JPH06504115A - 免疫組織化学のための自動的組織染色 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫組織化学のための自動的組織染色 本発明は免疫組織化学に関するものであり、より詳細にいうならば、組織切片又 は細胞標本の自動染色装置に関するものである。

組織化学は動物及び植物組織の化学組成及び構造を研究する生化学の一分野であ る。それは顕微鏡、Ｘ線回折及び放射性トレサー法を使用して骨、血液、筋肉及 びその他の動物及び植物組織の細胞組成及び構造を研究することを含む。

免疫組織化学は、標識抗体及びその他のリガンド（核酸プローブを含む）を用い て分子（マーカー）の細胞内分布を直接見るために有用である。標識は酵素、ラ ジオアイソトープ、および蛍光物質を含む。この方法を全細胞に適用して例えば リンパ腫（白血球癌）を確認することができ、又はこの方法を組織切片に適用し て例えば癌診断をすることかできる。

特異的（又は−次）抗体は直接標識できる。別法として、そしてよりしばしば、 標識をつけた二次抗体用いて第一の抗体に特異的に結合させる。また、問題の（ 酵素的）マーカーを発現させ、又は非特異的効果を除去するために、組織の前処 理か必１　要であることもある。

目に見えるシグナルを増幅するために多数の方法か開発されたが、増幅には方法 の工程か増加することか多い。結局、酵素標識の場合には、標識部位に着色生成 物を生じる基質が使用される。その後周囲組織を逆染色してコントラストをつけ る。そこで、染色を行うための大部分のプロトコルは、種々の時間のインキュベ ーションを多数含み、その間には使用ずみの試薬を除去するための洗浄段階かあ る。

少量の試薬（５０〜２００マイクロリツター）を適用して組織を十分に覆うよう に、また洗浄段階には使用ずみの試薬を完全に除去し、しかもスライドから組織 がたまたま失われるのを防ぐように、各操作にはかなりの注意が必要である。こ うして、手順中に多数のスライドが含まれる場合には、この方法は大きな労力並 びに長時間を要し、再現性が欠如することもある。

組織染色のために現在用いられている手動的方法は、すべての操作を手で行う熟 練技術者を必要とする。

先ず第一に、ガラス標本スライドをトレー上に担持せしめる。染色が周囲温度よ り高い温度で行われる場合には、特殊にデザインされた、高湿度を保持する温度 制御されたテンプレートを用いて加熱するのか普通である。

スライドを、手動計量分配ボトルからの緩衝液流て洗う。その後スライドを垂直 に置いて液体をしたたらせて液体を切り、試料周囲をペーパータオル材料で拭く 。

液体が組織サンプルを覆って広がるように、目で見て配置した手動的ピペッタ− から、生化学的作用物質か供給される。短い有効寿命をもつ化学試薬は標準ピペ ッタ−によってバイアル中で手動的に混合される。

これらの操作の順序及び時間のコントロールはストップウォッチとノートバット を用いて手動で行われる。

このような手動プロセスは本来不正確で時間がかかり、高価につくことは明らか である。このようなプロセスを自動化する試みがこれまでに行われた。このよう な試みの詳細を以下に記す。

（１）ストロス（５ｔｒｏｓｓ、　Ｗ、　Ｐ、　）、ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ、 　Ｍ、　）、メイソン（Ｍａｓｏｎ、Ｄ、Ｙ、） Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｐａｔｈｏｌ、　Ｊａｎ　１９８９４２巻（１）、１０６〜 １１２ページこれらの著者は現存の組織処理機器［Ｈｉｓｔｏｋｉｎｅｔｔｅ　 Ｅ７３２６　：ブリティッシュ　アメリカンオプティカル　コーポレーション（ Ｂｒｉｔｉｓｃｈ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　０ｐｔｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ ｎ）］を改良し、組織の免疫組織化学的染色を半自動的に行えるようにした。ス ライドをラックに置き、それを試薬タンクに浸す。試薬タンクは４力月まで繰り 返し用いられる。この方法は（ＡＰＰＡＡＰ）アルカリ性ホスファターゼ染色法 のみに適用され、−次抗体又は基質の適用を自動化してはいない。

