JPH06504672A - 乳頭腫ウイルスｈｐｖ３９のゲノムから誘導されるｄｎａ配列、ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断及び免疫原組成物の生成への前記配列の応用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 乳頭腫ウィルス１ｌＰＶ３９のゲノムから誘導されるＤＮＡ配列、ＩＮＶＩＴＲ Ｏ診断及び免疫原組成物の生成への前記配列の応用本発明は、乳頭腫ウィルスＨ ＰＶ３９のゲノムから誘導される所定のＤＮＡ配列（ゲノム全体に相当する配列 を含む）及び組換えＤＮＡ、特に前記ＤＮＡ配列を含んでいるベクターに関する 。本発明は更に、１ＩＰＶ３９のゲノムから誘導される対応配列を対応タンパク 質の形態で発現することのできる条件下において前記組換えＤＮＡで形質転換し た培養細胞に関する。本発明は最後に、これらの培養細胞から得られるようなそ れ自体か精製されているタンパク質に関する。最後に、本発明はこのようなタン パク質又はタンパク質の断片を含んでいる免疫原組成物の生成に関する。

引き続き、以下のような添付図面を参照して説明を行う。

図１：ｍＲＮ八と類似する）ｌＰＶ３９のＤＮＡストランドのヌクレオチド配列 。１（ＰＶ１６，１８とのアラインメントによって環状ゲノム上の１位企決定し た。

図２１　ＨＰＶ３９の２つのＤＮＡストランドの３つの読取り枠内での開始コド ン（上流の棒）及び終結コドン（下流の棒）の分布。（ａ　）　ｍＲＮ八と類似 するストランド。（ｂ）相補的なストランド。他の型のＨＰ■と比較して（ａ） 内のＯＲＦ　（読取り枠）を同定した。番号付は図１の番号付と一致している。

図３・非コード領域の主要特性。ＮＣＲの次の配列単位をヌクレオチド７１５８ がらヌクレオチド１０６まで示す。　は乳頭腫ウィルスの１２ｂｐ特異パリンド ロームを示す（第２及び第３の単位は縮退している）。　はポリアデニル化部位 を示す。　はＴＡＴ＾ボックスを示す。　は推定されるプロモーター要素を示す 。　はグルココルチコイド応答要素を示す。　は核（ｎｏｙａｕ　）のエンハン サ−（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｒｉｃｅ）配列を示す。　は核因子（ｆａｃｔｅｕ ｒ　ｎｕｃ１６ａｉｒｅ）■の考えられる結合部位を示す。　は活性化タンパク 質１の推定される結合部位を示す、は乳頭腫ウィルスのエンハンサ−に関係する 因子の結合部位を示す。

図４　：ＨＰＶ３９の考えられるグルココルチコイド応答要素（ＧＲＥ）　ト、 ＨＰＶ１６，１８ノＧＲＥ及びＧＲＥ／ＰＲＥ：ｙ　’ｙ　セフ　サス配列との 比較。コンセンサス配列と同一のヌクレオチドには下線を引く。

本発明は、ＨＰＶ３９内に存在する特定配列、即ち１ＩＰＶ３９を独創的なもの とし且つＨＰＶ３９型乳頭腫ウィルスの特に精密な検出を可能とする配列の発見 に基づいている。これらの配列又はこれらの配列の断片を、特に高感度のハイブ リッド形成用プローブ、とりわけＰＣＲ法による分析を可能とするプライマーの 構成のために使用できる。これらの配列又は配列断片について説明する前に、従 来技術の状態について簡単に説明し、それからＨＰＶ３９ゲノムについて詳しく 説明する。

６０種又はそれ以上の異なるヒト乳頭腫ウィルスの中で、生殖器の癌及び腫瘍に 関与するものが幾つかある（１）。

子宮頸管癌、外陰症又は陰茎癌の生検の５０％及び２０％でＩＩＰＶ１６及びＨ ＰＶ１８のＤＮＡが検出された（２．３）　、このような病巣ではＨＰＶ３１， ３３，３５，３９．４５はそれほど検出されなかった（１゜４）。）ＨＰＶ６の ＤＮＡを厳密度（ストリンジェント）の小さい条件下でハイブリッド形成用プロ ーブとして使用して、ＨＰＶ３９をまず、エビソーム形態のウィルスＤＮＡを含 んでいる過形成陰茎丘疹の生検試料からクローン化した。これに対してウィルス ＤＮＡは、浸潤性癌の細胞ゲノム内部に組み込まれていた（５）。１（ＰＶに怒 染した患者３６５人について実施した最近の調査では、組織試料の３．９％でＨ ＰＶ３９のＤＮＡが検出された。

