Ｉ−、Ｃ溶離液または沸騰したＰＬＡＰと比較してスチューデン ト式テストによりｐ＜Ｑ、０５゜ （３Ｈ）アラキドン酸の吸収および解放２４個のウェル組織培養プレート中の正 常なヒト末梢血液単球を標識したアラキドン酸を用いてボマラスキー（Ｂｏｍａ 　ｌ　ａ　ｓ　ｋ　ｉ）　Ｊ。

（１９８６ＬＣＩｉｎ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｉｍｍｕｏｐａｔｈ、、３９　： １９８−２１２中に記されている如（して培養し、その開示の全体をここに引用 によって加える。単核白血球を次に一般的方法に従うフィコルーハイバークを用 いて分離し、洗浄し、１０％の加熱不活性化した胎児仔ウシ血清を含有している ＲＰＭＩ−１６４０（完全媒体）中に再墾濁させそして１時間にわたり自然に付 着させた。非付着性細胞をＰＢＳを用いる洗浄により除去しそして標識したアラ キドン酸と２４時間にわたり積層させた。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、そして完 全媒体または１０単位／ｍｌのＰＬＡＰを含有している完全媒体で再培養した。

適当な時点で、細胞上澄み液のアリコートを採取しそしてシンチレーノヨン分光 計により計数した。細胞生存率をトリパン青色染色排除により決定した。ラクテ ートデヒドロゲナーゼ解放アッセイは対照用および処理された細胞に関して同一 結果を示した。

末梢血液細胞中のエイコサノイド生産の誘発ヒト末梢血液単球およびレチクロサ イトを標準的方法で調整した。細胞をＰ　Ｌ、　Ａ　Ｐと共に種々の時間にわた り培養し、遠心し、そして上澄み液をアッセイ用に回収した。放射イノムアッセ イキット（マサチュセッツ州、ボストン、ニューイングランド・ヌクレア）を用 いてロイコトリエンＢ４およびプロスタグランジンＥ２解放を測定した。

エイコサノイド解放のＰＬＡＰ誘発を示すために、標識したアラキドン酸があら かじめ充填されている正常なヒト末梢血液単球をＰＬＡＰで刺激した。アラキド ン酸代謝物質の意義ある解放が図５にまとめられている如（観察された。標識し た細胞の個々の代謝物質の放射イノムアッセイはプロスタグランジンＥ２を表７ に示されている如く解放された主要代謝物質として示していた。同様にＰＬＡＰ はロイコトリエンＢ、およびプロスタグランジンＥ２の解放を刺激することが示 された（表７）。

（ｐｇ／２．５ｘｌＯ’個の細胞）　（ｐｇ／２．５ｘｌＯ’個の細胞）緩衝液 　０　２　５　２１ ＰＬＡＰ（１単位＞　２　７　１３　２８メトリチン（１０μｇ）　２８　７１ 　２８　４１ＰＬＡ２−ブタ（１４ｐモル）０　７　１６７　＞３００ＰＬＡ２ −ウシ（１４ｐモル）　７　３０　２３４　＞３００＊　ヒト末梢血液単球およ び好中球は記載されている如くして製造された。細胞を］、ｍｌマイクロフージ 管中に入れ、そして指定されている化合物と共に３７℃において５または２０分 間にわたり培養した。管を次に遠心し、そして上澄み液を放射イノムアンセイに よるエイコサノイド決定用に採取した。各試料は二重に製造されており、そして 平均値で表示され、標準偏差は１０％以内であった。それの代表的実験からのデ ータ リウマチ髄液および皮下の小節組織の中のＰ　Ｌ　Ａ　Ｐの局在人の関節、中手 指節間接および膝関節中で見られるＰＬＡＰの細胞源を決定するために、試験体 を慢性関節リウマチまたは変形性関節炎を有する患者から得て、そして抗−Ｐ　 Ｌ　Ａ　Ｐ抗体で染色する免疫原化学法を行った。試験した全部で６人の慢性関 節リウマチ患者は強い染色を示しｔ−ｏ変形性関節炎患者から得られた試験試料 では染色が見られなかった。

