JPH06503833A - Suppression of immune responses with oligomeric forms of antigens in controlled chemistry - Google Patents

Suppression of immune responses with oligomeric forms of antigens in controlled chemistry

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JPH06503833A
JPH06503833A JP4504304A JP50430492A JPH06503833A JP H06503833 A JPH06503833 A JP H06503833A JP 4504304 A JP4504304 A JP 4504304A JP 50430492 A JP50430492 A JP 50430492A JP H06503833 A JPH06503833 A JP H06503833A
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ディンツィス，レニー　ゼット．
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]

制御された化学のオリゴマー形態の抗原での免疫応答抑制本発明は一般的に、望 ましからぬ免疫応答を制御する方法、ならびにそれに使用する構造物に関する。 本明細書に記載された発明は、アメリカ合衆国陸軍第ＤＡＭＤ　１７−８６−Ｃ −６０３８号の助成金、即ち奨励金に基づいた研究の一環としてなされたもので ある。 自己防衛の機構として、動物は外来物質に対する複雑な組み合わせの応答を発生 させて来たが、これは集合的に免疫系と言われている。免疫応答は一般的に有利 な（保護的な）性質のものであるが、特定の状況において、動物体は望ましから ぬ免疫応答を生じさせる。 そのような望ましくない応答には、アレルギー反応（これは外因性抗原に対する ＩｇＢ抗体の生産により特徴付けられる）ならびに自己抗原に対して免疫系が反 応する自動免疫疾患がある。 過去数十年間、特別な免疫応答を阻害、抑制、即ち“治癒”するための多くの方 法が記載されて来た。これらの方法には、動物の種々の化学的調製物による治療 が含まれ、それらの詳細は以下のようである。一連の本出願の基礎を形成する免 疫改変法は、物理的に制限された配列（ａｒｒａｙ）に関連して免疫系が外来抗 原を認識するという前提に基づいている。免疫系を刺激するために、配列は特定 の大きさくまたは幾何学的配列）の限度を越えなければならないし、かつ天然の ものと同一の、物理的に接近し得る最小数のエピトープを有さなければならない （最小結合価）。これらの二つのパラメーターが一旦合うか、または制限を越え ると、免疫系は抗原特異的Ｂ−細胞による抗体（ＩｇＭ、　ＩｇＧおよび／また はＩｇＢ）の生産、ならびにＴ−細胞因子および／または活性（Ｔ−細胞“ヘル プ、サイトカイン、細胞毒性など）の生産により応答するであろう。 本発明が関連する方法は、幾何学的および／または結合価が“閾値以下”であり 、かつ天然に存在する配列と自己免疫および外因性アレルギ一応答を競合する化 学的に誘導した高分子量配列を導入することでこの系を操作できるという出願人 の発見に基づく。 本発明の基礎を形成する技術は、旧ｎｔｚｉｓらのＰｒｏｃ、　Ｎａｔ’　ｌ　 Ａｃａｄ。 Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７３：３６７１−３６７５（１９７Ｂ）により記載された免 疫応答のイムノン　モデル（Ｉｍｍｕｎｏｎ　ｍｏｄｅｌ）から導かれたもので ある。この報告は、免疫原性応答を得るためにはＴ−細胞　依存性抗原上のハプ テンの数および間隔に関して閾地があるという概念を開示する。１９７６年の報 告も、免疫感作していない動物において、非免疫原性ポリマーは免疫原性ポリマ ーのデノボ免疫応答の引き金に対する作用に抑制的であることを開示する。非免 疫原性ポリマーの、免疫原性ポリマーの免疫応答に対する抑制効果はさらに、Ｐ ｒ０Ｃ，Ｎａｔ’１．ＳＣｉ、ＵＳＡ、　７９：３９５、１９８２；Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７９：８８４．１９８２：およびＪ 。 １＋ｎ＋ｎｕｎｏ１．、　１３１：２１９６．　１９８３（Ｄｉｎｔｚｉｓらの Ｊ、Ｉ＋ｏｍｕｎｏ１．１３５：４３２．　１９８５；Ｄｉｎｔｚｉｓらの免疫 学理論′″Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　Ｉ＋ｎ＋ａｕｎｏｌｏｇｙ、　Ｐｔ、ｌ　 第■巻、Ｐｅｒｅｌｓｏｎ、　Ａ、Ｓ、編集、アディソンーウエスレイ　出版社 、、リーディング、マス第８３−１０３頁、１９８８：ＤｉｎｔｚｉｓらのＪ、 　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４３：１２３９゜１９８９；ＤｉｎｔｚｉｓらのＥｕｒ 、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、７０：２９９．１９９０；およびＤｉｎｔｚｉｓおよび ＤｉｎｔｚｉｓのＩｍａ＋ｕｎｏ　１．　Ｒｅｖ　ｉ　ｅｗｓ第１１５　、第２ ４３−２５１頁、１９９０も参照）。に記載されている。 一連の本出願の初期の出願は、１ｇＭ生産のレベルによって評価できるＴ−非依 存性抗体反応が関与する実験的パラダイムを使用してなされた研究の詳細を含む 。低分子量ＤＮＡおよびハプテンに対するＩｇＭ抗体の生産を抑制するために、 構造を制限された骨格の種々のタイプ（直鎖ポリアクリルアミド、デキストラン 、Ｆｌｃｏｌｌ、カルボキシメチルセルロースなど）の使用について記載されて いる。（以下の実施例１から７を参照）。加えて、本発明を使用するために、花 粉に対するアレルギーや自己−免疫疾患（多発性硬化症および重症筋無力症を含 む）を抑制するための初期の発見も参照とする。本出願は、Ｔ−細胞依存性抗体 生産と、Ｔ−細胞それ自身による応答に関して詳細になされた研究を含む。従っ て本明細書に与えられるデーターは、ＩｇＧおよび１ｇＥによって表されるＴ− 細胞依存性抗体生産を含む複雑な応答に対する、初期に出願された一連の免疫抑 制法の応用をさらに支持する。さらに、本開示は、抑制構造物が確かに潜在的に 刺激性分子ではないという特性を与える望ましさを強調する。 上述したように、報告されたような化学調製物を、免疫応答の阻害法としての使 用に適するように変更することが多くの出版物の主題であった。開示された方法 は、明らかに使用されたポリマー骨格物質の“特別な化学組成物”に基づき、こ れはエピトープキャリアーを形成する。この機構によって、観察された特別な免 疫抑制が生じること、および特別な分子が抑制をもたらす要因になったことは、 以下の様々な原因になるものであった：ｌ）キャリアー物質中の炭素対水素対酸 素の比により定められた化学組成物（Ｄａｗｎら、Ｊ、ｌｍｌ１ｕｎｏ１．１２ ６：４０７−４１３．　（１９８１）；Ｗｅｉ　らＩｎｔ。 Ａｒｃｈｓ、　Ａｌｌｅｒｇｙ　Ａｐｐｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　８５：１−７ （１９８８））。 ２）ポリペプチドキャリアー物質を合成するにあたり“自然である″′Ｌ−アミ ノ酸ではなく、′自然にはない”Ｄ−アミノ酸を、使用することによって定めら れた“不自然さ”（ＫａｔｚらＪ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　＋１３４：２０１− ２２３（１９７１）：ＬｌｕらＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　ＵＳＡ　７６：１４３０−１４３４（１９７９）　；ＬｉｕらＪ、　Ａｌｌｅ ｒｇｙ　Ｃ１ｉｎ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　６６：３２２−３２６（１９８０）　 ；３）自然界では明確にされていない“特別”な化学的性質；そして ４）明確にされていない方法で“特異的抑制細胞”を増加させる能力、である。 （以下に続く特別な注解も参照のこと）。しかし、出願人の最も優れた知識に対 して、他のグループは、分子サイズとエピトープ結合価との正しい組み合わせを 持つ分子を含む抑制物質により免疫抑制が生じることを提案していなかったし、 さらに他のグループは、本発明が関連する方法を示唆も提案もしなかった。 ５ｅｈｏｎおよびその共同研究者は、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）　骨格構 造に結合させたエピトープを含むポリマー性分子の注射により誘導された特異的 免疫抑制に関する多くの研究を行った（例えば、ＤａｗｎらＪ、　Ｉｎ＋ｎｕｎ ｏ１．１２６：４０７−４１３（１９８１）　；Ｗｅｉ　らＩｎｔ、　Ａｒｃｈ ｓ、　Ａｌ　ｌｅｒｇｙＡｐｐｔ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　８５：　１−７（１９ ８８））。ＰＶＡ骨格構造は、低分子量のＰＶＡ（１４ｋＤａ）を臭化シアンで ポリマー上のいくつかの水酸基と反応させ、反応性型に転換して、そしてこれら の活性型水酸基を脂肪族ジアミンのアミノ基にカップリングさせて作られた。著 者らはこの反応はＰＶＡポリマー分子を、ジアミン付加物の未反応末端からの多 くの脂肪族アミノ基で置換するものと期待した。これらの末端は続いてハプテン 基で置換され、はとんど元のＰＶＡから変化していないと思われる分子量の多置 換ＰＶＡを形成した。 この実験法は、可溶性のハプテン化ポリマー物質を生成し、これはハプテンが関 与した特異的免疫応答に抑制的であった。しかし、多反応性ポリマー（臭化シア ン活性化ＰＶＡ　）と過剰の二価反応物（エチレンジアミン）との反応において 、実質的に様々な量の架橋結合がポリマー間でおこり、広範な分子量の多架橋結 合分子の形成を生じた。しかし５ｅｈｏｎおよびＬｅｅは、沈殿物に注目しそれ らを捨て、かれらは明らかにより高分子量（そして従って、潜在的に刺激性）の ポリマーが生成されなかったものと取り扱った。 出願人が５ｅｈｏｎらの公開された方法を繰り返した時、極めて広範な架橋結合 ポリマー分子が生成し、より高分子量物質は溶液から沈殿することが分かった。 溶液中に留まる、より可溶性のアミン−置換ＰＶＡは、沈殿物質を除去した後、 約ｆ５ｋＤａと１００ｋＤａとの間の分子量範囲を有した（分析的超遠心分析に よって表された）。これが、出願人が初期に申請した一連の出願において、任意 の投与量でも刺激性ではない免疫応答の抑制剤として定義した、ポリマー物質を 置換した可溶性多結合価のハプテンとしての分子量範囲である。 ５ｅｈｏｎらは彼らが使用した化学的なポリマー分子の架橋結合の可能性を考慮 しなかったので、ならびに彼らは生成した物質の実際の分子量を決定しなかった ので、彼らは不利なことには出願人のパラダイムの機能的範囲中で誤ったという ことである。 出願人は、事実、ハプテンで多置換された高分子量（１００ｋＤａより大きい） のＰＶＡ分子は、インビトロおよびインビボで免疫原性であり（□１ｎｔｚｉｓ ら、Ｊ、　［ｍｍｕｎｏｌ、　１４３：１２３９−１２４４（１９８９））、ベ ル型の投与応答曲線を与えると報告した。しかし出願人は分子量が１ｏｏｋＤａ より小さい同様の分子は、かれらのパラダイムにより予想されたように刺激能を 有することなく免疫応答の阻害剤であることを見いだした。 ＫａｔＺおよび共同研究者は、エピトープに対する免疫応答の特異的抑制を、こ れらのエピトープを合成ポリペプチドであるポリ（Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−リジ ン）即ちポリ（Ｄ−Ｇｌｕ、　Ｄ−Ｌｙｓ）から作られたキャリアー骨格に結合 させたものから成るポリマー調製物で処理して記載した（ＫａｔｚらＪ、　Ｅｘ ｐ、Ｍｅｄ、　１３４：２０１−２２３（１９７１）；ｌｉｕらＰｒｏｃ、　Ｎ ａｔ’　ＩＡｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７６：　１４３０−１４３４（１９ ７９）　；ＬｉｕらＪ、　Ａｌｌｅｒｇｙ　Ｃ１ｉｎ、　Ｉ＋ｎａ＋ｕ獅盾戟B ６６　：３２２−３２６（１９８０）。このポリペプチドは、市販されている不 規則に組織されたポリマーであって、Ｄ−アミノ酸、Ｄ−リジンおよびＤ−グル タミン酸の化学的に活性化された型から合成されたものであり、その比は６０　 ：　４０である。ＫｉｔｔＺは免疫抑制の発見を、通常のし一形のアミノ酸（こ れはすべてのタンパク質に見いだされる）ではなく、通常のアミノ酸ではないＤ −アミノ酸から成る合成ポリペプチドの“天然にはない”性質によって引き起こ されるものとして合理化した。この説明は明らかに、キャリアー骨格ポリペプチ ドがより普通のし一アミノ酸で合成された時、同等の免疫抑制が観察されなかっ たという発見により支持された。 Ｋａｔｚの発見は以下のように説明された免疫パラダイムに良く合う：ｌ）骨格 ポリマーとしてＫａｔｚに使用されたポリ（Ｄ−Ｇｌｕ、　Ｄ−Ｌｙｓ）調製物 は、市販のものから得られ、その平均分子量は１００ｋＤａより小さかった（主 な市販品、イエダ（イスラエル）、およびシグマ（セントルイス）は、出願人に とってそれらから７０ｋＤａより大きい平均分子量を有するそのようなポリマー を製造することは不可能であることが分かった）。従ってｘａｔｚは明らかに分 子量が１００ｋＤａより小さいポリマーを抑制骨格物質として、この幸運な分子 量の選択を認識することなく使用した。 ２）入手し得る、より高分子量のポリ（Ｄ−Ｇｌｕ、　Ｄ−Ｌｙｓ）から始まり 、イエダからの約７０ｋＤａを出願人はその多くのりジンアミノ基を、ハプテン 、フルオレセインに置換して、期待されたような非−免疫原性のＦＬＵ−ポリ（ Ｄ−Ｇｌｕ、　Ｄ−Ｌｙｓ）が生成することが分かった。この物質をＨＰＬＣで 検討することにより、期待通り４０ｋＤａ以下から少量の１００ｋＤ＆より大き な広範囲の分子量を含む分子を含んでいた。５ｕｐｅｒｏｓｅＣＬ−６Ｂでのゲ ル濾過クロマトグラフィーによる大きさの分画では、約２００ｋＤａ以上の少量 物質は排除される可能性があった。この高分子量分画は、マウスのフルオレセイ ンに対する免疫応答に関しては免疫原性であることが証明された。この発見は本 質的には、ＦＬＵ−ポリ（Ｄ−Ｇｌｕ、　Ｄ−Ｌｙｓ）については抑制的ではな いが、分子の大きさに基づき刺激性または非−刺激性となることを指示する。 ３）分子量の大きさをさらに試験するために、出願人は非−免疫原性の７０ｋＤ ａ　ＦＬＵ−ポリ（Ｄ−Ｇｌｕ、　Ｄ−Ｌｙｓ）分子をカルボジイミドで架橋結 合し、グルタミン酸残基のいくつかのカルボキシル基を、リジン残基のアミノ基 とカップリングして適当なアミド結合を形成した。 広範な分子量の製品が生じた。これらをゲル濾過カラムでサイズ−分画した時、 分子量が１００ｋＤＩＬより以上の物質はインビボおよびインビトロの両方で免 疫原性であったが、１００ｋＤａ以下の分子量の分画は免疫原性ではなかった。 これは再度、イムノン仮説に合致し、ＫＩｌｔＺにより説明されたものとは一致 しない。 ４）＋１乳動物はＤ−アミノ酸のみから構成されるポリペプチドを加水分解でき る酵素を生成しないので、そのようなポリペプチドは遊離であるかまたはエピト ープに置換されているとしても、動物体内で急速には分解されず、その効果が長 （続くであろうと思われる。 しかし、通常のし一アミノ酸から作られるポリペプチドは、通常のタンパク質分 解酵素によって体内で急速に加水分解され、徐放的効果を有すると期待されない 。これは、Ｋ２ＬｔＺによって記載された“天然にはない″Ｄ−アミノ酸ポリペ プチドの普通ではない性質は単に酵素による分解に対する抵抗によるものであり 、多くの合成および天然のポリマー分子に共通の性質である。 Ｄｉｅｎｅｒおよび彼の共同研究者は、カルボキシ−メチルセルロースをキャリ アーとしてエピトープをカップルさせた特異的抑制免疫効果を記載する文献を数 多く報告している（例えば、Ｄｉｅｎｅｒら、Ｊ。 Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２２：１８８６−１８９１（１９７９）　、参照）。これら はＤｉｅｎｅｒにより、カルボキシ−メチルセルロースの特別な化学的性質につ いて記載されているが、物質の分子量に関しては考慮されていない。しかし、出 願人は分子量１００ｋＤａより小さいカルボキシ−メチルセルロースのハプテン 調製物がそれにカップルされたエピトープに対して抑制的であり、任意の投与量 で刺激性ではないが、１００ｋＤａ　以上の分子量の調製物は正しい投与量で刺 激性である（Ｄｉｎｔｚｉｓら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。 １４３：１２３９−１２４４（１９８９））と報告した。明らかにＤｉｅｎｅｒ は分子量が主に１００ｋＤａより小さい物質を使用し、彼の調製物であるポリマ ーの分子量サイズが免疫効果を有するという重要性を認識していなかった。 ポリビニルピロリドン（ＰＶＣ）にカップルされたハブテンの特異的抑制効果は 、血液代替物として使用された物質について報告された（ｖｏｎ　５ｐｅｃｈｔ 　ら、Ｃｌ１ｎ、　Ｅｘｐ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　３３：２９２−２９７（１９ ７８）　：Ｌｅｅ　ら、Ｂｕｒ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１１：１３−１７（１９ ８１））　、他の著者はＦｉｃｏｌｌにカップルさせたハブテンの同様な抑制効 果を報告した（ＷａｔａｎａｂｅらＪ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。 １１８：２５１−２５５（１ｇ″７７））、ニューモコッカル（ｐｎｅｕｍｏｃ ｏｃｃａｌ）多糖（ＢｏｒｅｌらＮａｔｕｒｅ　２６１：４９−５０（１９７６ ）；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ　らＦｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　２：４６０−４ ６７（１９７２））　、植物多糖（Ｍｏｒｅｎｏら、ＣＩ　ｉｎ、　Ｅｘｐ、　 Ｉｏ＋ｍｕｎｏ１．３１　：４９９−５１１（１９７８）；　Ｈｕ＋ｎｐｈｒｅ ｙ、　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉ＋ｎｍｕｎｏ１．１１：２１２−２２０（１９８１））ま たは同級体の免疫グロブリン（Ｌｅｅら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１１４　： ８２９−８４２（１９７５）　；Ｂｏｒｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ　２６１：４９− ５０（１９７６））　、これらの報告は極めて多様であるものの、出願人が行っ たようなポリマーキャリアーの分子量とエピトープ結合価とを組み合わせた効果 を彼らの施与によって生じた免疫応答についての対象としていない。エピトープ −置換ポリマー調製物の分子量特性はこれらの報告された研究ではなされていな かった。しかし、実験法はこれらの調製物の平均分子量はすべての場合において １００ｋＤａ未満であったという説明とは一致する。 一般的に、ハプテンをカップルさせたポリマー調製物からの特異的抑制効果を報 告した著者らは、明らかに出願人が記載する抑制的可溶性分子に合致する調製物 に会う機会があった、すなわちそれは実質的な数のエピトープが分子量約１００ ｋＤａ未満のポリマーキャリアーにカップルされている。これらの条件は無意識 の内に様々な実験条件から出会ったかもしれないが、上述のように、そのような 出会いは本発明を示唆するものではない。 図面の簡単な説明 図１．デキストランからＧＭＢ−デキストランへの転換。 図２．カルボキシメチルデキストランからデキサミンへの転換。 図３．デキストランからポリアニオン性デキサミンへの転換。 図４．デキサミンからポリカチオン性デキサミンへの転換。 図５．ポリ（アクリルアミド、アクリル酸）からポリ　（アクリルアミド、アク リル酸）を含有する一級アミンへの転換。 図６．三量体および四量体の“点供給源”足場の例。 図７９点供給源足場としてのシクロデキストリン。 図８．ペプチドのＧＭＢ−デキストランへの結合。 図９．フルオレセイン処理したデキストランの分析的平衡超遠心。 ・＝　１４．　ＯＯＯＲＰＭ；　■＝　１６．　ＯＯＯＲＰＭ図１０．ペプチド −デキストラン結合体のアミノ酸分析。 図１１．狼癒ヒストンペプチドーデキストラン結合体の分析。 ＋＝ＰＴＣ−（ｓ−２−（２Ｒ，２Ｓ−サクシニル）−Ｌ−Ｃｙｓ；・＝ＰＴＣ −ＧＡＢＡ 図１２．結合ペプチド置換密度式。 図１３．ペプチド−デキストラン結合体の酸加水分解から誘導された別のマーカ ーアミノ酸。 図１４．酸（ＨＣＬ）加水分解そして続くフェニルインチオシアネート（ＰＩＴ Ｃ）での誘導の結果として生成されたサイズ−分画されたＤＮＡ／ＤｅＸｔ。、 結合体の加水分解ピーク。 図１５．酸加水分解そして続くフェニルインチオシアネート（ＰＩＴＣ）での誘 導の結果として生成されたＤＮＡの加水分解ピーク。 図１６．別個のマウスの血清中において、刺激性ポリマー（ポリマーＳ）を指示 された量（点あたりｌ０ＢＡＬＢ／　ｃマウス）で注射した６日後のＤｎｐに対 するＴｇＭ抗体の相対濃度平均を表す投与一応答測定。 誤差棒はそれが丸よりも大きい時、ＳＥＭを示す。連続した曲線は、マウスあた りの投与量が０．３μｇでイムノンサイズｑは、ＩＯであるときに生じるピーク 応答について式１（９６頁参照）から予想された理論的応答を示す。理論的応答 は、ｑが５より大きい時はｑの値に感受性ではない。応答曲線のピークは、血清 ｍｌ当たりの約３０μｇの抗−Ｄｎｐ　ＩｇＭに相当する。 図１７．種々のロットのＢＡＬＢ／　ｃマウスについての投与一応答測定、。 測定は別個のマウスからの血清に対して作成された。測定の平均は各投与量での 各グループについて表されるが、平均が記号よりも大きい時はＳＥＭと共に表す 。使用した記号の中で、連続黒丸は、点あたり１０匹のマウスを表しくこれらの 点は図１６と同じ）；中抜き丸“○”は点あたり５匹のマウスを表し；そして記 号口は、点あたり６匹のマウスを表す。 図１８．一定投与量の免疫原性ポリマー調製物Ｓと同時に注射した、非−免疫原 性ポリマー調製物Ｎの投与量を上昇させた場合についての応答−減少測定。測定 は別個のマウスからの血清について行った。 各グループの平均を、平均が記号よりも大きい時はＳＥＭとともに表す。ＢＡＬ Ｂ／　ｃマウス、点あたり１０匹のマウス、０．３１μｇのポリマーＳが各マウ スに与えられた。連続的な曲線は、イムノンサイズｑがｌＯで、かつ図１７から 誘導されるようにＤ′Ｉ■設定がマウスあたり０．５μｇに等しい場合について 、式ｌから予想された理論的応答を与える。理論的応答は、ｑの値に対しては極 めて感受性が無いが、形を変えることなくＤ’″０の値に応じて左右にシフトす る。 図１９．種々の濃度の免疫原性ポリマーＳの存在下でインキュベーションを開始 した３日後に、膵臓細胞培養から生産された直接的な抗−Ｄｎｐプラークの相対 数に関する投与一応答測定。データーは培養物あたり３重のアッセイを２重の培 養物について行った平均を表す；ＳＤは、平均が丸よりも大きい時を指示する。 実験のピーク応答は、盲実験（ポリマーなし）の１０’牌臓細胞あたり′４２ｏ プラークを有する１０’牌臓細胞あたりの一３００プラークに対応する。曲線は 、ポリマー濃度が０．４重ｇ　／ｍｌでイムノンサイズｑが１０で起こるピーク 応答について式ｌから予想された理論的応答を与える。 図２０．一定投与量（０，３重ｇ／　ｍｌ）の免疫原性ポリマー調製物Ｓと、非 −免疫原性ポリマー調製物Ｎ投与量を上昇させて、膵臓細胞中でインキュベーシ ョンした場合についての応答−減少測定。手順とデーター処理は図１９のごとく である。異なる記号は得られたデーターが別個の実験からであることを示す。曲 線は、イムノンサイズｑは、ＩＯであり、かつ式１９から誘導されるようにＤ″ ″１″１設定４重ｇ／ｍｌに等しい場合について、式ｌから予想された理論的応 答を示す。 図２１．インビトロ応答力イネティックス。天然の膵臓細胞の、ＦＩｌｌ。Ｐｖ Ａ４００ノ上昇に対する直接的（ＩｇＭ）抗−Ｆｌ応答は、３（・）、４（○） または５（ロ）８後の培養物を測定した。すべてのＳ、　Ｄ、が１０％未満であ った。 図２２．インビボ応答力イネティックス。至適な投与量（１０ｎｇ／マウス）　 （ＤＦｌｓｓＰＶＡ２００（０，５１１（７）生理塩溶液中）を腹膜中に注射し 、直接的（ＩｇＭ）抗−Ｆｌ応答を０から６６日に測定した。各点は、３匹のマ ウスで、３重アッセイの平均を表す。Ｓ、　Ｄ、は１０％より小さい。 図２３．異なるキャリアーを持つ４種のＦｌ−ポリマーにより作成されたインビ ボ−正常化投与応答曲線。各点は３重アッセイの平均を表す。マウスはＦｌ−ポ リマーの投与量を上昇させて（生理塩溶液中）、腹膜中に注射され（３匹／点） 　、ＰＦＣを４日後に測定した。曲線を最大応答が１の値になるように正常化し 、他の応答は最大応答の有理数であられされた。Ｓ、　Ｄ、は１０％より小さか った。Ｏ＝　Ｆｌ１６０−ＣＭＣ５２０゜・＝　Ｆｌ８５−ＤＥＸ４００．口＝ ＦＬ２４０−ＦＩｃ７５０；　△＝ＦＬ５５−ＤＶＡ２００゜図２４．異なるキ ャリアーを持つ５種のＦｌ−ポリマーにより作成されたインビトロ正常化投与応 答曲線。直接的（ＩｇＭ）抗−ＦＩＰＦＣは天然膵臓細胞とのポリマーの培養物 を３日後に測定した。曲線を最大応答が１の値になるように正常化し、他の応答 は最大応答の有理数であられされた。Ｏ＝ＦＬ１６０−ＣＭＣ５２０，・＝　Ｆ ｌ６５−ＤＥＸ４００　；口＝　Ｆｌ９０−Ｆｌｃ７５０；■＝　Ｆｌ９５−Ｐ Ａ３００　；△＝　ＦＬＩＩＯ−ＤＶＡ４００゜図２５．非−刺激性ＦＬポリマ ーによるＦｌ、。Ｆ　ｉ　ｃ７５０に対するインビトロ応答の阻害。ＩｇＭ　Ｐ ＦＣのＦｌｅ。Ｐｉｃ７５０のみに対する応答を１の値とし、非免疫原性ポリマ ーの付加量を含有する培養物の応答を有理数的な相対応答として表した。各培養 物におけるＦｌ、。Ｆｉｃ７５０の濃度は、ｍｌあたり３重ｇで一定に保った。 ○＝　Ｆｌ４−ＣＭＣ１５，・＝　ＦＬＹ−ＣＭＣ２７，口＝ＦＬ１４−ＰＶＡ ５０．■＝　Ｆｌ１４−ＰＶＡ５０．△＝　Ｄｎｐ１９−ＰＡ６０゜図２６．免 疫原性Ｆｌ−ポリマーの高投与量によるＦｌ、。Ｆｉｃ７５０に対するインビト ロ応答の阻害。ｍｌあたり３重ｇのＦＩ、。Ｆ　ｉ　ｃ７５０のみに対するＩｇ Ｍ　ＰＦＣ応答を１を値とし、Ｆｌ−ポリマーの付加量を含有する培養物の応答 を有理数的な相対応答として表した。−〇−＝　Ｆｌ１５０−ＣＭＣ４４０。 −ロー＝　Ｆｌ９０−Ｆｉｃ７５０；・・・口・・・＝　Ｆｌ２４０−Ｆｉｅ７ ５０；−口−＝ＦＬ６４０−Ｆｉｃ２０００Ｈ−ロー＝ＦＬ２３０−ＰＡ４００ ０ 図２７０時間の関数として、３匹の免疫感作マウスにおける抗−フルオレセイン ＩｇＧ抗体血清レベル。図に示すように、マウスは水酸化アルミニウムアジュバ ント中のフルオレセイン処理オボアルブミンを繰り返し注射されて、採血まで数 週間生かされた。すべての採血を、血清の１０．０００倍希釈物で同一のＥＬＩ ＳＡアッセイで分析した。 図２８．フルオレセイン処理ポリアクリルアミドポリマーＦＬ３０−Ｐａ５０（ これはすなわち５０ｋＤのポリアクリルアミドポリマーを３０フルオレセインハ ブテン基で置換したもの）による抗−フルオレセインＩｇＧ血清抗体レベルの治 癒。３ｍｇのポリマーが投与された時間を、時間軸上で任意に０日と命名した。 中抜き丸データ一点は、非抑制マウスについての図２７に示されるデータ一点の 平均であり、標準偏差および示された直線に最も合うスクエアを含む。他の６つ のデータ一点は別個の６匹のマウスを示す。 図２９．フルオレセイン処理デキストランポリマーＦＬ２５−Ｄｅｘ７０　（こ れはすなわち７０ｋＤのデキストランポリマーを２５フルオレセインハブテン基 で置換したもの）による抗−フルオレセインＩｇＧ血清抗体レベルの治癒。１ｍ ｇのポリマーが投与された時間を、時間軸上で任意に０８と命名した。中抜き丸 データ一点は、非抑制マウスについての図２７に示されるデータ一点の平均であ り、標準偏差および示された直線に最も合うスクエアを含む。他の６つのデータ 一点は別個の６匹のマウスを示す。 図３０．フルオレセイン処理デキストランポリマーＦＬ３０−Ｄｅｘ８０　（こ れはすなわち８０ｋＤのデキストランポリマーを３０フルオレセインノ＼ブテン 基で置換したもの）による抗−フルオレセインＩｇＧ血清抗体レベルの治癒。３ ＋ｎｇのポリマーが投与された時間を、時間軸上で任意に０日と命名した。中抜 き丸データ一点は、非抑制マウスについての図２７に示されるデータ一点の平均 であり、標準偏差および示された直線に最も合うスクエアを含む。他の３つのデ ータ一点は別個の３匹のマウスを示す。 図３１．　フルオレセイン処理デキストランによる抗−フルオレセインＩｇＧ血 清抗体応答の治癒。ＥＬＩＳＡアッセイの結果は、１００．０００倍希釈したマ ウスの血清であられされる。これらのマウスは指示された時間に、ｌｏｇの水酸 化アルミニウムに吸着させた１０量ｇのフルオレセイン処理オボアルブミンを投 与することにより刺激された。治癒は、指示された時間において、約４０ｋＤの 平均分子量の高度にフルオレセイン処理したデキストランを２＋＋＋ｇ投与する ことによる。データーは３匹のマウスの群からのもので、指示した平均および偏 差を持つ。△＝非刺激；・＝　ＦＬ−ＯＶＡ刺激；　Ｏ＝　ＰＬ−ＤＲＸ治癒。 図３２０図３１と同様であるが、マウスを指示した時間に１ｍｇのアルミニウム 水酸化物に上に吸着させた１μｇのフルオレセイン処理オボアルブミンの投与に より刺激した。 図３３０図３１と同様であるが、マウスを指示した時間に１ｍｇのアルミニウム 水酸化物に上に吸着させた０、１μｇのフルオレセイン処理オボアルブミンの投 与により刺激した。 図３４．抗−ＦＬ　ＩｇＧ血清抗体を生産する多数の牌細胞の治療による整復。 抗体−分泌細胞の数における整復は、実際アルミニウム水酸化物に吸着させたＦ Ｌ−ＯＶＡの広範な初期投与量にわたっている。ロ＝非−治癒；囮＝治癒。 図３５．　ＥＬ−Ｄｅｘで治癒したマウスの牌細胞からの抗−フルオレセインＩ ｇＧ生産リンパ球細胞の整復百分率。マウスは図３１から３３に示されたように 処置され、ＦＬ−Ｄｅｘの最終治癒投与を９５日、そして牌細胞を１２５．３５ 日後に分析した。日＝ゼラチンあたり０．２ＦＬ；Ｅ］＝ゼラチンあたり０．０ ８ＰＬ。 図３６１群あたり６マウスを、異なるラットを異なる日に使用して、治癒した（ ○）および治癒していない（・）マウスからのプールした血清のＩｇＢ抗体レベ ルについて行ったふたつの別個のＰＣＡ測定。 １ｍｇのアルミニウム水酸化物に上に吸着させた０、１μｇのＦＬ−ＯＶＡの刺 激投与が０．２１および７１日にすべてのマウスに対して与えられた。 治癒したマウスに関しては、抗−フルオレセイン１ｇＥ血清抗体応答の治癒は、 ３４および９５日の２ｍｇのＦＬ３０−Ｄｅｘ８０での治療によるものであった 。 図３７．ペニシリン及びベニシロイルハプテンの構造。ＲはペニシリンＧのベン ジル基である（ベンジルペニシリン）。ベニシロイルハプテンにおいて、内部の β−ラクタム環のアミド結合は、キャリアーからの一級アミンが関与するアミド 結合により置換された。 図３８．抑制ポリマーＢＰＯ−ＰＡの投与は実質的に抗−〇ＰＯ応答を完全に破 壊するが（図３８ａ）、抗−ＯＡ力応答は影響しない（図３８ｂ）。２力月間で 抗−ＢＰＯ力価が検出できない投与量になるだけではなく、マウスもＢＰＯ−Ｐ Ａに対して抵抗力を獲得し、１１０日に与えられた“追加免疫”には非応答であ る。口＝対照；■＝実験；↑ＢＰＯ−ＯＡまたはＡ　Ｉ　（ＯＨ）注射；會抑制 ポリマー（ＢＰＯ−ＰＡ）注射。 図３９０足場を制限された結合価を使用する進行中の抗−フルオレセインＩｇＧ 応答の抑制。０−０＝治癒なし；・−・＝７００μｇＣＩ−３７４；△−△＝７ ｏ４　ｇｃｌ−３７４；ムーム＝　７　μｇ　Ｃｌ−３７４；ローロ＝２ｍｇＣ Ｉ−３２３゜ 図４０．単量体（・）及び重合した（・）　ＢＳＡについての血清抗−ＢＳＡ　 １ｇＭ投与一応答。ＣＡＦＩ／Ｊマウスに１０．１００または１０００μｇの単 量体（６８ｋＤ）またはガルボジイミド架橋結合した７０量体（５０００ｋＤ） のＢＳＡ調製物を注射した。ＩｇＭ抗体の応答を、２００倍希釈した血清につい て６日にＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。データーは、点あたり３匹のマ ウスの平均である。 図４１．　ＢＳＡ単量体が応答に及ぼす影響。分子多量性が約１，３゜７．２０ および７０であるＢＳＡ（ＢＳＡ単量体は６８ｋＤの分子の大きさを有する）に ついて、図４０と同様のデーターである。・＝　ｔｏｏｏμｇ投与；・＝１００ μｇ投与；・＝１０μｇ１００図４２．　ＢＳＡ多量体が血清１ｇＧ応答に及ぼ す影響。種々の分子の大きさを有するＢＳＡポリマーを様々な投与量で単一注射 をした１４日後の血清抗−ＢＳＡ　ＩｇＧ抗体レベル。・＝　１ｏｏｏμｇ投与 ；・＝１００μｇ投与；・＝ＩＯμｇ投与。 図４３．単量体ＢＳＡ　（・）またはカルボジイミド架橋結合した２０量体（・ ’）　ＢＳＡの多回注射に関する血清抗−ＢＳＡ投与一応答。抗−ＢＳＡ　Ｉｇ Ｇ応答は、３０日おいて与えられた３回の注射の後に現れる。 ＥＬＩＳＡアッセイのために血清を４０００倍に希釈した。 図４４．極めて少量で与えられたＢＳＡ　“２〇−量体”に対する血清抗−ＢＳ Ａ　ＩｇＧの応答について、多回注射の効果。１μｇの単量体（・）またはカル ボジイミド架橋結合２０量体（・）　ＢＳＡポリマー（１４００ｋＤ）を月単位 で注射した。全体で５μｇ（５回注射）が与えられた。データは３匹のマウスか らの平均である。 図４５．　ＯＶＡ単量体（・）またはグルタルアルデヒド重合した１５０量体（ ・）の注射後５日の血清抗−０ＶＡ　１ｇＭ投与一応答。 図４６．単量体または種々分子の大きさのグルタルアルデヒド架橋重合分画ＯＶ Ａの多回注射に対する血清抗−０ＶＡ応答。ＥＬＩＳＡアッセイのために血清を ４０００倍に希釈した。・＝１００μｇ投与；・＝１０μｇ１０量・＝ｌμｇ投 与。 図４７．単量体および種々のポリマーの大きさのＢＳＡ（震）と０ＶＡ（・）に より生じた血清１ｇＭ応答の比較。月単位でＢＳＡまたはＯｖＡの単量体または 重合物１＋ｏｇ（生理塩溶液）の注射を３回与えられた。血清は２００倍に希釈 された。 図４８．フルオレセイン処理されたＢＳＡポリマーにより生じた抗−フルオレセ イン（ロ）および抗−ＢＳＡ（■）血清１ｇＧ応答。ＢＳＡポリマー（２０量体 ）の試料を、フルオレセインイソチオシアネートでハプテン処理して、ＢＳＡの 単量体あたり種々の量のフルオレセインを持つ調製物を生成する。マウスは隔週 に、生理塩溶液中のｌＯＯμｇを４回（全量４００μｇ）注射された。フルオレ セインおよびＢＳＡに対して血清のＩｇＧ抗体をアッセイした。 図４９．血清中のＩｇＧペプチド（ＧＡＬＡ）−特異的抗体のレベル。説明：マ ウス＃５０−○；マウス＃６　・−−一・；マウス＃７　△・・・△；マウス＃ ８　ム−・−・−ム；★＝注射された緩衝液。 図５０．　ＥＡＬＡ−ＤＥＸ８４による抗体レベル上昇の予防。治癒〇−〇；対 照　・−・・；対照は１　／　１９０．３ｍｌ緩衝液；治癒ＥＡＬＡ　ＤＥＸ− ８４゜図５１．１５９エピトープに対して向けられた１０４応答の特異的抑制。 ７７日の採血の採血後、８３日の治癒；８４日−採血ｄ７−ｄ９１　、説明：↑ “治癒”マウスは種々の投与量の１５９＋　ｏ−ｄｅｘｓ。を注射された；対照 マウスは生理塩溶液を注射された。★対照（・）及び治癒した（０）マウスは腹 膜中にｌｏｇｇの１０４−ＢＳＡを注射された。 図５２．抗−ヒストン抗体力価の抑制。図５２ａは実験群、図５２ｂは対照群で ある。 方法＝１日−１，１０，１００μｇの静脈内または１００μｇの腹膜内。 ３日−２００μｇ、腹膜内。 ９日−２００μｇ１腹膜内。 １６日−２００μｇ、腹膜内。 ２３日−２００μｇ１腹膜内。 説明：異なる直線は異なるマウスを表す。 図５３．抗−ヒストン応答の抑制特異性。 図５３ａ、−抗−Ｎ１５−Ｈ２Ｂ。 図５３ｂ、−抗−５ｓＤＮＡ　。 説明：実験−一ロー、Ｎ＝１７．対照−一〇−１Ｎ　＝　１１゜図５４．可溶性 フルオレセインポリマーによるＴ−細胞インターロイキン−２生産の活性化およ び阻害。トランスフェクションしたＴ−細胞系ＩＢ２をフォルボールエステル（ ３ｎｇ／ｍｌ）および示した種々の濃度の可溶性フルオレセインポリマーで処理 した。インキュベーションの後、上澄みを除去し、ｒＬ−２−依存性細胞系であ るＣＴＬＬ２の増殖を測定することによってＩＬ−２をアッセイした。ＣＴＬＬ ２の増殖は、放射活性チミジンの細胞性ＤＮＡ中への取り込みにより測定される 。（ａ）の部分では、異なる分子量および結合価のふたつのフルオレセインポリ マーに対するＴ−細胞の応答を種々の濃度で測定した。（ｂ）部分では、刺激性 ポリマーの指示された種々の濃度について、４種の濃度の阻害ポリマーが加えら れた：なしく中抜きの四角）　；　０．４８ｕ　ｇ／ｍｌ　（中塗りの三角）　 ；　４．ａ　ｕ　ｇ／ｍｌ　（記号Ｘ）；そして１５μｇ／＋ｏｌ（中塗り四角 ）。 図５５．可溶性フルオレセインポリマーによるＴ−細胞における細胞内カルシウ ム流出の活性化または阻害。トランスフェクションしたＴ−細胞をカルシウム感 受性蛍光染料１ｎｄｏ−ＪＡＭ　（モレキュラーブローブス、オージーン、ＯＲ ：Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｓ　Ｅｕｇｅｎｅ、　ＯＲ）の上に乗せた。コ ールタ−ＭＤＡＤＳフローサイトメーターを使用して、３５５ｎｍで別個に細胞 を刺激してふたつの波長（４０５および４８０ｎｍ）で蛍光発光を測定した。図 において、ある時間それぞれ単−細胞中にカルシウムの濃縮を表さなかった（横 座標軸は１６秒単位であられされる）。 トランスフェクションされた細胞を２０秒間分析し、次にフォルボールエステル またはアクセサリ−細胞が完全に無い条件下で種々のフルオレセインポリマーを 加えた。細胞を刺激性ポリマーであるＦＬ５−Ｆｉｃ１５０　（３８μｇ／＋ｎ ｌ）　（ａ）　、および３．８　μｇ／ａｔ　（ｂ）の濃度で処理した時、少な くとも１０％の細胞に実質的な細胞内カルシウム濃度の上昇が見られたが、３８ ０μｇ／＋ｎｌではより少ないカルシウム流出であった。しかし、阻害ポリマー であるＦＬＩＩ−Ｆｉｃ４６は、測定したいかなる投与量でも実質的なカルシウ ム溶出を誘導せず、しかし実質的な阻害効果を引き起こした（ｄおよびｅ）。刺 激性ポリマーであるＦＬ５０−Ｐｉｃ１５０（３８μｇ／１Ｉｌｌ）　（ｄ）お よび３．８１１　ｇ／＋０１　（ｅ）を、阻害ポリマーとともに細胞の短時間の インキュベーションの後に加えた。両方の場合において、刺激性ポリマーにより 誘導されたカルシウム溶出はほとんど排除される。 発明の説明 本発明の方法は、望ましからぬ免疫応答に罹患している個体に有効量の非−免疫 原性物質（これは多くの抗原性ドメイン、すなわち“エピトープ２または“ハプ テン”を有する）を投与することを含んで成り、この非抗原性物質はたとえばア レルギーまたは自己抗原のような望ましくない応答の原因であるアレルギーや自 己免疫疾患を引き起こす抗原に対応する。ハプテンまたはエピトープは、その指 示されたハプテンまたはエピトープに特異的な細胞の抗原レセプターと結合し、 ハプテンまたはエピトープ数が十分であり、且つ抗原レセプターとの刺激性クラ スターを形成しないようにキャリアーの大きさが正確な閾値限界よりも低ければ 、投与された物質は特異的免疫応答を抑制または回避するのに役立つ。投与され た物質は、アレルギーまたは自己−抗原に対する応答を、体内の一般的な免疫能 力を妥協または害することなく特異的に抑制する。 この一連の出願の初期の開示はＤＮＰ基をエピトープとして受容するために化学 的に修飾された大きさで分画された直線的ポリアクリルアミドを含む構造物に関 する記載を含む。これらの結合体は、ポリマー骨格の大きさく分子量）とハプテ ンの数（与えられた基について、ポリマーの平均分子量当たりのＤＮＰ基の数） に基づき複数の群に組織化される。これらふたつのスケールの量によって、ハプ テンの密度の法則を別個の可変値で定めることができる。これらの構造物を免疫 機能のインビトロ及びインビボモデルの両方に使用して得たデーターに基づき、 抗原によるＢ−細胞活性化を支配する特定の“法則”が解明され、そして抗原特 異性に基づき、Ｔ−細胞非依存性免疫応答を抑制するために使用した。免疫機能 における抗原特異的改変に影響するこれらの法則およびその使用は、初期に申請 した出願に含まれる。 一連のもうひとつの出願は、種々の骨格または足場およびハプテンを含んでこれ らの出願の法則を支持するためのさらなる実験を含む。すなわち、それらが特に Ｔ−細胞非依存性免疫系活性（実際的にはＩｇＭの生産）に応用される元の出願 において解明されたこの法則の“普遍性”を実証した。本開示は、これらの全く 同一の法則の免疫機能の範囲への応用性を明らかにする特異的実験を含み、それ にはＴ−細胞依存性抗体生産（実際にはＩｇＧとＩｇＢの生産として定義される ）、ならびにＴ−細胞活性も同様に含む。 以下に続〈実施例では、親のケースからの例、ならびに単に小さい分子量のＤＮ Ａおよびフルオレセインよりも広い多様性の抗原を含む複合体構造物の例を含む 。このような構造物を設計する時、考慮する必要のある生物物理的かつ生物化学 的考察を以下に説明する。 これらには構造物の合成の化学、ならびに一連の出願に開示された発明の実際的 な基盤を構成する結合価および大きさを支配する第一原理に適合し且つ追従する ように最終産物を特性決定する好ましい方法を含む。 構造物（結合体）については、非−刺激性であり、そして故に“抑制的”または 免疫寛容的性質を生じるものであるべきで、以下の基準のひとつまたは両方に合 わなければない：ｉ）結合体の“結合価”　（実際には最終的な高分子構造物あ たりの“別々の抗原的に認識し得る部分”の数として定義される）はイムノンモ デル閾値以下（一般的に、２０未満）でなければならない。 上述したように、これらの部分は単なるハプテンまたはより複雑なペプチドまた はタンパク質であることもできる。これらの各部分は、多様な“抗原性外観”を 有してもよいが、その部分を認識できる任意に与えられたＢ−細胞については、 たとえ他のＢ−細胞が問題とする他の部分の領域を認識できるとしても、その部 分はその特別なり一細胞のひとつの免疫グロブリンにより認識されるひとつおよ び唯一の別々の結合領域を有するであろうことが理解されるであろう。 結合価を定める目的に関して、多様な同一ペプチド配列（特定のマラリアタンパ ク質に見られる配列、または反復サブユニットを有するヘモグロビンに見られる ようなタンパク質）、または糖残基の規則的な反復を持つ炭水化物（細菌性の多 糖のような）を含有するペプチドまたはタンパク質のような特別な場合は、多様 な“別個の抗原性認識部分”を有すると思われる； ｉｔ）最終構造物の大きさは、“イムノン”を定めるレセプターのクラスターに 広がるために必要な最小の大きさよりも小さくなければならない。効果的な大き さは以下の独立的なパラメーターの数の関数になると思われる：骨格または足場 の幾何（直線、分岐、球状、放射状など）、骨格の物理的性質（柔軟性、強固、 “分節のある”など）、骨格の親水性または疎水性、結合体の静電的性質（上記 骨格と配列部分の両方の電荷の和）、ならびに大きさ、部分それ自体の幾何学的 および物理的修飾。 特別なハプテンまたはエピトープの至適な数および間隔は、キャリアーの大きさ と同様に、マウス、ラット、ウサギまたはブタなどの実験動物についての単純な 試験による実験を過度に行う事なく、選択された足場物質と抗原的に認識し得る 部分を使用して（上記１９７６年の文献を参照）、決定できることが理解される であろう。 ■、免疫抑制構造物の調製 本発明の使用に適する構造物は周知の方法で製造できる。好ましくは、使用され た製造法は別々の分子間の重合の可能性と同様に架橋結合の可能性を最小にする ものである。加えて、製造法は好ましくは配列部分あたり唯一の有力な反応性部 分が存在するように選択され、それによりその部分の骨格に対する方向が制御で きる。生成した構造調製物は、それが高分子量物質、潜在的に刺激性である物質 を含んでいないことを確認するために使用前に都合よく特性決定される。生成し た構造物の再現性を至適化するために、明確にされた化学の足場を制限した結合 価の使用が好ましい。 構造物の設計および解析 Ａ、一般的な化学考察 出願人の発明の基礎をなしている基本的概念は、免疫系がエピトープあるいはハ プテンの抗原アレイ（列）を認識することで外部環境との相互作用を行うことで ある。生物物理学的あるいは生化学的な観点からは、その他のレセプターのリガ ンドと上記エピトープあるいはハプテンは全く異なるところがなく、可溶性の免 疫グロブリンや膜結合性の類似レセプター（Ｂ細胞レセプターやＴ細胞レセプタ ーなど）は他の生物学系のタンパク質性レセプターと全く異なるところはない。 相違点は、個々のレセプターとリガンド間の相互作用にあるわけではなく、リガ ンドがレセプターに結合した後の“情報伝達”にあるわけでもない。免疫系を構 成する個々の膜結合性レセプターは１価のリガンドを結合することができ、この タイプのりガント−レセプター相互作用を行う機能的な相互作用は長期間安定に 存在するレセプターの凝集体を形成し、“イムノン”と命名され個別の単位とな る。この現象は、個々のレセプターとリガンドの相互作用が機能的に重要となる 他の生物学系とは質的に異なる。（例：１個の神経伝達物質がシナプス後膜にあ るレセプターと結合すれば、膜電位の変化が検出される。）イムノン形成は個々 のレセプターと個々のリガンド（エピトープあるいはハプテン）の結合に依存す るが、イムノン自体は配列全体の生物物理学的性質に依存し、個々の結合現象に 依存している訳ではない。 他の生物学系のレセプター−リガンド相互作用と比較した場合、この免疫系のレ セプター−リガンド相互作用の議論の前提となる概念は、閾値の下限と上限のア レイ（列）をそれぞれ免疫学的な“アゴニスト（作動薬）”と“アンタゴニスト （拮抗薬）”とすることである。古典的薬学では、アンタゴニストとはアゴニス トと同等のレセプター親和性を示す結合能力を持つが、′非生産的（拮抗的）″ に作用する物質である。つまり結合はするが、作動薬の結合によるその後の２次 的な現象を活性化しない。 機能遂行はイムノン形成に依存し個々のレセプター−リガンド相互作用には依存 しないため、′アンタゴニストリガンド”は“アンタゴニストアレイ（列）″に 置き換える必要があり、“アンタゴニストアレイ（列）”はレセプターを非生産 的な凝集体に変更し、それによって、“アゴニストアレイ（列）”によるイムノ ン形成を妨害する。生産的および非生産的なレセプターのクラスターと言うこの 概念を使用すれば、免疫学的なアゴニストは一定数のレセプターと結合しイムノ ン形成に必要な最小限度に見合うあるいは越える“閾値上限のアレイ（列）″と 見做すことができ、免疫学的なアンタゴニストはイムノン形成を誘導できないが 複数のレセプターと結合し、（アゴニストの）閾値上限の配列と同等のレセプタ ー結合特性を示す。 最後に、イムノンの概念（機構）が操作的に可能ならば、レセプターを凝集させ る生物物理学的な規則に合致する限りアレイ（列）の特殊な化学的性質は重要で はなく、配列されたリガンドが意図するレセプター群に認識されることは明らか である。たとえば、特定のアレイ（列）だけがレセプターの必要数と相互作用で きるためには、使用される足場の実際的な性質は標的細胞群に認識されるべきで はない。望ましい成果を得るためには、結合価数および／あるいは大きさの原則 が正確に維持された無数の構造物を使用できる。結果として、足場あるいは基本 骨格としての足場の化学的性質を制御することが重要となり、抗原配列が適切な リガンドとして合成され認識されるための基礎を与える。当業者は、生物学系に 導入される前に、使用される最終構造物の組成と完全性を確認することも重要で あると理解するであろう。 例えば、イムノンが凝集させられた８個のレセプターから成るならば、そこでは ８個以下の整数倍のリガンド数に限定された、厳密に限定された“結合価数制限 された”アンタゴニストアレイ（列）によって閾値の下限となるクラスターが得 られることになる。天然の動物では、そのような配列は非刺激性の性質を持ち問 題となるエピトープの抗体産生を阻害するように作用する。 同一抗原に対する免疫応答がすでに確立された動物では、そのような構造物は応 答を引き起こす際の拮抗阻害剤としての作用、つまり抑制的な性質を持つことに なる。他方、イムノンは最少の有限な大きさを持つ必要があり、それはリンパ球 表面上の抗原レセプターの必要数を達成できる最大充填密度から決定される。こ の最少領域（アンタゴニスト配列から制限される大きさ）をカバーできない配列 は、結合部位をどれだけ持ってるかどうかには関わらず、非刺激性の性質と抑制 的な性質を持つことが期待できる。ジニトロフェノール（ＤＮＰ）やフルオレセ イン、あるいは低分子のペプチドのようなリガンドでは、大きさの制限（多分に １５０．　ＯＯＱダルトンより小さい）から、アレイ（列）の大きさを決定する 主な因子は足場である。高分子量のポリペプチドや核酸、あるいはタンパク質の ようなもっと複雑なリガンドでは、最終構造物の大きさを考慮する場合、“リガ ンド”自体が制御要因となる。このような場合、構造から限定される等しい結合 価数が小さなエピトープのために設定された名目上の（計画的な）“大きさ”の 基準を越えるかもしれない。このような場合、どのように免疫系が応答するかと いう観点から、結合価数に対する配慮が大きさに対する配慮に優先する。システ ムに導入された特定のアレイ（列）がレセプターの結合部位に対して閾値以下の 数である場合には、配列の絶対領域がどれだけ大きくとも、イムノンが形成され ることは期待できない。 どちらの場合（大きさあるいは結合価数が制限されたアンタゴニストアレイ（列 ））でも、様々に異なった化学物質が同一の結果をもたらすだろう。以下に、本 発明にとって重要な３種類の技術的な要点を示す。最初の要点は、制御された選 択的な方法でリガンドを共有結合させる足場の調製である。第２の要点は、特定 の方向性で足場に結合できるような、リガンド自体の調製である。第３の要点は 、生物学系に導入する前の最終結合体の作成と評価である。 Ｂ８足場 アゴニストあるいはアンタゴニストアレイ（列）を作成するという観点から、生 物学的に利用可能な様々な足場あるいは基本骨格が利用できる。その中のいくつ かは、選択的な化学修飾を施さなくとも利用可能である。これらの足場に付けら れる唯一の制限は、最終生成物を調製した際にそれらが生理的に使用可能なバッ ファー溶液に対して充分な可能性を持っていることである。足場に結合されるリ ガンドが相対的に水不溶性であっても、最終生成物が可溶性になるような足場を 使用すべきである。あるいは、問題のリガンドが望ましくない荷電を持っている 場合（例：陽電荷）には、それを打ち消すような特性を足場に加えることで、最 終生成物を許容範囲に収められる。一般的な結合反応を導入するためには、足場 上の一級アミノ基が様々な化学修飾あるいは操作に利用できる官能基となり、温 和な水溶液の条件で反応を進めることができる。しかし、このような反応に利用 できる他の化学的性質も、当業者は正しく認識している。以下に、結合用の足場 として利用可能な化学物質のサンプルを提示する。表１に異なった生物物理学的 な性質を持つ足場（実施例１も参照）を要約し、不変概念にアンダーラインを引 いた。 表１ ポリマー分子の分子的特徴 使用する材料の所望される点としては、化学修飾の前後において分析可能であり 、必要に応じて均一性や相対的に狭い質量分布を確認するための調製的な分子量 分画法（例ニゲルろ過法や限外ろ過法）を使えることである。更に、化学修飾の 前後で質量を独立に検証する方法（例：レーザー光散乱法や／あるいは平衡超遠 心法）も同時に実施し、使用する足場がアゴニストアレイあるいはアンタゴニス トアレイのいずれにも必要な大きさの許容範囲に収まることを確認する。 Ｃ，エピトープ 目的のリガンドを修飾し選択された足場に結合するために必要な化学的性質に関 して、一般的な内容を以下に示す。繰り返すが、採用された特定の化学物質は様 々な方法で修飾あるいは変更が可能である。本文の以下に記載される詳細な内容 は、本発明に関連する構造物を生産するために利用できる化学物質の種類の例示 であることを、当業者は正しく認識している。 １、低分子量のハブテン ここでは特に低分子量のハブテンとして、足場の遊離アミノ基を利用でき修飾を 必要としない種類を記載する。例えば、アミノ基と短時間で反応し安定なチオウ レア結合を形成するフルオレセインイソチアネートから、フルオレセイン誘導体 が作成される。その他の低分子量のハブテンでも、既知の化学的方法を用いて利 用可能であることを、当業者は正しく認識している。 ２、ペプチド リガンドとして使用するために同定されたペプチドは修飾が可能であり、それに よって有効に配列することができるが、免疫系では所望の様式を認識される性質 を保つことが必要である。天然に合成されるペプチドあるいはタンパク質は、足 場にペプチドを結合する官能基としてそのまま使用可能な３種類のアミノ酸側鎖 を持つ。これらのグループは、リジンのイプシロンアミノ基（側鎖末端）および Ｎ−末端のアルファアミノ基から構成されるアミン、アスパラギン酸とグルタミ ン酸側鎖の末端に位置する。 カルボキシル基およびＣ−末端のカルボキシル基から構成されるカルボキシル基 、システィンのスルフィドリル（ＳＨ基）である。タンパク質の表面に露出して いるアミノ酸側鎖としてはグルタミン酸やアスパラギン酸、リシンは高頻度で見 られるものであり、結果として抗原−免疫系相互作用には一般的に使用されるこ とを、当業者は正しく認識している。１個以上のアミノ基および／あるいはカル ボキシル基の組み合わせを持つペプチドは、一定の方向性を持たせつつ化学的性 質を制御（維持）するために、特別な注意が必要になる。更に、それらの側鎖を 配列させ形成する際にリガンドのポリマーが生成する可能性があるため、それら を特定する必要がある。Ｒシスティンの遊離スルフィドリル基を利用すれば、各 種の重要な利点を活用できる。最初に、はとんどの生物学での場合、システィン は遊離のスルフィドリル基を持たない。結果として、抗原−免疫系相互作用には 滅多にそれが含まれない。第２に、生物学で一般的に見られるその他の反応基を 除外しても、スルフィドリル基を利用する豊富な化学的性質が存在する。更に、 システィンは自然界で利用されるアミノ酸であるため、組換えタンパク質にも導 入することが可能である。これらのそして更に詳しく述べられる以下の理由から 、ペプチドを様々な足場に結合するためには、スルフィドリル基を利用した化学 は大変望ましいシステムである。 ここで特定されて記載されるすべてのペプチドのために、標準的なペプチド固相 合成法が採用されており、実施例９にその特性が記載されている。問題のペプチ ドがタンパク質に結合された場合には、足場に結合されたペプチドを明確に定量 できる方法を示した出版物を特定する必要がある。リガンドの結合を妨げる主要 な立体的要因を防止するために、様々な種類のスペーサーを問題のリガンドに導 入することができる。 イプシロン（６−）アミノカプロン酸あるいはデルタ（５−）アミノ吉草酸のよ うな“自然界にはない”オメガアミノカルボン酸は、ペプチドを足場に結合する ために用いられるシスティン（あるいはシステアミン−以下参照）と問題のリガ ンドの間のスペーサーとして利用できる。これらのアミノ酸は標準的なアミノ酸 分析に対して特徴的な性質を持ち、ペプチドの“結合価数”の定量に使用可能で あり、同時に足場と問題のペプチド間の柔軟なリンカ−のために使用できる。 ３、タンパク質 タンパク質は、そのようなタイプの抗原で生成された免疫応答に関して、大変異 なった配慮を与える。タンパク質の１分子中には複数の異なった抗原となるエピ トープと同様に異なった種類のエピトープ（配列的な、立体的に線状（連続）な 、立体的に不連続なエピトープ）が含まれる。これらの問題を扱うために、それ らのエピトープとしての表現、それらの合成、アゴニストあるいはアンタゴニス ト内の配置、という異なった範鴫に属する３種類のタンパク質抗原に対するアプ ローチを考慮する必要がある。最初の問題では、低分子量のペプチドあるいは修 飾されたペプチドを基本としたリガンドで、タンパク質の見かけ上の抗原を“マ ツピングすることである。第２の問題は、タンパク質相互あるいは足場に共有結 合されたタンパク質全体あるいは大きなタンパク質のドメインを構成するオリゴ マーの構造である。第３は、タンパク質のエピトープの抗原構造を模倣するが、 天然に合成されたタンパク質とは組成的な相似性をほとんどあるいは全く持って いない“ミノトープの作成である。 これらの試みは、実施例１０に記載される。 ４、糖質 以下に示すものは共有結合で集合している分子を特定する方法で、それは、多糖 類やオリゴ糖類、単糖類（ショ糖）、糖タンパク質あるいはその他の成分の結合 を、還元末端を利用して大きな分子配列を形成させるものである。互換的に、以 下に記載される化学物質は多糖類やオリゴ糖類、糖脂質、糖タンパク質をハブテ ンとして異なった分子性足場に結合させるために使用される。他の分子との結合 に好適な反応性の末端基、アミノ基あるいはスルフィドリル基は、シッフ塩基の 中間体の生成および選択的な還元を利用する次の方法で高率に作成することがで きる。 一級脂肪族アミノグループーシアノ水素化ホウ素ナトリウム（濃、　度、例、０ ．ＯＩＭ）の存在下で、材料となる糖類を二塩酸エチレンジアミン（濃度、例、 ０．１−１．０　Ｍ）　（あるいはＮＯ３−（ＣＨ２）ｎ−ＮＯ３、式中ｎは小 さな数２あるいはそれより大きい）と反応（例、１８時間、ｐＨ５付近）させる 。透析あるいは脱塩カラムで試薬を除去し、それによって末端基の還元を行う完 全な反応が得られ、以後の結合反応に好適な末端の一級アミノ基が形成される。 スルフィドリルグループ−材料となる糖類を、上記のように、ジアミンに替えて システアミンニ塩酸塩（濃度、例、０．１−１．０　Ｍ）で反応させる。反応完 成後、得られたジスルフィド誘導体はＣ１ｅｌａｎｄ試薬のような標準的なジス ルフィド還元試薬で容易に還元され、以後の結合反応に好適なフリーの末端スル フィドリル基が形成される。 ５、核酸 少なく１種類の例（紅斑性狼癒の治療）では、２本ＤＮＡ−核酸が抗原であるこ とが知られている。レセプターと有効に結合するために必要な無修飾の２本鎖Ｄ ＮＡの最小限の大きさを設計する一連の研究から、１００％のレセプター結合に 必要な大きさが４０塩基対程度であることが明かとなった。安定化のために塩基 対の水素結合だけに依存するのではなく、２重鎖を共有結合させた場合には、こ の必要条件は異なってくるだろう。 天然に合成されるＤＮＡ　、合成りＮＡ　、あるいは天然に存在するリン酸結合 の代わりにフォスフォロチオエートを含む修飾ＤＮＡは、効果的なリガンドが作 成するために使用できる。適当な足場へ共有結合させるために必要な官能基を持 った望ましいエピトープの作成に使用できる化学物質のタイプが、実施例１１に 含まれている。 Ｄ、接合体 本発明が関連するこれら方法で使用するために好適な接合体の作成の最終段階は 、適当な足場とリガンドから望ましい配置で結合させ、最終物質が実際に意図し ている内容であるかどうかを確認することである。最終構造物の評価は、これら 材料の調製と使用の重要な部分である（実施例１２を参照）。 ■、Ｔ細胞に依存する免疫応答を抑制ための本構造物の利用これまで示されたよ うに、一連の本出願の初期の出願は大部分、大きさを制限した足場と低分子量の ハブテン（ＤＮＰやフルオレセインなど）で構成される構造物を利用したＴ細胞 とは独立な反応の抑制に関連している。次の本実施例に掲示される資料は、Ｉｇ ＧやＩｇＦ！で示されるＴ細胞依存性の抗体産生を含むより複雑な反応で同一種 類の抑制が得られたことを論証している。次の本実施例で明白なように、ハプテ ンに特異的な抑制性の構造物で動物を感作することにより、それはここに記載さ れた方法に従って作成されたものであるが、ハブテン特異的な（ＩｇＧ生産で示 される）抗体応答の迅速で完全な破壊に効果を与える。その資料では細胞レベル で抑制が生ずることを示している。ＩｇＢで示される臨床上重要な外来性アレル ゲン（小さな化学物質および複雑なエピトープの両者を含む）に対する抗体反応 は、以下に示される結合価数と大きさの基準に合致する構造物で完全に抑制され る。更に、本発明の構造物は自己免疫を抑制するためにも使用できる。 ここに提示された方法論に従った以下の実施例の結果および初期の出願から、低 分子量のハプテンと同様に複雑な抗原（ペプチド、タンパク質、リポタンパク質 、糖タンパク質、核酸、糖類、脂質、糖脂質）へのＴ（細胞）依存性の抗体応答 に対して広範囲に応用できることが、正しく理解される。含まれる本質的な原則 は、特定の足場あるいは足場に依存しない。非常に異なる化学的性質を持つポリ マー（デキストラン、ポリアクリルアミド、Ｆｉｃｏｌｌなど）を使用できる。 更に、以上に示されたように、抗原認識を行うイムノンモデルの規則に従うどの ようなあるいは全ての外来性（アレルギー性）抗原または内在性（自己免疫性） 抗原に対するＴ（細胞）依存性の抗体応答に、本技術は適用できる。以下の非− 制限的な実施例は本発明の特定の観点をより詳細に記載する。 実施例 実施例１０足場の合成： Ａ、デキストラン デキストランは多くの理由から“原型的”な足場と考えられる＝１）それは水性 緩衝液に自由に溶解できる、２）“いつでもすぐに（ｏｆｆ　ｔｈｅ　５ｈｅｌ ｆ）　”の化学を使用して、即修飾することができる、３）有意な毒性な（、血 漿増量剤としてヒトにダラム量で使用されて来た、４）大まかに大きさで分画さ れたバルク量が低いコストで入手可能である、５）＠乳類のデキストラナーゼは 知られていない。 後者の観点は、本技術で第一に考慮することのひとつが実験動物またはヒトに望 ましい結果を生じるようにするためには配列は代謝的に安定でなければならない ことであるので特に重要である。 本明細書では種々の化学を使用して代表的な実施例を与える。当業者はデキスト ランを修飾するための化学が他の系にも推定できることを理解するであろう。 ａ、基本的な“デキサミン”とＧＭＢ−デキサミンデキストランを活性化してペ プチドの共有結合が起こることができるように使用した化学式を図１に示す。種 々の分子量のデキストラン（１）は、始めにりｏｏ酢酸（ＣＩＣＨ，Ｃ０１Ｈ） 　テ、グ／ｌｚ：１シル２’−９３°　−または４°−水酸基の位置をカルボキ シメチル化して、対応するカルボキシメチル−デキストランを生成する（２）。 デキサミン（３）への転換は、次に（カルボキシメチル−デキストラン）をエチ レンジアミン（ＮＨＩ　ＣＨ、ＣＨ＊　ＮＨ、）と水溶性のカルボジイミド（Ｅ ＤＣ＝１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイド ロクロライド）−仲介カッブリング反応で反応させることにより達成される。デ キサミン（３）中の遊離のアミノ基の存在は、標準的な定量のための分析化学技 術を使用して“アミン置換密度”を測定することを可能にする。デキサミン（３ ）のミリグラムあたりのアミンの存在はμモル数で表され、アミン密度の値は、 任意の特定のペプチドについて理論的な最大置換密度を表す。本明細書に記載さ れた実施例で使用されたデキサミン（３）は、デキサミン（３）試料中の５グル コシル残基（または１０００　ｇ　１モル）あたりにひとつの−級アミノ基（− Ｎｌ（１）を日常的に含有することが分かった。 デキサミン（３）アミノ基のへテロニ官能性アシル化試薬での誘導化は二ガンマ ーマレイミドｎ−ブチル酸Ｎ−ヒドロキトサクシンイミド　エステル（ＧＭＢＳ ）で、次に活性化または“結合可能な”デキストランの形を与えた：ガンマーマ レイミドｎ−プチリルデキサミン（ＧＭＢ−デキサミン　４）。システィン−含 有ペプチドのスルフィドリル基と反応するのは（即ち結合するのは）ＧＭＢ−デ キサミン（４）の中のマレイミド官能基であり、ペプチドーデキサミン結合体を 生成する。 ペプチド−デキストラン結合体の調製に使用するデキストラン（１）は、大きさ で分画された平均分子量ポリマーである。クロロ酢酸およびエチレンジアミンは アルドリッチ化学社（Ａｌｄｒｉｃｈ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、　）から購入し た。！−エチルー３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロ クロライド（ＥＤＣ）とガンマ−マレイミドｎ−ブチル酸Ｎ−ヒドロキトサクシ ンイミド　エステル（ＧＭＢＳ）はシグマ化学社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ＋ｏｉｃ ａｌ　Ｃｏ、から購入した。トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）はピア ス化学社（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）から購入した。ＧＭＢ− デキサミン（４）の調製に使用したリン酸塩溶液（ＰＢＳ　：　１５０＋ｎＭ　 ＮａＣ１，１０ｏ＋Ｍ　リン酸、ｐＨ７，３−７，４）はオートクレーブ処理し 、続いて０．２μｍのフィルターを通してｌ０ＸＰＢＳ保存液を新しく調製した （毎日の反応の度に）。（このようなＰＢＳの調製は望ましくない混入を防止す るために、結合体の生産には重要である）。 透析チューブ（６，０００−８，０００＋ｎｗｃｏ）をスペクトル医療産業社（ ＳｐｅｃｔｒｕｍＭｅｄｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、）から得た 。 デキストラン（１）の精製およびデキストラン（１）またはデキサミン（３）と の分子量測定は、サイズ排除クロマトグラフィー、引き続き平衡超遠心、および ／またはレーザー光散乱法を使用して行った。 カルボキシメチル−デキストラン（２）をデキストランから以下のようにして生 成した：水酸化ナトリウム（６７５＋ｏｍｏｌｅ　、５Ｍ　ＮａＯＨを１３５ａ ＋１）を０．３Ｌの水に加え、生成した溶液を氷−水浴で撹拌しながら冷却した （０℃）。クロロ酢酸（６４，４ｇ、　６８５ｍｍｏｌｅ）を加えて撹拌を完全 な溶解が起こるまで０℃で続けた。生成した溶液を室温に暖め、ｐｔｔを約７に ＮａＯＨまたはクロロ酢酸を加えることにより調整した。全量の０．５Ｌに希釈 した後、１８５ｍ１のクロロ酢酸溶液をデキストラン試料（０，１４３ａ＋ｍｏ ｌｅ）に加え、カルボキシメチル化反応を５０ｍ１のＩＯＭ　Ｎａ０Ｈ（５００ ＋ｎ＋ｏｏｌｅ）を添加して開始した。反応溶液を全量２５０＋ｎｌに希釈して 、カルボキシメチル化を３７℃で２０時時間待させた。反応は、６ＭＨＣｌでｐ ｎを約７に調整して終了した。反応溶液を室温にまで冷却した後、５日間水に透 析（水を一日に２度交換した）し、生成したカルボキシメチル−デキストラン（ ２）を凍結乾燥により単離した。 デキサミン（３）を、カルボキシメチル−デキストラン（２）から以下のように して生成した：　（０，１４３ｍｍｏｌｅカルボキシメチル−デキストラン（２ ）反応スケール）：カルボキシメチルーデキストラン（２）を３００ｍ１の水に 溶解し、エチレンジアミン（４５ｇ　、　７５０ｍｍｏｌｅ）を加えた。生成し た溶液を室温で撹拌し、ｐＨを約５に１ＭＨＣｌで調整した。ｌ−エチル−３− （３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ， ４ｇ、　２０．８６ｍｍｏｌｅ）をＩＯから２０分間にわたって撹拌しながら滴 下した。反応溶液のｐＨを１５分毎にチェックし、はぼｐＨ５に４時間維持した （ＩＭＨＣＩを加えることにより）。次に徹底的な透析を以下のように行った８ ３０％ＡｃＯＨに一晩、水に２４時間（２度交換）、３０％ＡｃＯＨに一晩、水 に２４時間（２度交換）　、ＬＭ　ＮａＣ１に一晩そして水に４８時間（水を日 に２度交換）。 生成したデキサミン（３）を凍結乾燥によって単離した。 （デキサ）アミン含量（即ちアミン置換密度）の測定を以下のように行った：デ キサミン（３）を１ｍｌの０．１Ｍ四硼素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，３）に溶 解し、ｌ　−２ｍｇ／ｍｌの濃度の溶液を与えた。新しく調製したトリニトロベ ンゼンスルホン酸緩衝液（ＴＮＢＳ、四硼素ナトリウム緩衝液中の３０關溶液２ ５μＬ）を加えて、生成した反応混合液（ポルテックスで撹拌）を２時間室温に 暗所で保存した。黄色く着色した溶液を試薬ブランクに対して３６６ｎｍで読ん だ。１ｍＭリシン、２ｍＭグリシンまたは２＋ｏＭアミノブチル酸の標準を調製 し、標準曲線を緩衝液で全量１＋ｎｌに希釈した種々のアリコートから作成した 。 ＧＭＢ（ガンマ−マレイミド旦−ブチリル）−デキサミン（４）をデキサミン（ ３）から以下のように調製した：デキサミン（上記のように調製）をリン酸塩溶 液（ＰＢＳ、　ｐＨ７，５）に溶解し、室温で撹拌して５−１０＋ｎｇ／ｍｌの 濃度の溶液を与えた。（デキサ）ミン含量に比して（４）５モル過剰のＧＭＢＳ 　（ガンマ−マレイミド旦−ブチル酸Ｎ−ヒドロキトサクシンイミド　エステル ）を乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、　４オングストロームのモレキュラーシ ーブ上で保存）中に溶解し、ＧＭＢＳの濃度が約５ｈ＋ｇ／ｍｌになるようにし た。このＧＭＢＳ／ＴＨＦ溶液を撹拌しているデキサミン（３）に滴下し、アシ ル化反応を室温で３０分間進行させ、その間溶液のｐＨを１　ｍＭ　ＮａＯＨの 滴下によって７．１−７．５に維持した。ＧＭＢ−デキサミン（４）を次に、Ｐ ＢＳ（ｐＨ７，５）に平衡化した１５　Ｘ　３０ｃｍの５ｈｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ −２５カラム上で反応混合物をゲル濾過することにより過剰のＧＭＢＳと分離し た。カラムの溶出液をファルマシアの２波長Ｕｖモニターで２８０ｎｍで監視し た。ＧＭＢ−デキサミン（４）を含有するカラム分画を混合し、減少したシステ ィン（Ｃｙｓ）−含有ペプチドの未決定の有用性を残しておいた。 ｂ、別の中性、アニオン性およびカチオン性“デキサミン”上述したように、特 定の条件下で足場は問題のリガンドの望ましくない荷電プロファイルを補正する 必要があるだろう。以下に記載する手段によって、上述の基本的なデキストラン の化学の改変を使用してデキストランを基本とする足場を中性、アニオン性また はカチオン性の性質を有するものに作成できる。 中性の足場の調製のために、デキストラン（１）のカルボキシメチルデキストラ ン（２）への第一の改変は、上記のものと同一である。しかしこの点で、二つの 異なるアミノアミド（β−Ａｌａ−ＣＯＮＨｔまたはＬ−ＧＬｎ−ＣＯＮＨＣＨ ，）はカルボキシメチルデキストランと凝縮することができ、ふたつの異なるタ イプの“デキサミド”が形成され、これは最終的に図２に記載された荷電中性デ キサミンに転換するだろう。 アニオン性の足場を調製するために、別の前駆体デキサミドが必要である。これ は以下の手順に従ってＬ−ＡｓｎまたはＬ−Ｇｉｎのいずれかとデキストランと を凝縮させることにより形成することができる＝４−二トロフェニルク口口ホル メート（６８５Ｂ、　３．４＋ｎ＋ｎｏｌｅ）を、乾燥ＤＭＳＯ−ピリジン混合 物（１：　１．ｖ／ｖ）中の１ｇデキストラン溶液（１３，８７μｍｏｌｅ）に 氷−水浴中、０℃で加えた。この溶液に、７６ａ＋Ｈの４−（Ｎ、Ｎ−ジメチル アミノ）ピリジン（６，２２ａ＋ｍｏｌｅ）を加えた。反応混合液を０℃で４時 間撹拌し、次に５０倍過剰モルのＬ−ＡｓｎまたはＬ−Ｇｉｎのいずれかを加え た。反応混合液をゆっくりと室温にまで暖めて、さらに４８時間撹拌を続けた。 デキサミドは過剰の乾燥エタノール／エチルエーテル（８：　２．　ｖ／ｖ）で 沈殿し、真空下で乾燥させた。乾燥物質を水に溶解し、水に対して３日間透析し 、そして凍結乾燥させた（ｌ×）。 いったん所望のデキサミドが調製されれば、デキサミンをはじめに５０％水性ア セトニトリルに溶解して、次に室温でゆっくり撹拌することによって、対応する 中性またはアニオン性のデキサミンに転換できる。この溶液に数倍モル過剰（計 算されたアミド含量に比して）のイオドベンゼンニ酢酸を加え、反応混合液を一 晩撹拌する。 （イオドベンゼンニ酢酸は、化学量論的に１等量の一級アミドを対応する一級ア ミンに転換する）。生成したデキサミンを他の生成物からサイズ排除クロマトグ ラフィーにより精製して、真空濃縮、そして水から凍結乾燥することができる。 図３はデキストランからアニオン性に負荷したデキサミンの完全な転換を説明す る。 アニオン性の性質を有するデキサミンよりも有用ではないが、正味の電荷が正で ある（結合の後）デキサミンも特定の限られた場合においては有用であろう。こ の物質の調製は、エチレンジアミン−含有デキサミンで以下のように行われる： 　（デキ）サミン（４）基のＮａ−Ｎｐｙｓ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｏ３ｕのアシル化に より、アシル化された（デキ）サミン（４）等量あたり１等量の陽性電荷が取り 込まれることになる。引き続き、Ｎａ−Ｎｐｙｓ基の除去（（ｎ−Ｂｕ）　、　 Ｐで）遊離α−アミノ基を遊離し、これはさらにＧＭＢＳでアシル化されるか、 またはＮ−メトキシカルボニルマレイミドを通じてマレイミド官能基中に直接転 換されることができる。Ａｒｇのより長いまたは短い同族体も類似の様式で使用 できる（例えばホモアーグ（Ｈｏｍｏａｒｇ）　（図４参照）。 Ｂ、ポリアクリルアミドおよびポリ（アクリルアミン−アクリル酸）モノマーか ら合成した直鎖ポリアクリルアミドは水溶液で、平衡超遠心、高圧液体クロマト グラフィー（ＨＰＬＣ）、サイズ排除ゲルクロマトグラフィー　（ＳＥＣ）およ び光散乱法により２０．０００から５００．０ＯＯｋＤａに変化するの平均分子 の大きさを与える。調製物を適当なゲル濾過りｏｖトゲラフイーカラム（Ｓｅｐ ｈａｒｏｓｅＣＬ−２８，ＣＬ−４８またはＣＬ−６Ｂ　。 ファルマシア製）で大きさで分画し、）ＩＰＬＣにより測定されたように、比較 的狭い範囲の分子量分布の中央でカットした。 通常はそのようなポリアクリルアミド調製物を化学的にアミノ基と置換して、そ れらをさらにハブテン試薬と後にカップリングさせて調製した。これは始めに、 重炭酸緩衝液中でカルボキシアミド基を時間を変えて加水分解し、カルボキシ基 含量が異なる一連の調製物が生成した。そのようなカルボキシル化ポリマーは、 次にそのカルボキシル基において水溶性カルボジイミドの作用によりエチレンジ アミンと結合し、反応進行中に各カルボキシル基に置き換わったアミド結合およ び遊離のアミノ基を生成した。引き続きハプテンはアミノ基において、化学的置 換により生成したアミノ−置換ポリマーにカップルした。使用した方法の詳細は Ｄｉｎｔｚｉｓら（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’　１゜Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．　Ｕ、　 Ｓ、＾、７３：３６７１−３６７５（１９７６）およびＩｎｍａｎら、Ｂｉｏｃ ｈｅｍｓｔｒｙ８．４０７４−４０８２（１９８９））を参照のこと。 別の中性直鎖状ポリアクリルアミドを提供するために、ならびにアニオン性の性 質を有するもうひとつのキャリアーを提供するために、上記のイオドベンセンニ 酢酸反応を変更して使用し、市販されている、大きさで分画されたアクリルアミ ドアクリル酸のランダムコポリマーで合成した。特に、Ｉ、Ｉ−ビス（トリフル オロアセトキシ）イオドベンゼンをＤＭＦに溶解し、連続的に撹拌しながらその 中に等容量の水をゆっくりと加えた。次に大きさで分画したポリマーを反応混合 液に加えて、室温で一晩撹拌した。これを次に分別漏斗に移し、反応混合液と等 量の水で３回洗浄し、ジエチルエーテルで抽出した（４×容量で４回抽出）。最 終的な水層を真空で濃縮し、残渣を水に再溶解して水に対して数日間透析した。 透析物を濾過し凍結乾燥して綿毛のような白色固体を生成する。 １、Ｉ−ビス（トリフルオロアセトキシ）イオドベンゼンの１等量は化学量論的 に１等量の一級アミドを対応する一級アミンに転換するので、最終ポリマー産物 のアミン置換密度を変えることが可能である。さらに、当業者は同じ方法をアク リル酸含量にかかわらず任意のアクリルアミド含有ポリマーに採用できると理解 するであろう。ポリ（アクリルアミド・・・アクリル酸）から対応するアミン− 含有ポリマーへの転換を図５に示す。 Ｃ，Ｆｉｃｏｌｌ Ｆｉｃｏｌｌはデキストランのようなものであるが、デキストランを種々のデキ サミン（中性、アニオン性およびカチオン性）に転換するために記載したような 同一の化学を使用して修飾できる水酸基を有する多糖ポリマーである。加えて、 これらの物質は種々の分子量範囲を商業的にバルク量で入手できる。デキストラ ンを基本とする足場とＦｉｃｏｌｌを基本とする足場の相違は、Ｆｉｃｏｌｌが より球状すなわち“三次元”的な性質であるのに対し、デキストランはより直線 的で分岐している点である。以下に続〈実施例で与えられるデーターかられかる ように、この相違はアゴニストまたはアンタゴニスト配列の生産または使用に関 して有意に機能的な結論を導がないように思われる。 Ｄ、カルボキシメチルセルロース 繰り返すが、カルボキシメチルセルロースは生化学的観点からデキストランおよ びＦｉｃｏｌｌの両方に非常にょくにている。しがしこのポリマーは、初めから 正味のアニオン性の性質を有し、結果としてアニオン性の足場を作成するために 使用できる。理解されるように、このポリマーを修飾するために必要な化学は、 いったんカルボキシメチル化されればデキストランと本質的に同じである。 Ｅ、ポリビニルアルコール ポリビニルアルコールは炭水化物に基づくものではないが、デキストランについ て上述した同じ化学により修飾できる遊離の水酸部分を有する。 Ｆ、ポリ（Ｄ−Ｇｌｕ／Ｄ−Ｌｙｓ） ポリ（Ｄ−Ｇｌｕ／Ｄ−Ｌｙｓ）は、Ｄ−グルタミン酸とＤ−リジンのランダム な直線状ポリマーであり、分子量が１００．０００ダルトンより低いものが約４ ０％Ｄ−リシンおよび６ｏ％Ｄ−グルタミン酸組成で市販されている。より高分 子量の足場は、種々の濃度で水溶性カルボジイミドのような可溶性架橋剤を導入 することにより生成できる。生成した架橋結合物質は、次に上記の他のポリマー のためのものと同じサイズ排除クロマトグラフィーおよび分子量の大きさの分析 に供することができる。ポリマーはすでにＤ−リシン残基のイプシロンアミノ基 に由来する遊離の一級アミンを有するため、これらの構造物がＣＭＢＳのような 連結基を受け入れるためのさらなる修飾は不要である。 しかし、理解されるようにすべての電荷をカバーする能力はこのタイプの調製で は限界がある。 Ｇ、タンパク質 化学修飾のためのカルボキシルおよびアミノ基の両方の有用性に関しては、タン パク質または他のポリペプチドは多くの観点でポリ（Ｄ−Ｇｌｕ／Ｄ−Ｌｙｓ） コポリマーのように挙動する。タンパク質が提供する重要な利点を以下に説明す る。 第一にタンパク質は、上記のポリ（Ｄ−Ｇｌｕ／Ｄ−Ｌｙｓ）を架橋結合、なら びに分離した同様な様式で大きさに関して架橋結合、および分離されることがで きる。分画は効果的に結合価が制限されたオリゴマー（二量体、三量体など）に 等しいように分別できる。結果として、これらの構造物はアゴニストおよび／ま たはアンタゴニスト配列として、さらに修飾することなく使用できる。 第二に、組換えＤＮＡ　／タンパク質工学技術は、組換え的に生産した他のタン パク質またはタンパク質ドメインのオリゴマー性表示（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ　 ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）で核となる“足場”から作られた融合タンパク 質が構成できる点まで発展して来た。繰り返すが、最終生成物は所望の“エピト ープ”または“リガンド”は単にそれらが結合価を制限されたキャリアーに化学 的に架橋または結合されるだけで、結合価が制限された配列を表すように配合す ることができる。 最後に、ストレプトアビジンは比較的ユニークな構造を有し、それはビオチン部 分を所望のリガンドに導入することによって四量体配列を形成するために使用す ることができる。ストレプトアビジンは、その部分に高い親和性を有するビオチ ン用の４つの結合部位を有し、これは一旦結合すると本質的に共有結合と同じで ある。加えてストレプトアビジンは自由に可溶性であり、中性付近に等電点を有 するので、望ましくない荷電特性を避けることができる。 Ｈ１結合価を制限した足場の“点供給源”本明細書に開示されるデーターの大部 分は、大きさを制限した足場を使用して作成された。上述したように、アゴニス ト及びアンタゴニストのための結合価を制限した足場には別の方法を使用すべき である。以下に説明されたものの多くはこの目的のために使用できる、結合価を 制限した、または“点供給源”としての足場である。 当業者は、これらの足場がこの要求に見合うために構成できる有力な結合価を制 限されたタイプのわずか２〜３のものであることを認識するであろう。 マレイミド／ザクシンイミド部分をこの一連の足場の代表的な反応性基として使 用して、いくつかの可能性のある組成物を市販されている開始物質から合成でき る。図６に説明されたものは、これら“点供給源の足場”のタイプのサンプリン グである。当業者は、記載された特異的な化合物を修飾して点供給源としての足 場を生成でき、これは必要とされる結合体または“腕の長さ”の任意の大きさに ついて任意の多くの別法に利用されることを理解するであろう。 ■、シクロデキストリンを基本とした結合価を制限した足場最終的な構造物の効 果的な大きさと結合価の両方に関して変更し得る可能性を持つ、別のタイプの足 場も作成できる。ベーターデキストリンを鋳型として使用するこのタイプの足場 を以下に説明するが、ここで結合価は正確に定義された化学、ならびにポリエチ レングリコールのような種々のタイプの柔軟なスペーサーを使用する腕の長さに よって制御されることができる。 シクロデキストリン（ＣＤ）は、α　ｌ→４グリコシド結合を介して連結された グルコース単位から作られたオリゴサツカライドである。 生成した円環体状分子において、第一および第二級水酸基は対抗面に位置してい る。 第二級水酸基の存在下で、第一級水酸基を選択的に官能化することが可能である 。加えて、“連結基”の使用を介して、多官能化シクロデキストリンの任意の組 合わせを作成できる（図７）。 α、βまたはγＤＣの予備誘導化により、対応する６、７、および８の結合価の 生成物が提供される。これらの化合物のそれぞれが、モノ−官能化されることも できる。二官能性保護基でβ−ＣＤの処理（これは最も入手容易な基質である） をすることにより、二保護された生成物が生じるであろう。これは次に２又は５ 置換生成物を提供できる。従って、ふたつの連結基との反応は、３または４の結 合価を持つ生成物を導く。従って保護基の賢明な使用により、ｌから８のエピト ープをＣＤに付けることが可能である。 このタイプの化学を使用して、結合価および“腕の長さ”を変更して、リガンド 付与のための放射状に分かれた配列すなわち“タコのような”足場と考えられる ようなものを作ることができる。このタイプの配列は、レセプター群が細胞膜上 を比較的自由に移動するとき、レセプター／リガンド相互反応に適する。加えて 、“腕”の化学を変更して、前進的な柔軟性が無い腕に比較的自由な挙動範囲を 与えて生成することができる。 以下の開示は、望ましからぬ抗原特異的免疫応答を抑制するために使用する、こ のタイプの構造物を作成するために採用できる化学のいくつかである。 β−シシクデキストリンｌ、を図解した方法を使用して（Ｂｏｇｅｒら、Ｈｅ１ ｖｅｔｉｃａ　Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ　１９７８．６１：２９１０）そのヘ プタアミノ置換体に移行する（手順ｌ）。 手順ｌ 伸長した腕の生成物３を、以下のようにヘプタアミノβ−シクロデキストリン（ ２）　（３，０ｇ、　２．１５＋ｎｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２，４ａ ＋１．１７．２ａ＋＋＋＋ｏｌ）を５０ｍ１のＤＭＦに溶解した。ＥＤＣ（３， ７８ｇ　、　１９．３ｍｍｏｌ）を加え、次にＢｏｃ−ｅ−アミノカプロン酸（ ５，５３ｇ、　１９．３ａ＋ｍｏｌ）を加えた。反応混合物を一晩撹拌し、そこ に２００ｍ１の水を加えた時、沈殿が生じた。固体生成物を濾取して、水で洗浄 し、真空で乾燥して４．７８ｇ　（８５％）のＢｏｃ保護物３を生成した。脱保 護は以下のように実施した、つまり生成物を５０ｍ１のＨＣＩ飽和ジオキサン（ ４Ｎ）に溶解し、３時間撹拌した。次の蒸発によって３を２．９９ｇ　（７５％ ）生成した。 手順２ Ｃ５−０００１は３から以下のようにして作られた。伸長した腕のβ−シクロデ キストリン（３）　（５００ｍｇ、　０．２３ｍｍｏｌ）を６０ｍ１の０．１Ｍ Ｎ３４　Ｃｏ　ｓに溶解した。ＧＭＢＳ　（２，２５ｇ、　８．０５ｍｍｏｌ） を４０ｍ１のＴＨＦに溶解し反応混合物に加え、これを−晩撹拌した。混合物を 蒸発させ、ＲＰＨＰＬＣで精製して、２５ｈａｇ（３６％）のＣ５−０００１を 生成した。 手順３ さらに足場Ｃ５−０００２を上記のような条件で生成した＝３をＢｏｃ　−ε− アミノカプロン酸と凝縮し、Ｂｏｃ基を除去した。生成したより長い腕の３の変 更体を次にＣＭＢＳと反応させて、Ｃ５−０００２を与えた。 （手順４）。 手順４ フルオレセイン特異的構造物Ｃｌ−３７４を３から以下のように製造した。伸長 した腕のβ−シクロデキストリン（３）　（４０＋ｎｇ、　０．０１９ｍｍｏｌ ）をｌｏｍｌの０．１　Ｍ　ＮａＨＣＯｓに溶解した。フルオレセインイソチオ シアネート（２００ｍｇ、　０．５２ｎ＋＋＋＋ｏｌ）を加え、生成した混合物 を一晩撹拌した。 オレンジ色の溶液をＹＭ３膜を通して濾液の着色がなくなるまで限外濾過した。 残存するオレンジ色のレチンティト（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）をＲＰＩ（ＰＬＣ手 順５ １４本の腕を持つ足場（６）を以下のように製造した。ヘプタアミノβ−シクロ デキストリン（２）　（５００ｍｇ、　０．３６＋＋＋＋＋＋ｏｌ）を４ｍｌの ＤＭＦに溶解した。Ｎａ−ｔ　−Ｈｏｅ−Ｎε−ｔ　−Ｂｏｃ−Ｌ　−１ｙｓｉ ｎｅ　−Ｎ　−ヒドロキシサクシンイミド　エステル（４，５６ｍｇ、　１０． １ｍｍｏｌ）を加え、Ｎ−メチルモルホリン（３２ｏμＬ、　２．８８＋ｎｍｏ ｌ）を加えた。反応混合物を一晩撹拌し、そこに２５ｍ１の水を加えた時、沈殿 が生じた。固体生成物を濾取して、水で洗浄し乾燥した。生成した固体をＨＣＩ 飽和ジオキサン中に溶解し、３時間撹拌した。蒸発によって５７５＋ｎｇ（６３ ％）の５を生成した。 この１４本の腕を持つ生成物−５（４００ｍｇ、　０．１６ｍｍｏｌ）を４ｍｌ のＤＭＦに溶解した。Ｂｏｃ−ε−アミノカプロニック−Ｎ−ヒドロキシサクシ ンイミド　エステル（２，８９ｇ、　８．８５＋＋ｕ＋＋ｏｌ）を加え、Ｎ−メ チルモルホリン（４８０μＬ、　４．４２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を一 晩撹拌し、そこに２５ｍ１の水を加えた時、生成物の沈殿が生じた。１４本の腕 を持つ足場を濾取して、水で洗浄し乾燥した。生成した固体をすぐにＩＩｃＩ飽 和ジオキサン中に溶解し、３時間撹拌した。蒸発によって９６ｍｇ（６０％）の ６を生成した。 これらの化合物はすべて、満足する’ＨＮＭＲ、マススペクトルおよびアミノ酸 分析結果を表した。 手順６ 他の腕はポリエチレングリコール単位または他のいくつかの親水性ポリマーサブ ユニットから構成することができる。この種のスペーサーは、レセプター間の距 離の探索を可能にする。アミンとヒドロキシ末端を持つヘテロ三官能性連結基を 、活性化基をヒドロキシ末端で修飾するように官能化できる。これを次に化合物 ２または３のアミンと置換できる。Ｎ−末端保護基の除去の際にすでに記載した 足場のひとつが（より長い足場を有する）生じるであろう。 実施例２．結合体調製に使用されたペプチドについての合成および分析法 ａ、固相ペプチド合成 ペプチド−デキストラン結合体に取り入れられるべきペプチドは、標準的な段階 的ペプチド鎖伸長法を使用して固相ペプチド合成により作成された。簡単に述べ ると、固相ペプチド合成は、合成樹脂に付いているアミノ酸残基のＮａ−脱保護 から始まる。この工程は、次に脱保護したアミノ酸−含有樹脂の中和化および洗 浄し、これは樹脂が次のアミノ酸を受け入れる（即ち反応する）準備であり、そ れ自体を活性化して第一のペプチド結合（−Ｎ）ｌ−Ｃｏ−）の形成を容易にす る。引き続き、既に（ジ）ペプチド−含有となった樹脂を洗浄した後、所望のペ プチドが生成するまで一連の同じ出来事が続いて起こった。最終的なペプチドを 樹脂から次に切り離し、この条件は同時にいくつかのまたは全部のアミノ酸−鎖 保護基が除去される。樹脂からの切り離しに使用されるものとは異なる条件の特 別な保護基の除去は、しばしば引き続き骨格への結合がより制御し易くなるよう に採用される。 この研究に使用されたすべての試薬は、標準的な販売元から得た。 固相ペプチド合成は、アプライドバイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙ ｓｔｅｍｓ：ＡＢＩ）４３０Ａか、またはバイオサーチ９６００全自動ペプチド ドアミドメチル（Ａｃｍ、　）！Ｆ感受性）またはニトロピリジンスルフェニル （Ｎｐｙｓ、　ＨＦ安定性）で、ＨＰ感受性またはＨＦ安定性のいずれかの必要 に応じてＳ−保護した。結合体へ取り入れられべきペプチドのＮ−またはＣ−末 端のいずれかへのＣｙｓ残基の添加は、Ｃｙｓスルフィドリル基（−３Ｈ）が形 態する核性部分を持つペプチドで提供される。 別法として、他の結合体部分を提供するために他の一３Ｈ含有残基（例えばシス チミンまたはホモシスティン）をシスティンで置換することもできる。これらの 修飾の利点を以下に検討する。 最終的なペプチジル−残基を、真空で乾燥し、次にバイオサーチ（Ｂｉｏｓｅａ ｒｃｈ）ＨＦ開裂装置またはベニンスーララボラトリーズ（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）タイプＴＨＦ装置のいずれかの反応槽中に置いた 。ペプチドを標準的なＨＦ法を使用して樹脂から切り離す。真空中でＨＦ除去の 後、樹脂をジエチルエーテルでよく洗浄して、ペプチドを樹脂からトリフルオロ 酢酸（引き続きジエチルエーテルの添加によりペプチドを沈殿させる）または、 １０−３０％水性酢酸（引き続き凍結乾燥する）で抽出した。 逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）をウォーターズ　デルタ−プレツ ブ３０００調製用クロマトグラフイーシステム（４７＋ｎｍｘ　３０ｃｍ。 デルタ−バック、ラジアルコンプレッション、カートリッジ、３００オングスト ローム、１５μｍ　Ｃｐｓを含む）（Ｗａｔｅｒｓ　Ｄｅｌｔａ−Ｐｒｅｐ　３ ０００；Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ　ｒａｄｉａｌ　ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｃａｒ ｔｉｄｇ）で実施し、これは可変波長検出器を装備していた。典型的に、ペプチ ドを直線的アセトニトリル勾配（０％−１００％、一定濃度のトリフルオロ酢酸 を０．１％Ｖ／Ｖで含有）で４０分にわたって溶出した。精製は、２１５ｎｍで 監視し、精製物質の均一性を分析ＨＰＬＣをウォーターズ　デルタ−バックＣ１ ｌカラム（３００オングストローム、１５μｍ、ＣＩｌ；カラム径：　３．９ｍ ｍｘ３０ｃｍ）　、で同一の勾配で確認した。 合成したペプチドのアミノ酸分析を、ウォーターズＰｉｃｏ−ＴＡＧ化学（Ｂｉ ｄｌｉｎｇｍｅｙｅｒ、　Ｂ、Ａ、らＪ、Ｃｈｒｏｍ、、　３３６．９３−１０ ４（１９８４））を使用して得、これはペプチドの６ＭＨＣｌでの一定した沸騰 による揮発−相加水分解、フェニルインチオシアネート（ＰＩＴＣ）での遊離ア ミノ酸の誘導化、そしてウォーターズＰＩＣＯ４ＡＧ　Ｃｐｓカラム（５μｍ、 Ｃｐｓ；カラム径：　３．９ｍｍ　Ｘ　１５ｃｍ）の逆相高速液体クロマトグラ フィーによる生成したフェニルチオカルバモイル（ＰＴＣ）−アミノ酸を分離／ 定量、が関与した。精製されたいかなるペプチドのアミノ酸分析も提案された配 列と一致した（統合の正確さ：±５％）。 実施例３．エピトープ−タンパク質 ａ、エピトープマッピング エピトープマツピングは免疫系により認識される特異的タンパク質領域の特性決 定に関連する。体液性の応答を考慮する場合、少なくとも球状タンパク質の“核 （Ｃｏｒｅ）”に存在するペプチドは、免疫系には認識されないようである。結 果として、異なるエピトープに関するタンパク質の表面マツプを、所望の配列中 に取り込まれるべきペプチドの設計および合成のために使用すべきである。この タイプのエピトープマツピングの実施例は、ＮＺＢ／ＮＺＷマウスにより認識さ れるヒストン抗原の同定によって説明される。 ヒストンＨ２Ｂに対する自動免疫応答を抑制するために（これは全身性エリテマ トーデス（ＳＬＢ）の（ＮＺＢｘＮＺＷ）Ｆ、ネズミモデルにおいて生じている ）、ヒストンＨ２Ｂの抗体結合ドメインが同定されなければならなかった。同定 工程をここでは“エピトープマツピングと呼ぶが、引き続き分析されて抗原性領 域が確立される種々の重複したペプチド断片の合成を含む。明らかに、この全８ ２Ｂ構造（１２５アミノ酸）の研究は、大量のペプチド合成が必要であろう。し かしＳＬＩ？患者および狼癒一様の疾患の持つマウスの研究から、Ｈ２ＯＮ−末 端領域をトリプシンで除去することが抗原性の喪失を生じることが知られている （Ｐｒｏｔａｎｏｖａ、　Ｊ、Ｐ、らＪ、Ｉ＋ｕ＋ｕｎｏ１．３８．４４６−４ ５７（１９８７）　、それゆえに注目すべきは、ヒストン８２Ｂのこの領域から 誘導されるペプチドの合成に集中した。ペプチドおよびそれらのそれぞれの命名 を下記の表２に表す。 Ｈ２ＯのＮ−末端３０ｍｅｒ（＝狼癒７′）に反応性の（ＮＺＢｘＮＺＷ）Ｆ、 　マウスから得た血清は、初めの１５アミノ酸残基（狼癒２°）を含むペプチド には強く結合するが、より内部領域（即ち狼癒の３’　、４’、または５°）に 含まれるペプチドには結合しないことが分かった。 