ｉｎ’ｖｉＬｒｏウィルス増殖用組織培養系がないために、ＨＰＶの生物学研究 は足伽をはめられていた。若干数の乳頭腫ウィルスゲノムの配列分析（２，３， ６−１４）は、ゲノムの遺伝的体制及び調節の理解、個体遺伝子の発現、抗血清 の生成並びに多数の型のＨＰＶの中での系統骨頭関係の評価のための基礎を構成 していた。

ＨＰＶ３９のゲノムの完全なヌクレオチド配列を決定した。

単一のＥｃｏＲ１部位及び２つのＢａｍＨ１部位を使用して、オリジナルクロー ンから単離した１ｌＰＶ３９のＤＮＡ（５）をｐＵｃ１８内で同様寸法の３つの 断片にサブクローン化した。Ｈｅｎ１ｋｏｆｆの手順（１５）に従ってエキソヌ クレアーゼＩＩＩを用いて一連の検出を行い、ＤＮＡ鎖の配列決定に適したクロ ーンを産生じた。第１の鎖と相補的な合成オリゴヌクレオチドをプライマーとし て使用して第２の鎖の配列を決定した。Ｓａｎｇｅｒ等のジデオキシチェインタ ーミネーション法（１６，１７）を使用して、２本鎖プラスミドの配列を決定し た。

ＨＰＶ３９ノＤＮ八？、ｔ　７８３３ノ塩基対（ｂｐ）を含み（図１　）　、４ ０％のＧ／Ｃ含量を有する。ＤＮＡの消化によって配列の制限地図を確認した。

制限地図は、Ｈｉｎｃｌｌｌ追加部位、Ｐｖｕｌｌ追加部位及び４つの＾ｖａｌ ｌ追加部位を除いて、Ｂｅａｕｃｌｅｎｏｎ等によって発表された制限地図（５ ）と一致している。（３５９２位の）＾ａｖ１１部位は、Ｅ、ｃｏｌｉのｄｃｍ メチラーゼの認識配列と重なり合っているためにＥ、ｃｏｌｉ内でのクローニン グの後に耐開裂性を有する。

！（ＰＶ３９は、今日までに配列決定された全てのＩ（ＰＶで保存されている読 取り枠（ＯＲＦ　）全体を有する（図２ａ、表１）。

早期であると推定されたタンパク質及びカプシドの成分をコードするＯＲＦは同 一のＤＮＡストランド上で位置付ける。これらのＯＲＦは７８２の塩基対（ｂｐ ）の非コード領域（ＮＣＲ）によって分離されている。１ＩＰＶ１６，３１．３ ３について先に説明したように（２，４，１２）　、ＨＰＶ３９が他の生殖器乳 頭腫ウィルスと共有するゲノム特性は、ＯＲＦのＥｌとＥｌ、Ｌ２とＬｌとが重 なり合い、Ｅ２内にＥ４が封入され、Ｅｌのすぐ上流にＥｌが位置付けられ（３ ）　、Ｅ４内にΔＴＧ開始コドンが存在しないことである。

今日までに配列決定された全てのゲノムの相補的なりＮ＾ストランドは、寸法が ０６〜０．８ｋｂを越えるＯＲＦを含んでいない。このようなＯＲＦの機能的な 意味は、検出可能調節配列が存在しないことによって否定された。更には、ＯＲ Ｆが、ＲＰＶによって形質転換されたか又はＢＰＶに冒された細胞内で転写され ることは実証できなかった（　７，９，１８．１９　）。今日１゜３ｋｂの大き いＯＲＦを、ΔＴＧコドンと５°末端に近いスプライシング潜在受容部位（にＣ ＴＧＣＴＡＣＡＧＣ、ヌクレオチド１８７１−１８６１　）とを含んでいるＢＰ Ｖ３９のこのＩＩＮ＾ストランド（ヌクレオチド２０５０−７７６　）上で検出 したく図２ｂ）。同じＤＮＡストランドの更に上流では、小さいＯＲＦ　（ヌク レオチド４２０４−３８７５　）の前に２３ｂｐｌ！れたＴＡＴ＾配列（ヌクレ オチド４２２７　）と、核因子■用結合部位（ヌクレオチド４２７１　）とが存 在する（２０．２１）。

１．３ｋｂのＯＲＦの３°末端では、＾＾ＴＡＡＡポリアデニル化信号（ヌクレ オチド４１１）が−次転写生成物の成熟のために機能し得る（２２）。他の実験 によって、このＯＲＦがｉｎ　ｖｉｖｏ転写されるかどうかを確認できねばなら ない。