顕微鏡試験は髄液単球、大食細胞、および多核形巨大細胞の大量の染色並びに血 管円滑筋および内皮細胞のいくらかの追加的染色を示した。

同様な結果がリウマチ小節で観察された。変形性関節炎は顕微鏡試験下でさえＰ ＬＡＰ染色を示さなかった。プレーイミューン抗血清を有する試験体型では染色 は観察されなかった。

統計的データ分析 データはスチューデントを一試験を使用してまたは適宜スペアマン線状ランク相 互関連係数もしくは５ｓｐｓインコーボレーテツドのデータプログラミングモデ ル（イリノイ州シカゴ）を用いるウィルコキソン相互関連を使用して分析された 。２型誤差を避けるために必要な試料数はヤング（Ｙｏｕｎｇ）（１９８３）、 Ａｎｎａｌ、　Ｉｎｔｅｒｎ。

Ｍｅｄ、、β１−：２４８−２５１中に記されている如くして決定された。

動物データ用には、パリアンスＬＳＤ試験の不規則化された完全ブロック分析を 使用して処理手段間の差異を比較した。意義に関する基準として０．０５のアル ファを使用した（ＳＡＳマニュアル）。

ＰＬＡＰの分子クローニング 断らない限り、精製およびクローニングは例えばサムプルツク（Ｓａｍｂｒｏｏ ｋ）ら、「分子クローニング、研究室マニュアル（Ｍｏ　Ｉ　ｅｃｕｌａｒ　Ｃ ｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌｌ、第２版、コール ド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−・プレス、コールド・スプリング・バ ーバー、ニューヨーク、（１９８９）中に見られるものの如き標準的技術に従い 行われた。

ＢＣ３Ｈ１細胞をロイコトリエンＬＴＤ４（１μＭ）で２分間にわたり処理し、 その後に全細胞ＲＮＡをグアニジンイソチオシアネートで抽出してＰＬＡＰにコ ードするｍＲＮＡの合成を増加させた。ＲＮＡを含有しているポリＡをオリゴ（ ｄＴ）セルロース上での親和クロマトグラフィーにより選択した。

ｃＤＮＡライブラリーを次にポリ八選択ＲＮＡを用いて製造した。

ｃＤＮＡの第一ストランドをオリゴｄＴプライマーを用いる逆トランスクリブタ ーゼにより合成した。ｃＤＮＡの第二ストランドをＤＮＡポリメラーゼＩおよび 大腸菌ＤＮＡリガーゼを用いてグブラー（Ｇｕｂｌｅｒ）およびホフ７：／　（ Ｈｏｆ　ｆｍａｎ）　、ジーン（Ｇｅｎｅ）　、２５　：２６３−２７９の方法 に従い合成した。ＥｃｏＲ１リンカ−（ペルトル・ラブダ、プルリンゲーム、カ リフォルニア）を加え、そして挿入物を製造業者のプロトコルに従いλ１１１（ ペルトル・ラブダ、プルリンゲーム、カリフォルニア）と結紮させた。生じたラ イブラリーをスクリーニングしてヤング（Ｙｏｕｎｇ）およびデビス（Ｄａｖ　 ｉ　５Ｘ１９８３）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８ ０：１１９４−１１９９並びにスナイダー（Ｓｎｙｄｅｒ）、Ｍ、ら、Ｍｅｔｈ 。

