JPH06504438A - 白血病抑制因子受容体 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 白血病抑制因子受容体 〔技術背景） 本発明は一般的にはサイトカイン受容体、および特に白血病抑制因子受容体に関 する。 白血病抑制因子（Ｌ　Ｉ　Ｆ）は成人および胎児での異なった系の制御におして 中心的役割を果たしているポリペプチドホルモンである。ＬＩＦは種々の細胞型 に作用し、多数の生物活性を持っている。生物活性における多様性はＬＩＦの種 々の異名に反映されており、肝細胞刺激因子ｍ　（ＨＳ　Ｆ　ｍ　；　Ｂｘｕｍ ａｃｏおよびＷｏｅ。 阻害剤（ＭＬＰＬ　Ｔ　；１ｆｏ＋ｉ　Ｎ　＋１．、Ｂｉｏｅｈ＋ｉ　Ｂｉｏｐ ｈ７ｉＲｅａ、Ｃｃｍｍ、、ユ５Ｑ：　１０８５゜＋９Ｈ）　ｌ　Ｄ　Ａ細胞に 対するヒトインターロイキン（ＨＩ　ＬＤＡ　；）Ｊｕｅａｕ　ｅｌ　＋１．。 ８９＋１．　１９８９）：分化抑制活性（Ｄ　Ｉ　Ａ　；　Ｓｍ１ｉｂおよびＨ ｏｏｐｕ、　Ｄ＝ｗ！１．　Ｒｉｏｔ　ｕＬｌ、１９８７）および分化遅延因子 （Ｄ　ＲＦ　；　Ｋａｏｐ＋ｎｏおよびＣｏｔｔｏｎ、　Ｅｔｐ、　Ｃａ１ｌ。 Ｒｕ、１５４：　２３３．　１９８４ｔなどが挙げられる。 分化抑制または促進、増殖または機能促進にしろ、ＬＩＦの特質と考えられてい る生物活性の多様性はＬＩＦを結合する特異的原形質膜受容体により仲介される 。ＬＩＦにより開始される生物活性は広範囲であるにもかかわらず、リガンドは 種間て高度に保存されているので、ＬＩＦ受容体（Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒ）は種々の種 において高度に保存され、大多数の細胞上に発現されていると信しられて０るｉ Ｇｏｕｇｈ　＋ｔ　＋ｌ、、Ｐ：ｏＣＮａｉｌ、、１ｔｒｄ、Ｓｋｉ、　ＵＳ、 ｒ、　８ｊ：　１６２３．　１９３８：　Ｙｕ＋ａｍｏ＋堰@ｅｔ 細胞株、および骨芽細胞、胎盤栄養膜および肝実質細胞（Ｍ＋ｔ＋＋ｌｉ　＋ｉ 　ｒｌ、、　Ｒ１ｏｏｄ７６：　５０．　１９９０）を含むいくつかの非造血細 胞上でリガンドアフイニテイ架橋技術により同定された。そのような研究はＬＩ Ｆ−Ｒが９ＱｋＤａの分子量を持っていることを示唆している（１＋ｃｑｕｕ　 ｔＩａｌ、、５ｔｈ　５７ａｐｏ＋ｉｕｏ　ｔｕｔ　ｌｕ　）！ｕｑｕｕ＋＋　 ｄｅｌ’ｉ口ｉｌ＋ｌＩｍａｔｉｏ＊、リオン　１９９０年９月２５−２７日、 抄録Ｎα３７．ベージ１２２　（ｂｉ。 Ｍｕｉｅｕ　＋ａ、リオン、フランス））。結合等車線のスキャンチャード分析 によるＬｒＦ受容体の特徴付けにより、種々の標的細胞からの特異的細胞表面受 容体分子はＬＩＦに対しほとんど同じ親和性を持ち（４０〜１０１００ｐ、試験 されたすべての細胞型上に少数（細胞当り１５０から２，５００）存在している 。 ＬＴＦ−Ｈの構造的および生物学的特性およびＬ■Ｆ刺激に対する種々の細胞集 団の応答においてＬｒＦ−Ｒが果たしている役割の研究またはＬＩＦ−Ｒを治療 、診断またはアッセイに有効に使用するためには均質な組成物が必要とされる。 そのような組成物は培養細胞または受容体をコードしている遺伝子のクローニン グおよび発現により発現された受容体を精製することにより、理論的には入手可 能である。しかしながら本発明以前はいくつかの障害によりこれらの目的を達す ることができなかった。 第１に、いくつかの細胞はＬＩＦ−Ｒを発現することは同定されていたが、その ような細胞株は非常（°こ少ない数（１５０から２．５００受容体／細胞）のＬ ＩＦ−ＲＬか発現せず、そのためアミノ酸配列情報を得るまたはモノクローナル 抗体を発生させる十分な量の受容体の精製が妨げられていた。受容体の数が少な いため、実施が容易なりローニングの翻訳アッセイに基づく方法も不可能であっ た。 東２に、たとえＮ−末端蛋白質配列決定を可能にするほど十分に精製されたＬ　 Ｔ　Ｆ−Ｒ蛋白質組成物か得られても、遺伝コードの縮退のためかなりの追加の 実験なしには適切なプローブを決定することはできないであろう。ｃ　Ｄ　Ｎ　 Ａライブラリー中のハイブリダイズ配列を同定するのに必要とされる特異性を持 つプローブの決定には多くの繰返しの試みが必要であろう。直接発現クローニン グ技術は未知の特異性の異なったプローブを用いる繰返しのスクリーニングを必 要とせず、他の受容体のクローニング（例えばＩＬＩＲ）では宵用であったが、 少数のＬＩＦ−Ｒを発現している細胞由来のｃ　Ｄ　Ｎ　ＡライブラリーからＬ ｒＦ−Ｒクローンを同定するほど十分に感度が良いことは示されていない。 従って、１Ｆ−Ｒを精製またはＬ［Ｆ−Ｒをコードしている遺伝子をクローン化 するまたは発現する努力は、精製された受容体または受容体ｍＲＮＡの適切な材 料源がなかったため、いまだ達成されていない。 〔発明の概要〕 本発明は単離されたＬＩＦ−ＲおよびＩ、ＩＦ−Ｒ，特にヒトＬＩＦ−Ｒをコー ドしている単離されたＤＮＡ配列またはその類似物を提供する。好適にはそのよ うなり　Ｎ　Ａ配列は（ａ）ヒトクローン６５（配列番号第１番）およびマウス クローン３（配列番号第３番）のような天然ＬＩＦ−Ｒ遺伝子のコード領域由来 のヌクレオチド配列を持つｃＤＮＡクローン：　（ｂ）中程度のストリンジェン ト条件下（ａ）のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンにハイブリダイゼーシヨンでき、生物 学的に活性なしｒｌＦ−Ｒ分子をコードしているＤＮＡ配列；および（ｃ）（ａ ）および（ｂ）で定義されたＤＮＡ配列に対する遺伝コードの結果として縮退物 であり、および生物学的に活性なＬＩＦ−Ｒ分子をコードしているＤＮＡ配列か ら成る群より選択される。本発明はまた上に定義されたＤＮＡ配列を含む組換え 発現ベクター、組換え発現ベクターを用いて産生された組換えＬｒＦ−Ｒ分子お よび発現ベクターを利用して組換えＬＴＦ−Ｒ分子を産生ずる方法も提供する。 本発明はまたＬＩＦ−Ｒを含む実質的に均質な蛋白質組成物も提供する。 ＬＩＦ−Ｒ蛋白質は例えば配列番号第２番および配列番号第４番に示されている アミノ酸の配列を持っている。 本発明はまた上記の方法に従って製造された可溶性天然または組換え受容体蛋白 質の有効量を含み、治療、診断、ＬＩＦ−ＲのアッセイまたはＬＩＦ−Ｈに対す る抗体の上昇に使用するための組成物も提供する。 本発明のこれらおよびその他の観点は以下の詳細な説明を参照することにより明 らかになるであろう。 〔発明の詳細な説明〕 定　義 “白血病抑制因子受容体”および“Ｌ［Ｆ−Ｒ”とは単球−マクロファージおよ び巨核球を含む各種の造血細胞および骨芽細胞、胎盤栄養膜および肝実質細胞を 含む非造血細胞の表面上に存在し、哺乳類原形質膜蛋白質としてその天然の形状 で白血病抑制因子（ＬＩＦ）分子と結合でき、ＬＩＦにより細胞に与えられる信 号の伝達に役割を果たす蛋白質を意味する。成熟完全長ヒトＬＩＦ−Ｒは約９０ ｋＤｘの分子量を持つ蛋白質として以前に記載されている。しかしながら、本明 細書に記載されているヒ）ＬＩＦ−Ｒ蛋白質（配列番号第２番に示されている） の分子量は約１９０，０ＯＯｋＱｘである。ここで使用されるかぎり、上記の術 語はＬＩＦ結合または信号伝達活性を持つ天然ＬＩＦ−Ｒ蛋白質の類似体または サブユニットを含んでいる。特別に含まれているのは以下に定義するような先端 が切断されたＬＩＦ−Ｒ蛋白質の可溶化または融合形である。種の明示がない場 合、ＬＩＦ−Ｒは一般的に哺乳類ＬＩＦ−Ｒ（ヒト、マウスおよびウシＬｉ−Ｒ などが含まれるがそれらに限定されるわけではない）を意味する。同様に、欠失 突然変異体に特別の明示がない場合、術語ＬＩＦ−ＲはＬＴＦ−Ｒ生物活性を有 する突然変異体および類似体を含むＬＩＦ−Ｈのすべての形を意味している。 “可溶性ＬｒＦ−Ｒ”または’５ＬＩＦ−Ｒ”とは本発明に関連して使用される 場合、天然ＬＩＦ−Ｒの細胞外領域の全部または一部と実質的に同じであり、細 胞により分泌されるがしかしＬＴＦと結合する能力を保持しているかまたは細胞 表面詰合ＬｒＦ−Ｒ蛋白賀を経るＩ、ＩＦ信号伝達活性を阻害する蛋白質または 実質的に均等な類似体を意味している。もし可溶性ＬＩＦ−Ｒ蛋白質が細胞から 分泌されることができれば、可溶性ＬＩＦ−Ｒ蛋白賀にはトランスメンプラン領 域の一部または細胞質領域の一部または他の配列も含んでいてもよい。ＬｒＦ信 号伝達活性の阻害は内因性ＬＩＦ−Ｒを発現し、ＬＩＦに対し生物学的に応答性 でありまたは組換えＬＩＦ−ＲｃＤＮＡでトランスフェクトされた場合にＬｒＦ に対し生物学的に応答性である初代細胞または細胞株を用いて決定できる。 細胞はＬｒＦと接触させ生じる代謝的影響を試験する。もし、影響がリガンドの 作用に原因がある結果てあれば組換え受容体は信号伝達活性を持っている。 ポリペプチドが信号伝達活性を持っているかどうかを決定するために手本とする 方法はｌ＋ｍ＋ｄａ　ｃｌ　ａｌ、、Ｉ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、１７１：　８ ６Ｈｔ９９０）　；ＣｕＮｉ＋　ｅｌ　ｉｆ、、　ＰｔｏｃB 粕（＾ｃｓｔ　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　８６：　３ｆ１４５　（１９８９）　；　 ｔ’丁７ｖｅｓ　ｅｌ　ｚｌ、、　εＭＢＯ１，５：　２１V９ （１９８６）およびＣｈｏｐ　を自ｌ、、１．　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌｌ、　２ ６２：　１８４２　（＋９８７）に記載されている。 ＬＴＦ−Ｒ蛋白質または蛋白質組成物の純度を定義するため本明細書に関連して 使用される術語“単離された”または“精製された”とは蛋白質または蛋白質組 成物が他の天然のまたは内在性の蛋白質を実質的に含んでいず、製造過程の蛋白 質夾雑物残留物の量は約１９６未満である。しかしながらそのような組成物は安 定剤、担体、賦形剤または同時治療剤として添加された池の蛋白質を含有するこ とができる。Ｌ［Ｆ−Ｒがポリアクリルアミドゲル中の銀染色により単一の蛋白 質バンドとして検出されるなら、それは“単離されて”いる。 術語“実質的に同じ”をアミノ酸または核酸を定義するために使用する場合、そ れは例えば突然変異体配列のように１つまたはそれ以上の置換、欠失または付加 により参照とする配列とは異なっているが、例えば下記実施例１に記載されてい るようなＬＩＦ−Ｒ結合アッセイにおいて決定されるであろうＬＩＦ−Ｒ蛋白質 の生物学的活性を保持している正味の作用を示す特定の検体配列を意味している 。もしくは、もし、（ａ）ＤＮＡ配列がＬ　ｒ　Ｆ−Ｒクローン６５のコード領 域から誘導される；　（ｂ）中程度のストリンジェント条件下（５０℃、２×５ ＳＣ）、ＤＮＡ配列が（ａ）のＤＮＡ配列にハイブリダイズでき、生物学的に活 性なＬＩＦ−Ｒ分子をコードしている。