（２）ブリがティ（Ｂｒｉｇａｔｉ、Ｄ、Ｊ、）　、バジョン（Ｂｕｄｇｅｏｎ 。

し、Ｒ，）、アンガー（Ｕｎｇｅｒ、　Ｅ、　）　、ケブラー（Ｋｏｅｂｌｅｒ 、Ｄ、）　、りごｔＰ権ｆ−聞誼を陀杓出す新短のカバースリ・ツブ装置を報告 才モ（Ｃｕｏｍｏ、　Ｃ，）　、ケネディ（Ｋｅｎｎｅｄｙ、Ｔ、）　、ペルト モ（Ｐｅｒｄｏｍｏ、　Ｊ、　Ｍ、　） Ｊ、　Ｈｉｓｔｏｔｅｃｈｎｏｌ、　１１巻（３）、１９８８．１６５〜１８３ ページこれらの著者は免疫細胞化学のための最初の自動的方法を開発したと主張 している。その方法は三軸ロボット　スライドシステムを用いて、スライドのラ ックを試薬間を移動させるものである。スライドは対になっていて、試薬が毛細 管作用によってそのスライド間の隙間を充填する。そのシステムは完全な免疫染 色法並びに現場ハイブリダイゼーションを行うことかできると主張され、Ｆｉｓ ｃｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏ、　（Ｕ、Ｓ、Ａ、）から売り出されて いる。

（３）スターク（５ｔａｒｋ、　Ｅ、　）　、ファルティナート（Ｆａｌｔｉｎ ａｔ、Ｄ）　、フオンデルフエヒト（Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｆｅｃｈｔ、Ｒ，）Ｊ、 ［ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１０７巻（１９８８）　、８９ 〜９２ページこれらの著者は、３０ものスライドか円形トレー上に置かれ、円形 トレーは急速回転して試薬を除去することができるという装置を記載している。

抗体又はその他の溶液は標準プラスチック注射器によってスライド上に滴下され る。

この方法は、それか高価な試薬を多量用い、−次抗体段階を自動化しないという 大きな欠点をもっている。

（４）メーヴエン（Ｍｅｈｖｅｎ、Ｌ、）　（Ｍｅｄ、　Ｌａｂ、　Ｗｏｒｌｄ 　１９８９年２月号、４５〜４６ページ）は、スライドとカバースリップとの間 ＾マ二ノロ′え＃婢す２マニｌＶ實稗キ懇−ｔ−プ　開虹マ化＾智−を辿Ｓ問弾 −Ｃ＋ヒソ　山　ソ　栢ｆｉＸ　ｖノ／−″　八　ノ　ノ　ノ　武Ｉ　Ｃ惟口し た。試薬は、自動ピペット及びＸ−スライド　デバイスを用いて円形トレー上の バイアルからカバースリップの漏斗部分へ移される。１０の基礎的方法プログラ ムを用いて、種々の（９まて）−次抗体て２０のスライドを自動的に試験するこ とかできる。この機器はシャントン　サイエンティフイク（５ｈａｎｄｏｎＳｃ ｉｅｎｔｉｆｉｃ）　（英国）から“カデンザ（Ｃａｄｅｎｚａ）　”という商 品名で売り出されている。

（５）最近リブショウ（Ｌｉｐｓｈａｗ）　（米国）は、パーオキシド法によっ てスライドのバッチを自動染色する機器を発表した。

そのシステムは、ロボットのアームによってスライドのラックを試薬浴の間を移 動せしめるというものである。その機器の使用は同一方法を受けるスライドに限 られ、その機器は一次抗体を加えるためには作用でなく、その他の試薬を大量に 使用する。

本発明の目的は、組織又は細胞標本の免疫組織化学的染色のための改良装置を提 供することである。

本発明は、サンプル支持手段、洗浄液を上記サンプル上に供給するための洗浄手 段、上記サンプルをクリーニングするための清浄化（ｃｌｅａｒｉｎｇ）手段、 及び作用物質を上記サンプル上に供給するための作用物質供給手段を含んで成る 、免疫組織化学的サンプル処理用装置を提供する。本発明は、少なくとも１枚円 形トレーによって構成されるスライド支持手段と、上記スライド支持手段に対し て動くようになっており、液体を上記支持手段上のスライドに供給するようにな っているヘッドアセンブリ一手段とを含んで成る、組織サンプルを免疫組織化学 的に処理するための装置をも提供する。

