JPH06504199A - ｐＨ範囲にわたり分子荷電が低度に異なる突然変異体酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称：ｐＨ範囲にわたり分子荷電が低度に異なる突然変異体酵素 発明の分野 本発明は酵素、例えばそれらの生産のために適するｒＤＮＡ法、突然変異遺伝子 、ベクターおよび突然変異体、およびにそれらの生産に有用な形質転換微生物、 ならびに例えばそれらを含有する酵素的洗剤と掃除用組成物を含めてのそれらの 応用に関するものである。

より詳細な態様において、本発明は改良酵素およびその製造および使用、特に改 良プロテアーゼに関する。そのような改良プロテアーゼは、遺伝子的（例えばｒ ＤＮＡ法による）に改良された、祖先から系統を受け継いだ微生物由来のものを 含む。

より詳細な態様において、本発明は改良酵素の調製および使用に関し、特に改良 されたアルカリセリンプロテアーゼ、特に細菌および真菌起源のものに関する。

すなわち以下に記載する本発明は、とりわけプロテアーゼを生産するための技術 を提供し、それは例えばバチルス・ズプチルスブロテアーゼおよび他のズブチリ シンプロテアーゼであり、ならびにさらにそのような酵素の遺伝子的改良体およ びそのような酵素の洗剤および掃除用組成物中での使用を提供する。

発明の背景 酵素および特にプロテアーゼは、望ましくないタンパク質様の汚れなどを除去す るため、または除去を容易にするために洗剤および掃除用組成物中に２０年以上 の間使用されて来た。これらの目的のために使用される酵素の中で商業的に最も 重要なものはプロテアーゼであり、特にズブチリシンプロテアーゼである。

プロテアーゼは洗剤産業において２０年以上使用されて来たが、良好な洗濯結果 の要因となる物理的または化学的特性は未だ正確に知られていない。最近使用さ れている酵素は、天然からのプロテアーゼを単離し、そしてそれらを洗剤配合物 に試す事により見出された。

セリンプロテアーゼは酵素の一種として知られており、ズブチリシンを含むが、 これはペプチド結合を加水分解し、活性部位に必須なセリン残基が特徴である（ Ｗｈｉｔｅ、　ＨａｎｄｌｅｒおよびＳｍ１ｔｈ“生化学の理論（Ｐｒｉｎｃｉ ｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）”　第５版、マグロー−ヒル出版 社、ニューヨーク’ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ　Ｂｏｏｋ　Ｃｏ、　Ｎｅｗ　Ｙｏ ｒｋ）、　１９７３゜２７１−２７２頁）。

既知のセリンプロテアーゼの分子量範囲は２５．０００から３０．０００である 。それらはジイソプロピル−フルオロリン酸塩により阻害されるが、メタロプロ テアーゼとは対照的にエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）には耐性である（し かしそれらはカルシウムイオンにより高温で安定化されるが）。それらは単なる 末端エステルを加水分解し、これはやはりセリンプロテアーゼである真核性キモ トリプシンとも活性において同様である。換言すれば、アルカリプロテアーゼは セリンプロテアーゼの至適高温性ｐＨ９，０から１１．０を反映する（総説とし て、Ｐｒ１ｅｓｔの１９７７、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖ、　 ４１ニア１１−７５３を参照）。

ズブチリシンはグラム−陽性細菌または真菌により生産されるセリンプロテアー ゼである。ズブチリシンの広範な種類が同定されており、少なくとも８つのズブ チリシンについてアミノ酸配列が決定されている。これらはバチルス株からの６ つのズブチリシン、すなわち１６８ズブチリシンＢＰＮ’、ズブチリシンカール スバーグ（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ）、ズブチリシンＤＹ、ズブチリシンアミロサラ カリティクス（ａｍｙｌｏｓａｃｃｈａｒｉｔｉｃｕｓ）およびメセンテリコペ ブチダーゼ（ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄａｓｅＸＫｕｒｉｈａｒａら １９７２．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２４７：５６２９−５６３１　；　５ｔ ａｈｌおよびＦｅｒｒａｉ、　１９８４．　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５９ ：８１１−８１９、Ｊａｃｏｂｓら、１９８５．　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ ｓ、１３　：　８９１３−８９２６　：　Ｎｅｄｋｏｖら、１９８５．　Ｂｉｏ ｌ、Ｃｈｅｍ、Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ　３６６：４２１−４３０．　５ｖｅ ｎｄｓｅｎら、１９８６、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ　１９６　：　２２８−２３２ ）および２つの真菌ズブチリシンサーモアクチノミセス・ブルガリス（Ｔｈｅｒ ｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）からのズブチリシンであるサ ーミターゼ（ｔｈｅｒｍｉｔａｓｅ）（Ｍｅｌｏｕｎら、。

１９８５、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　１９８３　：　１９５−２００）およびト リチラチウム・アルブム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ　ａｌｂｕｍ）からのブロ ティナーゼＫ　（ＪａｎｙおよびＭａｙｅｒ、　１９８５．　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ ｅｍ、　Ｈｏｐｐｅ−５ｅｙｌｅｒ　３６６　：　５８４−４９２）である。

ズブチリシンは物理的および化学的によ（特徴づけられている。

これら酵素の一次構造（アミノ酸配列）に加えて、５０倍以上の解像度のズブチ リシンのＸ−線構造が決定され、これは基質との結合、遷移状態、産物、３種の プロテアーゼインヒビターを描写し、天然の変更体の構造的結論を定める（Ｋｒ ａｕｔ、　１９７７、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

４６　：　３３１−３５８）。

ズブチリシン遺伝子の不規則なおよび部位特異的突然変異は、酵素の物理的およ び化学的性質に関する両方の知識から生まれ、ズブチリシンの触媒活性、基質特 異性、三次元構造などに関する情報に寄与した（Ｗｅｌｌｓら、１９８７．　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８４　：　１２１９−１ ２２３　：　Ｗｅｌｌｓら、１９８６．　Ｐｈ１１．Ｔｒａｎｓ、Ｒ，Ｓｏｃ、 Ｌｏｎｄ、Ａ、　３１７　：　４１５−４２３：ＨｗａｎｇおよびＷａｒｓｈｅ ｌ、　１９８７．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、２６：　２６６９−２６７３；　Ｒａｏら ＋９８７．　Ｎａｔｕｒｅ　３２８：５５１−５５４）。

ズブチリシン遺伝子の部位特異的突然変異は多くの注目を浴び、種々の突然変異 が以下の特許出願および特許に記載されている：欧州特許第０１３０７５６号（ ジエネンティック）（対応する米国特許第４７６００２５（ジエネンコー））は 部位特異性または不規則に生成した”カルボニルヒドロラーゼ中の突然変異体に 関し、引き続き突然変異酵素の種々の性質、例えばＫｃａｔ／Ｋｍ比、ｐＨ−活 性プロファイル、および酸化安定性などを探索した。部位特異的突然変異の可能 性を示した事、ならびに特定部位（即ち、−１Ｔｙｒ、　３２Ａｓｐ、　１３５ Ａｓｎ、１０４ＴＹｒ、　２２２Ｍｅｔ、　１６６Ｇｌｙ、　６４Ｈｉｓ、　１ ６９Ｇｌｙ、　１８９Ｐｈｅ、　３３Ｓｅｒ、　２２１Ｓｅｒ。

２１７Ｔｙｒ、　１５６Ｇ１ｕまたは１５２Ａｌａ）でのズブチリシンＢＰＮ’ の突然変異が別の性質を表すことを酵素に与えたとは別に、その出願は所望の性 質を持つ酵素を得るためにどこに突然変異を導入するかを決めるという問題を解 決することには寄与していない。

欧州特許第０２１４４３５（ヘンケル）はズブチリシン　カールスバーグおよび その二つの突然変異体のクローニングと発現に関する（しかし１５８ＡＳｌ）か ら１５８ｓｅｒならびに１６１Ｓｅｒから１６１８Ｓｐへの突然変異の理由は与 えていない）。

国際特許出願第Ｗ０８７１０４４６１（アムジェン）は、親の酵素に存在するＡ ｓｎ−Ｇｌｙ配列の数を減少させて、ｐＨおよび熱安定性を表す酵素を得た。こ こではズブチリシンＢＰＮ’の１０９Ａｓｎと２１８Ａｓｎ残基の除去、変異ま たは修飾が強調された。

国際特許出願第Ｗ０８７１０５０５０（ジェネックス）は、改善された性質のた めのズブチリシンＢＰＮ’の不規則な突然変異とそれに続く多数の突然変異体の 探索を記載し、２１８Ａｓｎ、　１３１Ｇｌｙ、　２５４Ｔｙｒ、　１６６Ｇｌ ｙ。

１１６Ａｌａ、　１８８Ｓｅｒ、　１２６Ｌｅｕおよび５３Ｓｅｒ位での突然変 異を記載する。

欧州特許第０２５１４４６号（ジエネンティック）は、第一および第三次構造レ ベルでのホモロジーの考察を、同等のアミノ酸残基が、保存されているか、否か を同定するためにどのように応用できるかを記載する。この情報は、ズブチリシ ンＢＰＮ’の三次構造に関する著者の知識とともに、突然変異が可能な多（の部 位の選択を導き、これらは改変した性質をもつ突然変異体を得るために期待され るものである。そのように同定された部位としては、１２４Ｍｅｔ、　２２２Ｍ ｅｔ　。

１０４ＴＹｒ、　１５２Ａｌａ、　１５６Ｇｌｕ、　１６６Ｇ１ｙ、　１６９Ｇ ｌｙ、　１８９Ｐｈｅ、　２１７Ｔｙｒ　、である。また１５５Ａｓｎ、　２１ Ｔｙｒ、　２２Ｔｈｒ、　２４Ｓｅｒ、　３２Ａｓｐ、　３３Ｓｅｒ、　３６Ａ ｓｐ。

４６Ｇ１ｙ、　４８Ａｌａ、４９Ｓｅｒ、　５０Ｍｅｔ、　７７Ａｓｎ、　８７ Ｓｅｒ、　９４Ｌｙｓ、　９５Ｖａｌ、　９６Ｌｅｕ。

１０７１１ｅ、　１１０Ｇｌｙ、　１７０Ｌｙｓ、　１７１Ｔｙｒ、　１７２Ｐ ｒｏ、　１９７Ａｓｌ）、　１９９Ｍｅｔ、　２０４ＳｅｒB ２１３Ｌｙｓおよび２２１Ｓｅｒも酵素の種々の性質に影響を有すると同定され 、これらの提案を支持する多くの突然変異体が例示された。これらの部位での単 一突然変異に加えて、著者は多くの複数部位の突然変異も行った。さらに著者は 、２１５Ｇ１ｙ、　６７Ｈｉｓ、　１２６Ｌｅｕ、　１３５Ｌｅｕおよび９７− １０３．１２６−１２９．２１３−２１５および１５２−１７２の部分内のアミ ノ酸残基を、興味あるものと同定したが、これらの部位での突然変異は実施して いない。

欧州特許第０２６０１０５（ジェネンコー）は、触媒的な三組を含有する酵素中 の特定の性質を改変することを記載し、これは触媒的な三組から約１５Ａ内のア ミノ酸を選択し、選択したアミノ酸をもうひとつのアミノ酸と交換することによ る。本明細書に記載されたズブチリシンタイプの酵素は、特に触媒的な三組を含 有する酵素の種類に属すると言われている。ズブチリシンの２２２および２１７ 位は置換するに好ましい位置として指示されている。

Ｔｈｏｍａｓ、　Ｒｕ５ｓｅｌｌおよびＦｅｒｓｈｔ　（Ｎａｔｕｒｅ　（１９ ８５）　３１８．３７５−３７６）により、ズブチリシンの９９Ａｓｐを９９Ｓ ｅｒへ変換することにより酵素のｐＨ依存性か変化することか表された。引き続 づいて、同じ著者は記事（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　（１９８７）　１９３．８ ０３−８１３）で１５６ＧＩｕに代えて１５６Ｓｅｔの置換も検討している。こ れらの突然変異は活性な６４Ｈｉｓがら約１５Ａ離れた中にある。

Ｎａｔｕｒｅ、　３２８．４９６−５００　（１９８７）では、Ｒｕ５ｓｅｌｌ およびＦｅｒｓｈｔは、彼らの実験結果を討論し、ｐＨ−活性プルファイルを変 更するための規則を与え、これは酵素を突然変異させ、表面電荷を変えることに よる。