または（ａ）または（ｂ）で定義された ＤＮＡ配列に対する遺伝コードの結果として縮退され、生物学的に活性なＬ　Ｉ 　Ｆ−Ｒ分子をコードしているＤＮＡ配列であれば核酸サブユニットおよび類似 体はここに開示されている特異的Ｄ　Ｎ　Ａ配列と“実質的に同じ”である。　 −ここで使用される場合“組換え体”とは組換え（例えば微生物または哺乳類） 発現系から誘導される蛋白質であることを意味する。“微生物の”とは細菌また は真！（例えば酵母）発現系で製造された組換え蛋白質を意味する。生成物とし ての“微生物による組換え体”は本質的に天然の内在性物質を含んで（１ず、付 随する天然のグリコジル化は伴われていない蛋白質として定義される。はとんど の細菌培養で発現される蛋白質は（例えば大腸Ｗ）グリカンを含んでいないであ ろう：酵母中で発現される蛋白質は哺乳類中で発現されるものと異なったグリコ ジル化パターンを持っているであろう。 ＬｒＦ−Ｒの特質として、本明細書を通して使用される“生物学的に活性°とは 特定の分子が検出可能な量のＬＴＦ　（好適にはナノモルのＬｒＦ−Ｒ当り少く とも０．０１ナノモルのＬｒＦ）を結合できるＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒクローン６５と十 分なアミノ酸配列類似性を共有する、または（他の選択としては）例えばハイブ リット受容体構成物の組成物として細胞へのＬｒＦ刺激を伝達できる十分なアミ ノ酸配列類似性を共有する。より好適には、本発明の範囲内の生物学的に活性な Ｌ　［Ｆ−Ｒはナノモル受容体当り０，１ナノモル以上の１．ＩＦを、最も好適 にはナノモル受容体当り０．５ナノモル以上のＬｒＦを結合できる。 “ＤＮＡ配列”とは少くとも１度は実質的に純粋な形（即ち内因性物質を含んで いず、例えばクローニングベクターを用いるような標準的な生化学的方法により 配列およびそのヌクレオチド配列組成物の同定、取り扱いおよび回収が可能な量 または濃度で）で単離されたＤＮＡから誘導された分離された断片の形のまたは より大きなりＮＡ構成物の成分としてのＤＮＡポリマーを意味している。そのよ うな配列は好適には内部非翻訳配列またはイントロンにより中断されない転写解 読枠中に提供され、典型的には真核生物遺伝子内に存在している。しかしながら 、関連した配列を含むゲノムＤＮＡもまた使用できることは明らかであろう。 非翻訳ＤＮＡの配列は、コード領域の取り扱いまたは発現を妨害しない転写解読 枠からの５′または３′に存在してもよい。 °ヌクレオチド配列“とはデオキシリボヌクレオチドのヘテロポリマーを意味し ている。本発明により提供される蛋白質をコードしているＤＮＡ配列はｃＤＮＡ 断片および短いオリゴヌクレオチドリンカーから、または一連のオ１７ゴヌクレ オチドから組立てられ、組換え体転写ユニット中で発現されることが可能な合成 遺伝子が提供される。 “組換え発現ベクター”は（１）遺伝子要素または例えばプロモーターまたはエ ンハンサ−のような遺伝子発現に制御的役割を持つ要素、（２）ｍＲＮＡへ転写 され蛋白質へ翻訳される構造またはコード配列、および（３）適当な転写および 翻訳開始および終結配列の集合体から成る転写ユニットを含むプラスミドを意味 する。酵母発現系での使用を意図する構造要素は好適には宿主細胞による翻訳蛋 白質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含んでいる。もしくは、組換え蛋 白質がリーダーまたはトランスポート配列なしで発現される場合には、Ｎ？末端 メチオニノ残基を含んているてあろう。この残基は発現された組換え蛋白質から 随意に続いて切断され、最終生成物を提供する。 “組換え体微生物発現系”とは安定して組換え体転写ユニットを染色体ＤＮＡ内 へ組込み、または組換え体転写ユニットを常在性プラスミドの成分として運んで いる例えば大腸菌のような細菌または且　セレビシェ（ｃｕｕｉｉｉａｅ）のよ うな酵母などの適切な宿主微生物の実質的に均質な単一培養系を意味している。 一般に、本系を構成している細胞は単一の先祖の形質転換体の子孫である。ここ で定義された組換え体発現系は発現されるべきＤＮＡ配列または合成遺伝子に連 結された制御要素の誘導により異種蛋白質を発現するであろう◇ＬＩＦ−Ｒをコ ードしているｃＤＮＡの単離ヒトＬ［Ｆ−ＲをコードしているヒトＤＮＡ配列が ヒト胎盤細胞から単離されたポリアデニル化ＲＮＡの逆転写による常法を用いて 調製されたｃＤＮＡライブラリーから単離された。 生物学的に活性なＬＩＦ−Ｒを発現しているトランスフェクト体は最初Ｇｌｌｌ ｉｆｉｇ　ｓｔ　ｓｌ、、　刑　虹３６６７、　１９８７に本質的に記載されて いる修正スライドオートラジオグラフィー技術を用いて同定された。簡単に記す と、ＣＯ３−７細胞をｃＤＮＡクローンのプールからのｐＤｃ３０３中の少量の ＤＮＡでガラススライド上で直接的にトランスフェクトした。トランスフェクト された細胞を含むスライドは次に”Ｉ−ＬＩＦを含む培地とインキュベートし、 結合されていない標識ＬＩＦを除去するために洗浄し、グルタルアルデヒドて固 定し、液体写真乳化剤に浸し、暗所で曝露させた。スライドを現像後、顕微鏡で 個々を試験し、ＬＩＦを発現している陽性細胞は明るいバンクグラウンドに対す るオートラジオグラフの銀粒子の存在により同定される。 この研究により、１つのトランスフェクト体のプールがＬＩＦ結合に対し明らか に陽性の多数の細胞を示すまでスライドオートラジオグラフィー法を用いて約２ ．４００のｃＤＮＡのプール中の約２４０．０００のｃＤＮＡがスクリーニング された。このプールは次に６００のプールに分割され、再びスライドオートラジ オグラフィーによりスクリーニングされ、陽性のプールが同定された。このプー ルが更に６０のプールに分割され、結合１２５Ｉ−ＬＴＦの定量により分析され るプレート結合アッセイによりスクリーニングされた。６０のプールのどれが陽 性であったかを決定するために細胞を削り取り計数した。この６０のプールから の個々のコロニーは検出可能なＬＩＦ結合活性を持つ表面蛋白質の合成を指示す る単一のクローン（クローン６５）が同定されるまでスクリーニングされた。こ のクローンが単離され、ヒトＬＩＦ−ＲｃＤＮＡクローン６５の配列を決定する ためその挿入物の配列が決定された。ヒトＬＩＦ−ＲｃＤＮＡクローン６５を含 んでいるクローニングベクターｐＤｃ３０３はｐＨＬＩＦＲ−６５の名前で１９ ９０年１２月１１日２＾１１ｅ＋１ｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕ＋ｅ　Ｃｏ１ １ｅｃｔｉｏｎ、　Ｒｏ山（口ｅ、　ＭＤ。 ＵＳＡ　（ＡＴＣＣ）　ニ寄託され？−（ＡＴＣＣ寄託番号第６８４９１号）、 寄託物はブタベスト条約の条件下にある。 ヒト配列からプローブが構成でき、種々の他の哺乳類のｃＤＮＡライブラリーの スクリーニングに使用された。ヒトプローブにハイブリダイズするｃ　Ｄ　Ｎ　 Ａクローンが単離され、配列決定された。 多くの哺乳類遺伝子のように、哺乳類ＬＩＦ−Ｒはおそらく多−エクソン遺伝子 によりコードされている。転写後翼なったｍＲＮＡスプライシングをうけること ができ、ここに特許請求されたｃＤＮＡと同一のまたは類似の大きな領域を共有 する他のｍＲＮＡ構成物も本発明の範囲内であると考えられる。 ＬＩＦ−ＲをコードしているｃＤＮＡクローンの分析Ｌ［Ｆ−Ｒをコードしてい るｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列および翻訳されたアミノ酸配列は配列リストに 示されている。配列番号第１番および配列番号第２番はヒトＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒクロ ーン６５のヌクレオチド配列および予測されるアミノ酸配列を示している。この 特別のクローンは５′断片でありコード領域の３′末端が欠けている。コード領 域はヌクレオチド１７９−３１８２にわたって０る。このヌクレオチド配列より コードされている成熟ペプチドの部分アミノ酸配列−アミノ酸１−９５７により 規定されている。予測されるシグナルペプチドは−４４から−１のアミノ酸によ り規定されている。 配列番号第３番および配列番号第４番はマウスＬ　Ｔ　Ｆ−Ｒクローン３のヌク レオチド配列および予測されるアミノ酸配列を示している。この特別のクローン （よマウスＬＩＦ−Ｒの天然に存在する可溶性形であり、トランスメンブラン領 域を持っていない。トランスメンブラン領域かないため、この蛋白質分子は細胞 膜を通過して輸送される。コード領域はヌクレオチド５３−２２１２にわたって いる。 このヌクレオチド配列によりコードされている成熟ペプチドのアミノ酸配列はア ミノ酸１−６７８により規定されている。推測されるシグナルペプチドは−４３ から−１のアミノ酸により規定されている。 蛋白質および類似物 本発明は単離された組換え哨乳類ＬＩＦ−Ｒポリペプチドを提供する。本発明の 単離されたＬＩＦ−Ｒポリペプチドは天然または内因性起源の他の夾雑物質を実 質的に含んでいす、製造過程の蛋白質夾雑物残留の量は約１％未満である。本発 明のＬｒＦ−Ｒポリペプチドは随意に天然のパターンのグリコジル化を伴なって いなくてもよい。 本発明の哺乳類Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｈには実施例によると、霊長類、ヒト、マウス、イ ヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ヤギおよびブタＬＩＦ−Ｒが含まれる。哺乳類 ＬＩＦ−Ｒは例えば、哺乳類ｃＤＮＡライブラリーからＬＩＦ−ＲｃＤＮＡを単 離するためのハイブリダイゼーションプローブとしてヒトＬＩＦ−ＲＤＮＡ配列 クローン６５から誘導される一本鎖ｃＤＮＡを用いる交差種／％イブリダイゼー ションにより得ることができる。 本発明の範囲内のＬＩＦ−Ｒの誘導体はまた生物活性を保持する一次蛋白質の種 々の構造形も含んでいる。イオン化可能な例えばアミノおよびカルボキシル基が 存在するため、ＬＩＦ−Ｒ蛋白質は酸性または塩基性塩の形でまたは中性形で存 在できる。個々のアミノ酸残基はまた酸化または還元により修飾してもよい。 −次アミノ酸構造はグリコジル化、脂質、リン酸、アセチル基などのような他の 化学構造部分との共有結合または凝集性複合体の形成により、またはアミノ酸配 列突然変異体の創造により修飾してもよい。共有結合誘導体はＬＩＦ−Ｒアミノ 酸側鎖またはＮまたはＣ末端の特定の官能基を結合させることにより製造される 。本発明の範囲に含まれる別のＬＩＦ−Ｒの誘導体には、Ｎ末端またはＣ末端融 合のような組換え体培養における合成によるような、他の蛋白質またはポリペプ チドとのＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒまたはその断片の共有結合性または凝集性複合体が含ま れる。