JPH06504201A

JPH06504201A - 酵母ゲノム用“多部位”組込みカセット

Info

Publication number: JPH06504201A
Application number: JP4502908A
Authority: JP
Inventors: ニコラ，アラン; キュドラ，ベルナール; ラバ，ナタリー; パルド，ダニエル
Original assignee: ウーロリジンヌ
Priority date: 1990-12-13
Filing date: 1991-12-13
Publication date: 1994-05-19
Also published as: FR2670502A1; WO1992010577A1; CA2098304A1; EP0575338A1; FR2670502B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】酵母ゲノム用“多部位”組込みカセット本発明の主題は酵母ゲノム内組込み用カセット、そのカセットで形質転換された酵母株及びこうして形質転換された酵母株を用いる興味の向けられた産物の製造プロセスである。

組込みカセットとは酵母ゲノム中への興味の向けられた配列の組込みを確実にするように考えられたあらゆる組立体を意味すると理解される。

酵母内組込みに関する様々な技術が提案されてきた。

このように、ＨＩＣＫＳら（１）は本来そこに存在しない配列の酵母ゲノム内組込みに際して、酵母ゲノム中に存在する配列とプラスミドにより保有される配列との相同的組換えで、得られるプラスミドによる酵母の形質転換に関する現象について記載した。

相同的組換えに基づく今までに提案された方法によれば、酵母ゲノム中への興味の向けられた配列の縦列マルチコピー組込みが行えた。しかしながら、このタイプの組込みは不安定であり、このことは完全に満足すべき水準の形質転換であるにもかかわらず興味の向けられた配列の発現レベルを増加させるために考えられたこの技術の限界を示す。

これは例えばリポソームＲＮＡについてコードするＤＮＡの縦列反復中への興味の向けられた配列の組込みに関する場合である。これらの配列は約１００〜２００コピー／細胞で存在する（２）。しかし、このような天然反復は減数分裂及び有糸分裂の双方に際して姉妹染色分体間で不等“乗換え°タイプの組換え現象をしばしばおこす。史に、縦列要素間で染色体内組換えによる切除現象は特にＨ，Ｃ，ＫＬＥＩＮら（３）で既に記載されている。このり・イブの再配列は形質転換株の遺伝的浮動を起こし、興味の向けられた配列の喪失を招くことがある（４）。

したがって、酵母ゲノム中に興味の向けられた配列の多数かつ安定な組込みを行い、この興味の向けられた配列の発現レベルを実質的に増加させる酵母内組込み方法が真に望まれている。

本発明者らは機能がこれまで記載されていなかったサツカロミセス属の酵母のゲノムの天然反復分散配列が使用ｖ１能であることを今般見出した。この配列は“ 非必須″といわれ、このような酵母のゲノム中への新規組込み方法を開発するために用いられる。

したがって、本発明の主題は少くともニー酵母ゲノムにおける天然反復分散非必須配列と相同性を示す１つの組込み配列一興味の向けられた配列を含むことで特徴付けられるサツカロミセス属の酵母のゲノム内組込み用カセットである。

本発明による組込みカセットの有利な態様によれば、それはサツカロミセス属の酵母、特にＳ、セレビシェ（Ｓ、ｃｅｒｃｖｉｓｉａｅ）、０９ｏｌｏＬ　Ｔ　Ｒタイプ配列、特に５ｏｌｏＬＴＲ配列、の相同体である配列を組込み配列として含む。

５ｏｌｏＬ　Ｔ　Ｒ配列は酵母の転位因子に由来する。転位因子とは所定微生物のゲノムにおいである位置から他に移動できるＤＮＡ配列である。酵母において、レトロトランスポゾンとして確認される転位因子はＲＮＡを用いたメカニズムで転位する。

４タイプの転位因子が酵母について明らかにされている。それらは’ｒｙ１、Ｔｙ２、Ｔｙ３及びＴｙ４と表示される。

これらの要素は各々混成であり、各々数百塩基対のＬＴＲ（長末端反復）に隣接される数ｋｂの内部領域からなる（図１）。これらＬＴＲの末端は１０ｂｐ以内の逆方向反復配列である。

Ｔｙ要素の転位は１つのＬＴＲから他に転写され４５ｂｐの末端反復を有するＲＮＡによって生じる。このＲＮＡの逆転写後に、コピーされたＤＮＡはゲノム中に組込まれ、Ｔｙの片側において染色体ターゲットの５ｂｐ重複を生じる（５）。そのＬＴＲ間の相同的組換えによりＴｙ要素は切除され、５ｂｐ重複で囲まれる’５ｏｌｏＬ　Ｔ　Ｒ”と呼ばれるＬＴＲ配列をその組込み領域内に残す。これらの５ｏｌｏ要素はそれ自体では転位できない。

レトロトランスポゾンＴｙ１及びＴｙ２は構造的に類似している。それらは５．３ｋｂの内部εドメインと３３４〜３３８ｂｐのδ要素と呼ばれる２つのフランキング直列反復配列を保持する。それらはハブロイドゲノム当たり３０〜３５コピーの割合で存在する。それらは頻繁に自らを遺伝子の５゛領域に挿入して変異発現を通常誘導することにより転位する（６．７）。

逆に、レトロトランスポゾンＴｙ３はＴｙｌ及びＴｙ２の配列と限定的な配列相同性を示す（８）。１〜４つのＴＹ３要素がＴｙ３要素の転位による変異を観察することなく細胞当たりで記載された。Ｔｙ３は４．７ｋｂの内部ドメインとシグマ配列と呼ばれる３４０ｂｐＬＴＲ配列から構成される５、４ｋｂ要素である。

そして、約に４コピーのＴｙ４要素が細胞当たりでみられている。対応フランキング配列はタウ（τ）要素と呼ばれる。

酵母Ｓ、セレビシェのゲノムはＴｙｌ及びＴｙ２要素と関連しない約１００コピーの５ｏｌｏデルタ配列を更に含む。これらの５ｏｌｏデルタ配列はそれらの間で１０〜４００６もの高い配列ダイバージェンスを示す（９）。それらは４〜５要素の群でみられ、ｔ　ＲＮＡに先行する数百塩基の中で時々みられる（１０）。それらはその２つのフランキングデルタ配列間の相同的組換えによるＴ）／の内部領域の切除におそらく起因している。

５ｏｌｏシグマ又はタウ配列もＳ、セレビシェのゲノムで同様にみられる。

これらの５ｏｌｏＬ　Ｔ　Ｒ配列はそれらかサツカロミセス属の酵母にとり必須の機能を有しないかぎり組込み配列として特に有利である；更に、それらは組込まれた配列の利益になる自然安定性を有する。本発明を用いて得られた結果を理論的仮説に結び付けるわけではないが、おそらく細胞メカニズムがこれら天然反復配列の組換えとひいては安定性をコントロールするらしいことがここでは想起できる。これらのメカニズムでは例えば特異的なトポイソメラーゼを要することとなろう。

本発明による発現カセットの有利な態様によれば、それは５ｏｌｏングマ配列の相同体である組込み配列を含む。

研究された酵母株に応じて、約３０コピーの５ｏｌｏシグマ配列か存在する。それらは二配列間で観察される最大ダイバージェンスが２．５％であることから互いに比較して高い配列保存性を示す（１１）。５０１０デルタ配列とは異なり、５ｏｌｏシグマ配列は転移ＲＮＡ　（ｔＲＮＡ）と密接な関係を示す。特に、それらはｔ　ＲＮＡの転写開始箇所から５゛側に１６〜１９ｂｐの距離で常に位置し、シグマ要素とｔ　ＲＮＡの発現との間で相互作用は起きないらしい。

５ｏｌｏシグマ配列が互いに比較して高い配列相同性を示すという事実は、所定５ｏｌｏングマの使用により他のＳｏｌ。

ングマ配９り内組込み用組立体を同等に目標とすることを可能にする。

このため、酵母ゲノム内で分散され様々な５ｏｌｏシグマ配列に対応する様々な特定の座で興味の向けられた配列を組込むことが単一の形質転換ステップによって可能になる。

他方、それらの厳格な位置、即ち様々なｔＲＮＡについてコードする遺伝子から５′側に１６〜１９ｂｐの距離にある位置はそれらの中に組込まれた興味の向けられた配列の染色体環境について予想することを可能にする。

最後にかつ特に、それらと発現されるｔ　ＲＮＡとの密接な関係は高度転写配列のすぐ近くに５ｏｌｏシグマを維持できることを示唆している。このため、必須遺伝子近くにこのレベルで導入された興味の向けられた配列は、ｔ　ＲＮＡの発現に影響を与えるいかなる主要再配列現象に対しても高選択からおそらく利益を得るであろう。

Ｓ、セレビシェの染色体Ｖｌｌｌ上でＡＲＧ４遺伝子近くに位置する５ｏｌｏングマ配列について更に具体的に言及することかできる。

組込みカセットを製造するため、形質転換される酵母の染色体上に位置する５ｏｌｏＬ　Ｔ　Ｒ配列は出発物質として使用され、この配列は興味の向けられた配列を含みかつサツカロミセス属の酵母を形質転換できるＤＮＡ断片を産生ずるよう当業者に公知の技術を用いて修正できる。

これらの修正は：（Ｄ他のいかなる染色体配列も除外して５ｏｌｏＬ　Ｔ　Ｒ配列をサブクローニング及び単離すること＜ｊｉ）この５ｏｌｏＬ　Ｔ　Ｒ配列内で興味の向けられた配列をクローニングすること（ｉｊ＋）単純な制限により、いかなる細菌配列も含まず何らかの興味の向けられた配列により遮断された５ｏｌｏＬ　ＴＲ配列を含むＤＮＡ断片を単離することを可能にするはずである。

細菌株でその選択及びその増幅を行うため、こうして製造されたＤＮＡ断片は特に細菌複製源と選択遺伝子、例えば抗生物質耐性用遺伝子を含む細菌ＤＮＡ断片と組み合わされる。