Ｎ−末端（＝Ｎ−Ａｃ−（狼癒２’　（６−１５，５−１５，４−１５，３−１ ５およびおよび１２−８）−ＣＯＮＨｔ）から先端が短縮されたペプチドを含む ８２Ｂの自動抗原性領域のさらなる特性決定は、８２Ｂ残基３−１２中のように 、（ＮＺＢｘＮＺＷ）Ｆ、マウスにより認識される抗原を与えることが可能であ るという結果を得た。 表２ エピトープマツピングのために合成されたヒストンＨ２ＢペプチドＰ　ｒｏ−Ｇ 　ｌ　ｕ−Ｐｒｏ−Ａ　１ａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａ　１ａ−Ｐｒｏ−Ａ　１ａ− Ｐ　ｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ　−Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ｌｙｓ−ＣＹＳ−ＣＯＮＨｚ” 狼瘉２′Ｎ−Ａｃｅ　ｔ　ｙ　ｌ　−Ｃｙｓ−Ａ　Ｉａ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙ ｓ−Ｇ　Ｉ　ｙ−３ｅ　ｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ　−Ａ　１ａ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｌ ｙｓ−＾１ａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−ＣＯＮＨｔ：狼癒３゜＾−、ｌ；ｔ、３該Ｃ， ｙ、ｓＨＩ、ｙ、ｓλＡｌ２ＨＶ、Ｈ１２Ｔｈｒ−、：圓ＩＢＡＧｌｎ−Ｌｙｓ −Ｌｙｓ−ざ讃叩λＦ、２Ｅ、、１．１鴎９澤！計ε１舒ｙｓ−Ｇｌｙ−３°′ ルバ−’；＝！渾ｆｆ１ｇ’Ｅｉｊ＝−ＰｒＯｉＡｉ”；”ｇｃ＋歌Ｌｙｓ−ｃ ｌ　Ｙ−３°′−Ｌ間代ＡＩａ−、〒λ瞳晶−Ｐ、ｒ２−、！２１．ａ５Ｐｒｇ 、、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌ　ｙ−Ｎ−Ａｃｅ　ｔ　ｙ　Ｉ　−Ｐｒｏ−Ａ　Ｉａ −Ｌｙｓ−８ｅ　ｒ−Ａ　Ｉａ−Ｐｒｏ−Ａ　１ａ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ　 −Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ｌｙｓ−ＣＯＮＨｔ＝Ｎ−Ａｃ−［狼ｆＭ　２°（３−１５ ）コーＣＯＮＨ２涜ｙｔｙ、！　２ＧＩｕ５Ｐｒｇ、、鍋−ＬｙＳ−８°ｒ−Ａ ｌ″−Ｐｒｏ−ＣＯＮ）Ｉｔ゛ｊｑ−Ａｏ−Ｎ−Ａｃｅ　ｔ　ｙ　Ｉ　−Ｇ　Ｉ 　ｕ−Ｐｒｏ−Ａ　Ｉａ−Ｌｙｓ　−８ｅｒ−Ａ　Ｉａ−Ｐｒｏ　−Ａ　１ａ− Ｐｒｏ−ＣＯＮＨｔ；Ｎ−Ａｃ−［狼瘉２’　（２−１０）］−ＣＯＮＨ！Ｍ″ 品晶：？靜ご？♂讐−２ｙ（２昔ｒ５Ａ晃δ島ｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−抑 制性接合体内に取り込まれるべく選択されたペプチドは明らかに、マウス免疫系 により認識されるのに充分な免疫学的「情報」を含むばかりでなく、残基３−１ ２の正味正電荷特性をアドレスしなくてはならなかった。これを達成する目的で 、２つの非ヒストンＣ末端グルタミン酸（Ｇｌｕ）残基と同様に、免疫学的には 必要とされないＮ−Ａｃ−Ｇｌｕ”が含み入れられた。こうして「電荷平衡のと れた」ペプチドに対して、同じく免疫学的には必要でないが純粋に電荷平衡の目 的で含められた要素（すなわち−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ）と免疫学的認識のために必要 とされた要素（すなわち残基３−１２）の間にスペースを提供した残基であるグ リシンが付加された。Ｎ−Ａｃ−［Ｌｕｐｕｓ　２’　（２−１３）］−］Ｇｌ ｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−ＣＯＮＨと呼ばれる最後の標的ペプチド（表２参照）を次 に接合のために用いた。 上述のように、陽イオン性の高いエピトープは、特にそれらが多価で配列される 場合、補償される必要があるがもじれない。この場合、このような補償は、付加 的な陰イオン性アミノ酸を規定のエピトープに付加することによって行なわれた 。代替的には、陰イオン性足場を用いることもできた。いずれの場合でも、望ま れる成果は、細胞膜といった陰イオン性表面にこれらの化合物が非特異的に付着 するのを避けるため全体として電荷中性又は幾分が陰イオン性の構成体を得るこ とである。 Ｈ２Ｂヒストンタンパク質の抗原性ファサードは、マウス固体群によって産生さ れた抗体の固体群全体を収納することのできた単一の連続的ペプチド配列で構成 されている。又、各々の個別マウスがエピトープ全体内の離散性領域を認識した 一方で、マウスの固体群全体は、単一のペプチドリガンドを用いて処理できた。 多数の離散性エピトープに遭遇する可能性がより高いブタフサ抗原Ｅといったそ の他のタンパク質については、これが通例である可能性は低い。ここでも又、一 定の与えられたエピトープに関する一つの固体群内の一定量の微変異性が考えら れる：単一のエピトープが、固体群全体についてその地金てのものよりも卓越し うるとは全く考えられない。 上述のことから見て、少なくとも２つの代替案のうちの１つを利用することがで きる。いずれの多重リガンドでも合成することができ、特異的リガンドを各々伴 うアレイの混合物が又はリガンド混合物のアレイ（抗原的展望から見た人工タン バク質）のいずれがとして現われ、ここで各アレイは関連するリガンドの価が制 限された表現を含んでいる。もう１つの代替案は、問題のタンパク質の価が制限 されたアレイを生成することである。特定の抗原性タンパク質に対する免疫応答 を操作するためにこれらのタイプの構成体が最も適切な手段であることが決定さ れた場合、以下の合成アプローチを用いることができる。 ｂ、オリゴ価の不均質性エピトープアレイとしてのタンパク質オリゴマー タンパク質の抗原性ファサードをマツピングすることに対する一つの代替案は、 自らに架橋されたが又は異なるタイプの足場上に配列されたタンパク質から成る 問題のタンパク質のオリゴマー（価制限を受けた）アレイを生成することである 。このタイプの構成体は、免疫系によって認識されている離散性エピトープが多 数存在する場合又はエピトープのうちのいくつかが、分子の不連続で立体配座の 制約を受けた領域によって形成されている場合に望まれる。これらのタイプの構 成体のうちの２つが作製され、これらを用いてタンパク質オリゴマーがイムノン パラダイムに従って挙動することを確認した。これらのオリゴマーの調製につい て以下で記述する。 （１）ＢＳＡ及びＯＶＡの重合 全て水溶性及び時間安定性をもつ、２量体から非常に高度の重合体に至るまでの 重合体をＢＳＡ又はＯＶＡの重合によってかなりの収量で得ることができるよう にする条件が設定された。水溶性及び時間安定性という特性は、限定できる重合 レベルの狭い分画を生成した手順であるゲルろ過カラム上での重合体の長時間に わたるその後の分画化のため、特に重要なものである。ＢＳＡは１つの分子上の 遊離カルボキシル基とアミド結合を通して隣接する分子上の遊離アミノ基に連鎖 させる試薬である水溶性カルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミ ノプロピル）カルボジイミドを使用することによって、自らに重合させた。ＯＶ Ａは、１つの分子上の遊離アミノ基を隣接する分子上の遊離基に連鎖させる試薬 であるグルタルアルデヒドの使用により、自らに重合させた。 （２）分画化手順 上述の化学的架橋段階の間に生成されたタンパク質の単量体、オリゴマー及び重 合体を分画化し、ＨＰＬＣ分析によって測定した場合に狭い分子量分布を示すよ うになるまで、一連のゲルろ過カラム上での再分画化を反復して行なった。次に 、平衡条件下でＥ型分析用超遠心分離機を用いて、各分画についての分子量を測 定した。この長時間にわたる一連の緩慢な分画化段階の間に、処理、取扱い又は 保存に関与する数多くの段階のいずれかに対して不安定である分子を試料から分 画化し各々比較的狭い範囲の実質的時間安定性をもつ分子サイズを含む一連の調 製物を得た。これらの水溶性調整物を次に、その相対的免疫原性を決定するため 、いかなるアジュバントも使用せずに、腹腔内でマウスに注射した。標準的な固 体ＥＬＩＳＡ技法によりＢＳＡ又は（ＩＶＡに対する血清１ｇＭ又はＩｇＧ抗体 レベルを測定することによって、免疫応答レベルを測定した。 あるいは、タンパク質単量体１つにつきわずか１つのビオチン成分が取り込まれ るような形で、望まれるタンパク質をビオチニル化することができる。このこと は、タンパク質上の遊離アミン又はカルボキシル基のいずれかと反応できる修飾 ビオチン分子と、希釈溶液中のタンパク質単量体の有意なモル余剰分と反応させ ることによって、達成できる。これらの条件は、幾重もの誘導体化されたタンパ ク質単量体を最小限におさえながら、「単官能化された」タンパク質分子の卓越 性を生み出す。次にこれらのビオチニル化されたタンパク質を、いくつかの重合 体構成体がサイズ排除クロマトグラフィで除去された状態で、ストレブタビジン と厳密に四価で配列させることができる。 タンパク質リガンドの同様な「単官能化」は、多くの異なる化学的方法を用いて 達成でき、その場合官能化されたタンパク質は同じ終了点に達するべく、価が制 限された足場上で配列される。これらの価が制限されたアレイを用いて、次に望 ましい方法で免疫系を操作することが可能である。 最終的に、上述のとおり、充分に規定されたタンパク質ドメイン又はタンパク質 全体によって表わされるエピトープを、価の制限されたアレイの一部としてか又 は完全に独立した価の制限あるアレイとして使用するため望ましい価をもつ遺伝 子的に工学処理された構成体の中に取り込ませることが可能である。 Ｃ，ミモトーブ 免疫グロブリン及びそれに関連する表面結合レセプタは、問題の抗原の電荷及び 物理的構造（形状、疎水性又は親水性、水素結合ドナー又はアクセプタ基など） と、卓越した関連性をもつ。ペプチド配列、炭水化物含有量などとの関係におけ る抗原の特異的［含有量、１は、それがリガンドとレセプタの「適合」に貢献す る場合にのみ有意義である。その結果、数多くの異なる研究所において、望まし いレセプタに「適合する」能力についてスクリーニングを受けることのできる任 意に合成された数多くのりガントを生成できるようにする方法を開発することに 多大な研究努力が払われてきた。このような要領で識別されたリガンドと、免疫 系の応答が向けられる「天然の」リガンドとの関係は、その構造的類似性のみに 制限されている。 このようなリガンドには、天然に発生するエピトープを模擬するこのタイプのリ ガンドの能力を表現するため、「ミモトープ」という名称が与えられた。 当業者であれば、標準的な化学的修飾技術及び置換を用いて標的レセプタ個体群 に対するその結合を強化するべくミモトーブを修正することができるということ がわかるだろう。ランダムプロセスによって生成されたミモトーブは、アゴニス ト又はアンタゴニストアレイを生成するべく足場に対し接合させられる前に、修 正を必要とする可能性がある。 例４、エピトープ−核酸 ａ、サイズ分画化された天然に存在するＤＮＡ　Ｓａｌｍｏｎ　ｔｅｓｔｅｓ　 ＤＮＡの反応の生成物を、次にマンガンイオンの存在下でウシ膵臓デオキシリボ ヌクレアーゼＩ　（ＢＲＬ　Ｇｉｂｃｏ）での部分的消化に付した。マンガンイ オンの存在下で、ウシ膵臓ＤＮａｓｅｌは、はぼ同じ部位で２本鎖ＤＮＡの両方 の鎖を開裂させて、平滑末端になっているか又は長さがわずか１又は２ヌクレオ チドの突出した末端をもつＤＮＡのフラグメントを生み出す（Ｍｅｌｇａｒ及び Ｇｏｌｄｔｈｗａｉ　ｔｅ、　１９６８年）　ｅ＋　ＤＮａｓｅｌでの開裂の後 、ＤＮＡの５′末端はリン酸塩基を保持する。ＤＮａｓｅ１反応の生成物を次に 、５　ｃｍＸ　９２ｃ＋ｎの旧ｏｇｅｌ　Ａ−１，５ｍ　（細メツシユ、Ｂｉｏ −Ｒａｄ）カラム上でサイズ分画化させた。このカラムを、１５０　ｙａＭのＮ のＣＩ。 ５０＋ｎＭのトリスＨＣＩ　ｐＨ７，２，１ｍＭのＥＤＴＡで溶出させた。分画 を収集し、分画のアリコートをポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した 。長さが約６０〜１２０ヌクレオチドのＤＮＡを含んでいた分画をプールしエタ ノール沈降反応によりＤＮＡを回収した。ＤＮＡの濃度は、ＯＤ、６゜を測定す ることによって決定した。なおここで１ＯＤｔ＝ｏは５０Ｍｇ／ｍｌの２本鎖Ｄ ＮＡに等しい。このＤＮＡは次に以下の要領で接合のため修正された。 ビス−５゛　−リン酸塩として供給されたＤＮＡ（０，６４μｍｏｌｅ）を、１ −メチルイミダゾール緩衝液（０，１Ｍ　ｐＨ６）Ｉ）中テｌｌ：ＤＣ（０，１ ５Ｍ）を用いてビス−５’−（１−メチル）ホスフォリミダゾリドへと変換した 。次に（Ｓ−３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル）−システアミン（（Ｓ− Ｎｐｙｓ）−Ｃｍｎ、　０．２Ｍ）に対するカップリングによって、ビス−ホス フォルアミデート、すなわちＤＮＡの（保護解除後の）接合可能形状を得た。余 剰（Ｓ−Ｎｌ））’Ｓ）−Ｃｍｎの除去及び誘導体化されたＤＮＡの単離は、無 水ＥｔＯ）ｌからの反復的沈降反応により達成された。 ５０合成りＮＡ 「接合可能な」合成りＮＡを提供するように設計された他の合成の研究努力は、 ５′−長の誘導体化及び長さ４ｏヌクレオチドの合成りＮＡの最終的接合に、焦 点をあてていた。ＤＮＡは、メーカーの化学製剤及びプロトコルを用いてＡｐｐ ｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの３８１Ａ型ＤＮＡシンセサイザ上でβ−シア ノエチルを用いて合成された。オリゴヌクレオチドのいくつかは、５゛末端にア ミノ基を伴って合成された。このアミノ基は、市販のＤＮＡ合成試薬Ａ＋ｎ１ｎ ｏｌｉｎｋ２（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から誘導された。Ａｍ １ｎｏｌｉｎｋ２試薬は、メーカーの推奨プロトコルに従って用いられた。固体 支持体から除去し、メーカーのプロトコルに従って保護解除させた後、５ｅｐｈ ａｄｅｘ　Ｇ−５０（細メツシユ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の１．６　ｃｍＸ　１ Ｂｃｍカラム上でのゲルろ過によりＤＮＡを精製した。カラムを０．５ＭのＮＨ 、ＯＨで溶出させた。分画を収集し、ＤＮＡを含む分画をプールして凍結乾燥さ せた。ＤＮＡを水中で再度懸濁させ、ＯＤ□。 を測定することによって濃度を決定した。一本鎖ＤＮＡについて、１の１つを用 いて、誘導体化を行なう。 反応性−級アミノ基も同様に、Ｇｌｅｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈから入手できる修飾 ヌクレオチドのカップリングを介して合成りＮＡ　４０−ｍａｒの５′末端で取 込むことができる。このヌクレオチドつまり修飾されたチミジンは、ｌＯ原子の スペーサ基により塩基成分に付着されたトリフルオロアセチル化された一部アミ ンを含む。Ａ＋ｎ１ｎｏｌｉｎｋアプローチに対する代替案として、（アミン取 込みの）この方法は、保護されたアミノ基を支持するヌクレオチドの取込みの（ 標準的ＤＮＡ比色定量カップリング検定を介しての）確認という利点をもつ。合 成りＮＡの化学的５“−リン酸化も同様に可能であり、得られるＤＮＡが単官能 化されている点を除いて、上述のサイズ分画化されたＤＮＡと官能的に同じＤＮ Ａを生成する。接合のためこのタイプの合成りＮＡを調製すること、すなわち（ （Ｓ−Ｎｐｙｓ）−Ｃｍｎのカップリングとその後のジスルフィド還元は、上記 第８節で記されているとおりに達成される。当業者であれば、ホスフォロチオ酸 塩含有ＤＮＡ及びＤＮＡのエンド及び工可能であり、接合可能な核酸を生成する のと同じ技術（上述）により修正できるものであることがわかるだろう。 あらゆる場合において、接合を目的とするＤＮＡは、保護解除されマレイミド含 有足場と反応させられた時点で上述のチオール含有ペプチドと類似の要領で足場 に対し接合することになる保護されたチオール含有成分と誘導体化される。さら に、これらの修飾されたＤＮＡ類似体は、このとき、望ましい足場に対するＤＮ Ａの共有結合による付着を明確に確認し計量するのに用いることのできる１つの 残基を含んでいる。 例５量接合体 Ａ、接合体合成 硫黄ベースのさまざまなタイプの化学薬品の使用が本書で特定的に記述されてい るものの、これらの化学薬品は、リガンド及び足場を連鎖するために用いること のできるタイプのわずかな見本にすぎない。足場とリガンドの間のあらゆる立体 化学的相互作用を減少させるため［スペーサアームｊを提供するのに利用できる タイプの化学薬品又は、いずれかの特定の利用分野のための代替的接合化学薬品 を、上述の開示から外挿することが可能である。価及び／又はサイズの根本的法 則が維持され、リガンドが標的レセプタと相互作用できるかぎり、足場及びリガ ンドのあらゆる幾何形状又は化学的性質を受容することが可能である。イムノン パラダイムを最大の免疫応答範囲にまで拡張するのに利用された化学的作用のい くつかについて、以下に記述する。 ａ、低分子量のハブテン 以下で記述するように、調査のために選択された低分子量ハブテンは全て、望ま れる足場に対して容易に共有結合で付着できるようにする反応基を含んでいた。 接合は全て水溶液中で行なわれ、未接合の低分子量ハブテンは透析、限外ろ過又 はサイズ排除クロマトグラフィによって除去された。 ｂ、ペプチド システィン（Ｃｙｓ）含有ペプチドとＧＭＢ−デキサミン（４）の間の反応は、 α・β−未未飽和シルボニル系反応する請求核性試薬の周知の傾向の一例にすぎ ない。この反応は、接合体−又は１．　４−付加と呼ばれ、デキストランに対す るペプチドの共有結合による付着のために用いられる。当業者であれば、バック ボーン又はハプテンの組合せのいずれか特定のセットを収納するのに、他の接合 化学作用を利用できるということを認識するだろう。反応性チオールを活用する 他の化学作用としては、ハロアルカン又はハロアセトアミドとの反応が含まれる 。このような反応には全て、Ｎ−又はＣ−末端Ｃｙｓ残基を有するペプチドの還 元されたばかりの緩衝溶液及び調製されたばかりのＧＭＢ−デキサミン（４）が 関与する。 接合反応に使用されるＣ末端Ｃｙｓ含有ペプチドは、接合に先立って予備的１（ ＰＬＯによって分析的純度にまで日常的に精製されていた。Ｎ末端Ｃｙｓ含有ペ プチドはその接合に先立って精製される必要が無い場合があり、実際には標準的 ＨＦ後開裂抽出段階だけが行なわれた後で使用できるが、これらのペプチドはそ の接合に先立って精製も受けた。 Ｃｙｓ含有ペプチドとＧＭＢ−デキサミン（４）の反応はきわめて急速なプロセ スである（ＰＢＳ内ｐＨ５−７で接合されたペプチドについてはｔｌ／２＜５分 、酢酸緩衝液中でｐＨ７でのシスティンとＮ−エチルマレイミドの反応について はｔｌ／２＝０．７秒）ものの、（例えばＰＢＳ中で）遊離スルフヒドリル（Ｃ ｙｓ）−含有ペプチドとＧＭＢ−デキサミン（４）が混合される場合にはつねに 発生する全く異なる１つの競合反応が存在する。すなわち、非反応性ジスルフィ ドを生成するためのペプチドの２量体化である。これら２つのプロセス、すなわ ち同時に起こる接合と２量体化は、究極的な接合収量ひいては接合ペプチドの密 度も実現する。マレイミド官能基は、接合反応のｐＨ範囲（ｐＨ５〜７（全体に わたって極めて安定したものであることが観察された。特定的に言うと、マレイ ミド２重結合の加水分解により生成されたスクシニミド形状のデキサミンは、代 表的接合反応条件に対するＧＭＢ−デキサミン（４）の２日間にわたる露呈の後 も検出できなかった。従ってＧＭＢ−デキサミン（４）の加水分解は、接合収量 に影響を及ぼすｌ要因（すなわち副反応）であるとは思われない。 システィン（Ｃｙｓ）含有ペプチド及びＧＭＢ−デキサミン（４）は、上述のと おりに調製した。 ｃａ、　０．５ｍｅｑ／　ｇの還元能力をもつりダクトアクリル樹脂（不動化さ れたＣ１ｅｌａｎｄ試薬＝ジチオトレイトール（ＤＴＴ））を、ＣＡＬ１３１０ ＣＨＥＭＣｏｒｐから入手した。Ｃｙｓ含有ペプチドの還元及び接合反応で使用 されるリン酸緩衝溶液（ＰＢｓ）は、上述のとおりに調製した。 Ｎ−又はＣ−末端Ｃｙｓ残基を有する精製ペプチドを、最高３　ｌｌ１ｇ／ｍｌ の濃度でＰＢＳ中に溶解させた。次に、シングーガラスの底面と窒素（ガス）入 口を具備したガラス反応容器内で、５０倍モル余剰のりダクトアクリル樹脂（Ｄ ＴＴ当量）に、ペプチド溶液を付加した。窒素バブリングで促進して反応混合物 を穏やかに混合することにより、室温で３０〜４５分間ペプチドの還元を行なっ た。次に完全に還元されたＣｙｓ含有ペプチドを、ＰＢＳ中のＧＭＢ−デキサミ ン（４）の調製したばかりの溶液にゆっくりと加え、結果として得た接合反応を 室温で２時間（反応ｐＨ５〜７）進行させた。最大下レベルのペプチドで数多く の接合反応を行なったため、全ては、（デク）サミン含有量との関係において１ ０倍余剰分のメルカプトエタノール（ＭＥ）で２４時間、常法によりクエンチン グした。この予防措置により、接合体に対してそのインビボ寿命中に望ましくな いペプチド／タンパク質が付加されたり或いは又精製、保存又は使用中に接合体 が互いに又はその他の巨大分子に対し架橋したりすることが防止できる。最終的 接合体におけるより大きい陰イオン特性に対する必要性に応じて、メルカプトエ タノールを、それぞれ各々のマレイミド基について１つ又は２つの頁の電荷の当 量を導入するメルカプト酢酸（ＭＡＡ）又はメルカプトスクシン酸（ＭＳＡ）の いずれかで置換することが可能である。 ペプチド−デキストラン接合体の精製：クエンチングされた反応混合物内に存在 するペプチド−デキストラン接合体を、ＰＢＳに対する大規模な透析又は限外ろ 過のいずれかによって精製／単離した。このような処理により、完成した接合体 からメルカプトエタノール又はその他のクエンチング試薬及び未接合ペプチドが 効果的に除去される。後者のタイプの反応「汚染物質」に関しては、共有結合で 結びついていないペプチドが接合体の免疫原性又は免疫抑制性のいずれに対して も著しく貢献するはずがないという仮定は、免疫応答のイムノンモデルの状況に おいて接合体に期待されることを考えた場合、理にかなったものである。しかし ながらいくつかのタイプの共有結合付着の「指標」が無い場合、共有結合で結び ついていないペプチドは、実際上重大な意味をもつ数量である接合体ペプチド置 換密度の著しい過大評価という結果をもたらす可能性がある。共有結合した接合 体ペプチドの「明確な」指標が発見され（旦−２（２Ｒ，２旦−スクシニル）− Ｌ−Ｃｙｓ）、以下では、これについてさらに詳細に記述する。透析又は限外ろ 過のいずれによっても扱かわれないのは、完成したペプチド−デキストラン接合 体からの高分子量（すなわち、望まれる接合体のものよりも著しく大きい）の物 質の除去である。予備的データは、高分子量の物質が存在する場合、それが往々 にして非常にわずかな汚染物質にすぎないこと、つまり接合体が主として単量体 であることを示している。（高分子量の物質の観察はレーザー光散乱分析によっ て行なわれたため、汚染の正確な程度を立証することは不可能である）。 クエンチングされた接合反応混合物は、まとめて、１２０００〜ｉ、４０００ｍ ｗｃｏの透析用管へと移され、次に以下の予定に従ってＰＢＳに対し、透析され た：ｅａ、０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮを含むＰＢＳに対して２４時間（２回の ＰＢＳ交換）　、ＰＢＳに対して２４時間（３回のＰＢＳ交換）、そして次に１ ／ｌｏ強度（すなわち１５ｍＭのＮａＣｌ及び１ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７，３〜 ７．４）のＰＢＳに対して２４時間（３回のＰＢＳ交換）、限外ろ過は、以下の とおり、５０００又は１００００　ｍｗｃｏフィルタのいずれかが備わったＡｏ ｉ　ｃｏｎ８２００限外容器の中で行なわれた：接合反応混合物を、約０．０２ ％（ｗ／ｖ）ＮａＮを含むＰＩＩＳで合計量？、、００　ｍｌになるまで希釈し 、次に５５ｐｓ、（窒素圧力）で３０！１１以下の量まで濃縮した。次にこのプ ロセスを２回ＰＢＳに反復し、さらに１　、／ｌＯ強度のＰＢＳで２回反復した 。透析又は限外ろ過が完成した後、精製されたペプチド−デキストラン接合体を ポリプロピレン−ポリエチレンの小びんの中に等分し、冷凍して、凍結乾燥させ た。完成した接合体を、凍結乾燥させた形で一２０℃に保存した。 Ｃ１核酸 上述のとおり、接合のために用いられるＤＮＡは、接合したときにペプチドと類 似の方法で挙動するように修正される。以下に記述するのは、望ましい足場に合 成りＮＡ又はサイズ分画化されたＤＮＡのいずれかを付着させるいくつかの方法 である。 （１）天然ＤＮＡ ＤＮＡの保護解除すなわち５−Ｎｐｙｓ基の除去は、１ｍＭのＥＤＴＡ／　Ｊ、 　ＭのＮａＣｌを含む１−メチルイミダゾール緩衝液（０，］、６Ｍ、　ｐＨ６ ）内で１時間リダクトアクリル樹脂に対して露呈することによって行なわれる。 次に、（今や）チオールを含むＤＮＡを直接ＧＭ［１−Ｄｅｘ（５ｍｇ＞溶液中 に付加してＤＮＡ　／Ｄｅｘ接合体を生成させる。Ｌ−Ｃｙｓでのクエンチング 及び限外ろ過による反応体積の減少に続いて、５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−４００ ＨＲ上での予備的なゲルろ過により接合体を精製する。ＴＳＫ５０００（Ｔｏｓ ｏ　Ｈａａｓ）上での精製済接合体のサイズ排除ＨＰＬＣクロマトグラフィによ ると、ゲルろ過段階によってカップリングされていなかったＤＮＡの完全な除去 が達成されたことがわかった。ビス−チオール機能化ＤＮＡの使用は、オリゴマ （ＤＮＡと架橋されたデキストラン分子）の生産を可能性の高いものにし、濃縮 された接合反応混合物内のオリゴマの存在は、予備的なゲルろ過の間明白であっ た。ＤＮＡ　／Ｄｅｘ「単量体」ピークから完全に消散されていないものの、こ の「汚染物質」は、分画が保存的に組合わされた場合望ましい接合体から除去さ れうる。 価の計算上、反応性チオール（−ＳＨ）基をもつＤＮＡのビス−機能化がデキス トラン表面上での「ループ状のＪ　ＤＮＡ構造の生産という結県をもたらしたと 仮定した場合、アミノ酸分析により立証されたスクシニル−システアミン（Ｓｕ ｃｃ−Ｃａｎ）の計量された量は、共有結合で付着されたＤＮＡの量の２分の１ を示すことになる。上述の接合化学作用は、Ｄｅｘ　ｔ。Ｋ１モルあたり約６〜 ８モルの「ループ状Ｊ　ＤＮＡという結果をもたらすと思われる。 サイズ分画化されたＤＮＡ−デキストラン接合体を調製する間に、ＧＭＢ−デキ ストラン上に存在する極微量の未反応マレイミドを除去するべく注意を払った（ 余剰Ｃｙｓ付加の形で）。さらに上述のとおり、予備的ゲルろ過の間に存在する 高分子量の種（すなわちオリゴマ）を、保存的な分画組合せを介して除去した。 しかしながら、４℃で放置された時点で、精製された接合体はほぼ完全により高 い分子量のオリゴマへと変換することがわかった。ジスルフィドＣ−５−Ｓ−＞ ２量体は、ビス−チオール−機能化分子の関与するあらゆる反応プロセスに付随 する可能性があり、予備的ゲルろ過中に除去されたオリゴマの供給源であると仮 定されているため、観察された分子量の移動は、（推定された）ジスルフィド形 成プロセスの継続により説明がつく可能性が最も高い。この仮説と一貫している のは、精製された接合体が予想通りの要領で外園的に付加されたＤＴＴに応答し たという発見事実つまり基本的には望まれる比較的低い分子量の接合体の完全な 再生（再分化）であった。 さらに何か月か前に調製され４℃で連続的に保存されていたサイズ分画化された ＤＮＡ−デキストラン接合体はＤＴＴに応答したが、その反応速度は、調製され たばかりの接合体に付随するものに比べはるかに遅いものであった。これらの結 果は、長期間にわたる保管の結果として発達する比較的架橋度の高い（ジスルフ ィド結合を通しての）接合体調製物と一貫性をもつものである。ジスルフィド結 合の再形成（デキストラン間）を防ぐため、ＤＴＴ還元には、余分なマレイミド でのＳ−アルキル化が付随していた。 明らかに、分子量の移動を受けるこのタイプの接合体（又はその点についてあら ゆるタイプ）のもつ傾向は、免疫抑制剤を調製し投与するための努力を著しく混 乱させ得る、この例は、投与に先立ち接合体物質を完全に特徴づけすることの重 要性を強調している。 （２）合成りＮＡ 修飾された（すなわちＳＨ金含有　ＤＮＡの単離に続いて、サイズ分画化したＤ ＮＡについて上述のとおりに保護解除及び接合を行なう。次に、２本鎖ＤＮＡ含 有（デキストラン）接合体を得るため、１本鎖ＤＮＡ含有（デキストラン）接合 体を相補性ＤＮＡ鎖（同じく長さ４０ヌクレヌクレアーゼ及び（恐らくは）エン ドヌクレアーゼの消化速度を減少させようとして２本鎖ＤＮＡ　２重鎖の個々の 鎖を架橋するのに、特異性の高い試薬すなわちマイトマイシンＣ及び比較的特異 性の低いソラジンの両方を使用することができる。このような減少は恐らくＤＮ Ａ−Ｄｅｘ接合体の作用の持続時間をより長いものにし、従って同様に治療処置 のために必要とされる接合体の用量が結果的に少なくなると思われる。 あるいは、リン酸チオエートといった化学的に修正したＤＮＡの類似体を利用す ることも可能である。これらの核酸類似体はエンドヌクレアーゼ及びエキソヌク レアーゼ消化に対する耐性があるものとして知られている。 Ｂ１分析 あらゆる場合において、得られた接合体は、最終的生成物が望みどおりアゴニス ト又はアンタゴニストのために設定された基準を満たしていることを確認するた め含有量及び全体的構造の両方に関して厳密な分析を受ける。以下に記すのは、 接合体全般（ハブテン、ペプチド及び核酸）及び以下に示す例で用いられた特異 的ペプチド含有接合体のための代表的分析手順である。 （ａ）ハブテン化重合体の分画と特徴づけ上述のハブテン又はエピトープ配列さ れた接合体の調製に利用される手順は全て、望ましい分子質量及びハブテン置換 レベルの卓越してハブテン化された重合体を生成した。しかしながら、副反応の ため、重合体分子の間に発生する避けることのできない低レベルの架橋によって 生成された比較的高い分子質量をもつかなりの量の物質が不変的に存在した。従 って、さらに化学的又は物理的に特徴づけをして免疫学的研究に利用するために 充分なほど分子サイズ（質量）が均質になる前に、上述のようなゲルろ過クロマ トグラフィカラム上の反復的なサイズ分画化によって、ハブテン化又はエピトー プ置換された重合体調製剤を精製することが必要であった。 ハブテン化された重合体の組成分析： ｉ）乾燥重量分析 各タイプの重合体材料のための一次的分析参考基準は、一定の与えられたタイプ の重合体調製物の中に存在する重合体質量の実際量についての乾燥重量分析であ った。乾燥重量は、重合体試料及び適切な透析物試料の徹底的な真空乾燥の後に 測定された。 ｉｉ）スペクトル分析 これらの研究において用いられているハプテンは、一部には可視又は近紫外線領 域内の波長で同定可能なスペクトル吸収帯を有するように選択された。調製中型 合体分子に化学的にカップリングされたハプテンの量は通常、乾燥重量分析又は 屈折率増分分析によって測定されるように、重合体調製物の質量とハブテン基に よる吸光の比較から決定された。 ■）化学的分析 直接化学分析により重合体分子上に存在する成る種の化学基の数量を測定するこ とが、時として可能であった。アミノ基は往々にしてトリニトロベンゼンスルフ すン酸との反応によって測定され、有色生成物を生み出し、この生成物はその後 分光光度分析によって測定できた。炭水化物は硫酸及びフェノールとの反応によ って決定でき、測定可能な吸光を有する有色生成物が得られる。ベンジルペニシ リンハブテンは、水銀化合物との反応により測定でき、有色生成物が得られる。 接合体を含むペプチド及び／又はタンパク質は、アミノ酸分析によって特徴づけ できる（以下参照）。 ｉｖ）屈折率増分分析 各タイプの重合体分子についての乾燥重量測定値に対する重合体による屈折率増 分の入念な較正によって、乾燥重量測定値の代わりに屈折率増分測定値を置換す ることが可能であった。この手順は、サイズ排除カラム上でのＨＰＬＣ中に重合 体材料の質量を敏感かつ精確に測定できるようにすることによって、重合体質量 の測定精度を大幅に高めた。 ■）滴定分析 カルボキシル、アミノ及びフェノール基といった中性範囲近くのイオン化定数を 有する化学基は、酸−塩基滴定を用いて直接測定することができた。この手順は 、カルボキシル基が重合体水溶液中の分光光度手段によって測定するのが非常に 困難なものであることから、特に重要であった。イオン化可能な化学基のこのよ うな測定は、帯電した細胞表面と重合体分子の相互作用に影響を及ぼすパラメー タである大きな重合体分子上の正味電荷を決定する上で特に重要である。 （ｂ）ハプテン化された重合体調製物の分子質量及びサイズの決定： ｉ）サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＢＣ）ＳＥＣ方法の使用は、標準的なＨＰ ＬＣ技術を用いた未知の試料及び均質の標準試料のクロマトグラフィカラムの比 較により、相対的分子質量の適切な決定を可能にする。標準化重合体材料は、相 対的に均質であり、平衡超遠心分離又は低角度レーザー光散乱などのいくつかの 絶対的実験手順により分子質量について独立して較正されなくてはならない。 ＳＥＣ方法はカラム支持体と重合体分子の間のあらゆる物理的相互作用に対して 非常に敏感であるため、各々全てのタイプのハプテン化された重合体分子につい てカラム保持時間を較正しなくてはならない。このような較正は、重合体分子の 物理的及び化学的性質、ハプテンの化学的性質及び数、分子上の正味電荷などに 対し感応する。 ｉｉ）平衡分析超遠心分離 もう１つの実験的に測定可能な数量すなわち部分的比体積と適切に組合わされた 場合、短カラム均衡分析超遠心分離測定は、実質的に均質な重合体調製物の絶対 重量−平均分子量を生み出した。実験的方法には、いくつかの重合体濃度での一 連の測定及びそれに続くゼロ重合体濃度に対する結果の外挿が必要とされる。平 衡測定は、回転子速度に対する外挿された分子量の相対的独立性を立証するため 、異なる遠心分離回転速度で行なわれる。図９は、特定のフルオレセイン−デキ ストラン試料について、２つの異なる回転子速度（１４０００及び１６０００Ｒ ＰＭ）において及びゼロ重合体濃度に対する外挿によって決定される分子量の測 定を例示している。この場合、ハプテン化された重合体の重量平均分子量は、約 ６８ｋＤａである。 ｉｉ）低角度レーザー光散乱 実験的に決定された屈折率増分と適切に組合わされた場合、低角度光散乱方法は 、重合体調製物の絶対重量平均分子量についての値を生み出す。大きい分子につ いては、この方法には、多数の濃度及び角度での測定ならびにそれに続くゼロ重 合体濃度とゼロ測定角度の両方に対する外挿が必要とされる。 ＳＥＣを用いた異なる分子サイズの分子の分離と組合わせた場合、この光散乱方 法は、非常に少量の重合体調製物内の分子質量及び物理的サイズの分布の両方の 信頼できる決定を提供する。このタイプの測定は、高圧液体クロマトグラフィ装 置、Ｈｅｗｌｅｔｔ−ＰａｃｋａｒｄＨＰ１０９０Ｍ　、及び低角度レーザー光 散乱装置、Ｗｙａｔｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｄｏｗｎを用いて、日常的に行 なわれた。サイズ排除カラムは、Ｔｏｙｏ　５ｏｄａＴＳＫ、　ＧＭＰＷゲルカ ラム又はＰｈａｒ＋ｎａｃｉａ　５ｕｐｅｒｏｓｅ　６又は１２カラム又はその 組合せであり、特定の試料内に存在する分子サイズを分離するため適切に選択さ れた。低分子量の試料が塩から不適切に分離された場合、消散を増大させるため ５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ１５のカラムを付加した。ジニトロフェニル又はフルオレ セイのごとき相当な疎水性をもつ大量のハプテンで重合体を置換した時点で、７ ％ブテンとカラム材料の間には多大な相互作用があり、サイズ排除ベースの分離 との干渉をひき起こした。この効果が起こった場合、それはカラム緩衝液中に２ ０％のアセトニトリルを用いることによって最小限におさえられた。 低角度レーザー光散乱方法によって分析されたペプチド−デキストラン接合体で 得られた結果の例は表３に示されている。このデータは、サイズ排除カラムの異 なる組合せを用いた異なるランにおいて得られた結果を示している。明らかな技 術的問題点が存在したわずかなケースを除いて、このデータは、実質的な一貫性 を示しており、全体として特定の試料についての予想と合致している。 表３ 試　料　カラム　Ｍｎ　Ｍｗ　Ｍｗ／ＭｎＡ　ＧＭＰＷ　＋　２．５Ｋ　２３． ４Ｋ　３０．８Ｋ　１．３２ＣＯＲ−３２５７Ｇ−１５＋ＧＭＰＷ２２．８に２ ５．７に１゜１３（Ｃ）ペプチド−デキストラン接合体の分析：ペプチド−デキ ストラン接合体を分析することの重要性は、究極的に、異なる免疫学的挙動が異 なるペプチド置換密度をもつ接合体によって惹起されることになるという期待に 関わっている。ペプチド−デキストラン接合体の完全な酸（ＨＣＩ）加水分解の 後のＷａｔｅｒＳＰＸＣＯ−ＴＡＧ什学作用を介してのアミノ酸分析は、（接合 体）ペプチド及び炭水化物の両方の含有量を測定するための非常に有効な方法で あることがわかった。酸加水分解は無傷の実体としてのペプチド又は炭水化物部 分の回収を可能にしないが、このような回収は接合体ペプチド置換密度の評価に は必要でない。すなわち、接合ペプチド及びＧＭＢ−デキサミンから誘導された アミノ酸を回収し計量するだけで、結合ペプチドのモル数と回収されたデキサミ ンのモル数をそれぞれ評価することが可能である。ペプチド−デキストラン接合 体の酸加水分解から誘導された代表的生成物が図１０に示されている。 問題の３つの成分とは、以下のものである：ガンマーアミノブチル酸（ＧＡＢＡ ）　、これは、共有結合によって接合できるペプチドの最大量を表わし同様に回 収されたデキサミンバックボーンの量の直接的尺度も提供する；旦−２−（２に 、２旦−スクシニル）−Ｌ−Ｃｙｓ；これは、共有結合によって結合されていな い接合体ペプチドと共有結合された接合体ペプチドを識別する（というのも共有 結合されたペプチドのみが旦−スクシニル化されるからである）；及び接合され たペプチドから誘導されたアミノ酸。ＰｉＣＯ−ＴＡＧ　ＨＰＬＣカラム上で１ ．３３分の保持時間を有する５−２−（２Ｒ，２８−スクシニル）−Ｌ−Ｃｙｓ のフェニルチオカルバミル（ＰＴＣ）−誘導体は、その他のあらゆるＰＴＣ誘導 体からうまく分離される。しかしながらガンマ−アミノブチル酸のＰＴＣ誘導体 （ＰＴＣ−ＧＡＢＡ）は、アルギニン（Ａｒｇ）のものと同時溶出する。Ａｒｇ 含有ペプチド−デキストラン接合体が分析されている場合これは不利な点である が、その他の接合体ペプチド°アミノ酸の積分Ｐ−ｍｏｌｅ値がわかっている場 合にはＧＡＢＡ回収を測定するのに差異分析（すなわちＰｍｏｌｅｓ＠ＧＡＢＡ −ピークにおけるＰｍｏｌｅｓ数−ＯＡｒｇ　Ｐｍｏｌｅ数）を使用することが できる。Ｐｉｃｏ−ＡＴＧ接合体分析から得られた分析データのタイプの一例が 図１１に示されており、この図は、（ループス）ピストンペプチド−デキストラ ン接合体がら誘導されたＰＴＣアミノ酸のＨＰＬＣクロマトグラムを表示してい る。共有結合による接合体ペプチドと共有結合によらない接合体ペプチドの間で の区別の問題ならびに産生プロセス全体を通して発生しうる接合体の損失の可能 性に留意することの重要性は、図１２に例示されている。接合体分析プロセスの 究極的目標は、デキストランの平均分子あたりの結合ペプチド分子数をできるか ぎり精確に測定することである。この情報を提供する等式は充分に単純なもので あるが（図１２）、いくつかの変数がこの等式の分子及び分母に影響を与える。 しかしながら５−２−　（２Ｒ，２Ｓ−スクシニル）−Ｌ−Ｃｙｓ及びＧＡＢＡ のＰＴＣ誘導体の計量は、接合体ペプチド置換密度の測定値の精度を大幅に増大 する。 ５−２−　（２Ｒ，２Ｓ−スクシニル）−Ｌ−ＣｙｓのＰＴＣ−誘導体の重要性 はいくら評価しても評価しすぎることはないが、共有結合により付着した接合体 ペプチドの明確な評価を同様に提供することのできるその他の硫黄（Ｓ）含有ア ミノ酸も発見されている。限定的に言うと、相応するシステアミン−又はホモＣ ｙｓ−含有ペプチド／ＧＩＪ＆−デキサミン接合体から誘導された５−２−（２ Ｒ，２Ｓ−スクシニル）−システアミン（保持時間＝　３．３８分）及びＳ−２ −（２Ｒ，２Ｓ−スクシニル）　−ＤＬ−ｈｏｍｏｃｙｓ　（保持時間＝１゜５ ０分）のＰＣＴ誘導体（図１３参照）は、ＰＴＣ−（旦−２−（２Ｒ，２旦−ス クシニル）−Ｌ−Ｃｙｓに有効に置換することができる。３つの異なる硫黄（Ｓ ）−含有「標識」アミノ酸を生成し計量する能力は、異なるペプチドをＧＭＢ− デキサミン（４）の同じ試料に接合させるときに価値あるものでありうる。 ペプチド−デキストラン接合体の精製が完全であることを条件として、非硫黄含 有アミノ酸が類似の状況の下で（すなわち標識アミノ酸として）機能することも 可能である。特に、δ−アミノ吉草酸（δ−ＡＶＡ）　、ε−アミノカプロン酸 （ε−ＡＣＡ）　、β−アラニン（β−Ａｌａ）　、ノルロイシン（Ｎｌｅ）　 、ノルバリン（Ｎｖａ）及びα−アミノブチル酸（α−ＡＢＡ）といった接合さ れるべきペプチドの生物学的に関連する部分の中に通常見られないアミノ酸は、 特定の共有結合によって付着されたペプチドの量を特定する「標識Ｊとしてみな すことができる。反応性のＣｙｓ　、システアミン又はＤＬ−ｈｏｍｏＣｙｓ残 基に対し終りから２番目に位置づけされたとき、これらのアミノ酸は、ペプチド −デキストラン接合体内への取込みのためのペプチドの生物学的に関連する部分 と化学的に反応性ある（すなわち旦含有）部分の間の距離を提供する「スペーサ 」要素としても考えることができる。 Ｃ−末端Ｃｙｓ−含有ペプチドを、接合反応において使用する前に逆相ＨＰＬＣ により完全に精製することが有利である。その使用に先立ってこれらのペプチド を厳密に精製する理由は、固相技術によりすなわちＣ末端からペプチドが合成さ れる方法に直接関係する。Ｃ−末端Ｃｙｓ含有ペプチドと結びつけられた全ての 欠失ペプチド又は欠損配列は同様に反応性（すなわち−ＳＨ−含有）　Ｃｙｓ残 基を有することになる。その結果、これらの望まれないペプチドは、完成した又 は望まれるペプチドと同じ方法でＧＭＢ−デキサミン（４）に対し接合すると予 想できた。このような「一連の」反応は、実際に問題の全長ペプチドから誘導さ れた考えられる全ての欠失ペプチドの複合物である接合体を導き出す。この点に おいて、表４及び５に示されたデータに注目されたい。 表４ 試料名：　Ｃ１−００６０／１４２０Ｋ　Ｄｅｘ　（１：１）純粋ペプチドＡＡ 　Ｃｏｎｃ、　Ｍｏｌｅ％　Ｍｏ１ｅｓ　Ｉｎｔ。 ＡＳＰ　００００　０．０００　０．００　０ＧＬＵ　４６．５０　０．０７１ 　１．０６”　ｌ５ＥＲ８４，６４０，１２９１，９４２ＧＬＹ　４５．６５　 ０．０７０　１．０４　”　ＩＨＩＳ　Ｏ，０００，００００，０００ＡＲＧ　 Ｏ，０００，００００，０００ＴＨＲＯ，０００゜ｏｏｏ　ｏ、ｏｏ　。 ＡＬＡ　１４０゜３３　０．２１４　３．２１　３ＰＲＯ１７２，２５０，２６ ３３，９４４ＴＹＲＯ，０００，００００，０００ ＶＡＬ　Ｏ，０００，００００，０００ＭＥＴ　Ｏ，０００，００００，０００ ＩＬＥ　００ｏｏ　ｏ、ｏｏｏ　ｏ。０００ＬＥＤ　Ｏ，０００，００００，０ ００ＰＨＥ　Ｏ，０００，００００，０００ＬＹＳ　１６５．８９　０．２５３ 　３．８０　４ＣＩ−００６０＝ループス２　’　：　Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ −Ａｌａ−１，ｙｓ−５ｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＰｒＯ−Ｌｙｓ−Ｌｙ ｓ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ｌ）’５−Ｃ）’５−ＣＯＮＨｚデキサミン分子１つあた り（３７８のペプチド分子）（最大：　−１０２４）−ＡＢＡ回収率＝６８％ 表５ 試料名：　Ｃｌ−００６０／１４２０Ｋ　Ｄｅｘ　（１：１）不純ペプチドＡＡ 　Ｃｏｎｅ、　Ｍｏｌｅ％　Ｍｏ１ｅｓ　Ｉｎｔ。 ＡＳＰ　Ｏ，０００，００００，０００ＧＬＵ　３０．３９　０．０６２　０． ９３°　１ＳＥＲ６４，７？　０．１３３　１．９９　２ＧＬＹ　４１．８４　 ０．０８６　１，２９”　ＩＨｌｓ　Ｏ，０００，００００，０００ＡＲＧ　Ｏ ，０００，００００，０００ＴＨＲＯ，０００，００００，０００ ＡＬＡ　９８．６９　０．２０２　３．０３　３ＰＲＯ１１８，８５０，２４３ ３，６５４ＴＹＲＯ，０００，００００，０００ ＶＡＬ　Ｏ，０００，００００，０００ＭＥＴ　Ｏ，０００，００００，０００ ＩＬＥ　Ｏ，０００，００００，０００ｔＥｕ　ｏ、ｏｏ　ｏ、ｏｏｏ　ｏ、ｏ ｏ　。 ＰＨＩ！　０．００　０．０００　０．００　０ＬＹＳ　１３３．８２　０．２ ７４　４．１１　４ＣＩ−００６０＝／レーブス２　’　二Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐ ｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−３ｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌ ｙｓ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−ＣＯＮＨＬデキサミン分子１つあたり ２４７のペプチド分子（最大：　−１０２４）−ＡＢＡ回収率ニア４％ 傘　＝　Ｇｌｕ／Ｇｌｙ　＝０．７２ Ｎ末端近くのアミノ酸（Ｇｌｕ）とＣ末端近くのアミノ酸（Ｇｌｙ）のｐｍｏｌ ｅ比は、この実験のために調製されたループスペプチド（ＣＬ００６０）　／１ ４２０にデキストラン接合体についてｌに等しくなくてはならない。不純なＣ末 端Ｃｙｓ含有ペプチドが接合された場合にこの比率が著しくｌより小さくなると いう事実（表５）は、実際接合プロセスに参与するペプチド混合物と一貫性をも つ。 逆に言うと、Ｎ末端Ｃｙｓ含有ペプチドが同様に、樹脂から開裂された後に欠失 ペプチドで汚染されているとしても、これらのペプチドのいずれも反応性Ｃｙｓ 残基を有するべきではない。すなわち、問題のペプチド（これは完成したペプチ ドである）のみが接合反応を受けることができなくてはならない。これが実際に あてはまるということは、表６及び７の中のデータによって実証されている。こ こでも、Ｎ末端近くのアミノ酸（イプシロン−アミノカプロン酸＝ε−ＡＣＡ） とＣ末端近くのアミノ酸（Ｐｒｏ）のｐｍｏ　ｌ　ｅ比は、この実験のために調 製されたペプチド（ＣＩ−０１３４）／６５にデキストラン接合体についておよ そｌに等しくなくてはならない。 表６ 試料名：　Ｃ１−０１３４／６５Ｋ　Ｄｅｘ　（１：ｌ）純粋ペプチドＡＡ　Ｃ ｏｎｅ、　Ｍｏｌｅ％　Ｍｏ１ｅｓ　Ｉｎｔ。 ＡＳＰ　２７．５８°　０．０９１　２．０９　２ＧＬＵ　２６．７２　０．０ ８８　２．０３　２ＳＥＲ１２，１５０，０４００，９２１ＧＬＹ　７９．８８ 　０．２６３　６．０６　８ＨＩＳ　Ｏ，０００，００００，０００ＡＲＧ　２ ７．００　０．０８９　２．０５　２ＴＨＲＯ，０００，００００，０００ ＡＬＡ　２７．１２　０．０８９　２．０６　２ＰＲＯ１３，８３０，０４６１ ，０５”　ＩＴＹＲ１１，４００，０３Ｂ　０．８６　１ＶＡＬ　３８．４２　 ０．１２７　２．９１　３ＭＥＴ　Ｏ，０００，００００，０００ＩＬＥ　００ ００　０．０００　０．００　０ＬＥＵ　１３．７ｉ　０．０４５　１．０４　 １ＰＨＥ　１３．９７　０．０４６　１．０６　１ＬＹＳ　Ｏ，０００，０００ ０，０００ＡＣＡ　１１．４３　０．０３８　０．８７”　ＩＣｌ−０１３４＝ 　Ａｃ−Ｃｙｓ−（ε−ＡＣＡ）−Ａｌａ−Ａｓｐ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ− Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａ　１ａ−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　１ｙ−Ｇ　ｌ　 ｙ−Ｇ　１ｙ−Ｖａ　ｌ　−Ａｒｇ−Ｇ　ｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａ ｌ−Ｖａｌ−（ｄ）Ｔｙｒ−ＣＯ２Ｈデキサミン分子１つあたり９つのペプチド 分子（最大：　−５４）表７ 試ネ１名＋　Ｃｌ−０１３４／６５Ｋ　ｎｅｗ　（１：１）不純ペプチドＡＡ　 Ｃｏｎｃ、　Ｍｏｌｅ％　Ｍｏ１ｅｓ　Ｉｎｔ。 ＡＳＰ　２３．２８　０．０９３　２．１４　２ＧＬＵ　２２．４２　０．０８ ９　２，０６　２ＳＥＲ１１，０００，０４４１，０１１ＧＬＹ　６６．７５　 ０．２６６　６．１３　６Ｈ１ｓ　Ｏ，０００，００００，０００ＡＲＧ　２２ ．００　０．０８８　２．０２　２ＴＨＲＯ，０００，００００，０００ ＡＬＡ　２２．５７　０．０９０　２．０７　２ＰＲＯ１０，８５０，０４３１ ，００”　ＩＴＹＲ８，１３０，０３２０，７５１ ＶＡＬ　３１．１３　０．１２４　２．８６　３ＭＥＴ　Ｏ，０００，００００ ，０００ＩＬＥ　Ｏ，０００，００００，０００ＬＥυ　１１．４４　０．０４ ６　１．０５　１ＰＨＥ　１１．５８　０．０４６　１．０６　１ＬＹＳ　Ｏ， ０００，００００，０００ＡＣＡ　９．３６　０．０３７　０．８６１１ＣＩ− ０１３４＝　Ａｃ−Ｃｙｓ−（ε−ＡＣＡ）−Ａｌａ−Ａｓｐ−３ｅｒ−Ｇｌｙ −Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａ　１ａ−Ｇ　Ｉ　ｕ−Ｇ　ｌ　 ｙ−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ｇ　１ｙ−Ｖａ　ｌ−Ａｒｇ−Ｇ　ｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｖ ａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−（ｄ）Ｔｙｒ−Ｃ（ｈＨデキサミン分子１つあたり８つ のペプチド分子（最大−５４）”　ε−ＡＣＡ／Ｐｒｏ　〜０．８６ 比率は純粋又は不純のいずれのＮ末端Ｃｙｓ含有ペプチドが接合体生成のために 用いられても基本的に同じであるという事実は、不純なペプチドが接合プロセス におけるその参与の結果として「種類の純粋化」を受けるということを示唆して いる。接合体の可能なかぎり最高の純度を得るために、全てのペプチドは、接合 に先立って分析的純度まで精製される。 本書中に記されている研究において用いられている全ての試薬は、標準的な市販 の供給源から得たものであった。 精製されたペプチド−デキストラン接合体をＨＰＬｅ−グレードの水の中でｃａ 、１ｍｇ／ｍｌの濃度で日常的に溶解させた。適当なアリコートを除去し、真空 中で乾燥し、その後アミノ酸分析のためＷａｔｅｒｓＰｉｃｏ−ＴＡＧ化学作用 （上記）に付した。 重水素化ジメチルスルフォキサイド（ＤＭＳＯ）中でＶａｒｉａｎ　ＡＳＳＯＣ ｆａｆ［！ＳのＧｅｍｉｎｉ−３００３００ＭＨｚ分光光度計上で、陽子（′Ｈ ）核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを記録した。化学的移動値は、内部標準とし ての付加されたテトラメチルシラン（ＴＭＳ）との関係におけるものである。全 てのピークは、ＴＭＳからのダウンフィールドｐｐｍとして表現されている。 薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）はＭｅｒｃｋ（＃５７１５）シリカゲルプレー ト上で行なった。生成物をＣ１，／でんぷん−Ｋｌ染色及び／又はニンヒドリン 反応性によって視覚化した。 Ｃｙｓ　（０，０８２ｇ、０．５０ｍｌ１ｉｏｌｅ）の撹拌溶液に対して、ＮＭ Ｍ　（０，１０１ｇ、１ｍｍｏｌｅ）及びマレイミド（０，０４８５ｇ、　０． ５０ｍｍｏｌｅ）を加えた。室温で一晩中反応混合物を撹拌し、次にまとめて２ ５ａ＋ｍＸ　２２ｃ＋ｏのＤｏｗｅｘ　ＡＧ５０Ｗ−Ｘカラムへと移した。カラ ムをＨ２Ｏで溶出させ、分画（２５Ｘ　８　ｍｌ）を収集し、ＴＬＣにより分析 した。望ましいＣｙｓ誘導体を分画８−１４内に見い出した。これらの分画を組 合せ、凍結乾燥させてふわふわした白色固体を得た。収量：　０．０７４　ｇ　 （０，２８５ａ＋ｍｏｌｅ、　５７％）　ｍｐ　（融点）　ニア６〜８１℃。Ｔ ＬＣ（ｎ−ブタノール：酢酸、１（ｔｏ（４：　１　：　１））：Ｒ，〜０．４ ３゜Ｎｌ＋ｌＲ：　δ１．８６　（Ｓ、３　Ｈ）　、δ２．４３　（ｒｎ、ｌ　 Ｈ）　、δ２．９０　（ｄｄ、Ｉ　Ｈ）　、δ３．００−３．３０　（ｍ、２　 Ｈ）　、δ３．９５　（ｍ、Ｌ　Ｈ）。 ６４．２３　（ｍ、Ｉ　Ｈ）　、δ８．３１　（ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ）＋６８． ３４　Ｊ　＝　７．８Ｈｚ）＝ＩＨ９６１１，３９（Ｓ、ＩＨ）　。 ＰＩＣＯ−ＴＡＧ分析の予備段階としての（蒸気相の）６ＭのＨＣＩでの−Ｌ　 −Ｃｙｓを定量的収量で提供した。 透析又は限外ろ過による精製は、ペプチド−デキストラン接合体の調製の初期段 階において非常に満足のいくものであることが立証された。しかしながら、いく つかの利用分野では、高い又は低い分子量の不純物が完全に無い接合体調製物が 必要とされる可能性もあるｏ　５ｕｐｅｒｏｓｅ１２又は５ｕｐｅｒｏｓｅ　６ 上のデキストラン試料の分子排除クロマトグラフィは、試料精製手段として非常 に有効でありうる。社内高速タンパク質液体クロマトグラフィ　（ＦＰＬＣ）シ ステムに取りつけられた市販の分析用５ｕｐｅｒｏｓｅ１２カラム（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ）がフルオレセイン化されたデキストラン（Ｆｌ−Ｄｅｘ）試料をかな りうまく分離する。ペプチド−デキストラン接合体の大規模な反応混合物を精製 するためには、予備的５ｕｐｅｒｏｓｅ１２カラム（分離範囲：　１０００〜３ 　Ｘ　１０’ｇ／ｍｏｌｅ）を用いることができた。Ｆｌ−Ｄｅｘ標準を用いた 予備的５ｕｐｅｒｏｓｅ１２カラムから得られた分離結果は、このタイプのクロ マトグラフィが、接合体精製及び（大規模な）ペプチド回収の両方の手段として 役立つものでありうるということを示唆している。 これらの技術を用いて、本書に記述されている抗−ヒストン、抗ＯＶＡ及び抗Ｅ ＡＬＡ研究に使用された接合体を以下のように特徴づけしたニ ーヒストンペプチド接合体： １）６５にのデキストラン０．２：１ ルのペプチド （　＝　Ｃｌ−０１２５） （　＝Ｃｌ−００８４／　Ｄｅｘｇｓｘ（０．　２　：　１　）２）６５にのデ キストラン２：１モル反応→Ｄｅｘ　１モルあたり３５モルのペプチド （　＝　Ｃｌ−０１２６） （＝ＣＩ−００８４／ＤｅＸｓｓＫ（２　：　ｌ　））。 Ｃｌ−００８４　＝ＮーＡｃーＧｌｕーＰｒｏーＡｌａ−Ｌｙｓ−３ｅｒ−Ａｌ ａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙ ｓ−ＣＯＮＨ＊−０ｖａペプチド接合体：精製された抑制性接合体の分析は、以 下の結果を提供した。 １）４０にのデキストラン０．３：１モル反応→Ｄｅｘ　１モルあたり２モルの ペプチド。 （　＝　Ｃ　ｌ−０２５２） （　”　Ｃｌ−０１５９／　Ｄｅｘ４ｏｘ（０．　３　：　ｌ　））。 ２）４０にのデキストランｌ：Ｉモル反応→Ｄｅｘ　１モルあたり１０モルのペ プチド。 （　＝　Ｃ　ｌ−０２５３） （”Ｃｌ−０１５９／　ＤｅＸｔｏｘ　（　１　：　１　））。 Ｃｌ−０１５９　＝ＮーＡｅーＣｙｓ−（ｇ−ＡＣＡ）−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｈｔ ｓ”’ーＡｌａーＧｌｕーｔｉｅーＡｓｎＧｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ”’ ーＣＯＮＨｓーＥＡＬＡペプチド接合体１）８４にのデキストラン１：１モル反 応→Ｄｅｘ　１モルあたり５７モルのペプチド （　＝　Ｃｌ−０２１８） （＝ＣＩ−００１０／ＤｅＸｓ４ｘ　（　１　：　１　））。 ＣＣ−００１０＝Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−（Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ −Ａｌａ）ｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−３ｅｒ−Ｐ ｒｏ−Ａｌａ−ＣＯＮＨ＊　。 アミノ酸分析によるＤＮＡデキストラン接合体の特徴づけには、ペプチド−デキ ストラン接合体の分析に伴うものと同じタイプの操作が関与する。酸加水分解（ ６ＭのＨＣｌ、　１１０℃、　２２−２４時間）の結果として、接合体は減成さ れて、スクシニル−システアミン（Ｓｕｃｃ−Ｃｍｎ）上のスクシニル−Ｃｙｓ （Ｓｕｃｃ−Ｃｙｓ）及び−アミノブチル酸（ＧＡＢＡ、図１４参照）というＤ ＮＡヌクレオチドが加水分解ピークを生み出す。 （デキストランから誘導された炭水化物は計量可能な形では回収されない）。ペ プチド−デキストラン接合体についてそうであるように、遊離された旦−含有ア ミノ酸（Ｓｕｃｃ−Ｃｙｓ又はＳｕｃｃ−Ｃｍｎ）の重要性は、それがデキスト ラン重合体に対するＤＮＡの共有結合による付着のレベルの明確な評価を究極的 に提供することから、いくら強調しても強調しすぎることはない。ＤＮＡヌクレ オチド加水分解生成物の計量（図１５参照）及び２６０　ｎｍでの直接吸収度測 定によって提供されるものとこの接合尺度と組合わせることにより、接合された ＤＮＡの量の３つの評価が独立して生成される結果となる。デキストラン回収を 計量するのに用いられる回収されたＧＡＢＡ値と合わせて考慮した場合、接合体 ＤＮＡ置換密度を設定することが可能である。 例６゜ Ｄｎｐハプテン基と置換された線状ポリアクリルアミドを、上述のとおりに調製 した。かくして、平均分子量５ＸＩＯ’をもつ線状ポリアクリルアミド（Ｇｅｌ ａｍｉｄｅ　２５０−Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｙａｎａｍｉｄ）を、以前にポリア ミド球のために用いたものと類似の要領でエチレンジアミンと置換させた（Ｉｎ ｍａｎ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　８．４０７４−４０８２（１９６９）） 。余剰フルオロジニトロベンゼンと共にエチレンジアミン置換誘導体ヲ振とうさ せその後続けて大規模に透析することによりＤｎｐ誘導体を得た。置換レベルは 、３６０　ｎｍでの吸光度及び乾燥重量の測定から決定した。調製物を１１８１ で標識付けし、標識付けされた分子あたり１つの未満のｌｉＪに相応する、２５ ００個の単量体単位あたり約１つの置換レベルが得られた。 Ｂｊｏ−ＧｅｌＡ−０，５Ｍアガロース球の長さＩｎのカラムを通したゲルろ過 により、Ｄｎｐ−置換した重合体を分画化した。これらのもとの分画をさらに３ 度分画化して、分析用超遠心分離における沈降平衡測定によって決定されるよう に、比較的均質な調製物を得た。 以下の特徴をもつ２つのＤｎｐ置換重合体調製物を得た：重合体Ｂ　重合体り 分子量、Ｘｌ０−’　０，８　１．８ アクリルアミド単量体　１０５０　２３５０サブユニット／分子 重合体鎖の延長長さ、Ａ　２６００　６０００アクリルアミド単量体　４２３６ サブユニツト／Ｄｎｐ Ｄｎｐ基間の平均的距離　１０５　９０合計Ｄｎｐ基／分子　２５６６ 「有効なＪ　Ｄｎｐ基／分子　８〜１２２２〜３３重合体Ｂは免疫原性でなく、 一方重合体りは免疫原性であった（上述の表１．１９７６年の論文参照）。 重合体Ｂ及びＤを、セファロースＣｌ−４Ｂのさらなるカラム分画化に付した。 さらにテストするために２つの調製物（Ｎ及びＳ）を調製した。調製物Ｎは、重 合体Ｂの中央の下位分画であり、調製物Ｓは重合体りの中央の下位分画であった 。部分的比体積の測定（０，６９０ｍ１／ｇ）及び沈降平衡分子量の外挿は、Ｎ に対して６００００　、　Ｓに対して１３００００の値を与えた。これらの値は ３６０　ｎｍでの吸光度及び乾燥重量と共に、Ｓが分子１つあたり４３のＤｎｐ 基（１４−２１ｒ有効」）を含んでいるのに対してＮが分子１つあたり１９のＤ ｎｐ基［７−９ｒ有効」又は適切に離隔〕を含むことを示している。重合体Ｎ及 びＢは、１分子サイズ単位あたりのハプテン置換レベル又は「エピトープ密度」 がほとんど同じである。 抗体応答。０．５＋ｎｌの等張食塩水中に入れて重合体調製物をＢＡＬＢ／Ｃマ ウスに腹腔内注射した。６日後に、尾からの出血により血液を収集し、分析まで 一３０℃で血清を保存した。Ｄｎｐに対するＩｇＭ抗体の血清中濃度は、固相結 合検定によって測定された。抗Ｄｎｐマウス抗体を結合させるために、Ｄｎｐ置 換されたゼラチンで共有結合によりコーティングされた表面を用い、次にこの抗 体の存在を、マウスＩｇＭ抗体に対するト２′標識づけされたウサギ抗体と共に 第２のインキュベーションを行なうことによって測定した。 インビトロ培養と検定。頚部脱臼によりマウスを層殺し、その膵臓をＲＰＭｒ− １６４０培地中で切り刻み、ステンレス鋼メツシュ（６０Ｘ６０のメツシュ；直 径０．０１９　ｃｍ）を通して圧縮した。細胞砕片を沈降させ、分散した細胞の 懸濁液を含んで上澄みを傾瀉させ浸透圧衝撃によって赤血球を除去し、洗浄した 。有核膵臓細胞の懸濁液を次に、最終体積７．５＋ｏｌ中５Ｘ１０’の生存可能 な細胞を含む６０Ｘ１５ｍ＋ｎの組織培養皿の中で適切な重合体を伴って又は伴 なわずにインキュベートした。インキュベーションは３７．０℃で５％のＣＯ□ ／９５％の水飽和空気内で行なわれた。インキュベーション培地は、５％（ｖｏ ｌ／ｖｏｌ）の熱不活性化されたウシ胎児血清、２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の熱不 活性化されたウマ血清、４＋ｎＭのグルタミン、１００単位のペニシリン及び１ ｍｌあたり１００μｇのストレプトマイシン及び５０μＭの２−メルカプトエタ ノールで富化されたＲＰＭ１１６４０培地で構成されていた。 ３日間のインキュベージコンの後、細胞を収獲し洗浄した。直接（ＩｇＭ）抗Ｄ ｎｐプラーク形成細胞についての検定を行なった。Ｄｎｐ基に向かって反応性あ る血清１ｇＭ分子の濃度によって測定した場合の、免疫原性重合体調製物Ｓをさ まざま用量注射した後６日目のＢＡＬＢ／Ｃマウス体内の免疫原性応答は、図１ ６に示されている。この実験におけるマウスは供給業者から均一年令の単一出荷 で届いたものであり、１０匹ずつのグループに分割されていた。各グループのメ ンバーには同じ用量を注射し、全てのグループはできるかぎり均等に取り扱った 。図１６の実線曲線は、Ｄ、′°゛の数値を０．３μｇに調整することによって 実験的に決定された点に視覚的に合わせられた、等式から予想される理論上の応 答曲線である。Ｄｉｎｔｘｉｓ他（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７９：３９５（１９８２年）参照）は、免疫原の用 量り、と非免疫原のり、が１匹の被験動物に注射され、用量Ｄ　１．及びＤ’Ｎ が２番目の被験動物に注射された場合、第２の動物の体内での免疫応答に対する １番目の動物の体内での免疫応答の比ｒは等式１によって与えられるはずであり 、ここで］）　、１１ａｍは１匹の動物の体内で最大の応答を与える免疫原の用 量つまり用量一応答曲線のピークに相応する、ということを示した。 等式ｌの導出に関与した仮定の単純さ及び個々のマウスの応答の既知の可変性を 考慮すると、理論と実験の一致は驚くほど優れている。しかしながら、同じ育種 家によって供給されたマウスの異なるグループを用いて実験を反復した場合、被 験動物全体における生物学的応答の可変性はより明白なものとなる。 図１７は、ＢＡＬＢ／ｃマウスの３つの別々の出荷の用量一応答曲線を比較し、 各用量における個々のマウスの応答のグループ依存型の可変性及びグループ毎の 用量一応答曲線の形状の変化の両方を例示している。異なるマウスグループによ って与えられる可変的な免疫学的応答は、被験動物全体を用いた研究と細胞培養 を用いた研究の両方において観察された周知の現象である。これは恐らく、被験 動物の「抗原的純真性」に影響を及ぼしうる細胞、ウィルス及び寄生中に対する 露呈ならびに出荷中の熱及び低温といった環境的衝撃に対する露呈のような被験 動物の経歴及び取り扱いにおける要因により左右されるものである。 図１６及び１７に示されている観察された用量一応答曲線を図１６に示されてい る理論的の曲線と比較することにより、曲線間の一致が良好であるにもかかわら ず観察された応答がマウスのバッチ毎にかなり可変的であり、一般に図１６に示 されている曲線を生成した単純なモデルから予想されるものよりもさらに幅広い 用量応答曲線を示す、ということは明らかである。 この比較的幅広い実験的曲線は以下のように説明できる：すなわち、 図１６の理論上の曲線は、免疫原に応答している全ての細胞がＤｎｐ基に対する 同じ結合定数をもつレセプタ分子を有するという仮定に基づくものである。この 完全な等質性という仮定は、真実である可能性が低いものである。免疫原を結合 しそれに応答する細胞がＤｎｐに対する異なる結合定数をもつタンパク質レセプ タを有する場合、予想される反応は数多くの個々の細胞応答曲線の和であるはず である。各々の曲線は図１６にある曲線に似ているが、比較的低い結合定数をも つものは、Ｄｎｐに対するその結合定数間の比率に比例する量だけ右方に移動さ せられる。この観点から見て、図１６及び図１７を検討すると、実験上の用量一 応答曲線の観察された幅は、結合定数が１−１．５対数単位だけ異なるつまり１ ０〜３０倍だけ異なるレセプタをもつ個々の細胞固体群からの応答の合計の結果 として得られるものとして理解できるものである、ということがわかる。用量一 応答測定値は、このような固体群３つか４つの理論的応答を合計することにより 実験的誤差内で適合させることができる。 一定の免疫原性重合体用量について、等式１は同様に、非免疫原性重合体Ｎの増 大する量の用量で得られることになる反応減少の範囲を予想するためにも使用で きる。このタイプの測定値は、ＢＡＬＢ／Ｃマウスについて、図１８に示されて いる。図１８内の実線はデータに適合されたものではなく、図１７から得たマウ ス−匹あたり０．５μｇの最大応答用量Ｄ′″°８の見積り値を用いることによ って、等式１から直接計算されたものである。図１８中の実験上の点と計算され た理論上の曲線の一致は、この計算において任意に調整されたパラメータが存在 しないことを考えると、驚くべきものである。 図１６．１７及び１８に示されている生きた動物の体内での実験に加えて、用量 応答は、単離されたマウスの膵臓細胞を用いてインビトロでも測定された。図１ ９は、等式ｌから計算された視覚的に適合された理′論上の曲線と比較した場合 のこのようなインビトロ実験の結果を示している。培養された肺臓細胞（図１９ ）でのインビトロ実験についての実験と理論の間のこの一致（図１９）は、マウ ス全体を用いたインビボ実験の場合（図１６）とほぼ同じ位に良いものである。 両方の場合において、測定された応答曲線は、応答する細胞における均一なハブ テン結合定数に基づくモデルから予想されたものよりも幾分か広いものである。 本発明にとって特に重要なのは、図２０に示されている非免疫原性重合体の量の 増大に伴うインビトロ免疫応答の阻害の測定である。 実線は、データに適合されたものではなく、図１９からの０．４μｇ／ｍｌの最 大応答用量り、′″パ値を用いて等式ｌから直接計算されたものである。実験上 の点と計算された理論上の曲線の間には実質的な一致が存在する。 マウスの血液量及び細胞外液の量は各々約１ｎｌであり、従ってインビボでの最 適な免疫原性重合体用量は約１μｇ／ｍｌである。このインビボ用量とインビト ロで最適な免疫原性をもつ用量（ｚ　ｌ　ｎｇ／ｍｌ）の間に明らかに大きな食 い違いがある。はぼ１０００倍の感受性の差は、大部分が体全体にある食細胞に よる重合体分子の急速なインビボ（生体内）除去によって説明がつく。上述の１ ９７６年の論文の中で記述されているような重合体の１２″■標識付けされた調 製物を用いた研究は、注射された重合体の大半が肝臓内のクツパー細胞及びその 他の組織内の食細胞により循環、から急速に除去されるということを示していた 。その結果としてもたらされた遊離重合体濃度の降下は、異なる体液区画間の重 合体の平衡化速度に関する不確かさと合いまって、インビボ及びインビトロの相 対的最適濃度のあらゆる数量的比較を困難なものにしている。これらの問題点に もかかわらず、インビボで測定された用量一応答及び用量抑制曲線の形状がイン ビトロで測定されたものと驚くほど似ており両方のケースにおいて同じ制限プロ セスが厳密な調査の対象となっていることを強く暗示しているという事実は残る のである。その上、両方のケースにおいて、用量の一関数としての測定された応 答は、等式１から得ることのできる値とすばらしく良く一致している。 重合体Ｎはいかなる用量ででも刺激することができないが、重合体Ｓが最大の刺 激性をもつ同じ用量での重合体Ｓの阻害を行なう。 これは、表面レセプタに対する競合を表わす。両方の重合体調製物は共に、共通 の担体化学作用でほぼ同一の「エピトープ密度」をもつことから、この発見事実 は、「担体」によるエピトープ密度又は多クローン性（すなわち非特異的）活性 化を引合いに出すことで免゛疫原性を説明する理論とは一致しない。 例６についての検討 上述のデータは、特異的Ｔ細胞依存性刺激に関して以下のことを示している：　 （ｉ）特異的免疫原性シグナルが応答性細胞の表面上のイムノンの形成によって 生成される、（ｉｉ）イムノンは、充分な数の表面レセプタがクラスタ化した後 に初めて形成することになる、及び（ｉｉｉ）表面レセプタの特異的クラスタ化 は、これらのレセプタが連鎖したハブテンに結合された結果として起こる。この 結合はハブテン−レセプタ相互作用に特異的であり、ハブテンが付着される「足 場」に主として左右されるものではない。ハブテンを連鎖させる下にある物理的 足場は、性質的に分子様であってもよいし或いは又、「抗原提供細胞」の表面上 といったように小さなハブテン含有構造が凝集する１つの表面で構成されていて もよい。 マイトジェン、レクチン、細胞表面タンパク質に対する抗体及びその他の細胞か らの活性化又は阻害因子といった非特異的刺激は、応答する細胞の「被刺激性」 レベルに充分影響を及ぼすことができ、一定の与えられた量の免疫原性シグナル に対し応答するその可能性さらには特異的シグナルの不在下で応答するその可能 性を大きくしたり小さくしたりする。Ｔ細胞及びマクロファージからの因子はこ れまでに抗体応答を非特異的に高めることが示されてきた。マイトジェンは、抗 体を分泌するよう非特異的に細胞を刺激するものとして知られている。マイトジ ェンが特異的レセプタの凝集が関与するメカニズムによって間接的に又は直接的 にこれを行なうか否かは、知られていない。しかしながら、これらの比特異的刺 激とは対照的に、本書中のデータは、特異的刺激が、レセプタのイムノン内への 特異的結合部位によるその連鎖を用いて発生する、ということを示している：か くして、これらのレセプタを表示する細胞は刺激を受けて、特異的抗体を分泌す る細胞に分割し分化する。 以上では（又上述の１９７６年、１９８２年及び１９８３年の論文では）、可と う性ある線状重合体に連鎖されたハプテンから成る分子が、充分な数の適切に間 隔どりされたハプテンを有する場合にのみ免疫原性をもつということが実証され てきた。Ｔ細胞非依存性抗原についてのこの発見事実は、最初、Ｔ細胞依存性抗 原であり多数の同一抗原性部位を含まない数多くのタンパク質分子がそれでも抗 原性をもつという事実と矛盾するように思われる。しかしながら、いくつかの研 究により、インビボでのタンパク質の抗原性がその凝集状態によって左右される ということが示されてきた。物理的方法（熱、ベントナイトへの吸着；フロイド アジュバントでの乳化）又は化学的方法（グルタルアルデヒド又はミョウバンと の架橋）によるタンパク質分子の実験的に誘発された凝集がその抗原性を大幅に 強化するということは周知のことである。凝集物無しで遠心分離されたか又は注 射を受けた動物の血清から収集された非凝集タンパク質分子は免疫原性が無く寛 容原性を有している一方、推定上多くの抗原部位を有する凝集された物質は免疫 応答を生成する。従って、単一のＴ細胞非依存性重合体で決定されるような抗原 性に対する最小限の必要条件がＴ細胞依存性分子を含む多種多様な分子に対する 免疫応答への適用可能性を有し得るということが考えられる。いずれの場合にせ よ、上に例示したように非免疫原性重合体が免疫原性重合体に対して有する抑制 効果を用いて望ましくない免疫応答を抑制することができるというのは明白なこ とである。このように用いられる非免疫原性重合体の量は必然的に、関与する特 異的免疫応答、重合体担体、関与するエピトープの有効数、体重及びその他の要 因に応じて変化することになる。しかしながら、体重１ｋｇあたり０．５〜ｓｏ ｍｇ／ｋｇの投与が、望ましくない免疫応答を制御する上で有効であろうと考え られている。投与は、例えば非免疫原性重合体の無菌溶液を用いた注射により行 なうことができる。 餞工、他のハプテン及び担体への免疫応答の拡張上述の序文及び検討から明白な ように、本発明はハプテン又は担体の性質ではなく、担体の分子質量及びハプテ ン密度に依存しており、これらの物理的特性（分子質量、ハプテン密度）が、そ の物質が免疫原性又は非免疫原性又は抑制性であるか否かを決定する。このこと は、フルオレセイン化された担体を用いて行なわれた試験についての以下の開示 及び例証によってさらに示される。このさらなる研究作業において、５つの化学 的に異なるフルオレセイン化された（Ｆｌ）−重合体の分子特性は系統的に変化 させられ、その抗ハブテン免疫応答を刺激する能力が測定された。担体として用 いられた重合体は入念にサイズ分画化され、１つの天然重合体（デキストラン） 、１つの変更された天然重合体（カルボキシメチルセルロース）及び３つの合成 重合体（フィコール、ポリビニルアルコール、及びポリアクリルアミド）で構成 されていた。担体は物理的構造の面で、非常に架橋度の高いフィコールから幾分 か分枝したデキストランがら線状ポリアクリルアミド、カルボキシメチルセルロ ース及びポリビニルアルコールに至るまで変化した。重合体はＦｌでハプテン化 され、サイズ分画化されて、変化する分子質量、ハプテン価及びハプテン密度を もつ分子の一団を生み出す。これらのハプテン化され？＝重合体に対する抗Ｆ１ 応答は、食塩水中のＦｌ−重合体の腹腔内注射後インビボで測定され、特定の投 薬を受けていないマウスからの分画化されていない膵臓細胞での培養の後インビ トロで測定された。 Ｄｎｐ−ポリアクリルアミドが関与する上述の例証と合致するよ・）に、免疫原 性をもつためにはＦｌ−重合体の各々が分子質量及びハプテン価の比較可能な閾 値を超えなくてはならないということが発見された。最適な免疫原性は、Ｆｌ− 重合体が予想可能な範囲内にある質量及びハブテン密度の値を有する場合に起こ った。免疫原性は、これらの最適なパラメータが実質的に増大又は減少した場合 に減少した。従って結論としては、可溶性のハプテン化された重合体の免疫原性 が予想可能な物理的分子特性によって左右され、担体重合体の化学組成及び立体 配座からは比較的独立したものである、という結論を下すことができる。 ハブテン化されるものとして選択された重合体担体は、デキストラン（Ｔ２Ｏ０ ０，Ｔ５Ｏ０及びＴ２Ｏ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　；フィコール（４００及び７ Ｏ−Ｐｈａｒ＋ｎａｅｉａ）　Ｈカルボキシルメチルセルロース（中粘度−Ｓｉ ｇｍａ）　；ポリビニルアルコール（平均分子量！１５０００−Ａｌｄｒｉｃｈ ）　；及び線状ポリアクリルアミド（結晶質アクリルアミドから水溶液の形で合 成されたもの）であった。 重合体担体は、以下の手順によりフルオレセインと接合させた：反応性カルボキ シル基を、２０℃で０．０５ＭのＮａｚｃＯ３−０，０５ＭのＮａＨＣＯ１中の 部分的加水分解によってポリアクリルアミド内で生成した（３）。 Ｉｎｍａｎ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎａｌ、　１１４ニア０４４によって開示されて いる手順に従って、。 このようなジアミド化されたポリアクリルアミド内及びデキストラン、フィコー ル、ポリビニルアルコール及びカルボキシメチルセルロース内にアミノ基を導入 した。それに続いて、０．１ＭのＮａＪ４０を中でｐＨ９，２の余剰フルオレセ インイソチオシアネートに対し重合体上のアミノ基を接合させた。その後、次に 続くゲルろ過のために使用される緩衝液（０，１Ｍ　ＮａＣ＋、　０．００１Ｍ のＥＤＴＡ、　０．０２％のＮａＮ５．０．　（１１ＭのＫＰＯ＋、　ｐＨ７， ４）に対して徹底的に重合体を透析した。 次にＦｌ−重合体を、５ｃｐｈａｒｅｓｅ　ＣＬ−２８，ＣＬ−４Ｂ及び／又は ＣＬ−６８の９５ｃ＋ｎのカラム上で反復的に分画化させた；中心のカットを反 復的に行なって比較的狭い分子量分布の調製物を得た。Ｆｌについて７２０００ のモル吸光係数を用いて０．ＯＩＭのＮａｔＢ４０ｙ内で４９６　ｎｍでの光学 密度を測定することによりＦ１含有量を決定した。この測定値と重合体乾燥重量 の測定値を合わせて、エピトープ密度の計算が可能となった。 分子質量は、当該技術分野において既知のとおりの分析用超遠心分離機内での沈 降平衡分析によって決定した（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、７３： ３６７１、１９７６）。短カラム方法を用いることによって複数の重合体濃度で 測定を行ない、ゼロ重合体濃度に対する外挿により分子質量を得た。実験におい て用いた重合体をＰＢＳに対して透析し、０．２２−μα龜のＮｕｃｌｅｏｐｏ ｒｅフィルタを用いたろ過により滅菌した。 インビトロ研究のためには、特定の投薬を受けていないマウス（ＣＡＦ、　ＩＪ 、雌マウス、大部分が生後８〜１０週）からの２Ｘ１０’の有核膵臓細胞の懸濁 液を、水平から３度の角度で置いた１５＋ｏｌ入りの滅菌ポリスチレン遠心分離 管の中で適切な重合体を伴って又は伴わずに２ｍｌの最終体積で培養した。３日 間のインキュベーションの後、細胞を収獲し洗浄した。Ｔｒａｎｓ、Ｒｅｖ、１ ８：１３０　（１９７４年）内に記述されている手順の変更を用いて、直接（Ｉ ｇＭ）抗ハブテンプラーク形成細胞（ＰＦＣ）についての検定を行なった。全て の培養を３重で行ない、ＰＦＣ検定を各培養について２重で行なった。免疫応答 は、１０＠の膵臓細胞あたりのＰＦＣで表現した。抗原の付加無しの対照培養の 応答を、実験上の培養の応答から差し引いた。代表的には、この対照は１０’の 細胞あたり５　＋／−２ＰＦＣと測定された。 プラーク検定内の指標（インジケータ）細胞は、低親和力の（すなわち非特異的 な）抗体に対する検定応答を最小限におさえるべく低密度でハプテン置換された 、置換された指標細胞は、９ｍｌのホウ酸緩衝生理食塩水（ＢＢＳ　；　１１０ ０Ｉのホウ酸ナトリウムを含む０．９％のＮａＣ１，ｐ）１９．２）の中で溶解 された１ｍｇのフルオレセインイソチオシアン酸塩の溶液と１ｍｌの濃縮ロバ赤 血球（ＢＲＢＣ）を混合することによって調製された。次に混合物を暗室内で１ 時間室温で攪拌した。細胞はまずＢＢＳ内で次にＰＢＳ内で３〜４回、遠心分離 によって洗浄した。これらを１週間未満の間ｏ、　ｉｉ％のグリシルグリシンを 含むＰＢＳ内に保管した。使用前にこれらをＰＢＳ内で洗浄した。Ｆｌ置換され たＢＲＢＣは、このシステム中の抗−Ｆ！プラーク形成膵臓細胞を検出する上で Ｆｌ−重合体で置換されたＢＲＢＣと同じ程有効であることがわかった。Ｊ、　 Ｉ＋ｎｍｕｎｏ１．１３１：２１９６　（１９８３年）に記されているとおり、 トリニトロフェニル（Ｔｎｐ）置換された指標細胞を調製した。 体内分泌速度の差又は器官及び組織の分布による免疫原性挙動において考えられ る差異を妨げるため、動物全体の測定と平行してインビトロ研究を行なった。逆 に言うと、インビボ結果によるインビトロでの発見事実の確認は、インビトロで の発見事実が単に細胞培養の人工産物を反映していたにすぎないという懸念を無 くしてくれた。生きた動物の体内でこれらの分子が露呈される可能性のある細胞 環境をできるかぎり密に模倣するため、未分画化膵臓の培養が、好ましいインビ トロ検定であった。 インビトロ抗体応答については、重合体調製物と０．５ｍｌの等張食塩水中でマ ウスに腹腔内注射した。アジュバントは、投与された抗原の実際の分子質量の解 釈を不可能にするような形で抗原の物理的状態を変える可能性があるため、いか なる抗原投与においても用いられなかった。４日後、マウスを安楽死させその肺 臓を除去してＰＦＣ検定に付した。食塩水のみを注入した対照マウスの応答を、 被験マウスの応答から差し引いた。標準的には、この対照は１０６の細胞あたり １０＋、／−５ＰＦＣという測定であった。 抗ハブテン応答を生成するのに用いられたＦｌ−重合体の用量については、観察 された抗−Ｆｌ応答の１％未満は、免疫原として未置換担体を用いた場合に生成 できた。非特異的多クローン性抗体の生成について試験した場合、ハブテン化さ れていない担体分子は、未置換のロバ赤血球（ＢＲＢＣ）又は■型肺炎球菌胸膜 多糖体又はジニトロフェニル基のいずれかで置換されたＢＲＢＣに対して（デー タ示さず）いかなるプラークも生成しないことがわかった。これらの観察事実は 、抗Ｆｌ応答を生成させるのに必要とされる用量で、Ｆ１重合体がフルオレセイ ンとは全く異なるエピトープ特異性をもつＢ細胞を著しく刺激することはなかっ たということを示していた。 ここで用いられたハブテン化された重合体の組成及び特徴は、表１内に列挙され ている（２７ページ参照）。 これらの重合体担体は全て、負に帯電したＣＭＣを除いて、基本的に帯電されな かった。フルオレセインでのハブテン化は、結果として親水性で負に帯電した置 換された重合体をもたらした。 この一連のＦ１重合体に対する応答の運動性がＤｎｐ−ポリアクリルアミドにつ いて観察されたものに密に類似していることがわかった。 −例として、図２１は、数回のインキュベーション後のＦｌ−ＰＶＡに対する特 定の投薬を受けていない肺臓細胞の一次的インビトロ抗ハブテン応答の用量一応 答曲線を示している。インビトロ応答のピークは、３日間のインキュベーション 後に起こった。同じ重合体の最適用量に対する一次的インビボ抗ハブテン応答の 運動性は、図２２に示されている。肺臓ＰＦＣは約４８目でピークに達した。 ４つの異なるフルオレセイン化された重合体すなわちＦｌ−Ｄｅｘ、　Ｆｌ−Ｆ ｌ　ｉｃ、　Ｆｌ−ＣＭＣ及びＦｌ−ＰＶＡによって生成されたインビボ抗ハプ テン用量一応答曲線が、図２３に示されている。図２４に示されているインビボ 用量応答曲線は、付加的な重合体Ｆｌ−ＰＡによって生成された曲線を含んでい る。これらの曲線は、この研究において使用された免疫原性重合体全てによって 生成された応答を表わすものである。各用量一応答曲線は鐘形をしており、最大 に達するまでは当初抗原の用量と共に増大し、その後はさらに高い抗原用量で減 少する。 試験されたサイズ分画された重合体の各々は、インビトロ及びインビボの両方の 状況で免疫原性又は非免疫原性であり、これら２つの状況で挙動上一貫性を示し ていた。表８は抗ノ１ブテン抗体応答のその刺激についての検定の結果と共に、 代表的重合体の数を列挙している。 表８ Ｆｉｔ４ｏＦｉｃ７５０　０．３２　＋　＋ＦＩｔｏＦｉＣ７５０ｏ、　１２　 ＋　＋Ｆ１ａ５Ｄｅｘ４００　０，１６　＋　＋Ｆ１ｓｏＤｅｘ１７０　０．３ ５　＋　Ｎ、Ｄ、ｅＦｌｏｓＰＡ３００　０．３２　＋　Ｎ、　Ｄ。 Ｆｌｇ−０ＰＡ４００　０．５８　＋　Ｎ、Ｄ。 Ｆｉｔｓ。ＣＭＣ５２００，３２＋　＋Ｆ１＊ｉＣＭＣ１１００，２４＋＋ ＦｌｚｏＰＶＡ４００　０．２８　＋　Ｎ、Ｄ。 Ｆｌ、、ＰＶＡ２００　０．２８　＋　＋Ｆｌ　＋　＋Ｆｉｃ４０　ｏ、　３５ 　−−ＦｌｓＦｉｃ３５　０．１７　−− Ｆｌ　＋　４ＤｅＸ４０　０．３５　Ｎ、　Ｄ。 Ｆｌ、、ＰＡ８０　０．５９　−　Ｎ、Ｄ。 Ｆｌ、ＣＭＣ２７０，２２−− Ｆｌ１４ＰＶＡ５０　０，２８　−　−ａ）特定の投薬を受けていない肺臓細胞 の３日間の培養の後直接抗ＦＩ　ＰＦＣを測定することによって決定されたもの 。 ｂ）アジュバント無しで食塩水中で抗原を腹腔内注射した後４日目に収穫された 膵臓細胞の直接抗−Ｆｌ−ＰＦＣを測定することにより決定されたもの。 ｃ）Ｎ、Ｄ、＝測定せず。 ハブテンの略号の後の下付き番号は、分子１つあたりのハブテンの数を示しくハ ブテン価）、一方担体略号の後の番号はｋＤ単位の分子質量を示す。例えばＦｌ ｓｓＤｅｘ４００は、合計分子質量が４０００００ダルトンで１つのデキストラ ン担体上に６５のフルオレセイン基を伴う分子のことを指す。 ４対数用量範囲にわたり、破線より上に列挙された重合体グループは免疫原性を もち、破線より下のグループは非免疫原性であった１゜両方のグループ共、研究 された５種の重合体担体すなわちＦｌ−Ｆｉｅ。 ＰＩ−Ｄｅｘ、　Ｆｌ−ＰＡ、　Ｆｌ−ＣＭＣ及びＦｌ−ＰＶＡの各々を伴う分 子を含んでいた。 従って５つのＦ１重合体は全て、重合体担体の化学的組成の如何に関わらず免疫 原性又は非免疫原性のいずれかである可能性をもつ。表８内の重合体の分子特性 を検討すると、免疫原性が分子質量及びハブテン価に直接関係することがわかる 。破線より上の全ての重合体は、２０以上のハブテン価と１０００００ダルトン 以上の分子質量を有し、免疫原性をもっ°Ｃいた。破線より下の重合体は、１０ ００００ダルトン未満の分子量を有し、テストされた全ての用量で免疫原性をも たなかった。両方のグループにおけるハブテン密度は、重合体１グラムにつきフ ルオレセイン０．１２ミリモルから０．５９ミリモルというほぼ同じ範囲を有し ていた。従って、ハブテン密度自体は、免疫原性の存在又は不在を予言するもの ではなかった。 ％８、担体の化学作用とは独立した抗原特異的抑制非免疫原性のＦｌ−重合体の 阻害特性について、以下の例によりさらに例示する。 以上で示した通り、１０００００ダルトン以下の分子質量及び２０以丁のハブテ ン価をもつ可溶性のフルオレセイン化された重合体は、あらゆる測定された用量 で抗ハブテン応答を刺激することができなかった。しかしながら、この例は、最 適な濃度の刺激性Ｆｌ−重合体と混合させ、特定の投薬を受けていない膵臓細胞 とインビトロで培養させた場合に、抗ハプテン抗体の産生を阻害することができ るということを示している。図２５は、このような阻害の代表的な例を示してい る。 特定の投薬を受けていない膵臓細胞を、一定の濃度の免疫原性重合体Ｆｉｔ。Ｆ ｉｅ７５０と共に増大する濃度の非免疫原性重合体を含むべく処方された一連の 溶液を用いて培養した。ここでわかるように、非免疫原性重合体の阻害能力は、 １ｍｌあたり約１ｎｇから１０ｎｇの間の阻害因子濃度で免疫原性重合体に対す る抗Ｆｌ応答の完全な阻害に達するまで、濃度の増大と共に増大する。 図２５は、バックボーン担体すなわちＰＶＡ、Ｄｅｘ　、又はＣＭＣ上のＦｌが 、Ｆｌ−Ｆｉｃにより刺激される抗−Ｆ＋応答を阻害できるようにする「交叉阻 害」を実証している。このデータは、これらの非免疫原性Ｆ１重合体の阻害ポテ ンシャルが特定の担体の化学作用からたいてい独立したものであることを示して いる。対照として、図２５は、ＰＡ担体上の無関連ハブテン、Ｄｎｐが抗−Ｆｌ 応答を阻害できなかったことを示している。担体非依存性阻害はさらに表９内に て明らかにされている。 なおこの表では、異なる担体バックボーンをもつ４つの免疫原性重合体に対する 免疫応答を阻害する、４つの非免疫原性Ｆｌ−重合体の能力が示されている。 表１１は、担体としてＣＩＪＣを伴うセットと担体としてフィコールを伴うセッ トの計２つのセットの重合体の阻害能力を比較している。各セットにおけるハブ テン密度は似通っているが、分子量は異なる。 ＣＭＣ担体の中に含まれるのは２つの非免疫原性重合体（ＦＬ＠ＣＭＣ２７及び Ｆｌ、ＣＭＣ１５）である；１つの非免疫原性重合体（Ｆ１＋　４ＦｉＣ４０） がＦｉｃ担体担体セット台まれている。各々のセットにおいて、免疫原性ポテン シャルの如何に関わらず、より大きな分子量をもつ重合体は、より優れた阻害因 子である。 表１１：阻害能力に対する分子質量の影響ＦＬ、。、ＣＭＣ４４００，２４２゜ ＦＬ＊ｓＣＭＣ１１００，２４９ ＦＬ、ＣＭＣ２７０，２２１５ ＦＬ、ＣＭＣｌ５　０．２７　４０ ＦＬａ、。Ｆｉｃ２０００　０．３２　４ＦＬｇ＊ｏＦｉｃ７５０　０．３２　 ６ＦＬ、Ｆｉｃ４０　０．３５　９゜ ａ）５０％の阻害を与える濃度は、一定量（４ｐＭ）のＦｌｅｏＦｉＣ７５０を 含む培養に対して阻害重合体を付加することによる直接的抗−Ｆｌ−ＰＦＣの減 少を測定することによって決定された。 ＰＩ９．Ａ、ハブテンに対する進行中のＴ細胞依存性免疫応答の抑制 ニワトリ卵白アルブミン又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）といったハブテン化 されたタンパク質が水酸化アルミニウム上で吸収され反復的に少量の注射が与え られた場合、これらのハブテン化されたタンパク質に対して、ハブテンに対する 非常に強いＴ細胞依存性応答を起こさせることができる。結果として得られる応 答は、注射されたタンパク質にカップリングされるハブテンに対し向けられた高 レベルのＩｇＧ及びＩｇＢの両方の抗体を含むことができる。−例としては、こ のプロトコルによって数カ月の時間にわたりフルオレセインで置換されたＯＶＡ を用いて免疫化されその後何週間も抗原物質に対しさらに露呈されることのなか った３匹の個々のマウスの血清抗−フルオレセインＩｇＧ応答レベルが、図２７ に示されている。これらのマウスは、全て同じプロトコルに従って同時に免疫化 された大きなコホート（同船集団）の一部を成していた。これらのマウスのうち のいくつかは次に、以前に阻害性のものであることを見極めておいた重合体を用 いて、腹腔内注射を受けた。このような重合体は、高いハブテン置換密度をもつ ものの分子量が１０００００以下の可溶性フルオレセイン化重合体であった。こ れらの重合体は、進行中の高レベルの抗フルオレセインＩｇＧ抗体応答を抑制す る（治ゆ）その能力をテストするために注射された。個々のマウスの血清レベル に対する３つの異なるこのような重合体の注射からの結果は、図２８．２９及び ３０に示されている。なおこれらの図中、出血の時間尺度は、図２７のものと同 じである。 図２８のデータは、図２７に示されている抑制されていないマウスとは異なり、 多数のＰＬ置換されたＦＬ−Ｐａ、　ＦＬ３０Ｐａ５０を３ｍｇ用量受けたマウ スは、１力月以上の期間で血清の抗ＰＩ　ＩｇＧ抗体レベルが著しく減少した。 ６匹の抑制を受けたマウスのうち、５匹のマウスの血清抗体レベルは、低すぎて 測定できないレベルにまで急速に降下し、期間全体にわたりそのままであり続け た。６番目のマウス内の血清抗体レベルは、比較的緩慢に下がり、期間の終りで わずかな回復を示した。 重合体がデキストランであった場合（図２９）　、０．１　ｍｇというＦＬ２５ Ｄｅｘ７０の用量は、血清抗−ＦＬ　ＩｇＧ抗体レベルに対し全く見かけ上の効 果をもたず、一方次に続＜１ｍｇという用量は、マウスのうちの５匹において完 全な抑制をひき起こした。６番目のマウスは、低１ノベルまでの急な降下とそれ に続く緩慢かつ定常な衰退を示した。 図３０中のデータは、１ｍｇというＦＬ３０Ｄｅｘ８０の用量が非常に実質的な 但し完全ではない抗ＦＬ　ＩｇＧ抗体の血清レベルの抑制をひき起こしたという ことを示している。しかしながら３＋ｎｇという次に続く用量は、完全な抑制を もたらした。 図２７．２８．２９及び３０の組合せたデータから、免疫化されたマウス内への 適切なハブテン化されたミリグラム量の重合体の注射が、血清抗ハプテンＩｇＧ 抗体のレベルの深くかつ長い抑制をひき起こすことができるということは明白で ある。このことは、立証済みの体液性免疫応答の「治ゆ」と同等である。 その後に続く実験においては、［ｇＧ及びＩｇＥ（感作抗体）の両方の抗体の血 清レベルの平行測定ならびにＩｇＧクラスの抗フルオレセイン抗体を産生ずる膵 臓リンパ球の数の決定により高レベルの抗フルオレセイン応答の抑制（治ゆ）に ついてテストするべく研究努力が払われた。同一の実験においてこれらの異なる 抑制指数を測定するためには、多数のマウスを同時に水酸化アルミニウム上でＦ Ｌ−ＯＶＡで刺激し、その後、抑制及び再刺激の異なるプロトコルに付した。卵 白アルブミン分子１つあたり４．５のフルオレセインハブテン基のレベルまでフ ルオレセインイソチオシアネートで化学的に置換されたさまざまな用量のＯＶＡ をくり返し注射することによって、大きいグループのＣＡＦＩマウスにおいて、 ハブテン、フルオレセインに対するきわめて強い免疫応答が起こされた。強く均 質な免疫応答を生成するためには、ＦＬ−ＯＶＡを、水酸化アルミニウム１＋ｎ ｇあたり０．１．１又は１０μｇのＦＬ−ＯＶＡの比率で、アジュバントである 水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）ｓ上に吸着させた。結果として得られた１ｍ１ ｇのＡＩ（ＯＨ）、を含む一定量の抗原調製物を一連のマウスの体内に腹腔内注 射してフルオレセインに対する強い抗体応答をもたらす。２回目の抗原注射の後 、血清中の結果として得られたＴ細胞依存性抗−ＦＬ　ＩｇＧ抗体レベルは、均 等に非常に高いものであった。 得られた抗ＦＬ　ＩｇＧ抗体レベルを測定するためには、ＥＬＩＳＡ技術により 定量測定を行なうことができるように、血清を１０００００倍に希釈することが 必要であることがわかった。リン酸ニトロフェニルの加水分解速度に従って工学 的にかつ親和性精製されたアルカリホスファターゼでカップリングされた抗マウ スＩｇＧ（μ連鎖）の第２の抗体を用いて、フルオレセイン化されたゼラチンで コーティングされた９６枚のウェルプレート上で、測定を行なった。図３１−３ ３に示されているように、一点につき３匹のマウスについて１ｏｏｏｏｏ倍の血 清希釈液を用いて抗−ＦＬ　ＩｇＧ測定が行なわれ、測定値の平均的及び標準的 な偏差が示されている。 １００倍の範囲にわたりＦＬ−ＯＶＡの刺激性容量を変化させることによって観 察の一般性を見極めるべく努力が払われた。すなわち、ｌ＋ｎｇの水酸化アルミ ニウムに対してＦＬ−ＯＶＡが０．１．１又はｌＯμｇ注射された。ＥＬＩＳＡ 分析プレートをコーティングしていたゼラチン上の低レベルのフルオレセイン置 換を用いて、より優れた結合、より高い親和性、より多い臨床的に関連する抗Ｐ Ｌ抗体分子を強調した。 適切な用量（２ｍｇ）の非刺激性ではあるものの阻害性のフルオレセイン化され た重合体の注射によって、結果として得られた強い免疫応答の削除又は「治ゆ」 を達成した。この実験において用いられた特定の重合体は、高圧液体クロマトグ ラフィ分析によって測定された場合、結果として得られた重合体（ＦＬ３０−Ｄ ｅｘ８０）について８０ｋＤａという平均分子質量をもつデキストラン上でて置 換された３０のフルオレセイン基を含むフルオレセイン化されたデキストランで あった。 