例えば、複合されたペプチドは翻訳と同時にまたは翻訳後にその合成部位 から細胞膜または壁の内側または外側の機能する部位へ移される蛋白質のＮ末端 領域のシグナル（またはリーダー）ポリペプチド配列であろう（例えば酵母α因 子リーダー）。ＬＩＦ−Ｒ蛋白質融合物はＬＩＦ−Ｒの精製または同定を容易に するためのペプチドを含むことができる（例えばポリ−Ｈ１ｓ）。ＬＩＦ−Ｒの アミノ酸配列はペプチドＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａ、５ｐ−Ａｓｐ− Ａｓ　ｐ−Ｌｙｓ　（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）　（ｔｌｏｐｐ　ｅｔ　Ｊｌ、、　Ｂ ｉｏｌ　Ｔｅｃｈｃｏｌｏｇ７６−１２Ｇ１．　１９８８）とも連結できる。後 者の配列は非常に抗原性があり、特異的モノクローナル抗体により可逆的に結合 されるエピトープを提供し、発現された組換え蛋白質の迅速なアッセイおよび容 易な精製を可能にする。この配列はまたＡｓｐ−Ｌｙｓ対の直後の残基でウシ粘 膜エンテロキナーゼにより特異的に切断される。 このペプチドでキャップされた融合蛋白質はまた大腸菌における細胞内分解に対 する耐性を持っている。 Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒ誘導体はまた免疫原、受容体に基づくイムノアッセイまたはＬＩ Ｆまたは他の結合リガンドの親和性精製法のための結合剤として使用してもよい 。 ＬＩＦ−Ｒ誘導体はまたシスティンおよびリジン残基でのＭ−マレインイミドベ ンゾイルスクシンイミドエステルおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドのような 架橋剤によっても得ることができる。ＬＩＦ−Ｒ蛋白質はまた、臭化シアン活性 化、ビスオキシラン活性化、カルボニルジイミダゾール活性化またはトシル活性 化アガロース構造のような種々の不溶性物質への反応性側鎖を経た、またはポリ オレフィン表面への吸着により（グルタルアルデヒド架橋で、または架橋なしで ）共有結合で結合されていてもよい。一度基質へ結合されたら、ＬＩＦ−Ｒは抗 Ｌ　ｒ　Ｆ−Ｒ抗体またはＬＩＦの選択的結合に使用できるであろう（アッセイ または精製の目的で）。 本発明はまた、天然のパターンのグリコジル化を伴うまたは伴わないＬＩＦ−Ｒ を含んでいる。酵母または哺乳類発現系（例えばＣＯ３−７Ｉ［１胞）で発現す したＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒは発現系に依存して、天然分子と同様かまたはわずかに異な った分子量およびグリコジル化パターンであろう。大腸菌のような細菌中でのＬ ＩＦ−ＲＤＮＡの発現では非グリコシル化分子を生じる。不活性化Ｎ−グリコジ ル化部位を持つ哺乳類ＬｒＦ−Ｒの機能性突然変異類似体は、オリゴヌクレオチ ド合成および連結により、または部位特異性突然変異誘発技術により産生できる 。 これらの類似体蛋白質は酵母発現系を用いて好収量で均質な還元炭化水素形で製 造できる。真核生物蛋白質のＮ−グリコジル化部位はアミノ酸トリブレットＡｓ ｎ−Ａｔ−Ｚ（式中、Ａ１はＰｒｏを除いたアミノ酸であり、ＺはＳｅｒまたは Ｔｈｒである）により特徴付けられる。この配列においてアスパラギンは炭化水 素の共有結合のための側鎖アミノ基を提供している。そのような部位はＡｓｎま たは残基Ｚを他のアミノ酸で置換、ＡｓｎまたはＺの欠失またはＡ１およびＺの 間への非Ｚアミノ酸、またはＡｓｎおよびＡ１間へのＡｓｎ以外のアミノ酸の挿 入により除去することができる。 ＬＩＦ−Ｒ誘導体はＬＩＦ−Ｒまたはそのサブユニットの突然変異によっても得 ることができる。ここでＡＬＩＦ−Ｒ突然変異体とは、ＬｒＦ−Ｒと相同なポリ ペプチドであるが、欠失、挿入または置換により天然のＬｒＦ−Ｒと異なったア ミノ酸配列を持っているものを意味している。 生物学的に同等なＬＩＦ−Ｒ蛋白質の類似体は例えば、残基または配列の種々の 置換または生物学的活性に必要とされない末端または内部残基または配列を欠失 させることにより構成されるであろう。例えば復元に際し不必要なまたは誤った 分子内ジスルフィド架橋の形成を防止するためシスティン残基は欠失させるまた は他のアミノ酸と置き換えることができる。突然変異発生の他の方法にはＫＥＸ Ｚプロテアーゼ活性が存在する酵母系における発現を促進させるための隣接する 二塩基性アミノ酸残基の修飾が挙げられる。一般的に置換は保守的でおるべきで ある；即ち、最も好適な置換アミノ酸は置換されるべき残基と似た物理化学特性 を持つものである。同様に、欠失または挿入戦略が採用された場合、生物学的活 性に対する欠失または挿入の潜在的影響を考慮すべきである。上に定義したよう な実質的に同じポリペプチド配列は一般的に同じ数のアミノ酸配列を含んでいる が、可溶性Ｌ　ｒ　Ｆ−Ｒの目的にＣ末端を切断したものはより少いアミノ酸配 列しか含んでいないであろう。ＬＩＦ−Ｈの生物学的活性を保存するために、欠 失および置換によっても好適には相同的または保存的な置換配列を得、ある残基 は生物学的に類似のべ基により置換されることを意味している。保守的置換の例 としては脂肪族残基の他のもの（他のものとしてはＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕまた はＡｌａ）への置換、または１つの極性残基の他のものへの置換（Ｌｙｓおよび Ａｒｇ；ＧｌｕおよびＡｓｐ；またはＧｌｕおよびＡｓｎ間のような）が挙げら れる。別のそのような保守的置換には例えば類似の疎水性特性を持つ全領域の置 換がよく知られている。さらに、ヒト、マウスおよび他の哺乳類ＬｒＦ−Ｒ間の 特定のアミノ酸の相違はＬｒＦ−Ｈの必須の生物特性を変化させることなくでき るさらなる保存的置換を示唆するものである。 ＬｒＦ−Ｈのサブユニットは末端または内部残基または配列を欠失させることに より構成される。特に好適な配列には細胞培養培地内への受容体の分泌を容易に するためにＬＩＦ−Ｈのトランスメンブラン領域および細胞内領域を欠失させた または親水性残基で置換した配列が含まれる。もし可溶性ＬＩＦ−Ｒ蛋白質が細 胞から分泌されることが可能なら、可溶性ＬＩＦ−Ｒはまたトランスメンブラン 領域の一部を含んでいてもよい。得られた蛋白質は可溶性ＬｒＦ−Ｒ分子と称さ れ、ＬＨ’を結合するその能力は保持している。本発明はＬＩＦ−Ｒの細胞外領 域のすべての部分に対応するそのような可溶性ＬＩＦ−Ｒ構成物も企図している 。得られた可溶性ＬＩＦ−Ｒ構成物は次に適当な発現ベクター中に挿入および発 現され、実施例１に記載したようにＬＩＦを結合する能力が検定された。そのよ うな構成物から生じる生物学的に活性な可溶性ＬｆＦ−Ｒもまた本発明の範囲内 に含まれている。 ＬＩＦ−Ｒ類似体を発現するために構成されたヌクレオチド配列中の突然変異ｍ ＲＮＡの翻訳に悪い影響を与えるであろう。ループやヘアピンのような二次ｍＲ ＮＡ構造を作り出すようにハイブリダイズできる相補的領域を作り出さないであ ろう。突然変異の部位は前もって決定できるが、突然変異それ自体の性質が前も って決定される必要はない。例えば、ある部位での突然変異の最適な特性を選択 するためには標的コドンでの無作為な突然変異発生が実施され、所望の活性で発 現されたＬｒＦ−Ｒ突然変異体をスクリーニングする。 ＬｒＦ−Ｒをコードしているヌクレオチド配列のすべての突然変異が最終生成物 を発現するわけではなく、例えば、転写されたｍＲＮＡ中の二次構造ループを第 一に避けるように発現を促進させるように（ＥＰＡ７５．４４４Ａ、引例として 包含されている）または選択され宿主によりもっと容易に翻訳されるコドンを提 供するように（例えば、大腸菌での発現のためのよく知られている大腸菌にゝ　 好適なコドン）ヌクレオチド置換を行ってもよい。 天然配列の断片への連結を可能にする制限部位が隣接する突然変異配列を含むオ リゴヌクレオチドを合成することにより特定の座位へ突然変異が導入できる。 連結後、生じる再構成配列は所望のアミノ酸の挿入、置換または欠失を持つ類似 体をコードしている。 もしくは、必要とされる置換、欠失または挿入に従って変えられた特定のコドン を持つ変化遺伝子を提供するためにオリゴヌクレオチド指令部位特異性突然変異 誘発法を用いることができる。上に示した変更を行う方法の例はＷａｌｄｕ原理 および方法、ＰＩ！ｎｕｎ　Ｐｔｅｕ、１９８１）に記載されており；米国特許 第４．５１８．５８４号および第４，７３７，４６２号に適切な技術が開示され ており、ここに参照として編入される。 ＬｒＦ−Ｒの一価形および多価形の両方とも本発明の組成物および方法に宵用で ある。多価形はＬｒＦリガンドに対する複数のＬＩＦ−Ｒ結合部位を持っている 。例えば、二価可溶性ＬＩＦ−Ｒはリンカ−領域で分離されたしＩＦ−Ｈの細胞 外領域の２つの縦列繰返しから成っているであろう。別の多価形はまた例えば臨 床的に受容可能な担体分子、フィコール、ポリエチレングリコールまたはデキス トランから成る群より選択されるポリマーへの通常の結合技術を用いるＬＩＦ− Ｒの化学的結合により構成される。もしくは、ＬＩＦ−Ｒはビオチンへ化学的に 結合でき、次にビオチン−ＬＩＦ−Ｒ複合体はアビジンへ結合され、三価のアビ ジン／ビオチン／Ｌ　ｒ　Ｆ−Ｒ分子が得られる。ＬＩＦ−Ｒはまたジニトロフ ェノール（Ｄ　Ｎ　Ｐ　）またはトリニトロフェノール（ＴＮＰ）と共有結合で 結合され、得られる複合体は抗ＤＮＰまたは抗７ＮＦ−１ｇＭで沈殿され、ＬＩ Ｆ−Ｒ結合部位に対し＋価の士量体複合体を形成する。 組換えキメラ抗体分子はまたイムノグロブリン分子重鎮および軽鎖の片方または 両方の可変ドメインで置換されたＬ　ｒ　Ｆ−Ｒ配列を持って、および非修飾定 常部ドメインを持って産生されるのであろう。例えば、キメラＬ［Ｆ−Ｒ／Ｉ　 ｇＧｌは２つのキメラ遺伝子から産生されるであろう−−ＬｒＦ−Ｒ／ヒトに軽 鎖キメラ（Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒ／Ｃｋ）およびＬ［Ｆ−Ｒ／ヒトｇ１重鎖キメラ（Ｌ 　ｒ　Ｆ−Ｒ／Ｃｇ−［）。２つのキメラ遺伝子の転写および翻訳に続いて、Ｌ ＩＦ−Ｒを持つ単一のキメラ抗体分子へ組立てられた遺伝子産物は二価を示した 。 そのようなＬＩＰ−Ｈの多価形はＬＩＦリガンドに対し促進された結合親和性を 持っているであろう。そのようなキメラ抗体分子の構成に関する詳細はＷ。 ８９１０９６２２およびＥＰ３１５０６２に開示されている。 組換えＬＩＦ−Ｈの発現 本発明はＬＩＦ−ＲをコードとしているＤＮＡを増幅または発現するための組換 え発現ベクターを提供する。組換え発現ベクターは哺乳も細菌、ウィルスまたは 昆虫遺伝子から誘導された適当な転写または翻訳制御要素に作動できるように結 合された哺乳類ＬＩＦ−Ｒまたは生物学的均等物をコードしている合成またはｃ ＤＮＡ由来ＤＮＡ断片を持つ複製可能なりＮＡ構成物である。