通常、興味の向けられた配列は興味の向けられた何らかの産物：タンパク質、酵素等をコードできる。それは天然で産生されない産物を酵母で産生させるか又は一方酵母で天然に産生される産物の発現レベルを増加させることが望まれるかどうかに応じて異種でも又は同種であってもよい。

したかって、本発明の主題は、更に、本発明による組換えカセットでの酵母の形質転換によるサツカロミセス属の酵母により興味の向けられた産物を製造するための方ｌ去である。

かなり明らかには、いくつかの配列の組込み後発現を行えるように、興味の向けられたいくつかの配列を本発明による組換えカセットに保持させることもできる。この態様は特定代謝産物製造用生合成経路の遺伝子でコートされるいくつかの有用なタンパク質又は一方いくつかの酵素を酵母で同時に産生させることが望まれる場合に特に有利である。

本発明のもう１つの態様によれば、本発明による組換えカセットか酵母ゲノム中への興味の向けられた様々な配列の連続組込みを行うために用いられる。特に、前記の場合のように、この方法は特定代謝産物用生合成経路のいくつかの遺伝子の組込みにとり有用である。

したかって、本発明の主題は更にサツカロミセス属の酵母による興味の向けられたいくつかの産物の製造プロセスであり、それによればニーサツカロミセス属の酵母は、各々が興味の向けられた産物の１つをコードするＤＮＡ配列を興味の向けられた配列として含む本発明による複数の組込みカセットで、連続的に形質転換されるか、又は一サツカロミセス属の酵母は、各々が興味の向けられた産物の１つをコードする興味の向けられたいくつかの配列を含む本発明による組込みカセットで、形質転換され、 −こうして形質転換された酵母株か培養され、そして−上記代謝産物が回収される。

本発明を実施するためには、興味の向けられた配列は組込み配列内でクローニングされることが好ましい。

本発明のもう１つの面によれば、興味の向けられたいくつかの産物を製造するサツカロミセス属の酵母は各々が興味の向けられた遺伝子のサブセットを保有する２つの親株間で遺伝的交雑により得られ、その遺伝子は本発明による多部位組込みカセットにより天然反復配列の部位に組込まれる。親特性の遺伝的組換えにより、天然反復配列の部位で組込まれた興味の向けられた異なる配列を含み、したがって興味の向１すられた遺伝子のすべてを含む娘株を生じる。

このようなメカニズムは特にｆＦ１１１ｃ２で実証される。

興味の向けられたいくつかの産物を製造するサツカロミセス属の酵母株は、本発明の更にもう１つの面によれば、興味の向けられた様々な遺伝子を保有する本発明によるいくつかの組込みカセットで酵母株の同時形質転換により得ることができる。サツカロミセス属の酵母の同時形質転換は本発明による組込みカセットと選択ベクターでも行える。

これらの様々な産生方式は興味の向けられたすべての望ましい遺伝子を保有する酵母を産生ずるために組み合わせて連続的に用いることができる。

本発明は本発明による組込みカセットで形質転換された酵ノリ株にも関する。更に具体的には、その主題は、少くとも１つの天然反復非必須配列中に単一コピーで組込まれ、かつ上記天然反復配列の部位でそのゲノム中に分散された少くとも１つの興味の向けられた配列をそのゲ２ツム中に含むサツカロミセス属の酵母株である。それは特にそのゲノム中における上記天然反復及び分散配列が５ｏｌｏソグマ配列であるＳ、セレビシェの株である。

特に天然反復配列の部位における興味の向けられた配列の本発明に従・う組込みは既に記載された組立体と比較Ｉ２て有利な点を有する。

実際に、興味の向けられた遺伝子のコピーは関連のない宿主ＤＮＡの様々な箇所でターゲット化されて組込まれる。更に、組込み部位は酵母に必須でなく、この組込み中にターゲット化の特異性のせいで細胞に必須である遺伝子の部分的又は全体的不活性化を起こすリスクはないことが知られている。

本発明の組込みカセットによる酵母の形質転換は様々な方法、特に電気穿孔法で実施できる。

本発明の他の特徴及び利点は下記図１〜２３に伴う例示６様の下記詳細な記載の中で明らかにされるであろうニー図１．酵母のＴＶレトロトランシスゾンの遺伝子構造−図２　：　Ｓ、セレビシェの染色体Ｖ１１１上によりＡＲＧ４遺伝子近くで保有される５ｏｌｏシグマ配列の周囲における染色体領域の物理的地図一図３　：　ＡＲＧ４遺伝子から５−側に４ｋｂで位置するＳ、セレビシェの染色体Ｖｌｌ＋の領域のヌクレオチド配列。最も頻繁に得られる５ｏｌｏシグマ配列で観察される差異はその配列の下で示される一図４：Ｓ、セレビシェ株、ＯＬ　１．　ＭＧＤ１３１１０２Ａ及びＹＮＮ２９５の５ｏｌｏシグマ配列含有率のオートラジオグラフィーによる分析 −図５：いかなる他の染色体配列も含まないシグマ配列を正確にクローニングする制限部位をシグマＶＩＩ１．ｌ要素と接する逆方向反復配列の片側で部位特異的変異誘発により導入する異なるステップ一図６＝プラスミドｐＢＫ６０５中に組込んでクローニングされたシグマ配列の中心で興味の向けられた配列をクローニングするため、この位置でＰＣＨによる変異誘発技術により制限部位を導入するために用いられる様々なオリゴヌクレオチド一図７＝プラスミドｐＢＫ６０９、ｐ　ＢＮ２１０及びｐＢＫ６１４の構造ｍ−８＝プラスミドｐ　ＢＮ２１０のＣ１ａＩ−Ｈｉｎｄｌｌｌ断片のヌクレオチド配列−図９ニブラスミドｐ　ＢＮ２１７の構造−図１０．プラスミドｐＢＫ６１１、ｐＢＫ６１５及びｐＢＫ６１６の構造一図１１　プラスミドｐＢＫ６２０及びＩ）ＢＫ６２３の構造一図１２：特異的プローブＵＲＡ３を用いた形質転換株ＯＲ７７８６，１〜ＯＲ７７８６，９の染色体のオートラジオグラフィー一図１３．特異的プローブＵＲＡ３を用いた形質転換株０ＲＴ７３１〜０ＲＴ７４０の染色体のオートラジオグラフィー一図１４：特異的プローブＡＲＧ４を用いた形質転換株０ＲＴ７２０〜０ＲＴ７３０の染色体のオートラジオグラフィー一図１５＝図１５ａ）ニブラスミドｐＢＫ６１１のＳｍａ　ｌ−Ｈｌ　ｎｄｌｌｌ断片の構造及び境界配列図１５ｂ）：得られたＡＲＧ　形質転換株のサザンプロット分析一図１６：逆ＰＣＲ増幅と呼ばれる組込み方式を調べるために用いられる手法と形質転換株０ＲＴ７２４及び０ＲＴ７２３のゲノム配列−図１７．形質転換株０ＲＴ１３０４．０ＲＴ１３０５及び０ＲＴ１３０６の染色体のオートラジオグラフィーによる分析一図１８．特異的プローブＵＲＡ３及びＡＲＧ４を用いた様々なＡＲＧ”　ＵＲＡ＋超形質転換株の染色体のオートラジオグラフィーによる分析（超形質転換株ＯＲＴ７２０．６．７２０．７．７２０．８．７２３．８及び７２３．９）一図１９＝超形質転換株ＯＲＴ　７４０．１　、７４０．２及び７４０．３に関することを除き図１７と同様の分析−図２０＝形質転換株ＯＲＴ　１３２０−Ｘ（７）染色体のオートラジオグラフィーによる分析 −図２１　：　形質ｋ１株ＯＲＴ　１３２７−Ｘノ染色体のオートラジオグラフィーによる分析 −図２２二同時形質転換株０ＲＴ７４６．７４７．７４８．７４９．７５１．７５２及び７５３に関することを除き図１７及び１８と同様の分析例ＩＳ、セレビシェの染色体Ｖｌｌ＋によりＡＲＧ４遺伝子近くに保有されるシグマ要素のクローニング及び特徴化公知シグマ配列（１１）から単離された特異的配列を用いたハイブリッド形成後、ＡＲＧ４遺伝子から５′側に４ｋｂでその位置を特定することを可能にしたシグマ要素に特徴的なＸｈｏｌ制限部位の存在により、検出した。

対応染色体領域の制限地図は図２に示される通りである。

シグマ要素を含む４ｋｂｐ　（ｓｐｏ１３）２プラスミド（１２）から得られるＢａｍＨＩ−Ｐｓ　ｔ　Ｉ制限断片（図２）は様々な制限断片　Ｘｈｏ　Ｉ　− Ｂｇ　ＩＩＩ　（０，８ｋｂ）、ＢｇｌｌｌＸｈｏｌ　（１，７ｋｂ）及びＢｇｌｌｌ−Ｅｃ。

ＲＩ　（２，１ｋｂ）を形成するために用いる。次いでこれら断片の各々をブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）Ｋ　Ｓ−タイプベクター〔ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））に組込んでサブクローニングし、プラスミドｐＢＬ１．ｐＢＬ４及びｐＢＬ６を各々得る。

これらの異なるプラスミドは一本鎖ＤＮＡを得ることを可能にし、出発物質としてオリゴヌクレオチドブライマーＴ３を用いたＳａｎｇｅｒ技術により配列決定される。

ＡＲＧ４遺伝子近くの染色体Ｖｌｌ＋のゾーンに関して得られたヌクレオチド配列は図３に示される通りである。

このヌクレオチド配列はＸｈｏＩ部位のレベルで２５８〜５９８位と考えられたが、その３４１塩基対はシグマ要素の標準配列に相当する。次いでこの断片は組込みを指示するために用いる。特に、この要素の特徴的境界部に対応する逆方向反復配列ＴＧＴＴＧＴＡＴ及び＾ＴＡＣＡＡＣＡは２５８〜２６５位と５９１〜５９８位で観察される。