本発明はさらに、表面に液体を噴霧するためのデバイスを提供し、上記デバイス は上記液体か通過するための孔をもったボディーと、上記ボディーに位置し、上 記液の流れを概して上記孔に沿った方向から概して環状の流れに変える手段とを 含み、そこには液体出口の近くに位置する渦巻室かあり、渦巻室は、液体が上記 液体出口を通って上記室を去る前に、概して環状の流れを概して同心的な流れに 変えるようになっている。

本発明の好適実施態様を以下に添付の図を参照して詳細に説明する。図において ： 図１は自動組織染色装置の斜視図である：図２は、概ね図１に類似の装置の細部 の斜視図である。

図３は、クリアノズルの正面図である：図４は、図３のノズルの側面図である； 図５は、図３のノズルの一部分の背面図である：図６は、図３のノズルの底面図 である：図７は、図３の線Ａ−Ａに沿った断面図である：図８は、噴霧ノズルの 側面図である。

図９は、噴霧ノズルボディの端面図である：図１０は、図９の線Ａ−Ａに沿った 断面図である；図１１は、図１０の線Ｂ−Ｂに沿った断面図である：図１２は、 噴霧ノズル末端キャップの斜視図である；図１３は、図１３のキャップの正面図 である：図１４は、図１３のキャップの部分断面側面図である：図１５は、図１ ３のキャップの背面図である；図１６は、プラグの端面図である； 図１７は、図１６のプラグの側面図である。

先ず最初に図１及び図２を参照すると、自動組織染色機（１０）は、水平円形ト レー（１６）を示す開いた位置に蝶番で開く部分（１４）を有するボディー（１ ２）と、供給ヘッドアセンブリー（１８）と、クリアノズル（２０）と、噴霧ノ ズル（２２）とを有する。

図１に示したものと少し異なるモデルである図２に示されるように、円形トレー （１６）は、概ね垂直の軸の周囲に回転するように作られ、さらに、スライド（ ２４）を単一水平面上の外周近くに担持し、試薬などを入れた容器を円形トレー （１６）の軸に向けて担持するように作られている。

供給ヘッドアセンブリー（１８）はレール（２８）、（３０）上を、円形トレー の直径を横切るように移動するようになっており、円形トレーの回転運動とヘッ ド（１８）の並進移動との組み合わせによりノズル（２０）、（２２）が材料を スライド（２４）のどの部分にでも、又はどの容器（２６）にでも向けることか できる。第三（洗浄液配給）ノズルもヘッドアセンブリー（１８）に取り付けら れるのが好適である。各ノズルがアセンブリーに対して垂直運動可能であるのが 好適である。

装置（ｌＯ）は、種々のエレクトロメカニカル　システム（図示されていない） を用いて、自動的制御されたシーケンスを行わしめることができる。装置（ｌＯ ）はキーバッド（３２）及びディスプレイ（３４）によって運転され制御される 。

円形トレー（１６）は、多分熱空気を用いて、好適には下から加熱されるように なっている。好適には、支持台上にあって、スライドの下に位置する熱水か利用 される。好適には水の自動温度調節機能がついている。

ヘッドアセンブリー（１８）はまたスライド洗浄設備（図示されていない）を有 する。それはディスペンサーからの緩衝液又は洗浄液を、コントロールされた仕 方で上記第三ノズルから、ディスペンサー下に位置する円形トレー（１６）上の スライド（２４）に供給する。好適にはヘッド（１８）はスライド軸に沿って動 き、液体をスライド上に均一に分配する。好適には緩衝液は加圧された保存ボト ルからバルブ−オン−オフ−コントロールで供給される。

ヘッドアセンブリー（１８）はスライド清浄（ｃｌｅａｒ）設備も含む。それは 前に述べたようにスライド（２４）から不要になった液体を除去するために用い られる。このようにスライドを清浄にするためには、図３から図７までに記載さ れているノズル（３６）が用いられる。このノズル（３６）は図１の一般的ノズ ル（２０）の場所にある。