マウスは、「治ゆされた」時点でフルオレセインに対する抗体の高い循環レベル を有していたため、受容動物内の望ましくない副反応を避けるため、長い時間に わたり段階的に治ゆ量を投与することが重要であった。従って、初期用量ｌμｇ から始めて２時間毎に用量を最大１０倍に増大させた。このプロトコルにより、 ＦＬ−デキストランの投与中又は投与後動物の体内に視覚的ないがなる困難の兆 候も生じることはなかった。免疫応答が非常に実質的なものであった３５日目、 そして７５日目の動物を再度刺激する試みに続＜９５日目にも、治ゆ量が投与さ れた。 反復的に刺激を受けたマウスの応答と、刺激を受けその後治ゆされたマウスの応 答の直接的な比較が、図３１．３２及び３３に示されている。これらの図は、治 ゆ量の後の抗ＦＬ抗体レベルの劇的な減少ならびにその後の７５日目の再刺激に 対する応答の欠如を示している。治ゆ処置の有効性範囲を実証するために、これ らの図には、以前に高（１０μｇ）、中（１μｇ）及び低（０，１μｇ）用量の 刺激性抗原すなわち水酸化アルミニウム上のＦＬ−ＯＶＡで刺激されたマウスか らのデータが含まれている。図３１．３２及び３３は、血清抗ＦＬｕ　ｉｇＧ抗 体レベルが各々のケースにおいて唯一回の治ゆ処置によって極めて実質的に減少 させられ、当初の刺激を反復することによって再度刺激されないということを明 確に示している。 血中の循環する抗フルオレセイン［ｇＧ抗体分子の Suppression of Immune Responses with Antigens in Oligomeric Forms of Controlled Chemistry The present invention generally The present invention relates to methods for controlling unwanted immune responses and structures used therein. The invention described herein applies to the United States Army DAMD 17-86-C - This was done as part of research based on Grant No. 6038, i.e., a scholarship. be. As a self-defense mechanism, animals develop complex combinatorial responses to foreign substances. This is collectively referred to as the immune system. Immune response is generally favorable (protective) in nature, but in certain situations the animal body may be undesirable. produce an immune response. Such undesirable responses include allergic reactions, which are directed against exogenous antigens. characterized by the production of IgB antibodies) as well as against self-antigens. There are corresponding autoimmune diseases. Over the past few decades, many people have sought to inhibit, suppress, or “cure” specific immune responses. The law has been written. These methods include treatment of animals with various chemical preparations; are included, and their details are as follows. The exemptions forming the basis of this series of applications Infection modification methods allow the immune system to respond to foreign antibodies in association with physically restricted arrays. It is based on the premise of recognizing the origin. Sequences are specific to stimulate the immune system size or geometrical arrangement) and must exceed natural must have a minimum number of physically accessible epitopes that are identical to (minimum valency). Once these two parameters meet or exceed the limit The immune system then produces antibodies (IgM, IgG and/or production of IgB) and T-cell factors and/or activity (T-cell “help”). may respond by producing proteins, cytokines, cytotoxic substances, etc.). The method to which the present invention relates is characterized in that the geometrical and/or valency is “below a threshold”. , and competing autoimmune and extrinsic allergic responses with naturally occurring sequences. Applicant claims that this system can be manipulated by introducing chemically derived high molecular weight sequences. Based on the findings of The technology forming the basis of the present invention is based on the previous Proc of Ntzis et al. Acad. Sci, USA, 73:3671-3675 (197B). It was derived from the Immunon model of epidemic response. be. This report suggests that in order to obtain an immunogenic response, haptics on T-cell-dependent antigens are necessary. Discloses the concept that there is a threshold regarding the number and spacing of martens. 1976 report Also, in non-immunized animals, non-immunogenic polymers are The present invention discloses that the present invention has a suppressive effect on the triggering of a de novo immune response. non-exemption The suppressive effect of the epidemiogenic polymer on the immune response of the immunogenic polymer is further r0C, Nat'1. SCi, USA, 79:395, 1982; Proc. Nat'l Acad, Sci, USA, 79:884. 1982: and J. . 1+n+nuno1. , 131:2196. 1983 (Dintzis et al. J, I+omuno1. 135:432. 1985; Immunization of Dintzis et al. Theoretical I+n+aunology, Pt, l Volume ■, Perelson, A.S., editor, Addison-Wesley Publishers , Reading, Mass, pp. 83-103, 1988: Dintzis et al. Immunol, 143:1239゜1989; Dintzis et al. , J. Immunol., 70:299. 1990; and Dintzis and Dintzis's Ima+uno 1. Rev iews 115th, 2nd 43-251, 1990). It is described in. The earlier filings in this series of applications are T-independent, which can be evaluated by the level of 1 gM production. Includes details of studies done using experimental paradigms involving existing antibody responses. . To suppress the production of IgM antibodies against low molecular weight DNA and haptens, Various types of backbones with restricted structure (linear polyacrylamide, dextran) , Flcoll, carboxymethylcellulose, etc.) have been described. There is. (See Examples 1 to 7 below). In addition, to use the invention, flowers Allergies to powders and autoimmune diseases (including multiple sclerosis and myasthenia gravis) Reference is also made to early discoveries to suppress This application describes T-cell dependent antibodies. Includes detailed studies on the production and response by the T-cells themselves. follow The data presented herein is based on the T- An early application of a series of immunosuppressants against complex responses involving cell-dependent antibody production. Further support the application of legislation. Additionally, the present disclosure demonstrates that restraining structures can indeed potentially It emphasizes the desirability of imparting the property of not being an irritating molecule. As mentioned above, chemical preparations such as those reported may be used as a method of inhibiting immune responses. Its modification has been the subject of many publications. Disclosed method This is apparently based on the “special chemical composition” of the polymeric backbone material used. This forms an epitope carrier. This mechanism allows for the observed special The occurrence of epidemic suppression and the fact that special molecules were the factors that brought about the suppression These were various causes of: l) carbon vs. hydrogen vs. acid in the carrier material; The chemical composition defined by the ratio of the elements (Dawn et al., J, lml1uno1. 12 6:407-413. (1981); Wei et al. Int. Archs, Allergy Appl, Immunol, 85:1-7 (1988)). 2) When synthesizing polypeptide carrier substances, “natural” L-amino acids are used. determined by the use of 'unnatural' D-amino acids rather than amino acids. “Unnaturalness” (Katz et al. J, Exp, Med, +134:201- 223 (1971): Llu et al. Proc, Natl, Acad, Sci. USA 76:1430-1434 (1979); Liu et al. J, Alle rgy C1in, Immunol, 66:322-326 (1980) ;3) “special” chemical properties that are not clearly defined in nature; and 4) The ability to increase "specific suppressor cells" in an undefined manner. (See also special notes below). However, against the applicant's best knowledge, and other groups to determine the correct combination of molecular size and epitope valency. did not propose that immunosuppression occurs due to suppressive substances containing molecules with Still other groups did not suggest or suggest methods to which the present invention relates. 5ehon and his collaborators have developed a polyvinyl alcohol (PVA) skeleton structure. specificity induced by injection of polymeric molecules containing epitopes attached to conducted many studies on immunosuppression (e.g. Dawn et al. J, In+nun o1. 126:407-413 (1981); Wei et al. Int, Arch s, Al lazyAppt, Immunol, 85: 1-7 (19 88)). The PVA skeleton structure is made by combining low molecular weight PVA (14kDa) with cyanogen bromide. react with some hydroxyl groups on the polymer, converting them into reactive forms, and It was created by coupling the active hydroxyl group of 100% to the amino group of an aliphatic diamine. Author They found that this reaction frees the PVA polymer molecules from the unreacted ends of the diamine adduct. It was expected that many aliphatic amino groups would be substituted. These ends are subsequently attached to the hapten PVA is substituted with a group, and the molecular weight is almost unchanged from the original PVA. A converted PVA was formed. This experimental method produces a soluble haptenized polymeric material, which is associated with a hapten. It was suppressive to the specific immune response given. However, polyreactive polymers (cya bromide) In the reaction between activated PVA) and excess divalent reactant (ethylenediamine) , substantially varying amounts of cross-linking occur between polymers, resulting in multi-cross-linking over a wide range of molecular weights. This resulted in the formation of a combined molecule. However, 5ehon and Lee focused on the precipitate and They are clearly higher molecular weight (and therefore potentially irritating) It was treated as if no polymer was produced. When applicants repeated the published method of 5ehon et al., extremely extensive cross-linking It was found that polymer molecules were formed and higher molecular weight substances precipitated out of solution. The more soluble amine-substituted PVA that remains in solution, after removing precipitated material, It had a molecular weight range of approximately f5kDa and 100kDa (for analytical ultracentrifugation analysis). (expressed accordingly). This is optional in a series of applications filed by the applicant in the early stages. A polymeric substance defined as a suppressor of the immune response that is not irritating even at doses of This is the molecular weight range for a substituted soluble multivalent hapten. 5ehon et al. considered the possibility of cross-linking of the chemical polymer molecules they used. as well as they did not determine the actual molecular weight of the material produced. because they are disadvantageously erroneous within the functional scope of the applicant's paradigm. That's true. Applicants have in fact identified high molecular weight (greater than 100 kDa) polysubstituted haptens. PVA molecules are immunogenic in vitro and in vivo (□1ntzis et al., J. [mmunol, 143:1239-1244 (1989)), reported that it gave a dose-response curve of the type However, the applicant has a molecular weight of 1ookDa. Similar molecules that are smaller exhibit stimulatory potential as predicted by their paradigm. It was found to be an inhibitor of the immune response without having to do so. KatZ and co-workers demonstrated that specific suppression of the immune response to an epitope could be These epitopes were synthesized using the synthetic polypeptide poly(D-glutamic acid, D-lysylamide). ), i.e., bonded to a carrier skeleton made of poly(D-Glu, D-Lys). (Katz et al. J, Ex. p, Med, 134:201-223 (1971); liu et al. Proc, N at’ IAcad, Sci, USA 76: 1430-1434 (19 79); Liu et al. J, Allergy C1in, I+na+u Shidangeki B 66:322-326 (1980). This polypeptide is a commercially available A regularly organized polymer comprising D-amino acids, D-lysine and D-glue. It is synthesized from a chemically activated form of tamic acid, with a ratio of 60 : It is 40. KittZ made the discovery of immunosuppression by using the common amino acid D, which is not a normal amino acid (found in all proteins) - caused by the “unnatural” nature of synthetic polypeptides consisting of amino acids It was rationalized as something that would be done. This explanation clearly suggests that the carrier backbone polypeptide Comparable immunosuppression was not observed when D was synthesized with more common amino acids. This was supported by the finding that Katz's findings fit well into the immune paradigm described as: l) Skeletal Poly(D-Glu, D-Lys) preparation used by Katz as polymer was obtained from a commercially available product, and its average molecular weight was less than 100 kDa (mainly commercially available products, Yeda (Israel), and Sigma (St. Louis), to the applicant. Such polymers with an average molecular weight greater than 70 kDa (proved to be impossible to manufacture). Therefore, xatz is clearly By using polymers with molecular weights smaller than 100 kDa as restraining framework materials, this lucky molecule can be Used without awareness of quantity selection. 2) Starting from available higher molecular weight poly(D-Glu, D-Lys) , about 70 kDa from Ieda, the applicant has converted many of its amino groups into a hapten. , fluorescein was replaced with the expected non-immunogenic FLU-poly( D-Glu, D-Lys) were found to be produced. This substance was analyzed by HPLC. As expected, from less than 40kDa to a small amount of 100kD & larger It contained molecules with a wide range of molecular weights. Game with 5uperoseCL-6B In size fractionation by filtration chromatography, small amounts of about 200 kDa or more Substances could be excluded. This high molecular weight fraction is a mouse fluorescein It has been shown to be immunogenic with respect to the immune response to the drug. This discovery is a book Qualitatively, it is not suppressive for FLU-poly (D-Glu, D-Lys). However, depending on the size of the molecule, it can be irritating or non-irritating. 3) To further test the size of the molecular weight, Applicant selected a non-immunogenic 70kD a Cross-linking FLU-poly(D-Glu, D-Lys) molecules with carbodiimide Some carboxyl groups of glutamic acid residues are combined with amino groups of lysine residues. to form a suitable amide bond. A wide range of molecular weight products resulted. When these were size-fractionated using a gel filtration column, Substances with molecular weights greater than 100 kDIL are immunogenic both in vivo and in vitro. Although it was epidemigenic, the molecular weight fraction below 100 kDa was not immunogenic. This is again consistent with the imnon hypothesis and is consistent with that explained by KIltZ. do not. 4) +1 Mammals cannot hydrolyze polypeptides composed only of D-amino acids. such polypeptides are free or epitopic. Even if it is replaced by (It seems likely that this will continue. However, polypeptides made from ordinary amino acids are made from ordinary proteins. It is rapidly hydrolyzed in the body by enzymes and is not expected to have a sustained release effect. . This is the “unnatural” D-amino acid polypeptide described by K2LtZ. The unusual properties of putido are simply due to its resistance to enzymatic degradation. , a property common to many synthetic and natural polymer molecules. Diener and his collaborators used carboxy-methylcellulose as a carrier. There are a number of publications describing the specific suppressive immune effects of epitope coupling. Many have been reported (eg, Diener et al., J. Immunol, 122:1886-1891 (1979). these Diener describes the special chemical properties of carboxy-methylcellulose. However, the molecular weight of the substance is not considered. However, The applicant is a carboxy-methyl cellulose hapten with a molecular weight of less than 100 kDa. Any dose in which the preparation is inhibitory to the epitope coupled to it However, preparations with a molecular weight of 100 kDa or higher may be irritating at the correct dose. (Dintzis et al., J. Immunol. 143:1239-1244 (1989)). Obviously Diener used substances with molecular weights mainly less than 100 kDa, and his preparation of polymers did not recognize the importance of molecular weight size in having immunological effects. The specific inhibitory effect of habten coupled to polyvinylpyrrolidone (PVC) is , reported on substances used as blood substitutes (von 5pecht et al., Cl1n, Exp, Immunol, 33:292-297 (19 78): Lee et al., Bur, Immunol, 11:13-17 (19 81)), other authors have shown a similar inhibitory effect of Habten coupled to Ficoll. reported the results (Watanabe et al. J, Immunol. 118:251-255 (1g″77)), pneumococcal occal) polysaccharide (Borel et al. Nature 261:49-50 (1976 ); Mitchell et al. Fur, J. Immunol, 2:460-4 67 (1972)), Plant Polysaccharides (Moreno et al., CI in, Exp, Io+muno1. 31:499-511 (1978); Hu+nphre y, Eur, J, I+nmuno1. 11:212-220 (1981)) or congener immunoglobulins (Lee et al., J. Immunol, 114: 829-842 (1975); Borel et al., Nature 261:49- 50 (1976)), although these reports are extremely diverse, The combined effect of molecular weight and epitope valency of polymeric carriers such as are not concerned with the immune response generated by their administration. epitope -Molecular weight characterization of substituted polymer preparations was not done in these reported studies. won. However, experimental methods indicate that the average molecular weight of these preparations is in all cases This is consistent with the explanation that it was less than 100 kDa. Generally, specific inhibitory effects from hapten-coupled polymer preparations have been reported. The authors have clearly identified a preparation that corresponds to the inhibitory soluble molecule described by the applicant. i.e. that a substantial number of epitopes have a molecular weight of about 100 Coupled to a sub-kDa polymer carrier. These conditions are unconscious may have been encountered under various experimental conditions, but as mentioned above, such The encounter does not imply the invention. Brief description of the drawing Figure 1. Conversion of dextran to GMB-dextran. Figure 2. Conversion of carboxymethyl dextran to dexamine. Figure 3. Conversion of dextran to polyanionic dexamine. Figure 4. Conversion of dexamine to polycationic dexamine. Figure 5. Poly(acrylamide, acrylic acid) to poly(acrylamide, acrylic acid) Conversion to primary amines containing (lyric acid). Figure 6. Examples of trimeric and tetrameric “point source” scaffolds. Figure 79. Cyclodextrin as a point source scaffold. Figure 8. Coupling of peptides to GMB-dextran. Figure 9. Analytical equilibrium ultracentrifugation of fluorescein-treated dextran. ・=　14. OOORPM;■=16. OOORPM Figure 10. peptide -Amino acid analysis of dextran conjugates. Figure 11. Analysis of wolf-healing histone peptide-dextran conjugates. +=PTC-(s-2-(2R,2S-succinyl)-L-Cys;・=PTC -GABA Figure 12. Binding peptide substitution density equation. Figure 13. Another marker derived from acid hydrolysis of peptide-dextran conjugates -Amino acids. Figure 14. Acid (HCL) hydrolysis followed by phenylthiocyanate (PIT) Size-fractionated DNA/DeXt generated as a result of induction in C). , Hydrolysis peak of conjugate. Figure 15. Acid hydrolysis followed by induction with phenyl thiocyanate (PITC) DNA hydrolysis peak generated as a result of decoupling. Figure 16. Direct stimulating polymer (Polymer S) in the serum of separate mice 6 days after injection with the same amount (10 BALB/c mouse per point). Dose-response measurements representing the average relative concentration of TgM antibodies. Error bars indicate SEM when it is larger than a circle. Continuous curves are The dose of 0. At 3 μg, the immunosize q is the peak that occurs when IO Regarding the response, the theoretical response predicted from Equation 1 (see page 96) is shown. theoretical response is insensitive to the value of q when q is greater than 5. The peak of the response curve is the serum This corresponds to approximately 30 μg of anti-Dnp IgM per ml. Figure 17. Dose-response measurements for various lots of BALB/c mice. Measurements were made on serum from separate mice. The average of the measurements is at each dose. Expressed for each group, but when the mean is greater than the symbol, it is expressed together with the SEM . Among the symbols used, consecutive black circles represent 10 mice per point. Points are the same as in Figure 16); hollow circles “○” represent 5 mice per point; Numbers represent 6 mice per point. Figure 18. Non-immunogens injected simultaneously with a fixed dose of immunogenic polymer preparation S Response-Decrease Measurements for Increasing Doses of Polymer Preparation N. measurement were performed on serum from separate mice. The mean for each group is expressed with the SEM when the mean is greater than the symbol. BAL B/c mice, 10 mice per point, 0. 31 μg of Polymer S was added to each mouse. was given to A continuous curve is obtained when the immunosize q is lO and from Fig. 17 The D'I■ setting is 0.0 per mouse as induced. For the case equal to 5μg , giving the expected theoretical response from equation l. The theoretical response is polar for some value of q. Although it is not sensitive at all, it shifts left and right according to the value of D'″0 without changing its shape. Ru. Figure 19. Start incubation in the presence of various concentrations of immunogenic polymer S Three days later, direct anti-Dnp plaques produced from pancreatic cell cultures were compared. Dose-response measurements on numbers. Data represent triplicate assays per culture in duplicate. Represents the mean taken for the nutrients; SD indicates when the mean is greater than the circle. The peak response of the experiment was '42o' per 10'splenic cells in a blind experiment (no polymer). This corresponds to 1300 plaques per 10' splenic cells with plaques. The curve is , the polymer concentration is 0. Peak that occurs at immunosize q of 10 at 4 g/ml Give the predicted theoretical response from equation l for the response. Figure 20. A fixed dose (0.3 g/ml) of immunogenic polymer preparation S and non- - Incubate in pancreatic cells with increasing doses of immunogenic polymer preparation N. response-decrease measurements for the case of The procedure and data processing are shown in Figure 19. It is. Different symbols indicate that the data obtained are from separate experiments. song The line is immunosized q is IO and D″ as derived from equation 19. The theoretical response predicted from equation l for the case equal to ``1'' 1 setting quadruple g/ml. Show the answer. Figure 21. In vitro responsive force inetics. Fill of natural pancreatic cells. Pv The direct (IgM) anti-Fl response to elevated A400 was 3 (·), 4 (○). Alternatively, the culture after 5 (b) 8 was measured. All S and D are less than 10%. It was. Figure 22. In vivo responsive force inetics. Optimal dose (10ng/mouse) (DFlssPVA200 (0,511(7) in physiological saline solution) was injected into the peritoneum. , direct (IgM) anti-Fl responses were measured from days 0 to 66. Each point is Figures represent the average of triplicate assays. S, D, are smaller than 10%. Figure 23. Imbib prepared with four types of Fl-polymers with different carriers. Bo-normalized dose-response curve. Each point represents the average of triplicate assays. Mouse is Fl-po Increasing doses of Rimmer (in saline solution) were injected into the peritoneum (3 animals/point). , PFC was measured after 4 days. Normalize the curve so that the maximum response is a value of 1. , the other responses were given by the rational number of the maximum response. Are S and D smaller than 10%? It was. O=Fl160-CMC520°・=Fl85-DEX400. Mouth= FL240-FIc750; △=FL55-DVA200゜Figure 24. different keys In vitro normalized administration response created by five Fl-polymers with carriers. answer curve. Direct (IgM) anti-FIPFC culture of polymer with native pancreatic cells was measured 3 days later. Normalize the curve so that the maximum response has a value of 1, and other responses was expressed as a rational number with maximum response. O=FL160-CMC520,・=F l65-DEX400; Mouth=Fl90-Flc750;■=Fl95-P A300; △=FLIIO-DVA400゜Figure 25. Non-irritating FL polymer Fl, by. Inhibition of in vitro responses to Fi c750. IgM P Fle of FC. The response to Pic750 alone is taken as a value of 1, and the non-immunogenic polymer The responses of cultures containing added amounts of - were expressed as rational relative responses. Each culture Fl in things. The concentration of Fic750 was kept constant at 3 g/ml. ○=Fl4-CMC15, ・=FLY-CMC27, Mouth=FL14-PVA 50. ■=Fl14-PVA50. △=　Dnp19-PA60゜Figure 26. exemption Fl, due to high doses of epidemiogenic Fl-polymer. Invitro to Fic750 Inhibition of b response. 3 g FI per ml. Ig for F i c750 only M PFC response as value 1, response of culture containing added amount of Fl-polymer is expressed as a rational relative response. -○-=Fl150-CMC440. -Low=Fl90-Fic750;...Mouth...=Fl240-Fie7 50;-mouth-=FL640-Fic2000H-low=FL230-PA400 0 Figure 270 Anti-fluorescein in three immunized mice as a function of time. IgG antibody serum levels. As shown in the figure, mice were treated with aluminum hydroxide adjuvant. After receiving repeated injections of fluorescein-treated ovalbumin in patients, it took several hours before blood was drawn. I was kept alive for a week. All blood draws were performed at 10. Identical ELI at 1:000 dilution Analyzed by SA assay. Figure 28. Fluorescein-treated polyacrylamide polymer FL30-Pa50 ( This means that a 50 kD polyacrylamide polymer is mixed with 30 fluorescein. Treatment of anti-fluorescein IgG serum antibody levels with Healing. The time when 3 mg of polymer was administered was arbitrarily designated as day 0 on the timeline. One point of hollow circle data corresponds to one point of data shown in Figure 27 for non-inhibited mice. Mean, including standard deviation and square of best fit to the straight line shown. the other 6 One point of data represents six separate mice. Figure 29. Fluorescein-treated dextran polymer FL25-Dex70 (this This means that a 70 kD dextran polymer is combined with 25 fluorescein hubs. Curing of anti-fluorescein IgG serum antibody levels by (replaced with) 1m The time at which g of polymer was administered was arbitrarily named 08 on the time axis. Hollow circle A data point is the average of the data points shown in Figure 27 for uninhibited mice. , including the standard deviation and the square that best fits the straight line shown. 6 other data Each point represents 6 separate mice. Figure 30. Fluorescein-treated dextran polymer FL30-Dex80 (this That is, 80 kD dextran polymer and 30 fluorescein/butene Curing of anti-fluorescein IgG serum antibody levels by substituents). 3 The time when +ng of polymer was administered was arbitrarily designated as day 0 on the time axis. Middle-cut One circle of data is the average of the data shown in Figure 27 for non-inhibited mice. , including the standard deviation and the square that best fits the line shown. the other three de Each data point represents three separate mice. Figure 31. Anti-fluorescein IgG blood due to fluorescein-treated dextran Healing of serum antibody response. The results of the ELISA assay were 100. 000 times diluted ma It is hailed with mouse serum. These mice received log hydroxyl at the indicated times. 10 g of fluorescein-treated ovalbumin adsorbed on aluminum chloride was injected. stimulated by giving. Healing is approximately 40 kD at the indicated time. Administer 2+++g of highly fluorescein-treated dextran of average molecular weight. It depends. Data are from groups of three mice, with the indicated mean and deviation. have a difference. △=no stimulation;・=FL-OVA stimulation; O=PL-DRX healing. Figure 320 Similar to Figure 31, but with 1 mg of aluminum at the indicated time for the mouse. For administration of 1 μg of fluorescein-treated ovalbumin adsorbed onto hydroxide. It was more stimulating. Figure 330 Similar to Figure 31, but with 1 mg of aluminum at the indicated time for the mouse. Injection of 0.1 μg of fluorescein-treated ovalbumin adsorbed onto hydroxide. stimulated by feeding. Figure 34. Treatment-induced reversal of numerous tile cells producing anti-FL IgG serum antibodies. A reduction in the number of antibody-secreting cells was actually caused by F adsorbed on aluminum hydroxide. A wide range of initial doses of L-OVA was covered. Ro = non-healing; decoy = healing. Figure 35. Anti-fluorescein I from tile cells of mice cured with EL-Dex Percentage reduction of gG-producing lymphoid cells. Mice were prepared as shown in Figures 31 to 33. treated, final curative dose of FL-Dex at 95 days, and tile cells at 125 days. 35 Analyzed days later. Day = 0 per gelatin. 2FL;E]=0.0 per gelatin. 0 8PL. Figure 36 6 mice per group were cured using different rats on different days ( IgB antibody levels in pooled sera from ○) and unhealed (・) mice. Two separate PCA measurements were performed on the sample. Stimulation of 0,1 μg FL-OVA adsorbed onto 1 mg aluminum hydroxide. Intense administration is 0. was given to all mice on days 21 and 71. For cured mice, healing of anti-fluorescein 1gE serum antibody responses Treatment with 2 mg FL30-Dex80 on days 34 and 95 . Figure 37. Structure of penicillin and benicilloyl hapten. R is Ben for Penicillin G Zyl group (benzylpenicillin). In the beniciloyl hapten, the internal The amide bond of the β-lactam ring is an amide bond involving a primary amine from a carrier. replaced by a bond. Figure 38. Administration of the inhibitory polymer BPO-PA virtually completely abolished the anti-PO response. (Figure 38a), but the anti-OA force response is unaffected (Figure 38b). in two months Not only did the dose result in undetectable anti-BPO titers, but mice also received BPO-P. acquired resistance to A and did not respond to the “booster” immunization given on day 110. Ru. Mouth = control; ■ = experimental; ↑BPO-OA or AI (OH) injection; association suppression Polymer (BPO-PA) injection. Figure 390 Anti-fluorescein IgG in progress using scaffold-limited valency Response inhibition. 0-0=no cure;・-・=700μg CI-374;△-△=7 o4 gcl-374; Muum = 7 μg Cl-374; Rollo = 2 mgC I-323゜ Figure 40. Serum anti-BSA for monomeric (·) and polymerized (·) BSA 1 gM dose response. 10. to CAFI/J mice. 100 or 1000μg (68 kD) or galbodiimide cross-linked heptamer (5000 kD) of BSA preparation. IgM antibody responses were measured for serum diluted 200 times. It was measured by ELISA assay on the 6th day. The data is based on 3 mice per point. This is the average of Figure 41. Effect of BSA monomer on response. Molecular mass is approximately 1.3°7. 20 and 70 to BSA (BSA monomer has a molecular size of 68 kD). The data is similar to that shown in FIG. 40.・=　toooμg administration；・=100 μg administration;・=10μg100Figure 42. BSA multimer affects serum 1gG response influence. Single injection of BSA polymers with various molecular sizes at various doses Serum anti-BSA IgG antibody level 14 days after treatment.・=　1ooooμg administration ;・=100μg administration;・=IOμg administration. Figure 43. Monomeric BSA (・) or carbodiimide cross-linked 20-mer (・ ') Serum anti-BSA administration response for multiple injections of BSA. Anti-BSA Ig G responses appear after three injections given 30 days apart. Serum was diluted 4000 times for ELISA assay. Figure 44. Serum anti-BS against BSA “20-mer” given in extremely small amounts A. Effect of multiple injections on IgG response. 1 μg of monomer (・) or cal Bodiimide cross-linked 20-mer (・) BSA polymer (1400kD) on a monthly basis Injected with. A total of 5 μg (5 injections) was given. Is the data from 3 mice? is the average of Figure 45. OVA monomer (・) or glutaraldehyde polymerized 150-mer ( ・) Serum anti-0VA 1 gM administration response 5 days after injection. Figure 46. Monomers or glutaraldehyde crosslinked polymer fractions of various molecular sizes OV Serum anti-0VA responses to multiple injections of A. Serum for ELISA assay It was diluted 4000 times.・=100 μg administration;・=10 μg10 amounts・=1 μg administration Give. Figure 47. BSA (quake) and 0VA (・) of monomer and various polymer sizes Comparison of serum 1 gM responses generated by BSA or OvA monomer or Three injections of Polymer 1+og (saline solution) were given. Serum was diluted 200 times It was done. Figure 48. Anti-fluorescein produced by fluorescein-treated BSA polymer In (b) and anti-BSA (■) serum 1gG responses. BSA polymer (20mer ) sample was hapten-treated with fluorescein isothiocyanate to remove BSA. Preparations with varying amounts of fluorescein per monomer are produced. Mouse every other week Four times (400 μg total) were injected with 100 μg in physiological saline solution. fluore Serum was assayed for IgG antibodies against cein and BSA. Figure 49. Levels of IgG peptide (GALA)-specific antibodies in serum. Description: Ma Mouse #50-○; Mouse #6 ・--1・; Mouse #7 △...△; Mouse # 8　mu-・-・-mu; ★=injected buffer. Figure 50. Prevention of increase in antibody level by EALA-DEX84. Healing〇−〇; Vs. Control: 1/190. 3ml buffer; healing EALA DEX- 84°Figure 51. Specific inhibition of the 104 response directed against the 159 epitope. After blood collection on the 77th, healing on the 83rd; 84th day - blood collection d7-d91, explanation: ↑ "Healed" mice received various doses of 159+ o-dexs. injected; control Mice were injected with saline solution. ★Control (・) and healed (0) mice are abdominal logg's 104-BSA was injected into the membrane. Figure 52. Suppression of anti-histone antibody titers. Figure 52a is the experimental group, Figure 52b is the control group. be. Method = 1 day - 1, 10, 100 μg intravenously or 100 μg intraperitoneally. Day 3 - 200 μg intraperitoneally. Day 9 - 200 μg 1 ip. Day 16 - 200 μg intraperitoneally. Day 23 - 200 μg 1 intraperitoneal. Explanation: Different lines represent different mice. Figure 53. Specificity of inhibition of anti-histone responses. Figure 53a, -Anti-N15-H2B. Figure 53b, -Anti-5sDNA. Description: Experiment - 1 row, N=17. Control - 10 - 1N = 11° Figure 54. soluble Activation and activation of T-cell interleukin-2 production by fluorescein polymers and inhibition. The transfected T-cell line IB2 was treated with phorbol ester ( 3 ng/ml) and various concentrations of soluble fluorescein polymers indicated. did. After incubation, remove the supernatant and remove the rL-2-dependent cell line. IL-2 was assayed by measuring the proliferation of CTLL2. CTLL Proliferation of 2 is measured by incorporation of radioactive thymidine into cellular DNA. . In part (a), two fluorescein polysaccharides of different molecular weights and valencies are used. T-cell responses to mer were measured at various concentrations. In part (b), irritating For the various concentrations of polymer indicated, four concentrations of inhibiting polymer were added. 0. 48u g/ml (triangle of middle coating) ; 4. a　u　g/ml　(symbol ). Figure 55. Intracellular calcium in T-cells by soluble fluorescein polymers Activation or inhibition of mucus efflux. Transfected T-cells are sensitive to calcium. Receptive fluorescent dye 1ndo-JAM (Molecular Probes, Orgene, OR :Molecular Probs Eugene, OR). Ko Cells were measured separately at 355 nm using a Luther-MDADS flow cytometer. was stimulated and fluorescence emission was measured at two wavelengths (405 and 480 nm). figure showed no concentration of calcium in single cells at any given time (horizontal The coordinate axes are scaled in 16 second increments). Transfected cells were analyzed for 20 seconds, then phorbol ester or accessories - various fluorescein polymers under completely cell-free conditions. added. Cell stimulating polymer FL5-Fic150 (38μg/+n l) (a), and 3. When treated at a concentration of 8 μg/at (b), less A substantial increase in intracellular calcium concentration was observed in at least 10% of the cells, but 38 There was less calcium efflux at 0 μg/+nl. However, inhibiting polymer FLII-Fic46, which is a did not induce mu-elution, but caused a substantial inhibitory effect (d and e). thorn FL50-Pic150 (38μg/1Ill), a highly aggressive polymer (d) and 3. 811 g/+01 (e) for a short period of time in cells with an inhibiting polymer. Added after incubation. In both cases, the irritant polymer Induced calcium elution is almost eliminated. Description of the invention The methods of the invention provide an effective amount of non-immune therapy to an individual suffering from an undesirable immune response. antigenic substances (which contain many antigenic domains, i.e. “epitope 2” or “happy”) the non-antigenic substance, for example, Allergies or autoantigens that are the cause of undesirable responses, such as allergies or autoantigens. Corresponds to antigens that cause autoimmune diseases. A hapten or epitope is a binds to a cellular antigen receptor specific for the indicated hapten or epitope; The number of haptens or epitopes is sufficient and there is a stimulatory conflict with the antigen receptor. If the carrier size is lower than the exact threshold limit to avoid forming stars , the administered substance serves to suppress or evade a specific immune response. administered Substances that stimulate allergic or self-antigen responses can be stimulated by the body's general immune system. specifically suppress power without compromising or harming it. The early disclosures of this series of applications included the use of chemistries to accept the DNP group as an epitope. Constructs containing linearly modified and size-fractionated polyacrylamide Includes descriptions of These conjugates depend on the size and molecular weight of the polymer backbone and the haptics. number of DNP groups per average molecular weight of the polymer for a given group organized into multiple groups based on Depending on the amount of these two scales, Ten's density law can be defined with distinct variables. Immunize these structures Based on data obtained using both in vitro and in vivo models of function, The specific “laws” governing B-cell activation by antigens have been elucidated, and antigen-specific It was used to suppress T-cell independent immune responses based on isomerism. immune function These laws affecting antigen-specific modification and their use in included in the filed application. Another application in the series includes various scaffolds or scaffolds and haptens. Including further experiments to support the law of the application of et al. That is, they are especially Original application applied to T-cell independent immune system activation (practically IgM production) We demonstrated the "universality" of this law, which was elucidated in . This disclosure covers all of these Contains specific experiments that demonstrate the applicability of the same principles to a range of immune functions; T-cell dependent antibody production (actually defined as the production of IgG and IgB) ), as well as T-cell activity. In the examples that follow, examples from the parent case as well as simply small molecular weight DN Includes examples of complex constructs containing a wider diversity of antigens than A and fluorescein. . Biophysical and biochemical considerations that need to be taken into account when designing such structures The following is an explanation of the considerations. These include the chemistry of the synthesis of the structures, as well as the practical aspects of the inventions disclosed in the series of applications. Conforms to and follows first principles governing the bond valence and size that constitute the fundamental basis. including a preferred method of characterizing the final product. Constructs (conjugates) are non-stimulatory and therefore "inhibitory" or It should give rise to tolerogenic properties and meet one or both of the following criteria: i) “Valency” of the conjugate (actually the final polymer structure) (defined as the number of “distinct antigenically recognizable moieties” per immunomonitor) must be below the del threshold (generally less than 20). As mentioned above, these moieties can be simple haptens or more complex peptides or can also be a protein. Each of these parts has a diverse “antigenic appearance”. but for any given B-cell that can recognize that part, Even if other B-cells can recognize other areas of interest, A minute is recognized by one immunoglobulin in one particular cell. It will be understood that there will be only one separate binding region. For purposes of determining valency, various identical peptide sequences (specific malaria proteins) Sequences found in proteinaceous proteins, or found in hemoglobin with repeating subunits proteins) or carbohydrates with regular repeats of sugar residues (bacterial polypeptides). In special cases, such as peptides or proteins that contain It appears to have a “distinct antigenic recognition portion”; it) The size of the final structure depends on the cluster of receptors that define the “immunon”. Must be smaller than the minimum size required to spread. effective size The strength appears to be a function of a number of independent parameters: the scaffold or scaffold; geometry (straight, branched, spherical, radial, etc.), physical properties of the skeleton (flexible, strong, the hydrophilic or hydrophobic nature of the backbone; the electrostatic nature of the conjugate (e.g. “segmented”); the sum of the charges of both the backbone and the array part), as well as the size, the geometry of the part itself and physical modifications. The optimal number and spacing of specific haptens or epitopes depends on the size of the carrier. as well as for laboratory animals such as mice, rats, rabbits or pigs. Antigenically recognizable with the selected scaffold material without undue experimentation It is understood that using the part (see 1976 reference above), it can be determined Will. ■ Preparation of immunosuppressive constructs Structures suitable for use in the present invention can be manufactured by well known methods. Preferably, used The manufacturing method minimizes the possibility of cross-linking as well as the possibility of polymerization between separate molecules. It is something. In addition, the manufacturing method preferably produces only one dominant reactive moiety per sequence portion. is chosen so that its orientation with respect to the skeleton can be controlled. Wear. The resulting structural preparations contain high molecular weight substances, potentially irritating substances. It is conveniently characterized prior to use to ensure that it does not contain. generate Binding with defined chemical scaffolds to optimize reproducibility of constructed constructs The use of values is preferred. Structure design and analysis A. General chemical considerations The basic concept underlying Applicant's invention is that the immune system By interacting