JPH06504363A - 炭水化物の分析およびそのためのキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は炭水化物の分析に関する。

発明の背景 国際公開第ＷＯ３８／１０４２２号は、特に炭水化物構造を分析するためのまた は炭水化物物質を識別もしくは分離するための技術を開示しており、該技術は炭 水化物物質を電気泳動ゲルに適用し、ケルをゐ動して異なる物質の示差移動を引 き起こすことを含む。炭水化物物質を蛍光標識試薬、例えばアミンフルオレセイ ンで予め標識して該物質に電荷を付与し、それによって電気泳動的分離を可能に し、そしてゲルの泳動後の該物質の視覚化を可能にすることができる。この場合 、視覚化は内眼て行うことがてきるが、電荷結合素子（ＣＣＤ）を使って見るこ とにより一層高い感度が獲得される。

本発明は、そのような技術の開発に関し、蛍光標識試薬として別の材料を利用す ることに基つく。

発明の要約 本発明によれば、炭水化物物質を分離または識別する方法であって、ヒドラジ〉 基を含む蛍光試薬で炭水化物物質を標識して蛍光標識された物質を生成せしめ、 前記標識された物質を電気泳動用ケルに適用し、前記ゲルを泳動して異なる物質 の示差移動を引き起こすことを含んで成る方法が提供される。

本発明の別の観点は、炭水化物物質を分離または識別するためのキットであって 、蛍光標識された物質を生成することかできる標識試薬、電気泳動用ゲル、およ び試験しようとする炭水化物物質と比較するための炭水化物標準を含んで成るキ ットに関する。このキ・ノドは電荷結合素子を更に含んでもよい。

標識試薬のヒドラジン基は、還元性末端基を含む炭水化物と容易に反応し、荷電 し且つ蛍光性でありそして電気泳動処理によく適しているであろう誘導体を生成 する。

良好な実用結果は、蛍光試薬としてルシファーイエロー（ＬｕｃｉｆｅｒＹｅｌ ｌｏｗ）　Ｃ８４即ち６−アミノ−２−〔（ヒドラジノカルボニル）アミノ）− ２，３−ジヒドロ−１，３−ジオキソ−ＩＨ−ベンズ（ｄ　ｅ）イソキノリン− ５，８−ンスルホン酸（ＬＹＣＨ）を使って得られた。ニカリウム塩の構造式は 図１に示される。ルノファーイエローＣＨおよびそのニカリウム塩は、Ａｌｄｒ ｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ。

Ｉｎｃ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ、、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈ ｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ力１ら入手可能である。Ｓｔｅｗａｒｔ、　Ｗ、 、　Ｃｅ１１．１４．７４１　（＋９７８）も参照のこと（これは参考として本 明細書中に組み込まれる）。ＬＹＣＨの修飾変形および誘導体も同様な結果を与 えることかできる。

多数の他のヒドラジン基含有試薬も知られており、その幾つかを使って試験を行 った。例えば、ヒトランノアクリトンで標識された炭水化物は、電気泳動処理の 後、青色蛍光バンドを生した。この７＜ノドは乾燥後は明るい空色になった。リ サミンローダミンＢスルホニルヒドラジドを蛍光試薬として使用すると、電気泳 動ケル上ての泳動後に感光性の糖誘導体ノ１ントを生じた。

標識された炭水化物物質は蛍光性でなげればならない。標識試薬かそれ自体蛍光 性であってもよく、または炭水化物物質と反応後に蛍光性になってもよい。

好ましくは、ゲルは１５％〜６０％、好ましくは２０％〜４０％の範囲の濃度を 存する比較的濃厚なポリアクリルアミドゲルを含んで成るか、場合によっては、 より低濃度のゲルを使用することか可能であるかまたは好ましいかもしれない。

ゲルは均一濃度のゲルであるかまたは勾配ゲルの形である二とかできる。

ケルは、好ましくは、例えばＮ、Ｎ’−メチレンヒスアクリルアミド（ビス）に より架橋される。

現在好ましい１つのゲルは、２０％（最上部）から４０％（最下部）まで連続勾 配で異なるポリアクリルアミドゲル濃度（Ｗ／Ｖ）を存する直線ポリアクリルア ミド勾配ゲルを含んで成る。このケルは、最低濃度のポリアクリルアミドの所の ０．５３％から最高濃度のポリアクリルアミドの所の１．０６％まで異なる濃度 （Ｗ／Ｖ）でビスにより架橋される。