転写ユニットは一 般的に（１）遺伝要素または例えば転写プロモーターまたはエンハンサ−のよう な遺伝子発現に制御的役割を持つ要素、（２）ｍＲＮＡへ転写され蛋白質に翻訳 される構造またはコード配列、および（３）以下に詳しく記載されるような適当 な転写および翻訳開始および終結配列の集合体を含んでいる。そのような制御要 素は適したｍＲＮＡリポソーム結合部位をコードしている配列である転写を制御 するためのオペレーター配列を含んでいるであろう。宿主内での複製の能力゛（ 通常複製の起点により与えられる）および形質転換体の認識を容易にする選択遺 伝子もさらに取り込まれるのであろう。ＤＮＡ１ｌｊ域は互いに機能的に関係し ている場合、作動可能なように連結されている。例えば、シグナルペプチド（分 泌リーダー）のためのＤＮＡはもしそれがポリペプチドの分泌に関与する前駆体 として発現されるならポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能なように結合され ており：プロモーターはもしそれがコード配列の転写を制御するならコード配列 に対し作動可能なように結合されており；またはリポソーム結合部位はもしそれ が翻訳を可能にするように位置されるとするならコード配列に作動可能なように 連結されている。一般的に作動可能なように連結されているとは隣接しているこ とを意味しており、分泌リーダーの場合には隣接して解読枠内にある。酵母発現 系での使用を意図する構造要素は好適には宿主細胞による翻訳された蛋白質の細 胞外分泌を可能にするリーダー配列を含んでいる。もしくは、組換え蛋白質がリ ーダーまたは輸送配列なしで発現される場合には、Ｎ−末端メチオニン残基が含 まれているであろう。この残基は組換え蛋白質から続いて随意に切断され、最終 生成物を与える。 微生物中で発現するようにされた哺乳類ＬＩＦ−ＲをコードしているＤＮＡ配列 は好適にはＤＮＡのｍＲＮＡへの転写を未成熟のまま停止させることができるイ ントロンは含まないであろう：しかしながら、例えばそれは都合の良いＣ末端切 断物を持つ（例えば、トランスメンブラン領域の欠失は細胞膜に結合しない可溶 性受容体を与える）突然変異体を与えるであろうので転写の未成熟停止は望まし いことであろう。コード縮退のため、同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチ ド配列にはかなりの変異があり得る。他の実施態様には、中程度のストリンジェ ント条件下（５０℃、２ＸＳＳＣ）クローン６５にノーイブリダイズできる配列 が含まれており、別の配列は生物学的に活性なＬＴＦ−Ｒポリペプチドをコード している配列ヘハイブリダイズできるかまたは縮退している。 安定して染色体ＤＮＡ内へ組換え体転写ユニットを組込んでいる（形質転換また はトランスフエクションにより）、または内在するプラスミドの成分として組換 え体転写ユニットを運んでいる例えば大腸菌のような細菌または且、セレビシェ （ＣＵ＋マ…ａｔ）のような酵母などの適した宿主微生物の実質的に均質である 一単一培養からなる組換え体発現系で組換えＬＩＦ−ＲＤＮＡが発現されまたは 増幅される。一般的に系を構成している細胞は単一の祖先の形質転換体の子孫で ある。ここで定義される組換え体発現系は発現されるべきＤＮＡ配列または合成 遺伝子に連結された制御要素の誘導により異種蛋白質を発現するであろう。 形質転換された宿主細胞とは、組換えＤＮＡ技術を用いて構成されたＬＩＦ−Ｒ ベクターで形質転換またはトランスフェクトされている細胞である。形質転換さ れた宿主細胞は通常Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒを発現するが、ＬＩＦ−ＲＤＮＡのクローニ ングまたは増幅の目的で形質転換された宿主細胞はＬ　Ｔ　Ｆ−Ｒを発現する必 要がない。発現されたＬＩＦ−Ｒは選択されたＬ　Ｉ　Ｆ−Ｈに依存して、細胞 膜中にとどまるかまたは培養土清液内へ分泌される。哺乳類Ｌ　［Ｆ−Ｒの発現 に適した宿主細胞には原核生物、酵母または適当なプロモーター制御下の高等真 核生物が含まれる。原核生物には例えば大腸菌または桿菌などのゲノム陰性また はダラム陽性園が含まれる。高等真核生物細胞には以下に記載するような哺乳類 起源の確立された細胞株が含まれる。本発明のＤＮＡ構成物から誘導されるＲＮ Ａを用いて哺乳類Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒを産出するための細胞を含まない翻訳系もまた 使用することができる。細菌、真菌、酵母および哺乳類細胞宿主で使用するため に適したクローニングおよび発現ベクターはＰｏｕｗｅ！＋　ｓｔ　ａｌ、、に より記載されており（クローニングベクター　実験室マニュアル、Ｅｌ＋ｅｖｉ ！＋、　Ｎｕ　Ｙａｎｋ、　１９８５）　、その関連する記載はここに参照とし て含まれている。 原核生物発現宿主は、広範な蛋白分解およびジスルフィド処理を必要としないＬ ｒＦ−Ｒの発現に使用されるであろう。原核生物発現ベクターは一般的に１つま たはそれ以上の表現型選択可能マーカー（例えば抗生物質耐性を与える、または 独立栄養要求性を供給する蛋白質をコードしている遺伝子）、および宿主内での 増幅を確かにする宿主により認識される復製の起点を含んでいる。形質転換の題 により使用してもよい。 細菌で使用するための有用な発現ベクターは選択可能マーカーおよびよ−く知ら れたクローニングベクターｐＢＲ３２２ぐＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝要素を含 む市販品として入手可能なプラスミドから誘導される細菌の復製開始点を含むこ とができる。そのような市販ベクターには例えばｐＫＫ２２３−３およびｐ　Ｇ ＥＸ　（Ｐｈｕｍａｃｉｚ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃｇｌｘ、　Ｕｐｐ＋ｘｌｔ 　Ｓｗｅｄｅｎ）およびｐＧＥＭｌ（ＰｒｏｍＢ＋　Ｂｉｏｔｅｃ、Ｍａｄｉ＋ ｏｎ、　Ｉｆｆ、ＵＳＡ）が含まれる。これらのｐＢＲ３２２”バックボーン” 部分は適当なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組合わせられる。大 腸菌は典型的には大腸菌種から誘導されるプラスミド、ｐＢＲ３２２の誘導体を 用いて形質転換される（Ｂｏｌｉｖｉｒ　ｅｌ　ａｔ、、　Ｇｅｎｅ　２　：９ ５゜１９７７）　、　ｐ　ＢＨ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐 性遺伝子を含んでおり、従って形質転換した細胞の同定か簡単である。 組換え体微生物発現ベクターで通常使用されるプロモーターにはβ−ラクタマー ゼ（ペニンリナーセ）およびラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇ　ｔｔ　ｔ ｌ、。 Ｎａｔｕｒｅ　２７５：　６１５．　１９７８：およびＧｏ＋ｄｄｅｌ　４１　 ＋１．、　Ｎａｔｕ：＋　２８１　：　５４４．１９７９）A トリプトファン（ｔ！ｐｌプロモーター系（Ｇｏ＋ｄｄ＋ｌ　ｔｔ　ａｌ、、　 Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｔ　Ｒａ＋、％４０５７、　１９８０　およびＥＰＡ　３６ ．　７７６）およびｔａ＋プロモーター（ｖａｎｉａｔｉ＋、モレキュラークロ ーニング　実験室マニュアル、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈｉｂｏｒ　Ｌｉｂ ｏ：ａｔｏ４．　ｐ、４１２゜１．９８２）が含まれる。特に有用な細菌発現系 はファージＩＰＬプロモーターおよびＣｌ８５７ｔｓ熱不安定性レプレツサーを 用いる。大腸菌株ＪＭＢ９　（ＡＴＣＣ３７０９２）内在性プラスミドｐＨＵＢ ２および大腸菌ＲＲＩ　（ＡＴＣＣ５３０８２）内在性ｐＰＬｃ２８を含むＩＰ Ｌプロモーターの誘導体をとり込んだプラスミドベクターがアメリカンタイプカ ルチャーコレクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃ＋ｌｌ ！ｃｔｉｏｎｌから入手可能である。 組換えＬＩＦ−Ｒ蛋白質はまた酵母宿主（好適には且、セレビシェ（ｃｕｅｖｉ ｉｉｏ）のようなサツカロマイセス（Ｓ＋ｅｃｈａ＋ｏｍマｅ＋ｔｉ種から）中 で発現させてもよい。ピキア（Ｐｉｃｂｉｉ）またはクルイベロマイセス（Ｋｌ ｕ７ｖｅ：ｏｍ７ｃｅ＋）のような他の漠の酵母を使用してもよい。酵母ベクタ ーは一般的に２ｍ酵母プラスミドからの複製開始点または自律性複製配列（ＡＲ Ｓ）　、プロモーター、ＬｒＦ−ＲをコードしているＤＮＡ、ポリアデニル化お よび転写終結のための配列および選択遺伝子を含んでいる。好適には酵母ベクタ ーは酵素および大腸菌の両方の一形質転換を可能にする複製開始点および選択マ ーカー（例えば大腸菌および互、二子、これらはトリプトファンの中で増殖する 能力を欠く酵母の突然変異株のための選択マーカーを提供する）および下流の構 造配列の転写を誘導するための高度に発現された酵母から誘導されたプロモータ ーを含んでいるであろう。酵母宿主細胞ゲノム中のＴＲＰＩまたはＵＲＡ３障害 はトリプトファンまたはウラノル不在化での増殖による形質転換検出のための有 効な環境を提供する。 酵母ベクターの中の適したプロモーター配列にはメタロチオネイン、３−ホスま たはエノラーゼ、グリセロアルデヒド、３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキ ナーゼ、ビルベートデカルボキシラーセ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース −６−リン峻イソメラーゼ、３−ホスホグリセラードムターゼ、ピルベートキナ ーゼ、トリオースホスフニートイソメラーセ、ホスホグルコースイソのためのプ ロモーターが含まれる。酵母発現において使用するために適したベクターおよび プロモーターはＲ，Ｈｉｕｕ＋＋ａｎ　ｌ＋　Ｉｌ、、ＥＰＡ　７３．　６５？ にさらに記載されている。 好適な酵母ベクターは大腸菌中の選択および復製のためのｐＵｃ１８からのＤＮ Ａ配列（Ａｍｐ’遺伝子および複製開始点）およびグルコース抑制性ＡＤＨ２プ ロモーターを含む酵母ＤＮＡ配列およびα因子分泌リーダーを用いて組立てるい る。酵母α因子リーダー（異種蛋白質の分泌を指示する）はプロモーターと発を 参照されたい。リーダー配列はその３′末端近くに、リーダー配列と外来遺伝子 との融合を容易にするための１つまたはそれ以上の有用な制限部位を含むように 修飾してもよい。 遺切な酵母形質転換プロトコールは当業者には知られている；例となる技術はア デニンおよび２０μｇ　／　ｍｌウランノルら成る選択培地中でＴ　ｒ　ｐ”形 質転換体を、０，６７％ＹＮＢおよびＳｈ＋＋ｍａｎ　ｒ＋　＋１．