with the external environment by recognizing the antigen array (column) of the protein, be. From a biophysical or biochemical point of view, the triggering of other receptors is There is no difference between the above-mentioned epitope or hapten and there is no difference between the Epiglobulin and similar membrane-bound receptors (B cell receptors and T cell receptors) ) are no different from protein receptors in other biological systems. The difference lies not in the interaction between individual receptors and ligands, but in the Nor does it depend on "information transmission" after the nd binds to the receptor. structure of the immune system The individual membrane-bound receptors that form the membrane are capable of binding monovalent ligands; Functional interactions that carry out Gantt-receptor interactions are stable over long periods of time. They form aggregates of existing receptors and are named “immunons” and become individual units. Ru. This phenomenon suggests that the interaction between individual receptors and ligands is functionally important. Qualitatively different from other biological systems. (Example: One neurotransmitter is present in the postsynaptic membrane. If it binds to a receptor, a change in membrane potential is detected. ) Immunon formation is individual It depends on the binding of individual ligands (epitopes or haptens) to the receptors of However, the immunon itself depends on the biophysical properties of the entire sequence and depends on the individual binding phenomena. It's not that I'm dependent on it. When compared to receptor-ligand interactions in other biological systems, this immune system The concept underlying the discussion of receptor-ligand interactions is the lower and upper thresholds. The rays represent immunological “agonists” and “antagonists,” respectively. (antagonist)”. In classical pharmacology, an antagonist is an agonist. It has a binding ability that shows the same receptor affinity as that of ``unproductive (antagonistic)'' It is a substance that acts on In other words, it binds, but the subsequent secondary effects due to the binding of the agonist does not activate phenomena. Functional performance depends on immunological formation and on individual receptor-ligand interactions ``antagonist ligand'' is not included in the ``antagonist array''. The “antagonist array” is a non-producing receptor that needs to be replaced. aggregates, thereby allowing immunostimulation by “agonist arrays.” interfering with the formation of minerals. This cluster of productive and non-productive receptors Using the concept, an immunological agonist binds to a certain number of receptors and an “array of upper thresholds” that meet or exceed the minimum required for formation of It can be assumed that immunological antagonists cannot induce immunological formation, but A receptor that binds to multiple receptors and is equivalent to an upper threshold sequence (of the agonist) – Indicates binding properties. Finally, if the immunon concept (mechanism) is operationally possible, it is possible to aggregate receptors. The specific chemistry of the array is important as long as it meets the biophysical rules of It is clear that the arrayed ligands are recognized by the intended receptor group. It is. For example, only certain arrays (columns) can interact with the required number of receptors. In order to be effective, the practical nature of the scaffold used should be recognized by the target cell population. There isn't. Principles of bond valency and/or size should be used to achieve the desired outcome. A myriad of precisely maintained structures can be used. As a result, scaffolding or basic It will be important to control the chemistry of the scaffold as a backbone, ensuring that the antigen sequence is Provides the basis for synthesis and recognition as a ligand. Those skilled in the art will understand that It is also important to confirm the composition and integrity of the final structure used before it is installed. You will understand that there is. For example, if immunon consists of eight receptors aggregated, then Strictly limited “valency limit” limited to the number of ligands that is an integral multiple of 8 or less The cluster that is the lower limit of the threshold is obtained by the “antagonist array (column)” It will be done. In natural animals, such sequences have non-irritating properties and are It acts to inhibit the production of antibodies against the epitope in question. In animals that have already established an immune response to the same antigen, such structures may It acts as a competitive inhibitor in causing the reaction, that is, it has suppressive properties. Become. On the other hand, immunons need to have a minimum finite size, which is similar to lymphocytes. It is determined from the maximum packing density that can achieve the required number of antigen receptors on the surface. child Sequences that cannot cover the minimum area (size limited from the antagonist sequence) of Regardless of how many binding sites it has, it has a non-irritating property and an inhibitory effect. can be expected to have the following properties. dinitrophenol (DNP) and fluorescein Ligands such as molecules or small peptides have size limitations (possibly 150. Determine the size of the array (column) from OOQ (smaller than Dalton) The main factor is scaffolding. High molecular weight polypeptides, nucleic acids, or proteins For more complex ligands such as ” is itself a controlling factor. In such cases, equal connections limited by the structure Nominal (planned) “size” set for low-valence epitopes It may exceed the standard. How does the immune system respond in such cases? From this perspective, consideration of bond valence takes precedence over consideration of size. system A specific array (column) introduced into the system has a sub-threshold value for the binding site of the receptor. In the case of a number, an immunon is formed no matter how large the absolute area of the array is. You can't expect it to happen. In both cases (antagonist arrays with limited size or valency) )) But different chemicals will give the same result. Below, the book Three types of technical points important to the invention are shown. The first point is that controlled selection Preparation of scaffolds that covalently attach ligands in a selective manner. The second point is to identify The preparation of the ligand itself in such a way that it can be attached to the scaffold in this direction. The third point is , the preparation and evaluation of the final conjugate before introduction into the biological system. B8 scaffolding In terms of creating agonist or antagonist arrays, A variety of physically available scaffolds or basic skeletons can be used. how many of them can be used without selective chemical modification. attached to these scaffolds The only limitation is that the final products are prepared in physiologically compatible bags. It has sufficient potential for fur solutions. Links attached to scaffolding Even though the gunds are relatively water-insoluble, the final product is soluble. Should be used. Alternatively, the ligand in question has an undesirable charge (e.g., positive charge), adding properties to the scaffold that counteract it can maximize The final product can be kept within an acceptable range. To introduce general binding reactions, scaffolds The primary amino group on the top becomes a functional group that can be used for various chemical modifications or operations, and The reaction can proceed under mild aqueous conditions. However, when used for such reactions Those skilled in the art will appreciate other possible chemistries as well. Below is a scaffold for binding We present samples of chemicals available as Table 1 shows different biophysical Scaffolds with unique properties (see also Example 1) are summarized and invariant concepts are underlined. there was. Table 1 Molecular characteristics of polymer molecules Desirably, the materials used should be able to be analyzed before and after chemical modification. , preparative molecular weights to confirm homogeneity and relatively narrow mass distribution, if necessary. Ability to use fractionation methods (e.g. Niger filtration method and ultrafiltration method). Furthermore, chemical modification A method to independently verify the mass before and after (e.g. laser light scattering method and/or equilibrium (psychotherapy) was also performed at the same time, and the scaffold used was either an agonist array or an antagonist array. Ensure that all of the trays are within the required size tolerances. C, epitope related to the chemistry required to modify and attach the desired ligand to the selected scaffold. The general contents are shown below. Again, the specific chemicals employed vary. It can be modified or changed in various ways. Detailed information is provided below in the main text. are illustrative of the types of chemicals that can be utilized to produce structures related to the present invention. Those skilled in the art correctly recognize that. 1. Low molecular weight habuten Here, especially as a low-molecular-weight hubten, the free amino groups of the scaffold can be used for modification. Describe the types that are not required. For example, thiol reacts with amino groups in a short time and is stable. Fluorescein derivatives from fluorescein isocyanate forming rare bonds is created. Other low molecular weight habutens can also be used using known chemical methods. Those skilled in the art correctly recognize that it can be used. 2. Peptides Peptides identified for use as ligands can be modified and Therefore, it can be effectively arranged, but the property that the immune system recognizes in the desired manner It is necessary to maintain Naturally synthesized peptides or proteins are Three types of amino acid side chains that can be used directly as functional groups to bind peptides in situ have. These groups are the epsilon amino group (terminus of the side chain) of lysine and Amines composed of N-terminal alpha-amino groups, aspartic acid and glutami located at the end of the acid side chain. A carboxyl group consisting of a carboxyl group and a C-terminal carboxyl group , the sulfhydryl (SH group) of cysteine. exposed on the surface of proteins Glutamic acid, aspartic acid, and lysine are frequently found as amino acid side chains. and, as a result, commonly used methods for antigen-immune system interactions. Those skilled in the art correctly recognize that. one or more amino groups and/or carbon Peptides with a combination of boxyl groups have a certain directionality and chemical properties. Special care will be required to control (maintain) quality. Furthermore, those side chains Ligand polymers may be generated during alignment and formation; need to be identified. By utilizing the free sulfhydryl group of R cysteine, each You can take advantage of the important advantages of seeds. First, in most biology, cysteine has no free sulfhydryl group. As a result, antigen-immune system interactions It is rarely included. Second, other reactive groups commonly found in biology Even with this exclusion, there is a wealth of chemistry that utilizes sulfhydryl groups. Furthermore, Since cysteine is an amino acid used in nature, it can also be used in recombinant proteins. It is possible to enter For these and more detailed reasons below, , chemistry utilizing sulfhydryl groups is used to attach peptides to various scaffolds. is a highly desirable system. For all peptides identified and described here, standard peptide solid phase A synthetic method has been adopted and its properties are described in Example 9. Pepchi in question If the peptide is attached to a protein, clearly quantify the peptide attached to the scaffold. Publications that show how this can be done need to be identified. The main factor that prevents ligand binding Various types of spacers can be introduced to the ligand in question to prevent steric factors. can be entered. such as epsilon (6-) aminocaproic acid or delta (5-) aminovaleric acid. Unnatural omega aminocarboxylic acids bind peptides to scaffolds cysteine (or cysteamine – see below) and the ligator in question It can be used as a spacer between the two ends. These amino acids are standard amino acids It has characteristic properties for analysis and can be used to quantify the “bond valency” of peptides. and at the same time can be used for a flexible linker between the scaffold and the peptide in question. 3. Protein Proteins are highly variable with respect to the immune response generated with such types of antigens. Give extra consideration. One protein molecule contains multiple epitopes that serve as different antigens. Similar to topes, different types of epitopes (sequential, sterically linear (continuous) , sterically discontinuous epitopes). To deal with these issues, it their expression as epitopes, their synthesis, agonists or antagonists. We have developed an approach for three types of protein antigens that belong to different categories: Roach needs to be considered. The first problem involves the use of low molecular weight peptides or modifiers. Decorated peptide-based ligands “mask” the apparent antigens of proteins. It is to twip. The second problem is that proteins covalently bind to each other or to the scaffold. Oligos that make up entire proteins or domains of large proteins This is the structure of Mar. The third one mimics the antigenic structure of a protein epitope, but It has little or no compositional similarity to naturally synthesized proteins. This is the creation of a minotope. These attempts are described in Example 10. 4. Carbohydrate The method shown below identifies molecules that are covalently assembled. bonding of oligosaccharides, monosaccharides (sucrose), glycoproteins, or other components The reducing end is used to form large molecular arrays. Compatibly, The chemicals listed below contain polysaccharides, oligosaccharides, glycolipids, and glycoproteins. It is used as a linker to attach different molecular scaffolds. Bonding with other molecules A suitable reactive terminal group, an amino group or a sulfhydryl group, is a Schiff base. It can be produced at a high rate by the following method that utilizes the generation of intermediates and selective reduction. Wear. Primary aliphatic amino group-cyano sodium borohydride (concentrated, degree, e.g., 0 ．． In the presence of ethylenediamine dihydrochloride (concentration, e.g. 0. 1-1. 0 M) (or NO3-(CH2)n-NO3, where n is small 2 or larger) (e.g., 18 hours, around pH 5) . A complete process in which reagents are removed by dialysis or a desalting column, thereby reducing the end groups. A complete reaction is obtained, forming a terminal primary amino group suitable for subsequent coupling reactions. Sulfhydryl group - replacing the raw sugar with diamine as above Cysteamine dihydrochloride (concentration, e.g. 0. 1-1. 0M). Reaction completed After synthesis, the resulting disulfide derivative can be treated with standard disulfide derivatives such as C1eland's reagent. A free terminal sulfate that is easily reduced with a ruphide reducing reagent and suitable for subsequent coupling reactions. A fiddlele group is formed. 5. Nucleic acid In at least one case (treatment of erythematous lupus), two DNA-nucleic acids have been shown to be antigens. is known. Unmodified double-stranded D required for effective binding to receptors A series of studies designed the minimum size of NA, resulting in 100% receptor binding. It became clear that the required size was about 40 base pairs. base for stabilization Rather than relying solely on paired hydrogen bonds, this can be achieved if the duplexes are covalently bonded. The requirements will be different. Naturally synthesized DNA, synthetic DNA, or naturally occurring phosphate bonds Modified DNA containing phosphorothioate instead of can be used to create possesses the necessary functional groups for covalent attachment to a suitable scaffold. The types of chemicals that can be used to create desired epitopes are shown in Example 11. include. D, zygote The final step in making zygotes suitable for use in these methods to which the present invention relates is , from suitable scaffolds and ligands in the desired configuration to ensure that the final material is actually the intended one. The purpose is to check whether the content is correct. Evaluation of the final structure is based on these is an important part of the preparation and use of materials (see Example 12). ■Use of this structure to suppress T cell-dependent immune responses However, the earlier applications in this series were mostly based on size-restricted scaffolds and low molecular weight T cells using structures composed of Habten (DNP, fluorescein, etc.) It is associated with inhibition of responses independent of The following materials posted in this example are Ig G and IgF! A more complex reaction involving T cell-dependent antibody production shown in the same species. It has been demonstrated that similar suppression has been achieved. As will be evident in this example below, the haptic By sensitizing animals with inhibitory constructs specific for the However, it was produced according to the method described in effect on rapid and complete destruction of the antibody response. In that document, the cellular level This shows that suppression occurs at Clinically important exogenous alleles shown by IgB Antibody responses to genes (including both small chemicals and complex epitopes) is completely suppressed in structures that meet the valency and size criteria shown below. Ru. Furthermore, the constructs of the invention can also be used to suppress autoimmunity. From the results of the following examples and earlier applications following the methodology presented herein, the low Complex antigens (peptides, proteins, lipoproteins) as well as molecular weight haptens , glycoproteins, nucleic acids, sugars, lipids, glycolipids) It is correctly understood that it can be applied to a wide range of areas. ESSENTIAL PRINCIPLES INCLUDED does not depend on any particular scaffold or scaffold. Polymers with very different chemical properties polymers (dextran, polyacrylamide, Ficoll, etc.) can be used. Furthermore, as shown above, which methods follow the rules of the immunomodel for antigen recognition? such as or all foreign (allergic) antigens or endogenous (autoimmune) This technique is applicable to T (cell) dependent antibody responses to antigens. The following non- The limiting examples describe certain aspects of the invention in more detail. Example Example 10 Scaffold synthesis: A. Dextran Dextran is considered the “prototypical” scaffold for many reasons: 1) It is water-based Can be freely dissolved in buffer solution, 2) "off the 5hel" f) can be readily modified using the chemistry of It has been used in humans as a plasma bulking agent in duram amounts; 4) It is roughly fractionated by size. 5) @Milk dextranase is available in bulk quantities at low cost. unknown. The latter point of view is that one of the primary considerations for this technology is whether it is desirable for experimental animals or humans. Sequences must be metabolically stable to yield desirable results. This is especially important because Representative examples are provided herein using various chemistries. For those skilled in the art, Dext It will be appreciated that the chemistry for modifying orchids can be extrapolated to other systems. a. Activate basic “dexamine” and GMB-dexamine dextran to The chemical formula used so that covalent bonding of the peptides can occur is shown in Figure 1. seed Dextran (1) of various molecular weights were initially prepared using acetic acid (CICH, C01H). Te, g/lz: 1 syl 2'-93°- or 4°-hydroxyl position is replaced with carboxyl dimethylation to produce the corresponding carboxymethyl-dextran (2). Conversion to dexamine (3) is then carried out by etching (carboxymethyl-dextran). Diamine (NHI CH, CH*NH,) and water-soluble carbodiimide (E DC=1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydride rochloride)-mediated coupling reaction. De The presence of free amino groups in xamine (3) can be determined using standard analytical chemistry techniques for quantitative determination. It is possible to measure the "amine substitution density" using a technique called "Amine Substitution Density". Dexamine (3 ), the presence of amine per milligram is expressed in μmoles, and the value of amine density is Represents the theoretical maximum substitution density for any particular peptide. described herein The Dexamine (3) used in the example described was One -class amino group (- It was found to routinely contain Nl(1). Derivatization of the dexamine (3) amino group with a heterobifunctional acylation reagent -Maleimide n-butyric acid N-hydroxytosuccinimide ester (GMBS ), which then gave an activated or “binding” form of dextran: gamma Reimido n-butyryldexamine (GMB-dexamine 4). cysteine-containing It is GMB-dehyde that reacts (i.e., binds) with the sulfhydryl group of the peptide. Maleimide functional group in xamine (4), which forms the peptide-dexamine conjugate. generate. The dextran (1) used for the preparation of the peptide-dextran conjugate has a size of It is an average molecular weight polymer fractionated by Chloroacetic acid and ethylenediamine are Purchased from Aldrich Chemical Co. Ta. ! -ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydro Chloride (EDC) and gamma-maleimide n-butyric acid N-hydroxytosaccharide Imide ester (GMBS) is manufactured by Sigma Chemical Co., Ltd. Purchased from Al Co. Trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) is a peer It was purchased from Pierce Chemical Co. GMB- Phosphate solution (PBS: 150+nM) used to prepare dexamine (4) NaCl 1,10o+M phosphoric acid, pH 7,3-7,4) was autoclaved. , followed by 0. A freshly prepared lOX PBS stock solution was passed through a 2 μm filter. (Every time you react every day). (Preparation of PBS in this way prevents unwanted contamination. important for the production of conjugates). Dialysis tube (6,000-8,000+NWCO) was purchased from Spectrum Medical Industry Co., Ltd. ( Obtained from Spectrum Medical Industries Inc.) . Purification of dextran (1) and dextran (1) or dexamine (3) Molecular weight determination is performed by size exclusion chromatography followed by equilibrium ultracentrifugation, and /or performed using laser light scattering methods. Carboxymethyl-dextran (2) is produced from dextran as follows. Made: Sodium hydroxide (675+omole, 5M NaOH 135a +1) to 0. Added to 3 L of water and cooled the resulting solution with stirring in an ice-water bath. (0°C). Add chloroacetic acid (64.4 g, 685 mmole) and stir completely. The temperature was continued at 0°C until complete dissolution occurred. Warm the resulting solution to room temperature and bring the ptt to approximately 7. Adjustments were made by adding NaOH or chloroacetic acid. 0 of the total amount. Dilute to 5L After that, 185ml of chloroacetic acid solution was added to the dextran sample (0,143a+mo In addition to the carboxymethylation reaction, 50 ml of IOM NaOH (500 +n+oole) was added to start. Dilute the reaction solution to a total volume of 250+nl. , carboxymethylation was allowed to wait for 20 hours at 37°C. The reaction was carried out with 6M HCl at p The process was completed by adjusting n to about 7. After cooling the reaction solution to room temperature, it was soaked in water for 5 days. (water was exchanged twice a day) and the produced carboxymethyl-dextran ( 2) was isolated by lyophilization. Dexamine (3) was prepared from carboxymethyl-dextran (2) as follows: (0,143 mmole carboxymethyl-dextran (2 ) Reaction scale): Carboxymethyl-dextran (2) in 300ml of water Dissolved and added ethylenediamine (45g, 750mmole). generate The solution was stirred at room temperature and the pH was adjusted to approximately 5 with 1M HCl. l-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC, 4g, 20. 86 mmole) was added dropwise from IO over 20 minutes with stirring. I put it down. The pH of the reaction solution was checked every 15 minutes and maintained at pH 5 for 4 hours. (by adding IMHCI). Thorough dialysis was then performed as follows8. 30% AcOH overnight, water for 24 hours (2 changes), 30% AcOH overnight, water 24 hours (2 changes), overnight in LM NaCl and 48 hours in water (drink water daily). (replaced twice). The resulting dexamine (3) was isolated by lyophilization. Determination of (dexa)amine content (i.e. amine substitution density) was carried out as follows: Add xamine (3) to 1 ml of 0. Dissolved in 1M sodium tetraboron buffer (pH 9,3) The solution was diluted to give a solution with a concentration of 1-2 mg/ml. Freshly prepared trinitrobe 30% solution in TNBS, sodium tetraboron buffer (TNBS) 5 μL) and the resulting reaction mixture (stirred with a portex) was allowed to come to room temperature for 2 hours. Stored in the dark. Read the yellow colored solution at 366 nm against the reagent blank. is. Prepare standards of 1mM lysine, 2mM glycine or 2+oM aminobutyric acid and a standard curve was prepared from various aliquots diluted in buffer to a total volume of 1+nl. . GMB (gamma-maleimide-butyryl)-dexamine (4) was converted to dexamine ( 3) was prepared as follows: Dexamine (prepared as above) was dissolved in phosphate solution. Dissolve in solution (PBS, pH 7,5) and stir at room temperature to obtain a concentration of 5-10+ng/ml. gave a solution of concentration. (4) 5 molar excess of GMBS compared to the (dexa)mine content (Gamma-maleimide tan-butyric acid N-hydroxytosuccinimide ester ) was dried in tetrahydrofuran (THF, 4 angstroms of molecular weight). (stored on a tube) so that the concentration of GMBS is approximately 5h+g/ml. Ta. Add this GMBS/THF solution dropwise to stirring dexamine (3) and The reaction was allowed to proceed for 30 minutes at room temperature, during which time the pH of the solution was adjusted to 1 mM NaOH. 7. By dripping. 1-7. It was kept at 5. GMB-dexamine (4) then P 15 x 30 cm of 5hephadex G equilibrated in BS (pH 7,5) Separate excess GMBS by gel filtration of the reaction mixture on a -25 column. Ta. The column eluate was monitored at 280 nm using a Pharmacia dual wavelength UV monitor. Ta. Combine column fractions containing GMB-dexamine (4) and reduce system The utility of Cys-containing peptides remains undetermined. b. Another neutral, anionic and cationic "dexamine" as mentioned above, Under certain conditions, the scaffold compensates for the undesirable charge profile of the ligand in question. There will be a need. By the means described below, the basic dextran described above dextran-based scaffolds can be made into neutral, anionic or can be made to have cationic properties. For the preparation of neutral scaffolds, carboxymethyl dextran of dextran (1) The first modification to (2) is the same as above. But at this point, there are two Different aminoamides (β-Ala-CONHt or L-GLn-CONHCH , ) can be condensed with carboxymethyl dextran, resulting in two different molecules. ``Dexamide'' is formed, which ultimately forms the charge-neutral dexamide described in Figure 2. It will be converted to xamine. To prepare the anionic scaffold, another precursor dexamide is required. this is combined with either L-Asn or L-Gin and dextran according to the following steps. can be formed by condensing =4-nitrophenyl Mate (685B, 3. 4+n+nole) mixed with dry DMSO-pyridine Things (1: 1. 1 g dextran solution (13.87 μmole) in v/v) Added at 0°C in an ice-water bath. Add 4-(N,N-dimethyl of 76a+H) to this solution. Amino)pyridine (6,22a+mole) was added. The reaction mixture was kept at 0°C for 4 hours. Stir for a while, then add a 50-fold molar excess of either L-Asn or L-Gin. Ta. The reaction mixture was slowly warmed to room temperature and stirring continued for an additional 48 hours. Dexamide was prepared using an excess of dry ethanol/ethyl ether (8:2. v/v) Precipitated and dried under vacuum. The dry substance was dissolved in water and dialyzed against water for 3 days. , and lyophilized (lx). Once the desired dexamide is prepared, start with dexamine and 50% aqueous aqueous solution. by dissolving in setonitrile and then stirring slowly at room temperature. Can be converted to neutral or anionic dexamine. Add several molar excess (total amount) to this solution. iodobenzene diacetic acid (relative to the calculated amide content) was added, and the reaction mixture was quenched. Stir overnight. (Iodobenzene diacetic acid is stoichiometrically equivalent to 1 equivalent of primary amide to the corresponding primary amide.) (converted to min). Size exclusion chromatography of generated dexamine from other products It can be purified by roughy, concentrated in vacuo, and lyophilized from water. Figure 3 illustrates the complete conversion of anionically loaded dexamine from dextran. Ru. Less useful than dexamine, which has anionic properties, but has a positive net charge. Dexamine (after conjugation) may also be useful in certain limited cases. child The preparation of the substance is carried out with ethylenediamine-containing dexamine as follows: For acylation of (dex)samine (4) group with Na-Npys-L-Arg-O3u Therefore, one equivalent of positive charge is removed per equivalent of acylated (dex)samine (4). You will be trapped. Subsequently, the Na-Npys group was removed ((n-Bu), P) to liberate a free α-amino group, which is further acylated with GMBS or or direct transfer into the maleimide functional group through N-methoxycarbonylmaleimide. can be exchanged. Longer or shorter congeners of Arg can also be used in a similar manner. (for example, Homoarg (see Figure 4)). B. Polyacrylamide and poly(acrylamine-acrylic acid) monomers Linear polyacrylamide synthesized from (HPLC), size exclusion gel chromatography (SEC) and 20. by light scattering method. 000 to 500. Average molecule that changes to 0OOkDa gives the size of The preparation was filtered through a suitable gel filtration column (Sep. harose CL-28, CL-48 or CL-6B. Pharmacia) and fractionated by size as determined by IPLC). The target was cut at the center of a narrow range of molecular weight distribution. Typically, such polyacrylamide preparations are chemically substituted with amino groups to These were further prepared by subsequent coupling with Habten reagent. This is the beginning, The carboxamide group was hydrolyzed in bicarbonate buffer for varying times to form a carboxy group. A series of preparations with different contents were produced. Such carboxylated polymers are Next, the carboxyl group is treated with ethylene diimide by the action of water-soluble carbodiimide. Amide bonds and and generated free amino groups. Subsequently, the hapten has a chemical position at the amino group. was coupled to the amino-substituted polymer produced by the reaction. Details of the method used are Dintzis et al. (Proc, Nat' 1° Acad, Sc1. U, S,^, 73:3671-3675 (1976) and Inman et al., Bioc. hemtry8. 4074-4082 (1989)). To provide different neutral linear polyacrylamide as well as anionic properties In order to provide another carrier with high quality, Commercially available size-fractionated acrylamide using a modified acetic acid reaction It was synthesized using a random copolymer of acrylic acid. In particular, I, I-bis(triflu Dissolve the iodobenzene (oroacetoxy) in DMF and add it with continuous stirring. An equal volume of water was slowly added inside. Next, the size-fractionated polymers are mixed by reaction. The mixture was added to the liquid and stirred at room temperature overnight. This is then transferred to a separatory funnel and equalized with the reaction mixture. of water and extracted with diethyl ether (extracted 4 times with 4 volumes). most The final aqueous layer was concentrated in vacuo and the residue was redissolved in water and dialyzed against water for several days. The dialysate is filtered and lyophilized to produce a fluffy white solid. 1, 1 equivalent of I-bis(trifluoroacetoxy)iodobenzene is stoichiometric converts one equivalent of primary amide to the corresponding primary amine, resulting in the final polymer product It is possible to vary the amine substitution density of . Furthermore, those skilled in the art can implement the same method. It is understood that it can be applied to any acrylamide-containing polymer regardless of the lylic acid content. will. Corresponding amine from poly(acrylamide...acrylic acid) The conversion to containing polymer is shown in FIG. C.Ficoll Ficoll is like dextran, but dextran can be as described for conversion to samin (neutral, anionic and cationic) It is a polysaccharide polymer with hydroxyl groups that can be modified using the same chemistry. In addition, These materials are available commercially in bulk quantities in various molecular weight ranges. dextra The difference between scaffolding based on ficoll and scaffolding based on ficoll is that It is more spherical or “three-dimensional” in nature, whereas dextran is more linear. This is a divergent point. Continuing below: From the data given in the examples As such, this difference may be related to the production or use of agonist or antagonist sequences. does not seem to lead to any significant functional conclusions. D, carboxymethyl cellulose Again, carboxymethylcellulose is similar to dextran and dextran from a biochemical perspective. I am very familiar with both Ficoll and Ficoll. From the beginning, Shigashiko's polymer to have net anionic properties and create anionic scaffolds as a result Can be used. As understood, the chemistry required to modify this polymer is Once carboxymethylated, it is essentially the same as dextran. E, polyvinyl alcohol Polyvinyl alcohol is not based on carbohydrates, but it is have free hydroxyl moieties that can be modified by the same chemistry described above. F, poly(D-Glu/D-Lys) Poly(D-Glu/D-Lys) is a random combination of D-glutamic acid and D-lysine. It is a linear polymer with a molecular weight of 100. 000 daltons or less is about 4 It is commercially available with a composition of 0% D-lysine and 6o% D-glutamic acid. more expensive Scaffolds incorporate soluble crosslinkers such as water-soluble carbodiimides at various concentrations It can be generated by The resulting cross-linked material is then combined with the other polymers mentioned above. Same size exclusion chromatography and molecular weight size analysis as for It can be provided to The polymer already contains the epsilon amino group of the D-lysine residue. Because these structures have free primary amines derived from No further modification is necessary to accommodate the linking group. However, as understood the ability to cover all charges is has its limits. G, protein Regarding the utility of both carboxyl and amino groups for chemical modification, tan Proteins or other polypeptides are in many respects poly(D-Glu/D-Lys). Behaves like a copolymer. The important benefits provided by proteins are explained below. Ru. First, the protein cross-links the above poly(D-Glu/D-Lys), then can be cross-linked and separated in a similar manner with respect to size. Wear. Fractionation effectively separates oligomers (dimers, trimers, etc.) with limited valence. They can be separated equally. As a result, these structures are agonists and/or or as an antagonist sequence without further modification. Second, recombinant DNA/protein engineering techniques can be used to develop other recombinantly produced proteins. Oligomeric representation of proteins or protein domains fusion protein made from the core “scaffold” It has developed to the point where quality can be constructed. Again, the final product is the desired “epitope” ``groups'' or ``ligands'' simply mean that they are chemically attached to carriers with limited valency. are only cross-linked or bonded together and are formulated to represent a sequence with limited valency. can be done. Finally, streptavidin has a relatively unique structure, which consists of a biotin moiety. used to form a tetrameric array by introducing the desired ligand into can be done. Streptavidin is a biotinylated protein with high affinity for its moieties. It has four binding sites for binding, which is essentially the same as a covalent bond once bound. be. In addition, streptavidin is freely soluble and has an isoelectric point near neutrality. Therefore, undesirable charging characteristics can be avoided. “Point Source” of Scaffolds with Limited H1 Valency Most of the data disclosed herein The minutes were created using scaffolds with limited size. As mentioned above, agonis Alternative methods should be used for scaffolds with limited valency for antagonists and antagonists. It is. Many of the ones described below can be used for this purpose; Scaffolding as a limited or “point source”. Those skilled in the art will appreciate the potential valencies that these scaffolds can be constructed to meet this requirement. You will recognize that there are only a few of a limited number of types. The maleimide/succinimide moiety was used as a representative reactive group for this series of scaffolds. Several potential compositions can be synthesized from commercially available starting materials using Ru. The one illustrated in Figure 6 is a sample of these “point source scaffold” types. It is Those skilled in the art will be able to modify the specific compounds described to use feet as a point source. Fields can be generated that can be made to any size of bond or “arm length” required. It will be understood that the term may be used in any number of alternative ways. ■Efficacy of the final cyclodextrin-based scaffold with limited valence Another type of foot with variable potential both in terms of effective size and valence. You can also create a place. This type of scaffold uses beta-dextrin as a template is explained below, where the bond valency is defined by precisely defined chemistry as well as polyethylene. at the arm's length using various types of flexible spacers such as lene glycol Therefore, it can be controlled. Cyclodextrin (CD) was linked via α l → 4 glycosidic bonds It is an oligosaccharide made from glucose units. In the resulting toric molecule, the primary and secondary hydroxyl groups are located on opposite sides. Ru. In the presence of secondary hydroxyl groups, it is possible to selectively functionalize primary hydroxyl groups . In addition, through the use of "linking groups" any set of multifunctionalized cyclodextrins can be You can create a match (Figure 7). Prederivatization of α, β, or γDCs results in corresponding valencies of 6, 7, and 8. A product is provided. Each of these compounds can also be mono-functionalized. can. Treatment of β-CD with bifunctional protecting groups (this is the most readily available substrate) will yield a diprotected product. This is next 2 or 5 Substitution products can be provided. Therefore, the reaction with two linking groups is Deriving a product with a total value. Therefore, by judicious use of protecting groups, epitopes from 1 to 8 can be It is possible to attach a tape to a CD. Using this type of chemistry, the valence and “arm length” of the ligand can be changed to It is thought to be a radially divided array or “octopus-like” scaffold for attachment. You can make something like this. In this type of arrangement, the receptor group is located on the cell membrane. When molecules move relatively freely, they are suitable for receptor/ligand interactions. In addition , by changing the chemistry of the “arm” to give an arm that lacks forward flexibility a relatively free range of motion. It can be given and generated. The following disclosure describes methods for use in suppressing unwanted antigen-specific immune responses. These are some of the chemistries that can be employed to create this type of structure. using the illustrated method (Boger et al., He1 vetica Chimica Acta 1978. 61:2910) that Move on to the pta-amino substitute (Step 1). Step l The extended arm product 3 was treated with heptaamino β-cyclodextrin ( 2) (3.0g, 2. 15+nmol) and triethylamine (2,4a +1. 17. 2a++++ol) was dissolved in 50 ml of DMF. EDC(3, 78g, 19. 3 mmol) and then Boc-e-aminocaproic acid ( 5,53g, 19. 3a+mol) was added. The reaction mixture was stirred overnight and then When 200 ml of water was added to the solution, precipitation occurred. Filter the solid product and wash with water 4. Then dry in vacuum. 78 g (85%) of Boc protected product 3 was produced. Debonding The protection was carried out as follows, the product was poured into 50 ml of HCI saturated dioxane ( 4N) and stirred for 3 hours. The next evaporation converts 3 to 2. 99g (75% ) generated. Step 2 C5-0001 was made from 3 as follows. β-cyclode of extended arm Kistrin (3) (500mg, 0. 23 mmol) in 60 ml of 0. 1M Dissolved in N34Cos. GMBS (2.25g, 8. 05 mmol) was dissolved in 40 ml of THF and added to the reaction mixture, which was stirred overnight. mixture Evaporation and purification by RPHPLC yielded 25 hag (36%) of C5-0001. generated. Step 3 Furthermore, scaffold C5-0002 was generated under the above conditions and Boc -ε- It was condensed with aminocaproic acid to remove the Boc group. 3 variations of the generated longer arm The blank was then reacted with CMBS to give C5-0002. (Step 4). Step 4 Fluorescein-specific construct Cl-374 was prepared from 3 as follows. elongation β-cyclodextrin (3) (40+ng, 0. 019 mmol ) to 0. Dissolved in 1M NaHCOs. Fluorescein isothio Cyanate (200mg, 0. 