現在以下のズブチリシンプロテアーゼが知られており、それらの多（が世界中の 多くの国で、特に洗剤用として販売されている：ズブチリシンタイプ’またはＮ ｏｖａ、例えば米国、セントルイス、シグマから市販されている： ズブチリシン　カールスバーグ、Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ／Ｓ　（デンマ ーク）からＡＬＣＡＬＡＳＥ　（ＴＭ）として、ならびにＩＢＩＳ（オランダ） からＭＡＸＡＴＡＳＥ（ＴＭ）として市販されている： バチルス　レンテス　ズブチリシン、Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ／Ｓ　（デ ンマーク）から５ＡＶＩＮＡＳＥ　（ＴＭ）　トＩ、”Ｃ市販ｔｔＬｃイル：に ０ＰＴＩＣＬＥＡＮ　（ＴＶ）　（オランダ）がＭｉｌｅｓ　Ｃｈｅｍｉｅ　（ ドイツ）から市販されている： バチルス　レンテス　ズブチリシン、Ｎｏｖａ−Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ／Ｓ　（デ ンマーク）からＥＳＰＥＲＡＳＥ　（ＴＭ）として市販されている：ＫＡＺＵＳ ＡＳＥ　（ＴＭ）が昭和電工（日本）により市販されている。

例えば、ズブチリシンは他の酵素（他の基質に対して活性である）と組み合わせ て使用することもでき、選択したズブチリシンはそのような酵素に対して安定性 を有するべきであり、また選択したズブチリシンは好ましくは他の酵素を消化す べきではない。また選択したズブチリシンは洗剤配合物中の他の成分、例えば漂 白剤、酸化剤などに対して耐性であるべきであり、特に洗剤配合物中で使用され る酵素は、保存中および洗浄中の液体中での洗剤中の非−酵素的成分により形成 される酸化粉末、カルシウム結合性質、洗浄性およびｐＨ状態に関して安定であ るへきである。洗浄液中で安定に維持される酵素能力は、しばしば洗浄能力また は洗浄力といわれる。

天然ズブチリシンは、その洗浄力、すなわちｐＨおよびイオン強度なとの種々の パラメーター下での能力に関して高度に可変であるということが分かった。上記 市販されている洗剤用プロテアーゼのいくつかは、まさに約２０年以上前から販 売されているものよりもよい性能を有するが、各酵素の至適性能は配合および洗 浄力に関してそれに＃宵の条件があり、それは例えばｐｌ１温度、イオン強度（ Ｉ）、活性系、ビルダーなとである。

結果として、低いｐＨおよび低い■で所望の性質を有する酵素はよりアルカリ性 の条件では望ましくなく、逆も言えることが見いだされた。

さらに、洗浄過程で起こる洗浄液のＰＨ変化に対して比較的耐性である酵素を製 造および使用することがのぞましい。

現在、所望のアミノ酸配列を有する酵素を構築することが可能であり、上記のよ うに変更したズブチリシンの性質を構築するためにかなりの研究か費やされた。

多くの突然変異酵素を生産および探索する方法が提案された中で、欧州特許第０ １３０７５６（ジエネンティック）（米国特許第４．７６０，０２５）　（ジエ ネンコー））および国際特許出願Ｗ０８７１０５０５０（ジエネックス乃は天然 酵素の単離およびその性質についてのそれらのスクリーニングの古典的方法に対 応するが、より効果的ではある。

ズブチリシンプロテアーゼはそれぞれが天然に存在し得る２０のアミノ酸の１つ であり得る約２７５アミノ酸残基から典型的に構成されるので、その操作では、 −次スクリーニングにおいて注目の性質を示す選択された変異体をさらに試験す るに先立って、生成した極めて多数の変異体を予備スクリーニングにかけなけれ ばならないという重大な欠点かある。これはまたたとえば、洗浄液の特別な条件 下で改良された洗浄能力を表す洗浄用組成物を配合する場合のような目的の使用 について、改良された性質を持つ所望の酵素を得るためにどのアミノ酸残基を変 異させるかというガイドラインが示めされていないからである。

これらの特許出願に概略された方法は、従って、従来の長い間知られたランダム 突然変異法よりわずかによいだけである。

他の既知の技術は、加水分解速度（欧州特許第０２６０１０５（ジエネンコー） ）およびｐＨ−活性プロファイル（ＴｈｏｍａｓおよびＲｕ５ｓｅｌｌ、および Ｆｅｒｓｈｔ、同上）のような、特定な性質を変更させることに関する。これら の出版物のどれも酵素の洗浄性能すなわち“洗浄力″を変更することに関連しな い。

まさに、そのようによく知られた酵素の性質と酵素の洗浄性能すなわち”洗浄力 ”との間の関係はよ（同定されていない。

国際特許出願第Ｎｏ　（８９１０６２７９（ＰＣＴ／ＤＫ　８８１００００２） 　（ＮｏｖａインダストリーＡ／Ｓ）は、どのアミノ酸を変更すべきであるか、 および洗浄力において所望の変更を得るためにどのアミノ酸を導入すべきである かを決定するためのホモロジー比較の概念の使用を提案している。

（出版されていないが）欧州特許出願第９０３０６９５２．４　（Ｕｎｉｌｅｖ ｅｒ）は、変更されたｐｌを持つ突然変異ズブチリシンプロテアーゼの生産と使 用、ならびにそれらを含有する洗浄組成物を記載する。

残る課題は、多くの研究がプロテアーゼ酵素作用の機構を明らかにすることを対 象としたが、それらを洗浄性能に関して酵素の性質を決定する、構造とアミノ酸 残基の組合せはいまだ少しも知られていないことにあると思われる。

結局、洗浄システムに対するプロテアーゼ酵素の改良と作成についての必要性が 、掃除用または洗剤用組成物として実際に使用する際のプロテアーゼ作用機構の よりよい理解と同様に未だ存在する。

発明の説明 本発明の内容において、突然変異プロテアーゼ、例えば突然変異ズブチリシンプ ロテアーゼは、元々の又は親遺伝子を有しそして対応する親酵素を生産する親機 生物から誘導された突然変異遺伝子を発現している生物により生産されたプロテ アーゼを意味し、親遺伝子は突然変異遺伝子を生産するために突然変異され、こ れにより安定な宿主中で発現された時に該突然変異プロテアーゼが生産される。

上記のように細菌および真菌起源のプロテアーゼは、特にズブチリシンプロテア ーゼはそれらが特に洗剤および掃除用組成物において有用であり、それは例えば 洗濯用洗剤のようなものである。

ズブチリシンおよび他のアルカリプロテアーゼはアルカリ性の洗浄条件にある程 度耐えることができ、それにより実際の使用が可能になるものである。にもかか わらず、それらはアルカリ領域のｐＨへの活性および安定依存性を示し、酵素の 性質が現在までに入手し得るものよりもよりアルカリｐＨ領域で扱いやすい酵素 調製物が望まれる。

ひとつの観点において本発明は、ｒＤＮＡ法で製造されるプロテアーゼ（例えば ズブチリシンプロテアーゼ）を提供することであり、これはそのアミノ酸配列に おいて、少なくともひとつの突然変異を有し、親のプロテアーゼと比較すると、 ｐＨ領域にわたって分子荷電の低度の変化を示す（例えばｐＨ＠域にわたり荷電 が実質的に一定に到達する、例えば中性に到達する）。

また本発明により提供されるのは、例えば洗剤用界面活性剤および洗剤用添加物 に加えて、ｒＤＮＡ法により生産されたプロテアーゼ（これはそのアミノ酸配列 において、少なくともひとつの突然変異を有し、親のプロテアーゼと比較すると ｐＨ領域にわたって分子の荷電の低度の変化を示す（例えばｐＨ領域にわたり荷 電の実質的一定性に到達する、例えば中性に到達する））を含む酵素的洗剤用組 成物である。

本発明によれば、そのような分子電荷の低度の変化により（特に例えばｐＨ領域 にわたって分子電荷が実質的に中性または一定である）、洗剤用配合構成物の柔 軟性を提供し、幾つかの場合においては所望のｐＨに近いｐＨを育する洗剤の配 合を可能にする。そのような酵素はまた使用中に、野生型酵素よりもｐＨ変化に 対してより感度が低い。

そのような突然変異酵素は、洗剤用または掃除用組成物の一部として使用した時 、活性、安定性、および／または洗剤性能において、そして／またはより広範囲 のｐＨ領域にわたって使用されるという点で利点をもたらすことができる。

そのような突然変異酵素は、洗浄液のｐＨ変化に対する感度の減少を示すことに より衣類洗濯サイクル中の望ましくない性能変化を減少することができる。

そのような酵素は、実質的に均等な性能をもって、比較的高いまたは比較的低い ｐＨの洗剤において適用することができる。

ズブチリシンプロテアーゼのなかで広く使用されているもののひとつ（ズブチリ シン３０９、上記）は１１８領域７から１１にわたり、低ｐＨでの約＋５から高 ｐＨでの約−３までの、分子あたり約８単位の正味の分子荷電の変化に反映され るｐＨに対する感受性を示す。

本発明に包含される突然変異酵素の例は、野性型酵素に比べて、ｐＨによる変化 が小さく、例えば分子荷電の変化が実質的に小さく、実質的な一定値に達し、あ る場合には分子荷電の中性に達し、例えばＩ）Ｈ範囲が約８から約１１、場合に よってはより広い約７から約１１の多少法がりのあるｐＨ領域において、その変 化はある場合は分子あたり５に荷単位より小さく、例えば分子あたり３電荷より 小さな変化であり、さらにある場合は分子あたり約１電荷より小さい。

最も普通には、荷電はｐＨの上昇に伴いより陰性になる。突然変異プロテアーゼ が、ｐＨに対応して分子の荷電の小さい割合の変化を表せば十分であるが、この ｐＨ範囲はｐＨ７から１１の範囲をあまり超えず、例えばすくなくとも０．５ｐ Ｈ単位のｐＨ領域にわたって、例えば少なくとも１９Ｈ単位、例えば少なくとも ２または３ｐＨ単位にわたり、そのようなあまり超えない範囲はｐＨ領域約７か ら約１１内に位置し、例えば約ｐ）１８から約ｐＨ１１に位置する。

ｐＨに対する減少した電荷変化の領域内の、ｐＨ値での分子電荷は、分子あたり 約＋５から約−３電荷単位の間にあり、例えば＋３から一１単位範囲内にあり、 正味の電荷は＋／−１１例えば＋／−０，５、例えばゼロに近いかまたはわずか に陽性である。

ある場合には、プロテアーゼの正味の電荷は、分子あたり＋／−１またはより狭 くは＋／−０，５電荷の変化の範囲で、例えばほとんど一定、すなわちほとんど ゼロに維持されることができる。

本発明の態様による突然変異酵素は、一般的に知られているｒＤＮＡ法を応用し て作ることができ、これは例えば上記の出版物および本明細書の引用参照に述べ られている（引用により本明細書に編入された）。

以下に述べる本発明による突然変異酵素の態様は、タンパク質に天然に存在する アミノ酸の以下の省略記号を参照することにより特定される： Ａ＝　Ａｌａ＝ｌミニア ラニンＶａｌ＝バリン Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン １＝ｒｌｅ＝イソロイシン Ｎ＝　Ａｓｎ＝アスパラギン Ｑ−Ｇｌｎ＝グルタミン Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸 Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸 Ｈ＝　Ｈｉｓ＝ヒスチジン Ｂ＝　Ａｓｘ＝　ＡｓｐまたはＡｓｎ Ｚ＝　ＧＩＸ＝　ＧＩＬＩまたはＧｉｎそのようなもうひとつのホモロガスなズ ブチリシンプロテアーゼの対応する部位への言及として理解されるべきである。

そのような対応部分は、他のＢＰＮ’の遺伝子との比較により、そのような他の プロテアーゼの遺伝子中の明らかな削除と挿入の理由により番号が他のプロテア ーゼの鎖に沿って異なるかもしれない。該表において、アミノ酸の削除または欠 損は′＊′　で、ＢＰＮ’に比較して挿入となるものは位置番号に付された小文 字のアルファベットで示される。

本発明によれば、突然変異ズブチリシン酵素は、ズブチリシンＢＰＮ’、ズブチ リシンアミロサラカリティクス、ズブチリシン１６８、ズブチリシンメッセント リコペブチダーゼ、ズブチリシンカールスバーグ、ズブチリシンＤＹ、ズブチリ シン３０９、ズブチリシン１４７、サーミターゼ、バチルスＰＢ９２プロテアー ゼおよびブロティナーゼＫから選択された親の酵素の突然変異を表すことが好ま しく、好ましくはズブチリシン３０９、ズブチリシン１４７、ズブチリシンカー ルスバーグ、アクアリシンまたはバチルスＰＢ９２プロテアーゼである。

本発明の範囲にある有用なズブチリシンプロテアーゼは、リシン、ヒスチジン、 システィンかつ／またはチロシン残基（これはしばしば滴定値（ｔｉｔｒａｔｅ ）またはｐＫａ値が８−１１の範囲中にある）を持ち、それらが非−滴定（ｎｏ ｎ−ｔｉｔｒａｔｉｎｇ）残基、またはその範囲外のｐＫａ値、又は場合によっ ては７−１２以外の範囲にある残基（特にチロシン以外の残基）（例えばリシン またはシスティンからアルギニン、ロイシン、スレオニン、アスパラギン、グル タミン酸またはアスパラギン酸へ：チロシンからフェニルアラニン、スレオニン 、バリン、トリプトファンまたはグルタミン酸へ；ヒスチジンからグルタミン、 アスパラギン、セリン、グルタミン酸またはアスパラギン酸へ）により置換され る。