加えて、その要素は直列方向に反復されるＧＡＡＴＧ配列の重複により接せられる。このＧＡＡＴＧ配列はシグマ要素に特異的でないが、但し組込み座に特異的である。シグマ要素の片側にあるこのＳ　ｂｐｆｆｆ複は、そのＬＴＲシグマ要素間の分子内組換えによるＴ　Ｙ　ＩＩＩの切除サインである。したかって我々はこの座で“５ｏｌｏシグマ゛要素を有することとなる。更に、転移ＲＮＡ遺伝子の配列は２４１〜１６９位てみられる。それはＡＣＧコドンを認識する主要イソアクセプターであるＡｌａ　ｔＲＮＡについてコードする遺伝子である。シグマ要素はこのｔ　ＲＮＡの転写開始点から５′側に１６塩基対でみられることが観察される。

以下の記載において、確認された各シグマ要素はシグマＸＸＸ、ｘｘで表示されるが、ここでローマ数字のｘＸｘはシグマを保有する染色体の数値を特定し、アラビア数字のＸＸは所定染色体におけるシグマを特定する。例えば、得られる配列はシグマＶＩ１１．ｌに由来する。

このシグマＶＩＩ１．ｔの配列をＳａｎｄｍｅｙｅｒ（１１）によりランダムにクローニングされた様々なシグマ要素の場合と比較することにより、一致がＳａｎｄｍｅｙｅｒのクローン魔７で観察される。更に、ジグ７Ｖｌｌ＋、ｌはＳａｎｄｍｅｙｅｒで主に得られた配列と比較して９つの配列単一性を有することが観察される（これらの配列単一性は対応塩基の５ａｎｄＩＩｅｙｅｒ配列下における指示で確認される一図３）。

このダイバージェンスは３４１中９つのヌクレオチド、即ち２．６％を表す。

例２サツカロミセス・セレビシェのゲノムのシグマ配列含有率の特徴化形質転換用の宿主として後で用いられるサツカロミセス・セレビシェの株ＯＬＩ及びＭ　Ｇ　Ｄ　１３１１０２Ａｌ：　ツイテ研究する。

これらの株は次の遺伝子型：　ＯＬ　１　：Ｈａｔａ、ｈｉｓ３−（１１゜１５）　、１ｅｕ２−（３，１１２）、ｕｒａ３−（２５７，３７３）、ｇａ１２とＭＧＤ１３１１０２＾Ｍａｔα、旧５３−１、ａｄｅ２、ａｒｇ４−Δ２０６０、ｕｒａ３−５２　、ｔｒｐｌ−２８９を示す。これら株の分析はパルスフィールド電気泳動［ＣＩＩＥＦ　ＤＩ？　ＩＩ、バイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））で染色体を分離することにより実施し、しかる後分離してから、染色体を／＼イボンド（ｌｌｙｂｏｎｄ）　Ｎ＋ナイロン膜〔アマーンヤム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）］上に移す。得られたフィルターはプラスミドｐＢＫ６０５に由来し３２Ｐで標識されたＣ１ａｌ−Ｈｉｎｄｌｌｌ断片によりランダムプライム化でハイブリッド形成させる。この断片はシグマＶＩＩ１．ｌ配列のみを保有する（図６）。

プラスミドｐＢＫ６０５の組立ては例３で詳細に記載されている。

株ＯＬＩ及び株Ｍ　Ｇ　Ｄ　１３１１０２＾の双方において３つの染色体ｖ１、Ｘ及びＸｌｌ＋はシグマ要素を有さず、染色体■、ＩＩＩ　、ＩＸ、　ＸＩ及びＩＩは１つの要素を保有するだけらしく、他の染色体はいくつかの要素を保有することが図４で示されたオートラジオグラフで観察できる。ＶＩＩ＋、１が単離された染色体Ｖｌｌ＋はいくつかの要素を保育するらしいことが観察できる。

染色体移動のマーカーとして用いられるＳ、セレビシェの株ＹＮＮ２９５　（バイオラッド）において、シグマ含有率は株ＯＬＩ及びＭ　Ｇ　Ｄ　１３１１０２Ａで観察される場合と異なることが観察できる。その結果はシグマ要素を保有する染色体と染色体当たりに存在するシグマ要素数の双方に関して株毎に異なる。

最後に、得られた結果は、選択されたシグマＶｌｌ＋、１がハブロイドゲノム当たり約３０と見積られる数の要素をハイブリッド形成できることを示す。したがって、それは他の８０１０シグマ要素において興味の向けられた配列の組込みを指令できるはずである。

帆ユ組込みベクターｐ　ＢＫ６１０及びｐＢＫ６１４の組立て１−シグマＶＮ１．ｌの部位特異的変異誘発最初の変異誘発では、いかなる他の染色体配列も除外してこの要素を正確にクローニングするシグマＶＩＩ１．ｌ要素制限部位に接する逆方向反復配列の片側における導入を行う。

これを行うため、シグマＶＩＩ１．Ｌ配列は、図５で詳記される変異原性オリゴヌクレオチドブライマーＡ及びＢを用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応）により増幅させる。

この変異誘発に用いられた初期組立体はシグマＶＩＩ＋、１を含む２．１ｋｂＢｇｌｌｌ−ＥｃｏＲＩ染色体断片を保有するプラスミドｐＢＬ６である。

増幅では用いられた２つのオリゴヌクレオチドプライマー間でＤＮＡ断片を合成する。この合成中におけるオリゴヌクレオチドＡ及びＢの物理的取込みはシグマ配列の５゛側で直列に５ｐｅｌ、Ｅａｇｌ及びＣｌａＩ部位と上記配列の３′側で直列にＨ１口ｄｌｌｌ　、　Ｓａ　ｌ　Ｉ及びＸｂａ１部位を形成する。

ＰＣＲ反応用の反応混合液（１００μｌ）はニー説イオン及び無菌水５３μｍ −ＩＯＸ緩衝液ｌＯμｌ　：０．５ＨＫＣｌ０．１Ｍ　トリスＣ１ｐＨ８，３１５１Ｍ　ＭｇＣｌ２０．１％（ａ＋／ｖ）ゼラチン −４つのｄ　Ｎ　Ｔ　Ｐ　１６μｍ　（各々１．２５ｍＭ）−オリゴヌクレオチドＡ５μｍ（２０μＭ）−オリゴヌクレオチド８５μ１（２０μＭ）−プラスミドｐ　Ｂ　Ｌ　６　１０μｌ　（５０ｎｇ）からなる。

混合液を１００℃で３分間インキュベートし、氷冷する。次いで熱安定ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ１μｌ　（５Ｕ）を混合液に加える。次いで後者に鉱油２００ μｌをいれる。

増幅反応はＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌａｌｅｒ　ＣｅｔｕｓＤ　Ｎ　Ａ熱すイクラ−で２５サイクル行うか、１サイクルはニー９４℃で２分間のＤＮＡ変性ステップ＝３７℃で２分間のアニーリングステップ＝７２℃で２分間の重合ステップからなる。

２５サイクル後、中断合成を完了させるため２０分間重合ステップを７２℃で実施する。

増幅産物の一部（２０μｌ）をアガロースゲル電気泳動で分離する。次いで得られた３　５０　ｂｐＤ　Ｎ　Ａ断片をガラスピーズ吸着により精製し、ＴＥに溶解させ、酵素５ｐｅｌ及び５ａｌｌで制限する。

次いでこの制限断片を酵素Ｘｂａｌ及び５ａｉｌで開環されたＭ１３ｍｐ１８ベクター中に組込んでクローニングし、プラスミドｐＢＫ６０５を得る（図６参照）。

実施された二次変異誘発の目的はシグマ要素の中心に制限部位を作成してこの位置で興味の向けられた配列をクローニングするためである。

これを行うため、２回のＰＣＲ増幅を出発物質としてプラスミドｐＢＫ６０５を用いて別々に実施する（図６）。

これら増幅の１回目はシグマ要素の中心における変異原性オリゴヌクレオチドＳｉｇＢとシグマ上流のベクターに位置する非変異原性オリゴヌクレオチドＲＥＶである。

第二増幅はＳｉｇＢに相補的である変異原性オリゴヌクレオチドＳ　ｉ　ｇＡとシグマ下流のベクターに位置する非変異原性オリゴヌクレオチドＯＮを用いて実施する。

オリゴヌクレオチドＳｉｇＡ及びＳｉｇＢの構造は図６で示されている。

こうして、２つの半分のシグマ要素をそれらの各々に関して２つの新しい部位：Ｂａ１ｌ又はＥａｅｌ及び５ｔｕｌを用いて合成する。

これら２回の合成産物をアガロースゲルで精製する。

第−増幅中に得られたＤＮＡ断片を酵素Ｓｍａ　Ｉ及び５ｔｕｌで制限し、しかる後酵素Ｓｍａ　！で開環されたブルースクリプトＫｓ＋中に組込んでクローニングし、プラスミドｐＢＫ６０９を得る（図７）。

第二増幅中に得られたＤＮＡ断片を酵素５ａｉｌ及び５ｔｕｌで制限する。次いでこの断片を、最初酵素Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩで開環されてポリメラーゼ！クレノウ断片で処理され、後酵素５ａｌｌで制限されたプラスミドｐＢＫ６０９中に組込んでクローニングする。

得られるプラスミドｐＢＫ６１０は図７で示される通りである。

プラスミドｐＢＫ６１０から得られたＣ１ａｌ−Ｃ１ａｌ制限断片を、Ｓ　ｍ　ａ　Ｉ　ｓ　Ｐ　ｓ　ｔ　Ｉ、ＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＶ部位を欠くブルースクリプトＫＳ＋に由来するプラスミドのＣｌａｌ部位に導入する。