52n++++ol) and the resulting mixture was stirred overnight. The orange solution was ultrafiltered through a YM3 membrane until the filtrate was free of color. The remaining orange retentate is processed by RPI (PLC). Order 5 A scaffold (6) with 14 arms was manufactured as follows. heptaamino β-cyclo Dextrin (2) (500mg, 0. 4ml of 36++++++ol) Dissolved in DMF. Na-t -Hoe-Nε-t -Boc-L -1ysi ne-N-hydroxysuccinimide ester (4.56 mg, 10. N-methylmorpholine (32oμL, 2. 88+nmo l) was added. The reaction mixture was stirred overnight and when 25ml of water was added to it, a precipitate appeared. occurred. The solid product was collected by filtration, washed with water and dried. The generated solid is treated with HCI Dissolved in saturated dioxane and stirred for 3 hours. 575+ng (63 %). This 14-armed product-5 (400 mg, 0. 4ml of 16mmol) of DMF. Boc-ε-aminocapronic-N-hydroxysacsi Imide ester (2.89g, 8. 85++u++ol) and N-method. Tilmorpholine (480 μL, 4. 42 mmol) was added. Add the reaction mixture After stirring overnight, when 25 ml of water was added thereto, precipitation of the product occurred. 14 arms The scaffolds were filtered, washed with water, and dried. The resulting solid was immediately saturated with IIcI. The mixture was dissolved in dioxane and stirred for 3 hours. 96 mg (60%) by evaporation 6 was produced. All these compounds have satisfactory 'HNMR, mass spectra and amino acid The analysis results are presented. Step 6 The other arm is a polyethylene glycol unit or some other hydrophilic polymer sub- It can be composed of units. This type of spacer increases the distance between receptors. Enables remote exploration. Heterotrifunctional linking group with amine and hydroxy ends , can be functionalized to modify the activating group with a hydroxy terminus. This is then compound Can be substituted with 2 or 3 amines. As already described for the removal of the N-terminal protecting group One of the scaffolds (with a longer scaffold) will result. Example 2. Synthetic and analytical methods for peptides used in conjugate preparation a. Solid phase peptide synthesis The peptide to be incorporated into the peptide-dextran conjugate is prepared by standard steps. were created by solid-phase peptide synthesis using a standard peptide chain extension method. briefly explain Then, solid-phase peptide synthesis involves Na-deprotection of amino acid residues attached to the synthetic resin. start from. This step then involves neutralization and washing of the deprotected amino acid-containing resin. This prepares the resin to accept (i.e. react with) the next amino acid; activates itself to facilitate the formation of the first peptide bond (-N)l-Co-). Ru. Subsequently, after washing the resin already containing (di)peptide, the desired peptide is added. The same series of events continued until Putido was created. the final peptide Then released from the resin, this condition simultaneously releases several or all amino acid-chains. Protecting groups are removed. Characteristics of conditions different from those used for separation from resin Removal of additional protecting groups often makes subsequent attachment to the backbone more controllable. will be adopted. All reagents used in this study were obtained from standard commercial sources. Solid-phase peptide synthesis was performed by Applied Biosystems. stems: ABI) 430A or Biosearch 9600 fully automatic peptide Doamidomethyl (Acm, )! F sensitive) or nitropyridine sulfenyl (Npys, HF stable), requiring either HP sensitivity or HF stability. S-protected accordingly. N- or C-terminus of the peptide to be incorporated into the conjugate Addition of a Cys residue to either end causes the Cys sulfhydryl group (-3H) to form It is provided as a peptide with a nuclear moiety that is Alternatively, other 3H-containing residues (e.g. cis Thymine or homocystine) can also be replaced with cysteine. these The advantages of modification are discussed below. The final peptidyl-residue was dried in vacuo and then rch) HF cleavage device or Peninsula Laboratories (Peninsula Laboratories) type THF equipment. . The peptide is cleaved from the resin using standard HF methods. HF removal in vacuum Afterwards, the resin is thoroughly washed with diethyl ether to remove the trifluoropeptide from the resin. Acetic acid (followed by addition of diethyl ether to precipitate the peptide) or Extracted with 10-30% aqueous acetic acid (followed by lyophilization). Waters Delta Pretz reverse phase high performance liquid chromatography (HPLC) Bu3000 Preparation Chromatography System (47+nm x 30cm. Delta-back, radial compression, cartridge, 300 angst ROHM, 15 μm (including Cps) (Waters Delta-Prep 3 000;Delta-Pak radial compression car tidg), which was equipped with a variable wavelength detector. Typically, pepti A linear acetonitrile gradient (0%-100%, constant concentration of trifluoroacetic acid) 0. (contained at 1% V/V) over 40 minutes. Purification at 215 nm Monitor and analyze the homogeneity of the purified material using HPLC Waters Delta-Vac C1 1 column (300 angstroms, 15 μm, CIl; column diameter: 3. 9m m x 30 cm), with the same slope. Amino acid analysis of the synthesized peptide was performed using Waters Pico-TAG chemistry (Bi dlingmeyer, B. A. et al. J. Chrom, 336. 93-10 4 (1984)), which was obtained using constant boiling of the peptide in 6M HCl. Volatile-phase hydrolysis with phenyl thiocyanate (PITC) Derivatization of amino acids and Waters PICO4AG Cps column (5 μm, Cps; Column diameter: 3. 9mm x 15cm) reversed phase high performance liquid chromatograph Separation of phenylthiocarbamoyl (PTC)-amino acids produced by Quantification was involved. Amino acid analysis of any purified peptide can be performed using the proposed configuration. matched the column (integration accuracy: ±5%). Example 3. epitope - protein a. Epitope mapping Epitope mapping is the characterization of specific protein regions recognized by the immune system. related to When considering humoral responses, at least the “nucleus” of globular proteins (Core)” does not seem to be recognized by the immune system. As a result, surface maps of proteins related to different epitopes can be mapped to the desired sequence. should be used for the design and synthesis of peptides to be incorporated into this Examples of type epitope mapping are those recognized by NZB/NZW mice. This is explained by the identification of histone antigens. To suppress the automatic immune response against histone H2B (this is due to systemic lupus (NZBxNZW)F of Todes (SLB), occurring in a murine model. ), the antibody binding domain of histone H2B had to be identified. identification The process is referred to here as “epitope mapping” and is subsequently analyzed to identify antigenic regions. This involves the synthesis of various overlapping peptide fragments in which a region is established. Obviously, all 8 Studying the 2B structure (125 amino acids) would require extensive peptide synthesis. death Kashi SLI? From studies of patients and mice with lupus-like disease, H2ON-end Removal of the end regions with trypsin is known to result in loss of antigenicity. (Protanova, J, P, et al J, I+u+uno1. 38. 446-4 57 (1987), it is therefore noteworthy that from this region of histone 82B We focused on the synthesis of derivatized peptides. Peptides and their respective naming are shown in Table 2 below. (NZBxNZW)F reactive to the N-terminal 30mer of H2O (=Rokuhei 7'), Serum obtained from mice contains a peptide containing the first 15 amino acid residues (2°) but more internally (i.e. 3', 4', or 5° of lupus) It was found that it did not bind to the included peptides. N-terminus (=N-Ac-(Rouyu 2' (6-15, 5-15, 4-15, 3-1 Contains truncated peptides from 5 and 12-8)-CONHt) Further characterization of the autoantigenic region of 82B revealed that, as in 82B residues 3-12, , (NZBxNZW)F, is capable of presenting an antigen recognized by mice. The result was that Table 2 Histone H2B peptide Pro-G synthesized for epitope mapping l u-Pro-A 1a-Lys-Ser-A 1a-Pro-A 1a- Pro-Lys-Lys-Gly-3er-Lys-CYS-CONHz” Luka 2'N-Ace t y l -Cys-A Ia-Pro-Lys-Ly s-G I y-3e r-Lys-Lys-A 1a-Val-Thr-L ys-^1a-Gln-Lys-CONHt: Wolf healing 3゜^-, l;t, 3C, y, sHI, y, sλAl2HV, H12Thr-,: 圓IBAGln-Lys -Lys-zasankakuλF, 2E, 1. 1 seagull 9 sawa! Total ε1 ys-Gly-3°' Ruba-’;=!澾ff1g’Eij=-PrOiAi”;”gc+utaLys-c l Y-3°'-L clonic AIa-, λ pupil crystal-P, r2-,! 21. a5Prg ,,Lys-Lys-Gl y-N-Ace ty I-Pro-A Ia -Lys-8e r-A Ia-Pro-A 1a-Pro-Lys-Lys -Gly-3er-Lys-CONHt=N-Ac-[Wolf fM 2° (3-15 ) Ko CONH2 blasphemy,! 2GIu5Prg,, pot-LyS-8°r-A l″-Pro-CON) It゛jq-Ao-N-Ace ty I-G I u-Pro-A Ia-Lys-8er-A Ia-Pro-A 1a- Pro-CONHt;N-Ac-[Luka2' (2-10)]-CONH! M″ Shinaki:? Silence? ♂enemy-2y (2 years ago r5A 時δ島o-Ala-Pro-Lys-inhibition The peptides selected for incorporation into the suppressor zygote clearly Residues 3-1 not only contain sufficient immunological “information” to be recognized by The net positive charge characteristics of 2 had to be addressed. with the aim of achieving this , as well as the two non-histone C-terminal glutamic acid (Glu) residues, are immunologically ``N-Ac-Glu'', which is not required, was included. Although this is not necessary immunologically, for peptides that are elements included in the target (i.e. -Glu-Glu) and necessary for immunological recognition. group, which is the residue that provided the space between the elements (i.e., residues 3-12) Added lysine. N-Ac-[Lupus 2' (2-13)]-]Gl The final target peptide, called u-Glu-Cys-CONH (see Table 2), was used for bonding. As mentioned above, highly cationic epitopes are particularly useful when they are arranged in multivalent If you need to be compensated, don't hesitate. In this case, such compensation shall be carried out by adding specific anionic amino acids to defined epitopes. . Alternatively, anionic scaffolds could be used. In either case, the desired The result is that these compounds non-specifically adhere to anionic surfaces such as cell membranes. In order to avoid That is. The antigenic facade of the H2B histone protein is produced by a population of mice. Consists of a single continuous peptide sequence that can accommodate an entire population of antibodies has been done. Additionally, each individual mouse recognized discrete regions within the entire epitope. On the other hand, an entire population of mice could be treated with a single peptide ligand. Others, such as pigweed antigen E, are more likely to encounter large numbers of discrete epitopes. This is unlikely to be the case for other proteins. Again, one A certain amount of microvariability within a group of individuals for a given epitope is considered. - a single epitope is more prominent than its base in an entire population of individuals. I can't imagine it being possible at all. In view of the above, one of at least two alternatives can be used. Wear. Any multiplexed ligands can be synthesized, each associated with a specific ligand. A mixture of ligand arrays or an array of ligand mixtures (artificial proteins from an antigenic perspective) (bacteria), where each array is expressed as Contains limited expressions. Another alternative is that the titer of the protein in question is limiting. The goal is to generate an array of Immune response to specific antigenic proteins It has been determined that these types of constructs are the most appropriate means for manipulating If so, the following synthetic approach can be used. b, Protein oligomers as heterogeneous epitope arrays of oligovalency. One alternative to mapping the antigenic facade of a protein is to Consisting of proteins cross-linked to themselves or arranged on different types of scaffolds is to generate oligomeric (valency-limited) arrays of the protein of interest. . This type of construct has many discrete epitopes that are recognized by the immune system. If there are several epitopes or some of the epitopes are discontinuous and conformational in the molecule. Desired when formed by constrained regions. These types of structures Two of the adults were created and used to make protein oligomers immunofluorescent. We confirmed that it behaves according to the paradigm. Regarding the preparation of these oligomers This is described below. (1) Polymerization of BSA and OVA ranging from dimers to very high polymers, all water-soluble and time-stable. The polymer can be obtained in considerable yields by polymerization of BSA or OVA. Conditions have been set for The properties of water solubility and time stability are limited to polymerization. The long run of the polymer on a gel filtration column, a procedure that produced narrow-level fractions, This is of particular importance because of the subsequent fractionation. BSA is on one molecule Free carboxyl group linked to free amino group on adjacent molecule through amide bond Water-soluble carbodiimide, 1-ethyl-3-(3-dimethylamidium) Nopropyl) carbodiimide was used to self-polymerize. O.V. A is a reagent that links a free amino group on one molecule to a free radical on an adjacent molecule By using glutaraldehyde, it polymerized on its own. (2) Fractionation procedure The protein monomers, oligomers and polymers produced during the chemical cross-linking step described above The aggregates are fractionated so that they exhibit a narrow molecular weight distribution as determined by HPLC analysis. Repeated refractionation on a series of gel filtration columns was performed until a next The molecular weight of each fraction was measured using an E-type analytical ultracentrifuge under equilibrium conditions. Established. During this long series of slow fractionation steps, processing, handling or Isolate molecules from a sample that are unstable to any of the many steps involved in preservation. A series of preparations, each containing a relatively narrow range of molecular sizes with substantial temporal stability. I got the product. These water-soluble preparations were then tested to determine their relative immunogenicity. , without any adjuvant, was injected into mice intraperitoneally. standard hard Serum 1 gM or IgG antibodies against BSA or (IVA) were determined by ELISA technique. The level of immune response was determined by measuring the levels. Alternatively, only one biotin component may be incorporated per protein monomer. The desired protein can be biotinylated in such a manner that the desired protein is biotinylated. this thing is a modification that can react with either free amines or carboxyl groups on proteins. React biotin molecules with a significant molar excess of protein monomer in the diluted solution. This can be achieved by These conditions apply to multiple derivatized proteins. The excellence of “monofunctionalized” protein molecules while minimizing the amount of protein monomers Generate sex. These biotinylated proteins are then subjected to several polymerizations. Strebutavidin and can be arranged in strictly tetravalent order. Similar “monofunctionalization” of protein ligands can be achieved using many different chemical methods. can be achieved, in which case the functionalized protein is valently controlled to reach the same end point. arranged on a limited scaffold. These value-limited arrays can then be used to It is possible to manipulate the immune system in new ways. Finally, as mentioned above, well-defined protein domains or proteins the epitope represented by the whole, either as part of a valence-limited array or is a gene with the desired valence for use as a limited array of completely independent valences. They can be incorporated into sub-engineered constructs. C, mimotobe Immunoglobulins and their associated surface-bound receptors are sensitive to the charge and Physical structure (shape, hydrophobicity or hydrophilicity, hydrogen bond donor or acceptor groups, etc.) and has an outstanding relationship. In relation to peptide sequence, carbohydrate content, etc. The specific [content, 1] of an antigen is the amount by which it contributes to the “match” between ligand and receptor. It is only meaningful if As a result, many different laboratories have Appointments that can be screened for their ability to “fit” into new receptors. We decided to develop a method that allows us to generate a large number of glue Gantts synthesized at will. Significant research efforts have been made. Ligands identified in this way and immune system The relationship with the “natural” ligand toward which the system's response is directed is based solely on its structural similarity. Limited. Such ligands include this type of ligand that mimics naturally occurring epitopes. The name "Mimotope" was given to express Gand's ability. Those skilled in the art will be able to modify target receptor populations using standard chemical modification techniques and substitutions. that the mimotobe can be modified to strengthen its bond to You will understand. Mimotobes generated by a random process are agonis modifications before being attached to the scaffold to generate a target or antagonist array. may require correction. Example 4, Epitope - Nucleic acid a, Size-fractionated naturally occurring DNA Salmon tests The product of the DNA reaction was then purified with bovine pancreatic deoxyribonucleotides in the presence of manganese ions. It was subjected to partial digestion with nuclease I (BRL, Gibco). manganii In the presence of on, bovine pancreatic DNAsel binds both double-stranded DNA at approximately the same site. strands that are blunt ended or only 1 or 2 nucleotides long produces a fragment of DNA with overhanging ends (Melgar and Goldthway Te, 1968) after cleavage with e+DNasel. , the 5' end of the DNA retains a phosphate group. The product of the DNase1 reaction is then , 5cmX 92c+n old ogel A-1,5m (fine mesh, Bio -Rad) was size fractionated on a column. This column was CI. Elution was done with 50+nM Tris HCI pH 7, 2, 1mM EDTA. fraction were collected and aliquots of fractions were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis. . Fractions containing DNA approximately 60 to 120 nucleotides in length were pooled and DNA was recovered by Nord precipitation. The concentration of DNA is measured at OD, 6°. It was determined by Here, 1ODt=o is 50Mg/ml double-stranded D Equal to NA. This DNA was then modified for conjugation as follows. DNA (0.64 μmole) supplied as bis-5゛　-phosphate was added to 1 - Methylimidazole buffer (0,1M pH 6) I): DC (0,1 5M) to bis-5'-(1-methyl)phosphorimidazolide. . Then (S-3-nitro-2-pyridinesulfenyl)-cysteamine ((S- Npys)-Cmn, 0. 2M), the bis-phospho Foramidate, a conjugable form of DNA (after deprotection) was obtained. The rest Removal of residue (S-Nl)'S)-Cmn and isolation of derivatized DNA are performed without This was achieved by repeated precipitation reactions from water (EtO)l. 50 synthetic NA Other synthetic research efforts designed to provide "conjugable" synthetic NAs include The focus is on the 5'-length derivatization and the final conjugation of the synthesized 4o nucleotide-long NA. I was scoring points. DNA was purified using the manufacturer's chemical formulations and protocols. β-sia on a Biosystems 381A DNA synthesizer Synthesized using noethyl. Some of the oligonucleotides have a 5′ end. Synthesized with mino group. This amino group was converted into a commercially available DNA synthesis reagent A+n1n. olink2 (Applied Biosystems). Am 1nolink2 reagent was used according to the manufacturer's recommended protocol. solid After removal from support and deprotection according to manufacturer's protocol, 5 eph adex G-50 (fine mesh, Pharmacia) 1. 6 cm x 1 DNA was purified by gel filtration on a Bcm column. Column 0. 5M NH , OH. Collect fractions and pool fractions containing DNA and lyophilize. I set it. Resuspend the DNA in water and OD□. Concentrations were determined by measuring . For single-stranded DNA, use one of 1. and then perform derivatization. Reactive-grade amino groups are similarly modified with modifications available from Glen Re5earch. Synthesized through nucleotide coupling at the 5' end of the NA 40-mar. can be included. This nucleotide, the modified thymidine, is the lO atom. A partially trifluoroacetylated amino acid attached to the base moiety by a spacer group. Including. As an alternative to the A+n1nolink approach, This method (inclusive) of the incorporation of nucleotides supporting protected amino groups It has the advantage of confirmation (via standard DNA colorimetric coupling assays). If Chemical 5"-phosphorylation of DNA is also possible, and the resulting DNA is monofunctional. DNA that is functionally the same as the size-fractionated DNA described above, except that Generate A. Preparing this type of synthetic NA for conjugation, i.e. ( Coupling of (S-Npys)-Cmn and subsequent disulfide reduction was described above. Accomplished as noted in Section 8. Those skilled in the art will understand that phosphorothioic acid Generates salt-containing DNA and DNA ends and conjugable nucleic acids It will be seen that this can be modified using the same techniques (described above). In all cases, the DNA intended for conjugation must be deprotected and maleimide-containing. Once reacted with a scaffold, the scaffold reacts in a manner similar to the thiol-containing peptide described above. derivatized with a protected thiol-containing moiety to which it will be conjugated. Sara These modified DNA analogs can then be used to target the DNA to the desired scaffold. One method that can be used to clearly confirm and quantify the covalent attachment of A is Contains residues. Example 5-mer conjugate A. Zygote synthesis The use of various types of sulfur-based chemicals is specifically described in this document. Although these chemicals can be used to link ligands and scaffolds, This is just a small sample of the types that can be used. Any solid between the scaffold and the ligand To reduce chemical interactions [can be used to provide spacer arms type chemicals or alternative joining chemicals for any specific application. can be extrapolated from the above disclosure. Fundamentals of value and/or size As long as the rules are maintained and the ligand is able to interact with the target receptor, the scaffold and It is possible to accept any geometry or chemistry of the bond. Imnon The chemistry used to extend the paradigm to the maximum range of immune responses Some of them are described below. a, low molecular weight habuten As described below, all of the low molecular weight hubtens selected for investigation were It contained a reactive group that allowed it to be easily covalently attached to a scaffold. All conjugations are performed in aqueous solution, and unconjugated low molecular weight hubten is removed by dialysis, ultrafiltration or was removed by size exclusion chromatography. b, peptide The reaction between cysteine (Cys)-containing peptide and GMB-dexamine (4) is This is just one example of the well-known tendency of nuclear reagents to react with α and β-unsaturated silvonyl systems. do not have. This reaction is a conjugate- or 1. It is called 4-addition and is added to dextran. used for covalent attachment of peptides. If you are a person skilled in the art, back other joints to accommodate any particular set of bones or hapten combinations. You will realize that you can use chemistry. Take advantage of reactive thiols Other chemistries include reactions with haloalkanes or haloacetamides . All such reactions involve the reduction of peptides with N- or C-terminal Cys residues. Fresh buffer solution and freshly prepared GMB-dexamine (4) Involved. The C-terminal Cys-containing peptide used in the conjugation reaction is preliminarily 1 ( It was routinely purified to analytical purity by PLO. N-terminal Cys-containing Putidos may not need to be purified prior to their conjugation, in fact standard These peptides can be used after only the HF post-cleavage extraction step has been performed; It also underwent purification prior to joining. The reaction of Cys-containing peptides with GMB-dexamine (4) is an extremely rapid process. (tl/2<5 min for conjugated peptides at pH 5-7 in PBS) , for the reaction of cysteine and N-ethylmaleimide at pH 7 in acetate buffer. is tl/2=0. 7 seconds), but free sulfhydryls (C ys)-containing peptide and GMB-dexamine (4) are mixed. There is one completely different competing reaction that occurs. That is, non-reactive disulfide Dimerization of peptides to generate peptides. These two processes, viz. Simultaneous conjugation and dimerization may affect the ultimate conjugation yield and thus the tightness of the conjugated peptide. It will also be realized. The maleimide functional group is suitable for the pH range of the conjugation reaction (pH 5-7 (overall It was observed to be extremely stable over time. Specifically, Murray The succinimide form of dexamine produced by hydrolysis of the mid-double bond is After 2 days of exposure to GMB-dexamine (4) to superficial mating reaction conditions. could not be detected either. Therefore, hydrolysis of GMB-dexamine (4) reduces the conjugation yield It does not appear to be a factor (i.e., a side reaction) that affects the Cystine (Cys)-containing peptide and GMB-dexamine (4) are as described above. Prepared separately. ca, 0. Tsuriduct acrylic resin (immobilized) with a reducing ability of 5meq/g C1eland reagent = dithiothreitol (DTT)) was added to CAL1310 Obtained from CHEMCorp. Used in reduction and conjugation reactions of Cys-containing peptides The phosphate buffered solutions (PBs) used were prepared as described above. Purified peptides with N- or C-terminal Cys residues at up to 3 ml 1 g/ml Dissolved in PBS at a concentration of . Next, place the bottom of the Xingu glass and the nitrogen (gas) In a glass reaction vessel equipped with a spout, add a 50-fold molar excess of glue duct acrylic resin (D TT equivalent), the peptide solution was added. Promote the reaction mixture with nitrogen bubbling Carry out peptide reduction for 30-45 min at room temperature by gentle mixing. Ta. The fully reduced Cys-containing peptide was then purified with GMB-dexamin in PBS. (4) and the resulting conjugation reaction. It was allowed to proceed for 2 hours (reaction pH 5-7) at room temperature. Numerous submaximal levels of peptides Because the conjugation reaction of Quentin was added in a standard manner for 24 hours using 0x excess mercaptoethanol (ME). I clicked. This precaution ensures that the zygote has no undesirable effects during its in vivo lifespan. If a new peptide/protein is added to the conjugate or the conjugate is removed during purification, storage or use. can be prevented from crosslinking with each other or with other macromolecules. Final Depending on the need for greater anionic character in the conjugate, mercaptoesters tanol, each with one or two page charge equivalents for each maleimide group. of mercaptoacetic acid (MAA) or mercaptosuccinic acid (MSA) It is possible to replace it with either. Purification of peptide-dextran conjugates: present in quenched reaction mixtures The peptide-dextran conjugate is subjected to extensive dialysis or ultrafiltration against PBS. Purified/isolated by either of the following methods. Through this process, the completed joint mercaptoethanol or other quenching reagent and unconjugated peptide from effectively removed. For the latter type of reaction "contaminants", covalent The unbound peptide contributes to either the immunogenic or immunosuppressive properties of the conjugate. The assumption that the This makes sense when you consider what is expected of a zygote. but However, if there is no "indicator" for some types of covalent attachment, Peptides that are not labeled are conjugate peptide locations, which is a quantity that is of practical significance. This can result in a significant overestimation of the denaturation density. covalent bond A “clear” indicator of the body peptide (dan-2(2R,2dan-succinyl)- L-Cys), which will be described in more detail below. Dialysis or ultrafiltration What is not handled by either method is the completed peptide-dextran conjugate. High molecular weight (i.e., significantly larger than that of the desired zygote) from the body It is the removal of quality. Preliminary data indicate that when high molecular weight substances are present, This means that the conjugate is primarily a monomeric It shows that. (Observation of high molecular weight substances is done by laser light scattering analysis. (as the exact extent of contamination is impossible to establish). The quenched conjugation reaction mixture was combined at 12000~i, 4000 m wco dialysis tubing and then dialyzed against PBS according to the schedule below. ta:ea, 0. 0.02% (w/v) NaN in PBS for 24 h (2 times) PBS exchange), 24 hours to PBS (3 PBS exchanges), then 1 /lo strength (i.e. 15mM NaCl and 1mM phosphate, pH 7.3~ 7. 4) for 24 hours (3 PBS changes), ultrafiltration was performed as follows: Ao with either 5000 or 10000 mwco filter It was carried out in an icon 8200 ultravessel: the conjugation reaction mixture was mixed at approx. 02 %(w/v) Total amount of PIIS including NaN? Dilute to 00 ml. , and then concentrated to a volume of 30!11 or less at 55 ps (nitrogen pressure). Then this program The process was repeated twice in PBS and then twice in PBS at a strength of 1,/lO. . After dialysis or ultrafiltration is completed, the purified peptide-dextran conjugate is Aliquoted into polypropylene-polyethylene vials, frozen, and lyophilized. Ta. The completed zygotes were stored at -20°C in lyophilized form. C1 nucleic acid As mentioned above, the DNA used for conjugation is similar to the peptide when conjugated. modified to behave in a similar way. The following describes the desired scaffolding. Several methods of attaching either intact NA or size-fractionated DNA It is. (1) Natural DNA Deprotection of the DNA, i.e. removal of the 5-Npys group, was performed using 1 mM EDTA/J, 1-methylimidazole buffer containing M NaCl (0,], 6M, pH 6 ) by exposure to reduct acrylic resin for 1 hour. Next, the (now) thiol-containing DNA was directly transferred to GM[1-Dex (>5 mg in solution). to generate a DNA/Dex conjugate. Quenching with L-Cys and 5ephacryl S-400 following reduction of reaction volume by ultrafiltration. Purify the conjugate by preliminary gel filtration on HR. TSK5000 (Tos o By size exclusion HPLC chromatography of the purified conjugate on complete removal of uncoupled DNA by gel filtration step. was found to have been achieved. The use of bis-thiol functionalized DNA (dextran molecules cross-linked with DNA), making it more likely to produce and concentrate The presence of oligomers in the conjugated reaction mixture was evident during preliminary gel filtration. Ta. Although not completely dissipated from the DNA/Dex “monomer” peak, this 'Contaminants' are removed from the desired zygote when the fractions are conservatively combined. It can be done. In calculating the value, bis-functionalization of DNA with reactive thiol (-SH) groups is This led to the production of a loop-shaped J DNA structure on the surface of trans. If hypothesized, succinyl-cysteamine (Su The measured amount of cc-Can) is half the amount of covalently attached DNA. will be shown. The conjugation chemistry described above is based on Dext. Approximately 6 to 1 mole of K This appears to result in 8 moles of "looped J" DNA. During the preparation of size-fractionated DNA-dextran conjugates, GMB-dextran Care was taken to remove trace amounts of unreacted maleimide present on the strands ( in the form of extra Cys addition). Furthermore, as mentioned above, during the preliminary gel filtration High molecular weight species (ie oligomers) were removed via a conservative fractionation combination. However, upon standing at 4°C, the purified conjugate becomes almost completely It was found that the compound was converted into an oligomer with a high molecular weight. Disulfide C-5-S-> Dimers are associated with any reaction process involving bis-thiol-functionalized molecules. may be the source of the oligomers removed during the preliminary gel filtration. , the observed molecular weight shift is due to the (presumed) disulfide form. The most likely explanation is the continuation of the formation process. consistent with this hypothesis The purified conjugate responded to exogenously added DTT in a predictable manner. The discovery that the desired relatively low molecular weight conjugate is essentially It was regeneration (redifferentiation). In addition, size fractions prepared several months ago and stored continuously at 4°C The DNA-dextran conjugate responded to DTT, but the reaction rate was It was much slower than that associated with fresh zygotes. These consequences The fruit has a relatively high degree of cross-linking (disulfurization), which develops as a result of long-term storage. is consistent with conjugate preparations (through peptide binding). disulfide bond To prevent the re-formation of bonds (between dextrans), excess maleimide is added to the DTT reduction. It was accompanied by S-alkylation at . Clearly, conjugates of this type that undergo a molecular weight shift (or anything else for that matter) The tendency for immunosuppressive drugs to be prepared and administered significantly confuses efforts to prepare and administer immunosuppressants. This example highlights the importance of fully characterizing conjugate materials prior to administration. It emphasizes the importance. (2) Synthetic NA Following isolation of modified (i.e. SH gold-containing) DNA, size-fractionated D Perform deprotection and bonding as described above for NA. Next, double-stranded DNA-containing single-stranded DNA-containing (dextran) conjugates to obtain (dextran) conjugates. A complementary DNA strand (also 40 nucleases and (presumably) an enzyme) Double-stranded DNA To cross-link the chains, highly specific reagents such as mitomycin C and relatively specific Both low-strength thorazines can be used. Such a decrease is probably DN The duration of action of the A-Dex conjugate is longer and therefore therapeutic treatment as well. This would result in a lower dose of conjugate being required. Alternatively, chemically modified DNA analogues such as phosphothioate can be used. It is also possible to These nucleic acid analogs are endonucleases and exonucleases. It is known to be resistant to lyase digestion. B1 analysis In all cases, the resulting conjugate ensures that the final product is as agonistic as desired. to ensure that it meets the criteria set for the target or antagonist. undergoes rigorous analysis regarding both grain content and overall structure. Below are the following: Conjugates in general (habten, peptides and nucleic acids) and specificities used in the examples below A representative analytical procedure for target peptide-containing conjugates. (a) Fractionation and characterization of hubtenized polymers The above-mentioned hubten or epitope sequences The procedures used to prepare the conjugates are all consistent with the desired molecular mass and hubten substitution. It produced an excellent level of hubtened polymer. However, side reactions due to the unavoidable low level of cross-linking that occurs between polymer molecules. There remained a significant amount of material with relatively high molecular mass produced. subordinate Therefore, in order to further chemically or physically characterize it and use it for immunological research. Before the molecular size (mass) becomes sufficiently homogeneous, gel filtration chromatography as described above is performed. Habtenylation or epitope formation is achieved by iterative size fractionation on topography columns. It was necessary to purify the substituted polymer preparation. Composition analysis of hubtenized polymer: i) Dry weight analysis The primary analytical reference standard for each type of polymeric material is a given type is a dry weight analysis of the actual amount of polymer mass present in a polymer preparation. It was. The dry weight is determined after thorough vacuum drying of the polymer sample and the appropriate dialysate sample. Measured. ii) Spectral analysis The haptens used in these studies are partially in the visible or near UV range. was selected to have an identifiable spectral absorption band at wavelengths within the range. Preparation type The amount of hapten chemically coupled to the combined molecule is usually determined by dry weight analysis or The mass of the polymer preparation and the habten groups as determined by incremental refractive index analysis It was determined from a comparison of the absorbances. ■) Chemical analysis Determining the quantity of different chemical groups present on a polymer molecule by direct chemical analysis. was sometimes possible. The amino group is often trinitrobenzene sulfur. It is measured by reaction with phosphoric acid to produce a colored product, which is then It could be determined by spectrophotometric analysis. Carbohydrates are produced by reaction with sulfuric acid and phenol. A colored product with a measurable absorbance is obtained. benzyl penicillium Linhabten can be measured by reaction with mercury compounds to give a colored product. Peptides and/or proteins containing conjugates are characterized by amino acid analysis Yes (see below). iv) Refractive index incremental analysis Refractive index increase due to polymer versus dry weight measurements for each type of polymer molecule Careful calibration of the refractive index increment measurement in place of the dry weight measurement It was possible to This procedure involves polymerization during HPLC on a size exclusion column. Polymer mass The measurement accuracy has been greatly improved. ■) Titration analysis Ionization constants near the neutral range such as carboxyl, amino and phenol groups The chemical groups possessed could be measured directly using acid-base titration. This step is , carboxyl groups are very difficult to measure by spectrophotometric means in aqueous polymer solutions. This was particularly important because it was difficult. This type of ionizable chemical group Such measurements investigate parameters that affect the interaction of charged cell surfaces with polymer molecules. This is particularly important in determining the net charge on large polymer molecules that are large in size. (b) Determination of molecular mass and size of haptenized polymer preparations: i) Use of size exclusion chromatography (SBC) SEC method Chromatography column ratio of unknown sample and homogeneous standard sample using LC technique The comparison allows an appropriate determination of relative molecular masses. Standardized polymeric materials As opposed to homogeneous, some methods such as equilibrium ultracentrifugation or low-angle laser light scattering Must be independently calibrated for molecular mass by absolute experimental procedures. The SEC method is sensitive to all physical interactions between the column support and polymer molecules. Each and every type of haptenized polymer molecule is highly sensitive. The column retention time must be calibrated. Such a calibration is based on the physical and chemical properties, hapten chemistry and number, net charge on the molecule, etc. Be sensitive to it. ii) Equilibrium analysis ultracentrifugation Suitably combined with another experimentally measurable quantity, i.e. partial specific volume. In the case of short column equilibrium analytical ultracentrifugation measurements, absolute Weight-average molecular weight was generated. Experimental methods include A series of measurements and subsequent extrapolation of the results to zero polymer concentration is required. flat Equilibrium measurements are used to establish the relative independence of the extrapolated molecular weight on rotor speed. , performed at different centrifugation rotational speeds. Figure 9 shows a specific fluorescein-dextrin Two different rotor speeds (14000 and 16000R Molecular weight measurements determined at PM) and by extrapolation to zero polymer concentration. This example illustrates the In this case, the weight average molecular weight of the haptenized polymer is approximately It is 68kDa. ii) Low angle laser light scattering When properly combined with experimentally determined refractive index increments, low angle light scattering methods can , yields a value for the absolute weight average molecular weight of the polymer preparation. For large molecules In some cases, this method involves measurements at multiple concentrations and angles followed by zero weight. Extrapolation to both the combined concentration and the zero measurement angle is required. When combined with the separation of molecules of different molecular sizes using SEC, this light scattering method The method evaluates both the molecular mass and physical size distribution within very small amounts of polymer preparations. Deliver decisions you can trust. This type of measurement is performed using a high pressure liquid chromatography instrument. Hewlett-Packard HP1090M, and low-angle laser beam Performed routinely using a scattering device, Wyatt Technology Down. I was told. Size exclusion columns are Toyo 5odaTSK and GMPW Gelka. Ram or Phar+nacia 5uperose 6 or 12 column or its combinations, appropriately selected to separate the molecular sizes present within a particular sample. It was. If a low molecular weight sample is improperly separated from the salt, this will increase dissipation. A column of 5ephadex G15 was added. dinitrophenyl or fluorescein Upon replacing the polymer with a large amount of hapten with considerable hydrophobicity, such as There is a significant interaction between %butenes and the column material, leading to size exclusion-based separations. caused interference with. If this effect occurs, it is due to the presence of 2 This was minimized by using 0% acetonitrile. Peptide-dextran conjugates analyzed by low-angle laser light scattering method. Examples of the results obtained are shown in Table 3. This data is the size exclusion column difference. The results obtained in different runs using the following combinations are shown. obvious skill With the exception of a few cases in which technical problems existed, this data shows substantial consistency. , which is generally consistent with expectations for the particular sample. Table 3 Sample column Mn Mw Mw/MnA GMPW + 2. 