クリアノズル（３６）のボディ（３８）は、広がった供給末端（４０）を有すし 、その上方にはプレート（４２）がある。

ボディ（３８）内の孔（４４）は、末端（４０）の空間（４６）とつながってい る。出口孔（４８）からはエアー“カーテン”がスライド（２４）に向かって出 ている。好適には加圧されたマニホルドからの空気がノズル（３６）に供給され る。

ノズル（３６）はヘッド（１８）によってスライド（２４）の軸にそって移動し 、出口孔（４８）からの空気流又はエアカーテンかスライド（２４）表面の液を スライド軸に沿って押し流し、スライド末端から押し出す。

ヘット（１８）はまた図８から図１７までの噴霧ノズル（５０）を用いる生化学 的作用物質供給設備を有する。このノズル（５０）は図１の一般的ノズル（２２ ）の場所にある。

噴霧ノズル（５０）は主部（ｍａｉｎ　ｂｏｄｙ）　（５２）と末端キャップ’ 　（５４）とプラグ（５６）とを有する。主部（５２）には、主部（５２）を末 端キャップ（５４）に固定するために用いられるｏ　−レット付き部分（５８） がある。主部（５２）にはフロー分割チャンネル（６０）及びフェルール　シー ル（６２）もあり、後者は噴霧ノズルを作動させるための真空源、ピペッタ−な どに接続するためのものである。

末端キャップ（５４）は内部円周唇（６４）をもち、これは主部（５２）とぴっ たり合っている。キャップは軸方向に位置する出口孔をもち、その後に渦巻室（ ６８）がある。

図１３（背面図）には、液体を渦巻室（６８）に向かわせ（矢印を見よ）、その 流れが確実に室軸と同軸になるように働く構造体（７０）か示される。

プラグ（５６）にはスピゴット（７２）と位置決め突起（７４）がある。

図８の組み立てられたノズル（５０）では、液流の方向は矢印で示される。ノズ ル（５０）は小旋回噴射室効果をもち、ここでは流れが軸に同心的になるような 仕方で、液体が加圧下で円形室（６８）に押し出される。スプレー（噴霧液）は 中央出口（６６）を通って出る。

噴霧ノズル（５０）の構造及び操作は、抗体（試薬サブグループとしての）が活 性を喪失せずに表面に噴霧されるようになっている。

抗体の蛋白質は従来の噴霧ノズルには普通よく起こる剪断力に感じ易い。この結 果抗体は変性し、したがって活性を失う。

その理由で、抗体の噴霧は不可能と考えられてきた。

この噴霧ノズル（５０）を用いる場合には、抗体か出口（６６）から無傷で出て いくように流体の通路ができているように見える。

スプレーヘッドの“デッドスペース”を最小にすること、及び液体の速度及び流 れを最適にして、供給位置からスライド（２４）の成る面積をおおうために正し い噴霧範囲及び噴霧パターンか得られるようにするのか好適である。好適にはそ の面積はスライドの総面積より小さく、総スライド面積の４／１ないし４／３ま での範囲がより好適であり、総スライド面積の３／ｌかより好適である。ノズル （５０）はスライド（２４）から１０ないし１００ｍｍ上方に位置するのか好適 であり、スライド（２４）から約３０ｍｍ上方に位置するのかより好適である。

さらに、ノズル（５０）の１回のスプレーの総液量か５０ないし２００マイクロ リツトルであるのか好適である。このような少量を選ぶのは、スライド面積を均 一な液層でおおうためである。

ノズル（５０）の種々の部分（５２，５４，５６）は、好適には射出成形プラス チック材料から形成され、ノズルはフェルール（６２）を経てピペッタ−供給ヘ ッドの供給導管に連結するのか好適である。好適にはピペッタ−は電気／電子ビ ペツターンステムであって（図示されていない）、注射器に作動して液体を容器 （２６）　（保存バイアル）から引き出し、その液体をノズル（５０）からスラ イド（２４）に供給する。

ピペッタ−はコントロールされた垂直運動によって液体を容易に獲得てきる；す なわちそれは、注射器か液体保存バイアル（２６）内に入るように下がる：それ から必要量の液体をシステム内に引き込むように作動する：注射器はコントロー ルされた仕方で上方に動き、保存バイアル（２６）から引き上げられる。