こうして得られたプラスミドｐＢＫ６１４は図７で示される通りである。

この最後のプラスミドにおいては、Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩ及びＥａｇ１部位の型抜か抑制され、シグマ要素がＨｉ　ｎｄＩＩ＋及びＣｌａｌ部位で直接隣接される。

プラスミドｐＢＫ６１０のＣ１ａｌ−Ｈｉｎｄｌｌｌ断片を配列決定したが、その配列は図８に示される通りである。

この配列の分析では変異シグマ要素が制限部位で直接接せられ、それがその中間で４つの独特な部位：Ｂａ１ｌ又はＥａｅＩＳＰｓｔＩＳＥ、ｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＶを有することを示す。

これらの制限部位を保有する３８ヌクレオチド、即ち下記配列：ＣＣＡＡＡＧＡＧＧＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＴＣＧＡＴＡＴＣＡＡＧＣＴＣＣＴがシグマＶＩＩ１．Ｈ７）　１２中心ヌクレオチドＴＧＧＡＡＧＣＧＧＡの代わりに導入されていることに留意すべきである。

これらの異種ヌクレオチドは図８においてイタリック体で表される。

得られる変異シグマ要素はシグマＶＩ１１．１本と呼ばれる。

例４Ｓ、セレビシェのＵＲＡ３遺伝子を含む組込みベクターの組立てＵＲＡ３遺伝子（１３）を含むＥｃｏＲＩ−Ｎｓ　ｉ　Ｉ制限断片（１，１ｋｂ）のＤＮＡを精製し、酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔｌで開環されたプラスミドｐＢＫ６１４中に導入する。

得られたプラスミドｐ　ＢＫ６１７は図９に示される通Ｓ、セレビンエのＡＲＧ４遺伝子を含む組込みベクターの組立てＡＲＧ４転写単位（図２）を含むＳ、セレビシェゲノムからの２０６０ｂｐＩ（ｐａ　Ｉ−Ｈｐａ　Ｉ断片のＤＮＡをプラスミドｐＵｃ１８及びｐＵｃ１９のポリリンカーのＳｍａ　Ｉ部位でクローニングする。これらのクローニングから得られるプラスミドのＥｃｏＲＩ−Ｐｓ　ｔ　Ｉ断片（２、１ｋｂ）を精製し、酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔｌで開環されたプラスミドｐＢＫ６１０及びｐＢＫ６１４中に挿入する。これらの組立てから得られるプラスミドｐＢＫ６１１、ｐ　ＢＫ６１５及びｐＢＫ６１６は図１０でＳ、セレビシェの変異ａｒｇ４−ＥｃｏＲＶ及びａｒｇ４−Ｂｇｌｌ＋遺伝子を含む組込みベクターの組立て各々プラスミドｐＮＰｓ３０８及びｐＭＹ２３２から精製された変異ＡＲＧ４遺伝子、即ちａｒｇ４−ＥｃｏＲＶ又はａｒｇ４−Ｂｇｌｌｌのいずれか（Ｎｉｃｏｌａｓら、　１９８９）を含む２０６０塩基対ＨｐａＩ−ＨｐａＩ制限断片のＤＮＡをプラスミドｐＢＫ６１４のＥｃｏＲＶ部位てクローニングする。これらの組立て得られるプラスミドｐＢＫ６２０及びｐＢＫ６２３は図１１で示される。これらのカセットはそれらか変異形のＡＲＧ４遺伝子を含むことからシグマ：：ａｒｇ４と呼ばれる。

例７シグマ：：Ｕ　ＲＡ　３断片（ＵＲＡ３遺伝子で遮断されたシグマＶＩＩ！、１＊）によるＯＬＩ株の形質転換変異ｕ　ｒ　ａ　３−　（２５７，３７３）を保有する受容味ＯＬＩをプラスミドｐ　ＢＫ６１７の切断後にアガロースゲルから精製された１、　４ｋｂＨｉ　ｎ　ｄｌｌｌ−ＨＬｎ　ｄｌｒｌ断片（シグマ：：ＵＲＡ３）で電気穿孔法〔バイオ・ラッド中シーンパルサー（Ｂｌｏ−Ｒａｄ　Ｇｅｎｅｐｕｌｓｅｒ）］により形質転換する。

これを行うため、２×１０７細胞／１に達したＹＰＤ中の培養物８０１を３５００　ｒｐｍで５分間遠心する。細胞ペレットを２５ｍＭジチオスレイトール８１に溶解する。

細胞を室温で２０〜２５分間保ち、しかる後回遠心する。

ペレットを電気穿孔緩衝液ニー　２７０ｍＭスクロース一１０１ＭトリスＣ１，ｐＨ８ −０，１ｍＭ　ＭｇＣｌ２に８００μ！　（即ち１０９細胞／ａｔ）で溶解する。

以下を２ＩＩ１１電気穿孔キユベツトにいれるニー細胞１００μ１（１０８細胞）一＃′ｇ製断片１０μｍ　（１００〜５００ｎｇ）−キャリアＤＮＡ　１μｍ　（音波処理中胸腺Ｄ　Ｎ　Ａ　ｔｏμｇ）キュベツトを電気穿孔室にいれ、下記条件ニー電圧４５０Ｖ／ｃａ＋一静電気容量２５０μＦ −抵抗（ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ）　２００Ωに従い放電させる。

無菌水４００μｌを室温でショック後直ちにキュへ・ントに加えて混合液を冷却させる。次いで混合液１００〜５００μｌを選択培地にいれ、細胞を３０℃で４８時間おく。

こうして、３００〜６００ＵＲＡ＋形質転換株を無つランルの選択培地で直鎖断片μｇ当たりで得る。

９つのランダムに選択されたＵＲＡ３＋形質転換株（ＯＲＴ　ＴＢＧ、１〜７８６．９と表示される）の分析は染色体分離、トランスファー及びＵＲＡ３遺伝子（１３）のＨｉ　ｎ　ｄ　ｌｌｌ−Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ断片からなる特異的プローブを用いて得られるフィルターのｌ＼イブリッド形成により実施する。

このハイブリッド形成の結果は図１２に示される通りである。

このオートラジオグラフにおいて、分析されたすべての形質転換株は受容味ＯＬＩに関して観察されるように変異配列ｕ　ｒ　ａ　３−　（２５７，３７３）を保有する染色体Ｖのレベルでシグナルを示すことか観察できる。更に、形質転換株０ＲＴ７８Ｇ、ｌ　１．２１．４１．６１，８及び、９は染色体ＸＶ又ハＶＩＩ　、　ＸＩＶ　、　Ｉ＋、＋Ｘ、　ＸＶ又はＶｌｌｌ：各々分散されたＵＲＡ３配列の追加コピーを保有する。形質転換株０ＲＴ７１１１Ｇ、３１．５及び、７の場合、追加バンドはみられない。これは変異対立遺伝子ｕ　ｒ　ａ　３−　（２５７，３７３）から野生型への遺伝子変換又は染色体ＶもしくはＶｌｌｌでＵＲＡ４配列の追加コピーの組込みのいずれかで説明できる。

例８シグマ：：Ｕ　ＲＡ　３断片（ＵＲＡ３遺伝子で遮断されたジグ７ＶＩＩ１．ｌ＊）　ｌ；ｌ：　ヨルＭ　Ｇ　Ｄ　１３１１０２Ａ株ノ形質転換上記結果を一般化できるように、研究をもう１つのモデル株Ｍ　Ｇ　Ｄ　１３１１０２Ａで続けた。

変異ｕｒａ３−５２を有するこの株を、プラスミドｐ　ＢＫ６１７の制限により得られた精製１．４ｋｂＨｉｎｄ　ｌｌｌ−Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ断片（ジグ７：：ＵＲＡ３）で電気穿孔法により、前記のように形質転換させた。得られたＵＲＡ＋形質転換株（ＤＮＡμｇ当たり１５０〜３５０）を無ウラシル培地で選択する。

１０のランダムに選択されたＵＲＡ＋形質転換株（ＯＲＴ７３１〜０ＲＴ７４０で表示される）の分析は染色体分離、トランスファー及び特異的プローブＵＲＡ３を用いて得られるフィルターのハイブリッド形成により実施する（図１３）。

分析されたすべての形質転換株中への追加ＵＲＡ３コピーの組込みは形質転換株に応じて様々な染色体て、即ち０ＲＴ７３３．７３６及び７３８の場合染色体Ｖｌｌｌ、０ＲＴ７３５（７）場合染色体ＸＶＩ　、０ＲＴ７３２．７３６．７３７及び７３９の場合染色体ｘ■又ハＯＲＴ　７３４　（７）場合染色体Ｘｌｌで観察される。

染色体Ｖに位置する変異遺伝子ｕｒａ３−５２のコピーが各形質転換株で更に検出される。

この結果は、“−シグマ要素に一遺伝子″を用いた系が、第二味のゲノム中に興味の向けられた配列を分散させることを示し、本発明が反復及び分散５ｏｌｏシグマ要素を保有するいかなる株でも可能性として用いうろことを実証している。

例９シグマ：・ＡＲＧ４断片（ＡＲＧ４遺伝子で遮断されたジグ７ＶＩＩ１．Ｉ＊）　Ｉ：ヨるＭ　Ｇ　Ｄ　１３１１０２Ａ株の形質転換もう１つの興味の向けられた配列への多部位組込みカセットの本発明使用を一般化するため、変異ａｒｇ４ −Δ２０６０を保有する受容味Ｍ　Ｇ　Ｄ　１３１　ＬＯ２Ａを、プラスミドｐＢＫ６１１の切断から得られる２、５ｋｂＳｍａ　１−　Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ制限断片（ジグ７　：：Ａ　ＲＧ　４　）で、電気穿孔法により前記のように形質転換させる（図１０参照）。