特に、本発明の態様は以下の突然変異または突然変異の組み合わせを指示した部 位に導入することができる：Ｈ１７Ｑ、　Ｋ２７Ｒ，Ｈ３９Ｓ、　Ｅ５４Ｄ、　 Ｙ９１Ｆ、　Ｋ９４Ｒ，Ｈ１２０Ｄ、　Ｈ１２ＯＮ、　Ｙ１６７Ｅ。

Ｙ１６７Ｆ、　Ｙ１７１Ｖ、　Ｙ１９２Ｅ、　ＹＩ９２Ｆ、　Ｙ２Ｏ９Ｆ、　Ｙ ２１４Ｔ、　Ｈ２２６Ｓ、　Ｋ２３５Ｌ。

Ｋ２３５Ｒ，Ｋ２３７Ｒ，Ｋ２５１Ｅ、　Ｋ２５１Ｎ、　Ｙ２６３Ｆ。

Ｅ５４Ｄおよびに９４Ｒの突然変異は通常−緒に導入されるべきである。

突然変異の例はさらに次のように分けられる：ａ−に２７Ｒ； ｂ　−Ｈ１７Ｑ＋に２７Ｒ＋Ｈ３９Ｓ；ｃ　−ＥＳ４Ｄ＋Ｙ９１Ｆ＋に９４Ｒ； ｄ−ε５４０＋Ｙ９１Ｆ十に９４Ｒ＋８１２０Ｄ；ｅ　−Ｅ５４Ｄ＋Ｙ９１Ｆ＋ に９４Ｒ＋Ｈ１２ＯＮ；ｆ　−Ｙ１６７Ｆ＋Ｙ１７１Ｖ＋Ｙ１９２Ｆ＋Ｙ２Ｏ９ Ｆ＋Ｙ２１４Ｔ；９−　に２３ＳＬ＋に２３７Ｒ＋に２ＳＩＥ＋Ｙ２６３Ｆ；ｈ −に２３ＳＬ＋に２３７Ｒ＋に２５１Ｎ＋Ｙ２６３Ｆ；ｉ　−８２２６Ｓ十に２ ３５し＋に：’３７Ｒ十に２ＳＩＮ＋Ｙ２６３Ｆ；ｋ　−Ｈ２２６Ｓ＋に２３５ Ｌ＋に２３７Ｒ十に２５１Ｅ＋Ｙ２６３Ｆ；９′−に２３５Ｒ＋に２３７Ｒ＋に ２５１Ｅ＋Ｙ２６３Ｆ；ｈ′−に２３５Ｒ＋に２３７Ｒ十に２５１Ｎ＋Ｙ２６３ Ｆ　；１’　−Ｈ２２６Ｓ＋に２３５Ｒ＋に２３７Ｒ＋に２５１Ｎ＋Ｙ２６３Ｆ ；に’　−Ｈ２２６Ｓ＋に２３５Ｒ＋に２３７Ｒ＋に２５１Ｅ＋Ｙ２６３Ｆ；従 って、本発明の態様はａ＋ｃ＋ｆ＋ｇ、ｂ＋ｄ＋ｆ＋ｉ、ｂ＋ｅ＋ｆ＋に、ｂ＋ ｅ＋ｆ＋ｉ、ｂ＋ｄ＋ｆ＋に、ａ＋ｃ＋ｆ＋ｇ’。

ｂ＋ｄ十ｆ十ｉ’　、ｂ＋ｅ＋ｆ＋に’　、ｂ＋ｅ＋ｆ＋ｉ’　、ｂ＋ｄ＋ｆ＋ に’、に対応する組み合わせの突然変異を有する例も含み、ここで文字は上のバ ラグラフで示した変異又は変異の組合せを示す。

目的の突然変異プロテアーゼの特別な例は次のごとくである：Ａ　：　Ｋ２７Ｒ 。

Ｂ　：　Ｋ２３５Ｒ＋に２３７Ｒ＋に２５１Ｅ＋Ｙ２６３Ｆ；Ｃ：　Ｅ５４Ｄ＋ Ｙ９１Ｆ＋に９４Ｒ：Ｄ　：　Ｋ２７Ｒ＋Ｅ５４Ｄ＋Ｙ９１Ｆ＋に９４Ｒ＋Ｙ２ Ｏ９Ｆ＋Ｙ２１４Ｔ＋に２３５Ｒ＋に２３７Ｒ＋に２５１Ｅ＋Ｙ２６３Ｆ。

Ｅ　：　Ｋ２７Ｒ＋Ｅ５４Ｄ＋Ｙ９１Ｆ＋に９４Ｒ＋Ｙ１６７Ｆ＋Ｙ１７１Ｖ＋ Ｙ１９２Ｆ＋Ｙ２Ｏ９Ｆ＋Ｙ２１４Ｔ＋に２３５Ｒ＋に一２３７Ｒ＋に２５１Ｅ ＋Ｙ２６３Ｆ　（すべてのＹ、　Ｋか変化）：Ｆ：Ｄ残基に電荷を加え、そして ひとつのＥ残基に電荷を加えたさらに二つの突然変異を存する突然変異体ＥＧ　 ：　１７．３９．１２０．２２６位のヒスチジンに中性残基のさらなる突然変異 を有する突然変異体Ｆ、 Ｈ：Ｎ−末端が化学的に修飾されて（ブロック）中性基を与えるか、またはｐＫ ａが７から１２の範囲外にある基を与える突然変異体Ｇ プロテアーゼＡからＨの滴定曲線（計算した）は、野生型ズブチリシン３０９と 一致し、添付の図１から３に与えられる。

上記プロテアーゼＨに関連して記載したように、そして一般的に応用できるもの として、プロテアーゼ（ポリペプチドの環境におし）でしばしば約８のｐＫａを 有する）のＮ−末端アミノ基を修飾することも有用であり、これは例えば微生物 により生産された後のプロテアーゼをアシル化またはアルキル化するための修飾 試薬による。これは、８−１１のアルカリｐＨでの電荷の安定化の程度に寄与す るためには、例えばブロッキング処理の結果によりＮ−末端のアミノ基をｐＫａ が約８−山例えば約７−１２の外にある基で置換して配置することによる。

適当な方法は例えば”タンパク質の化学的修飾（ＣｈｅｍｉｃａｌＭｏｄｉｆｉ ｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ’　Ｇ、Ｅ、Ｍｅａｎｓ、　Ｒ，Ｅ、Ｆｅ ｅｎｅｙ、１９７１ホｌレデンデイ社（Ｈｏｌｄｅｎ　Ｄａｙ　Ｉｎｃ、）サン フランシスコ、およびＦｉｎｎ　Ｗｏｌｄによる′タンパク質のインビボ修飾（ Ｉｎ　Ｖｉｖｏ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ　Ｐｒｏｔ ｅｉｎｓ）”、　Ａｎｎ、Ｒｅｖ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　５０　（１９８１）、　７ ８３−８１４に開示されている。最適な方法は、（ｉ）例えばエチルアセトアミ ドと反応させることによりアミノ基をホモグアニジウム基に転換するか、または ０−メチルイソウレアでグアニジル化することにより、末端アミノ基を修飾して 、より高いｐＨの正電荷基を残す、（ｉｉ）　Ｎ−末端を無水酢酸によりアセチ ル化することにより、またはシアネートでカルバミル化することにより中和する 、または（ｉｉｉ）末端−アミノ基を例えば無水コハク酸でアシル化することに より負電荷基に転換する、工程を含む。これらの方法は接近可能なりシン残基に 影響する。

本発明はまた、本発明の突然変異酵素を、掃除および洗剤組成物中に使用するこ とから成り、そしてそのような突然変異酵素を含む掃除および洗剤組成物にまで 広がる。

これらの酵素は洗剤組成物中に既知の量で使用できる。その量は非常に広い範囲 に変化し、洗剤組成物のダラムあたりアンソン単位（Ａｎｓｏｎ）で例えば約０ ．０００２−０．０１．例えば約０．００５−０．０５である。他の単位で表せ ば、プロテアーゼ組成物中に、洗剤配合物あたり約０．１−１００ＧＵ／ｍｇ　 （例えば１−５０．特に５−２０ＧＵ／　ｍｇ）のオーダーで、または任意に洗 剤配合物あたり約０．０１−４、例えば０．１−０．４ｋＮＰＵを中心とした広 範囲の量である。

ＫＮＰｔｌは、Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ／Ｓにより発表された技術的文書 中に定義されたものである。

ＧＯはグリシン単位であり、これは標準的な条件下で、４０℃で１５分間Ｎ−ア セチルカゼインを基質としてインキュベーションする間に、１マイクロモルのグ リシンと等量のＮＨ，基を生成するタンパク質溶解酵素活性として定義される。

例えば、リットル当たり０．０８ｋＮＰＵのオーダーの酵素活性に対応して本発 明の酵素を洗濯液１リツトルあたり約０．２５ｍｇの割合で使用することか適当 である。対応する洗剤配合物は例えば０．１−０．４ＫＮＰ［Ｊ／ｇのオーダー の量で含有できる。

そのような組成物は、本発明の前述の任意の観点に従った突然変異ズブチリシン 酵素の任意のひとつ又はそれ以上のみに加えて、当業者に周知のそのような組成 物中に含まれる成分を含む。

そのような成分は、リン酸またはゼオライト研摩剤のようなビルダー、アニオン 、カチオンまたは非−イオン性のような界面活性剤、アクリル酸または同等のポ リマーのようなポリマー、過硼酸塩−またはアミノ酸−含有漂白前駆体または活 性化剤のような漂白系、シリケート構造物のような構造物、ｐＨを調整するため のアルカリまたは酸、除湿剤および、または中性有機塩を含む。

洗剤組成物はさらに酵素を含有する。

例えば、欧州特許第２５８０６８中のＮｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ／Ｓのリパ ーゼおよびリボラーゼおよび他の酵素組成物を、キャリアー物質とともにリパー ゼ酵素の粒状組成物として加えることができる（別法として溶液またはスラリー で）。

リパーゼの添加量は、広い範囲で選択でき、例えばダラムあたりの界面活性剤系 または洗剤組成物に５０から３０．０ＯＯＬＵ／　ｇ　、例えば頻繁には少なく とも１００ＬＵ／　ｇ、大変有効には少なくとも５００ＬＵ／　ｇ　。

しばしば好ましくは１０００．２０００ＬＵ／ｇまたは４０００ＬＵ／　ｇ以上 であり、従って最も頻繁には５０−４０００ＬＵ／　ｇの範囲内、そして可能な 範囲は２００−１０００ＬＬＩ／　ｇである。このリパーゼ単位の仕様は、欧州 特許第２５８０６８に定義されたものである。

脂肪溶解酵素は広範なリパーゼから選択できる：特に以下の特許明細書に記載さ れたリパーゼ、欧州特許第２１４７６１号（Ｎｏｖｏ　ＮｏｒｄｉｓｋＡ／Ｓ） 、欧州特許第０２５８０６８号および特にサーモマイセス　ラヌギオネスス（Ｔ ｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）　ＡＴＣＣ２２０７０からの リパーゼに対して生じる抗血清に免疫的交差反応を表すリパーゼ、欧州特許第０ ２０５２０８号および欧州特許第０２０６３９０号、そして特にクロモバクター 　ビスコスム　バー　リボリティクム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｖｉｓｃｏｓ ｕｍ　ｖａｒ　Ｉｉｐｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＮＲＲＬ　Ｂ−３６７３からの、また はアルカリジーンズ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）　ＰＬ−６７９，ＡＴＣＣ３１ ３７１およびＦＥＲＭ−Ｐ　３７８３からのリパーゼに対して生じる抗血清に免 疫的交差反応を表すリパーゼ、またＷＯ３７１００８５９（ギストーブローカデ ス）および欧州特許第０２０４２８４（サラポロビール）の明細書。特に有用な ものは、例えば以下の市販されているリパーゼ組成物である：　Ｎｏｖａリパー ゼ、アマノ　リパーゼＣＥ　Ｐ、　Ｂ、　ＡＰ、　Ｍ−ＡＰ、　ＡＭＬおよびＣ ＢＳおよびメイト−リパーゼＭＹ−３０，ＯＦ、およびＰＬ、　またエステラー ゼ（Ｅｓｔｅｒａｓｅ）　Ｍｕ、リボザイム（Ｌｉｐｏｚｙｍｅ）、　５Ｐ２２ ５．　５Ｐ２８５、サイカン　リパーゼ、エンゼコリパーゼ、トーヨー　ジコゾ ーリパーゼおよびダイオシシスリパーゼ（商標）である。