、酵母遺伝 学の方法のための実験コースマニュアル（Ｌａｂｏｐｘｔｏ４　Ｃｏｕ！＋＋　 Ｍａｎｕａｌ　：ｏｒＭｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｙｌ！ＩＩ　Ｇｅｎｅ＋ｉｃ＋）、 Ｃｏ１ｊ　Ｓｐ！ｉｎｇ　Ｈａ：ｈｕ　Ｌａｂｏ＋＋ｔｏ＋ｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｌｋ、１９８６に記■ されているようなアミノ酸および塩基を含む培地中でＵＲＡ、−！−形質転換体 を選択する。 ＡＤＨ２プロモーターを含むベクターにより形質転換された宿主株は８０μｇ／ ｍｌアデニンおよび８０μｇ／ｍｌウランルを補強した１％酵母抽出物、２％ペ プトンおよび１％または４％グルコースから成るリッチ培地中で発現のために増 殖されるであろう。ＡＤＨ２プロモーターの脱抑制は培地グルコースの枯渇によ り起こる。粗酵母上清液が濾過により採取され、更なる精製のために４℃に保た れた。 種々の哺乳類または昆虫細胞培養系もまた組換え蛋白質の発現に都合よく使用さ れる◇哺乳類細胞での組換え蛋白質の発現は特に好適であり、なぜならそのよう な蛋白質は一般に正しく折りたたまれ、適切に修飾され、および完全に機能的で あるからである。適した哺乳類宿主細胞株にサル腎臓細胞のＣＯ３−７株（Ｇｌ ｕ＋ｍ１ｕによりＣａ１ｌ　２３：　１７５．　１９８１に記載されている）お よび例えばＬ細胞、Ｃ１２７，３Ｔ３．　チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ ）細胞、ヒーラおよびＢＨＫ細胞株を含む適当なベクターを発現できる他の細胞 株が含まれる。哺乳類発現ベクターは複製開始点のような非転写要素、発現され るべき遺伝子に連結されている適したプロモーターおよびエンハンサ−１および 必要なリポソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアク セプタ一部位および転写終結配列のような他の５′または３′隣接非転写配列お よび５′または３′非翻訳配列を含んでいるであろう。昆虫細胞中での異種蛋白 質産出のためのバキ形質転換されるを椎動物細胞で使用される発現ベクター中の 転写および翻訳制御配列はウィルスを材料源として提供されるであろう。例えば 、通常使用されるプロモーターおよびエンハンサ−はポリオーマウィルス、アデ ノウィルス２、゛サルウィルス４０　（ＳＶ４０）およびヒトサイトメガロウィ ルスから誘導されている。ＳＶ４０ウィルスゲノムから誘導されるＤ　Ｎ　Ａ配 列、例えばＳＶ４０開始点、初期および後期プロモーター、エンハンサ−、スプ ライスおよびポリアデニル化部位は異種ＤＮＡ配列の発現に必要とされる他の遺 伝子要素の提供に使用されるであろう。初期および後期プロモーターは両方とも 容易にウィルスからＳＶ４０複製開始点を含む断片として得ることができるので （Ｆｉ＋ｒ＋　ｅｌ　ｘｌ、、　Ｎａｔａ＋ξ２７３：１１３、　１９７８’） 特に有用である。より小さなまたはより大きなＳＶ４０断片もまた使用され、Ｈ ｉｎｄ３部位からＢｇ１１部位が位置し、ウィルスの複製開始点が含まれている 約２５０ｂｐの配列が提供される。さらに、哺乳類ゲノムＬＩＦ−Ｒプロモータ ー、制御および／またはシグナル配列が利用され、そのような制御配列は選択さ れた宿主細胞と適合性がある。組換え哺乳類ＬＩＦ−Ｒを産出するための哺乳類 の高い発現ベクターの使用に関する詳細は下記実施例２に提供されている。模範 的なベクターはＯｋｚ７ａｗａおよびＢｅ！ｇ（ｉｉｏｌ、　ｃａｌｌ、　Ｂｉ ｏｌ、　３：　２ｇ０．　１９８３）により記載されているようにして構成でき る。 Ｃ１２７マウス哺乳類上皮細胞における安定で高いレベルでの哺乳類受容体ｃＤ ＮＡの発現に有用な系はＣｏ＋１ｎｘｎ　ＩＩ　１１．、［ｈｔ、Ｉｍｍｕｎｏ ｌ、　２３＋　９３５．　１９８６）に記載されているようにして実質的に構成 できる。 本発明の好適な観点において、ＬＩＦ−ＲｃＤＮＡを含む組換え発現ベクターは 宿主細胞ＤＮＡ内へ安定に組込まれている。ベクターＤ　Ｎ　Ａが増幅された細 胞株を選択することにより、高い濃度の発現生成物が達成される。ベクターＤ　 Ｎ　Ａの数が増加した細胞株は、例えば既知の薬剤で阻害される酵素をコードし ているＤＮＡ配列を含むベクターで宿主細胞を形質転換することにより選択され る。ベクターはまた所望の蛋白質をコードしているＤＮＡ配列を含んでいてもよ い。もしくは宿主細胞は所望の蛋白質をコードしているＤＮＡ配列を含む第２の ベクターで同時形質転換されてもよい。形質転換されたまたは同時形質転換され た宿主細胞は次に既知の薬剤濃度を高めて培養され、それにより薬剤耐性細胞を 選択する。そのような薬剤耐性細胞はしばしば酵素をコードしている遺伝子が増 幅される結果、薬剤により阻害される酵素を過剰生産することにより毒性薬剤の 高い濃度でも生存している。薬剤耐性が阻害可能酵素をコードしているベクタニ ＤＮＡのコピー数の増加により起こされる場合、宿主細胞のＤＮＡ中の所望の蛋 白質（例えばＬＩＦ−Ｒ）をフードしているベクターＤＮＡも付随して同時増幅 される。 そのような同時増幅のための好適な系では薬剤メトトレキセート（ＭＴＸ）によ り阻害できるジヒドロ葉酸レダクターセ（ＤＨＦＲ）のための遺伝子が使用され る。同時増幅を達成するには、ＤＨＦＲをコードする活性な遺伝子を持たない宿 主細胞は、ＤＨＦＲおよび所望の蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含むベクター で形質転換されるか、またはＤＨＦＲをコードするＤＮＡ配列を含むベクターお よび所望の蛋白質をコードしているＤＮＡ配列を含むベクターで同時形質転換さ れる。形質転換されたまたは同時形質転換された宿主細胞は高められた濃度のＭ ＴＸを含む培地中で培養され、生き残った細胞株が選択された。 特に好適な同時増幅系では、反応の進行にＡＴＰからＡＤＰおよびリン酸への加 水分解を利用するグルタミン酸およびアンモニアからのグルタミンの合成に関与 するグルタミン合成酵素（Ｇ　Ｓ）のための遺伝子が使用される。ＧＳは例えば メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）などの種々の阻害剤により阻害を受け易い 。 従って細胞をＧＳおよび所望の蛋白質のためのＤ　Ｎ　Ａ配列を含むベクターで 形質転換し、または、ＧＳをコードしているＤＮＡ配列を含むベクターおよび所 望の蛋白質をコードしているＤＮＡ配列を含むベクターで同時に形質転換させ、 高められた濃度のＭＳＸを含む培地中で宿主細胞を培養し、生存した細胞を選択 する同時増幅によりＬＩＦ−Ｒは高い濃度で発現できる。ＧＳ同時増幅系、適当 な組換え体発現ベクターおよび細胞株は以下のＰＣＴ出願に開示されている＋Ｗ Ｏ８７１０４４６２、ＷＯ３９１０１０３６、ＷＯ３９／１０４０４およびＷＯ ８６１０５８０７゜ 組換え蛋白質はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはもしくはＳＰ ２１０−Ａｇ１４またはＮ　Ｓ　Ｏようなマウス骨髄腫細胞株またはＹＢ２／３ ．０−Ａｇ２Ｏのようなラットを髄Ｍｍ胞株（ＷＯ８９／１０４０４およびＷＯ ３６１０５８０７に開示されている）のような哺乳票宿主細胞中ＤＨＦＲ−また はＧＳの同時増幅により好適に発現される。 ＬＩＦ−ＲＤＮＡの発現のために好適な真核生物ベクターは下記実施例１に記載 されている。ｐＤｃ３０３と称されるこのベクターは哺乳類高発現ベクターｐＤ ｃ２０１から誘導され、ＳＶ４０．ＣＭＶおよびアデノウィルスからの制御配列 を含んでいる。 組換えＬｒＦ−Ｈの精製 純粋な哺乳類ＬＩＦ−Ｒｓまたは類似体は適切な宿主／ベクター系を培養するこ とにより本発明のＤＮＡの組換え翻訳生成物を発現させ、それは続いて培養培地 または細胞抽出物から精製された。 例えば、培養培地内へ組換え可溶性ＬＩＦ−Ｒ蛋白質が分泌される系がらの上清 液は最初は市販品として入手可能な蛋白質濃縮フィルター（例えばＡｌｌ１ｉｃ ｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏ＋ｅ　Ｐｅ１ｌｉｃｏｎ限外濾過ユニツト）を用いて 濃縮される。濃縮工程に続いて、濃縮液は適当な精製マトリックスを応用できる 。例えば好適なアフィニティマトリックスはＬＩＦまたはレクチンまたは抗体分 子が適当な支持体へ結合されたものを含むことができる。もしくは、アニオン交 換樹脂、例えばジエチルアミノエチル（Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ）基が懸垂しているマト リックスまたは基質を用いることができる。マトリックスはアクリルアミド、ア ガロース、デキストラン、セルロースまたは蛋白質精製で通常使用される他の型 のものであろう。もしくはカオチン交換工程が使用できる。適したカオチン交換 物はスルポブロピルまたはカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリックス である。スルポブロビル基が好適である。 最後に例えば懸垂メチルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲルのような疎水性 逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ；ｌ媒体を用いる１回または それ以上のＲＰ−ＨＰＬＣ工程をＬｒＦ−Ｒ組成物のさらなる精製に使用するこ とができる。前記の精製工程のいくつかまたはすべてが種々に組合わされて、均 質な組換え蛋白質を得るために使用できる。 細菌培養物中に産出される組換え蛋白質は通常最初に細胞ペレットから抽出され 、続いての１回またはそれ以上の濃縮、脱塩、水性イオン交換またはサイズ排除 クロマトグラフィ一工程により精製される。最後に高速液体クロマトグラブイ− （）ＴＰＬＣ）が最終精製工程として使用できる。組換え哺乳類ＬＩＦ−Ｒの発 現に用いられた細菌細胞は、凍結−融解サイクル、超音波処理、機械的粉砕また は細胞溶菌剤を使用する常法により粉砕できる。 分泌蛋白質として可溶性哺乳類Ｌ［Ｆ−Ｒを発現する酵母の発酵は非常に精製工 程を藺略化する。大規模発酵により得られた分泌組換え蛋白質はＴｏｄｓｌ　ｅ ｔａｌ、、ｆｌ、Ｃｈ＋ｏｍａｔｏｇ、２９６：　１７１．　１９８＋＋により 記載されている方法と類似の方法により精製できる。この参照文献は分取ＨＰＬ Ｃカラムによる２回の連続した組換えヒトＧＭ−Ｃ５Ｆの精製のための逆相ＨＰ ＬＣ工程を記載している。 組換え培養において合成されたヒＩ−ＬＴＦ−Ｒは蛋白質を含む非ヒト細胞成分 の存在の量および培養物からヒトＬ、ＩＦ−Ｒを回収するために採られた精製工 程に依存した特性により確認される。