無アルギニン選択培地で得られた断片μｇ当たり形質転換株１５０〜１２００１０のランダムに選択されたＡＲＧ＋形質転換株（ＯＲＴ７２０〜０ＲＴ７２９で表示される）の分析は染色体分離、トランスファー及び特異的プローブＡＲＧ４を用いて得られるフィルターのハイブリッド形成により実施する。

用いられたプローブはＡＲＧ４転写単位（図２）を含みかつ受容味の２０６０欠失に正確に相当する２０６０ｂｐＨｐａｉ−Ｈｐａｌ断片である。こうして形質転換中に導入された遺伝子のコピーのみがハイブリッド形成により検出される。

このハイブリッド形成の結果は図１４で示される。

いくつかの事項がこのオートラジオグラフで観察できるニーＡＲＧ４遺伝子は形質転換株に応じて異なる染色体上に存在する（ＯＲＴ７２０１７）場合ＩＸ、０ＲＴ７２１．７２４及び７２８の場合Ｖ１１１．０ＲＴ７２２．７２３及び７３０の場合＋１．０ＲＴ７２５（７）場合ｘｖ又１１１１；０ＲＴ７２６及び７２９の場合Ｘｌ＋又はｍ。

−得られるハイブリッド形成シグナルの強度は可変的で、０ＲＴ７２２及び７２３）場合に高＜−？：０ＲＴ７２９の場合に弱いが、この形質転換株は表現型上ＡＲＧ　である。

組込まれたシグマ、・ＡＲＧ４断片の構造及びコピー数を特定するため、形質転換株０ＲＴ７２０．７２２及び７２４の全ＤＮＡを抽出し、単−Ｃ１ａｌ、Ｂｇｌｌｌ及びＢａｍＨＩ制限と二重Ｘｈｏｌ＋Ｎｄｅｌ制限でサザンブロノティングにより分析する（図１５）。

用いられたプローブはＡＲＧ４遺伝子に特異的である２０６０ｂｐＨｐ　ａ　Ｉ　−Ｈｐ　ａ　Ｉ断片である。

分析されたすべての形質転換株はプラスミドｐＢＫ６１１のＸｈｏｌ−Ｎｄｅｌ切断で予想されるように単一の２．４５ｋｂＸｈｏ　Ｉ−Ｎｄｅ　Ｉバンドを示す。

０ＲＴ７２４に関して得られた結果の分析（Ｂｇｌｌｌで２つの２．３５及び２．７ｓｋｂバンドとＢａｎＨＩで１つの４．４５ｋｂバンド）は本来のシグマＶＩＩ１．Ｉ中へのＡＲＧ４遺伝子の単一コピー組込みの存在と一致する（二の領域の制限地図？照、図２）つ０ＲＴ７２４の場合と類似する形質転換株０ＲＴ７２０及び７２２のＢｇｌｌｌ及びＢａｍＨＩ制限特性は、ＡＲＧ４遺伝子の単一コピー組込みがこれらの形質転換株で起きたことを示すと思われる。

得られた結果は“−シグマ要素に一遺伝子゛を用いた系が第二タイプの興味の向けられた配列をゲノム中に分散できることを示す。

得られた２つの形質転換株（ＯＲＴ７２３及び０ＲＴ７２４）の組込み方式を正確に調べるため、Ｘｈｏ　Ｉ部位側で各挿入物に接するＤＮＡを“逆ＰＣＲ”と呼ばれる方法で増幅させ、しかる後得られた増幅断片を配列決定する。これら２つの形質転換株に関する単一増幅断片の産生はゲノム中で唯一のコピー組込みを示唆する。

増幅技術及び得られた配列は図１６に示される通りである。

そのシグマ：：Ａ　ＲＧ　４断片が染色体ｖ１１１で組込まれた０ＲＴ７２４の場合、配列の読みでは以下を示すニーシグマＶｌｌ＋、１３４７〜２５８位に特異的なすべてのヌクレオシドがみられる。

−Ｓｍａ　ｌ−Ｈｌ　ｎｄｌｌｌ断片に最初存在したＸｈｏＩ部位の５゛側に位置するすべての異種ヌクレオチド、特にＣ１ａｌ制限部位に相当する配列が欠失している（図加えて、組込まれたシグマ：：Ａ　ＲＧ　４要素に隣接する１８０塩基対はシグマＶＩ１１．１７７〜２５７位のフランキング領域に関して最初に記載された場合と正確に対応する。これらの１８０塩基対はシグマＶＩＩ１．ｌと関連したＡｌａ　ｔＲＮＡをカバーしている（図３）。

これはシグマ：：Ａ　ＲＧ　４断片の組込みが実際に出発シグマＶＩＩ１．ｌとの相同的組換えにより形質転換株０ＲＴ７２４で起きたことを実証している。

そのシグマ、、Ａ　ＲＧ　４断片が染色体１１中に組込まれた形質転換株０ＲＴ７２３の場合、その配列は以下を示す：−シグマに特異的なヌクレオチドは逆方向反復配列ＴＧＴＴＧＴＡの末端までにみられる。前記と同様に、形質転換に用いられたＳｍａ　ｌ−Ｈ１ｎｄｌｌｌ断片と接するすべての異種ヌクレオチドが欠失している。新しい未知の染色体配列は組込み保存されたシグマ：：Ａ　ＲＧ　４配列のレベルで始まる。加えて、Ａｌａ　ｔＲＮＡに相当する配列は組込みシグマ：：Ａ　ＲＧ　４から５−側に１６ｂｐで観察される。

最後に、シグマ特異性配列は２つの重要な特徴を有するニーシグマＶｌ１１．ｌを単一化するヌクレオチドＧが３４３位でみられる（図３）。

−２つのヌクレオチドＡがシグマＶＩＩ１．ｌを単一化して形質転換に用いられたＳｍａ　ｌ−Ｈ１ｎｄｌｌ＋断片の配列中に最初存在したヌクレオチドＣ及びＧの代わりに３０７及び３０９位で各々みられる。

これらの結果は形質転換株０Ｒ７７２３においてシグマ：、Ａ　ＲＧ　４断片の組込みが前ケースのように先夜染色体シグマで相同的組換えにより起きたことを実証している。その結果、０ＲＴ７２３において、組換えがおそらく関与するシグマ要素のヌクレオチド３０９及び３４３間で起きたことを特定することができる。

例１０ジグ７：：ａ　ｒ　ｇ４−　Ｅ　ｃ　ｏＲＶ断片（ｕｒａ４−Ｅｃ。

ＲＶ遺伝子で遮断されたシグマＶＩ１１．１”　）による株ＭＧＤ１３１２Ｃ及びＭ　Ｇ　Ｄ　１３１１０２＾の形質転換変異ａｒｇ４−Δ２０６０を保有する受容株ＭＧＤ１３１２Ｃ及びＭ　Ｇ　Ｄ　１３１１Ｑ２Ａは、プラスミドｐＢＫ６２０から精製された２、　４ｋｂＨｉ　ｎ　ｄｌｌｌ−Ｈｔ　ｎ　ｄｌｌｌ制限断片と、株ＭＧＤ１３１２Ｃを形質転換するためのＬＥＵ２遺伝子又は株Ｍ　Ｇ　Ｄ　１３１１０２Ａを形質転換するためのＨＩＳ３遺伝子いずれかの選択マーカーを有する酵母複製プラスミド１μｇを用いて、電気穿孔法により同時形質転換する。形質転換株は無ロイシン又は無ヒスチジンの選択培地で各々選択し、シグマ：：ｕｒａ４−ＥｃｏＲＶ断片（Ｎｉｃｏｌａｓら、　１９８９）を組込んだ同時形質転換株のスクリーニングを可能にする適合性的サイシのテスター株ａｒｇ４−Ｂｇｌｌｌを用いて分裂バピレーション化（ｐａｐｉｌ　１ａｔｉｏｎ）の試験により分析する。複製プラスミド（ＬＥＵ２又はＩＩ　Ｓ３遺伝子を含む）はロイシン又はヒスチジン含有の富ＹＰＧ培地で増殖させることにより細胞から分離する。

シグマ：：ｕｒａ４−ＥｃｏＲＶ形質転換株の物理的分析は例９のように染色体分離、ナイロン膜上へのトランスファー及びＡＲＧ４遺伝子含有プローブとのハイブリッド形成により実施する。図１７で示された結果は形質転換株に応じた様々な染色体中へのｕｒａ４−ＥｃｏＲ■遺伝子の組込みについて示す（株Ｍ　Ｇ　Ｄ　１３１Ｃで得られる０ＲＴ１３０４）場合染色体ＸＶＩ；株Ｍ　Ｇ　Ｄ　１３１１０２Ａて得られる０ＲＴ１３０５（７）場合染色体１ｘ及びＯＲＴ　１３０６の場合染色体ｘｖ又はｖｌｌ）。

これらの結果は“−シグマ要素中に挿入されたー遺伝子”を用いた系が同時形質転換によりゲノム中に興味の向けられた配列を選択なしに分散できることを示す。その例は遺伝子の変異配列の組込みについて示す。

例１１株Ｍ　Ｇ　Ｄ　１３１　ＬＯ２Ａの連続形質転換例８で得られ特徴化された形質転換株ＡＲＧ”ｕｒａ−ＯＲＴ７２０及び０ＲＴ７２３を、プラスミドｐＢＫ６１７の切断後に精製されたＣ１ａｌ断片（シグマ：：ＵＲＡ３）のＤＮＡで、電気穿孔により形質転換する。