これらのさらなるリパーゼ酵素の遺伝子工学は、適当なリパーゼ遺伝子（例えば サーモマイセス　ラヌギオネススからのリパーゼ遺伝子またはその突然変異体） の抽出、例えばアスペルギルスなどの適当な生産体生物中にその遺伝子またはそ の誘導体を導入、発現させて達成される。その方法は、Ｗｏ　８８１０２７７５ （Ｎｏｖａ　Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ／Ｓ）、欧州特許￥＆０２４３３３８号（Ｌａ ｂｏｆ　ｉｎ）または欧州特許第０２６８４５２号（ジェネンコー）および注目 すべきは欧州特許第０３０５２１６号（Ｎｏｖ。

Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ／Ｓ）または欧州特許第０２８３０７５（ギストーブローカ デス）が適用できる。

他の酵素における同様の考察がミュータシス　ミュータンデス（Ｍｕｔａｔｉｓ 　Ｍｕｔａｎｄｉｓ）にも適用でき、これもまた存在する。制限する事なく：例 えば所望によりアミラーゼも使用でき、その範囲はダラムあたりの洗剤組成物あ たり約１から約１００ＭＵの範囲の量であり（マルトース単位）（または０．０ １４−１．４　、例えば０．０７−０．７ＫＮＩＪ／　ｇ　）（Ｎｏｖｏ単位） である。例えばセルラーゼも所望により使用でき、それはダラムあたりの洗剤組 成物あたり約０．３から３５ＣＥＶＵ単位の範囲の量である。

本発明の洗剤組成物中に通常量で存在できる有用な洗剤成分は以下のとおりであ る。組成物は構築されてもされてなくてもよく、そしてゼロ−Ｐ（すなわちリン 酸含有ビルダーは含有しない）であることかできる。従って組成物は例えば１− ５０％から、例えば少なくとも５％、そしてより頻繁には３５−４０重量％まで のひとつまたはそれ以上の有機および／または無機ビルグーの凝集物を含んでも よい。

ビルダーの典型的な例は上記に述べたものを含む他、より広範にはアルカリ金属 、オルト、ピロ、およびトリポリフオスフェート、アルカリ金属カーボネイト、 方解石、アルカリ金属クエン酸塩、アルカリ金属ニトリロトリ酢酸塩、カーボキ シメチルオキシサクシネート、ゼオライトポリアセタールカルボキシレートなど の単独または混合物を含む。

さらに、洗剤組成物は１−３５％の漂白剤、または漂白前駆体、または漂白剤お よび／またはその活性化剤の前駆体とともになるシステムを含んでもよい。さら に随意の成分として、気泡増進剤、消泡剤、抗−腐食剤、汚れ沈殿防止剤、金属 イオン封鎖剤、抗−汚れ再付着剤、香料、染料、酵素のための安定化剤などであ る。

組成物を、特に限定的にではなく、綿およびポリエステルを基本とした、または それらの混合物の衣料材料を洗濯するために使用できる。例えば特に、約８０− ６５℃またはそれより低い、例えば約３０−３５°Ｃまたはそれより低い温度で 行われる洗濯に適する。洗濯液中の界面活性剤１リツトルあたり約０．４−０． ８　ｇ提供するこの為に十分な量の組成物を使用することが適当であるが、所望 によりより少ない、またはより多い使用も可能である。限定的にではなく、例え ば〆ｌからｌＯｇ／Ｌ、例えば約３−６　ｇ／Ｌの洗剤配合物の使用割合か、実 施例と実質的に同じ配合物の場合には適当である。

本発明の観点の中にある洗剤組成物の特別な形態には：ａ）リン酸ビルダー、ア ニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、アクリル酸または同等のポリマー 、過硼酸塩漂白前駆体、アミノ−含有漂白活性化剤、シリケート又は他の構造体 、使用に適するｐＨに調整するアルカリ、および中性有機塩を含有する洗剤粉末 として配合された洗剤組成物。

ｂ）ゼオライトビルダー、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、アク リル酸または同等のポリマー、過硼酸塩漂白前駆体、アミノ−含有漂白活性化剤 、シリケート又は他の構造体、使用に適するｐＨに調整するアルカリ、および中 性有機塩を含有する洗剤粉末として配合された洗剤組成物。

Ｃ）アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、有機酸、苛性アルカリ、９ から１０の間の値に調整されたｐＨの液体洗剤として配合された洗剤組成物。

ｄ）本質的に直線状アルコキシル化−級アルコール、トリアセチン、三リン酸ナ トリウム、苛性アルカリ、過硼酸モノハイドレイト漂白前駆体、三級アミン漂白 活性化剤、９からＩＯの間の値に調整されたｐＨから成る液体非イオン性界面活 性剤を含む非水性液体洗剤として配合された洗剤組成物。

ｅ）アニオン性界面活性剤および各アルコキシル化度が約７と約３との非イオン 性界面活性剤の混合物、低い、または実質的にゼロである中性無機塩、リン酸ビ ルダー、過硼酸塩漂白前駆体、三級アミン漂白活性化剤、シリケートナトリウム 、そしてマイナーズ（ｍｉｎｏｒｓ）および湿度を含有する少なくとも６００　 ｇ　／　Ｌのバルク密度を持つ粒質物の形態である洗剤粉末として配合された洗 剤組成物。

ｆ）アニオン性界面活性剤および各アルコキシル化度が約７と約３との非イオン 性界面活性剤の混合物、低い、または実質的にゼロである中性無機塩、ゼオライ トビルダー、過硼酸塩漂白前駆体、三級アミン漂白活性化剤、シリケートナトリ ウム、そして微量物質および湿分を含有する少なくとも６００　ｇ　／　Ｌのバ ルク密度を持つ粒質物の形態である洗剤粉末として配合された洗剤組成物。

ｇ）アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、アクリル酸ポリマー、脂肪 酸石鹸、炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、粘度粒子、過硼酸塩漂白前駆体、三 級アミン漂白活性化剤、シリケートナトリウム、そして微量物質および湿分を含 有する洗剤粉末として配合された洗剤組成物。

ｈ）牛脂とココナツツ油との全一鹸化混合物に基づく石鹸、オルトリン酸で中和 化し、プロテアーゼを混合し、またギ酸ナトリウム、ホウ砂、プロピレングリコ ールおよび硫酸ナトリウムとを混合し、そしてさらに石鹸生産ラインで作られた （石鹸）棒洗剤として配合された洗剤組成物。

０１リツトルの界面活性剤あたり０．４−０．８ｇ／Ｌに対応する割合で使用さ れる時、洗浄液のｐＨを９またはそれより低くするように配合された、酵素洗剤 組成物。

ｋ）１リツトルの界面活性剤あたり０．４−０．８ｇ／Ｌに対応する割合で使用 される時、洗浄液のｐＨを８．５またはそれより高くするように配合された、酵 素洗剤組成物。

１）１リツトルの界面活性剤あたり０．４−０．８ｇ／Ｌに対応する割合で使用 される時、洗浄液のイオン強度を０．０３またはそれより低く、例えば０．０２ またはそれより低くするように配合された、酵素洗剤組成物。

ｍ）１リツトルの界面活性剤あたり０．４−０．８ｇ／Ｌに対応する割合で使用 される時、洗浄液のイオン強度を０．０１またはそれより高く、例えば０．０２ またはそれより高くするように配合された、酵素洗剤組成物。

本発明はさらに以下の実施例および付随する図面により説明される。

実施例 実施例Ａ、添付図面の図１−３及び図４　（１／７乃至７／７）は適当なｒＤＮ Ａ法による本発明の変種プロテアーゼの構成に係わり、さらにはプロテアーゼの 製造に育用な突然変異を誘発させた遺伝子、ベクター及び変異体及び形質転換微 生物に係わる。

実施例Ｂは実施例Ａのプロテアーゼを含む洗剤の組成とその性能テストの結果に 係わる。

実施例ＤＩ−Ｄ１４は本発明のプロテアーゼを適当に組込むことのできるその他 の洗剤組成に係わる。

実施例Ａ： ■： 遺伝子に突然変異を導入する種々の方法が既に公知となっている。サブチリシン 遺伝子のクローン化に関して概説したのち、サブチリシン遺伝子内の不特定部位 及び特定部位に突然変異を発生させる方法を説明する。

公知の種々の方法によりゲノム陽性の細菌または真菌からサブチリシンをコード する遺伝子をクローン化することができる。先ず、研究対象たるサブチリシンを 産生ずる生物体からの染色体ＤＮＡまたはメツセンジャーＲＮＡを利用してＤＮ Ａのゲノムライブラリー及び／またはｃＤＮＡライブラリーを構成しなければな らない。次いで、もしサブチリシンのアミノ酸配列が判明しているなら、相同性 の標識付きオリゴヌクレオチド・プローブを合成し、これを利用することによっ て細菌ＤＮＡのゲノム・ライブラリーからの、または真菌ｃＤＮＡライブラリー からのサブチリシン・コード化クローンを識別すればよい。これに代わる方法と して、他の菌株に属する細菌または真菌からのサブチリシンと相同の配列を含む 標識付きオリゴヌクレオチドをプローブとして使用し、比較的ゆるやかなハイブ リダイゼーション及び洗浄条件を利用することによってサブチリシン・コード化 クローンを識別することも可能である。

サブチリシン産生クローンを識別する他の方法では、ゲノムＤＮＡのフラグメン トを例えばプラスミドのような発現ベクターに挿入し、得られたゲノムＤＮＡラ イブラリーでプロテアーゼ陰性細菌を形質転換し、次いでサブチリシンの基質、 例えばスキムミルクを含有する寒天培地で形質転換細菌を平板培養する。サブチ リシン支持プラスミドを含有するこの細菌は排出されるサブチリシンがスキムミ ルクを消化することで、透明な寒天培地の輪によって囲まれたコロニーを産生ず る。

サブチリシン遺伝子をクローン化してプラスミドのような適当なベクターに導入 したら、あとはいくつかの方法を利用することによって遺伝子に不特定（ランダ ム）突然変異を導入することができる。

１つの方法として、検索可能なベクターの一部としてクローン化サブチリシン遺 伝子を大腸菌の突然変異誘発菌株に組込む。

他の方法では、１本鎖形のサブチリシン遺伝子を発生させ、サブチリシン遺伝子 の一部か１本鎖のままとなるようにサブチリシン遺伝子を含有するＤＮＡのフラ グメントを他のＤＮＡフラグメントと共にアニールする。この孤立した１本鎖領 域に任意の突然変異誘発剤、例えば亜硫酸ナトリウム、ヒドロキシルアミン、亜 硝酸、ギ酸、またはヒドララジンを作用させる。まお、突然変異誘発剤は上記例 に限らない。不特定（ランダム）突然変異を発生させるこの方法の１例は５ｈｏ ｒｔｌｅ及びＮａｔｂａｎｓの論文（１９７８，Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ。

Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　、　７５　：　２１７０−２１７４）に記載されている。５ ｈｏｒｔｌｅ及びＮａｔｂａｎｓの方法によれば、サブチリシン遺伝子を支持す るプラスミドを、遺伝子の内部で開裂する制限酵素によってニックする。ＤＮＡ ポリメラーゼ■のエキソヌクレアーゼ作用を利用してこのニックをギャップに広 げる。こうして得られた１本鎖ギャップを、任意の上記突然変異誘発剤を利用し て突然変異させる。

さらに池の方法では、天然プロモーター及びその他の制御配列を含むバチルス属 からのサブチリシンをクローン化して、大腸菌及び枯草菌双方のレプリコン、選 択可能な遺伝子表現マーカー、及びヘルパー・ファージＩＲＩとの重感染で１本 鎖プラスミドＤＮＡを産生ずるＭ１３ｏｒｉ−領域を含有するプラスミド・ベク ターに導入する。クローン化サブチリシン遺伝子を含有する１本鎖プラスミドＤ ＮＡを分離し、ベクター配列は含有するがサブチリシンのコーディング領域は含 有しないＤＮＡフラグメントと共にアニールすることによってギャップのある二 本鎖分子を得る。上述したように亜硫酸ナトリウム、亜硝酸またはギ酸を作用さ せるかまたは大腸菌の突然変異誘発菌株中で複製することによりサブチリシン遺 伝子に突然変異を導入する。

亜硫酸ナトリウムは１本鎖ＤＮＡ中のシトシンとだけ反応するから、この変異原 物質による突然変異はコーディング領域だけに制限される。反応時間及び亜硫酸 塩濃度は実験ごとに異なり、平均して各サブチリシン遺伝子に対して１つまたは ５つの突然変異が誘発されるようにする。１））（６，０の４Ｍ亜硫酸ナトリウ ムに１０マイクログラムのギャップのある２本鎖ＤＮＡを溶かした溶液を４００ マイクロリツトルの反応容積中で９分間３０℃に保温して１本鎖領域のシトシン の約１％を脱アミノする。ＤＮＡ１ｌによっても異なるが熟成サブチリシンのコ ーディング領域は約２００個のソトシンを含有する。好都合なことに、反応時間 には約４分間（約１　／２００の突然変異一度）から約２０分間（約５　／２０ ０）までの幅がある。