これらの成分は普通酵母、原核生物または 非ヒト高等真核生物起源であろうし、好適には無害の夾雑量しか存在しない（重 量で約１％未満のオーダー）。さらに、組換え体細胞培養は、その起源の種にお いて天然に観察されるように（例えば細胞、細胞浸出液または体液中に）通常は ＬｒＦ−Ｈに伴われるであろう蛋白質を含まないＬＩＦ−Ｒの産生を可能にする 。 組換え体可溶性Ｌ［Ｆ−Ｈの治療的投与本発明は有効量の可溶性ＬＩＦ−Ｒ蛋白 質および適切な希釈剤および担体を含む治療組成物を用いる方法、および有効量 の可溶性ＬＩＦ−Ｒ蛋白質の投与を含むヒトにおけるＬＩＦ依存性生物応答の抑 制法を提供する。　□治療的使用には、精製された可溶性ＬＩＦ−Ｒ蛋白質が低 音（好適にはヒト）に徴候に適した方法で処置するために投与される。従って、 例えば可溶性ＬＩＦ−Ｒ蛋白質組成物はポーラス注射、連続的注入、インブラン トからの徐放性放出または他の適当な技術により投与できる。典型的には可溶性 Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒ治療薬は生理学的に受容可能な担体、賦形剤または希釈剤と組合 わされた精製蛋白質を含む組成物の形で投与されるであろう。そのような担体は 用いられる用量および濃度では受容者には無毒であろう。通常、そのような組成 物の調製には、緩衝剤、アスコルビン酸のような抗酸化剤、低分子量（約１０残 基未満）ポリペプチド、蛋白質、アミノ酸、グルコース、ショ糖またはデキスト リンを含む炭化水素、ＥＤＴＡのようなキレート剤１、グルタチオンおよび他の 安定剤および賦形剤とＬＩＦ−Ｈの混合が伴われる。同一種の血清アルブミンと 混合された中性緩衝化塩溶液または塩溶液が模範的な適当な希釈剤である。好適 には、生成物は希釈剤として適当な賦形剤溶液（例えばショ糖）を用いる凍結乾 燥物として処方される。 適した用量はテストにより決定できる。 ＬＴＦ−Ｒ蛋白質はＬＩＦに結合するので、可溶性ＬＩＦ−Ｒ蛋白質はＬＩＦへ の競合的結合に使用でき、そのため細胞表面ＬＩＦ−Ｒ蛋白質へのＬＩＦの結合 を阻害する。従って可溶性Ｌ　Ｉ　Ｆ−ＲはＬＩＦ依存性生物活性を阻害するこ とが期待される。例えば可溶性ＬｒＦ−Ｒは癌轡者におけるＬＩＦ誘発悪質液の 影響を防止するための治療またはアテロームおよび肥満症のようなリボ蛋白代謝 疾患の処置に有用であろう。可溶性Ｌ　Ｉ　Ｆ−Ｒはまた骨またはカルシウム代 謝の障害または肝細胞、神経細胞および白血球に付随するＬＩＦの過剰産生に伴 われる障害の処置にも有用である。ＬＩＦによる胚のおよび造血細胞幹細胞の制 御もまた可溶性Ｌ［Ｆ−、−Ｒで処置されるであろう。可溶性ＬＩＦ−Ｒはまた 増殖性のためＬＩＦに応答する白血病細胞の処置にも使用されるであろう。 ＬＩＦ−ＲまたはＬＩＦ−Ｒに対する抗体は異常なＬＩＦ−Ｈの存在により特徴 付けられる疾患の検出のための診断試薬としても有用である。 以下の実施例は例示のために提供されるものであり、本発明を制限するためのも のではない。 実施例 実施例１ ヒトＬＩＦ−ＲをコードしているｃＤＮＡの単離および発現ようにして、組換え ヒトＬＩＦが酵母中で発現され、均質にまで精製された。精製された蛋白質は市 販品として入手可能な＋ｍ＋ｙｖｏｂｅａｄ放射性ヨウ素化試薬（ＢｉＧＲａｄ ）を用いて放射標識された。この方法においては５０ｄの０．２Ｍリン酸ナトリ ウム、ｐＨ７，２中の１０ＨｇのｒＬｒＦが５０ｄのｕＢｍｏｂｅａｄ試薬、２ ０ｄの０．０５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７，０，中の２ｍＣｉのヨウ化ナトリ ウム、１０４の２．５％ｂ−Ｄ−グルコースと混合された。２５℃にて１０分後 、アジ化ナトリウム（５０１のものを２０４）およびメタ重亜硫酸ナトリウム（ ５■／ｍｌを１０ｍ）を添加し、２５℃で５分間インキュベーンタンを続けた。 反応混合物は２．５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　、０．２％ｔ ｖ／ｖ：＋アジ化ナトリウムおよび２０ｄへベスｐＨ７，４を含むＭａｘｗｅｌ ｌ　Ｐｕｋ　ＭｅｍｏｒｉａｌＩｎｉｔｉｔｕｔｓ　（ＲＰＭ　Ｉ）　３−６４ ０培地（結合培地）で平衡化した２ｍｌのベット容量のＳ＋ｐｈａｄｕ（Ｅ）Ｇ 　−２５（Ｓｉｇｍａ）でのゲル濾過により分画した。”［−ＬＩＦの最終的プ ールは結合培地中３×１叶８Ｍの作業用貯蔵溶液に希釈され、受容体結合活性を 損失することなく４℃で１ケ月まで貯蔵された。比活性は通常６−８×１１０１ ５ｃｐ／ミリモルＬＩＦの範囲である。 Ｂ、膜結合アッセイ ヒト胎盤膜を結合培地中の”＋−Ｌ＋ＦＳ０．１％バシトラシン、０．０２％ア プロチニンおよび０．４％ＢＳＡと総量て１．２ｍｌとし、４°Ｃて２時間イン キュベートした。１００倍モル過剰の非標識ＬｒＦをさらに含む対照チューブて 非特異的結合が決定された。反応混合物は次にマイクロフ７−ン中５分間遠心分 離を行った。上ａ液を捨て、膜ペレットの表面を水冷結合培地で注意深く洗浄し 、ガンマカウンターで放射活性を計数した。このアッセイを用いて、ＬＩＦ−Ｒ は胎盤膜上に存在したことおよび、胎盤膜蛋白質■当たり、９６フニトモルまで の１２５１−ＬＩＦか結合できたことが決定された。 Ｃ１胎盤ｃＤＮＡライブラリーの構成およびスクリーニング上記実施例ＩＡに記 載したようにして製造されたＬ２５■−標識ＬＩＦへの結合する能力に基づいた ＬＩＦ−Ｈの発現について種々のヒト細胞株および組織がスクリーニングされＬ ＩＦ−Ｒの組織源が選択された。長さの整っていないｃＤＮＡライブラリーがヒ ト胎盤組織からの全ＲＮＡ抽出物から単離されたポリアデニル化ｍ　ＲＮ　Ａの 逆転写により構成された（Ａｕ＋ｕｂｅ［ｃｌ　ａｌ、、＆ｉ　分子生物学にお ける現下のプロトコール１巻、１９８７）。細胞はグアニジニウムイソチオンア ネート溶液中での組繊細胞の溶解により採取し、全ＲＮ　Ａが５ｉａｎｉａｌｉ ＋、モレキュラークローニング：実験室マニュアル、　Ｃｏ１ｄ、Ｓｐｒｉｎｇ 　ｔｌｕｂｏ＋　Ｌｘｂｏ＋ａｔｏ＋７．　１９８２に記載されているような普 通の技術を用いて単離された。 ポリアデニル化ＲＮＡはオリゴｄＴセルロースクロマトグラフィーにより電離さ れ、二本鎖ｃＤＮＡはＧｕｂｌｅ＋および［Ｉｏ！ｆｍａｎ、　Ｇｓｎ＋　２５ 　：　２６３．　１９８３の方法と同様の方法により真説された。藺単に記すと 、ポリアデニル化ＲＮＡはオリゴｄＴをプライマーとして用いて逆転写酵素によ りＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドへ変換された。ＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッド は次にＤＮＡポリメラーゼＩと組合わされたＲＮＡ＋ｉｓ　Ｈを用いて二本鎖ｃ ＤＮＡへ変換された。得られた二本鎖ｃ　Ｄ　Ｎ　ＡはＴ４ＤＮＡポリメラーゼ で平滑末端化された。１ｉＢ（Ｉ＋＋ｌ＋、ｕ　ａｌ、。 Ｎｕｃｌ＋ｉｃ　Ａ＋ｉｄ＋　Ｒｕｅ＋＋＋ｈ　１４：８６１５．　１９８６に 記載されているごとく、得られた平滑末端化ｃＤＮＡの５′末端にＢｇ１ｍアダ プターが結合された。結合されなかったアダプターは６８℃のゲル濾過クロマト グラフィーにより除去するとｃＤＮＡ上に２４のヌクレオチドの非自己相補性オ ーバーハングが残る。同様の方法て哨乳類発現ヘクターｐＤｃ３０３　（ＡＴＣ Ｃ６８１０２）の５’Ｂｇｌ１１末端をｃＤＮＡに付加したものと相補的な２４ のヌクレオチドオーバーハングへ変換した。アダプターを付けたベクターおよび ｃＤＮＡを最適な比率でＴ４ポリヌクレオチドキナーゼの存在下結合させた。透 析した結合混合物は大腸菌株ＤＨ５ａ内へ電気穿孔で導入され形質転換体はアン ビンリンプレート上で選択された。 哺乳類細胞内へトランスフェクトされた場合その複数のクローニング部位で挿入 されたｃＤＮＡ配列を発現するように設計された真核生物発現ベクターｐＤＣ３ ０３内へ得られたｃＤＮＡを結合した。ｐＤｃ３０３はｐＤｃ２０１　（ｐＭＬ ＳＶの誘導体、Ｃｏｍｍｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３１２ニア６８． 　１９Ｈに記載されている）、５Ｖ４ＱおよびサイトメガロウィルスＤＮＡから 組立てられており、順に（１）複製開始点、エンハンサ−配列および初期および 後期プロモーターを含む座５１７１−２７０からのＳＶ４０配列；　（２〕プロ モーターおよびエンハンサ−領域を含むサイトメガロウィルス配列ＩＢｏ＋ｃｌ ＋＋：ｔ　ｔｌ　＋１．、　Ｃａ１ｌ　４１５２１．　１９８５により公表され ている配列のヌクレオチド６７１から〒６３）　；　（３）　３分節系リーダー （ＴＰＬ）の第１のエクソンのための配列を含む座５７７９−６０７９、ＴＰＬ の第２のエクソンおよび第３のエクソンの一部およびＸｈｏＩ、ＫｐｎＩ。 ＳｍａＩおよびＢｇｌＩのための部位を含む多クローニング部位（ＭＣＳ）を含 む座７１０１−７１７２および９６３４−９６９３からのアデノウィルス−２− 配列；　（４）ポリアデニル化および初期転写の終結信号を含む座４１２７−４ １００および２７７０−２５３３からのＳＶ４０配列、（５）ウィルス付随ＲＮ Ａ遺伝子ＶＡＩおよびＶＡ■を含む座１０５３２−１１１５６からのアデノウィ ルス配列、および（６）アンビンリン耐性遺伝子および複製開始点を含む座４３ ６３−２４８６および１０９４−３７５からのｐＢＲ３２２配列を含んでいる。 １岑られたｐＤｃ３０３中のヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーは大腸菌株ＤＨ５α の形質転換に使用され、組換え体は播種されプレート当り約２．４００のコロニ ーが提供され、スクリーン当り総計で約２４０，０００のコロニーを提供する十 分なプレートに播種された。コロニーは各々のプレートからがき取られ、プール され、各々のプールからプラスミドＤＮＡが調製された。プールされたＤＮＡは 次にサルＣＯ３−７細胞のザブコンフルエント層をトランスフェクトするのに使 用された。トランスフェクションのためＣ０９−７細胞は完全培地（１０％（１ ／マ）ウシ胎児血清（Ｆ　ＣＳ）　、５０　Ｕ／ｍｌのベニノリン、５０Ｕ／ｍ ｌのストレプトマイシン、２ｄのし一グルタミンを含むダルベツコ改良イーグル 培地（ＤＭＥＭ））中に維持されており、次に６つのウェルの皿（Ｆａｌｃｏｎ ）または単一ウェルチャンバートスライド（Ｌａｂ−Ｔｅｋ）に２Ｘ１０５細胞 ／ウエルの密度で播種することにより準備された。皿およびスライドは１ｍｌの ヒトフィブロネクチン（１０■／ｍ１ＰＢｓ）で３０分間前処理され、ＰＢＳで １回洗浄されている。 付着細胞層から培地を除き、１３４ｍＭクロロキン硫酸を含む１．５ｍｌの完全 培地で置換した。０，２ｍｌのＤＮＡ溶液（２８ｇＤＮＡ、０．５■／ａ＋Ｉ　 ＤＥＡＥ−デキストランがクロロキンを゛含む完全培地に溶解されている）を細 胞に加え５時間インキュベートした。