ｄ　Ｅｎｚｙｍｏ＋　、−１５４：１０７−１２８（１９８４）の方法に従いＰ 　Ｌ　Ａ　Ｐ用にコードするＤＮＡを含有しているクローンを同定した。

抗−メリチン抗体はクラーク（Ｃ１ａｒｋ）ら、（１９８８）　、Ｂｉ。

ｃｈｅｍ、　Ｊ、、２５０：１２５−１３２およびクラークら、（１９８７）、 Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２６２：４４０２−４４０６の方法に従い製造 され、それらの両者の開示の全体をここに引用によって加える。

抗−メリチン抗体を用いるスクリーニングにより同定された正のｃＤＮＡクロー ンをサンが−（Ｓａｎｇｅｒ）ら、（１９８０）　、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ 、、１４３：１６１−１６９、およびスナイダー９Ｍら、上記文献中に記されて いるジデオキシ方法を用いてβ１３にサブクローニングしそして配列させた。酵 素および他の必要な試薬はオフ１イり州クリーブランドのＵＳバイオケミカル・ コーポレーションから得られた。このクローンの配列は図２に示されている。

Ｂ　Ｃ３Ｈ１細胞中のｒＰＬＡＰの表示プリンスター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ）ら、 ネーチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）、２９６　：　３９−４２により配されているメ タロチオネイン促進剤は化学的に合成されそしてネオマイシン抵抗性遺伝子を含 有しているプラスミドｐＵｃ１９（サザーン（Ｓｏｕ　ｔｈｅｒｎ）およびベル ブ（Ｂｅｒｇ）（１９８２ＬＪ、Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、、圭：３２７−３４１） 中に結紮させた。Ｐ　Ｌ　Ａ　Ｐ用にコードするｃＤＮＡはラムダｇｔｌｌクロ ーンからＥｃｏＲｌを用いて切除しそしてメタロチオネイン促進剤からｐＵｃ１ ９下向き流中で結紮させた。

ＰＬＡＰｐＵＣ１９表示ベクトルを１００μｇのＤＮＡ／１０’個の細胞を用い るエレクトロポレーション並びに２５０ボルトおよび２５μＦｄの設定を用いる バイオラッドエレクトロポレーション装置によりＢＣ３Ｈ１細胞中にトランスフ ェクションさせた。細胞をデュルベッコ変性最小必須媒地（ギブコ、グランド・ アイランド、ニューヨーク）中で成長させた。安定な変換された細胞を次にネオ マイシン（０，３ｍＭ）（０４１Ｂ、ギブコ、グランド・アイランド、ニューヨ ーク）が補充されている媒地中での成長により選択した。変換された細胞を［３ Ｈ］−アラキドン酸（１０μＣｉ／ｍｌ）中で一夜培養した。翌日に細胞を食塩 水中で３回洗浄し、その後に銅で処理した。上澄み液のアリコート（１ｍｌ）を あらかじめ決められた時間に集め、そして解放された放射活性の量を液体シンチ レーション分光計により測定した。５’−３’方向へのＰＬＡＰｃＤＮＡ挿入を 含有しているクローンが銅を用いる処理後に放射活性アラキドン酸の酸代謝物質 の解放速度を増加させたが、３’−５’方向にＰＬＡＰｃＤＮＡクローンを含有 していた細胞は［３Ｈ］−アラキドン酸およびそれの代謝物質の解放を抑胸する ようであった。

ＰＬＡＰ　（ｒＰＬＡＰ）を用いる抗体製造抗体を生産させて製造されたＰＬＡ Ｐ　（ｒＰＬＡＰ）をβ−ｇａ　Ｉ　−ＰＬＡＰ融合タンパク質として組み換え た。β−ｇａｌ＝融合タンパク質はスナイダー１Ｍ、ら（１９８４Ｌメソツズ・ イン・エンツィモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１ ５４：１０７−１２８中に開示さねている方法に従い製造され、その開示の全体 をここに引用によって加える。簡単に述べると、大腸菌１ｏ８９細胞にＰＬＡＰ のｃＤＮＡを含有しておりそして溶層を生産するラムダクローンを感染させた。