良好な分離および感度のために、ゲルは、タンパク質およびＤＮＡ断片を扱うだ めの既知の技術、例えばＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓにより発光されたＢ、Ｄ、　Ｈａｍ ｅｓおよびり、　Ｒｉｃｋｗｏｏｄ編の本”Ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅ ｓｉｓ　ｏｆｌ）ｒｏｔｅｉｎｓ：　ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃ ｈ”に記載された技術を使って、好ましくは濃縮用緩衝液系を使って泳動される （移動界面電気泳動、多相ゾーン電気泳動および他の名称で知られている）。

電気泳動は、便利には、Ｎｅｖｉｌｌｅ、　Ｊｒ、　Ｄ、Ｍ、、Ｊ、　Ｂｉｏｌ 、　Ｃｈｅｍ。

２４６．６３２８−６３３４に記載されたものに基づいた不連続電気泳動緩衝液 系を使って実施される。

ゲルを泳動した後、適当な波長の光、例えば紫外光を照射すると、場合によって は標識された炭水化物物質を肉眼で見ることかできるけれとも、ＣＣＤを使って 像化することにより、より良好な分離と感度を得ることができる。適当な励起に より、ＬＹＣＨは黄色発光と高い量子収率て強力に蛍光を発する。発光はＣＣＤ による検出に非常に適し、スペクトルの赤色端で最大の感度と量子収率を有し、 スペクトルの青色端で最低の感度と量子収率を存する。ＣＯＤの使用は、非常に 迅速に容易に量子化された結果を与えるという利点も有する。

更に、優れた定量的結果は、直線的動的範囲か広いためＣＣＤによりすぐに利用 可能である。更に、ＣＣＤは、ゲルを泳動している最中にゲルを観察するのに用 いることができる。

冷却２−Ｄ　ＣＣＤを使用し、遅いスキャン読み出して操作することが好ましい 。適当なＣＯＤシステムの一例は、Ａｓｔｒｏｍｅｄ　Ｌｉｍ１ｔｅｄ。

Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎｇｄｏｍにより製造されたＣＣＤ 　２２００　Ｉｍａｇｉｎｇｓｙｓｔｅｍである。ＣＣＤは好ましくは少なくと も一２５°Ｃはどの低温に冷却され、−１６０°Ｃまて更に冷却することにより 感度が有意に増大する。典型的な作業温度は一４０°Ｃ〜−１３０°Ｃの範囲内 である。

標識試薬、例えばＬＹＣＨは、必要であれば結合した生体分子からの遊離後、炭 水化物物質上の部位に結合させることができる。あるいは、生体分子を既知の方 法で修飾して標識試薬の取り込みを可能にしてもよい。

炭水化物物質は、ことによると還元剤、例えば水素化シアノホウ素ナトリウムの 存在下で、該物質をＬＹＣＨと共にインキュベートすることにより、ＬＹＣＨて 標識することができる。水素化シアノホウ素ナトリウムは、好ましくはジメチル スルホキッド（ＤＭＳＯ）中の溶液の形である。良好な標識のためには、酢酸と 水の混合物、例えば１５容量部の酢酸と８５容量部の水を含む混合物中の溶液の 形てＬＹＣＨを添加するのが育用であると判明した。ＬＹＣＩＩは例えはＭｏ１ ｅｃｕｌａｒ　ＰｒｏｂｅｓＩｎｃ、、Ｅｕｇｅｎｅ、　Ｏｒｅｇｏｎから市販 されており、それらはカリウム塩の形で該材料を供給している。

電気泳動にかけた物質の移動速度は、物質の大きさく分子量）および構造によっ て異なる。よって本発明を使って炭水化物物質の大きさおよび形状に関する情報 を得ることができ、そして既知の標準の結果と比較することにより、未知の炭水 化物物質を部分的にまたは完全に特徴付けることか可能であろう。本発明の１つ の利用は、参考として本明細書中に組み込まれるＷＯ３８／＋０４２２に記載さ れたように、グルコシダーゼを使って未知の炭水化物を小さい断片に開裂せしめ 、そして生じた断片を同定することにより、炭水化物構造を明らかにすることに おいてである。