得られたＵＲＡ＋形質転換株を無ウラシル培地で選択する。これらのＵＲＡ＋形質転換株は無アルギニン培地で増殖しうる能力を保有している。

５つのランダムに選択された超形質転換株ＡＲＧ４”Ｕ　ＲＡ　３−　（ＯＲＴ　７２０゜Ｇ　、７２０．７．７２０．８及びＯＲＴγ２３．８．７２３．９で表示される）の分析は染色体分離、ナイロン膜上へのトランスファー及び特異的プローブＡＲＧ４及びＵＲＡ３を用いて得られたフィルターのハイブリッド形成により実施する（図１８）。

超形質転換株ＯＲＴ　７２０．６．７２０．７及び７２０．８はそれらか由来する０ＲＴ７２０にのようにＡＲＧ４遺伝子を染色体ＩＸ上に保有する。更に、これらの超形質転換株は各々染色体Ｘｌｌ　、ＶＮＩ及び１ｖ上にＵＲＡ３遺伝子を保有する。

更に、超形質転換株ＯＲＴ　７２３．８及び７２３．９はそれらが由来する０ＲＴ７２３株のように染色体１１上にＡＲＧ４遺伝子と各々染色体Ｖｌｌｌ及びＸｌｌ上にＵＲＡ３遺伝子を保有する。

対称的に、例７で得られ特徴化された形質転換株ＵＲＡ”　ａ　ｒ　ｇ−０ＲＴ７４０を、プラスミドｐＢＫ６１５の切断後に精製されたＨｉｎｄｌ１１断片（２，４ｋｂシグマ：：Ａ　ＲＧ　４　）のＤＮＡで、電気穿孔により形質転換する。

得られたＡＲＧ＋形質転換株を無アルギニン培地で選択する。これらの形質転換株は無ウラシル培地で増殖しうる能力を保有している。

３つのランダムに選択された超形質転換株ＵＲＡ”ＡＲＧ−（ＯＲＴ７４０．ｌ　、７４０．２及び７４０．３で表示される）の分析は染色体分離、ナイロン膜上へのトランスファ　−及び特異的プローブＡＲＧ４及びＵＲＡ３を用いて得られたフィルターのハイブリッド形成により実施する（図１　つ）。

これら′うつの超形質転換株はそれらか由来する０ＲＴ７４（］株のように染色体ｖ１１１上にＵＲＡ３遺伝子と各々染色体１ｘ、１ｖ及びＸｌｌ上にＡＲＧ４遺伝子を保有することか観察できる。

（７たかって、こう［２て、本発明に従い提案された組込み系により異なる様々な座において同細胞で異なるタイプの配列の分散を得ることかできる。

Ｃ）シグマ　・ａｒｇ４断片を用いる ’ＣＦ−シグシグ：ａｒｇ４−Ｂｇｌｌｌ断片（ａｒｇ４−８ｇ１１１遺伝子で遮断されたシグマＶＩＩ１．Ｉ＊）当たり１つのシグマ・・ａｒｇ４−ＥｃｏＲＶコピーを冑する株ＯＲＴ　１３０５の形質転換第一シグマ・・ａｒｇ４カセットの組込みで得られる形質転換株が第二カセットを導入する上で再び形質転換できるかどうかを調へるため、染色体Ｉｘ中に組込まれたシグマ　：ａｒｇ４−ＥｃｏＲＶ配列を含む一次形質転換株０ＲＴ１３０５を断片シグマ：：ａｒｇ４−Ｂｇｌｌｌで再形質転換させた。遺伝子型シグマ：：ａｒｇ４−ＥｃｏＲＶ（染色体ＩＸ）　、ａ　ｒｇ４　２０６０　（染色体Ｖｌｌ＋）、ａｒｇ３−５２、ｔ　ｒｐｌ、ｈｉｓ３、ａｄｅ２、Ｍａ　ｔ　ａの０ＲＴ１３０５株を、酵素ＨｉｎｄｌｌｌでプラスミドｐＢＫ６２３の切断後に精製された２、４ｋｂ断片シグマ：：ａｒｇ４−ＢｇｌｌｌとＨ’Ｓ３遺伝子を含む複製プラスミドで、同時形質転換させた。

ＨＩＳ＋形質転換株を無ヒスチジン培地で選択し、ａｒｇ４−ＥｃｏＲＶ情報を保有してａｒｇ４−８ｇ１１１マーカーを獲得した細胞を確認するため自動バビレーション化試験で遺伝的に分析する。なおａｒｇ−表現型であるこれらの細胞は無アルギニン培地で増殖するＡＲＧ＋原栄養細胞を栄養増殖中組換えにより生じる能力をその後で有する。いくつかのランダムに選択されたＯ　ＲＴ　１３２０−Ｘと呼ばれる形質転換株の分析は染色体分離、トランスファー及び特異的プローブＡＲＧ４を用いて得られるフィルターのハイブリッド形成により実施する（図２０）。予想されるように、これらの形質転換株は２つのハイブリッド形成バンドを示し、一方は染色体１ｘて親コピーａｒｇ４−ＥｃｏＲＶに相当し、他方は新たに導入されたコピーに対応して様々な染色体上に分散している（図２０の例に関して染色体Ｖ　、　ＯＲＴ　１３２０−１４；染色体Ｖｌｌｌ、　ＯＲＴ　１３２０−１９　、ＯＲＴ　１３２０−２７及びＯＲＴ　１３２０−３３．染色体ＸＶ／Ｖｌｌ、　ＯＲＴ　１３２０−３０；染色体１゜ＯＲＴ　１３２０ −３４）。

これらの結果は２つのシグマ；Ｈａｒｇ４カセットを連続して組込む可能性について実証している。カセットシグマ：：ａｒｇ４−ＥｃｏＲＶ及びジグ７：：ａｒｇ４−Ｂｇｌｌｌは２４００ヌクレオチドの全長にわたり６塩基対（ａｒｇ４ −ＥｃｏＲＶ変異のレベルで２塩基対及びａｒｇ４−ＢｇＩＩＩ変異のレベルて４塩基対）で異なる。

したかって、Ｆ目間的組換えにより酵母ゲノム中に興味の向けられた遺伝子の少くとも２コピーを連続的に組込むことかできる。

本Ｃ２−ジグ７：：ａ　ｒｇ４−Ｂｇｌｌｌ断片（ａ　ｒ　ｇ４−８ｇ１１１遺伝子で遮断されたシグマＶＩＩ１．Ｉ＊）当たり２つのシグマ・・ａｒｇ４−ＥｃｏＲＶコピーを有するＯ　ＲＤ　ｌ３０６−７Ｄ株の形質転換前記タイプの実験（例１１．ＣＩ）を第三のシグマ：：ａｒｇ４コピーを導入することが可能かどうかを調べるため２つのシグマ：・ａｒｇ４−ＥｃｏＲＶコピーを有する親株ＯＲＤ　１３０６−７Ｄで実施した。

遺伝子型シグマ：：ａｒｇ４−ＥｃｏＲＶ　（染色体ＩＸ）、ジグ”：：ａ　ｒ　ｇ４−　ＲＶ　（染色体ＸＶＩ）、ａ　ｒ　ｇ　４−２０６０、ｈｉ　ｓ３、ｕｒａ’３−５２、ｔｒｐｌ、Ｍ　ａ　ｔ　ａの受容法ＯＲＤ　１３０Ｂ−７Ｄは例１０で記載された株０ＲＴ１３０４及び０ＲＴ１３０５の交雑から得られる二倍体０ＲＤ１３０６の胞子形成により得た。これは形質転換株の交雑と減数分裂中染色体の再配列により数コピーのカセノトシグマ二二遺伝子を導入する可能性について実証している。

ＯＲＤ　１３０６−７Ｄ株を、ＨＩＳ＋複製プラスミドと酵素Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩで切断されたプラスミドｐＢＫ６２３から精製されたシグマ：：ａｒｇ４− Ｂｇｌｌｌ断片で、同時形質転換した。３つのＨＩＳ”ａｒｇ−形質転換株を得たが、これは無アルギニン培地で自動バピレーション化する（ＡＲＧ”　）。染色体分離、トランスファー及びプローブＡＲＧ４を用いたハイブリッド形成によるこれら３つの形質転換株の分析では、それらの各々に関して２つの親バンド（染色体ＩＸ及びＸＶＩ）と新規バンドに相当する形質転換株に応じて異なる３つのハイブリッド形成バンドの存在を示すが（図２１）、これはシグマＨ：ａｒｇ４カセットの第三コピーの分散挿入について実証している（染色体ＩＩ、　ＯＲＴ　１３２７−２１；染色体１■又ハＸＩ＋、ＯＲＴ　１３２７−２３：染色体ｘｖ又はＶｌｌ、ＯＲＴ　１３２７−２７）。

これらの結果はシグマ：：遺伝子カセットの使用が連続形質転換により数コピーの興味の向けられた遺伝子を相同的組換えで組込めることを実証している。このタイプの組込体の単離は単純な遺伝子又は分子スクリーニングにより実施する。

例１２断片シグマ：：、Ａ　ＲＧ　４及びシグマ：：Ｕ　ＲＡ　３による酵母株Ｍ　Ｇ　Ｄ　１３１１０２Ａの同時形質転換株Ｍ　Ｇ　Ｄ　１３１１０２Ａａ　ｒ　ｇ　４−Δ２０６０ｕ　ｒａ　−５２はニープラスミドｐＢＫ６１５の切断後に精製されたＨｉｎｄｌｌ＋断片（２，４ｋｂシグマ、、Ａ　ＲＧ　４　）−プラスミドｐ　ＢＮ２１７の制限から得られたＣ１ａｌ断片（１，４ｋｂシグマ　・ＵＲＡ３）を含むＤＮＡ混合物を用いて電気穿孔法により形質転換する。

ＡＲＧ＋形質転換株は無アルギニン培地で選択し、無ウラシル培地で継代培養する。こうして、ＡＲＧ”　ＵＲＡ＋同時形質転換株をスクリーニングする。

ＡＲＧ”　ＵＲＡ＋同時形質転換株（ＯＲＴ７４６．７４７．７４８．７４９．７５１．７５２及び７５３で表示される）の分析を染色体分離、ナイロン膜上へのトランスファーと特異的プローブＵＲＡ３及びＡＲＧ４を用いて得られるフィルターのハイブリッド形成により実施する（図２２）。