いくつかの化学的作用物質は使用直前に混合する必要かある：それらは混合後の 有効寿命は短いためである。これらの物質を混合するためにはピペッタ−システ ムを利用し、１作用物質をその保存バイアルから引き出し、それを第二の作用物 質を入れた保存バイアルに供給する。その後混合溶液を引き上げ、既述のように スライド上に供給する。

前述のように、装置（ｌＯ）は自動的組織染色プロセス又はスライド洗浄／乾燥 コーティングプロセスを提供する。

好適には６つの運転モードがある： プロセスモード・ユニットは自動的にプログラムを行う。

ロードモード：運転者はスライド／試薬を速やかにユニットに積み込む。

プログラムモード：運転者はプロセスモードに使用する特殊なプロトコールプロ グラムを決める。

アンロードモード　サイクルか完了したとき、運転者は処理したスライドを取り 出す。

セルフクリーンモード・ユニットは作業面を自動的に洗い流す。

セルフテストモード　ユニットは試験前チェックを行う。

装置は、プログラムされたプロトコルの組み合わせを最高ＩＯまで遂行すること かてきる。その装置は２０枚までのスライドを処理することかできる。

装置は電源バッテリーバックアップ機能をもち、処理か適切な段階でうまく切れ るようになっていることか好ましい。

本発明は古い手動的方法に代わって、あまり熟練していない運転者でも運転でき る自動操作を行うことかできる装置を提供するものと考えることができる。

１大− 補正音の写しく翻訳分）提出書（特許法第１８４条の８）平成０５年０１月１４ 日

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．サンプル支持手段と、洗浄液を上記サンプルに供給する洗浄手段と、上記サ ンプルをクリーニングするための清浄化手段と、作用物質を上記サンプルに供給 する作用物質供給手段とを具える免疫組織化学的サンプル処理装置。
2. ２．上記サンプルがスライド上に載せられたサンプルである請求の範囲第１項記 載の装置。
3. ３．上記サンプル支持手段が上記スライドを支持するための平らな表面をもつ回 転可能の円形トレーである請求の範囲第２項記載の装置。
4. ４．上記洗浄手段と清浄化手段と作用物質供給手段とが、上記支持手段に対して 移動可能のヘッドアセンブリーに配設されている先行せる請求項のいずれかの項 に記載の装置。
5. ５．上記清浄化手段が、上記スライドにエアカーテンを提供するノズルを含んで 成る請求の範囲第４項記載の装置。
6. ６．上記作用物質供給手段がピペッターシステムと連結している請求の範囲第４ 項記載の装置。
7. ７．上記作用物質が試薬又は生化学的作用物質である先行せる請求項のいずれか の項に記載の装置。
8. ８．回転可能の円形トレーで構成され、最低１枚のスライドを支持するスライド 支持手段と、上記スライド支持手段に対して移動するように、そして上記支持手 段上のスライドに液体を供給するように構成されているヘッドアセンブリーとを 含んで成る免疫組織化学的組織サンプル処理装置。
9. ９．表面に液体を噴霧するためのデバイスであって、上記液体が通過するための 一つの孔をもったボディと、上記ボディ内に位置し、上記液体の流れを概ね上記 孔に沿った方向からほぼ環状の流れに変えるための手段とを含み、液体出口の近 くに渦巻室があり、その渦巻室は、液体が液体出口を通って渦巻室を出る前に上 記のほぼ環状の流れをほぼ同心的な流れに変えるように構成されているデバイス 。
10. １０．上記ボディが、直径の広がる環状流れを順次に作り出すようになっている プラグ手段と、上記環状流れを上記渦巻室に向け、ほぼ同心的な流れを作り出す 手段とを含んで成る請求の範囲第９項記載のデバイス。
11. １１．上記液体出口が上記渦巻室と同軸である請求の範囲第９項又は第１０項記 載のデバイス。
12. １２．方向づけ手段が、上記環状流を遮断し、その流れの液体を上記室円周に対 して接線方向に供給するように構成されている最低一つのチャンネルである請求 の範囲第９項ないし第１１項のいずれかに記載のデバイス。