インキュベーション後、培地を除去し、１ ０％ＤＭＳＯを溶液を新鮮な完全培地に置き換えた。細胞を培養液中で増殖させ 、挿入された配列の過渡的発現を可能にする。これらの条件で生き残ったＣＯ３ −７細胞は８０％の頻度でトランスフェクションを受けた。 ４８から７２時間後、トランスフェクトされたＣＯ３−７の単層は、以下のスラ イドオートラジオグラフィー技術を用いた放射性ヨウ素裸１ＩＬｒＦ（前記ｄよ うに調製された）の結合によりＬ［Ｆ結合蛋白質の発現をアッセイした。トラン スフェクトされたＣＯ５−７細胞は１回結合培地（２５■／ｍｌウシ血清アルブ ミン（ＢＳＡ）　、２ｕ／ｍｌアジ化ナトリウム、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７ ，２、および５０■／ｍｌ無脂肪乾燥ミルク（ＮＦＤＭ）を含むＲＰＭＩ培地１ ６４０）で洗浄し、１．２５Ｘ１０＝ＭＬ２５１−ＬＩＦを含む１ｍｌの結合培 地＋ＮＦＤＭと４℃で２時間インキュベートした。インキュベージコン後、チャ ンバートスライド中の細胞は非結合”ｒ−Ｌ［Ｆを除去するため、結合培地すＮ ＦＤＭで３回続いてＰＢＳ、ｐ）１７．３で２回洗浄された。細胞を１０％グル タルアルデヒドを含むＰＢＳ、ｐＨ７，３中、室温で３０分間インキュベートす ることにより固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、風乾した。スライドはＫｏｄａｋ　 ＮＴＢ−２写真用乳剤（水で５倍希釈）に浸し、暗所で光を通さない箱の中で１ ２時間から７日間４℃で暴露させる。スライドは次に約５分間Ｋｏｄａｋ　Ｄ１ ９現像液（４０ｇ１５００ｍｌ水）で現像し、水で洗浄し、ＡｇｆａＧ４３３Ｃ 固定液で固定した。 スライド個々に２５−４０倍の顕微鏡で検査し、ＬＩＦ−Ｒを発現している陽性 細胞は明るいバックグラウンドに対するオートラジオグラフの銀粒子の存在によ り固定された。 ６ウエルプレート中の細胞は１度結合緩衝液＝ＮＦＤＭで、続いて、ＰＢＳ。 ｐＨ７，３で３回洗浄して非結合Ｌ２５ｒ−ＬｒＦを除く。結合細胞は次にトリ プシン処理されてプレートから除かれ、結合”Ｉ−ＬＩＦはガンマカウンターで 計数した。 スライドオートラジオグラフィー法を用いて、１つのトランスフェクト体プール がＬＩＦ結合に明らかに陽性の多くの細胞を示すまで約２，４００ｃＤＮＡのプ ール中の約２４０，０ＯＯｃＤＮＡがスクリーンされた。このプールは次に６０ ０のプールに分割され、再びスライドオートラジオグラフィーによりスクリーン され陽性プールが同定された。このプールは更に６ｏのプールへ分割され、陽性 プールが同定されるまでスライドオートラジオグラフィーでスクリーンされた。 この６０のプールからの個々のコロニーは検出可能なＬＩＦ結合活性で表面蛋白 質の合成を指示する単一のクローン（クローン６５）が同定されるまでスクリー ンされた。このクローンは単離され、その挿入物が配列決定され、ヒトＬｒＦ− ＲｃＤＮＡクローン６５の配列が決定された。ヒトＬ［”−ＲｃＤＮＡクローン ６５を含むｐＤｃ３０３クローニングベクターは１９９０年１２月１１日、ｐＨ ＬｒＦＲ−６５の名前で４ｍｕｉｃｕ　ＴｙｐｌＣｕｌｔｕ＋ｓ　Ｃｏ１１ｅｃ ｔｉｏｎ。 Ｒｏｅｋｙｉ目ｅ、　ＶＤ、　ＵＳＡ　（ＡＴＣＣ）へ寄託され、ＡＴＣＣ寄託 番号６８４９１が割当て懸濁培養で増殖したＤＡ−１細胞との結合アッセイは本 質的にＰｕｋ　＋ｔ　ｉｆ、。 Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｂｅｍ、２６１＋４１７７１９８６およびＰｕｋ　ｅｌ１． 、　Ｐｒｏｃ　ｅｌ　！＋、、Ｐ＋ｏｃ、　Ｎｇｔｌ。 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　［ｌＳＡ　８４　：　５２６７、１９８）に記載されてい るフタレート油分離法（Ｄｏｗｅｒｅｔ　！＋、、１．　ｌｌｌｆｆ１ｕｎｏ１ ．　１３２：　７５１．　１９８４１により実施された。Ｌ２５ｒ−Ｌ［Ｆの非 特異的結合は２００倍またはそれ以上の過剰モルの非標識ＬＩＦの存在下で測定 された。３７℃でのＬ２５ｒ−ＬＩＦのインターナリセーシランを防止するため 、アジ化ナトリウム（０，２％）がすべての結合アッセイに含まれている。ＤＡ −１細胞ハｌ”　ｒ　−Ｌ　Ｉ　Ｆｌ：結合Ｌ、細胞表面ニ約７．　４　Ｘ　１ ０　”　Ｍ−’　ｆ）観相定数（Ｋａ）で約２００のＬＩＦ受容体が存在するこ とが決定された。 ＬＩＦ受容体発現プラスミドからのプラスミドＤＮＡはＬｕ＋ｈ＋ｕｎ　ｃｌ　 ａｔ、。 に続くクロロキン処理を用いるサルＣ０９−７細胞サブコンフル工ント層のトラ ンスフエクシヨンに使用された。細胞を続いて培養液中で３日間増殖させ、挿入 させた配列の過渡的発現を可能にする。３日後、Ｍｏ５ｌｅ７　ｅｔ　＋１．、 　Ｃｅ１ｌ　５９：３３５、　１９８９に本質的に記載されているごとく、細胞 単層の”Ｉ−ＬＩＦ結合についてのアッセイを行った。Ｌ２５１−Ｌ　Ｔ　Ｆの 非特異的結合は２００倍またはそれ以上の非標１！Ｌ［”の存在下で測定された 。Ｌ、１Ｆ−ＲｃＤＮＡクローン６５でトランスフェクトされたＣＯ８細胞への ”ｒ−ＬＩＦの最初の結合研究は高親和性結合（Ｋａ＞１ｘｌＯ’　Ｍ”）が明 らかであることがスキャッチャード分析後に示された。ｐＤｃ３０３対照ベクタ ートランスフニクト細胞はＣＯ５−７細胞にバックグラウンドの内在性ＬｒＦ受 容体の存在を示した。対照ベクタートランスフェクト細胞は１３０の高親和性Ｌ ＩＦ受容体（Ｋａ＝４．２Ｘ１０”Ｍ−’）−および低親和性（Ｋａ＝７．８ｘ １０８Ｍ−１）の２．４００の受容体を発現した。 Ｌ　ＩＦ−Ｒりａ−ン６５含有ｐＤＣ３０３でＣＯ５−７細胞をトランスフェク トし、トランスフェクトされた細胞を対照ｐ　Ｄ　Ｃ３０３ベクターですてにト ランスフェクトされている細胞で１：１０に希釈した。組換え体受容体発現はし ばしば非常に大きいのでリガンド−受容体親和性を正確に決定するためこの戦略 が利用される。これらの実験の結果はＬＩＦ−Ｒクローン６５でのトランスフェ クション後に両方の種類のＬ［Ｆ受容体が存在していたことを示した。ＬｒＦ− Ｒトランスフェクト体には約１７８の高親和性部位（Ｋａ＝１．．４Ｘ１０１１ Ｍ−１）および９，８００の低親和部位（Ｋａ＝１．１ｘｌＯ９Ｍ−１）が存在 した。 Ｅ、ＬｒＦ−Ｈの３５３−標識およびアフィニティ精製ｐＤｃ３０３またはヒト Ｌ［”−ＲｃＤＮＡクローン６５を含むｐＤｃ３０３でトランスフェクトされた ＣＯ３−７細胞が３５８−システィン／メチオニンで放射標識された。Ｍｏ＋ｌ Ｂ　ｅｌ　ｉｆ、、　（前記文献）により記載されているようにして放射標識細 胞の界面活性剤抽出物が調製された。製造元の指導書に従って組換えヒトＬＩＦ を臭化ンアン活性化Ｓ＋ｐｈａ＋ｏ＋ｅ　（Ｐｈａ「ｍａｃｉａｌまたはＨｙｄ ｒａ＋１Ｉｉｓ　Ａ！ｆｉｇｅｌ（Ｂｉｏｒｉｄ）へ結合させることによりＬＩ Ｆアフィニティ・マトリックスが調製された。約１９０，０００のＭｒの蛋白質 が両方のマトリックスでのアフィニティ精製およびＬ　Ｉ　Ｆ−Ｒクローン６５ ＣＯ３−７細胞溶菌物の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析後に検出されたが、対照ベクター トランスフェクションでは検出不可能であった。ＬＩＦ−Ｒクローン６５ｃＤＮ Ａからは分子量１１１，３７４が予測されるがたくさんのグリコジル化が起こる であろうのでこの大きさと観察された１９０．０００のＭｒの相違はうめられる 。更に、クローン６５ＬＩＦ−ＲはｃＤＮＡの３′末端に停止コドンを含んでい ないので翻訳は発現ベクター内の３アミノ酸で終結する。それ故１９０．０ＯＯ ＬＩＦ−Ｒ蛋白質の４０１ダルトンはこれらのベクター配列によりコードされて いる。 マウスＬＩＦ−ＲｃＤＮＡはマウス肝ｃＤＮＡから作られたライブラリー（Ｓ＋ ＋ｓｔｇｇｅｕ、Ｓ！ｎ　［ｌｉｅｇｏ、Ｃｉｔ＃９３５３Ｇ２）からヒトＬＩ Ｆ−Ｒプローブによ−る交差種ハイブリダイゼーションにより単離された。二本 鎖ヒトＬＩＦ−ＲプローブはヒトＬＩＦ−Ｒクローン６５のＢｇｌｌ［［断片の 切り出し、およびランダムプライマー（Ｂｏｅｈ＋ｉｎｇｕ４ａｎｎｈｅｉｍ） を用いるｃＤＮＡの３２ｐ標識により製造された。 ３５％ホルムアミド中、総計で約５ｘｔｏｓのプラークがヒトプローブでスクリ ーニングされた。マウスＬＩＦ−ＲｃＤＮＡクローン３が単離された。この特別 のクローンはＬＩＦ受容体の可溶性のものをコードしていた。コード領域はヒト ＬＩＦ−Ｒと重なる領域でアミノ酸レベルで約７０％の同一性（８０％類似性） およびヌクレオチドレベルで約７８％の同一性を持つＬＩＦ−Ｒをコードしてい る。 実施例３ 精製組換えＬｒＦ−Ｒ（例えばヒトＬＩＦ−Ｒ）または高レベルのＬＩＦ−Ｒを 発現しているトランスフェクトされたＣｏＳ細胞が、常法（例えば米国特許第４ ，４１１，９９３号に記載）を用いて、ＬＩＦ−Ｒのモノクローナル抗体の発生 に用いられた。そのような抗体はＬＩＦ−ＲへのＬＩＦの結合の妨害（例えばＬ ＩＦの毒性または他の望ましくない効果の改善）またはＬＩＦまたは可溶性ＬＩ Ｆ−Ｒの診断または研究上のアッセイの成分として有用であろう。 マウスを免疫化するため、ＬＩＦ−Ｒ免疫原は完全フロインドアジュバント中で 乳化され、１０−１００μｇの量Ｂａ１ｂ／ｃマウスに皮下で注射された。 １０から１２日後、免疫化された動物は不完全フロインドアジュバント中に乳化 した追加の免疫原でブーストされ、その後−週から二週の免疫化スケジュールで 周期的にブーストされた。周期的にドツトプロット分析（抗体サンドイッチ）ま たはＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着剤アッセイ）で試験するため眼窩後方出血ま たは尾先端切除により血清試料を採取する。他のアッセイ法もまた適している。 適当な抗体力価が検出されたら、陽性動物に抗原の塩溶液を静脈内へ注射する。 ３から４日後動物を殺し、牌細胞を採り、マウス骨髄腫細胞株ＮＳＩと融合させ る。この方法で生じるハイブリドーマ細胞株は多ミクロタイタープレート中のＨ ＡＴ選択培地（ヒボキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）に加え、非融 合細胞、骨髄腫細胞ハイブリッドおよび牌臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害“す る。 このようにして生じたハイブリドーマクローンはＬＴＦ−Ｒとの反応性をＥＬＩ ＳＡによりスクリーニングできる（例えば、Ｅｎｇｍｌ　ｅｔ　ｚｌ、、ｌｉｍ ｕｎｏｃｈ＋ｔ　８−８７１　（１９７１）および米国特許第４．７０３．００ ４号により記載されている技術を応用して）。次に陽性クローンを同系のＢａ１ ｂ／ｃマウスの腹腔に注射して高濃度（〉１■／ｍｌ）の抗Ｌｌｌ−Ｒモノクロ ーナル抗体を含む腹水を産生させる。