次に細胞を３０℃において０．４のＯＤ、。０まで成長させそシテβ−ｇａｌ− 融合タンパク質の合成をイソプロピル−Ｂ−Ｄ−４オガラクトシド（ＩＰＴＧ、 １００μｇ／ｍＩ）の存在下での１時間にわたる３７℃への移行により誘発させ た。細胞を次に回収し、ＳＤＳ試料緩衝液［ラエンリ（Ｌａｅｍｍｌ　ｉ）、Ｕ 、に、、（１９７０）、２２７；６８０−６８５１中に入れ、そして凍結させた 。融合タンパク質を６％ポリアクリルアミドゲルを使用する調整ＳＤＳポリアク リルアミド電気泳動により分離した。融合タンパク質を含有しているバンドをＩ 　ＰＴＧ処理に応答するそれの増加した合成によりそして抗−メリチン抗体を使 用するウェスターン・プロット合成により同定した。他のタンパク質から良好に 分解されたバンドを切除および粉砕し、佐薬と混合し、そして標準のプロトコル に従い雌のニューシーラント白ウサギ中に皮下注射した（１００７ｚｇ／注射） 。β−ガラクトンダーゼに対する対照抗血清はメリーランド化、ベテスダのベテ スダ・リサーチ・ラボラトリーズから購入された。

抗−ｒ　Ｐ　Ｌ　Ａ　Ｐ抗体の親和精製抗血清の免疫グロブリンに富んだ分画を 硫酸アンモニウム沈澱により製造した。生じたＩｇＧに富んだ分画を次に製造業 者により示唆されている如く臭化シアン活性化セファローズ（スエーデン、アッ プサラのファーマシア）上で固定化した。抗ｒＰＬＡＰ抗体を抗−メリチン抗体 の代わりに使用したこと以外はクラーク（Ｃｌ　ａ　ｒｋ）　、Ｍ、Ａ、ら、（ １９８３）、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、λ旦す：１２５−１３２、およびクラーク 、Ｍ、Ａ、他、（１９８７）、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、λ旦又：　４４ ０２１４０６中に記載されている如くしてＰＬＡＰを免疫精製し、該文献の両者 の開示の全体をここに引用によって加える。簡単に述べると、ＣＰＡＥ細胞から 生産された全細胞超音波処理物を充分洗浄されているカラム上に通し、その後に 結合された物質を低ｐＨ緩衝液（５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ３，１）で溶離し た。生じた分画をそれらがここに記されている如きＰＬＡ２活性を刺激する能力 に関して評価した。

単一標準化アンチセンスＤＮＡおよびＰＬＡＰペプチド類の合成ホスホルアミダ イトを基にした試薬に関するインストラクションに従いベックマンまたはファー マシアＤＮＡ合成器を使用して単一標準化ＤＮＡを製造した。ｔ−ＢＯＣアミノ 酸類に関するインストラクションに従いミリケン／バイオサーチ（マサチュセッ ッ州、ミルフォード）を使用して合成ＰＬＡＰペプチド類を製造した。標準的Ｈ ＰＬＣ方法により精製されたペプチド類を製造した。

Ｐ　Ｌ　Ａ　ＰのｍＲＮＡ誘発性ノザーン・プロット分析ＣＰＡＥまたはＢＣ３ Ｈ１細胞を種々の時間期間にわたりロイコトリエンＤ４（１μＭ）で処理し、そ して合計ＲＮＡを熱いフェノール（６５℃）を使用して抽出した。抽出されたＲ ＮＡを１％アガロース（１０Ｐｇ／レーン）から製造されたゲル上で電気泳動さ せ、そして標準的工程に従いニトロセルロース膜上で染色させた。３２Ｐ　ｄＣ ＴＰで刻印標識したＰ　ｉ、　Ａ　ＰのｃＤＮＡクローンを用いて検査を行った 。