突然変異誘発後、試験管中でギャップを有する分子をＤＮＡポリメラーゼＩ　（ Ｋｌｅｎｏｗフラグメント）で処理することにより完全な２本鎖分子を形成し、 突然変異を固定する。次いで反応性大腸菌を変異誘発原物質処理ＤＮＡで形質転 換することにより増幅された突然変異体サブチリシンのライブラリーを産生ずる 。エラーを生じ易いＤＮＡポリメラーゼが原因で変異範囲を広げる大腸菌のＭｕ ｔ　０株中でプラスミドＤＮＡを培養することによっても増幅された変異体ライ ブラリーを得ることができる。

変異誘発原物質である亜硝酸及びギ酸を使用することによって変異体ライブラリ ーを産生ずることもできる。これらの化学物質は亜硫酸ナトリウムのように１本 ｆｆｌ　ＤＮＡに対して特異性ではないから、突然変異誘発反応を以下に述べる 方法で進行させる。即ち、サブチリシン遺伝子のコーディング部分を標準的な方 法によってＭ１３ファージ中でクローン化し、１本鎖ファージＤＮＡを調製する 。次いで１本ｍＤＮＡヲ１Ｍ、ｐＨ４，３０）亜硝酸ト２３℃テ１５−６０分間 ニ亘ッテ、または２．４Ｍギ酸と２３°Ｃで１−５分間に亘って反応させる。こ のような範囲の反応時間で１／１０００乃至５／１０００の突然変異頻度が得ら れる。変異誘発後、汎用プライマーをアニールしてＭ１３　ＤＮＡを得、変異誘 発された１本ＭＤＮＡをテンプレートとして使用することにより相補結合ＤＮＡ を合成し、サブチリシン遺伝子のコーディング部分が完全な２本鎖となるように する。この時点でコーディング領域は制限酵素でＭ１３ベクターから切断され、 変異誘発されていない発現ベクターに結合されるから、制限フラグメントだけに 突然変異が起こる（Ｍｙｅｒｓ等、５ｃｉｅｎｃｅ　２２９　（１９８５）　２ ４２−２５７）。

サブチリシン遺伝子をクローン化し、所期の突然変異部位が明らかになったら、 合成オリゴヌクレオチドを利用してこの突然変異を導入することができる。この オリゴヌクレオチドは所期の変異誘発部位に位置するヌクレオチド配列を含有す る。変異誘発ヌクレオチドはオリゴヌクレオチド合成の過程で挿入される。

好ましい方法では、サブチリシン遺伝子を架橋するＤＮＡの１本鎖ギャップかサ ブチリシン遺伝子支持ベクター中に形成される。次いで、所期の突然変異を生む 合成ヌクレオチドをアニールして１本鎖ＤＮＡの相同部分を得る。残るギャップ をＤＮＡポリメラーゼＩ　（Ｋｌｅｎｏｗフラグメント）により埋め、Ｔ４リガ ーゼを利用して構成体を結合する。この方法の具体例はＭｏｒｉｎａｇａ等の論 文（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２（１９８４）　６４６−６３９）に記載さ れている。３Ｍｏｒｉｎａｇａ等の論文では、制限エンドヌクレアーゼを利用し て遺伝子内のフラグメントを除去する。

ギャップを含んでいるベクター／遺伝子を変性させ、ハイブリダイズ処理するこ とにより、ギャップの代りにギャップ領域より外側の部位を他の制限エンドヌク レアーゼで裂開させられたベクター／遺伝子を得る。遺伝子の１本鎖領域を変異 誘発オリゴヌクレオチドでハイブリダイズ処理し、残るギャップにＤＮＡポリメ ラーゼ■のＫｌｅｎｏｗフラグメントを埋め、挿入体をＴ４ＤＮＡリガーゼで結 合し、１複製サイクル後、所期の変異を有する２本鎖プラスミドを産生ずる。Ｍ ｏｒｉｎａｇａ法は新しい制御部位を構成する余分な操作を省くから、多重部位 における突然変異発生を容易にする。

米国特許第４．７６０．０２５号（Ｅｓｔｅｌｌ等、１９８８年７月２６日）は カセットを少し変更することによって多重変異を育するオリゴヌクレオチドを導 入する方法を開示しているが、Ｍｏｒｉｎａｇａ法では長さの異なる多数のオリ ゴヌクレオチドを導入できるから一度にもっと多様な突然変異を導入できる。

本発明の実施に際しては、上記の類似方法またはこれらに代わる公知の方法によ って上記の変異を誘発されたサブチリシン遺伝子を産生ずることができ、発現ベ クターを利用して酵素の形で発現させることかできる。発現ベクターは典型的な りローニング・ベクターの成分、即ち、微生物のゲノムに関係なく微生物におけ る自律的なベクター複写を可能にするエレメント、及び選択用の１つまたは２つ 以上の表現マーカーを含むのが普通であるから、一般的にはクローニング・ベク ターの定義に当てはまる。発現ベクターはプロモーター、オペレーター、リポソ ーム結合部位、トランスレーション開始シグナル、及び必要に応じてリプレッサ ー遺伝子または種々の賦活性遺伝子をコード化する制御配列を含む。

発現蛋白質の分泌を可能にするためには、遺伝子のコーディング配列に先立って “シグナル配列′を挿入すればよい。制御配列の指示下に発現させるため、本発 明に従って処理すべき標的遺伝子をしかるべき読み枠において制御配列と連動さ せる。プラスミド・ベクターに組込むことのでき、変異体サブチリシン遺伝子の 転写を支持できるプロモーター配列としては例えば原核生物タイプのβ−ラクタ マーゼ・プロモーター（Ｖｉ　ｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ、　ＡｃａｄＳｃｉ　ＵＳＡ　７５　（１９７８）　３７２７−３７３１） やタック・プロモーター（ＤｅＢｏｅｒ等、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓ ｃｉ　ＵＳＡ　８０　（１９８３）　２ｌ−２５）などが挙げられる。さらに、 ５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ、　２４２　（１９８０）　７４−９ ４に掲載された“Ｕｓｅｆｕｌ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｆｒｏｍ　ｒｅｃｏｍｂｉ ｎａｎｔ　ｂａｃｔｅｒｉａ”にも掲載されている。

１つの態様では、変異誘発されたＤＮＡを担持する発現ベクターによって枯草菌 を形質転換する。枯草菌のような分泌微生物において発現させたい場合、シグナ ル配列が翻訳開始シグナルにつづき、問題のＤＮＡ配列に先行すればよい。シグ ナル配列は発現産生物を細胞壁へ運び、細胞壁において産生物は分泌と同時に産 生物から分離する。上記の用語″制御配列”はもしシグナル配列が存在するなら このシグナル配列をも含むものとする。

■： 本発明の実施例に従って野性型及び変種のプロテアーゼ酵素の遺伝情報を指定す るための遺伝子を構成し、発現させる好ましい方法を示す以下に述べる実施例で は下記の材料に言及する：枯草菌３０９及び１４７はバシルス・レングス（Ｂａ ｃｉｌｌｕｓ　１ｅｎｔｕｓ）の変種であり、ＮＣＩＢに寄託され、受理番号Ｎ ＣＩＢ　１０１４７及びＮＣＩＢ　１０３０９を与えられ、米国特許第３７２３ ２５０号に記載されており、該特許の内容を引用により本願明細書中に組み入れ る。

大腸菌ＭＣ１００Ｏ（Ｍ、Ｊ、Ｃａ５ａｄａｂａｎ及びＳ、Ｎ、Ｃｏｈｅｎ、　 Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｏｉｌ　１３８（１９８０）　１７９−２０７）は公知の方法に よりγ−ｍ＋にされたものであり、米国特許出願第０３９．２９８号にも記載さ れている。

サブチリシン３０９及びその変異体の遺伝情報を指定する合成遺伝子に適したベ クターを構成した。これは本質的にはｐＵｃ１９プラスミド（Ｃ，Ｙａｎｉｓｈ −Ｐｅｒｒｏｎ及びＪ、Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｇｅｎｅ　３３　（１９８５）　１ ０３−１１９）であり、多重クローニング部位が遺伝子を構成する５個のサブフ ラグメントを分離するための制限部位を含むリンカ−に置き換えられている。新 しいリンカ−をＥｃｏ　Ｒ１−Ｈｌｎ　ｄｎ［切断ｐＵｃ１９に挿入してこの制 限部位を破壊した。

（Ｒ１）　にｐｎＩ　ＰｓｔＩＥｃｏＲＩＨ４ｎｄ３　Ｃ１ａｌ　５ｐｈｌ　Ｒ ａｍ　（８３ンサブチリシン３０９の熟成部分の遺伝情報を指定する合成遺伝子 を以下に説明し、添付図面の図４（シートＩ／７−７／７）に示すように構成し た。合成遺伝子の構造はシート１／７−４／７に、構成に使用されるフラグメン トと共に略示しである。各サブフラグメントは６乃至１２個のオリゴヌクレオチ ドから成る。このオリゴヌクレオチドは調節ガラス支持板上のフォスフ中ラミダ イト化学を利用する自動ＤＮＡシンセサイザーでオリゴヌクレオチドを合成した （Ｓ、　Ｌ。

Ｂｅａｕｃａｇｅ及びＭ、Ｈ，Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏ ｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２　（１９８１）１８５９−１８６９参照）。図中オリ ゴヌクレオチドの５′一端の点はこれらのオリゴヌクレオチドガリン酸塩付加さ れたことを指示する手段である。５分間に亘って９０°Ｃに加熱してから７５分 間に亘って室温まで冷却することによって対応のオリゴヌクレオチド対から２本 鎖（シートｌ／７〜４／７）を形成した。２本鎖を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ で処理した。

５個のサブフラグメントを２％アガローゼ・ゲル上で分離し、ｐｓＸ１９１に挿 入した。ジデオキシヌクレオチド・シーケンシングによって配列を確認した。フ ラグメントＡ−Ｅを分離し、ＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩｃｕｔ　ｐＸｓ１９１と共に 結合した。結合混合物を利用してアンピシリン耐性の点で有効な大腸菌ＭＣ１０ ０Ｏγ−１ｍ＋を形質転換した。次いで酵素の熟成部分の遺伝情報を指示するサ ブチリシン３０９の部分を構成する８５０ｂｐ　Ｋｐｎｌ−ＢａｍＨＩフラグメ ントを利用してｐｓＸ２１２の野生型遺伝子を置き換えてｐＳＸ２２２とし、こ れを有効な枯草菌５Ｈａ２７３に形質転換した。形質転換された菌種を発酵させ 、酵素を精製した結果、産生物が野生型産生物と区別できないことが判明した。

突然変異を必要とする部位に（例えば後述するような）異なる配列を有するオリ ゴヌクレオチドを使用し、これを合成遺伝子に適した他のオリゴヌクレオチドと 混合することによって合成遺伝子から得られるプロテアーゼ変種を調製した。そ の他の点では上述したのと同様の態様で変異遺伝子を組立てる。合成遺伝子に関 するその他の情報はＮａｔｕｒｅ　２２７　（１９７０）　２７−３４に掲載さ れたＡｇａｒｖａｌ等の論文に記載されている。

酵素の熟成部分をコード化するサブチリ２２３０９合成遺伝子の先頭にＫｐｎ　 Ｉ部位を導入した。使用された方法はいわゆるオリゴヌクレオチド２本領破壊修 復変異誘発法であり、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ　５ｃｉＵＳＡ　８３ 　（１９８６）　７１７７−７１８１に掲載されたＷｌｏｄｅｋ　Ｍａｎｄｅｃ ｋｉの論文に記載されている。サブチリシン３０９熟成部分の先頭部分において ＮｃｏＩでｐｓＸ１７２を開き、アミノ酸配列を変えずに２個の塩基を変えるこ とによってＮｃｏ　Ｉの直ぐ前にＫｐｎ１部位を導入する。ｐｓＸ１７２はヨー ロッパ特許出願第ＥＰ　Ｏ４０５９０１号に記載されている。このように形成さ れたＫｐｎ　Ｉ部位を４００−ｂｐ　ＰｖｕｉＮｈｅｌフラグメントのｐｓＸ１ ２０に挿入しテｐＸ２１２を生成させる。ｐｓｘｔ２ｏもヨーロー）ｔ＜特許出 願第ＥＰ　０４０５９０１号に記載されている。