5K 23. 4K 30. 8K 1. 32COR-3257G-15+GMPW22. 8 to 2 5. 7 to 1゜13(C) Analysis of peptide-dextran conjugate: Peptide-dextran The importance of analyzing strand conjugates is ultimately due to their different immunological behavior. The expectation was that this would be induced by a conjugate with a peptide substitution density of I'm involved. Complete acid (HCI) hydrolysis of peptide-dextran conjugates Later amino acid analysis via WaterSPXCO-TAG chemistry (conjugation body) is a very effective method for measuring both peptide and carbohydrate content. I found out something. Acid hydrolysis removes the peptide or carbohydrate moiety as an intact entity. Although such recovery does not allow for the recovery of conjugate peptide substitution density, such recovery is not necessary. that is, derived from the conjugated peptide and GMB-dexamine. Simply collect and weigh the amino acids to determine the number of moles of bound peptide and the recovered dexamine. It is possible to evaluate the number of moles of each. Peptide-dextran conjugation A representative product derived from acid hydrolysis of the body is shown in FIG. The three components in question are: gamma-aminobutyric acid (GABA); ), which represents the maximum amount of peptides that can be covalently conjugated and similarly It also provides a direct measure of the amount of dexamine backbone recovered; , 2-succinyl)-L-Cys; this is not linked by a covalent bond. Identifying conjugate peptides that are covalently linked to conjugate peptides that are only the conjugated peptide is succinylated); and the conjugated peptide Amino acids derived from peptides. 1 on PiCO-TAG HPLC column ．． 5-2-(2R,28-succinyl)-L-Cys with a retention time of 33 minutes The phenylthiocarbamyl (PTC)-derivatives of Well separated from the body. However, PTC derivatives of gamma-aminobutyric acid (PTC-GABA) co-elutes with that of arginine (Arg). Arg This is a disadvantage when containing peptide-dextran conjugates are being analyzed. However, if the integral P-mole value of other conjugate peptides and amino acids is known, In some cases, differential analysis (i.e. Pmoles@GABA) is used to measure GABA recovery. - Number of Pmoles at the peak - OArg (Number of Pmoles) can be used can. An example of the type of analytical data obtained from Pico-ATG conjugate analysis is (Lupus) Piston Peptide-Dextra HPLC chromatogram of PTC amino acids derived from the conjugate. Ru. Between covalent and non-covalent conjugate peptides problems of differentiation and the possibility of loss of zygotes that can occur throughout the production process. The importance of paying attention to gender is illustrated in FIG. Zygote analysis process The ultimate goal is to reduce the number of peptide molecules bound per average molecule of dextran. It is important to measure as accurately as possible. The equation that provides this information is simple enough. (Figure 12), but several variables affect the numerator and denominator of this equation. However, 5-2-(2R,2S-succinyl)-L-Cys and GABA Weighing of PTC derivatives greatly increases the accuracy of measurements of conjugate peptide substitution density. do. Importance of PTC-derivative of 5-2-(2R,2S-succinyl)-L-Cys cannot be overestimated, but conjugates attached by covalent bonds Other sulfur (S)-containing compounds that can similarly provide a clear evaluation of the peptide Mino acids have also been discovered. In particular, the corresponding cysteamine- or homo-C 5-2-(2 R,2S-succinyl)-cysteamine (retention time = 3. 38 minutes) and S-2 -(2R,2S-succinyl)-DL-homocys (retention time = 1゜5 0 min) PCT derivative (see Figure 13) is PTC-(dan-2-(2R, (Cusynyl)-L-Cys can be effectively substituted. Three different sulfur (S )-containing "labeled" amino acids, the ability to generate and quantify different peptides into GMB- It may be of value when conjugated to the same sample of dexamine (4). Provided that the purification of the peptide-dextran conjugate is complete, non-sulfur-containing Containing amino acids can also function under similar circumstances (i.e. as labeled amino acids). It is possible. In particular, δ-aminovaleric acid (δ-AVA), ε-aminocaproic acid (ε-ACA), β-alanine (β-Ala), norleucine (Nle) , norvaline (Nva) and α-aminobutyric acid (α-ABA). Amino acids that are not normally found in the biologically relevant portion of the peptide to be ``labeled J'' specifies the amount of peptide attached by a specific covalent bond. can be done. Reactive Cys, cysteamine or DL-homoCys residue When placed in the penultimate position relative to the group, these amino acids - Biologically relevant portions of peptides for incorporation into dextran conjugates a “spacer” that provides a distance between the chemically reactive (i.e. It can also be considered as an element. C-terminal Cys-containing peptides were subjected to reverse phase HPLC prior to use in conjugation reactions. It is advantageous to purify more completely. These peptides prior to their use The reason for rigorous purification is that the peptide is synthesized from the C-terminus using solid-phase technology. Directly related to how it is done. All associated with C-terminal Cys-containing peptides Deleted peptides or deleted sequences contain similarly reactive (i.e. -SH-containing) Cys residues. It will have a group. As a result, these unwanted peptides are is predicted to be conjugated to GMB-dexamine (4) in the same manner as the desired peptide. I could imagine it. Such a “series” of reactions is actually derived from the full-length peptide in question. A conjugate is derived that is a composite of all possible deleted peptides. to this point Please note the data shown in Tables 4 and 5. Table 4 Sample name: C1-0060/1420K Dex (1:1) pure peptide AA Conc, Mole% Moles Int. ASP 0000 0. 000 0. 00 0GLU 46. 50 0. 071 1. 06” l5ER84,640,1291,942GLY 45. 65 0. 070 1. 04” IHIS O,000,0000,000ARG O,000,0000,000THRO,000゜ooo　o,oo　. ALA 140°33 0. 214 3. 21 3PRO172,250,26 33,944TYRO,000,0000,000 VAL　O,000,0000,000MET　O,000,0000,000 ILE　00oo　o, ooo　o. 000LED O,000,0000,0 00PHE O,000,0000,000LYS 165. 89 0. 253 3. 80 4CI-0060 = Lupus 2’: Pro-Glu-Pro -Ala-1,ys-5er-Ala-Pro-Ala-PrO-Lys-Ly s-Gly-3er-L)'5-C)'5-CONHz per dexamine molecule (378 peptide molecules) (Max: -1024) - ABA recovery rate = 68% Table 5 Sample name: Cl-0060/1420K Dex (1:1) impure peptide AA Cone, Mole% Moles Int. ASP　O,000,0000,000GLU　30. 39 0. 062 0. 93° 1SER64,7? 0. 133 1. 99　2GLY　41. 84 0. 086　1,29''　IHLs　O,000,0000,000ARG　O ,000,0000,000THRO,000,0000,000 ALA 98. 69 0. 202 3. 03 3PRO118,850,243 3,654TYRO,000,0000,000 VAL　O,000,0000,000MET　O,000,0000,000 ILE　O,000,0000,000tEu　o,oo　o,ooo　o,o o. PHI! 0. 00 0. 000 0. 00 0LYS 133. 82 0. 2 74 4. 11 4CI-0060=/Raves 2' 2 Pro-Glu-P ro-Ala-Lys-3er-Ala-Pro-Ala-Pro-Lys-L ys-Gly-3er-Lys-Cys-CONHL per dexamine molecule 247 peptide molecules (maximum: -1024) - ABA recovery near 4% Umbrella = Glu/Gly = 0. 72 pmol of amino acids near the N-terminus (Glu) and amino acids near the C-terminus (Gly) The e ratio is the lupus peptide prepared for this experiment (CL0060)/1 420 must be equal to l for the dextran conjugate. impure C ending When the terminal Cys-containing peptide is conjugated, this ratio becomes significantly smaller than l. This fact (Table 5) is consistent with the peptide mixture actually participating in the conjugation process. One. Conversely, the N-terminal Cys-containing peptide is similarly deleted after being cleaved from the resin. Even if contaminated with peptides, none of these peptides contain reactive Cys It should not have any residues. i.e. the peptide in question (this is the finished peptide) only those that are conjugated must be able to undergo the conjugation reaction. This is actually This is demonstrated by the data in Tables 6 and 7. child Again, the amino acid near the N-terminus (epsilon-aminocaproic acid = ε-ACA) The pmole ratio of the amino acid (Pro) and the amino acid near the C-terminus was prepared for this experiment. The dextran conjugate was added to the prepared peptide (CI-0134)/65. It must be equal to . Table 6 Sample name: C1-0134/65K Dex (1:l) pure peptide AA C one, Mole% Moles Int. ASP 27. 58° 0. 091 2. 09 2GLU 26. 72 0. 0 88 2. 03 2SER12,150,0400,921GLY 79. 88 0. 263 6. 06 8HIS O,000,0000,000ARG 2 7. 00 0. 089 2. 05　2THRO,000,0000,000 ALA 27. 12 0. 089 2. 06　2PRO13,830,0461 ,05” ITYR11,400,03B 0. 86 1VAL 38. 42 0. 127 2. 91　3MET　O,000,0000,000ILE　00 00 0. 000 0. 00 0LEU 13. 7i 0. 045 1. 04 1PHE 13. 97 0. 046 1. 06 1LYS O,000,000 0,000ACA 11. 43 0. 038 0. 87” ICl-0134= Ac-Cys-(ε-ACA)-Ala-Asp-8er-Gly-Glu- Gly-Asp-Phe-Leu-A 1a-Glu-G 1y-Gl y-G 1y-Va l-Arg-G ly-Pro-Arg-Val-Va l-Val-(d)Tyr-CO2H Dexamine 9 peptides per molecule Molecule (maximum: -54) Table 7 1 trial person + Cl-0134/65K new (1:1) impure peptide AA Conc, Mole% Moles Int. ASP 23. 28 0. 093 2. 14 2GLU 22. 42 0. 08 9 2,06 2SER11,000,0441,011GLY66. 75 0. 266 6. 13 6H1s O,000,0000,000ARG 22 ．． 00 0. 088 2. 02 2THRO,000,0000,000 ALA　22. 57 0. 090 2. 07　2PRO10,850,0431 ,00” ITYR8,130,0320,751 VAL　31. 13 0. 124 2. 86 3MET O,000,0000 ,000ILE　O,000,0000,000LEυ　11. 44 0. 04 6 1. 05 1PHE 11. 58 0. 046 1. 06 1LYS O, 000,0000,000ACA 9. 36 0. 037 0. 8611CI- 0134=Ac-Cys-(ε-ACA)-Ala-Asp-3er-Gly -Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-A 1a-G I u-G l y-G I y-G 1y-Va l-Arg-G ly-Pro-Arg-V al-Val-Val-(d)Tyr-C (8 per hH dexamine molecule Peptide molecules (maximum -54)" ε-ACA/Pro ~0. 86 The ratio is that either pure or impure N-terminal Cys-containing peptide is used for conjugate production. The fact that impure peptides are essentially the same when used in the conjugation process suggests that it undergoes a "purification of kind" as a result of its participation in There is. To obtain the highest possible purity of the conjugate, all peptides were purified to analytical purity prior to All reagents used in the studies described herein were standard commercially available. It was obtained from a source of The purified peptide-dextran conjugate was incubated in HPLe-grade water at ca. , routinely dissolved at a concentration of 1 mg/ml. Remove appropriate aliquots and vacuum Waters Pico-TAG chemistry for amino acid analysis. (above). Varian ASSOC in deuterated dimethyl sulfoxide (DMSO) faf[! Protons ('H ) Nuclear magnetic resonance (NMR) spectra were recorded. Chemical transfer values were used as internal standards. This is in relation to the added tetramethylsilane (TMS). all All peaks are expressed as ppm downfield from TMS. Thin layer chromatography (TLC) was performed using Merck (#5715) silica gel spray. This was done on the website. The product was stained with C1,/starch-Kl and/or ninhydrin. Visualized by reactivity. Cys (0,082g, 0. For a stirred solution of NM M (0,101 g, 1 mmole) and maleimide (0,0485 g, 0. 50 mmole) was added. Stir the reaction mixture overnight at room temperature, then combine with 2 5a+mX 22c+o Dowex AG50W-X column. Kara The sample was eluted with H2O and fractions (25X 8 ml) were collected and analyzed by TLC. did. The desired Cys derivative was found in fractions 8-14. Combine these fractions Combined and lyophilized to give a fluffy white solid. Yield: 0. 074 g (0,285a+mole, 57%) mp (melting point) near 6-81°C. T LC (n-butanol:acetic acid, 1(to(4:1:1)):R, ~0. 4 3°Nl+lR: δ1. 86 (S, 3H), δ2. 43 (rn, l H), δ2. 90 (dd, IH), δ3. 00-3. 30 (m, 2 H), δ3. 95 (m, LH). 64. 23 (m, IH), δ8. 31 (d, J=7. 8Hz)+68. 34 J = 7. 8Hz) = IH9611, 39 (S, IH). -L in 6M HCI (in vapor phase) as a preliminary step for PICO-TAG analysis -Cys in quantitative yield. Purification by dialysis or ultrafiltration is an initial step in the preparation of peptide-dextran conjugates. It has proven to be very satisfactory on the floor. However, I will go In some applications, conjugate preparations that are completely free of high or low molecular weight impurities are desirable. May be required o 5uperose12 or 5uperose6 Molecular exclusion chromatography of the above dextran samples is highly recommended as a means of sample purification. can be effective. In-house fast protein liquid chromatography (FPLC) system A commercially available analytical 5uperose12 column (Pharm acia) is a sample of fluoresceinated dextran (Fl-Dex). Separates well. Purification of large-scale reaction mixtures of peptide-dextran conjugates To do this, prepare a preliminary 5uperose12 column (separation range: X 10'g/mole) could be used. Using Fl-Dex standard The separation results obtained from the preliminary 5uperose12 column are similar to those obtained with this type of chromatography. Matography as a means of both conjugate purification and (large-scale) peptide recovery This suggests that it could be useful. Using these techniques, the anti-histone, anti-OVA and anti-E The zygotes used in the ALA study were characterized as follows: - Histone peptide conjugate: 1) Dextran in 650. 2:1 le peptide ( = Cl-0125) (=Cl-0084/Dexgsx(0. 2: 1) 2) De of 65 Kytran 2: 1 mole reaction → 35 moles of peptide per 1 mole of Dex ( = Cl-0126) (=CI-0084/DeXssK(2:l)). Cl-0084=N-Ac-Glu-Pro-Ala-Lys-3er-Al a-Pro-Ala-Pro-Lys-Lys-Gly-Glu-Glu-Cy s-CONH*-0va peptide conjugate: Analysis of the purified inhibitory conjugate was as follows. Provided the results below. 1) Dextran in 40 0. 3: 1 mole reaction → 2 moles per 1 mole of Dex peptide. (=C l-0252) (　”　Cl-0159/　Dex4ox(0. 3: l)). 2) Dextran l:I mole reaction with 40 → 10 moles of peptide per 1 mole of Dex Petite. (=C l-0253) (“Cl-0159/DeXtox (1:1)). Cl-0159 = NA-Ae-Cys-(g-ACA)-Glu-Ala-Ht s"'-Ala-Glutie-AsnGlu-Ala-Gly-Arg"' -CONHs-EALA peptide conjugate 1) 1:1 molar reaction of dextran to 84 Response → Dex 57 moles of peptide per mole ( = Cl-0218) (=CI-0010/DeXs4x (1:1)). CC-0010=Cys-Gly-Ala-Gly-(Glu-Ala-Leu -Ala)s-Gly-Ala-Gly-Arg-Gly-Asp-3er-P ro-Ala-CONH*. Characterization of DNA-dextran conjugates by amino acid analysis includes peptide-dextran conjugates. The same type of manipulations involved in the analysis of strand conjugates are involved. Acid hydrolysis ( 6M HCl, 110°C, 22-24 hours), the conjugate was degraded. succinyl-Cys on succinyl-cysteamine (Succ-Cmn) (Succ-Cys) and -aminobutyric acid (GABA, see Figure 14). NA nucleotides produce hydrolysis peaks. (Carbohydrates derived from dextran are not recovered in measurable form). Pe As is the case with peptide-dextran conjugates, the released dan-containing amines The importance of amino acid (Succ-Cys or Succ-Cmn) is that it Ultimate for unambiguous assessment of the level of covalent attachment of DNA to run polymers It cannot be overemphasized because it provides dna nucleus Determination of otide hydrolysis products (see Figure 15) and direct absorbance measurement at 260 nm By combining this bonding measure with that provided by the This results in three independent estimates of the amount of DNA being generated. Dextran recovery When considered in conjunction with the recovered GABA values used to weigh the conjugate It is possible to set the DNA substitution density. Example 6゜ Linear polyacrylamide substituted with Dnp hapten groups was prepared as described above. did. Thus, linear polyacrylamide (Gel amide 250-American Cyanamid) was previously Ethylenediamine was substituted in a manner similar to that used for midospheres (In man et al., Biochemistry 8. 4074-4082 (1969)) . Shake the ethylenediamine substituted derivative with excess fluorodinitrobenzene. After that, a Dnp derivative was obtained by subsequent extensive dialysis. The replacement level is , determined from absorbance at 360 nm and dry weight measurements. Preparation 1181 25, corresponding to less than one liJ per labeled molecule. A substitution level of approximately 1 per 00 monomer units was obtained. Gel filtration through a column of length In of Bjo-GelA-0,5M agarose spheres The Dnp-substituted polymer was fractionated. These original fractions are further divided into 3 as determined by sedimentation equilibrium measurements in analytical ultracentrifugation. A relatively homogeneous preparation was obtained. Two Dnp-substituted polymer preparations were obtained with the following characteristics: Polymer B Molecular weight, Xl0-' 0,8 1. 8 Acrylamide monomer 1050 2350 subunits/molecule Extended length of polymer chain, A 2600 6000 Acrylamide monomer 4236 Subunit/Dnp Average distance between Dnp groups 105 90 Total Dnp groups/molecule 2566 "Effective JDnp group/molecule 8-1222-33 polymer B is not immunogenic, On the other hand, polymers were immunogenic (see Table 1 above). (see 1976 paper). Polymers B and D were subjected to further column fractionation on Sepharose Cl-4B. Two preparations (N and S) were prepared for further testing. Preparation N is Preparation S was the middle sub-fraction of polymer B and Preparation S was the middle sub-fraction of polymer . Determination of the partial specific volume (0,690 m/g) and extrapolation of the sedimentation equilibrium molecular weight were performed using N A value of 60,000 was given to S, and a value of 130,000 was given to S. These values are Dnp with S of 43 per molecule, along with absorbance at 360 nm and dry weight group (14-21r effective), whereas N is 19 D per molecule. Indicates that it contains np groups [7-9r effective" or appropriately spaced]. Polymer N and and B are the hapten substitution levels or “epitope density” per molecular size unit. are almost the same. Antibody response. 0. The polymer preparation was added to the BALB/C matrix in 5+nl of isotonic saline. mice were injected intraperitoneally. After 6 days, blood was collected by tail bleeding and subjected to analysis. Serum was stored at -30°C. The serum concentration of IgM antibodies against Dnp is determined by solid-phase binding. It was measured by a matching test. In order to bind the anti-Dnp mouse antibody, the Dnp placement Using a surface covalently coated with converted gelatin, this anti-oxidant The presence of the body was detected together with a 2′-labeled rabbit antibody directed against a mouse IgM antibody. This was determined by performing a second incubation. In vitro culture and assay. Mice were sacrificed by cervical dislocation and their pancreas was RPMr- 1640 medium and cut into stainless steel mesh (60x60 mesh; Diameter 0. 019 cm). Sediment the cell debris and remove the dispersed cells. The supernatant containing the suspension was decanted to remove red blood cells by osmotic shock and washed. . The suspension of nucleated pancreatic cells was then reduced to a final volume of 7. 5X10' viable in 5+ol with or without appropriate polymer in a 60X15m+n tissue culture dish containing cells. The cells were incubated without anaesthesia. Incubation is 37. 5% CO□ at 0℃ /95% water saturated air. The incubation medium was 5% (vo l/vol) heat-inactivated fetal bovine serum; 2% (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum; activated horse serum, 4+nM glutamine, 100 units of penicillin and 1 100 μg streptomycin and 50 μM 2-mercaptoeta per ml It consisted of RPM11640 medium enriched with Nord. After 3 days of incubation, cells were harvested and washed. Direct (IgM) anti-D Assays were performed for np plaque forming cells. Reactive towards Dnp group The immunogenic polymer preparation S as measured by the concentration of 1 gM molecule in serum Immunogenic responses in BALB/C mice 6 days after injection at various doses are shown in Figure 1. 6. The mice in this experiment were a single shipment of uniform age from the supplier. The animals arrived in Japan, and were divided into groups of 10 each. Each group's menu members were injected with the same dose and all groups were treated as equally as possible. . The solid line curve in FIG. 16 shows the values of D and ′°゛ as 0. By adjusting to 3μg The theoretical response expected from the equation, visually aligned to the experimentally determined points. This is the answer curve. Dintxis et al. (Proc. Natl. Acad, Sci, USA 79:395 (1982)) for the use of immunogens. and non-immunogenic glue were injected into one test animal and dose D1. and D’N is injected into a second test animal, the immune response in the second animal's body The ratio r of the immune response in the body of the first animal should be given by equation 1, , where ]), 11am is the immunogen that gives the maximum response in one animal. It was shown that the amount corresponds to the peak of the dose-response curve. Given the simplicity of the assumptions involved in the derivation of equation l and the known variability of individual mouse responses, Taken into account, the agreement between theory and experiment is surprisingly good. However, the same breeding If the experiment is repeated using different groups of house-supplied mice, the The variability of biological responses across test animals becomes more apparent. Figure 17 compares the dose-response curves of three separate shipments of BALB/c mice; Group-dependent variability of individual mouse responses at each dose and group-by-group It illustrates both the change in the shape of the dose-response curve. by different mouse groups. The variable immunological responses conferred by This is a well-known phenomenon observed in both studies using This is probably the test against cells, viruses and parasites that can affect the “antigenic purity” of the animal. Tests such as exposure to environmental shocks such as heat and cold during exposure and shipping. It depends on factors in the animal's history and handling. The observed dose-response curves shown in Figures 16 and 17 are shown in Figure 16. Although the agreement between the curves is good, However, the observed responses were highly variable from batch to batch of mice and were generally shown in Figure 16. even wider than would be expected from the simple model that produced the curve shown. It is clear that a dose-response curve is shown. This relatively broad experimental curve can be explained as follows: The theoretical curve in Figure 16 shows that all cells responding to the immunogen It is based on the assumption that the receptor molecules have the same binding constant. this The assumption of perfect homogeneity is unlikely to be true. bind immunogen In response to this, cells have protein receptors with different binding constants for Dnp. the expected response should be the sum of many individual cell response curves. It is. Each curve is similar to the one in Figure 16, but also has a relatively low binding constant. is shifted to the right by an amount proportional to the ratio between its binding constants to Dnp. be given From this perspective, examining Figures 16 and 17 shows that the experimental dose The observed width of the response curve is consistent with binding constants of 1-1. Different by 5 logarithmic units, i.e. 1 Results from the sum of responses from individual cell populations with receptors that differ by a factor of 0 to 30 It can be seen that it can be understood as something obtained as. dose one The measured response is determined by summing the theoretical responses of three or four such groups of individuals. It can be adapted within experimental error. For a fixed immunogenic polymer dose, Equation 1 similarly shows that the increase in non-immunogenic polymer N It can also be used to predict the range of decreased response that will be obtained with larger doses. Wear. This type of measurement is shown in Figure 18 for BALB/C mice. There is. The solid line in Figure 18 was not fitted to the data, but was drawn from Figure 17. Sue - 0 per animal. By using an estimated maximum response dose of 5 μg D′″°8 is calculated directly from Equation 1. The experimental points in Figure 18 and calculated The fit of the calculated theoretical curves is limited by the presence of arbitrarily adjusted parameters in this calculation. It's surprising considering that it doesn't. Figure 16. In addition to the in vivo experiments in live animals shown in 17 and 18, the dose Responses were also measured in vitro using isolated mouse pancreatic cells. Figure 1 9 when compared with the visually fitted theoretical curve calculated from equation l. The results of such in vitro experiments are shown. Cultured lung cells (Figure 19 This agreement between experiment and theory (Fig. 19) for in vitro experiments with It is almost as good as the in vivo experiment using the whole body (FIG. 16). In both cases, the measured response curves represent uniform hubs in the responding cells. This is somewhat broader than expected from a model based on ten-coupling constants. Of particular importance to the present invention are the amounts of non-immunogenic polymer shown in Figure 20. Measurement of inhibition of in vitro immune response with expansion. The solid line is not the one fitted to the data, but the 0. 4μg/ml maximum It is calculated directly from equation l using the large response dose and the ′′ value.Experimentally There is substantial agreement between the points and the calculated theoretical curve. The blood volume and extracellular fluid volume of mice are approximately 1 nl each, thus the maximum in vivo A suitable immunogenic polymer dose is about 1 μg/ml. This in vivo dose and in vitro It is clear that large amounts of food are needed during the optimal immunogenic dose (zl ng/ml). There is a difference. The 1000-fold difference in sensitivity is mostly due to phagocytes throughout the body. This can be explained by the rapid in vivo removal of polymer molecules by 1 mentioned above 12″■ labeled preparations of polymers as described in the 976 paper. Studies using this product have shown that most of the injected polymers are found in the Khuthupah cells in the liver and their showed that it is rapidly cleared from the circulation by phagocytes in other tissues. . The resulting drop in free polymer concentration is due to the Coupled with uncertainties regarding the equilibration rate of coalescence, in vivo and in vitro This makes any quantitative comparison of relative optimum concentrations difficult. These problems Nevertheless, the shape of the dose-response and dose-inhibition curves measured in vivo strikingly similar to that measured in vitro, with the same limiting profile in both cases. The fact remains that Seth is heavily implied to be the subject of close investigation. It is. Moreover, in both cases the measured response as a function of dose The answer is in excellent agreement with the value that can be obtained from equation 1. Polymer N is unable to stimulate at any dose, while polymer S has the greatest stimulation. Inhibition of Polymer S at the same dose with high potency is carried out. This represents competition for surface receptors. Both polymer preparations have a common This discovery is due to the fact that they have almost the same "epitope density" due to their carrier chemistry. is the epitope density or polyclonal (i.e. non-specific) activity due to the “carrier”. This is not consistent with the theory that explains immunogenicity by citing oxidation. Consideration of Example 6 The above data indicate the following regarding specific T cell-dependent stimulation: (i) A specific immunogenic signal is generated by the formation of immunones on the surface of responsive cells. (ii) Immunons are generated after a sufficient number of surface receptors have clustered. and (iii) specific clustering of surface receptors. occurs as a result of the binding of these receptors to linked habutens. this Binding is specific to the habten-receptor interaction, and the ``foot'' to which habten is attached It is not primarily influenced by the place. The physical underlying chaining of the hub ten The scaffold may be molecular in nature or alternatively may be attached to the surface of the "antigen presenting cell". It consists of a single surface on which small hubten-containing structures aggregate, such as Good too. Mitogens, lectins, antibodies against cell surface proteins and other cells Non-specific stimuli, such as activating or inhibitory factors, can affect the ``stimulability'' of responding cells. a given amount of immunogenic signal that can be sufficiently influenced to influence the level of its potential to respond to Increase or decrease the size. Factors from T cells and macrophages are It has been shown to nonspecifically increase antibody responses. Mitogens are anti- It is known to non-specifically stimulate cells to secrete secretions from the body. Maitoji genes can be indirectly or directly by a mechanism involving the aggregation of specific receptors. It is unknown whether or not this will be done. However, these specific stimuli In contrast to the intense It shows that the linkage of specific binding sites occurs: Cells displaying these receptors can then be stimulated to secrete specific antibodies. The cells divide and differentiate into different cells. In the above (and in the 1976, 1982, and 1983 papers mentioned above), Molecules consisting of a hapten chained to a flexible linear polymer are It has been demonstrated that drugs with spaced haptens are immunogenic only. It's here. This discovery of T cell-independent antigens was initially Numerous protein molecules that do not contain many identical antigenic sites are still This seems to contradict the fact that it is primordial. However, some research Studies show that the antigenicity of proteins in vivo depends on their aggregation state. It has been shown that. Physical methods (heat, adsorption to bentonite; Floyd Emulsification with adjuvants) or chemical methods (with glutaraldehyde or alum) Experimentally induced aggregation of protein molecules by cross-linking (cross-linking) significantly reduces their antigenicity. It is well known that it is strengthened. Centrifuged without aggregates or Non-aggregated protein molecules collected from the serum of vaccinated animals are non-immunogenic and tolerated. While tolugenic, aggregated materials with putatively many antigenic sites are immunogenic. Generate a response. Therefore, antigens as determined by a single T cell-independent polymer The minimal requirement for sex is for a wide variety of molecules, including T cell-dependent molecules. It is conceivable that it may have applicability to immune responses. In any case , the inhibition that non-immunogenic polymers have over immunogenic polymers as exemplified above. It is clear that the effects can be used to suppress unwanted immune responses. That is. The amount of non-immunogenic polymer thus employed will necessarily depend on the specific properties involved. heterogeneous immune response, polymeric carrier, effective number of epitopes involved, body weight and other factors. It will change depending on the cause. However, 0.0% per kg of body weight. 5~so We believe that administration of mg/kg may be effective in controlling undesirable immune responses. It is being Administration may be by injection, e.g. with a sterile solution of the non-immunogenic polymer. can become. It is clear from the above introduction and discussion that the extension of the immune response to other haptens and carriers As such, the present invention does not depend on the nature of the hapten or the carrier, but rather on the molecular mass of the carrier and the hapten. hapten density, and these physical properties (molecular mass, hapten density) Determine whether the substance is immunogenic or non-immunogenic or suppressive. this thing The following disclosure regarding studies conducted with fluoresceinated carriers and further illustrated by example. In this further research work, five chemical The molecular properties of different fluoresceinated (Fl)-polymers vary systematically. and its ability to stimulate anti-habten immune responses was determined. Used as a carrier The dried polymer is carefully size fractionated to produce one natural polymer (dextran). , one modified natural polymer (carboxymethylcellulose) and three synthetic Composed of polymers (Ficoll, polyvinyl alcohol, and polyacrylamide) It had been. The carrier is somewhat similar in physical structure to the highly cross-linked Ficoll. Branched dextran linear polyacrylamide, carboxymethyl cellulose It has changed from alcohol to polyvinyl alcohol. Polymer is haptenized with Fl and size-fractionated to determine varying molecular masses, hapten titers, and hapten densities. produces a group of molecules with Are these haptenized? = anti-F1 against polymer Responses were measured in vivo after intraperitoneal injection of Fl-polymer in saline and In vitro after culture with unfractionated pancreatic cells from drug-naïve mice. Measured in Toro. Consistent with the above illustration involving Dnp-polyacrylamide, the immunogen In order to have a property, each Fl-polymer must have a comparable threshold of molecular mass and hapten number. It was discovered that the value must be exceeded. Optimal immunogenicity is found in Fl- Occurs when the polymer has mass and hubten density values that are within a predictable range. It was. Immunogenicity is determined when these optimal parameters are substantially increased or decreased. decreased to Therefore, the conclusion is that the immunogenicity of soluble haptenized polymers depends on predictable physical and molecular properties, chemical composition and steric properties of the carrier polymer. It can be concluded that it is relatively independent of conformation. The polymeric carrier chosen to be hubtenized was dextran (T2O0 0, T5O0 and T2O-Pharmacia); Ficoll (400 and 7 O-Phar+naeia) H carboxyl methylcellulose (medium viscosity-Si gma); Polyvinyl alcohol (average molecular weight! 15,000-Aldrich ); and linear polyacrylamide (synthesized from crystalline acrylamide in the form of an aqueous solution); was completed). The polymeric support was conjugated with fluorescein by the following procedure: reactive carboxyl The syl group was removed at 20°C. 05M NazcO3-0, in 05M NaHCO1 It was produced in polyacrylamide by partial hydrolysis (3). Disclosed by Inman, J. Immunal, 114 near 044 Follow the steps. In such diamidated polyacrylamide and dextran, Fico Introducing amino groups into polyvinyl alcohol and carboxymethylcellulose did. Following that, 0. Excess fluorescein at pH 9.2 in 1M NaJ40. The amino groups on the polymer were conjugated to inisothiocyanate. then then Buffers used for subsequent gel filtration (0.1M NaC+, 0. 001M of EDTA, 0. 02% NaN5. 0. (11M KPO+, pH 7, The polymer was extensively dialyzed against 4). Next, the Fl-polymer was added to 5cpharese CL-28, CL-4B and/or Iteratively fractionated on a 95c+n column of CL-68; Replication was performed to obtain preparations with relatively narrow molecular weight distributions. About Fl72000 0. using a molar extinction coefficient of 0. Optical at 496 nm in OIM NatB40y F1 content was determined by measuring density. This measurement and the polymer dry weight By combining the measured values, it became possible to calculate the epitope density. Molecular mass is determined by sedimentation in an analytical ultracentrifuge as known in the art. Determined by descending equilibrium analysis (Proc, Natl, Acad, Sci, 73: 3671, 1976). at multiple polymer concentrations by using a short column method. Measurements were made and molecular masses were obtained by extrapolation to zero polymer concentration. experiment smell The used polymer was dialyzed against PBS and 0. 22-μα Nucleopoly Sterilization was performed by filtration using a re filter. For in vitro studies, mice (CAF, IJ Suspension of 2X10' nucleated pancreatic cells from female mice, mostly 8-10 weeks old) The liquid was placed in a 15+ ol sterile polystyrene centrifuge at an angle of 3 degrees from the horizontal. The tubes were incubated with or without the appropriate polymer in a final volume of 2 ml. 3 days After a period of incubation, cells were harvested and washed. Trans, Rev, 1 8:130 (1974), directly (I gM) Anti-hub template plaque forming cells (PFC) assays were performed. all Cultures were performed in triplicate and PFC assays were performed in duplicate for each culture. immune response was expressed in PFC per 10 pancreatic cells. Control culture without addition of antigen The response was subtracted from that of the experimental culture. Typically, this control is 10' 5+/-2 PFC per cell was determined. Indicator cells within a plaque assay are low affinity (i.e. non-specific) cells. ) Hapten substituted at low density to minimize assay response to antibodies , the replaced indicator cells were added to 9 ml of borate buffered saline (BBS; 110 0.01 containing 0I sodium borate. 9% NaCl, p)19. 2) dissolve in solution of 1 mg of fluorescein isothiocyanate and 1 ml of concentrated donkey red Prepared by mixing blood cells (BRBC). Next, mix the mixture in the dark with 1 Stirred at room temperature for an hour. Cells were centrifuged first in BBS and then in PBS 3-4 times. Washed by. o, ii% glycylglycine for less than one week. were stored in PBS containing These were washed in PBS before use. Fl replaced The BRBC is anti-F! in this system. In detecting plaque-forming pancreatic cells It was found to be as effective as BRBC substituted with Fl-polymer. J. I+nmuno1. 131:2196 (1983), Trinitrophenyl (Tnp) substituted indicator cells were prepared. Possible immunogenicity behavior is due to differences in internal secretion rates or organ and tissue distribution. In vitro studies were performed in parallel with whole animal measurements to prevent potential differences. reverse In other words, in vitro findings cannot be confirmed by in vivo results. This eliminates concerns that the findings simply reflect an artifact of cell culture. Thank you for your help. Cells where these molecules may be exposed in living animals Cultures of unfractionated pancreas are the preferred in vitro culture to mimic the environment as closely as possible. It was a Toro test. For in vitro antibody responses, polymer preparations and 0. Mathematica in 5 ml of isotonic saline. mice were injected intraperitoneally. The adjuvant is a solution to the actual molecular mass of the administered antigen. Because it can change the physical state of the antigen in a way that makes it impossible to It was also not used for antigen administration. After 4 days, mice were euthanized and their lungs The viscera was removed and subjected to PFC assay. The response of control mice injected with saline alone was subtracted from the response of the test mouse. Typically this control is per 106 cells. The measurement was 10+,/-5 PFC. For the dose of Fl-polymer used to generate an antihabten response, the observation Less than 1% of the anti-Fl responses produced using the unsubstituted carrier as the immunogen did it. When tested for the production of non-specific polyclonal antibodies, the The unsubstituted carrier molecules are unsubstituted donkey red blood cells (BRBCs) or pneumococcus pleura. For BRBC substituted with either polysaccharide or dinitrophenyl groups (data It was found that no plaque was generated (not shown). These observed facts are , the F1 polymer reacts with fluorescein at the dose required to generate an anti-Fl response. It does not significantly stimulate B cells with epitope specificity that is completely different from that of It showed that The composition and characteristics of the hubtenized polymers used here are listed in Table 1. (See page 27). All of these polymeric supports are essentially uncharged, except for the negatively charged CMC. won. Habutenylation with fluorescein results in a hydrophilic and negatively charged substrate. yielded a converted polymer. The kinetics of response to this series of F1 polymers is related to Dnp-polyacrylamide. It was found to be closely similar to what was observed. - As an example, Figure 21 shows the characteristics for Fl-PVA after several incubations. Dosage of primary in vitro antihabten response in lung cells not receiving regular medication The response curve is shown. Peak in vitro response occurs after 3 days of incubation. It happened later. Primary in vivo antihabten responses to optimal doses of the same polymer. Motility is shown in FIG. 22. Lung PFC peaked at approximately 48 eyes. Four different fluoresceinated polymers namely Fl-Dex, Fl-F In vivo antihaps generated by lic, Fl-CMC and Fl-PVA The Ten dose-response curve is shown in FIG. In vivo shown in Figure 24 The dose-response curve includes the curve generated by the additional polymer Fl-PA. Ru. These curves are consistent with all immunogenic polymers used in this study. It represents the generated response. Each dose-response curve is bell-shaped, with a maximum initially increases with antigen dose until reaching 1, then decreases with higher antigen doses. Do a little. Each of the size-fractionated polymers tested showed both in vitro and in vivo be immunogenic or non-immunogenic in some situations and exhibit consistent behavior in these two situations. was. Table 8, along with the results of assays for its stimulation of anti-nobutene antibody responses, A number of representative polymers are listed. Table 8 Fit4oFic750 0. 32 + +FItoFiC750o, 12 + +F1a5Dex400 0,16 + +F1soDex170 0. 3 5 + N, D, eFlosPA300 0. 32 + N, D. Flg-0PA400 0. 58 + N, D. Fits. CMC5200,32+ +F1*iCMC1100,24++ FlzoPVA400 0. 28 + N, D. Fl,, PVA200 0. 28 + +Fl + +Fic40 o, 35 --FlsFic35 0. 17 -- Fl + 4DeX40 0. 35 N, D. Fl,, PA80 0. 