Ｐ　Ｌ　Ａ　Ｐ中和活性に関するアッセイここに記されている如き精製ＰＬＡＰ 　（１０単位）を２μｍの硫酸アンモニウム精製抗−ｒＰＬＡＰ抗体と共に培養 した。抗体ＰＬＡＰ溶液を全細胞超音波処理物に加えそしてＰＬＡ、活性をここ に記されている如くして評価した。抗−メリチン抗体はＰ　Ｌ　Ａ　Ｐに対する 中和活性を有していないことが見いだされた。

アンチセンス、ＰＬＡＰ、および慢性関節リウマチの治療炎症刺激に対する内皮 細胞シン応答におけるＰＬＡ、の活性化におけ６ＰＬＡＰタンパク質合成の役割 を評価するために、アンチセンス実験を行った。培養された細胞に対する合成ア ンチセンスＤＮＡの直接的添加がタンパク質の合成を特異的に崩壊させるという ことが最近示されている［グラハム（Ｇｒａｈａｍ）Ｆ、Ｌ、、バンデレブ（Ｖ ａｎｄｅｒｅｂ）Ａ、Ｊ、（１９７３）　、ピロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）５ ２：４５６−４６３：ヘイキラ（Ｈｅｉｋｋｉｌａ）Ｒ，、シュワップ（Ｓｅｈ ｗａｐ）Ｇ、、ウィソクソン（Ｗｉ　ｃｋｓｏｎ）、Ｅ、、プルジンク（ＰＩ　 ｕＺ　ｉ　ｎｋ）　Ｄ、Ｈ，、ワット（Ｗａ　ｔ　ｔ）　Ｒ，、ニーカーズ（Ｎ ｅｅｋｅｒｓ）Ｌ、（１９８７）　、ネーチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）３２８：４＝ １５−４４９１　。ＰＬＡＰｅＤＮＡクローンの解放読み取り枠の５′終ａの最 初の２０個の基礎に対するアンチセンスＤＮＡ同族体の単一ストランドを合成し た。アンチセンス配列は下記の配列：ＣＡＣＴＡＴＡＴＧＡＧＣＧＧＣＣＡＣＴ ＣＴＡＡＴＴ　（これは図２中の矢印の間の配列である）を有していた。このＤ ＮＡを次にＣＰＡＥつ／内皮細胞に２５ｍＭの濃度で実験の開始前約４時間にわ たり加えた。

細胞に対するアンチセンスの添加がＥＬＩＳＡアッセイにより決定されるＬＴＤ ４処理（１μＭ）後にＰ　Ｌ　Ａ　Ｐタンパク質合成の誘発を成功裡に廃止させ た。ＰＬＡ２活性、アラキドン酸解放およびプロスタシフリン合成も抑制された 。これらの結果は表８．９および１０中にまとめられている。表８では、アンチ センスまたは非誘導ＤＮＡをここに記されている如きホスホリパーゼＡ２活性の 決定の前に細胞に加えた。全ての値は毎分１ｍｇのタンパク質当たりに生産され た反応生産物のｐモルとして表示された。表９では、細胞を３Ｈ−アラキドン酸 １０μＣｉ／ｍ１と共に一夜培養し、次にアンチセンスまたは非誘導ＤＮＡを培 養２５μＭに対してＬＴＤの添加前に４時間にわたり加えた。１０分間の処理後 にＬ澄み液中に排出された放射標識量を定量化した。全ての値は１０分間の処理 後に１０５個の細胞により解放されたＣｐｍとして表示されている。表１０では 、細胞をアンチセンスＤＮＡまたは非誘導ＤＮＡ２５μＭと共にＬＴＤ４（１μ Ｍ）の添加前に４時間にわたり培養した。細胞により解放されたプロスタシフリ ンの量を放射イノムアッセイにより定量化した。