本発明は、糖タンパク質、プロテオグリカン、糖脂質およびスフィンゴ糖脂質並 びに池の生体分子から誘導されるものを包含する、広範囲の炭水化物構造におい て利用可能である。

下記の実施例によりおよび添付図面への参照により、本発明を例示のつもりで更 に説明する。

図１は、ニカリウム塩の形のＬＹＣＨの構造を示す。

図２は、ＬＹＣＨて標識された種々の糖を示す電気泳動ゲルの写真である。

実施例 ＬＹＣＨはニカリウム塩としてＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ　Ｉｎｃ、か ら入手した。

氷酢酸／水（１５：　８５．　ｖ／ｖ）中に微細な懸濁液（５，２１ｇ／ｌ）を 調製した。水素化シアノホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）はＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、から入手し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の ０．１Ｎ１溶液として使用する。

次の還元糖（全てＤ配置）を各々５ナノモル含存する溶液を超遠心管中に凍結乾 燥した。６−ジオキシグルコース、グルコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルガ ラクトース、ガラクトノルα−１，４−ガラクトース、ラクトース、マルトース 、ガラクトースース、セロトリオース、マルトトリオース、マルトテトラオース 、マルトペンタオース、マルトヘキサオースおよびマルトヘプタオース。凍結乾 燥した糖にＬＹＣＨ懸濁液５μｌと水素化シアノホウ素ナトリウム溶液５μｌを 添加した。生した溶液をよく混合し、室温で３０分間インキュベートし、そして 遠心真空蒸発器を使って４０″Ｃにて４時間凍結乾燥した。この反応混合物に、 ０．０４］Ｍトリス塩基、０．０４Ｍホウ酸（ｐＨ８，６４）中に６Ｍ尿素を含 む溶液（電気泳動用試料緩衝液）を適量加えた。得られた試料を即座に使用する かまたは電気泳動するまで一７０″Ｃで保存した。

５２．１ｇ／ｌのＬＹＣＨ懸濁液を使って上記手順を繰り返し、そして全く糖を 含まない対照も調製した。

ＬＹＣＨて標識された糖と対照をポリアクリルアミドゲル中ての電気泳動にかけ た。分離は各糖の分子量および構造に依存する。移動界面（濃縮用）緩衝液系を 使ってシャープなバンドと高分解能を与える。この系は上記に言及したＮｅｖｉ ｌｌｅの方法に基づく。

電気泳動は、２０％ｗ／ｖアクリルアミド、０，５３％ｗ／ｖ　Ｎ、　Ｎ’　− メチレンビスアクリルアミド（ビス）から４０％Ｗ／Ｖアクリルアミド、１、０ ６％Ｗ／Ｖ　ヒスまての直線勾配から成る分離用ゲルを使って実施した。３．０ ％Ｗ／Ｖアクリルアミドと０．０８％Ｗ／Ｖビスを含む濃縮用ケルを使った。Ｎ ｅｖｉｌｌｅにより記載されたものに基つく不連続電気泳動緩衝液系を使用した か、ただしＳＤＳを削除した。ゲルを５〜７°Ｃの周囲緩衝液により冷却した。

使用した電圧は１００Ｖ　（定電圧）で３０分間、次いて５００Ｖ　（定電圧） で６０分間、次いて１００Ｖ　（定電圧）で９０分間であった。

４レーンにおいて次の試料を使ってゲルを泳動した。

レーン１　糖＋ＬＹＣ）！　（５２，１ｇ／　ｉ溶液）。

レーン２　糖なし＋ＬＹＣ）Ｉ　（５２，１ｇ／　Ｉ！温溶液。

レーン３　糖＋ＬＹＣＨ（５，２１ｇ／ｌ溶液）。

レーン４　糖なし＋ＬＹＣＨ（５，２１ｇ／ｌ溶液）。

下方から紫外照明ボックスにより照射した結果生じたゲルの写真を図２に示す。

照明ボックスからの紫外光と青色光を減らすためにカメラにＷｒａｔｔｅｎ　Ｎ ｏ、８フイルターを使った。糖に相当するハントは、それらが明瞭である場所に 示される。

ＬＹＣＨ標識は、適当な照射光（吸光度最大波長＝４２８　ｎｍ）で刺激した時 に強く蛍光を発する。予備実験は、おそら＜　ＬＹＣＨ中の不純物により生じた と忠われるゲル上の幾つかのほやけたバントを示した。