59 - N, D. Fl, CMC270,22-- Fl14PVA50 0,28--a) Lung cells not receiving specific medication Determined by measuring anti-FI PFC directly after 3 days of incubation. . b) Harvested on day 4 after intraperitoneal injection of antigen in saline without adjuvant Determined by measuring direct anti-Fl-PFC in pancreatic cells. c) N, D, = not measured. The subscript number after the Habten abbreviation indicates the number of Habten per molecule. butene number), while the number after the carrier abbreviation indicates the molecular mass in kD. For example, Fl ssDex400 is one dextra with a total molecular mass of 400,000 Daltons. refers to a molecule with 65 fluorescein groups on a fluorine carrier. Over a 4-log dose range, the polymer groups listed above the dashed line were immunogenic. However, the groups below the dashed line were non-immunogenic. Five types of polymeric carriers were prepared, namely Fl-Fie. Minutes with each of PI-Dex, Fl-PA, Fl-CMC and Fl-PVA It included a child. Therefore, all five F1 polymers are effective for immunostimulation, regardless of the chemical composition of the polymeric carrier. It has the potential to be either immunogenic or non-immunogenic. Molecular properties of the polymers in Table 8 It can be seen that immunogenicity is directly related to molecular mass and habten titer. . All polymers above the dashed line have a hubten number of 20 or higher and 100,000 Daltons. It had a molecular mass of 100% or more and was immunogenic. Polymers below the dashed line are 10 It has a molecular weight of less than 0,000 Daltons and is not immunogenic at all doses tested. I didn't. The hubten density in both groups is Luorescein 0. 12 mmol to 0. It has almost the same range of 59 mmol. was. Therefore, habten density itself is predictive of the presence or absence of immunogenicity. It wasn't. %8, antigen-specific inhibition of non-immunogenic Fl-polymer independent of carrier chemistry The inhibitory properties are further illustrated by the following examples. As shown above, the molecular mass of 100,000 Daltons or less and the hub temperature of 20 or more A soluble fluoresceinated polymer with a failed to stimulate anti-habten responses. However, this example Pancreatic cells mixed with appropriate concentrations of stimulatory Fl-polymer and free from specific medications. can inhibit the production of anti-hapten antibodies when cultured in vitro with This shows that Figure 25 shows a typical example of such inhibition. Ru. Specified drug-naïve pancreatic cells were treated with a fixed concentration of the immunogenic polymer Fit. F A series of formulations containing increasing concentrations of non-immunogenic polymers with ie750. Culture was performed using the solution. As can be seen here, the inhibitory ability of non-immunogenic polymers is against immunogenic polymers at concentrations of inhibitor between approximately 1 ng and 10 ng per ml. increases with increasing concentration until complete inhibition of the anti-Fl response is reached. Figure 25 shows that Fl on a backbone carrier, i.e. PVA, Dex, or CMC. , a “cross-inhibitor” that allows inhibition of the anti-F+ response stimulated by Fl-Fic. has proven to be harmful. This data supports the inhibitory potential of these non-immunogenic F1 polymers. shows that the chemical properties are largely independent of the specific carrier chemistry. There is. As a control, Figure 25 shows that an unrelated hubten, Dnp, on a PA carrier was This indicates that the response could not be inhibited. Carrier-independent inhibition is further shown in Table 9. It has been made clear that This table shows the results for four immunogenic polymers with different carrier backbones. The ability of four non-immunogenic Fl-polymers to inhibit immune responses has been demonstrated. Table 11 shows the set with CIJC as carrier and the set with Ficoll as carrier. The inhibitory abilities of two sets of polymers are compared. hub in each set Ten density is similar, but molecular weight is different. Contained within the CMC carrier are two non-immunogenic polymers (FL@CMC27 and Fl, CMC15); one non-immunogenic polymer (F1+4FiC40) A Fic carrier carrier set is included. In each set, the immunogenic potency Polymers with larger molecular weights have better inhibitory properties, regardless of their It is a child. Table 11: Effect of molecular mass on inhibition ability FL. , CMC4400, 242° FL*sCMC1100,249 FL, CMC270, 2215 FL, CMCl5 0. 27 40 FLa,. Fic2000 0. 32 4FLg*oFic750 0. 32 6FL, Fic40 0. 35　9゜ a) The concentration that gives 50% inhibition is a constant amount (4 pM) of FleoFiC750. Direct anti-Fl-PFC reduction by adding inhibitory polymers to cultures containing It was determined by measuring the amount of PI9. A, Suppression of the ongoing T cell-dependent immune response to Habten. hubtenized proteins such as chicken ovalbumin or bovine serum albumin (BSA) The protein is absorbed onto aluminum hydroxide and given by repeated small injections. For these habutenylated proteins, if A very strong T cell dependent response can be generated. The resulting response The answer is the high concentration directed against the habten, which is coupled to the injected protein. Levels of both IgG and IgB antibodies can be included. -For example, OVA substituted with fluorescein over a period of several months by a protocol of During subsequent immunization with antigenic substances and subsequent exposure to antigenic material for many weeks, Serum anti-fluorescein IgG response levels of three individual mice tested are shown in Figure 27. is shown. These mice were all immunized at the same time following the same protocol. They formed part of a larger cohort of ships that were Of these mice Some of these are then used with polymers that have previously been determined to be inhibitory. and received an intraperitoneal injection. Such polymers have a high hubten substitution density. It was a soluble fluoresceinated polymer with a molecular weight of 100,000 or less. child These polymers suppress ongoing high-level anti-fluorescein IgG antibody responses. He was injected to test his ability to heal. Serum levels in individual mice The results from injections of three different such polymers are shown in Figure 28. 29 and 30. In these figures, the time scale of bleeding is the same as that in Figure 27. It is the same. The data in Figure 28 differs from the unrestrained mouse shown in Figure 27; Mice receiving a 3 mg dose of FL-Pa with multiple PL substitutions, FL30Pa50. The serum anti-PI IgG antibody level decreased significantly over a period of one month or more. Of the 6 suppressed mice, serum antibody levels in 5 mice were too low. falls rapidly to unmeasurable levels and remains there for the entire period Ta. Serum antibody levels within the sixth mouse decreased relatively slowly and at the end of the period showed slight recovery. When the polymer was dextran (Figure 29), 0. FL25 of 1 mg The dose of Dex70 had no apparent effect on serum anti-FL IgG antibody levels. A subsequent dose of <1 mg had no effect, whereas a subsequent dose of <1 mg resulted in complete failure in 5 of the mice. It caused total restraint. The 6th mouse is a steep descent to low 1 novel and then It showed a slow and steady decline following . The data in Figure 30 shows that a dose of 1 mg of FL30Dex80 is very substantial. However, it is said that it did not completely suppress the serum level of anti-FL IgG antibodies. It is shown that. However, the next dose of 3+ng did not produce complete inhibition. Brought. Figure 27. 28. From the combined data of 29 and 30, in immunized mice. Injection of milligram quantities of the appropriate habtenized polymer will reduce serum anti-hapten IgG. It is clear that it is possible to cause a deep and long suppression of antibody levels. be. This is equivalent to a proven "healing" of the humoral immune response. In subsequent experiments, both gG and IgE (sensitizing antibodies) Parallel measurement of serum levels and pancreas producing anti-fluorescein antibodies of the IgG class. Determining the number of visceral lymphocytes to suppress (cure) high levels of anti-fluorescein responses Research efforts have been made to test this. These different experiments in the same experiment To measure the inhibition index, a large number of mice were simultaneously exposed to F on aluminum hydroxide. Stimulation with L-OVA was followed by different protocols of inhibition and restimulation. egg 4 per white albumin molecule. Fluorescence up to the level of the fluorescein hubtene group of 5. Various doses of OVA chemically substituted with luorescein isothiocyanate in a large group of CAFI mice by repeated injections of A very strong immune response to Habten and fluorescein was generated. strong and even In order to generate a quality immune response, FL-OVA should be combined with aluminum hydroxide 1+n 0.0 per g. 1. adjuvant at a ratio of 1 or 10 μg FL-OVA Adsorbed onto aluminum hydroxide Al(OH)s. The resulting 1m1 A fixed amount of antigen preparation containing g of AI(OH) was injected intraperitoneally into a series of mice. fluorescein, resulting in a strong antibody response to fluorescein. After the second antigen injection , the resulting T cell-dependent anti-FL IgG antibody levels in serum were etc. were extremely high. To measure the obtained anti-FL IgG antibody level, use ELISA technology. Serum can be diluted 100,000 times so that quantitative measurements can be made. It turned out to be necessary. Engineering according to the hydrolysis rate of nitrophenyl phosphate Anti-mouse coupled with selectively and affinity purified alkaline phosphatase fluoresceinated gelatin using a second antibody of μ-linked IgG (μ-linked). Measurements were performed on coated 96 well plates. Figure 31-3 1oooooo times blood for 3 mice per point as shown in 3. Anti-FL IgG measurements were performed using diluted solutions, and the average and standard values of the measurements were deviations are shown. observed by varying the stimulatory volume of FL-OVA over a 100-fold range. Efforts were made to determine the generality of the observations. That is, l + ng of aluminum hydroxide FL-OVA is 0. 1. 1 or 10 μg was injected. ELISA Low levels of fluorescein deposited on the gelatin that coated the assay plate. better binding, higher affinity, and more clinically relevant anti-P The L antibody molecule is highlighted. Appropriate doses (2 mg) of non-stimulatory but inhibitory fluoresceinated The resulting strong immune response can be removed or “cured” by injection of the polymer. achieved. The specific polymer used in this experiment was The resulting polymer (FL30-D ex80) on dextran with an average molecular mass of 80 kDa. with a fluoresceinated dextran containing 30 fluorescein groups. there were. Mice have high circulating levels of antibodies to fluorescein when “cured” To avoid undesirable side effects in recipient animals, It was important to administer the therapeutic dose in stages. Therefore, the initial dose lμg The dose was increased up to 10 times every 2 hours starting from . This protocol allows No visible signs of difficulty in the animal's body during or after administration of FL-dextran No symptoms occurred. On day 35, when the immune response was very substantial, Then, following an attempt to re-stimulate the animals on day 75, a curative dose was administered on day 95. It was. Responses of mice that were repeatedly stimulated and mice that were stimulated and then cured. A direct comparison of the answers is shown in Figure 31. 32 and 33. These diagrams Dramatic decrease in anti-FL antibody levels after hydration and subsequent restimulation on day 75 It shows a lack of response to. In order to demonstrate the range of effectiveness of curative treatment, this Their figure shows previously high (10 μg), medium (1 μg) and low (0,1 μg) doses. Mice stimulated with stimulatory antigen, i.e. FL-OVA on aluminum hydroxide. Contains data from Figure 31. 32 and 33 are serum anti-FLu IgG anti- body levels are reduced very substantially in each case by only one treatment be stimulated and not stimulated again by repeating the initial stimulation. It clearly shows. Circulating anti-fluorescein [ggG antibody molecules]

【ノベルの測定に加えて、こ のような分子を血清内に活発に分泌しているリンパ球の数を知ることも重要であ る。理想的には、循環する特異的抗体のレベル及びこのような分子を分泌するリ ンパ球の数の両方について、進行中の抗体応答の抑制がその減少をひき起こすべ きである。スボ１２９．１８７−１９７．１９９０）は、フルオレセインに特異 的なＩｇＧ抗体を活発に分泌している膵臓細胞の数の測定を可能にする。 異なる量の水酸化アルミニウム上のＰＬ−ＯＶＡで３回１０日目、２１日目及び ７５日目）刺激された３匹のマウスからのプールされた膵臓細胞を分析するため １２５２５日目の方法を用いたとき、がなりの数の細胞が、各ケースにおいて抗 −ＦＬ　ＩｇＧ抗体を分泌していることがわかった（図３４）（ｒ治ゆされてい ない」棒」。しかしながら、同じプロトコルによる刺激を受けたものの上述のよ うに３５日目及び９５日目にも治ゆを受けたマウスの膵臓から細胞を分析し７た とき、各ケースにおいて、抗−Ｆｌ、ｕ　ＩｇＧ抗体分子を産生ずる細胞の数に はかなりの減少が見られた（図３４）、（「治ゆされた」棒」。これらのデータ は、治ゆプロセスが血清からの関連する自由に循環する抗体を除去するばかりで なく、このような抗体分子を産生ずることのできる膵臓４工胞の大部分を削除し たことを示している。これら２つの測定値の相対的絶対値から、ＰＬ−Ｄｅｘで の抑制によりひき起こされた抗体産生細胞の阻害度が計算され、結果として得ら れた値が図３５に示されでいる。 上述のデータは、抑制性ＰＬ−Ｄｅｘでの処置の結果として、特異的免疫応答の 非常に実質的な抑制が起こったということを示している。 図３５中のデータ並びに図示（てぃない付加的なデータから、実験条件と測定さ れた抑制度を関係づけする２つの異なる傾向を識別することができる；すなわち 、 １、測定された抑制は、免疫応答を産生じた免疫原の用量が減少ず−るにつれて 増大すること、そし、て、 ２、測定された抑制は、スポット−ＢＬＩＳＡ検定のために使用され六：ゼラチ ンにカップリュノグされたエピトープ（フルオレセイン）の量が減少するにつれ て増大する・−と（すなわち、ゼラチンあたり０．０８のＦＬで測定された阻害 百分率は、ゼラチンあたり０．２のＦＬで測定された場合に比べて大きい）。 さらに多くの測定値（図示せず）が、抗体産生細胞についてのスポット−ＥＬＩ ＳＡ検定及びＩｇＧ抗体の血清レベルについてのＥＬＳＡ検定の両方における抗 Ｆ１抗体を産生ずる細胞についての検定内の広範囲のハプテン置換密度全体にわ たってこの傾向が真実であることを示していた。 上述の２つの傾向は、上述の抑制性重合体によってその出現が最も有効に阻害さ れる抗体はハプテン（ＰＬ）に対し最高の親和力をもつものであるという結論と 一貫している。アレルギー及び自己免疫疾患の状態と少量の高親和性抗体の存在 とは往々にして相関関係づけされてきたことから、これは、医学関連状況への応 用に対する将来性ある観察事実である。 Ｂ、高レベルの抗ＦＬ　ＩｇＥ応答の治ゆ数多くのアレルギー効果は関連抗原性 物質に露呈されたときヒスタミンを放出するマスト細胞を活性化することのでき るＩｇＥクラスの抗体の存在によるものである。ＩｇＥクラスのこのような抗体 の存在に対するきわめて特異的な生物学的検定は、受身皮ふアナフィラキシ−（ ＰＣＡ）試験であり、この試験においては、分析中の動物からの希釈された数マ イクロリットルの血清が被験動物の皮ふ内に注射される。１時間又は２時間後に 、被験動物には、可溶性染料を含む食塩溶液中の関連抗原が腹腔内注射される。 抗原に対する注射された血清のＩｇＥ抗体が存在する皮ふ領域内では、マスト細 胞の活性化の結果として可視的染料色が現われ、その後媒介物質が放出されて血 管性漏洩をひき起こす。観察可能な皮ふ応答を誘発することになる注射された血 清の最大の希釈倍数は、その血清中のＩｇＩ！抗体価の尺度である。これは通常 、１ｍｌの未希釈血清あたりの特異的１ｇＥ抗体のす、ノブラムレベルまで検出 可能である。この生物学的に有意なＰＣＡ試験を、上の図３２に示されているよ うに刺激及び抑制を受りたマウスの一部からの血清に適用した場合、図３６に示 された結果が得られた。 図３６は、実質的レベルのＩｇＢ抗フルオレセイン抗体が発達させられた後、唯 一回の抑制性Ｆｌ−Ｄｅｘの注射がこのようなＩｇＥ抗体の血清レベルを数週間 きわめて低いレベルに下げてしまうことを立証シ、Ｃいる。（実際には、レベル は非常に低いため、これを測定の背景レベルから実験的に識別することは不可能 であった）。 その上、このように処置されたマウスは、反復用量の抗原での追加免疫に対し完 全な耐性を有しているのに対し、対照マウスは、追加免疫を受けたときそのＩｇ Ｂ血清力価の非常に実質的な増大を示した。抑制性重合体の注射が、マウス体内 の立証済みのアレルギー・型応答の長く持続する「治ゆ」をひき起こしたように 思われる。 要約すると、フルオレセインハブテンに対する強い進行中のＴｍ胞依存性免疫応 答を抑制又は「治ゆ」するという抑制性形状のフルオレセイン化重合体の能力の 実験的試験が行なわれてきた。その結果は、ハブテンに特異的な臨床的に関連す るＩｇＧ及びＩｇＥ抗体ス２（，１、血清抗−ハブテン［ｇＧ抗体レベル２、抗 ハプテン［ｇＧ抗体を分泌する膵臓リンパ球の数；及び３　面清抗ハブテンＩｇ Ｂ抗体レベル における劇的かつ長く持続する減少によって測定されるように、有効に除去され うるということを示している。 Ｃ３血清抗ペニシリンＩｇＥの減少 ペニシリンアレルギーは、数多くの疾患にとってペニシリン（又はその関連化合 物）の投与が今なお好まれる処置であることから、臨床的に最も悲惨な薬物アレ ルギーである。（２かしながら数多く　ｆ）人がペニシリンに対するアレルギー をもつ（すなわち、即時型過敏症反応を示す）か、或いは又長期にわたるペニシ リン療法を受けている間にそのようになる。以下に記しているのは、ペニシリン に対する免疫応答が実際にはこの技術を用いて特異的に抑制されうることを示す データである。 以下の実験的詳細は、この例に記されている研究にあてはまるものである。 動物：　Ｃｕｍｅｒｌａｎｄ　Ｆａｒｍｓ、Ｃ１１ｎｔｏｎ、ＴＮからＣＡＦ（ ＢＡＬＢ／　ｃ　ｘ　Ａ　）雌マウスを入手し、これらは最初に免疫化したとき 生後約ｌθ週目であった。Ｈｏｌｔｘｍａｒ　Ｃｏ、、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＩＩか ら体重３２０〜３８０　ｇの雄のＳＤラットを入手した。 化学薬品：ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）分画ＶをＭｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓ。 Ｉｎｃから入手した。Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯからペニシリンＧ（ナトリウム塩）及び結晶性ニワト リ卵白アルブミン（ＯＶＡ）を入手し、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｌｏｓ　Ａｎ ｇｅｌｅｓ、　ＣＡ、からＰ−クロロメルクリ安息香酸塩（ＰＣＭＢ）はＣａｌ ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｌｏｓ　Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡから入手し、エバンスブルーは 、ｆ！ａｓｔｌｎａｎ　ＫＯ（！＆に、ＲＯＣｈｅＳｔｅｒ、Ｎ、Ｙ、から購入 し、エチレンジアミン（ＢＤＡ）は、Ｍ　ＣＢ　Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ　 Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ。 Ｃ１ｎｃｉｎｎａｔｉ、　ＯＨに発注した。 ハブテン・担体接合体 ＢＳＡ又はＯＶＡを室温でｐ）１１０．０の０．５Ｍのに２ＣＯｍ内でペニシリ ンＧ（ベンジルペニシリン）とインキュベートすることによって、ベンジルベニ シロイル−ウシ血清アルブミン（ＢＰＯ−ＢＳＡ）及びベンジルベニシロイル− 卵白アルブミン（ＢＰＯ−ＯＶＡ）を調製した（Ｎａｋａｇａｗａ　ｅｔａｌ、 　［ｎｔ、Ａｒｃｈｓ、ＡＩＩｅｒｇＹ　Ａｐｐｌｙ、　Ｉ＋ｏｍｕｎｏ１，６ ３：２１２（１９８０））。さまざまなインキュベーション時間は、異なるエピ トープ密度を生み出した。 担体１つあたりのハブテン数は、下付き文字で示されている。すなわち、４つの ＢＰＯ基で置換されたＯＶＡはＢＰＯ，−０ＶＡである。置換度はｐｅｎａｍａ ｌｄａｔｅ検定を修正したものによって決定した（Ｐａｒｋｅｒ、　Ｃ，Ｗ、免 疫学及び免疫化学の方法、ＷｉｌｌＬａｗ＋ｓ　ａｎｄ　Ｃｈａｓｅ　ｅｄｓ、 Ｖｏｌ、　Ｉ、ｐ１３３゜Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９６７乃。 ｐＨが９．２の０．０５Ｍの炭酸塩中のベニシロイル−担体接合体１．（１＋１ に対してｐＨ９，２の０．０５Ｍの炭酸塩中の２ＸＩＯ−”ＭのＰＣＭＢ　Ｏ， １ｍｌを付加する。おおよそのベニシロイル濃度は２〜４×ｌＯ−Ｍでなくては ならない。混合して５〜ｌＯ分間室温で放置した後２８５ｍμで読取りを行なう （ε＝２．３８Ｘ１０’）。組合されていないＰＣＭＢについての補正（２，８ ２Ｘ　１０−’Ｍの最終濃度で０．０３８）及び希釈（タンパク質濃度はもとの ９１％）の後の増分的増加は、ＰＣＭＢから形成されたｐｅｎａ＋ｏａｌｄａｔ ｅ及びベニシロイル基のせいである。 上述のようにゲルろ過により入念に線状ＰＡをサイズ分画化させることによって 、ベンジルベニシロイル−ポリアクリルアミド（ＢＰＯ−ＰＡ）を作った。９０ 分間５０℃でエチルジアミン（ＢＤＡ）と共にＰＡをインキュベートしその後大 規模に透析を行なうことにより、置換度の高いＥＤＡ−ＰＡが結果として形成さ れる。これを次に、タンパク質接合体を調製するのに用いられる方法によってペ ニシリンと接合させた。 結果として得られたハブテン化された重合体を次に、相対的なサイズ均質性に至 るまでゲルろ過によって分画化した（図３７参照）。 免疫化：各々４匹のマウスから成る２つのグループに、０．１０ｍ１の０．０１ Ｍトリス、０．１５Ｍ　ＮａＣ１緩衝液、ｐＨ８，３中で１ｍｇのＡｔ（ＯＨ） 、上のＢＰＯＩ−ＯＶＡ　１Ｍｇを腹腔内投与した。−次注射から２．５週間後 に、１ｍｇのＡＩ　（ＯＨ）　ｓ上のＢＰＯ，−０ＶＡ３　μｇの追加免疫注射 を与えた。−次免疫から約３．５力月後に、マウスにｌｏｇのＡＩ（ＯＨ）ｓ上 のＢＰＯ，−０ＶＡ３μｇを再度攻撃誘発した。 抑制＝４匹のマウスから成る上述のグループのうちの１つは、０、２５！１１の リン酸緩衝溶液（０，ＯＩＭのリン酸塩、０．１５ＭのＮａＣ１，、ｐＨ７，４ ＰＢＳ）中の１ｍｇのＢＰＯ−ＰＡの腹腔内注射を受けた。このポリアクリルア ミドは、４００００のおよその分子量を有しく平衡超遠心分離により決定）、ポ リアクリルアミド分子１個あたり約２５のＢＰＯ基で置換された。先行研究は、 このＢＰＯ−ＰＡ調製物があらゆる用量で非免疫原性であることを示している。 検定：受身皮ふアナフィラキシ−（ＰＣＡ）検定（Ｏｖａｒｙ、　Ｉｎｔ、　Ａ ｒｃｈｓ。 Ａｌｌｅｒｇｙ　Ａｐｐｌ　Ｌ　Ｉ＋ｏ＋ｏｕｎ、　３：２９３（１９５３）） を修正したものによってＩｇＢ含有量を決定した。各グループ内のマウスからの 等量の血清をプールし、ラットの皮ふ内に０．１ｍ１体積の希釈血清を注射した 。２時間後、０．５ｍｌのＰＢＳ中４ｍｇのＢＰＯＩ−ＢＳＡに１ｈ＋Ｈのエバ ンス・ブルー染料を加えたものを静脈内（ｉ、　Ｖ、　）注射し、２５分後ラッ トを安楽死させ、皮を剥ぎ、力価（直径５ｍ＋ｎ以上の病巣を生み出す最高希釈 倍数の逆数）を決定した。 ＡＩ（ＯＨ）、ゲル上（７）　ＢＰＯ，−０ＶＡノ注射を受けたマウスは、ＰＣ Ａ検定で測定されるように抗ＢＰＯＩｇＢ応答（図３８）を発達させた。この抗 −〇ＰＯ応答はヒトペニシリンアレルギーのマウス対性である。４匹のマウスは 、ＢＰＯでハブテン化されたポリアクリルアミド（ＢＰＯ−ＰＡ）の１ｍｇとい う抑制量の注射を受けた。ＢＰＯ−ＰＡを抑制量受けた後１週間以内に、被験グ ループ内の抗−ＢＰＯＩｇＢの血清レベルは、９８％以上減退した（図３８ａ） のに対し、抗−０ＶＡ　ＩｇＨのレベルは一定にとどまった（図３８ｂ）。すな わち、抑制の後、ＢＰＯノ１ブテンに対する被験グループの応答は、対照グルー プの応答のｌ／８０未満であった。 被験グループがその抑制量のＢＰＯ−ＰＡを受けてから約２．５力月後、両方の グループはｌｎＨのＡＩ（ＯＨ）ｓ上のＢＰＯ，−０ＶＡ３　ｕ　ｇの腹腔内注 射で追加免疫を受けた。対照グループ内のマウスは当初の応答よりもさらに大き い抗ＢＰＯ応答を有し、一方被験グループ内のマウスは「追加免疫」注射に対し 応答しなかった（図３８ａ）。従って、ＢＰＯ−ＰＡによって誘発された抑制は 急速である（−週間以内）ばかりでなく数カ月間持続する。さらに、これは、Ｂ ＰＯハプテンに対する付加的な露呈に対し応答性をもたなくするためマウスを免 疫的に寛容化させる。 Ｄ、抑制性構成体としての価制限を受けたシクロデキストリンベースの接合体の 利用 Ｂａ１ｂ／ｃマウスを免疫し、次に、高力価のＩｇＧ抗−Ｆｌ抗体をひき起こす ため水酸化アルミニウム上に吸着されたＦｌ−ＢＳＡで２度追加免疫した。これ らのマウスをグループに分け、３つの異なる用量で上記例ＩＨに記述されている ような７つのＦＩＴＣ基（ＣＩ−０３７４）を有する価制限を受けた足場、或い は又先行する実験で最適な抑制性をもつことが示された用量の６０ＦＩＴＣ基（ ＣＩ−０３２３）で置換された７００００ダルトンのデキストランを用いて処置 した。もう１つのグループは、対照として緩衝液単独で免疫した。マウスをこれ らの処置後間隔を置いて出血させ、先行例で記述したとおりＩｇＧ抗−Ｆ１抗体 についてＥＬＩＳＡによって血清を検定した。価制限を受けた足場が、ＰＩ−デ キストラン構成体によって誘発されたものに類似した抗−ＦＬ応答の用量依存性 の長く持続する抑制を誘発できるということは明らかである（図３９参照）。 例１０．タンパク質及びタンパク質オリゴマに対するＴ細胞依存性抗体の応答 免疫応答性のイムノンモデルの仮定は、各種の可能性あるエピトープの単一コピ ーのみを含む単量体タンパク質分子が、単量体可溶形態で投与される場合に免疫 原性であってはならない、というものである。しかしながらこれらの分子は、重 合された形で投与される場合又は、可溶性又は不溶性の凝集物として又は体内の その他のいくつかのプロセスによって、アジュバント上に吸収された密に間隔ど りしたアレイの形に重合される場合、免疫原性であってよい。 重合体ＢＳＡの免疫原性：抗−ＢＳＡ　ＩｇＭの測定重合化されたＢＳＡの研究 から得た結果について最初に記述する。 前述のハプテン化されたデキストラン研究の場合そうであったように、抗−ＢＳ Ａ　１ｇＭ血清レベルは急速に上昇し、約６８目にピークに達し、その後安定状 態のレベルにまで下降することがわかった。 図４０は、可溶性の高度に重合されたＢＳＡ　（７０ＢＳＡ単量体を含む「７Ｏ −ｔｎｅｒ　Ｊ　）が非常に低い用量においてさえＩｇＭ抗体を高めることがで きるのに対し、単量体ＢＳＡはＢＳＡに対する検出可能な１ｇＭレベルに到達さ せるのにかなり高い用量を必要とする、ということを示している。 異なる分子量の一連のＢＳＡ重合体からのデータを比較すると、図・ｉ】におい て、６８目に１ｇＭレベルによって測定された免疫原性は、より高い分子量で最 も急速に増大するものの全ての分子量におい°Ｃ強い用量依存性をもつことがわ かる。 重合体ＢＳＡの免疫原性：抗−ＢＳＡ　ＩｇＧの測定ＢＳＡの可溶性重合体の注 射後１４日目止でに、実質的なアイソタイプクラスの切り換えが起こり、抗−Ｂ ＳＡ　！ｇＧ抗体は、抗原用量及び分子質量のいくつかの組合せについて存在す ることがわかった。ＢＳＡ重合体を何回も少量ずつ注射した場合、応答は、ＢＳ Ａ重合体の分子量に対する高い依存性を有していた。図４３は、マウスに対して 食塩水中のＢＳＡ重合体が１μｇ、　１０μｇ又は１００μｇずつ３０日越して ３回注射された実験を例示している。単一の注射について言えるように、抗−Ｂ ＳＡ　ＩｇＧ血清レベルは、用量及び重合体サイズに強く依存していた。図４３ は、最高１００μｇの用量での食塩水中での反復的注射の後でさえ抗−ＢＳＡ　 ＩｇＧ応答を生み出す上で単量体ＢＳＡがさほど効果的でないことを示している 。これとは対照的に、実質的なサイズの重合体を含む調製物は、非常に有効であ った。この観察事実は、図４４に例示されているように月ベースで連続した注射 の合計回数を５回に増やした場合に確認された。図４４は、前述の各図において 明白であった傾向すなわち、少量の用量が投与された場合有意な量の抗体が可溶 性ＢＳＡの重合体形態までしか高まらないという傾向を、さらに明確に例示して いる。同様に、きわめて重合体レベルの高いタンパク質は非常に少ない用量（ｌ μｇ）でさえ、反復的に投与された場合アジュバントの不在下で免疫原性をもち 得るということも明白である。 重合体ＯＶＡ　（７）免疫原性：抗−０ＶＡ　ＩｇＭ重合されたＢＳＡで得られ るものに非常に類似した結果が、抗原性物質として重合された卵白アルブミンＯ ＶＡを用いた場合に得られた。 共に食塩水中で注射した重合レベルの非常に高いＯＶＡと単量体のＯＶ／’に対 する一次応答は、図４５に示されている。 重合体ＯＶＡ　（７）免疫原性：抗−０ＶＡ　ＩｇＧグルタルアルデヒドと重合 されたＯＶＡをサイズ分画化し個々の分画をいくつかの異なる用量で月毎の間隔 で３回注射した場合、免疫応答は、ＯＶＡ重合体のサイズ及び用量に強く依存す ることがわかった（図４６）。用量及び重合体サイズに伴う応答の変動は、図４ ２のＢＳＡ重合体の場合に見られたものにおおよそ匹敵する。 抗原の投与から短時間後、重合されたＢＳＡ又は重合されたＯＶＡ　１ｍｇに対 する一次１ｇＭ応答を比較すると（図４７）、実質的なレベルの類似性が見られ る。両方の図は共に重合が増大するにつれての免疫原性の増大を示している。 重合されたタンパク質上にハブテンに対する免疫応答を見極めるために、フルオ レセインを、数多くの異なる置換レベルでＢＳＡ重合体にカップリングし、図４ ８に示されているように数回の注射後、免疫応答を決定した。 結果は、ハブテン応答が望まれるＩｇＧアイソタイプのものであったことを実証 している。これは、置換度の増大と共に上昇し、ＢＳＡ単量体１つあたりほぼ５ つのフルオレセイン又はＢＳＡ　２０−ｍｅｒあたり合計１００のフルオレセイ ンでピークに達した。次にこれは、置換の増大に伴ってきわめて低いレベルまで 急速に降下した。一方、ＢＳＡ自体に対する免疫応答は、約５つのハプテンが付 加されるまでフルオレセイン置換の増大と共に比較的一定にとどまり、この付加 の時点で、むしろ驚くほどに同様に急速に降下する。このことは、潜在的にワク チンのために有用なタイプのペプチドエピトーブでの重合されたタンパク質の最 適な置換レベルも存在することを表わしている。このタイプの化学作用を用いた 最大限の免疫原性をもつアジュバント無しのワクチンの構成が考えられている。 上述の結果から、以下のような結論を導き出すことができる：１）アジュバント 無しに投与された重合体ＢＳＡ及びＯＶＡは、多大な［ｇＭ及びＩｇＧ抗タンパ ク質応答を刺激する。 ２）これらのポリタンパク質の免疫原性は、タンパク質の多様性が増大するにつ れて増大する。 ３）ポリタンパク質の免疫原性は、用量に強く左右され、免疫原性は用量の増加 と共に増大する。 例１１．外因性抗原からのペプチドに対する抗体応答及び内因性タンパク質上の エピトープに対する自己免疫抗体応答の抑制以下の物質及び方法論は、以下に続 く実験結果の記述において言及されるものである： Ｄａｗｌｅｙ、　Ｉｎｄｉａｎａ−ｐｏｌ　ｉｓ、　ＩＮ、のいずれかから、Ｂ ａ１ｂ／ｃｖウスを入手した。これらのマウスは、生後８〜１０週目で使用した 。 免疫プロトコル−ＩｇＧ抗体（Ａｂｓ）を高めるために、水酸化アルミニウム上 に吸着された１０〜５０μｇのペプチド−ＢＳＡ接合体を一回だけマウスに腹腔 内注射した。その後何度も試験用出血を採血し、抗ペプチドＩｇＧ　Ａｂ力価を 測定した。ペプチド−デキストラン接合体の免疫原性をテストするため、さまざ まな置換比でペプチドが接合されたデキストランバックボーン１００μｇ用量を 、マウスに腹腔内注射した。出血を週毎の間隔で採取し、血清中のＩｇＭ及びＩ ｇＧペプチド特異Ａｂｓのレベルを測定した（図４９）。相反する指示の無いか ぎり、以下の方法で抑制性ペプチド−デキストラン接合体を投与した：すなわち 、２時間の間隔で１．ｌＯ及び１００μｇの用量を注射した。 なおｌμｇ及び１１０１ｔの用量は静脈内注射したのに対し、高用量は腹腔内に 投与した（「治ゆ」処置）。その後の抑制維持用用量は、週間隔で投与した。 ＥＬＩＳＡ検定−標準的固相ＥＬＩＳＡ検定により、抗体価を測定した。 ０．１μｇ／ウェルでペプチド−ゼラチン接合体を用いて４℃で、マイクロタイ タブレート（１＋ｎｍｕｎｏｌｏｎ　Ｉｌ、　Ｄｙｎ−ａｔｅｃｈ　Ｌａｂｓ、 Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ。 ＶＡ）をコーティングした。ＰＢＳ／ゼラチンでプレートをブロックした後、さ まざまな抗血清希釈液を付加し、２時間室温でインキュベートした。プレートを 洗浄し、抗体の結合をホースラディツシュペルオキシダーゼで接合されたアイソ タイプ特異抗原（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄａｎｄ　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｓ、Ｇａｉ −ｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）とそれに続＜　ＡＢＴＳ基質を用いて検出した。 ＡＢＴＳ産物のＯＤ４゜１１としてデータを表現している。リンカ−領域に対し て向けられた抗体を、無関連ペプチド−ゼラチン調製物を用いて検出し、これら の読取り値を特異的結合についての読取り値から差引いた。 研究のために選択された第１のペプチドは、グルタミン酸−アラニン−ロイシン −アラニン配列（単一文字のアミノ酸コードを用いたＥＡＬＡ）とそれに続くペ プチド配列グリシン−アラニン−グリシン−アルギニン−グリシン−アスパラギ ン酸−セリン−プロリン−アラニン−アミドの６重反復であった。このペプチド を以下（ＥＡＬＡ）と呼ぶ。 規定のＥＡＬＡ−デキストラン接合体を、非免疫原性であることが確認された８ ４０００ＭＷのデキストラン（ＥＡＬＡ−Ｄｅｘｓ４）上で合成した。これらの 接合体を用いて［！ＡＬＡ−ＢＳＡによって惹起された進行中の抗−ＥＡＬＡ− ＩｇＧ応答を抑制した。ＥＡＬＡ−ＢＳＡの注射から４６日後、これらのマウス を２つのグループに分割し、そのうちの一方のグループは、１．ＩＯ及び１００ μｇという増大する用量のデキストランバックボーンでＥＡＬＡ−ｄｅＸｓ＋を 受け、もう一つのグループは、緩衝液のみの注射を三回受けた。３日後そしてそ の後は３日毎の間隔でマウスを出血させ、その抗−ＥＡＬＡ　ＩｇＧ力価が何ら かの減少を示していないか血清をテストした。図５０は、ＥＡＬＡ−ｄｅｗｓ　 １が、未処置のマウスにおいて進行し続けていたＡｂレベルの上昇を防止したこ とを明確に示している。少なくとも２１日間、低レベルが持続した。この時点で 、抑制を受けたマウスの低い応答が有効に完全破壊され得たか否かを見るため同 じ養生法を用いてもう一つの治療を行なった。ＥＡＬＡ−ｄｅＸ＊４の投与によ って応答がさらに減少することはなかったものの、対照マウスのものがなお増加 しているように思われたのに対してこの応答は少なくともさらに１４日間低レベ ルに維持されていた。 第２の研究については、免疫学の分野で大規模に研究されてきた異なるペプチド が選択された。１５９と呼ばれるこのペプチドは、ニワトリ卵白アルブミン（Ｏ ＶＡ）の残基３３１−３３９を表わす。このタンパク質の残基３２３−３３９か ら成る、ここでは１０４と呼ぶペプチドは、特にＨ２“マウスにおいてヘルパー Ｔ細胞によって認識可能なＯＶＡ上の優性エピトープである。 １０４が高分子量のデキストラン上に配列されこれらの接合体がＢａ１ｂ／　ｃ （Ｈ２’　）マウスに注射されると、高１ｇＧ　Ａｂ応答が急速に得られる。さ らに、１０４がＢＳＡ上に配列され、水酸化アルミニウム上に沈降され、マウス に注射されると、極端に活発な抗体応答が見られた。興味深いことに、デキスト ラン上又はＢＳＡ上のいずれかに配列された１０４に対する抗体応答の約４０〜 ５０％が、１５９によって表わされるＣ末端の１０個のアミノ酸の特徴とするこ とができた。このときこのシステムは、抗原全体に対する生成された抗体の割合 が大きいことによって短かく線状のアミノ酸配列が認識されるさらに複雑な抗原 （タンパク質のような）に類似している。 このモデルを用いて、さらに複雑なシステムの規定されたエピトープに対する応 答を特異的かつ選択的に抑制する能力を立証することができた。このシステムを より良く特徴づけするべく設計された初期の研究は、ペプチド１５９が６５００ ０ＭＷのデキストラン上に配列されたとき、イムノンモデルで予想できるとおり 、免疫原性をもたないということを明らかにした。しかしながら、このペプチド は、ＢＳＡ接合体が１５９に対する優れた抗体応答を起こすことから、Ｂ細胞に よって認識されうる。その上、上述のとおり、１０４の接合体によって高められ た抗体の大部分は、ＥＬＩＳＡ検定における直接的結合及び１０４−ゼラチンに 対する抗１０４抗体の結合を阻害するのに遊離１５９を用いる競合検定の両方に よって表示されるように１５９に対して向けられたものである。 図５１は、１５９エピトープに向けられた１０４応答の部分を特異的に抑制する 能力を立証している。ＩｇＧ抗体は、アルミニウム上に吸着された１０４−ＢＳ ＡをＢａ１ｂ／ｃマウスに注射することによって１０４に対して高められた。高 い力価は、１０４及び１５９の両方に対して高められた（図５１）。免疫注射か ら４０日後（図中の０日目）、８匹のマウスから成るグループに対し、デキスト ラン１モルあたり１０モルのペプチドの比率で１５９と接合された４００００分 子量のｌμｇ、１０μｇ及び１００μｇのデキストラン（すなわち１５９．。− ｄｅＸ＋。）又は食塩水のいずれかを注射した。その後、マウスを３日目そして その後７日の間隔で出血させ、１５９と１０４の両方に対する応答について検定 した。 図５１は、治ゆ後の応答を示し、１５９に対する応答が処置後直ちに劇的に減少 したものの抗体価は１４日以内に対照レベルまで事実上回復したことを示してい る。処置を受けたマウスにおける１０４に対する応答は、１５９の応答と同じ減 少及び回復のパターンに従っていたが、３日目に１５９が治ゆ前レベルの約９％ まで減少しているのに対して、治ゆ前の応答の約６０％まで減少したにすぎない 。換言すると、１０４に対する応答の約４０％が１５９１゜−ｄｅｘｔ。の投与 によって除去され、１０４応答のこの部分が１５９配列内のエピトープに対して 向けられていることを表わしている。実際には、１０４の応答のうち最高４０％ がまさに溶液相競合検定において可溶性１５９で成功裡に完成されつる（データ 示さず）。 次に、前の通り治ゆを反復したが、この場合最大用量として２００μｇを用いた 。さらに、その後、抑制性接合体の連続的投与が１５９の応答の慢性的抑制を維 持するか否かを見るため、−週間の間隔どりで２００μｇの用量を与えた。図５ １は、この第２の治ゆが再び基本的に完全に、７日後に測定された１５９に対す る応答を阻害し、これは最初の治ゆの後に見られた減少に匹敵しうるものであっ た（第１の治ゆ後７日目で応答は治ゆ前のレベルの１３％であり、第２の治ゆ後 ７日目で治ゆ前レベルの１０％であった）ということを示している。 さらに、１５９に対する応答は、１５９１゜−ｄｅｘ　４゜が週毎の間隔で腹腔 内注射された次の４０日間全体にわたって、抑制されたままであった。 次に注射を停止し、さらに約３０日間抗体応答を監視した。応答は力価が対照マ ウスの低下する抗体レベルに近づくようにまさに増大する傾向を有していたもの の、抑制状態にとどまっていることがわかった（図５１）。この時点で、マウス を再び１μｇ、１０μｇ及び１００μｇの１５９−ｄｅｘで治ゆしく７７日目） 、それに続いて、対照マウスと同様に、１０４−ＢＳＡでの追加免疫を腹腔内に ほどこした。対照マウスの抗体応答は実質的に（予想通り）追加免疫されたもの の治ゆマウスの抗体応答は攻撃誘発前のレベルから著しい変化を示さなかったこ とから、治ゆを受けたマウスがこの攻撃誘発に耐えることができるということは 明らかである。 従って、１５９□。−ｄｅｘ　１゜の効果が、進行中の抗１５９抗体の応答を抑 制することだけでなく、特異的記憶Ｂ細胞を不活性化してもはや１０４−ＢＳＡ での攻撃誘発に応答できなくすることにもあると思われる。 このことはすなわち、抑制が特異的Ｂ細胞のレベルで起こり、循環する接合体に 吸収されかくして血清から効果的に除去されつつある抗−１５９抗体によってひ き起こされる単なる見かけ上の抑制ではないということを表わしている。 実際に対照におけるよりも治ゆを受けたマウスにおいて１５９に応答するＢ細胞 が少なかったか否かをテストするため、各グループからの試料マウスの膵臓を、 スポットＥＬＩｓＡ検定によって、抗体分泌細胞について数え上げた。表１２は 、治ゆを受けた動物と対照の動物の間で抗−１５９抗体を分泌する肺臓細胞の数 に大きな差が実際に存在していたことを表わしている。治ゆを受けた動物におい ては、スポット（斑点）の数は無視できるものであったのに対し、一方、対照に おいては多数が発生した。このことは、１５９１゜ｄｅｘ　１゜の投与が１５９ 特異的Ｂ細胞の機能的欠失をひき起こし、従ってこの細胞はもはや特異的抗原で のその後の刺激の時点で抗体分泌細胞へと分化できないということを表わす。 表１２ 個々のマウスからの膵臓を抗１５９抗体を分泌する細胞について数えた。２Ｘ１ ０’の細胞を各ウェルに付加した。 ＮＤ＝測定せず。 佐坪、自己免疫疾患の治療 上述の研究から、外因性抗原に対する進行中の抗体応答を抑制するイムノン技術 の能力は明白である。自然発生的自己免疫プロセスに対するその適用可能性は、 後に続く結果によって立証されている。 自己免疫疾患のモデルは数多く存在するが（多発硬化症のための実験的自己免疫 性脳を髄炎（ＥＡＲ）、実験的自己免疫性筋無力症、慢性関節リウマチのための 膠原誘発性関節炎など）、それらは全て共通の１つのパラダイム的問題を有して いる：すなわち、被験動物において示される症候群が、疾病の誘発のために外因 性抗原の投与を必要とするのである。 数多くのケースにおいて、症状が維持されるためには、連続的に抗原を定期的に 投与することが必要であり、そうしなければ疾病プロセスは衰える。人間におい て自然発生的に起こる自己免疫プロセスに対するこれらのモデルの関連性及び適 用可能性は、明らかでな疾患のモデルが１つ存在する（ヒト全身性エリトマト− デスのＮＺＢ／ＮＺＷマウスモデル−マウス狼癒）。これは自然発生的であり、 その誘発又は維持のために外因性抗原の投与を必要としない；生成される抗体の スペクトルは、ヒト狼癒に見られるものと類似している；症状の発現は糸球体腎 炎と同じで、原発性である；又動物の性別に関しての疾患分布は同じである（雌 は雄に比べ症例が早発で重症である）。自己免疫疾患に対するこの技術の有用性 を実証するのに選択されたのは、この自己免疫モデルである。 マウスの狼癒を患っている動物は、抗ヒストンならびに抗−ＤＮＡの両方の抗体 の産生を示す。予備実験において、これらのマウスにおけるヒストンタンパク質 に向けられた抗体の分布は、Ｈ２Ｏのアミノ末端領域に卓越して制限されている ことがわかった。実際、テストを受けたマウスのうち９５％以上においてこのタ ンパク質の抗原性領域は残基３から１２まで（３および１２を含む）の間にある と呼ばれるペプチドが合成され、６５０００分子量のデキストランに接合された （詳細については、上述の合成の節を参照のこと）。このペプチドは、Ｈ２Ｏの 残基２〜１３と、２つのグルタミン酸と１つのシスティンから成る。生理学的ｐ Ｈでペプチド上の電荷全体を中性にするためにグルタミン酸が含まれ、システィ ンは、接合化学作用のために含まれていた。次に、すでに立証済みのヒストン及 びＤＮＡの両方に対する抗体価でマウスに最終的構成体を与えた。 接合体投与のためのプロトコルは図５２に含まれている。これを見ればわかるよ うに、抑制性接合体を受けたマウス全てにおいて、抗ヒストン抗体価はバックグ ラウンドレベルまで抑制され、一方対照接合体を受けた動物はその抗ヒストンレ ベルにおいて著しい変化を全く示さなかった（又は数多くのケースにおいて実際 的増加を全く示さなかった）。抑制の特異性は図５３に例示されている。ここで は抗ＤＮＡレベルが基本的に不変であるのに対し、抗ヒストン応答が抑制される ことが示されている。循環する抗体価の抑制に加えて、対照又は「治ゆを受けた 」マウスにおける抗ヒストン及び抗ＤＮＡ抗体を分泌するＢ細胞個体群の数え上 げ値は、測定された抗体レベルに匹敵することがわかった。ヒストン特異的抑制 性接合体で処置された動物（これにより９５％以上循環抗体価が減少した）は、 対照動物が我々の標準的プロトコルを用いて計量するにはあまりにも数多いもの である抗ヒストン抗体分泌細胞の個体群を有していた一方で、抗ヒストン抗体を 活発に分泌する検出可能な細胞を全く有していないことがわかった。両方のグル ープ共（対照及び治ゆされたもの）、同等の抗ＤＮＡ分泌細胞ならびに抗体価の 両方を有していた。これらのデータは明らかに、抗原特異的ベースで自然発生時 な進行中の自己免疫応答を抑制するというイムノン技術の能力を例示している。 例１３．フルオレセイン置換された可溶性重合体によるフルオレセイン特異的Ｔ 細胞応答の刺激及び抑制 Ｔ細胞表面抗原レセプタに特異的に結合することのできるハブテンを含む規定の 可溶性重合体分子に対する露呈の後、Ｔ細胞系統の生物学的に関連する応答につ いての測定を行なった。Ｔ細胞系統を用いてこれらの実験において得られた応答 は、イムノンモデルに基づく予想と密に一致していることがわかった。これは、 個々のハブテン化された重合体調製剤に対するＴ細胞の用量一応答挙動及び、刺 激性重合体及び非刺激性（抑制性）重合体が一緒に投与された場合に観察された 用量−阻害挙動の両方について言えることであった。 発見事実は、イムノン理論において暗に意味されている刺激及び競合阻害の一般 的規則が、抗体分子を分泌する細胞を生み出すＢ細胞及び免疫応答の調節におい てさまざまな機能を有するＴ細胞の両方に適用することのできるものであったと いう事実を確認した。 これらの実験において用いられたＴ細胞は、末梢ヒト休止Ｔ細胞の一つのモデル として広く用いられてきたヒトＴ細胞系統（Ｊｕｒｋａｔ）から誘導された。Ｊ ｕｒｋａｔ　Ｔ細胞は、フルオレセイン特異的ヒトＴ細胞抗原レセプタのアルフ ァ及びベータの両方のポリペプチド連鎖をコードする遺伝子でのトランスフェク ションを受けた。このトランスフェクションを受けたＪｕｒｋａｔ系統は、培地 内での抗レセプタ抗体及びフォルボールエステルの組合せといった従来のＴ細胞 活性化体での処置の時点でリンフ才力イン、インターロイキン−２を産生するこ とができたことから、機能性をもつことがわかった。特定の抗原に対するその応 答性についてテストされた場合、結果として得られる変更された（トランスフェ クションを受けた）　Ｊｕｒｋａｔ　Ｔ細胞は、その細胞表面上のトランスフェ クションを受けた抗原レセプタに対し直接可溶性フルオレセイン化重合体を結合 することがわかった。適当な可溶性フルオレセイン化重合体すなわち、多数のフ ルオレセインエピトープを含み高い分子質量をもつものは、Ｔ細胞トランスフェ クシント（形質移入体）の機能的活性化をひき起こした。 これらの可溶性重合体によるＴ細胞の活性化は、２つの異なる検定、すなわち １）Ｔ細胞インターロイキン−２の産生、２）細胞内カルシウムフラックスの産 生のいずれかによって立証された。 比較的小さい分子質量でしかも比較的少ないハプテン基で置換された可溶性重合 体は、トランスフェクションを受けたＴ細胞を活性化せず、それでもさらに大き くさらにハブテン化度の高い重合体によりひき起こされた活性化の潜在的阻害因 子であった。 図５４は、特定のフルオレセイン化された一対の重合体について、上述の実験的 データの代表的なデータを立証している。図５４（ａ）は、１００ｋＤａ以上の 分子質量をもつフルオレセイン置換度の高いフィコール調製物ＦＬ５０−Ｆｉｃ １５０が、ＩＬ−２感受性細胞系統によるトリチウム標識チミジン取込みによっ て測定されるように、トランスフェクションを受けたＪｕｒｋａｔ　Ｔ細胞を活 性化してインターロイキン２を産生じたということを示している。用量一応答刺 激曲線は、前述の類似のマウスＢ細胞研究において観察されたように、鐘形をし ている。 これとは対照的に、同じ図は、類似のエピトープ密度をもつものの分子質量が１ ００ｋＤａをはるかに下回るフルオレセイン置換デキストランＦＬ８−Ｄｅｘ２ １が、匹敵するどの用量においても同じトランスフェクションを受けたＴ細胞を 刺激することができなかったということを示している。 しかしながら、図５４（ｂ）は、トランスフェクションを受けたＴ細胞に対して ２つの重合体が同時に付加されたとき、益々大量の比較的小さな非刺激性重合体 が、比較的大きく刺激性ある重合体の活性化能力を用量依存的に益々阻害するこ とが、明らかにわかるということを示している。 可溶性フルオレセイン化重合体を用いて、トランスフェクションを受けたＴ細胞 について細胞内カルシウムフラックスを測定した時にも、同様な活性化及び阻害 効果が観察された、図５５゜数多くの類似の測定を代表するこの特定の例におい ては、大きく置換度の高い重合体ＦＬ５０−Ｆｉｃ１５０が、高用量（Ｃ）では なく、低用量又は中用量（ａ及びｂ）で付加された時点で細胞内カルシウムフラ ックスの急速な活性化を刺激した。さらに小さいサイズであるが類似のエピトー プ密度をもつ非刺激性重合体ＰＬＩＩ−Ｆｉｃ４６は、刺激性重合体に対する細 胞による応答の欠如をひき起こし、ここでも又競合阻害を実証した（ｄ及びｅ） 。 ＦＩＧ、５ ＦＩＧ、７ ＦＩＧ、８ 一２８◆ ２Ｈ５−Ｃｙｓ−ペプチド　ｍ−ペプチド　−Ｃｙｓ−５−５−Ｃｙｓ−ペプチ ド″二量体化　”　＜７１ ＦＩＧ、９ ポリマー濃度ｍｇ／ｍ１ ＦＩＧ、　１０ ’２−２−（２Ｆ３，２５．−サクシニル）−Ｌ−ンステインＦＩＧ、　ＩＩ ＦＩＧ、　１２ 結合ペプチド置換密度式 ペプチド分子なし／デキサミノ分子 ・・・−・−以下の工程中のデキサミンの損失旦−２−（２Ｆｊ、２旦−サクシ ニル　）−ＯＬ−ネモンステインポリマーＳ、マウス当りのｌｏｇμｇ ポリマーＳ、マウス当りのｌｏｇμｇ ポリマーＮ、マウス当りのｌｏｇμｇ ＦＩＧ、　／９ ポリ？−３ｌｏｇｎｇ／ｍｌ ホ＋）マーＮ、ｌｏｇｎｇ／ｍ１ ＦＩＧ、　２７ Ｆｌ−ＰＶＡｆｉ度ｎｇ／ｍ１ ＦＩＧ、　２２ 時（日） ＦＩＧ、　２３ マウス当りのμｇポリマー ＦＩＧ、　２４ ｍｌあたりのｎｇポリマー ＦＩＧ、　２５ 阻害剤濃度（ｎｇ／ｍ１） ＦＩＧ、　２６ 阻害剤濃度（口ｇ／ｍ１） ＦＩＧ、２７ 時間（日） ＦＩＧ、　２８ 時間（日） 時間（日） ｕ！ＬＬＩ１０ＯＬＬＩ　”＞／ｌｓ６＋　］」−Ｍｕ！ｕＪ１０ＯＬＬ＋　’ ）６１　ｎ１ｊ−ＭＬｌ！ＬＬＩ／ＧＯｕＪ　’　ｌ＞／ｌ９５１　ｎ’ｌｊ− ：！ＦＩＧ、３４ ＦＬ−ＯｖＡ刺激投与、Ｊ、ｌ９ ＦＩＧ、３５ ＰＬ−ＯＶＡ　ｏｎ　Ａｌ（ＯＨ）３の刺激投与量、μｇＦＩＧ、３６ 刺激　刺激　刺激 初回刺激後の時間（日） ＦＩＧ、　３７ ペニシリン Ｈ 担体 ペニシロイル ＦＩＧ、　３９ 治療 時間（日） ８Ｓ＾投与量（μｇ） ＦＩＧ、４２ 注射したＢＳＡポリマーの分子の大きさくダルトン）ＦＩＧ　４４ 時間（日） ＦＩＧ、４５ ＦＩＧ、４６ 注射したタンパク質の分子量の大きさくダルトン）注射したタンパク質の分子量 の大きさくダルトン）ＦＩＧ、４Ｂ ＢＳＡ分子あたりのフルオレセイン螢光ハブテン時間（日） ｒｌｆ’　ｅチー 日 ｒ″ｌＵ６口５ａ ＦＩＧ、　５５ｄ　ＦＩＧ、　５５ｅ 国際調査報告 フロントページの続き （７２）発明者　プロットゲット、ジェームズ　ケー。 アメリカ合衆国、コロラド　８００２１．ブルームフィールド、ウェスト　ワン ハントレッドサード　アベニュ　１０６０３ （７２）発明者　チェロニス、ジョン　シー。 アメリカ合衆国、コロラド　８０２７７、レイクウッド、サウス　ロブ　ウェイ 　１９５０（７２）発明者　カージエンヒユーター、ゲイリーアメリカ合衆国、 コロラド　８０００５．アーバダ、ウェスト　エイティーフォース　ドライブ　 １２６７９ [In addition to novel measurements, this It is also important to know the number of lymphocytes that actively secrete molecules such as Ru. Ideally, the levels of circulating specific antibodies and the tissues that secrete such molecules should be For both lymphocyte numbers, suppression of the ongoing antibody response should cause their decline. It is possible. Subo 129.187-197.1990) allows determination of the number of pancreatic cells actively secreting fluorescein-specific IgG antibodies. Methods for analyzing pooled pancreatic cells from three mice stimulated three times (days 10, 21 and 75) with different amounts of PL-OVA on aluminum hydroxide. When used, a large number of cells were found to secrete anti-FL IgG antibodies in each case (Figure 34). The above is what I received. When cells were analyzed from the pancreas of mice that had undergone curing on days 35 and 95, in each case there was a significant decrease in the number of cells producing anti-Fl,u IgG antibody molecules. were seen (Figure 34), (“cured” rods.) These data indicate that the curing process not only removes relevant freely circulating antibodies from the serum, but also removes such antibody molecules. Most of the four pancreatic cells capable of producing It shows that From the relative absolute values of these two measurements, the degree of inhibition of antibody-producing cells caused by inhibition with PL-Dex was calculated, and the resulting The calculated values are shown in FIG. The above data indicate that treatment with inhibitory PL-Dex resulted in a very substantial suppression of the specific immune response. From the data in Figure 35 and the additional data shown, the experimental conditions and measured Two distinct trends can be identified that relate the degree of suppression measured; 1. the measured suppression increases as the dose of immunogen that produced an immune response decreases; and , 2. The measured inhibition was used for the spot-BLISA assay. As the amount of epitope (fluorescein) coupled to the (i.e., the percentage inhibition measured at 0.08 FL per gelatin is greater than when measured at 0.2 FL per gelatin). More measurements (not shown) show that a wide range of haptens within the assay for anti-F1 antibody-producing cells in both the spot-ELISA assay for antibody-producing cells and the ELSA assay for serum levels of IgG antibodies are shown. Overall substitution density This trend proved to be true. The above two trends are the ones whose appearance is most effectively inhibited by the above-mentioned inhibitory polymers. The results are consistent with the conclusion that the antibodies with the highest affinity for hapten (PL) are those with the highest affinity for hapten (PL). Since allergic and autoimmune disease states have often been correlated with the presence of small amounts of high-affinity antibodies, this may be relevant in medically relevant situations. This is a promising observation for future use. B. High levels of anti-FL IgE responses are responsible for many allergic effects and can activate mast cells that release histamine when exposed to antigenic substances. This is due to the presence of IgE class antibodies. A highly specific biological assay for the presence of such antibodies of the IgE class is the passive cutaneous anaphylaxis (PCA) test, in which a diluted number of antibodies from the animal under analysis is Microliters of serum are injected into the skin of the test animal. One or two hours later, the test animals are injected intraperitoneally with the relevant antigen in saline solution containing a soluble dye. In areas of the skin where IgE antibodies of the injected serum against the antigen are present, mast cells A visible dye color appears as a result of the activation of the vesicles, after which mediators are released and the blood Causes ductal leakage. Injected blood that will induce an observable skin response The maximum dilution factor of the serum is IgI! It is a measure of antibody titer. It is usually detectable down to nobrum levels of specific 1gE antibodies per ml of undiluted serum. This biologically significant PCA test is shown in Figure 32 above. When applied to serum from a portion of mice subjected to sea urchin stimulation and suppression, the results shown in Figure 36 were obtained. Figure 36 shows that only after substantial levels of IgB anti-fluorescein antibodies have developed. It has been demonstrated that a single injection of inhibitory Fl-Dex reduces serum levels of such IgE antibodies to very low levels for several weeks. (In fact, the level was so low that it was impossible to distinguish it experimentally from the background level of the measurement). Moreover, mice treated in this way are immune to boosting with repeated doses of antigen. Control mice showed a very substantial increase in their Ig B serum titers when receiving the booster, whereas they had total tolerance. Injections of the inhibitory polymer appeared to cause a long-lasting ``cure'' of a proven allergic-type response in the mice. In summary, there is a strong ongoing Tm cell-dependent immune response to fluorescein hubten. Experimental tests have been conducted of the ability of suppressive forms of fluoresceinated polymers to suppress or "cure" fluorescein. The results are clinically relevant and specific to Habten. Dramatic and prolonged increase in serum anti-hapten [gG antibody levels], number of pancreatic lymphocytes secreting anti-hapten [gG antibodies; C3 Serum Antipenicillin IgE Reduction Penicillin allergy has been linked to penicillin (or its related compounds) for a number of diseases. The most clinically disastrous drug allergy remains the treatment of choice. Lugie. (2, but many f) the person is allergic to penicillin (i.e. exhibits an immediate hypersensitivity reaction) or is exposed to penicillin over a long period of time. This happens while receiving phosphorus therapy. Described below are data showing that the immune response to penicillin can indeed be specifically suppressed using this technique. The following experimental details apply to the study described in this example. Animals: CAF (BALB/cxA) female mice were obtained from Cumerland Farms, Cllnton, TN and were approximately lθ weeks old when first immunized. Holtxmar Co, Madison, II? Male SD rats weighing 320-380 g were obtained. Chemicals: Bovine serum albumin (BSA) fraction V from Miles Laboratories. Obtained from Inc. Penicillin G (sodium salt) and crystalline elderberry from Sigma Chemical Corporation, St. Louis, MO. Ovalbumin (OVA) was obtained from Calbiochem, Los Angeles, CA, P-chloromercribenzoate (PCMB) was obtained from Calbiochem, Los Angeles, CA, Evans Blue was obtained from f! astlnan KO (!