この分析ではＡＲＧ４及びＵＲＡ３遺伝子が各同時形質転換株で同染色体に組込まれてみられることを示す。

この染色体は同時形質転換株毎に異なる。実際に、ＡＲＧ４及びＵＲＡ３遺伝子は下記染色体でみられるニー０ＲＴ７４９の場合Ｘ１ｌ −ＯＲＴ７４７の場合ＩＶ −ＯＲＴ７４６．７４８又は７５３の場合ｘ■又はＶｌｌ−０ＲＴ７５１の場合１ｌ −ＯＲＴ７５２の場合ＸＩＶ参考文献１）Ｊ、Ｂ、Ｈｉｃｋｓ、Ａ、Ｈｉｎｎｅｎ及びＧ、Ｒ，Ｆｉｎｋ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆＹｅａｓｔ　Ｔｒａｎｓｒｏｒｎａｔｉｏｎ　（酵母形質転換の性質）、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ　Ｓｙａ＋ｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｑｕａｎｔ、Ｂｉｏｌ；４３，１３０５−１３１３（１９７８）。

２）Ｔ、Ｓ、Ｌｏｐｅｓ、Ｊ、Ｋｌｏｏｔｗｉｊｋ、Ａ、Ｅ、Ｖｅｅｎｓｔｒａ、Ｐ、Ｃ，ｖａｎ　ｄｅｒＡａｒ、）１．ｖａｎ　Ｈｅｅｒｉｋｈｕｊｚｅｎ、ｔ（、Ａ、Ｒａｕｅ及びＲ，Ｊ、Ｐｌａｎｔａ：Ｈｉｇｈ−ｃｏｐｙ−ｎｕｌｌｂｅｒ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　１ｎｔｏ　ｔｈｅ　ｒｉｂｏｓｏｓａｌＤＮＡ　ｏｆ　Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：　ａ　ｎｅｗ　ｖｅｃｔｏｒ　ｆｏｒ　ｈｉｇｈ−１ｅｖｅｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　（Ｓ　、セレビシェのリポソームＤＮＡ中への高コピー数組込み：高レベル発現用の新規ベクター）：Ｇｅｎｅ　７９：１９９−２０６（１９８９）３）Ｈ，Ｌ、Ｋｌｅｉｎ：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　Ｒｅｐｅａｔｅｄ　ＹｅａｓｔＧｅｎｅｓ　（反復酵母遺伝子間の組換え）：ｐ　３５５−４２２　ｉｎ　ＴｈｅＲｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍａｔｅｒｉａｌ（遺伝物質の組換え）、Ｂｒｏｏｋｓ　Ｌｏｗ　Ｅｄｉｔｏｒ、Ａｃａｄ、Ｐｒｅｓｓ（１９，８８）。

４）Ｐ、Ｃ，Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ａａｒ、Ｔ、Ｓ、Ｌｏｐｅｓ、Ｊ、ＫＩｏｏｔｖｉｊｋ、Ｐ、Ｈ。

Ｇｒｏｅｎｅｖｅｌｄ、Ｈ，Ｗ、Ｖａｎ　Ｖｅｒｓｅｒｅｌｄ及びＡ、Ｈ，Ｓｔｏｕｔｈａｍｅｒ：Ｃｏｎ５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ　ｋｉｎａｓｅ　ｏｖｅｒ−ｐｒｏｄｕｃｔ　ｒｏｒ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　ｏｒＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　（Ｓ　、セレビシェの増殖及び生理機能に関するホスホグリセリン酸キナーゼ過剰産物の結果〉；Ａｐｐｌ　、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　、ＢＬｏｔｅｃｈｎｏｌ、３２：５７７−５８７（１９９０）５）Ｊ　、Ｄ、Ｂｏｅｋｅ、　Ｄ、　Ｊ　、Ｇａｒｆｉｎｋｅｌ　、Ｃ，Ａ、５ｔｙｌｅｓ及びＧ、Ｒ。

Ｐｉｎｋ：ＴＹ　ＥｌｅＩｌｅｎｔｓ　Ｔｒａｎｓｐｏｓｅ　ｔｈｒｏｕｔｈ　ａｎ　ＲＮＡ　Ｉｎｔｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅ（Ｔ　Ｙ要素はＲＮＡ中間体により転位する）；Ｃｅ１ｌ、４０：４９１−５００（１９８５）。

６）Ｖ、Ｍ、Ｗｉｌ　ｌ　ｉａｍｓｏｎ、Ｅ、Ｔ、Ｙｏｕｎｇ及びＭ、Ｃｌｒ＋ａｃｙ：Ｔｒａｎｓｐｏ−ｓａｂｌｃ　Ｅｌｅｍｅｎｔｓ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｃｏｎ５ｔｉｔｕｔｉｖｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ａｌｃｏｈｏｌ　Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（アルコールデヒドロケナーゼの構成性発現に関連する転位要素）；Ｃｅ１ｌ、２３：ｆｉ０５−６１４（１９８１）　。

７）Ｄ、Ｔ、Ｃｈａｌｅｆｒ及びＧ、Ｒ，Ｆｉｎｋ：Ｇｅｎｅｔｉｃ　ＥｖｅｎｔｓＡｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ａｎ　Ｉｎ５ｅｒｔｉｏｎ　Ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　（酵母における挿入変異に関連した遺伝現象）；Ｃｅ１１．２Ｌ：２２７−２３７（１９８０）。

８）ＤＪ、Ｃ１ａｒｋ、Ｖ、讐、Ｂｉ　１ａｎｃｈｏｎｅ、Ｌ、Ｊ、Ｈａｙｗｏｏｄｓ、Ｓ、Ｌ、Ｄｉｌｄｉｎｅ及びＳ、Ｂ、Ｓａｎｄｅｒｍｅｙｅｒ：Ａ　Ｙｅａｓｔ　ＳｉｇｍａＣｏｍｐｏｓｉｔｅ　ＥＩｅａ＋ｅｎｔ、ＴＹ３．ｈａｓ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ａ　Ｒｅｔｒａｎｓ−ｐｏｓｏｎ　（酵母シグマ混成要素ＴＹ３はリトラシスポゾンの性質を有する）：Ｊ、Ｂｉｏ、Ｃｈｅｍｉｓｔ、２６３：Ｎｏ、３．１４１３−１４２３（１９８８）。

９）Ｆ、Ｓ、Ｇｅｎｂａｕｆｆｅ、Ｅ、Ｃ，ＣｈｉｓｈｏｌｒＡ及びＴ、Ｇ、Ｃｏｏｐｅｒ：Ｔａｕ。

Ｓｉｇｍａ　ａｎｄ　Ｄｅｌｔａ（タウ、シグマ及びデルタ）、Ｊ、Ｂｉｏ。

Ｃｈｅｉ、２５９：１０５１８−１０５２５（１９８４）　。

１０）Ａ、Ｅｉｇｅｌ及びＨ，Ｆｅ１ｄａｎｎ：Ｔｙｌ　ａｎｄ　Ｄｅｌｔａ　ＥｌｅｍｅｎｔｓＯｃｃｕｒ　Ａｄｊａｃｅｎｔ　ｔｏ　５ｅｖｅｒａｌ　ｔＲＮＡ　Ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ（Ｔ　ｙｌ及びデルタ要素は酵母においていくつかのｔ　ＲＮＡ遺伝子に隣接して生じる）、ＥＭＢＯＪ、ｌ：Ｎｏ、１０．１２４５−１２５０（１９ｇ２）　。

１１）Ｓ、　Ｂ、５ａｎｄ１１ｅｙｅｒ　、　Ｖ、　Ｗ、Ｂｉ　ｌ　ａｎｃｈｏｎｅ、Ｄ、　Ｊ　、　Ｃｌ　ａｒｋ　、　Ｐ。

Ｍｏｒｃｏｓ、Ｇ、Ｆ、Ｃａｒｌｅ及びＧ、Ｍ、Ｂｒｏｄｅｕｒ：ＳｉｇｒＡａ　ＥｌｅＩＩｌｅｎｔｓ　ａｒｅＰｏｓｉｔｉｏｎ−８ｐｃｃｉ［’ｉｃ　ｒｏｒ　Ｍａｎｙ　Ｄｉｆｒｅｒｅｎｔ　Ｙｅａｓｔ　ｔＲＮＡＧｅｒ＋ｃＳ　（シグマ要素は多くの異なる酵母ｔ　ＲＮＡ遺伝子に位置特異的である）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１０：１４９９−１５１５（１９８ｇ）　。

１２）Ｈ，Ｔ、Ｗａｎｇ、Ｓ、Ｆｒａｃｋｍａｎ　、Ｊ　、Ｋｏｖａｌ　１ｓｙｎ　、Ｒ，Ｅ、Ｅｓｐｏｓｉ　ｔ。

及びＲ，Ｅｌｄｅｒ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　５ＰＯ１３，ａＧｅｎｅ　ｒｅｑｕｉｒｅｄ　ｆｏｒ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ＣｈｒｏＩＩｏ−ｓｏｍｅｓ　ａｔ　Ｍｅｉｏｓｉｓ　（減数分裂で相同的染色体の分離に要する遺伝子５Ｐ０１３の開発調節）、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、７：Ｎｏ。