得られた産生物をオリゴヌクレオチドＮ０Ｒ７８９（配列を図４（７／７）を示 す）と混合し、１００°Ｃに加熱し、０℃まで冷却し、大腸菌に形質転換する。

再び形質転換したのち、３２−Ｐ−標識Ｎ０Ｒ７８９を利用するコロニー・ハイ ブリダイゼーションによって組換え型部分をスクリーンすることができる。

突然変異及び対応のオリゴヌクレオチドの例は下記の通りである＝Ａ２−０２／ Ａ３−０１：　Ｋ２７Ｒ：　Ｂ１−０２；　Ｅ５４Ｄ：　Ｂ４−０３：　Ｙ９１ Ｆ、　Ｋ９４Ｒ；　Ｄｌ−０１／Ｄ２−０２：　Ｙ１６７Ｅ、　Ｙ１７１Ｖ；　 Ｄ３−０４：　Ｙ１９２Ｅ；　Ｄ４−０１／Ｄ５−０１：　Ｙ２Ｏ９Ｆ、　Ｙ２ １４Ｔ；Ｂ２−０１：　Ｋ２３５Ｒ，Ｋ２３７Ｒ；　Ｂ３−０１：　Ｋ２５１Ｅ ；　Ｂ４−０２；　Ｙ２Ｏ３Ｆ　、ここに述べるような突然変異導入に適したこ のようなオリゴヌクレオチドは例えば下記のような配列を持つことができる：に ２７Ｒ（Ａ　２とＡ３のオーバーラツプ）Ｙ１９２Ｂ　（フラグメントＤ３） これらのオリゴヌクレオチドを合成遺伝子からのオリゴヌクレオチドのうち変化 しない部分と組合わせた。突然変異誘発されたフラグメントＡ、Ｂ、Ｃ及びＥを 変異体構成に全く変化を必要としないフラグメントＣと共に結合した。

■： サブチリシン１４７をベースとする対応の変異体も同様に生成させることかでき 、形質転換させた枯草菌を発酵させ、事後処理することによって所期の酵素を精 製する。

■： 下記の精製法はサブチリシン１４７酵素、サブチリシン３０９酵素またはその変 異体のｉｏ！！スケール発酵ブロスを精製する典型的な方法である。

約８１の発酵ブロスを１１ビーカーで３０分間に亘って５０００ｒｐｍで遠心分 離する。１０％酢酸で上澄をｐＨ６，５に調節し、５ｅｉｔｚ　５ｕｐｒａＳ１ ００フイルター・プレートで濾過する。

Ａｍ１ｃｏｎ　５ＩＹＩＯＯＦカートリッジを装備したＡｍ１ｃｏｎ　ＣＨ２Ａ 　ＩＪｐユ＝　ットを使用して濾液を約４００ｒＩ＠ｌに濃縮する。ＯＦ濃縮液 を遠心分離し、濾過してから室温でｐＨ７のＢａｃｉｔｒａｃｉｎアフィニティ ー・カラムに吸着させる。０．０１ジメチルグルタル酸、０．１Ｍ硼酸及び０． ００２Ｍ塩化カルシウムから成るｐＨ７の緩衝液に２５％２−プロパツール及び １Ｍ塩化ナトリウムを加えた溶液を使用して室温でＢａｃｉｔｒａｃｉｎカラム からプロテアーゼを溶出させる。

Ｂａｅ　ｉ　ｔ　ｒａｃ　ｉｎ精製工程から得られたプロテアーゼ活性留分を一 括して、０．Ｏｌジメチルグルタル酸、０．２Ｍ硼酸及び０．００２Ｍ塩化カル シウムから成るｐＨ６，５の緩衝液で平衡させた７５０ｒｎｌＳｅｐｈａｄｅｘ 　Ｇ２５カラム（直径５ａｎ）に添加する。

５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５カラムから得られたブロティナーゼ活性留分を一括し 、０．０１Ｍジメチルグルタル酸、０．２Ｍ硼酸、及び０．００２Ｍ塩化カルシ ウムを含有するｐＨ６，５の緩衝液で平衡させた１５０ｍ／　ＣＭ　５ｅｐｈａ ｒｏｓｅＣＬ　６Ｂ陽イオン交換カラム（直径５ａｎ）に加えた。

２１の同じ緩衝液におけるＯ−０，１Ｍ塩化ナトリウムの線形勾配を利用してプ ロテアーゼを溶出させる（サブチリシン１４７の場合には０−０．２Ｍ塩化ナト リウム）。

最終精製工程でＣＭ　５ｅｐｈａｒｏｓｅカラムからのプロテアーゼ含有留分を 一括し、（Ｄａｎｉｓｈ　Ｓｕｇａｒ　Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ製の）　Ｇ Ｒ８１ＰＰ膜を装備したＡｍ１ｃｏｎ限外濾過セルで濃縮する。

実施例Ｂ 本発明のプロテアーゼ及び洗剤の代表的な実施例の滴定曲線及び洗浄性能は以下 に述べる通りである： 実施例Ａで述べた方法で形成された変異体プロテアーゼ酵素Ａ。

Ｂ１及びＣをテストした。それぞれのアミノ酸配列はサブチリシン３０９のそれ に対応し、下記のような突然変異を伴なった：Ｂ　：　Ｋ２３ＳＲ＋に２３７Ｒ ＋に２５１Ｅ＋Ｙ２６３ＦＣ：　Ｅ５４Ｄ＋Ｙ９１Ｆ＋に９４Ｒ それぞれの計算滴定曲線をサブチリシン３０９の曲線と共に図１（＝示す。

図１乃至３にはその他の変異体の計算滴定曲線をも示す：Ｄ　：　Ｋ２７Ｒ＋Ｅ ５４Ｄ＋Ｙ９１Ｆ＋に９４Ｒ＋Ｙ２Ｏ９Ｆ＋Ｙ２１４Ｔ＋に２３５Ｒ＋に２３７ Ｒ＋に２５１Ｅ＋２６３Ｆ Ｅ　：　Ｋ２７Ｒ＋Ｅ５４Ｄ＋Ｙ９１Ｆ＋に９４Ｒ＋Ｙ１７１Ｖ＋Ｙ１９２Ｆ＋ Ｙ２Ｏ９Ｆ＋Ｙ２１４Ｔ＋に２３５Ｒ＋に２３７Ｒ＋に２５１Ｅ＋Ｙ２６３Ｆ Ｆ：Ｄ残基の電荷を加えるさらに２個の変異及びＥ残基に電荷を加える１つの変 異を有する変異体ＥＧ：位置１７．３９．１２０．２２６におけるヒスチジンが 突然変異して中性残基となっている変異体Ｆ ＨｌＮ−末端か化学的に変性（ブロック）されて中性基となっている変異体Ｇ 変異体酵素のブロティナーゼ活量は参考のため本願明細書にその内容を引用した Ｎｏｖａ−Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ／Ｓ、　Ｂａｇｓｖａｅｒｄ、　Ｄｅｎｍａｒｋ から発行のＮ０ＶＯＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　ＡＦ　２２０−ｇｂ　（または新 版）に記載されているジメチルカゼイン（ＤＭＣ）法によって分析評価すること ができる。

洗浄テストは下記の洗剤系において行われた：洗浄液は下記組成（重量％）から 成る２０°Ｃの０．８３ｇ／Ｌ溶液であった：直両１蔦ツアルキルベンゼンスル ネン酸ナトリウム　２５ゼオライトＡ　２２ 珪酸ナトリウム　５ 硫酸ナトリウム　４ ポリエチレングリコール　２ 炭酸ナトリウム　１７ （Ｗｅｒｎｅｒ　Ｍａｔｈｉｓ　ＡＧ、　Ｚｕｒｉｃｈ、　５ｗ１ｔｚｅｒｌａ ｎｄ）の製造にかかるＭａｔｈｉｓＷａｓｈｉｎｇ　ａｎｄ　Ｄｒｙｉｎｇ　Ｕ ｎｉｔ　Ｔｙｐｅ　ＴＨの草ジュースを満たした容器に糊抜き綿布（１００％綿 、ＤＳ７１　）に通して約０．１ｇのテスト布（２，２ａｎｘ２、２ｃｍ）を作 成し、最後に布を室温の強い空気流で乾燥させ、室温で３週間貯蔵したのち、使 用まで１８°Ｃに保つ。

テストはすべて模型のミニウすツシュ・システムで行う。このシステムでは６（ ７の洗剤液が入っている１５０ｍ１ビーカー中で６枚のテスト布を洗浄する。ビ ーカーを磁気撹拌された２０℃の恒温水溶中に維持する。

１０分間洗浄したのち布をバケツの中で２５分間水道水で水洗いする。

次いで（日光を避けて）１晩布を空気乾燥し、Ｄａｔａｃｏｌｏｒ　Ｓ、Ａ、。

Ｄｉｅｔｋｉｋｏｎ、　５ｗ１ｔｚｅｒｌａｎｄの製造にかかるＥＬＲＥＰＨＯ ２０００光度計により４６０ｎｍにおいて反射率Ｒを測定する。

洗浄性能の目安として酵素を添加して洗浄したあとの反射率と酵素を添加しない で洗浄したあとの反射率との差に相当する反射率差ΔＲを利用する。

改善率は用量反応曲線から計算され、問題の野生型酵素との比較において一定の ΔＲ値を得るのに要する酵素量と関連する。ここでは酵素の性能を「野生型」サ ブチリシン３０９（’ｗｔ’　）の性能と比較した。例えば、改善率２は同じΔ Ｒ値を得るのに半分の酵素量で足りることを意味する。

結果は下記の通りであったニ プロテアーゼ：　ｐｉ（ｃａｌｃ）　下記ｐＨにおける改善率Ｂ　９．６　１． ４　１．３　３．６　１．９これらの変異体プロテアーゼのうち好ましいのはプ ロテアーゼＢであり、滴定曲線が最もゆるやかで、改善率が野生型酵素と比較し て最も大きい。

以下に本発明の洗剤組成の実施例を列記するが本発明はこれらの実施例に制限さ れるものではない。

洗剤Ｄ１＝ ビルダーとして燐酸塩を含有する本発明の実施例として下記成分から粉末洗剤を 調合する：活性洗剤総量約１６％、アニオン性洗剤約９％、非イオン性洗剤約６ ％、燐酸塩系ビルダー約２０％、アクリルまたは等価のポリマー約３．５％（あ るいは約２％）、漂白先駆物質として過硼酸的６−１８％（あるいは約１５−２ ０％）、アミノ含有漂白賦活剤的２％、珪酸塩またはその他の構造剤的３．５％ （あるいは約８％）、約８グリシン単位／ｍｇ活量の酵素、使用に必要なｐＨに 調節するためのアルカリ、及び中性無機塩、及び酵素（各酵素約０．５％）。

アニオン性洗剤はドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムまたは直鎖型アルキル ベンゼンスルホン酸ナトリウム６％と、第１硫酸アルキル３％の混合物である。

非イオン性洗剤は１モル当りエトキシレート残基を７個有する約Ｃ１３−Ｃ１５ 第１アルコールのエトキシレートである。ビルダーとしての燐酸塩はトリポリ燐 酸ナトリウムである。ポリマーはポリアクリル酸またはアクリル／マレイン・コ ポリマーである。漂白先駆物質としての過硼酸塩は四本化または一水化四硼酸ナ トリウムである。賦活剤はテトラアセチルエチレンジアミンである。構造剤は珪 酸ナトリウムである。中性無機塩は硫酸ナトリウムである。酵素は上述したプロ テアーゼＢである。

洗剤Ｄｌａ： ビルダーとして燐酸塩を含有する本発明の実施例として下記成分から粉末洗剤を 調合する二活性洗剤総量約１５％、アニオン性洗剤約６％、燐酸塩系ビルダー約 ２５％、アクリルまたは等価のポリマー約０．５％、漂白先駆物質としての過硼 酸塩約１０％、アミノ含有漂白賦活剤的２％、珪酸塩またはその他の構造剤的６ ％、約８グリシン単位／ｄグレードのプロテアーゼ酵素、使用に必要なｐＨに調 節するためのアルカリ、及び中性無機塩、及び酵素（各酵素約０．５％）。

アニオン性洗剤は直鎖型アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムである。非イオ ン性洗剤は１モル当り７個のエトキシレート残基を育する約Ｃ１３−Ｃ１５第１ アルコールのエトキシレートまたはこれと対応の、即ち、１モル当り３個の残基 を有するようにエトキシレートされたアルコールとの混合物である。ビルダーと しての燐酸塩はトリポリ燐酸ナトリウムである。漂白先駆物質としての過硼酸塩 または過酸は四本化四硼酸ナトリウムである。賦活剤はテトラアセチルエチレン ジアミンである。構造剤は珪酸ナトリウムである。中性無機塩は硫酸ナトリウム である。酵素は上記プロテアーゼＢである。