&, purchased from ROCheSter, N, Y, and ethylenediamine (BDA) was ordered from MCB Manufacturing Chemicals, CINCINNATI, OH.Habten-Carrier Conjugate BSA or OVA at room temperature p) 110. Penicillary within 2 COm to 0.5M of 0 Benzyl benicilloyl-bovine serum albumin (BPO-BSA) and benzyl benicilloyl-ovalbumin (BPO-OVA) were prepared by incubating with G (benzylpenicillin) (Nakagawa et al, [nt, Archs, AIIergY Apply , I+omuno 1, 6 3:212 (1980)). Different incubation times will result in different epi Created taupe density. The number of habten per carrier is indicated by a subscript. That is, OVA substituted with four BPO groups is BPO, -0VA. The degree of substitution was determined by a modified penama ldate test (Parker, C.W., Immunol. Methods of Epidemiology and Immunochemistry, Will Law+s and Chase eds, Vol. I, p. 133° Academic Press, NY (1967). Add 1 ml of 2XIO-''M PCMBO in 0.05M carbonate, pH 9.2. Approximate benicilloyl concentration should be 2-4 x lO-M. Mix and add Readings are taken at 285 mμ after standing at room temperature for 10 minutes (ε = 2.38X10'). Correction for uncombined PCMB (0.038 at final concentration of 2,82X 10'M) and dilution (protein The incremental increase after the original concentration (91%) is due to the pena+oaldate and benicilloyl groups formed from PCMB. Careful size fractionation of the linear PA by gel filtration as described above. Benzylbenicilloyl-polyacrylamide (BPO-PA) was prepared by incubating PA with ethyldiamine (BDA) at 50 °C for 90 min followed by extensive dialysis to obtain highly substituted EDA-PA. is formed as a result It will be done. This is then peppered by the method used to prepare the protein conjugate. Conjugated with Nishirin. The resulting hubtened polymer is then processed to achieve relative size homogeneity. The fraction was fractionated by gel filtration until the total amount was reached (see Figure 37). Immunization: Two groups of 4 mice each received 1 mg of At(OH), 1 Mg of BPOI-OVA in 0.10 ml of 0.01 M Tris, 0.15 M NaCl buffer, pH 8.3. was administered intraperitoneally. - 2.5 weeks after next injection were given a booster injection of 3 μg of BPO,-0VA on 1 mg of AI(OH)s. - Approximately 3.5 months after the next immunization, mice were re-challenged with 3 μg of BPO, -0VA on log AI(OH)s. Inhibition = One of the above groups of 4 mice was tested in phosphate buffer solution (0, OIM phosphate, 0.15 M NaCl, pH 7.4 in PBS) of 0.25!11 received an intraperitoneal injection of 1 mg of BPO-PA. This polyacrylic Polyamide has an approximate molecular weight of 40,000 (determined by equilibrium ultracentrifugation), Approximately 25 BPO groups were substituted per lyacrylamide molecule. Previous studies have shown that this BPO-PA preparation is non-immunogenic at all doses. Assay: IgB content was determined by a modified passive cutaneous anaphylaxis (PCA) assay (Ovary, Int. Archs. Allergy Appl LI+o+own, 3:293 (1953)). Equal volumes of serum from mice within each group were pooled and rats were injected intracutaneously with a 0.1 ml volume of diluted serum. After 2 hours, 4 mg BPOI-BSA in 0.5 ml PBS for 1 h+H Injected intravenously (i, v, The animals were euthanized, skinned, and the titer (reciprocal of the highest dilution yielding lesions greater than 5 m+n in diameter) was determined. Mice receiving AI(OH), on gel (7) BPO, -0VA injections developed anti-BPO IgB responses (Figure 38) as measured by the PCA assay. This anti-PO response is the murine counterpart of human penicillin allergy. Four mice received 1 mg of BPO hubtenized polyacrylamide (BPO-PA). Received a caries-suppressing dose of injection. Within one week after receiving a suppressive dose of BPO-PA, the test group Serum levels of anti-BPO IgB within the loop decreased by more than 98% (Figure 38a), whereas levels of anti-0VA IgH remained constant (Figure 38b). sand That is, after suppression, the test group's response to BPO-butene was significantly lower than that of the control group. It was less than 1/80 of the response of the sample. Approximately 2.5 months after the test group received its suppressive dose of BPO-PA, both groups received an intraperitoneal injection of 3 μg of BPO, -0VA3 on AI(OH)s in the lnH. received a booster immunization. Mice in the control group responded even louder than the initial response. had strong anti-BPO responses, whereas mice in the test group did not respond to the "booster" injection (Figure 38a). Thus, the suppression induced by BPO-PA is not only rapid (within - weeks) but also persists for several months. Furthermore, this renders the mice unresponsive to additional exposure to BPO haptens. Tolerate epidemics. D. Utilization of titre-limited cyclodextrin-based conjugates as inhibitory constructs. Ba1b/c mice were immunized and then plated on aluminum hydroxide to elicit high titers of IgG anti-Fl antibodies. Boosters were given twice with adsorbed Fl-BSA. this The mice were divided into groups and treated with three different doses of a valence-limited scaffold with seven FITC groups (CI-0374) as described in Example IH above; The cells were also treated with a 70,000 Dalton dextran substituted with 60 FITC groups (CI-0323) at a dose shown to have optimal inhibitory properties in previous experiments. Another group was immunized with buffer alone as a control. mouse this At intervals after these treatments, the sera were bled and assayed by ELISA for IgG anti-F1 antibodies as described in the previous example. The value-limited scaffold is It is clear that a dose-dependent, long-lasting suppression of the anti-FL response similar to that induced by the chytran construct can be induced (see Figure 39). Example 10. T Cell-Dependent Antibody Responses to Proteins and Protein Oligomers The assumption of the immunological model of immune responsiveness is that a single copy of each potential epitope monomeric protein molecules containing only - should not be immunogenic when administered in monomeric soluble form. However, these molecules When administered in combined form or as soluble or insoluble aggregates or absorbed onto adjuvants by some other process in the body, may be immunogenic when polymerized in the form of a microarray. Immunogenicity of Polymeric BSA: Determination of Anti-BSA IgM We first describe the results obtained from studies of polymerized BSA. As was the case in the haptenated dextran study described above, anti-BSA 1gM serum levels rose rapidly, peaking at about 68 days, and then plateaued. It was found that the level of Figure 40 shows that soluble highly polymerized BSA (7O-tner J containing 70 BSA monomers) is able to increase IgM antibodies even at very low doses. whereas monomeric BSA reaches detectable 1 gM levels for BSA. This indicates that a fairly high dose is required to achieve this. Comparing data from a series of BSA polymers of different molecular weights shows that Therefore, the immunogenicity measured by the 1 gM level at day 68 was maximal at higher molecular weights. It was found that all molecular weights had a strong dose dependence in °C, although the temperature increased rapidly. Karu. Immunogenicity of Polymeric BSA: Determination of Anti-BSA IgG Notes on Soluble Polymers of BSA By day 14 post-shot, a substantial isotype class switch occurred, with anti-BSA! gG antibodies exist for several combinations of antigen dose and molecular mass. It turns out that When the BSA polymer was injected in multiple small doses, the response had a high dependence on the molecular weight of the BSA polymer. Figure 43 illustrates an experiment in which mice were injected with 1 μg, 10 μg, or 100 μg of BSA polymer in saline three times over 30 days. As with single injections, anti-B SA IgG serum levels were strongly dependent on dose and polymer size. Figure 43 shows that monomeric BSA is less effective in producing anti-BSA IgG responses even after repeated injections in saline at doses up to 100 μg. In contrast, preparations containing polymers of substantial size are highly effective. It was. This observation was confirmed when the total number of consecutive injections was increased to 5 on a monthly basis as illustrated in Figure 44. Figure 44 shows a trend that was evident in the previous figures, namely that a significant amount of antibody is soluble when small doses are administered. This further exemplifies the trend towards only the polymeric form of BSA. It is likewise clear that proteins with very high levels of polymers can be immunogenic even in very small doses (1 μg) in the absence of adjuvant when administered repeatedly. Polymer OVA (7) Immunogenicity: Anti-0VA IgM obtained with polymerized BSA Results very similar to those described above were obtained when using polymerized ovalbumin OVA as the antigenic substance. For very high levels of polymerization of OVA and monomer OV/' both injected in saline. The first-order response is shown in FIG. Polymeric OVA (7) Immunogenicity: When OVA polymerized with anti-0VA IgG glutaraldehyde is size fractionated and the individual fractions are injected three times at monthly intervals at several different doses, the immune response is is strongly dependent on the size and dosage of the OVA polymer. It was found that (Fig. 46). The variation in response with dose and polymer size is roughly comparable to that seen for the BSA polymer in Figure 42. Shortly after antigen administration, for 1 mg of polymerized BSA or polymerized OVA. Comparing the first-order 1 gM responses (Figure 47) shows a substantial level of similarity. Ru. Both figures together show an increase in immunogenicity as polymerization increases. Fluorine was added onto the polymerized protein to determine the immune response to Habten. Resein was coupled to BSA polymer at a number of different substitution levels and the immune response was determined after several injections as shown in Figure 48. The results demonstrate that the Habten response was of the desired IgG isotype. This increases with increasing degree of substitution, giving approximately 5 fluoresceins per BSA monomer or a total of 100 fluoresceins per BSA 20-mer. It reached its peak at This then dropped rapidly to very low levels with increasing substitution. On the other hand, the immune response to BSA itself is associated with approximately five haptens. It remains relatively constant with increasing fluorescein substitution until addition, at which point it falls rather surprisingly similarly rapidly. This is potentially exciting. of polymerized proteins with a type of peptide epitope useful for This indicates that there is also a suitable replacement level. The construction of adjuvant-free vaccines with maximum immunogenicity using this type of chemistry is being considered. From the above results, the following conclusions can be drawn: 1) Polymeric BSA and OVA administered without adjuvant significantly reduce [gM and IgG anti-protein Stimulates a qualitative response. 2) The immunogenicity of these polyproteins increases as protein diversity increases. and increase. 3) Immunogenicity of polyproteins is strongly dose dependent, with immunogenicity increasing with increasing dose. Example 11. Suppression of antibody responses to peptides from exogenous antigens and autoimmune antibody responses to epitopes on endogenous proteins The following materials and methodologies are described below. B a1b/cv mice were obtained from either Dawley, Indiana-polis, IN. These mice were used at 8-10 weeks of age. Immunization Protocol - To raise IgG antibodies (Abs), mice were injected once intraperitoneally with 10-50 μg of peptide-BSA conjugate adsorbed on aluminum hydroxide. Thereafter, test bleeds were collected many times and the anti-peptide IgG Ab titer was measured. To test the immunogenicity of peptide-dextran conjugates, various Mice were injected intraperitoneally with a 100 μg dose of dextran backbone conjugated with peptides at a uniform substitution ratio. Bleeds were collected at weekly intervals and levels of IgM and IgG peptide-specific Abs in serum were measured (Figure 49). Are there any conflicting instructions? The inhibitory peptide-dextran conjugate was administered in the following manner: 1. A dose of IO and 100 μg was injected. The doses of 1μg and 1101t were injected intravenously, whereas the higher doses were administered intraperitoneally (“cure” treatment). Subsequent maintenance doses were administered at weekly intervals. ELISA Assay - Antibody titers were determined by a standard solid phase ELISA assay. Microtiter plates (1+nmunolon Il, Dyn-atech Labs, Alexandria, Va.) were coated with peptide-gelatin conjugate at 0.1 μg/well at 4°C. After blocking the plate with PBS/gelatin, Various antiserum dilutions were added and incubated for 2 hours at room temperature. Wash the plate and replace antibody binding with horseradish peroxidase-conjugated isotope. Detection was performed using type-specific antigen (Kirkegaard and Perry Labs, Gai-thersburg, MD) followed by ABTS substrate. Data are expressed as OD4°11 of ABTS product. Antibodies directed against the linker region were detected using irrelevant peptide-gelatin preparations and these readings were subtracted from those for specific binding. The first peptide selected for study was a glutamic acid-alanine-leucine-alanine sequence (EALA using a single letter amino acid code) followed by a peptide sequence glycine-alanine-glycine-arginine-glycine-asparagi It was a six-fold repeat of phosphoric acid-serine-proline-alanine-amide. This peptide is hereinafter referred to as (EALA). Defined EALA-dextran conjugates were synthesized on 84000 MW dextran (EALA-Dexs4), which was confirmed to be non-immunogenic. Using these zygotes [! The ongoing anti-EALA-IgG response elicited by ALA-BSA was suppressed. Forty-six days after the injection of EALA-BSA, these mice were divided into two groups, one of which received 1. One group received EALA-deXs+ with IO and increasing doses of dextran backbone of 100 μg, and another group received three injections of buffer only. 3 days later and then Thereafter, mice were bled at 3-day intervals until their anti-EALA IgG titer showed any Serum was tested to see if it showed a decrease in Figure 50 shows that EALA-dews 1 prevented the ongoing rise in Ab levels in untreated mice. It clearly shows that. Low levels persisted for at least 21 days. At this point, the same procedure was performed to see whether the low responses of the suppressed mice could be effectively completely destroyed. Another treatment was performed using the same regimen. By administration of EALA-deX*4 Although the response did not decrease further, this response remained at a low level for at least an additional 14 days, whereas that of control mice still appeared to increase. It was maintained at For the second study, different peptides were selected that have been extensively studied in the field of immunology. This peptide, called 159, represents residues 331-339 of chicken ovalbumin (OVA). Residues 323-339 of this protein The peptide, here referred to as 104, consisting of 104 is the dominant epitope on OVA that can be recognized by helper T cells, especially in H2'' mice. H2') when injected into mice, a high 1gG Ab response is rapidly obtained. Furthermore, when 104 was arrayed on BSA, precipitated on aluminum hydroxide, and injected into mice, an extremely vigorous antibody response was seen. Interestingly, Dext Approximately 40-50% of the antibody responses to 104, sequenced either on Ran or on BSA, are characterized by the C-terminal 10 amino acids represented by 159. I was able to do it. The system is then analogous to more complex antigens (such as proteins) where short, linear sequences of amino acids are recognized due to the large ratio of antibodies generated to the total antigen. Using this model, we can further explore how complex systems respond to defined epitopes. We were able to demonstrate the ability to specifically and selectively suppress the response. Initial studies designed to better characterize this system revealed that peptide 159 was not immunogenic when arrayed on 65,000 MW of dextran, as predicted by the immunological model. I made it. However, this peptide is highly effective against B cells, as the BSA conjugate generates a superior antibody response to 159. Therefore, it can be recognized. Moreover, as mentioned above, most of the antibodies raised by the 104 conjugate were bound directly to 104-gelatin in the ELISA assay. Both competition assays use free 159 to inhibit the binding of anti-104 antibodies to 159 as shown. Figure 51 demonstrates the ability to specifically suppress the portion of the 104 response directed against the 159 epitope. IgG antibodies were raised against 104 by injecting Balb/c mice with 104-BSA adsorbed on aluminum. high High titers were increased for both 104 and 159 (Figure 51). Is it an immune injection? After 40 days (day 0 in the figure), a group of eight mice was given dextrose. Run 40,000 min conjugated with 159 at a ratio of 10 moles of peptide per mole of peptide. 1 μg, 10 μg and 100 μg of either dextran (i.e. 159..- deX+.) or saline were injected. Mice were then bled on day 3 and at 7 day intervals thereafter and assayed for responses to both 159 and 104. Figure 51 shows the post-cure response and shows that although the response to 159 decreased dramatically immediately after treatment, antibody titers virtually recovered to control levels within 14 days. Ru. The response to 104 in treated mice was the same decrease as the response to 159. It followed a pattern of decrease and recovery, with 159 decreasing to about 9% of pre-healing levels on day 3, whereas it only decreased to about 60% of its pre-healing response. In other words, about 40% of the responses to 104 are 1591°-dext. , indicating that this portion of the 104 response is directed against an epitope within the 159 sequence. In fact, up to 40% of the 104 responses were just successfully completed with soluble 159 in the solution phase competition assay (data not shown). The cure was then repeated as before, but this time using 200 μg as the maximum dose. Furthermore, subsequent administration of the inhibitory conjugate maintains chronic suppression of the 159 response. A dose of 200 μg was given at −weekly intervals to see if it persisted. Figure 5.1 shows that this second cure was again basically complete, compared to 159 measured after 7 days. This was comparable to the decrease seen after the first cure (7 days after the first cure the response was 13% of the pre-cure level; 7 days after the second healing, it was 10% of the pre-healing level). Furthermore, the response to 159 remained suppressed throughout the next 40 days when 1591°-dex 4° was injected intraperitoneally at weekly intervals. Injections were then stopped and antibody responses were monitored for an additional approximately 30 days. The response is the titer those that had a tendency to increase just to approximate the decreasing antibody levels of mice. It was found that the cells remained in a suppressed state (Fig. 51). At this point, mice were again treated with 1 μg, 10 μg, and 100 μg of 159-dex (day 77), followed by an intraperitoneal boost with 104-BSA as well as control mice. Antibody responses in control mice were substantially (as expected) boosted The antibody responses of the cured mice did not show significant changes from prechallenge levels. It is clear that the cured mice are able to withstand this challenge. Therefore, 159. The effect of -dex 1° suppresses the ongoing anti-159 antibody response. The purpose of this study is not only to inhibit specific memory B cells, but also to inactivate them so that they are no longer able to respond to challenge with 104-BSA. This means that suppression occurs at the level of specific B cells and is inhibited by anti-159 antibodies that are being absorbed by circulating conjugates and thus effectively cleared from the serum. This shows that this is not just an apparent suppression. To test whether there were indeed fewer B cells responding to 159 in the cured mice than in the controls, the pancreas of sample mice from each group was enumerated for antibody-secreting cells by spot ELIsA assay. . Table 12 shows that there was indeed a large difference in the number of lung cells secreting anti-159 antibodies between the cured and control animals. Cured animal odor In the control case, the number of spots was negligible, whereas in the control case, the number of spots was negligible. A large number of cases occurred. This indicates that administration of 1591°dex 1° causes a functional deletion of 159 specific B cells, so that these cells can no longer differentiate into antibody secreting cells upon subsequent stimulation with specific antigen. represents something. Table 12 Pancreata from individual mice were counted for cells secreting anti-159 antibodies. 2×10′ cells were added to each well. ND = not measured. Satsubo, Treatment of Autoimmune Diseases From the studies described above, the ability of Immunon technology to suppress ongoing antibody responses to exogenous antigens is evident. Its applicability to naturally occurring autoimmune processes is substantiated by subsequent results. Many models of autoimmune diseases exist, including experimental autoimmune encephalomyelitis (EAR) for multiple sclerosis, experimental autoimmune myasthenia, and collagen-induced arthritis for rheumatoid arthritis. ), they all have one paradigmatic problem in common: the syndrome exhibited in the test animal requires the administration of exogenous antigen for induction of disease. In many cases, continued periodic administration of antigen is necessary for symptoms to be maintained or the disease process will decline. human smell The relevance and applicability of these models to naturally occurring autoimmune processes There is one disease model with clear potential for use (the NZB/NZW mouse model of human systemic lupus erythematosus death - mouse lupus). It is spontaneous and does not require the administration of exogenous antigen for its induction or maintenance; the spectrum of antibodies produced is similar to that seen in human lupus; the onset of symptoms is glomerular kidney Like inflammation, it is primary; and the distribution of the disease in terms of animal sex is the same (cases occur earlier and are more severe in females than in males). It is this autoimmune model that was chosen to demonstrate the utility of this technology for autoimmune diseases. Animals suffering from murine lupus exhibit production of both anti-histone and anti-DNA antibodies. In preliminary experiments, the distribution of antibodies directed against histone proteins in these mice was found to be highly restricted to the amino-terminal region of H2O. In fact, over 95% of mice tested The antigenic region of the protein lies between residues 3 and 12 (inclusive), and a peptide called 2000 was synthesized and conjugated to a 65,000 molecular weight dextran (see the Synthesis section above for details). (see ). This peptide consists of residues 2-13 of H2O, two glutamic acids and one cysteine. Glutamate is included to neutralize the overall charge on the peptide at physiological pH, and cysteine was included for conjugation chemistry. Next, the already established histone and Mice were given the final construct with antibody titers against both the DNA and the DNA. A protocol for conjugate administration is included in FIG. 52. You'll understand when you see this In all mice receiving the inhibitory conjugate, anti-histone antibody titers were was suppressed to round levels, whereas animals receiving control zygotes had their anti-histone levels suppressed. showed no significant change (or in many cases no real increase) in the level of The specificity of inhibition is illustrated in FIG. 53. here It has been shown that anti-histone responses are suppressed while anti-DNA levels are essentially unchanged. In addition to suppressing circulating antibody titers, enumeration of B cell populations secreting anti-histone and anti-DNA antibodies in control or “cured” mice The increase values were found to be comparable to the measured antibody levels. Animals treated with histone-specific inhibitory conjugates (which reduced circulating antibody titers by more than 95%) showed that control animals had anti-histones that were too numerous to quantify using our standard protocols. While they had a population of antibody-secreting cells, they were found to have no detectable cells that actively secreted anti-histone antibodies. both gurus Both controls (control and cured) had comparable anti-DNA secreting cells and antibody titers. These data clearly illustrate the ability of Immunon technology to suppress naturally occurring and ongoing autoimmune responses on an antigen-specific basis. Example 13. Stimulation and Suppression of Fluorescein-Specific T-Cell Responses by Fluorescein-Substituted Soluble Polymers Following exposure to defined soluble polymer molecules, including Habten, which are capable of specifically binding to T-cell surface antigen receptors, T-cell lineages are stimulated and suppressed. biologically relevant responses. The measurements were carried out. The responses obtained in these experiments using T cell lines were found to be in close agreement with predictions based on the immunomodel. This demonstrates the dose-response behavior of T cells to individual hubtenized polymer preparations and the stimulation This was true for both the dose-inhibition behavior observed when aggressive and non-irritating (inhibitory) polymers were administered together. The findings indicate that the general rules of stimulation and competitive inhibition implicit in the immunological theory play a role in the regulation of B cells and immune responses that give rise to cells that secrete antibody molecules. This method can be applied to both T cells, which have various functions. I confirmed that fact. The T cells used in these experiments were derived from a human T cell line (Jurkat) that has been widely used as a model for peripheral human resting T cells. Jurkat T cells are fluorescein-specific human T cell antigen receptor alpha Transfection with genes encoding both alpha and beta polypeptide chains. tion was received. This transfected Jurkat strain was able to produce lymphocytes and interleukin-2 upon treatment with conventional T cell activators, such as a combination of anti-receptor antibodies and phorbol esters, in the culture medium. It was found that it has functionality. its response to specific antigens When tested for responsiveness, the resulting modified (transfected) Jurkat T cells have transfected cells on their cell surface. It was found that the soluble fluoresceinated polymer binds directly to the antigen receptor that receives the reaction. A suitable soluble fluoresceinated polymer, i.e. Those with high molecular mass containing luorescein epitopes caused functional activation of T cell transfectants. Activation of T cells by these soluble polymers was determined by two different assays: 1) production of T cell interleukin-2; 2) production of intracellular calcium flux. Proven by any of the raw. Soluble polymerization with relatively small molecular mass and substituted with relatively few hapten groups The body does not activate the transfected T cells and they still grow larger. Furthermore, the potential inhibition of activation caused by highly hubtenated polymers He was a child. Figure 54 establishes representative data of the experimental data described above for a particular fluoresceinated polymer pair. Figure 54(a) shows that FL50-Fic 150, a highly substituted Ficoll preparation with a molecular mass of 100 kDa or more, was activated by tritium-labeled thymidine uptake by an IL-2 sensitive cell line. activates transfected Jurkat T cells as measured by This indicates that they have become sexualized and produced interleukin-2. dose-response The sharp curve is bell-shaped, as observed in similar mouse B cell studies described above. In contrast, the same figure shows that fluorescein-substituted dextran FL8-Dex21, with similar epitope density but with a molecular mass much lower than 100 kDa, produced the same transfected T cells at any comparable dose. This indicates that it was not possible to stimulate the However, Figure 54(b) shows that when the two polymers were added simultaneously to transfected T cells, an increasingly large amount of the relatively small non-stimulatory polymer Increasingly inhibiting the activation ability of coalescence in a dose-dependent manner This shows that it is clearly understandable. Similar activation and inhibition effects were observed when intracellular calcium flux was measured in transfected T cells using soluble fluoresceinated polymers; Figure 55 is representative of a number of similar measurements. In this particular example In this case, the highly substituted polymer FL50-Fic150 increases intracellular calcium flux when added at low or medium doses (a and b) rather than at high doses (C). stimulated rapid activation of A similar epitope, albeit smaller in size, PLII-Fic46, a non-irritating polymer with again demonstrating competitive inhibition (d and e). FIG, 5 FIG, 7 FIG, 8 -282H5-Cys-Peptide m-Peptide -Cys-5-5-Cys-Peptide "Dimerization" <71 FIG, 9 Polymer concentration mg/ml FIG, 10 '2-2-(2F3,25.-succinyl)-L-instein FIG, II FIG, 12 Bonded peptide substitution density formula Peptide molecule None/dexamino molecule...--Dexamine loss during the following steps-2-(2Fj, 2-sacsi )-OL-Nemon Stain Polymer S, log μg per mouse Polymer S, log μg per mouse Polymer N, log μg per mouse FIG, /9 Poly? -3 logng/ml H+)mer N, logng/ml FIG, 27 Fl-PVAfi degree ng/ml FIG, 22:00 (Sun) FIG, 23 μg polymer per mouse FIG, 24 ng polymer per ml FIG, 25 Inhibition Agent concentration (ng/ml) FIG, 26 Inhibitor concentration (g/ml) FIG, 27 Hour (day) FIG, 28 Hour (day) Time (day) u! LLI10OLLI ”＞/ls6+ ]”-Mu! uJ10OLL+’)61 n1j-MLl! LLI/GouJ ’ l>/l951 n’lj- :! FIG, 34 FL-OvA stimulating dose, J, l9 FIG, 35 PL-OVA on Al(OH)3 stimulating dose, μgFIG, 36 Stimulus Stimulus Stimulus Time after initial stimulation (days) FIG, 37 Penicillin H Carrier Penicilloyl FIG, 39 Treatment time (days) 8S＾Dose (μg) FIG, 42 Molecular size of injected BSA polymer (Dalton) FIG 44 Time (day) FIG, 45 FIG, 46 Molecular size of injected protein (Dalton) ) Molecular weight of the injected protein Dalton) FIG, 4B Fluorescein fluorescein time per BSA molecule (days) 72) Inventor Plotget, James Kay. United States, Colorado 80021. Bloomfield, West One. 10603 Huntred Third Avenue (72) Inventor Chelonis, John See. South Rob Way, Lakewood, Colorado 80277, United States 1950 (72) Inventor Karzienhuter, Gary United States, Colorado 80005. 12679 West Eighty-Fourth Drive, Arvada

Claims (43)

【特許請求の範囲】[Claims] １．望ましくない免疫応答に苦しむ哺乳動物においてこの免疫応答を特異的に抑 制する方法において、 ｉ）薬学的に許容される担体に結合された望ましくない免疫応答をひき起こす抗 原の抗原決定基に相応する少なくとも１つの個別の抗原的に認識可能な成分を含 む構成体を調製し、そしてｉｉ）この構成体を前記望ましくない免疫応答の抑制 が行なわれるほどの量で前記哺乳動物に対して投与する、ことを含み、前記担体 に結合された前記成分の数及び前記担体上の前記成分の間隔は、前記構成体が前 記成分に対する免疫応答を惹起せず、前記決定基を認識する免疫適格細胞上のレ セプタについて前記抗原と直接競合するようなものであり、かくして前記構成体 が前記望ましくない免疫応答を特異的に抑制する方法。1. Specifically suppressing immune responses in mammals suffering from undesirable immune responses. In the method of controlling i) an anti-inflammatory agent that causes an undesirable immune response conjugated to a pharmaceutically acceptable carrier; containing at least one distinct antigenically recognizable component corresponding to the original antigenic determinant. and ii) using the construct to inhibit said undesirable immune response. administering to the mammal in such an amount that the carrier The number of said components attached to said structure and the spacing of said components on said carrier are such that said structure is A receptor on immunocompetent cells that recognizes the determinant without eliciting an immune response against the component. such that it directly competes with said antigen for the receptor and thus said construct. A method for specifically suppressing said undesirable immune response. ２．望ましくない免疫応答に苦しむ哺乳動物においてこの免疫応答を特異的に抑 制する方法であって、 ｉ）薬学的に許容される担体に結合された望ましくない応答をひき起こす抗原の 抗原決定基に相応する少なくとも１つの個別の抗原的に認識可能な成分を含む構 成体を調製し、そしてｉｉ）この構成体を前記望ましくない免疫応答の抑制が行 なわれるほどの量で前記哺乳動物に対して投与すること、を含み、前記担体に結 合された前記成分の数は、前記決定基を認識する免疫適格細胞上の前記成分に対 するレセプタに結合した時に抗体形成を刺激するのに充分な前記レセプタの集合 体を形成するのに必要な数よりも少なく、前記構成体が前記免疫適格細胞上の抗 原−レセプタ集合体の形成を競合的に阻害し、かくして前記望ましくない応答を 特異的に抑制する方法。2. Specifically suppressing immune responses in mammals suffering from undesirable immune responses. A method of controlling i) of an antigen that causes an undesired response conjugated to a pharmaceutically acceptable carrier; a construct comprising at least one distinct antigenically recognizable component corresponding to an antigenic determinant; ii) the construct is subjected to suppression of said undesired immune response; administering to the mammal in such an amount that the carrier binds to the carrier. The number of said components combined is relative to said component on immunocompetent cells that recognize said determinant. a population of said receptors sufficient to stimulate antibody formation when bound to said receptors; the constructs are present in smaller numbers than necessary to form cells, and the constructs are competitively inhibits the formation of proto-receptor aggregates, thus suppressing the undesired response. How to specifically suppress it. ３．望ましくない免疫応答に苦しむ哺乳動物においてこの免疫応答を特異的に抑 制する方法であって、 ｉ）薬学的に許容される担体に結合された望ましくない応答をひき起こす抗原の 抗原決定基に相応する少なくとも１つの個別の抗原的に認識可能な成分を含む構 成体を調製し、そしてｉｉ）この構成体を前記望ましくない免疫応答の抑制が行 なわれるほどの量で前記哺乳動物に対して投与する、ことを含み、構成体は、該 構成体の前記成分が前記決定基を認識する免疫適格細胞上のこの成分に対するレ セプタに結合した時に抗体産生を刺激するのに充分な前記レセプタの集合体を形 成するのに必要な量小サイズよりも小さく、この構成体が前記免疫適格細胞上の 抗原−レセプタ集合体の形成を競合的に阻害しかくして前記望ましくない免疫応 答を特異的に抑制する方法。3. Specifically suppressing immune responses in mammals suffering from undesirable immune responses. A method of controlling i) of an antigen that causes an undesired response conjugated to a pharmaceutically acceptable carrier; a construct comprising at least one distinct antigenically recognizable component corresponding to an antigenic determinant; ii) the construct is subjected to suppression of said undesired immune response; administering to said mammal in an amount such that said composition said component of the construct recognizes said determinant on immunocompetent cells; form an aggregate of said receptors sufficient to stimulate antibody production when bound to said receptors. This construct is smaller than the amount needed to form a microorganism on the immunocompetent cell. Competitively inhibit the formation of antigen-receptor aggregates and thus reduce the unwanted immune response. How to specifically suppress the answer. ４．前記抗原が、アレルギ反応をひき起こす外因性抗原である、請求の範囲第１ 項に記載の方法。4. Claim 1, wherein the antigen is an exogenous antigen that causes an allergic reaction. The method described in section. ５．前記抗原が、自己免疫疾患をひき起こす内因性抗原である、請求の範囲第１ 項に記載の方法。5. Claim 1, wherein the antigen is an endogenous antigen that causes an autoimmune disease. The method described in section. ６．前記抗原が異種タンパク又は組織である、請求の範囲第１項に記載の方法。6. 2. The method of claim 1, wherein the antigen is a heterologous protein or tissue. ７．前記構成体が非免疫原性である、請求の範囲第１項に記載の方法。7. 2. The method of claim 1, wherein said construct is non-immunogenic. ８．前記抗原がＴ細胞依存性抗原である、請求の範囲第１項に記載の方法。8. 2. The method of claim 1, wherein the antigen is a T cell dependent antigen. ９．前記免疫適格細胞がＢ細胞である、請求の範囲第１項に記載の方法。9. 2. The method of claim 1, wherein the immunocompetent cell is a B cell. １０．前記免疫適格細胞がＴ細胞である、請求の範囲第１項に記載の方法。10. 2. The method of claim 1, wherein the immunocompetent cells are T cells. １１．前記構成体が、前記抗原に対する免疫応答を刺激する物質を実質的に含ま ない形で投与される、請求の範囲第１項に記載の方法。11. said construct substantially comprises a substance that stimulates an immune response against said antigen; 2. The method of claim 1, wherein the method is administered in the form of １２．前記担体に結合された前記半分の数が１〜２０である、請求の範囲第１項 に記載の方法。12. Claim 1, wherein the number of halves bound to the carrier is from 1 to 20. The method described in. １３．前記構成体が約１５００００ダルトン未満の分子量を有する、請求の範囲 第１項に記載の方法。13. Claims wherein said construct has a molecular weight of less than about 150,000 Daltons. The method described in paragraph 1. １４．哺乳動物に投与された時点で抗原に対する望ましくない免疫応答を抑制す る構成体を調製する方法において、（ｉ）前記抗原の抗原決定基に相応する少な くとも１つの個別の抗原的に認識可能な成分を、薬学的に許容される担体分子に 結合し、かくして前記構成体を形成し、そして ｉｉ）結合段階（ｉ）の後で存在する免疫刺激性分子から離れるように前記構成 体を精製する段階、 を含み、前記担体に結合された前記成分の数及び前記担体上の前記成分の間隔は 、前記構成体が前記成分に対する免疫応答を惹起せず、前記決定基を認識する免 疫適格細胞上のレセプタに対し前記抗原と直接競合するようなものである方法。14. suppresses unwanted immune responses to antigens when administered to mammals. A method for preparing a construct comprising: (i) a small amount corresponding to an antigenic determinant of said antigen; at least one individual antigenically recognizable component on a pharmaceutically acceptable carrier molecule. combine, thus forming said construct, and ii) said configuration away from the immunostimulatory molecule present after the binding step (i); The stage of purifying the body, , the number of said components bound to said carrier and the spacing of said components on said carrier are , the construct does not elicit an immune response against the component and has an immune system that recognizes the determinant. A method that involves direct competition of said antigen for receptors on competent cells. １５．哺乳動物に投与された時に抗原に対する望ましくない免疫応答を抑制する 構成体を舞製する方法において、（ｉ）前記抗原の抗原決定基に相応する少なく とも１つの個別の抗原的に認識可能な成分を、薬学的に許容される担体分子に結 合し、かくして前記構成体を形成し、そして （ｉｉ）結合段階（ｉ）の後で存在する免疫刺激性分子から離れるように前記構 成体を精製する、 ことを含み、前記担体分子に結合された前記成分の数が、前記決定基を認識する 免疫適格細胞上の前記成分に対するレセプタに結合する時に、抗原産生を刺激す るのに充分な前記レセプタの集合体を形成するのに必要な数よりも少ない、調製 方法。15. suppresses unwanted immune responses to antigens when administered to mammals A method for producing a construct comprising: (i) at least one group corresponding to an antigenic determinant of said antigen; both conjugate one individual antigenically recognizable moiety to a pharmaceutically acceptable carrier molecule. together, thus forming said construct, and (ii) said structure is directed away from the immunostimulatory molecule present after the binding step (i); Purify the adult body, wherein the number of moieties attached to the carrier molecule recognizes the determinant. stimulates antigen production when binding to receptors for said components on immunocompetent cells. The number of preparations is less than that required to form a population of said receptors sufficient to Method. １６．哺乳動物に投与された時に抗原に対する望ましくない免疫応答を抑制する 構成体を調製する方法において、（ｉ）前記抗原の抗原決定基に相応する少なく とも１つの個別の抗原的に認識可能な成分を、薬学的に許容される担体分子に結 合し、かくして前記構成体を形成し、そして （ｉｉ）結合段階（ｉ）の後で存在する免疫刺激性分子から離れるように前記構 成体を精製する、 ことを含み、前記構成体は、その前記成分が前記決定基を認識する免疫適格細胞 上の前記成分に対するレセプタに結合された時に、抗原産生を刺激するのに充分 な前記レセプタの集合体を形成するのに必要な最小サイズよりも小さい、調製方 法。16. suppresses unwanted immune responses to antigens when administered to mammals A method for preparing a construct comprising: (i) at least one of the following: both conjugate one individual antigenically recognizable moiety to a pharmaceutically acceptable carrier molecule. together, thus forming said construct, and (ii) said structure is directed away from the immunostimulatory molecule present after the binding step (i); Purify the adult body, said construct comprises an immunocompetent cell, said component of which recognizes said determinant. sufficient to stimulate antigen production when bound to receptors for said components on a preparation method that is smaller than the minimum size necessary to form an aggregate of said receptors. Law. １７．前記成分が前記担体分子に共有結合されている、請求の範囲第１４項に記 載の方法。17. 15. The method according to claim 14, wherein said component is covalently bonded to said carrier molecule. How to put it on. １８．前記担体分子が、多糖類重合体、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコ ール又はポリペプチドである、請求の範囲第１４項に記載の方法。18. The carrier molecule may be polysaccharide polymer, polyacrylamide, polyvinyl alcohol. 15. The method according to claim 14, wherein the method is a polymer or a polypeptide. １９．前記成分がペプチド又はタンパク質、炭水化物、核酸又は脂質である、請 求の範囲第１４項に記載の方法。19. The claim is that the component is a peptide or protein, carbohydrate, nucleic acid or lipid. The method described in item 14 of the scope of the request. ２０．前記成分は、前記結合段階（ｉ）に先立って、前記担体分子に対する結合 がそれを通して行なわれるような保護されたチオール含有基と誘導体形成される 、請求の範囲第１４項に記載の方法。20. Said component is bound to said carrier molecule prior to said binding step (i). is derivatized with a protected thiol-containing group through which , the method according to claim 14. ２１．前記担体分子に対する前記チオール含有基の前記結合が、酸加水分解又は 還元を受けにくい共有結合の形成を介して行なわれる、請求の範囲第２０項に記 載の方法。21. The bonding of the thiol-containing group to the carrier molecule is performed by acid hydrolysis or The method according to claim 20, which is carried out through the formation of covalent bonds that are not susceptible to reduction. How to put it on. ２２．前記チオール含有基が、前記抗原成分内で一級アミンと、Ｎ−アセチル− Ｓ−Ｎｐｙｓ−Ｌ−システイン−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル又はＮ− （スクシニル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル）−Ｓ−Ｎｐｙｓ−システ アミンを反応させることによって形成される、請求の範囲第２１項に記載の方法 。22. The thiol-containing group has a primary amine and an N-acetyl-containing group within the antigenic component. S-Npys-L-cysteine-N-hydroxysuccinimide ester or N- (succinyl-N-hydroxysuccinimide ester)-S-Npys-system The method of claim 21, formed by reacting an amine. . ２３．前記結合段階（ｉ）の後、前記構成体のアリコートを酸加水分解に付し、 この加水分解産物の中に存在するＳ−スクシニル化された成分の量を測定する段 階がさらに含まれる、請求の範囲第２２項に記載の方法。23. After said binding step (i), subjecting an aliquot of said construct to acid hydrolysis; A step for measuring the amount of S-succinylated components present in this hydrolysis product 23. The method of claim 22, further comprising a floor. ２４．前記成分がペプチド又はタンパク質であり、前記成分がアミノ酸残基のス ルフヒドリル基を介して前記担体分子に結合されている、請求の範囲第１４項に 記載の方法。24. The component is a peptide or a protein, and the component is a chain of amino acid residues. according to claim 14, wherein the Method described. ２５．前記残基がシステイン、ホモシステイン又はシステアミン残基である、請 求の範囲第２４項に記載の方法。25. The claim is that the residue is a cysteine, homocysteine or cysteamine residue. Scope of Claim 24. ２６．前記半分がスペーサ分子を介して前記担体分子に結合されている、請求の 範囲第１４項に記載の方法。26. of claim 1, wherein said half is bonded to said carrier molecule via a spacer molecule. The method according to scope item 14. ２７．前記担体分子及び前記構成体が、生理学的に許容される緩衝液中に可溶性 である、請求の範囲第１４項に記載の方法。27. the carrier molecule and the construct are soluble in a physiologically acceptable buffer; 15. The method according to claim 14. ２８．前記成分と結合する官能基を導入するべく前記結合段階（ｉ）に先立って 前記担体分子が修節される、請求の範囲第１４項に記載の方法。28. prior to said bonding step (i) to introduce a functional group to be bonded to said component; 15. The method of claim 14, wherein the carrier molecule is modified. ２９．前記官能基が一級アミンである、請求の範囲第２８項に記載の方法。29. 29. The method of claim 28, wherein the functional group is a primary amine. ３０．前記成分がサッカリド部分を含み、前記結合段階（ｉ）に先立ってこのサ ッカリド部分は、前記結合がそれを通して行なわれる１つの末端一級アミノ基が 上に形成されるような条件の下でジアミンと反応させられる、請求の範囲第１４ 項に記載の方法。30. said component comprises a saccharide moiety, and said saccharide moiety is added prior to said binding step (i). The calido moiety has one terminal primary amino group through which the bonding takes place. Claim 14 is reacted with the diamine under conditions as formed above. The method described in section. ３１．前記成分がサッカリド部分を含み、前記結合段階（ｉ）に先立ってこのサ ッカリド部分は、前記結合がそれを通して行なわれる１つの遊離末端スルフヒド リル基が上に形成されるような条件の下でシステアミン又はその塩と反応させら れる、請求の範囲第１４項に記載の方法。31. said component comprises a saccharide moiety, and said saccharide moiety is added prior to said binding step (i). The calido moiety has one free terminal sulfhydride through which the linkage takes place. reacted with cysteamine or its salt under conditions such that a lyl group is formed on it. 15. The method of claim 14, wherein: ３２．前記担体分子がデキストランであり、前記結合段階（ｉ）に先立ち前記担 体分子がデキサミンに変換される、請求の範囲第１４項に記載の方法。32. said carrier molecule is dextran, and said carrier molecule is dextran prior to said binding step (i). 15. The method of claim 14, wherein the body molecule is converted to dexamine. ３３．前記デキサミンが、前記結合段階（ｉ）に先立ってガンマーマレイミド− ｎ−ブチリルデキサミンに変換されている、請求の範囲第３２項に記載の方法。33. The dexamine is combined with gamma maleimide prior to the binding step (i). 33. The method of claim 32, wherein the n-butyryldexamine is converted to n-butyryldexamine. ３４．均質性が得られるまでサイズ分画された構成体の調製物において、この均 質な調製物の各構成体が、薬学的に許容される担体分子に結合された望ましくな い免疫応答をひき起こす抗原の抗原決定基に相応する少なくとも１つの個別の抗 原的に認識可能な成分を含んでおり、 前記担体分子に結合された前記成分の数及び前記担体分子上の前記成分の間隔は 、前記構成体が前記成分に対する免疫応答を惹起せず前記決定基を認識する免疫 適格細胞上のレセプタに対して前記抗原と直接競合するようなものである、構成 体調節物。34. This homogeneity is achieved in the preparation of size-fractionated constructs until homogeneity is achieved. Each component of the quality preparation contains an undesirable component linked to a pharmaceutically acceptable carrier molecule. at least one individual antibody corresponding to an antigenic determinant of the antigen that elicits a strong immune response; Contains originally recognizable components, The number of said components bound to said carrier molecule and the spacing of said components on said carrier molecule are , an immune system in which the construct recognizes the determinant without eliciting an immune response against the component; composition such that it competes directly with said antigen for receptors on competent cells. Body conditioning. ３５．前記成分がスペーサ分子を介して前記担体分子に結合されている、請求の 範囲第３４項に記載の構成体調製物。35. of claim 1, wherein said component is bound to said carrier molecule via a spacer molecule. A construct preparation according to scope 34. ３６．前記スペーサ分子がオメガアミノカルボキシル酸である、請求の範囲第３ ４項に記載の構成体調製物。36. Claim 3, wherein the spacer molecule is an omega aminocarboxylic acid. 4. Construct preparation according to item 4. ３７．前記担体分子がタンパク質である、請求の範囲第３４項に記載の構成体。37. 35. A construct according to claim 34, wherein the carrier molecule is a protein. ３８．前記構成体がタンパク質オリゴマを含む、請求の範囲第３４項に記載の構 成体。38. 35. The construct of claim 34, wherein the construct comprises a protein oligomer. Adult. ３９．前記構成体が組換えにより産生された融合タンパク質である、請求の範囲 第３８項に記載の構成体。39. Claims wherein the construct is a recombinantly produced fusion protein. The construct according to paragraph 38. ４０．前記構成体が、ストレパビジン上に四価で配列されたビオチニル化された タンパク質を含んでいる、請求の範囲第３４項に記載の構成体調製物。40. The construct was biotinylated and tetravalently arranged on strepavidin. 35. A construct preparation according to claim 34, comprising a protein. ４１．前記成分はスクシニル化された硫黄を含有するアミノ酸又はアミノ酸誘導 体を介して前記担体分子に結合されている、請求の範囲第３４項に記載の構成体 調製物。41. The component is a succinylated sulfur-containing amino acid or an amino acid derivative. 35. A construct according to claim 34, which is linked to the carrier molecule via the body. Preparation. ４２．前記アミノ酸又はアミノ酸誘導体がシステイン、システアミン又はホモシ ステインである、請求の範囲第４１項に記載の構成体調製物。42. The amino acid or amino acid derivative may be cysteine, cysteamine or homocysteine. 42. A composition preparation according to claim 41, which is a stain. ４３．前記担体分子がシクロデキストリン又は修正されたシクロデキストリンを 含む、請求の範囲第３４項に記載の構成体調製物。43. The carrier molecule is a cyclodextrin or a modified cyclodextrin. 35. A construct preparation according to claim 34, comprising:
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