本発明の好ましい実施態様の上記記載は例示と説明のために提供されている。そ れは開示される正確な形式に本発明を限定するつもりのものではない。明らかに 、当業界の専門家には多数の改良および変更が明白であろう。本発明の原理およ びそれの実用を最も良く説明し、それによって当業者か本発明の様々な実施態様 を理解できるようにするために、そして期待される特定の用途に適するように様 々な変更を伴って、実施態様を選択し記載した。本発明の範囲は次の請求の範囲 およびそれらの同等物により定義される。

〒Ｈ２ Ｈ ！ Ｈ２ ＦＩＧ、Ｉ ＦＩＧ、２ 国際調査報告 １＊ｌｔｒ＋−啼一静−−一一宮テ／１ｍ１八鳩ζ

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．炭水化物物質を分離または識別する方法であって、ヒドラジン基を含む標識 試薬で炭水化物物質を標識して蛍光標識された物質を生成せしめ、前記標識され た物質を電気泳動用ゲルに適用し、そして前記ゲルを泳動して異なる物質の示差 移動を引き起こすことを含んで成る方法。
2. ２．前記標識試薬がルシファーイエロー（Ｌｕｃｉｆｅｒ　Ｙｅｌｌｏｗ）ＣＨ を含んで成る、請求項１の方法。
3. ３．前記炭水化物物質が、前記物質を還元剤の存在下でルシファーイエローＣＨ と共にインキュベートすることによりルシファーイエローＣＨで標識される、請 求項２の方法。
4. ４．前記還元剤が水素化シアノホウ素ナトリウムである、請求項３の方法。
5. ５．前記ゲルが、１５％〜６０％の範囲の濃度を有する比較的濃厚なポリアクリ ルアミドゲルを含んで成る、請求項１の方法。
6. ６．前記ゲルが２０％〜４０％の範囲の濃度を有する、請求項５の方法。
7. ７．前記ゲルが勾配ゲルの形である、請求項１，２，３，４または５の方法。
8. ８．前記ゲルが架橋される、請求項１，２，３，４，５，６または７に記載の方 法。
9. ９．前記ゲルが、２０％（最上部）から４０％（最下部）までの連続勾配で異な るポリアクリルアミドゲル濃度（ｗ／ｖ）を有する直線ポリアクリルアミド勾配 ゲルを含んで成り、前記ゲルが最低濃度のポリアクリルアミドの所の０．５３％ から最高濃度のポリアクリルアミドの所の１．０６％まで異なる濃度（ｗ／ｖ） でビスにより架橋される、請求項１，２，３，４，５，６，７または８の方法。
10. １０．前記ゲルが濃縮用緩衝液系を使って泳動される、請求項１，２，３，４， ５，６，７，８または９の方法。
11. １１．前記標識された炭水化物物質が電荷共役装置を使ってゲル中で像化される 、１，２，３，４，５，６，７，８，９または１０の方法。
12. １２．前記電荷結合素子が、遅いスキャン読み出しで操作される冷却２０ｄＣＣ Ｄである、請求項１１の方法。
13. １３．炭水化物物質を分離または識別するためのキットであって、ａ）蛍光標識 された物質を生成することができるヒドラジン基を含む標識試薬； ｂ）電気泳動用ゲル：および ｃ）試験しようとする炭水化物物質と比較するための炭水化物標準 を含んで成るキット。
14. １４．前記標識試薬がルシファーイエローＣＨである、請求項１３のキット。
15. １５．前記キットが還元剤を更に含んで成る、請求項１３のキット。
16. １６．前記還元剤が水素化シアノホウ素ナトリウムである、請求項１５のキット 。
17. １７．前記電気泳動用ゲルが１５％〜６０％の範囲の濃度を有する比較的濃厚な ポリアクリルアミドゲルである、請求項１３のキット。
18. １８．前記ゲルが２０％〜４０％の範囲の濃度を有する、請求項１６のキット。
19. １９．前記ゲルが勾配ゲルの形である、請求項１６または１７のキット。
20. ２０．前記ゲルが架橋される、請求項１６，１７または１８のキット。
21. ２１．前記キットが電荷結合素子を含んで成る、請求項１６，１７，１８または １９のキット。