得られるモノクローナル抗体は硫酸アンモ ニア沈殿、続いてゲル排除クロマトグラフィーおよび／または黄色ブドウ球菌の プロティンＡへの抗体の結合に基づいたアフィニティクロマトグラフィーにより 精製できる。 配　列　表 （１）一般情報 （１）　出願人　（Ｇｅａ＋ｉａｇ、　Ｄｔｖｉｄ　Ｐ、）（Ｂｅｃｋ＋ｏｎ、 　Ｍ、　Ｐ、） （１、発明の名称　白血病抑制因子受容体（ｉｉｉ）配列の数　、４ （１ｖ）連絡住所　： （Ａ　）受信人　：　１ｍｍｕｎｅｘ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂ）ストリー ト　５１　Ｕｎｉｖ＋＋５ｉｔｙ　５ｔｒｅｅｔ（Ｃ）市　：　Ｓ＋ａｔｔｌｅ （Ｄ）州　：ＷＡ （Ｅ）国　ＵＳＡ （Ｆ）ジップコード＋９８１０１ （マ）コンピューター読み取り可能形 （Ａ）　中型　・フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター＋ＩＢＭＰＣコンｌく−ティプル（Ｃ）操作システム：　 ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）シフトウエア：Ｐａｔｅｎｔｌｎ　リリース ＃１．　２４（７１）現行出願データ： （Ａ、）出願番号 （Ｂ）出願日　： （Ｃ）分類　： （ｖｉｉｉｌ弁護士／代理人情報： （Ａ）名前　：　（ｆｉｇｈｔ、Ｃｈｒｉ＋ｔｏｐｈｕ　Ｌ、）（Ｂ）登録番号 　・３１．６８０ （Ｃ）参照／摘要録番号＋２６０６−Ａ（１り電話通信情報。 （Ａ）電話　：　２０６−５８７−０４３０（Ｂ）ファックス：２０６−５８７ −０６０６（２）配列番号第１番の情報 （１）配列特性 （Ａ）配列の長さ　３１８２塩基対 （Ｂ）配列の型　核酸 （Ｃ）鎖の数　、一本鎖 （Ｄ）トポロジー　１！鎖状 １′口）分子の型　ｃＤＮＡからｍＲＮＡ（ｉｉｉ１仮定　Ｎ ｆｒ　ｖ＋アンチセンス二Ｎ ：′マ）断片型　Ｎ−末端 （ｖｉ）起源 （Ｆ）組織型：胎盤 ζｖ１１）直接の起源。 （Ｂ）クローン：ｈｕｌｉｆｒ、６５ を目）特色 （Ａ）名称／検索　ＣＤ５ （Ｂ）位置　・１７９．．３１８２ （Ｄ）その他の情報： （Ｂ）位置　・３１１．．３１７９ （Ｃ）その他の情報 （ｉ　１ｌ特色 （Ａ）名称／検索　ｓｉｇ−ペプチド （Ｂ）位置　１７９．．３１０ （Ｄ）その他の情報。 ′１１）配列の記述・配列番号　第１番：ＡＧ＾ＧＣＴＴＧＧＡ　ＡＣＧＡＧＡ ＣＧ、八ＣＣＴＧＣ丁ＣＴＣＴＣＴＣＣＣ入ＧＡＡＣＧ　ＴＧＴＣＴＣＴＧＣＴ 　ＧＣＡＡＧＧＣＡＣb６０ ＧＧＧＣＣＣＴＴＴＣＧＣＴＣ丁ＧＣＡＧＡ　入ＣＴＧＣＡＣＴ丁Ｇ　ＣＡＡＧ ＡＣＣＡ丁Ｔ　ＡＴＣＡＡＣＴＣＣＴ　ＡへＴＣＣＣＡＧＣs　１２０ ＣＡＧＡＡＡＩ：ＧＧＡ　ＧＣＣＴＣＴＧＣＧＡ　ＣＴＣＡＴＴＣＡＴＣＧＣＣ ＣＴＣＣＡＧＧ　ＡＣＴＧＡＣτＧＣＡ　ＴＴＧＣＡＣＡＧ@ｌフ８ ＾ＴＧ　ＡＴＧ　ＧＡＴ　ＡＴＴ　ＴＡＣＧＴＡ　ＴＧＴ　ＴＴＧ　ＡＡＡ　Ｃ ＧＡ　ＣＣＡ　ＴＣＣＴＧＧ　ＡＴＧ’ＧＴＧ　ＧＡＣ２２U ｉ１ｅｊ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　ｌｉｅ　Ｔｙ＋　Ｙｔｌ　Ｃｙ＋　Ｌｅｗ　ＬＦｓ 　ＡｔＨＰｒｏ　Ｓｅｔ　Ｔａｐ　Ｍｅｔ　Ｙｉｌ＾凰−ＡＡＴ　ＡＡＡ　ＡＧ Ａ　ＡＴＧ　ＡＧＧ　ＡＣＴ　ＧＣＴ　ＴＣＡ　ＡＡＴ　ＴＴＣＣＡＧ　ＴＧＧ 　ＣＴＧ　ＴＴＡ　ＴＣＡ　ＡＣＡ　Q７４ ＾＄！　ＬＦＩ　ＡｔＨ１ｌｅｌ　ＡｔＨＴｋｔ　Ａｆｔ　Ｓｅｔ　Ａｎ　Ｐｈ ｅ　Ｇｌｗ　Ｔｒｐ　ＬＩＬｅｌＳｕ　Ｔｋｔ−２５〜２０　−１５ ７７丁　ＡＴＴ　ＣＴＴ　ＣＴＡ　ＴＡＴ　ＣＴＡ　ＡＩＯＡＡＴ　ＣＡＡ　Ｇ ＴＡ　ＡＡＴ　ＡＧＣＣＡＧ　ＡＡＡ　ＡＡＧ　ＧＧＧ　３Q２ Ｐｂｅ　ＩＬｅ　Ｌｅｇ　Ｌｅｔ　Ｔｙ＋　Ｌｅｌ　Ａｌｌ　Ａｌｌ　ＧＩ量　 Ｖａｌ　Ａｎ　Ｓｅｔ　Ｇｌａ　Ｌｙｓ　ＬＦＩ　ＧＩＦＧＣＴ　ＣＣＴ　ＣＡ Ｔ　ＧＡＴ　ＴＴＧ　ＡＡＧ　ＴＧＴ　ＧＴＡ　ＡＣＴ　ＡＡＣＡＡＴ　ＴＴＧ 　ＣＡＡ　ＧＴＧ　ＴＧＧ　ＡＡＣ３V０ ＴＧＴ　ＴＣＴ　ＴＧＧ＾＾＾ＧＣＡ　ＣＣＣＴＣＴ　ＧＧＡ　ＡＣＡ　ＧＧＣ ＣＧＴ　ＧＧＴ　ＡＣＴ　ＧＡＴＴＡＴ　ＧＡＡ　４１８Ｃ７ｓ　Ｓｅｒ　Ｔｒ ｐ　Ｌｙｓ＾Ｉｓ　Ｐｒｏ　Ｓｓｒ　ＧＩ７　Ｔｋｔ　Ｇ１２＾ｔＨＧ１７　Ｔ ｋｔ　Ａｓｐ　ＴＦＩ　Ｇ１ｍＧＴＴ　ＴＧＣＡＴＴ　ＧＡＡ　ＡＡＣＡＧＧ　 ＴＣＣＣＧＴ　ＴＣＴ　ＴＧＴ　ＴＡＴ　ＣＡＧ　ＴＴＧ　ＧＡＧ　ＡＡＡ　Ａ ＣＣ４６６Ｖａｌ　Ｃ７ｓ　Ｉｔｓ　Ｇ１ｗ＾■＾ＨＳｅｒ＾ｔＨＳｅｔ　Ｃ７ ＋　Ｔ２ｔ　Ｇｌｓ　Ｌｅｗ、Ｇｌｗ　Ｌ７ｓ　Ｔｋ＋＾ＧＴ　ＡＴＴ　ＡＡＡ 　ＡＭ　ＣＣＡ　ＧＣＴ　ＣＴＴ　ＴＣＡ　ＣＡＴ　ＧＧＴ　ＧＡＴ　ＴＡＴ　 ＧＡＡ　ＡＴＡ　ＡＣＡ　ＡＴＡ　T１４ Ｓｇｔ　［ｌｅ　ＬＦＩ　Ｉｊｅ　Ｐｒｅ　Ａｆｔ　Ｌｅｇ　Ｓｅｒ　［！ｉ＋ 　ＧＩ２　Ａｓｐ　Ｔｙ＋　Ｇｌｗ　Ｉｌｅ　Ｔｌｕ　ｌ１■ ＡＡＴ　丁ＣＴ　ＣＴＡ　ＣＡＴ　ＧＡＴ　ＴＴＴ　ＣＧＡ　ＡＣＴ　ＴＣＴ　 ＡＣＡ　ＡＧＴ　ＡＡＡ　ＴＴＣＡＣＡ　ＣＴＡ　ＡＡＴ　T６２ Ａｕ　Ｓｅｔ　Ｌａｗ　Ｈｉｓ　Ａｉｐ　Ｐｈｅ　Ｇ１７　Ｓｅｒ　Ｓｅｔ　Ｔ ｋｔ　Ｓｅｒ　Ｌｙｔ　Ｐｂｅ　Ｔｋｔ　Ｌｅｔ　Ａｎ７０　７５　Ｂ ＧＡＡ　ＣＡＡ　ＡＡＣＧＴＴ　ＴＣＣＴＴＡ　ＡＴＴ　ＣＣＡ　ＧＡＴ　ＡＣ Ｔ　ＣＣＡ　ＧＡＧ　ＡＴＣＴＴＧ、　ＡＡＴ　ＴＴＧ　６P０ Ｇ１ｗ　Ｇ１１ｌ　ＡＩＯＶｓｌ　Ｓｅ「Ｌ＠ｍ　ＩＩｓ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｔ ｋｔ　Ｐｒｅ　Ｇ１ｗ山ＬＨＡｌｌ　ＬｕＡｓ　９０　９５　１００ ＴＣＴ　ＧＣＴ　ＧＡＴ　ＴＴＣｒｃＡ　ＡＣＣＴＣＴ　ＡＣＡ　ＴＴＡ　ＴＡ ＣＣＴＡ　ＡＡＧ　ＴＧＧ　ＡＡＣＧＡＣＡＧＧ　６５ｇ５ｅｔＡＩ＠Ａ１ｐ　 Ｐｋ！Ｓｅｔ　Ｔｈｅ　Ｓｔｒ　Ｔｂｒ　ＬｌＴｉｔ　Ｌｕ　ＬＦＩ　Ｔｒｐ　 ＡｌＡｇｐ　Ａｔ１Ｇ１７　Ｓｏｒ　ＴｔＩ　Ｐｂｅ　Ｐｎ　Ｉｌｉ＋＾ｒ１５ ｅｔ＾ｓｓ　Ｗｔｌ　ｌｉｔ　Ｔｔｐ　Ｇｌｗ　Ｉｌ＠Ｌ２ｔマ麿１ＣＴＡ　Ｃ ＧＴ　ＡＡＡ　ＧＡＧ　ＡＧτ＾ＴＧ　ＧＡＧ　ＣＴＣＧＴＡ　ＡＡＡ　ＴＴＡ 　ＧＴＧ　ＡＣＣＣＡＣＡＡＣＡＣＡ　７５４−　Ｌｓｗ　ＡｒＴ　ＬＦＩ　Ｇ ｌｌ　Ｓｔｔ　ｌｉｔ　Ｇｌａ　ＬＦＩ　Ｖｔｌ　Ｌｙｓ　ＬＦＩ　Ｖｓｌ　丁 ｂｒ　Ｈｉｓ　Ａｓａ　Ｔ汲■ ＾ＣＴ　ＣＴＧ　ＡＡＴ　ＧＧＣＡＡＡ　ＧＡＴ　ＡＣＡ　ＣＴＴ　ＣＡＴ　Ｃ ＡＣＴＧＧ　ＡＧＴ　ＴＧＧ　ＧＣＣＴＣＡ　ＧＡＴ　Ｈ２Ｔｉｅｒ　Ｌｔｗ　 Ａｔａ　ＧＩＦ　＋４１　ＡＩｐ　Ｔｂｔ　Ｌｓｗ　８ｉｔ　ｆｌｉｓ　Ｔｒｅ 　Ｓ＠＋　丁ｒｐ　Ａｌｓ　Ｓｅｔ　Ａ狽■ ＡＴＧ　ＣＣＣＴＴＧ　ＧＡＡ　ＴＧＴ　ＧＣＣＡｒＴ　ＣＡＴ　ＴＴＴ　ＧＴ Ｇ　ＧＡＡ　ＡＴＴ　ＡＧＡ　ＴＧＣＴＡＣＡＴＴ　８５０ＴｔＩ　Ｐｒｏ　Ｌ ｓｔ　Ｇｌｗ　ＣＦＩＡｌｓ　ｌｉｔ　ｔｌｉｓ　Ｐｋｅ　Ｍｅｌ　Ｇｌｗ　ｆ ｉｒ　ＡｔＨＣ７ｔ　Ｔｌｔ　１ｉｅＧＡＣＡＡＴ　ＣＴＴ　ＣＡＴ　ＴＴＴ　 ＴＣＴ　ＧＧＴ　ＣＴＣＧＡＡ　ＧＡＧ　ＴＧＧ　ＡＧＴ　ＧＡＣＴＧＧ　ＡＧ ＣＣＣＴ　８９８＾■　Ａｓａ　Ｌｓ−旧Ｉ　Ｐｋｓ　Ｓｅ「　ＧＩＹ　Ｌｕ　 Ｇｌｓ　Ｇｌｗ　ＴｔＩ　Ｓ、＊ｔ　Ａｓｐ　Ｔｔｐ　Ｓｕ　Ｐｒ。 １８５　１９０　、１９５ ＧＴＧ　ＡＡＧ　ＡＡＣＡＴＴ　ＴＣＴ　ＴＧＧ　ＡＴＡ　ＣＣＴ　ＧＡＴ　Ｔ ＣＴ　ＣＡＧ　ＡＣＴ　ＡＡＧ　ＧＴＴ　ＴＴＴ　ＣＣＴ　X４６ Ｖ＊Ｉ　ＬＦＩ　Ａｓａ　ＩＩｓ　Ｓｅｔ　Ｔａｐ　Ｉｔｓ　Ｐｔｏ　Ａｓｐ　 Ｓｓｒ　Ｇｌｗ　Ｔｋｔ　Ｌｌｌマ＊Ｉ　Ｐｋｓ　Ｐｔｏ　| ２００！Ｏ５２１０ ＣＡＡ　ＣＡＴ　ＡＡＡ　ＧＴＧ　ＡＴＡ　ＣｒＴ　ＧＴＡ　ＧＧＣＴＣＡ　Ｇ ＡＣＡＴＡ　ＡＣＡ　ＴＴＴ　ＴＧＴ　ＴＧＴ　ＧＴＧ　、@９９４ Ｇｌａ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｖ畠Ｉ　ＩＩｓ　Ｌｅｔ　Ｖｌｌ　ＧＩＦ　Ｓｔｔ　 Ａｓｐ　ＩＩｓ　Ｔｂｔ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　ＣＦＳ　Ｖｌ１ＡＧＴ　ＣＡＡ　Ｇ ＡＡ　ＡＡＡ　ＧＴＧ　ＴＴＡ　ＴＣＡ　ＧＣＡ　ＣＴＧ　ＡＴＴ　ＧＧＣＣＡ Ｔ　ＡＣＡ　ＡＡＣＴＧＣＣＣＣ１０４Q Ｓｓ＋　Ｇｌａ　Ｇｌｗ　Ｌ７ｓ　Ｍｅｌ　１４１　Ｓｉｒ　Ａｌｓ　Ｌｅｗ　 Ｉｌｅ　ＧＩＦ　［Ｉｉｓτｈ「Ａｓａ　ＣＬＩ　Ｐｒ。 ２３０　２３５　２４Ｇ τＴＧ　ＡＴＣＣＡＴ　ＣＴＴ　ＧＡＴ　ＧＧＧ　ＧＡ＾＾＾τＧＴＴ　ＧＣＡ 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Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．哺乳類ＬＩＦ受容体（ＬＩＦ−Ｒ）をコードしている単離されたＤＮＡ配列 。
2. ２．ヒトＬＩＦ−Ｒをコードする請求項１に記載の単離されたＤＮＡ配列。
3. ３．（ａ）生物学的に活性なＬＩＦ−Ｒ蛋白質をコードしており、天然哺乳類Ｌ ＩＦ−Ｒ遺伝子のコード傾城から誘導されたヌクレオチド配列を持つｃＤＮＡク ローン； （ｂ）生物学的に活性なＬＩＦ−Ｒ蛋白質をコードしており、中程度のストリン ジェント条件下で（ａ）のクローンヘのハイブリダイゼーションができるＤＮＡ 配列； （ｃ）生物学的に活性なＬＩＦ−Ｒ蛋白質をコードしており、（ａ）および（ｂ ）で定義されたＤＮＡ配列に対する遺伝コードの結果として縮退物であるＤＮＡ 配列 からなる群より選択される請求項１に記載の単離されたＤＮＡ配列。
4. ４．可溶性ＬＩＦ−Ｒをコードしている請求項１に記載の単離されたＤＮＡ配列 。
5. ５．ｐＨＬＩＦＲ−６５（ＡＴＣＣ６８４９１）により発現されるＬＩＦ−Ｒポ リペブチドをコードしている請求項１に記載の単離されたＤＮＡ配列。
6. ６．請求項１〜５のいずれかの１項に記載のＤＮＡ配列を含む組換え発現ベクタ ー。
7. ７．前記ＤＮＡ配列によりコードされているＬＩＦ−Ｒの発現を促進する条件下 、請求項６に記載のベクターを含んでいる適当な宿主細胞を培養することからな る哺乳類ＬＩＦ受容体（ＬＩＦ−Ｒ）またはその類似体の製造方法。
8. ８．単離および精製された生物学的に活性な哺乳類ＬＩＦ受容体（ＬＩＦ−Ｒ） 蛋白質。
9. ９．本質的にヒトＬＩＦ−Ｒからなる請求項８に記載の単離および精製されたＬ ｌＦ−Ｒ蛋白質。
10. １０．本質的に可溶性ＬＩＦを含む、単離および精製された請求項８に記載のＬ ＩＦ−Ｒ蛋白質。
11. １１．請求項８に記載の有効量の哺乳類ＬＩＦ受容体（ＬＩＦ−Ｒ）蛋白質、お よび適当な希釈剤または担体を含む、ＬＩＦ−依存性生物的応答を制御するため の組成物。
12. １２．請求項８に記載の蛋白質を使用することからなるＬＩＦまたはＬＩＦ−Ｒ 分子またはその相互反応の検出方法。
13. １３．哺乳類ＬＩＦ−受容体と免疫反応性である抗体。