これらの実験から、ＬＴＤ４がこれらのウシ内皮細胞中でプロスタシフリン生産 を増加させる機構には細胞が最初にアクチノマイシンＤ処理により抑制可能な事 象であるＰＬＡＰのｍＲＮＡを合成することが必要であると結論づけられた。次 にＰ　Ｌ　Ａ　ＰのｍＲＮＡを生産される成熟ＰＬＡＰタンパク質に関する順序 で駐訳しなければならない。ＰＬＡＰメソセージの翻訳はシクロへキシミドまた はアンチセンスＰＬＡＰのＤＮＡを使用して抑制させることができる。抑制方法 とは無関係に、ＰＬＡＰの製造がロイコトリエン刺激後のアラキドン酸の解放に おける重要段階であること並びにロイコトリエン刺激後の増加した生合成に対す る細胞応答が細胞がＰＬＡＰを選択的に表示する能力により決定されるというこ とは明らかである。

表８ ＰＬＡ２のＬＴＤ４活性化に対するアンチセンスの影響アンチセンスＤＮＡ　６ ．０±１．０　９．１±１．１対照ＤＮＡ　６．０±１．４　１．９．０±２． ０表９ アラキドン酸のＬ　Ｔ　Ｄ、誘発解放に対するアンチセンスＤＮＡの影響アンチ センスＤＮＡ　４７５５　５５１６対照ＤＮＡ　４９１０　１１１８０ 表１０ Ｌ　Ｔ　Ｄ、誘発ＰＧＩ２合成に対するアンチセンスＤＮＡの影響処理　対照　 十ＬＴＤ４ なし　２．４上鉤６　４．３±０．４ アンチセンスＤＮＡ　２．２上鉤５　２．１±０．４トＣ °（ ＰＬＡ、、活性（×ｌＯｌコピル／分／ｍｇタンパク質）［３Ｈ１−解放されｆ ：　（ｃｐｍＸｌｏ３）国際調査報告 フロントページの続き （７２）発明者　クラーク、マイク・エイアメリカ合衆国ニュージャーシイ用０ ７８３５デンビル・ウェットモアドライブ１５ （７２）発明者　ショーア、ロバート・ジー・エルアメリカ合衆国ニュージャー シイ用０８８１７エデイソン・プルツクフォールロード２８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、工程： 慢性関節リウマチを有することが疑われる人からの体液または組織の試料を準備 し、 前記試料をホスホリパーゼＡ２活性化タンパク質に対して特異的な抗体と接触さ せ、こうして前記抗体は前記試料の中のホスホリパーゼＡ２活性化タンパク質と 結合し、そして 前記抗体を検出し、これによりホスホリパーゼＡ２活性化タンパク質の存在を示 し、ここで慢性関節リウマチをもたない人の中に見いだされるレベルと比較して 前記試料の中のホスホリパーゼＡ２活性化タンパク質のレベルの増加は、前記人 における慢性関節リウマチの存在を示す、からなる、慢性関節リウマチを有する ことが疑われる人の中のホスホリパーゼＡ２活性化タンパク質のレベル増加を検 出し、これにより前記人における慢性関節リウマチの存在を示す方法。 ２、実質的に精製されたヒトホスホリパーゼＡ２活性化タンパク質またはそのホ スホリパーゼＡ２刺激部分。 ３、請求の範囲第２項記載のタンパク質をコードする実質的に精製された核酸配 列。 ４、ホスホリパーゼＡ２活性化タンパク質をコードする実質的に精製された核酸 配列。 ５、前記配列はウシ細胞から誘導される、請求の範囲第４項記載の核酸配列。 ６、前記配列は第２図の核酸配列の解読部分の配列を有する、請求の範囲第５項 記載の核酸配列。 ７、請求の範囲第２項記載のタンパク質に対して特異的な精製された抗体。 ８、工程： ａ）体液または組織を固体の支持体に結合した抗メリチン抗体または抗ホスホリ パーゼＡ２活性化タンパク質抗体と接触させ、ここで前記体液または組織の中の ホスホリパーゼＡ２活性化タンパク質は前記抗メリチン抗体または抗ホスホリパ ーゼＡ２活性化タンパク質抗体と結合し、ｂ）結合したホスホリパーゼＡ２活性 化タンパク質を前記固体の支持体から溶離し、 ｃ）工程ｂからの溶離されたホスホリパーゼＡ２活性化タンパク質を大きさ排除 カラムに通過させ、そして ｄ）精製されたホスホリパーゼＡ２活性化タンパク質を集める、からなる、体液 または組織からヒトホスホリパーゼＡ２活性化タンパク質を精製する方法。 ９、前記固体の支持体はシリカである、請求の範囲第８項記載の方法。 １０、前記溶離工程は酢酸ナトリウムの緩衝液を使用して実施する、請求の範囲 第８項記載の方法。 １１、工程： ａ）哺乳動物の体液の試料をホスホリパーゼＡ２活性化タンパク質に対して特異 的な抗体と接触させ、ここで前記抗体は前記体液または組織の中のホスホリパー ゼＡ２活性化タンパク質に結合し、そしてｂ）前記抗体を検出し、これにより前 記体液または組織の中のホスホリパーゼＡ２活性化タンパク質の存在を示す、か らなる、哺乳動物の体液または組織の中のホスホリパーゼＡ２活性化タンパク質 を検出する方法。 １２、前記検出工程は、 桔合したホスホリパーゼＡ２活性化タンパク質に対して特異的な抗体を、前記結 合した抗体と結合可能な検出可能に標識した抗体と接触させ、そして 前記検出可能な標識を検出する、 ことからなる、請求の範囲第１１項記載の方法。 １３、前記検出可能な標識はペルオキシダーゼであり、そして前記検出可能な標 識の検出は前記ペルオキシダーゼをＯ−フェニルジアミン基質と接触させ、そし て基質生産物の光学密度を決定することからなる、請求の範囲第１２項記載の方 法。 １４、ホスホリパーゼＡ２活性化タンパク質に対して特異的な抗体および担体ま たは希釈剤からなる、哺乳動物の体液または組織の中のホスホリパーゼＡ２活性 化タンパク質を検出するための試薬。 １５、ａ）ホスホリパーゼＡ２活性化タンパク質に対して特異的な抗体をその上 に結合してを有する固体の表面、ｂ）請求の範囲第１４項記載の少なくとも１種 の試薬、およびｃ）前記抗体を検出する手段、 からなる、哺乳動物の体液または組織の中のホスホリパーゼＡ２活性化タンパク 質を検出するためのキット。 １６、前記抗体を検出する手段は、 前記ホスホリパーゼＡ２活性化タンパク質に対して特異的な抗体と結合可能な検 出可能に標識した抗体および担体または希釈剤からなる試薬、および 前記検出可能な標識を検出する手段、 からなる、請求の範囲第１５項記載のキット。 １７、前記ホスホリパーゼＡ２活性化タンパク質に対して特異的な抗体は検出可 能な標識をその上に結合してを有し、そして前記抗体を検出する手段は前記検出 可能な標識を検出する手段からなる、請求の範囲第１５項記載のキット。 １８、工程： 哺乳動物細胞をホスホリパーゼＡ２活性化タンパク質のホスホリパーゼＡ２活性 化タンパク質合成抑制配列をコードするアンチセンスの核酸配列と接触させ、こ こで前記アンチセンスの核酸配列はホスホリパーゼＡ２活性化タンパク質の合成 を抑制する、からなる、哺乳動物細胞の中のホスホリパーゼＡ２活性化タンパク 質の合成を抑制する方法。 １９、前記アンチセンス配列はＲＮＡである、請求の範囲第１５項記載の方法。 ２０、前記アンチセンス配列はＤＮＡである、請求の範囲第１５項記載の方法。