洗剤Ｄ２： ビルダーとしてゼオライトを含有する本発明の実施例として、下記成分から粉末 洗剤を調合する：活性洗剤総量約１６％、アニオン性洗剤約９％、非イオン性洗 剤約６％、ゼオライト系ビルダー約２０％、アクリルまたは等価のポリマー約３ ％、漂白先駆物質としての過硼酸塩約６−１８％、珪酸塩またはその他の構造剤 的３．５％または約２．５％、約８（または約５）グリシン単位／ｍｇの酵素、 使用に必要なｐＨに調節するためのアルカリ、及び中性無機塩、及び酵素（各酵 素約０．５％）。

アニオン性洗剤はドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムまたは直鎖型アルキル ベンゼンスルホン酸ナトリウム６％と、第１硫酸アルキル３％の混合物である。

非イオン性洗剤は１モル当り７個のエトキシレート残基を育する約Ｃ１３−Ｃ１ ５第１アルコールのエトキシレートである。ゼオライト系ビルダーはＡゼオライ トである。ポリマーはポリアクリル酸である。漂白先駆物質としての過硼酸塩は 四本化または一水化四硼酸ナトリウムである。賦活剤はテトラアセチルエチレン ジアミンである。構造剤は珪酸ナトリウムである。中性無機塩は硫酸ナトリウム である。酵素は上記プロテアーゼＢである。

洗剤Ｄ２ａ： 七オライド系ビルダーを含有する本発明の実施例として下記成分から粉末洗剤を 調合する：活性洗剤約１４％、アニオン性洗剤約７％、非イオン性洗剤約７％、 ゼオライト系ビルダー約２５％、アクリルまたは等価のポリマー約３％、アミノ 系漂白賦活剤的２％、珪酸塩また。はその他の構造剤的０．５％、約６個のグリ シン単位／ｍｇを有する酵素、使用に必要なｐＨに調節するためのアルカリ、及 び中性無機塩、及び酵素（各酵素約０．５％）。

アニオン洗剤は直鎖型アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムであり、非イオン 性洗剤は１モル当り７個及び３個のエトキシレート残基をそれぞれ有する約ＣＩ ３−　Ｃ１５第１アルコール・エトキシレートの混合物である。ゼオライト系ビ ルダーはＡゼオライトである。

ポリマーはアクリル／マレイン・コポリマーである。漂白先駆物質としての過硼 酸塩は一水化四硼酸ナトリウムである。賦活剤はテトラアセチルエチレンジアミ ンである。構造剤は珪酸ナトリウムである。中性無機塩は硫酸ナトリウムである 。酵素は上記プロテアーゼＢである。

洗剤Ｄ３： 本発明の実施例として下記成分から水性液状洗剤を調合するニドデシルベンゼン スルホン酸１６％、７モル１モルのエチレンオキシドで縮合したＣ　Ｉ２−　Ｃ １５直鎖型アルコール７％、モノエタノールアミン２％、クエン酸６．５％、キ シレンスルホン酸ナトリウム６％、水酸化ナトリウム約４．１％、プロテアーゼ ０．５％、微量成分及び水１００％またはそれ以下。ｐＨは９乃至ｌＯの範囲に 調節する。酵素は上記プロテアーゼＢ及び／またはＣである。

洗剤Ｄ４： 本発明の実施例として４．９モル１モルのエチレンオキシド及び２．７モル１モ ルのプロピレンオキシドでアルコキシル化したＣ　１３−Ｃｌ３直鎖型第１アル コール３８．５％、トリアセチン５％、三燐酸ナトリウム３０％、ソーダ灰４％ 、微量のすキソ硼酸塩を含む一水化過硼酸ナトリウム１５．５％、ＴＡＥＤ　４ ％、０．１％がホスホン酸であるＥＤＴＡＯ１２５％、Ａｅｒｏｓｉｌ　０．６ ％、ＳＣＭＣ１％、及びプロテアーゼ０．６％から非水性液状洗剤を調合する。

ｐＨは９乃至ｌＯｌ例えば約９．８に調節する。酵素は上記プロテアーゼＢ及び ／またはＣである。

洗剤Ｄ５： 本発明の実施例として下記成分からかさ密度が少な（とも６００ｇ／ｌの顆粒状 洗剤を調合する：約ｌＯ％がドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、残りが５ ｙｎｐｅｒｏｎｉｃ　Ａ７と５ｙｎｐｅｒｏｎｉｃ　Ａ３（約５．５％乃至４． ５％）の混合物である約２０重量％の界面活性剤、中性無機塩（例えば硫酸ナト リウム）０％、燐酸塩系ビルダー約３３％、西水化過硼酸ナトリウム約１６％、 ＴＡＥＤ賦活剤約４．５％、珪酸ナトリウム約６％、炭酸ナトリウム約２％を含 む微量成分、及び水分的ｌＯ％。酵素（各酵素約０．５％）をも含む。酵素は上 記プロテアーゼＢである。

洗剤Ｄ６： 本発明の実施例としてかさ密度が少なくとも６００ｇ／Ｉ！または約５５０ｇ＃ の顆粒状洗剤を下記成分から調合する：約９％または約７％がドデシルベンゼン スルホン酸ナトリウムまたは直鎖型アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムであ り、残りが５ｙｎｐｅｒｏｎｉｃ　Ａ７と５ｙｎｐｅｒｏｎｉｃ　Ａ３　（また はこれらと類似のエトキシレート）（それぞれ５％と６％、または約４％と７％ ）の混合物である約２０または約１６重量％の界面活性剤、中性無機塩（例えば 硫酸ナトリウム）０％、ゼオライト系ビルダー約３０％または約２５％、四本化 または−水化過硼酸ナトリウム約１４％または１５％、ＴＡＥＤ賦活剤約３．６ ％、及び炭酸ナトリウムを含む微量成分約９％または約１５％、Ｄｅｑｕｅｓｔ 　２０４７約０．７％及び水分約１０％。酵素（それぞれ約０．５％またはリパ ーゼ０．２％及びプロテアーゼ約０．７％）をも含む。酵素は上記プロテアーゼ Ｂである。

洗剤Ｄ６ａ： 本発明の実施例として、かさ密度が少なくとも６００　ｇ　／　ｌの顆粒状洗剤 を調合する：約７％が直鎖型アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、２％が第 １硫酸アルコール、残りが５ｙｎｐｅｒｏｎｉｃ　Ａ７または類似のエトキシレ ートである約１５重量％の界面活性剤、中性無機塩（例えば硫酸ナトリウム）０ ％、ゼオライト系ビルダー約２２％、四本化過硼酸ナトリウム約１５％、ＴＡＥ Ｄ賦活剤約７％、炭酸ナトリウムを含む微量成分約１５％、Ｄｅｑｕｅｓｔ　２ ０４７約０．７％、及び水分約ｌθ％。

酵素（約１．２％）として上記プロテアーゼＢなども含まれる。

洗剤Ｄ７： 本発明の実施例として下記成分を含有する粉末洗剤を調合するニドデシルベンゼ ンスルホン酸６％、７モル１モルのエチレンオキシドと縮合したＣ　Ｉ２−　Ｃ １５直鎖覆アルコール５％、脂肪酸石けん３％、５ｏｋｏｌａｎ　ＣＰ５ポリマ ー３％、ゼオライトＡ　２２％、炭酸ナトリウム１０％、硫酸ナトリウム１７％ 、粘土粒子８％、四本化過硼酸ナトリウム１３％、テトラアセチルエチレンジア ミン２％、プロテアーゼ０．５％、微量成分及び水１００％またはそれ以下。ｐ Ｈを９乃至ｌＯに調整する。プロテアーゼ酵素は上記プロテアーゼＢである。

洗剤Ｄ８： 本発明の実施例として下記のように棒状洗剤（捧石けん）を調合する：完全けん 化８２％獣脂と１８％のココナツツ油をベースとし、０．１５％のオルト燐酸で 中和し、（捧組成物の約８ＧＵ／ｍｇに相当する）プロテアーゼ及びギ酸ナトリ ウム２％、硼砂２％、プロピレングリコール２％及び硫酸ナトリウム１％と混合 したのち、石けん製造ラインを進む。プロテアーゼ酵素は上記プロテアーゼＢ及 び／またはＣである。

洗剤Ｄ９： 構造性の液状洗剤はプロテアーゼのほかに例えば２−１５％の非イオン性界面活 性剤、場合によってはアニオン性界面活性をも含めて合計５−４０％の界面活性 剤、５−３５％の燐酸塩系または非燐酸塩系ビルダー、分子量が１０６以上の例 えば交差結合アクリルポリマーのような０．２−０．８％の増粘ポリマー、少な くとも１０９６の珪酸ナトリウム例えば中性水ガラス、ｐＨを所要の値、好まし くは９−１０またはそれ以上の値、例えば１１に調節するためのアルカリ（例え ば、カリウムを含むアルカリ）を含有することができ、ナトリウム陽イオンと珪 酸塩陰イオン（遊離シリカ）の重量比は０．７：１．粘度０．３−３０Ｐａｓ（ ２０℃、２０ｓ−１）とすればよい。

好適な実施例は１モル当り約５個のＥＯ基及び１モル当り約２．７個のＰＯ基で アルコキシレートされた約５％の非イオン性界面活性剤Ｃ１３−Ｃ１５アルコー ル、シリカと酸化ナトリウムの重量比が３．５の中性水ガラス１５−２３％、さ らに１３−１９％のＫＯＨ，８−２３％の５ＴＰＰ、　０−１１％の炭酸ナトリ ウム、０．５％のＣａｒｂｏｐｏｌ　９４１を含有する。

プロテアーゼとしては上記プロテアーゼＢを例えば０．５％の組成比で組込めば よい。

洗剤Ｄ１０： 洗濯用に適した構造性の高粘度水性液状洗剤を下記のように調合する（重量％） ： クエン酸　２．５ 硼砂（１０ｓｇ）　４ ＮａＯＨ２ Ｃ１４−Ｃ１５直ｆｉｌ型アルキルベンゼンスルネン酸塩またはＣ１４−Ｃ１５ 第１硫酸了ルコール　６．５Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ　Ａ３ 非イオン性Ｃ１２−Ｃｌ３　３Ｅ０　１．２Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ　Ａ７ 非イオン性Ｃ１２−Ｃｌ３　７Ｅ０　３．６アミラーゼ（テルマミル３００ＬＤ Ｘ）　０．２微量成分及び水　残余 ｐＨは９乃至ＩＯに調節する。酵素は上記プロテアーゼＢである。

洗剤Ｄ１１＝ 洗濯用の等優性の水性液状洗剤を下記のように調合する（重量％）クエン酸　２ 硼酸　１ 非イオン性界面活性剤 （Ｃ１２−アルコール　６．５ＥＯエトキンレート基１モル）１０（または第　 １　硫酸アルコールｔトリウム）オレイン酸　１６ ヤシ油（Ｃ１２）石けん　１１ プロテアーゼ　０．５ 微量成分及び水　残余 ｐＨは９乃至ＩＯに調節する。酵素は上記プロテアーゼＢ及び／またはＣである 。

洗剤ＤＩ２： 下記成分組成で水性液状洗剤を調合する：アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウ ム　１４．５Ｃ１８ナトリウム石けん　２ 非イオン性洗剤（ＣＩ２−１５　６ＥＯ）　９脂肪酸（オレイン酸）４．５ アルケニルンはく酸ナトリウム　１１ クエン酸ナトリウム　３．２ キレート剤、例えばＤｅｑｕｅｓｔ　２０６０　０．７塩化ナトリウム　０．５ 微量成分及び水　残余 ｐＨは９乃至１０に調節すればよい。酵素は上記プロテアーゼＢ及び／またはＣ である。

洗剤Ｄ１３： 下記組成を有する水性液状洗剤を調合する：アルキルベンゼンスルホン酸ナトリ ウム　８非イオン性洗剤６．５Ｅ０　１０ オレイン酸ジエチルアミド　ｌＯ 脂肪酸（Ｃ１２／Ｃ１８７５：２５）　１８クエン酸ナトリウム　Ｉ トリエタノールアミン　５ Ｄｅｑｕｅｓｔ　２０６０　０．５ 微量酸分及び水　残余 ｐＨは９乃至ｌＯに調節すればよい。酵素は上記プロテアーゼＢ及び／またはＣ である。

洗剤Ｄ１４： 下記組成（重量％）となるように非水性液状洗剤を調合する：液状非イオン性洗 剤（ＣＩＯ−１２，６，２ＥＯ）　４１％トリアセチン　５ 直鎖型アルキルベンゼンスルホン酸　６安定剤としての酸化マグネシウム　ｌ ビルダー／ベースとしての炭酸ナトリウム　１８ビルダーとしての炭酸カルシウ ム　８ 漂白賦活剤ＴＡＩＩ：Ｄ　３．５ 漂白先駆物質としての一水化過硼酸塩　１０．５部分疎水性シリカ　２ プロテアーゼ　０．４ リパーゼ（Ｌｉｐｏｌａｓｅ）　３ 微量酸分または補足の液状非イオン性 界面活性剤（水を含まず）　残余 この組成物の調合に際しては、液状非イオン性界面活性剤及びトリアセチンを先 ず添加してから酸化マグネシウムを、さらに酵素以外のその他の成分を添加する 。コロイドミルで混合物を混練して冷却し、最後に酵素やその他の感熱性微量成 分を添加する。