４、１４２５−１４３５　（１９８７）　。

１３）Ｍ、ｌ、、Ｂａｃｈ、Ｐ、Ｌａｃｒｏｕｔｅ及びり、Ｂｏｔｓｔｅｉｎ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｒｏｔｉｄｌｎｅ−５°−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ　１ｎ　ｙｅａｓｔ　ｂｙ　ｈｙｂｒｉｄｌｚａｔｉｏｎｏｆＩＩＲＮＡ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｙｅａｓｔ　５ｔｒｕｃｔｕａｌ　ｇｅｎｅ　ｃｌｏｎｅｄ　１ｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ　（大腸菌でクローニングされた酵母構造遺伝子へのｍＲＮＡのハイブリッド形成による酵母におけるオロチジン −５゛−リン酸デカルボキシラーゼの転写調節に関する証拠）　、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７８：３８６−３９０（１９７９）　。

１４）Ｎｉｃｏｌａｓ、Ａ、、Ｔｒｅｃｏ、Ｄ、、５ｃｈｕｌｔｅｓ、Ｎ、及び５ｚｏｓｔａｋ。

Ｊ、：Ａｎ　１ｎｉｔｉａｔｉｏｎ　５ｉｔｅ　ｆｏｒ　ｎ＋ｅｉｏｔｉｃ　ｇｅｎｅ　ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｉｎ　ｔｈｅ　ｙｅａｓｔ　５ａｃｃｈａｒｏａ＋ｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（酵母サツカロミセス・セレビシェにおける減数分裂遺伝子変換に関する開始部位）、ＮａＬｕｒｃ、３３８．３５−３９（１９８９）。

図面に関する説明図１に関する説明ＬＴＲ：長末端反復ＴｙＩ及びＴ　ｙ　ＩＩの場合デルタ（３３２ｂｐ）Ｔ　ｙ　ＩＩ＋の場合シグマ（３４１ｂｐ）５−一　：内部逆方向反復（８ｂｐ） ■　：ターゲットの５ｂｐ重複ＴＹＡ−レトロウィルスのｇａｇ遺伝子の相同体ＴｙＢニレトロウィルスのｐｏ＋遺伝子の相同体図２に関する説明 ■　シグマ配列図３に関する説明 ΣＳｇＳ　シグマの逆方向反復配列Ｔ　Ｙ　１１１組込み用ターゲットの重複配列Ｌ　、Ｊ　Ａｌａ　ｔＲＮＡをコードする遺伝子の限界口ｔ　ＲＮＡに関するＡＧＣアンチコドンの位置最も多く観察されるシグマ配列で観察される差異は配列の下で示されている。

図５に関する説明 −−１−染色体ｖ１１１のゲノム配列−■■■■■　シグマ配列岬　、６１　逆方向反復配列図７に関する説明Ａｐ　Ａｐａｌ　Ｂｈ　ＢａｍＨＩ　Ｂｇ　ＢｇｌｌｌＢｘ　ＢｓｔＸＩ　Ｅ　ＥｃｏＲＩ　ＥＶ　ＥＣ０ＲＶＨ１ｌｌ　ＨｉｎＤＩＩＩ　Ｈｐ　Ｈｐａｌ　Ｋｐ　ＫｎｐｌＮｄ　Ｎｄｅｌ　Ｓｔ　Ｎｏ【／Ｅａ！！ｌ　Ｓａ　５ａｌｌＳｔ　５ａｃｌ　５１１５ａｃｌｌ　Ｓｍ　ＳｍａｌＸｂ　Ｘｂａｌ　Ｘｈ　Ｘｈｏｌｌ≧＝≧＝コ　シグマ配列＝７　６＝　逆方向反復配列図８に関する説明＝＝＝四　シグマの逆方向反復配列因８に関する説明＾ｐ　Ａｐａｌ　ａｈ　ＢａｍＨＩ　Ｂｇ　Ｂｇｌ夏ｌＢｘ　Ｂｓ＋ＸＩ　Ｅ　ＥｃｏＲＩ　Ｅｖ　ＥｃｏＲＶＨｌｌｌ　ＨｉｎＤＩＩＩ　Ｈｐ　Ｈｐａｌ　Ｋｐ　Ｋｎｐ［Ｎｄ　Ｎｄｅｌ　Ｎｔ　Ｎｏｔ／Ｅｘｇｌ　Ｓａ　５ａｉ１５１　５ａｃｌ　Ｓｉｒ　５ａｃｌｌ　Ｓｍ　ＳｍａｌＸｂ　Ｘｂａｌ　Ｘｈ　Ｘｈｏｔ１≧＝！玉］　ング＝配ダ・ｊ＝７　４−　逆方向反復配列鴫−ｍ−−６ドメイン　−一−−−− 噂−ＴＶ要素（５，３〜５，６　ｋｂ）　−一一一一一−１ｋｌ）Ｄｅａｄ　８２　Ｄｅａｄ　８１　ＡＲＧ４　””　””ＯＬｌ　’ＭＧＤ１３１１０２Ａ　ＹＮＮ２９５Ｂｐ８に６０５：　７．３ｋｂＴＧＡＴｒＣ磁二区江ＦＣ二ＴＡＧＡＧＣＣＴＡ３°　日ａＶＥａｅ　５ｔｕｌ　５゜ｉｇ　ＢｐＢＫ６０９　：　３，１５ｋｂＢａ／Ｅａｅ　Ｐｓ　ＥＩ　ＥＶ　（Ｈ１ｌｌ／５ｔｕ）ＰＢＫ６１０　：　３，３　ｋｂＢａ／Ｅａｅ　Ｐｓ　ＥＩ　ＥＶｐＢＫ６１４　：　３，３　ｋｂＣ１ａ　Ｉ　Ｘｈｏ　ＩＥｉａｌｌ／Ｅａｅｌ　Ｐｓｔ　１（Ｐｓｔ／Ｎ５ｉ）　Ｅｖ　Ｐｓｔ　Ｂｈ　Ｓｍ　５１　ＥＩｐ！１ＩＣ６ｉ７：６．７ｋｂＰｓ　Ｓａ　Ｘｂ　Ｂｈ　Ｋｐ　ＳＩ　ＥｌｐＢＫ６１１　：　５．３　ｋｂＰｓ　Ｓａ　Ｘｂ　ａｈ　Ｋｐ　ＳＩ　ＥＩｐＢＫ６１５　＋　５，３ｋｂＰｓ　Ｓａ　Ｘｂ　Ｂｈ　Ｋｐ　５１　ＥｌｐＢＫ６１６　：　５．３　ｋｂＢｇ　（Ｅｖ／Ｂｈ）フ２０　フ２１　７２２　フ２３　７２４　７２５　フ２６　７２８　７２９　７３０ａｌａ　ｔＲＮＡ　−−一−− プローブＡＲＧ４　プローブＡＲＧ４＋ＵＲＡ３７４０．２　７４０．２ブＯ−ブＡ日Ｇ４　プローブυＲＡ３ブａ−ブＡＲＧ４　プローブ　ＵＲＡ３平成　５　年　６　月　１４日

Claims

【特許請求の範囲】

１．少くとも：酵母ゲノムにおける天然反復分散非必須配列と相同性を示す１つの組込み配列と興味の向けられた配列とを含むことを特徴とする、酵母ゲノム内における多部位組込みカセット。
２．組込み配列が、酵母、特にサッカロミセス属、のＳｏｌｏＬＴＲタイプ配列と相同性を示す配列である、請求項１に記載の多部位組込みカセット。
３．ＳｏｌｏＬＴＲタイプ配列がＳ．セレビシエのＳｏｌｏＬＴＲ配列から選択されるものである、請求項２に記載の多部位組込みカセット。
４．Ｓ０ｌｏＬＴＲタイプ配列がＳ．セレビシエのＳｏｌｏシグマ配列である、請求項３に記載の多部位組込みカセット。
５．Ｓｏｌｏシグマ配列が、Ｓ．セレビシエの染色体ＶＩＩＩ上でＡＲＧ４遺伝子近くに位置するＳｏｌｏシグマ配列である、請求項４に記載の多部位組込みカセット。
６．興味の向けられた配列が組込み配列内でクローニングされる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の多部位組込みカセット。
７．興味の向けられた配列が相同性を示す天然反復配列で相同的組換えの標的とされる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の多部位組込みカセット。
８．請求項１〜７のいずれか一項で記載された多部位組込みカセットにより形質転換された酵母株。
９．ゲノムの少くとも１つの天然反復分散配列において上記天然反復配列の部位において単一コピー中に組込まれた少くとも１つの興味の向けられた配列をそのゲノム中に含むことを特徴とする、サッカロミセス属の酵母株。
１０．少くとも１つのＳｏｌｏシグマ配列中にそのＳｏｌｏシグマ配列の部位で組込まれた少くとも１つの興味の向けられた配列をゲノム中に含むことを特徴とする、Ｓ．セレビシエの株。
１１．−サッカロミセス属の酵母が請求項１〜７のいずれか一項記載の組込みカセットで形質転換され、−こうして形質転換された酵母株を培養し、そして−得られた産物を回収することからなる、サッカロミセス属の酵母による興味の向けられた産物の製造方法。
１２．−各々が興味の向けられた産物の一つをコードするＤＮＡ配列を興味の向けられた配列として含む請求項１〜７のいずれか一項記載の組込みカセットでサッカロミセス属の酵母を連続的に形質転換し、または各々が興味の向けられた産物の一つをコードする興味あるいくつかの配列を含む請求項１〜７のいずれか一項記載の組込みカセットでサッカロミセス属の酵母を形質転換し、 −こうして形質転換された酵母を培養し、そして興味の向けられた上記産物を回収することからなるサッカロミセス属の酵母による興味の向けられたいくつかの産物の製造方法。
１３．−各々が興味の向けられた産物の一つをコードする少くとも一つのＤＮＡ配列を興味の向けられた配列として含む請求項１〜７のいずれか一項記載の少くとも二つの組込みカセットを用いてサッカロミセス属の酵母の同時形質転換を実施し、 −こうして形質転換された酵母を培養し、そして興味の向けられた上記産物を回収することからなる、請求項１１又は１２に記載のサッカロミセス属の酵母による興味の向けられたいくつかの産物の製造方法。