ＨＰＶ３９非コード領域を、乳頭腫ウィルスのへＣＣＧＮＮＮＮＣＧＣＴ特異パ リンドローム（ヌクレオチド４３，５９，７４５６，７６２５．７７９８）の３ 種の完全な変形及び２種の退化した変形並びにＥ２依存性エンハンサ−によって ３つのセグメントに分割する（２３゜２４）。これらのセグメントは、ＢＰＶ１ ６，１８．３３のゲノム内の同様寸法の部分に相当する（３）。非コード領域に は２つのＴＡＴ＾ボックス配列がある。その一方は、ＯＲＦ　Ｅ６の上流に位置 付けられている。このＯＲＦ　Ｅ６は恐ら＜、１２ｂｐパリンドロームのタンデ ムに繰り返される配列の上流に置かれた＾＾＾ＧＧＧＡＧＴ＾保存プロモーター との会合によって、プロモーターＥ６の一部分及び他の早期遺伝子を構成する（ 　２５−２７　）。

遅いウィルス転写生成物について推定されるポリアデニル化部位を、終結コドン Ｌ１から約１００塩基対だけ下流に位置する場所に位置付ける。ＯＲＦ　Ｅ５の 下流に位置する他の要素ＡＡＴＡＡＡは、早期転写生成物のためのポリアデニル 化信号として機能し得る（１８）。

予め配列決定された生殖器ＨＰＶの長い制御領域は、多数の転写因子のための結 合部位を含み、またＢＰＶ６，１１，１６．１８のための細胞型特異エンハンサ −として機能するものとして示されていた（２８−３０）。１（ＰＶ３９の調節 領域は、核因子Ｉ　（ＮＦＩ）のための４つの可能結合部位（２１，３１）と、 活性化タンパク質１（ＡＰＩ）のための２つの部位（２１，３２）と、先程説明 した゛乳頭腫ウィルスエンハンサー関連因子：ＰＶＦ”用結合単位（３１）と、 ＳＶ４０及び他のウィルス内に保持された“核のエンハンサ−配列”　（３３） とを含んでいる（図３）。グルココルチコイド応答潜在要素（ＧＲＥ　）は、同 種のＨＰＶ型のＮＣＲ内に存在する要素と類似している（２７）。

他の型のＨＰＶではＯＲＦ内に十分保持されているＧＲＥ追加要素と同等のもの はない（図４）。このＧＲＥ要素は、ＳＶ４０及びＢＰＶのエンハンサ−内でも 検出される結合部位式Ｐ２と重なり合っている（３４）。このことは、ＮＣＲの 上流に位置する領域のために調節機能が存在することを示している。１ＩＰＶ１ ６のエンハンサ−についてはＮＦＩとＡＰＩとの協働作用及びＮＰＩとグルココ ルチコイド受容体との協働作用はそれぞれ説明されている（３０）。多数の因子 とＢＰＶ３９のＮＣＲ及びＬｌ内の潜在結合部位との相互作用を更に解明せねば ならない。スプライシング供与部位（ヌクレオチド２３３）及び受容体くヌクレ オチド４０８）はＮＣＲの下流に位置付けられている。これらは、腫瘍遺伝子Ｈ ＰＶ型内でのＥ７　ｍＲＮ＾の生成に重要であると実証された（４．３５）。

個々のＯＲＦ配列を比較すると、ＢＰＶ３９が１ＬＰＶ１８と最も相同であるこ とが分かる。ＢＰＶ３９は他の生殖器乳頭腫ウィルスとは少し離れ、また皮膚Ｈ ＰＶ型要素ＨＰＶ８とは更に離れている（表２）。従って、ＢＰＶ３９は、多く の潜在腫瘍ウィルス（例えばＩ（ＰＶ１８、）ＢＰＶ４５　（１）　）　及びＨ ＰＶ１６／３１／３３グルーブトは異なるＭＥ１８０癌の細胞系列から最近クロ ーン化されたＢＰＶ３９と極めて相同な新たな型を含む生殖器ＨＰＶグループに 属している。