酵素は上記プロテアーゼＢである。

例えば上記プロテアーゼＢとはＥＰ　０３４２１７７に開示されている洗剤組成 を使用することもできる。

以上、特定の実施例に基づいて本発明を説明したが、これらの実施例は本発明の 用途及び範囲を制限するものではなく、本発明は以上に述べ、請求の範囲におい て後記する構成要件のあらゆる組合わせに及ぶものである。

浄書（内容に変更なし） 手続補正書（方式） 平成５年７月り日 １、　事件の表示 ＰＣＴ／ＤＫ　９１１０　Ｑ　３９９ Ｚ　発明の名称 ｐＨ範囲にわたり分子荷電が低度に異なる突然変異体酵素 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　ノポノルディスクアクティーゼルスヵブ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号静光虎ノ門ビル　電話３５０ ４−０７２１６、補正の対象 （１１明細書、請求の範囲及び要約書の翻訳文（２）図面の翻訳文 ７、補正の内容 （１１明細書、請求の範囲及び要約書の翻訳文の浄書（内容に変更なし） （２）図面の翻訳文の浄書（内容に変更なし）（２）図面の翻訳文　１通 国際調査報告 ｍｌｙ＋ｕｌ１Ｍ−＾−にネー１１Ｌ　ＰＣＴ／ＤＫ　９１１００３９９１．□ ニー１灯八東９１１００３的 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，”　識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｒ１：１９） （Ｃ１２Ｎ　９１５６ ＣＩ　２　Ｒ１：１２５） （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＳＥ）、　ＡＴ、 　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ、　ＤＫ、　ＥＳ 、　Ｆｌ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、　ＭＧ、　 ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ。

ＰＬ、ＲＯ，ＳＤ、ＳＥ、５Ｕ （７２）発明者　オルセン、オレ　ビルステッドデンマーク国、デーコー−２７ ００ブローエンショエイ、バエケスコウバイ　３８ （７２）発明者　エリクセン、ニーナ デンマーク国、デーコー−２０００フレデリクスベルウ、１．テーベー、マチイ ルデバイ１５ （７２）発明者　りンデガールド、ポールデンマーク国、デーコー−２１００コ ペンハーゲン　Ｏ，オースチル　ソエガゼ　５２Ｉ （７２）発明者　カステレイーン、エリクオランダ国、エヌエル−２９０７セー ヘ一カベル、パリエテルブルハ　１０５ （７２）発明者　マールテン、ロベルト　エフモンドオランダ国、エヌエル−３ ４６１ヘーデーリシスホーテン、デ　ネス　謁、アー／デー　イーセル （７２）発明者　ハフェルカンプ、ヨハンオランダ国、エヌエル−２６６１カー エルベルフスヘンホーク、デ　クロス　カルペル４０ （７２）発明者　ムステルス、ワウチルオランダ国、エヌエル−３１４１エルデ ーマースルイス、ウィッペルスパルク　１３８（７２）発明者　デ　フリーフ、 ヤコブオランダ国、エヌエル−３０１１カーハーロッテルダム、ホウドセシンヘ ル　２７４工

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ｐＨ範囲に亘るプロテアーゼの分子電荷変動を親プロテアーゼよりも軽度に する（例えば、ｐＨ範囲に亘って電荷をほぼ一定、例えば中性に近づける）少な くとも１つのアミノ酸配列突然変異を誘発することを特徴とする例えば変異体サ ブチリシンプロテアーゼのような変異体プロテアーゼ。 ２．サブチリシンのアミノ酸配列の１又は複数の突然変異が約７乃至約１１のｐ Ｈ範囲内における変異体プロテインのプロテアーゼ分子電荷変動を親プロテアー ゼよりも軽度にする（例えばほとんど一定、例えば正味電荷がほぼゼロの状態） ことを特徴とする請求の範囲第１項に記載のプロテアーゼ。 ３．前記軽度の正味電荷変動が約７乃至約１１のｐＨ範囲内の少なくとも０．５ ｐＨ単位のｐＨ範囲内で現われることを特徴とする請求の範囲第２項に記載のプ ロテアーゼ。 ４．前記軽度の正味電荷変動が約７乃至約１１のｐＨ範囲内の少なくともＩｐＨ 単位のｐＨ範囲内で現われることを特徴とする請求の範囲第２項または第３項に 記載のプロテアーゼ。 ５．前記軽度の正味電荷変動が約７乃至約１１のｐＨ範囲内の少なくとも２ｐＨ 単位のｐＨ範囲内で現われることを特徴とする請求の範囲第２項、第３項または 第４項に記載のプロテアーゼ。 ６．前記軽度の正味電荷変動が約８乃至約１１のｐＨ範囲内のほとんど全域に亘 って現われることを特徴とする請求の範囲第２項から第５項までのいずれかに記 載のプロテアーゼ。 ７．前記軽度の正味電荷変動が約７乃至約１１のｐＨ範囲内のほとんど全域に亘 って現われることを特徴とする請求の範囲第２項から第６項までのいずれかに記 載のプロテアーゼ。 ８．プロテアーゼの正味電荷が１分子当り±１電荷の偏差範囲内でほとんど一定 またはほとんどゼロのままであることを特徴とする請求の範囲第２項から第７項 までのいずれかに記載のプロテアーゼ。 ９．前記ほとんど一定またはほとんどゼロの正味電荷の偏差範囲が１分子当り± ０．５電荷以内であることを特徴とする請求の範囲第２項から第８項までのいず れかに記載のプロテアーゼ。 １０．前記ほとんど一定の正味電荷が約＋４，＋３，＋２，＋１，０，−１，− ２，−３または−４であることを特徴とする請求の範囲第８項または第９項に記 載のプロテアーゼ。 １１．約８乃至１１の範囲よりも外側、例えば約７乃至１２の範囲よりも外側に 側鎖ｐＫａを有する残基に置き換えるか、または残基が全く無くするような、少 なくとも１つのリシン、ヒスチジン、システイン及び／またはチロシン残基突然 変異を誘発することを特徴とする請求の範囲第１項から第１０項までのいずれか に記載のプロテアーゼ。 １２．（リシンまたはシステインを）アルギニン、ロイシン、スレオニン、アス パラギン、グルタミン酸またはアスパラギン酸に；（チロシンを）フェニルアラ ニン、スレオニン、バリン、トリプトフアンまたはグルタミン酸に；または（ヒ スチジンを）グルタミン、アスパラギン、セリン、グルタミン酸またはアスパラ ギン酸に置き換えるような少なくとも１つのリシン、ヒスチジン、システイン及 び／またはチロシン残基突然変異を誘発することを特徴とする請求の範囲第１項 から第１１項までのいずれかに記載のプロテアーゼ。 １３．下記突然変異の少なくとも１つを誘発することを特徴とする請求の範囲第 １項から第１１項までのいずれかに記載のプロテアーゼ：Ｅ５４Ｄ，Ｈ１７Ｑ， Ｈ１２０Ｄ，Ｈ１２０Ｎ，Ｈ２２６Ｓ，Ｈ３９Ｓ，Ｋ２７Ｒ，Ｋ９４Ｒ，Ｋ２３ ５Ｌ，Ｋ２３７Ｒ，ＫＺ５１Ｅ，ＫＺ５１Ｎ，Ｙ９１Ｆ，Ｙ１６７Ｅ，Ｙ１５７ Ｆ，Ｙ１７１Ｆ，Ｙ１７１Ｖ，Ｙ１９２Ｅ，Ｙ１９２Ｆ，Ｙ２０９Ｆ，Ｙ２０９ Ｌ，Ｙ２１４Ｆ，Ｙ２１４Ｔ，Ｋ２３５Ｒ，Ｙ２５３Ｆ。 １４．下記の突然変異または突然変異群の少なくとも１つを誘発することを特徴 とする請求の範囲第１３項に記載のプロテアーゼ：ａ−ＫＺ７Ｒ； ｂ−Ｈ１７Ｑ＋Ｋ２７Ｒ＋Ｈ３９Ｓ； ｃ−Ｅ５４Ｄ＋Ｙ９１Ｆ＋Ｋ９４Ｒ； ｄ−Ｅ５４Ｄ＋Ｙ９１Ｆ＋Ｋ９４Ｒ＋Ｈ１２０Ｄ；ｅ−Ｅ５４Ｄ＋Ｙ９１Ｆ＋Ｋ ９４Ｒ＋Ｈ１２０Ｎ；ｆ−Ｙ１６７Ｆ＋Ｙ１７１Ｖ＋Ｙ１９２Ｆ＋Ｙ２０９Ｆ＋ Ｙ２１４Ｔ；ｇ−Ｋ２３５Ｌ＋Ｋ２３７Ｒ＋Ｋ２５１Ｅ＋Ｙ２６３Ｆ；ｈ−Ｋ２ ３５Ｌ＋Ｋ２３７Ｒ＋Ｋ２５１Ｎ＋Ｙ２６３Ｆ；ｉ−Ｈ２２６Ｓ＋Ｋ２３５Ｌ＋ Ｋ２３７Ｒ＋Ｋ２５１Ｎ＋Ｙ２６３Ｆ；ｋ−Ｈ２２６Ｓ＋Ｋ２３５Ｌ＋Ｋ２３７ Ｒ＋Ｋ２５１Ｅ＋Ｙ２６３Ｆ；ｇ′−Ｋ２３５Ｒ＋Ｋ１３７Ｒ＋Ｋ２５１Ｅ＋Ｙ ２６３Ｆ；ｈ′−Ｋ２３５Ｒ＋Ｋ２３７Ｒ＋Ｋ２５１Ｎ＋Ｙ２６３Ｆ；ｉ′−Ｈ ２２６Ｓ＋Ｋ２３５Ｒ＋Ｋ２３７Ｒ＋Ｋ２５１Ｎ＋Ｙ２６３Ｆ；ｋ′−Ｈ２２６ Ｓ＋Ｋ２３５Ｒ＋Ｋ２３７Ｒ＋Ｋ２５１Ｅ＋Ｙ２６３Ｆ．１５．それぞれの文字 が請求の範囲第１４項に示した突然変異または突然変異群を表わすとして、下記 の突然変異または突然変異群の少なくとも１つを誘発することを特徴とする請求 の範囲第１４項に記載のプロテアーゼ： セットａ＋ｃ＋ｆ＋ｇ，ｂ＋ｄ＋ｆ＋ｉ，ｂ＋ｅ＋ｆ＋ｋ，ｂ＋ｅ＋ｆ＋ｉ，ｂ ＋ｄ＋ｆ＋ｋ，ａ＋ｃ＋ｆ＋ｇ′，ｂ＋ｄ＋ｆ＋ｉ′，ｂ＋ｅ＋ｆ＋ｋ′，ｂ＋ ｅ＋ｆ＋ｉ′，ｂ＋ｄ＋ｆ＋ｋ′。 １６．Ｎ−末端アミノ基を約８乃至１１の範囲より外側、例えば約９乃至１２の 範囲より外側にｐＫａを有する基に転換できる試薬で請求の範囲第１項から第１ ５項までのいずれかに記載のプロテアーゼを処理することを特徴とする方法。 １７．約７−１２、（例えば８−１１のアルカリｐＨに電荷を安定させるためプ ロテアーゼのＮ−末端アミノ基を変性させることのできる試薬と反応させたこと を特徴とする請求の範囲第１項から第１５項までのいずれかに記載のプロテアー ゼ。 １８．プロテアーゼがサブスチリシンＢＰＮ′、サブスチリシンアミロサッカリ チクス、サブスチリシン１６８、サブスチリシンメセンテリコベプチダーゼ、サ ブスチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ、サブスチリシンＤＹ、サブチリシン３０９、 サブスチリシン１４７、サブスチリシンテルミターゼ、プロテアーゼＴＷ７、プ ロテアーゼＴＷ３、及びプロテアーゼＫまたはアクアリシンから選択された親酵 素の突然変異を表わすことを特徴とする請求の範囲第１項から第１７項までのい ずれかに記載のプロテアーゼ。 １９．プロテアーゼが親サブチリシンとしてサブチリシン３０９をベースとする ことを特徴とする請求の範囲第１８項に記載のプロテアーゼ。 ２０．プロテアーゼが親サブチリシンとしてサブチリシン１４７をベースとする ことを特徴とする請求の範囲第１８項に記載のプロテアーゼ。