ＯＲＦ　Ｅ６．Ｅ７は通常、子宮預管癌及び癌腫の細胞系列内で転写される。そ れらの遺伝子の生成物を、−吹上皮細胞及び線維芽細胞の不滅化（ｉｍｍｏｒｔ ａｌｉｓａｔｉｏｎ）及び形質転換に関与させる。パ亜鉛指゛型構造の形成によ ってＤＮＡの結合に関与し得る配列決定された全ての乳頭腫ウィルスのタンパク 質Ｅ６内の４つのＣｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙｓ単位（３８）が更にＢＰＶ３９内に存 在する。これに対して、十分に保存された２つの要素Ｃｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙｓの うち第１の要素をタンパク質Ｅ７内で検出することができる。第２の要素は、チ ロシンの代わりにシスティンを有する。ＢＰＶ１６のＯＲＦ　Ｅ７の突然変異分 析によって、亜鉛指が形質転換能力に対して十分であることを実証することがで きたのて（３９）　、ＢＰＶ３９のタンパク質Ｅ７は恐らく絶えず機能的である 。更には、ＢＰＶ３９のＥ７は、形質転換に関与する多数の遺伝子生成物（例え ばＳＶ４０のＴｖＬ原、アデノウィルスのＥｌ＾、悪性生殖器１１ＰＶ　（但し ＢＰＶ６及びＦＩＰＶｌｌは除く）のタンパク質ｍｙｃ及びタンパク質Ｅ７）に 共通の゛細胞分裂タンパク質（ｃｄ）”単位（４）　：　虫／ａＳｎ−Ｘ−Ｘ− 工−ｘ　−ｓ　ｅ　ｒ　／　ｔ　ｈ　ｒ　／　ＩＬＬ！！−ｘ　−（１−８）　 −ａ　ｓ　ｐ　／　ＬＬ！！　−ａ　ｓ　ｐ　／　ｇ　ｌ　普@／　ｓ　ｅ　ｒ 　／　ｔ　ｈ　ｒ　−ａｓｐ／山（ＢＰＶ３９のＥ７アミノ酸には下線を引く） を含んでいる。ＳＶ４０の大きいＴ抗原とアデノウィルスのタンパク質との単位 ｃｄは、網膜芽腫の抗腫瘍遺伝子物質の結合を担うように思われる（４０）。Ｅ ７の形質転換活性は更に配列ｃｄを介してのタンパク質−タンパク質の相互作用 に寄与し得る。

本発明は特に、図１のヌクレオチド２０５０からヌクレオチド７７６まで伸びて いるＬ３ｋｂの大きいＯＲＦに対応する配列、又はこの配列に含まれるか若しく はこの配列から誘導される断片に間する。この断片は少なくも１５のヌクレオチ ドを含んでいる。

本発明は更に特に、ヌクレオチド４２０４からヌクレオチド３８７５まで、更に はヌクレオチド４２２７からヌクレオチド３８７５まで伸びている小さいＯＲＦ に対応する配列又はこれらの配列から産生若しくは誘導される配列に関する。

同様に本発明は更に、少なくとも１５のヌクレオチドを含み、十分に保存された ＧＲＥ要素を備え、またヌクレオチド６３６７のレベルで十分に保存されたこの ＧＲＥ要素内に特に図４に示すＧＡＣ＾配列を含んでいる、ＨＰＶ３９の全配列 から産生又は誘導される少なくとも１５のヌクレオチドの配列に関する。最後に 本発明は特に、以下のように同定された３つのヌクレオチド配列： に関する。

本発明は更に、寸法が先に定義した断片の寸法を越えない全ての断片に関する。

後者の断片は、苛酷な条件（温度が一２０℃）下で、特に以下の条件下で処理す るときに前者の断片とハイブリッド形成することを特徴とする。

５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐ荷液＝６．５と、５ｘＳＳＣ（１ｘｘＳＳＣ −０，１５Ｍ　ＮａＣ１，０，０１５Ｍクエン酸ナトリウム）と、５０％ホルム アミドと、２００ｕｇ／ｍｌの酵母転移ＲＮ＾と、０．０２％Ｄｅｎｈａｒｔ溶 液とを含んでいる溶液中、４２℃でハイブリッド形成する。

とりわけ先に定義した断片との交差（ｃｒｏｉｓ６ｅｓ　）ハイブリッド形成の 比率が５０％を越えることを特徴とする同一型に属する断片も本発明に含まれる 。

先に示した配列のいずれか又はこれらの配列を含んでいる核酸の使用は、生物学 試料中で）ｌＰＶ３９に近い乳頭腫ウィルスＤＮＡを検出できるハイブリッド形 成用プローブを製造するのに特に適している。

従って、本発明は一般に、前述したＤＮＡ−ＲＰＶ又はこのＤＮＡ−１（ＰＶの 断片を含んでいる組換えＤＮＡ、特にこれらの組換えＤＮＡから形成され、ＨＰ Ｖ３９への感染又はこの乳頭腫ウィルスの変形又は亜種の検出に特に適したハイ ブリッド形成用プローブに関する。これらのプローブは、特にプローブを異なる マーカーと直接的又は間接的に共役するために、それ自体がマーキングされてい るが又は幾っがのヌクレオチドのレベルで修飾され得る。これらのプローブ内で は、乳頭腫ウィルスのＤＮＡに対応し、通常クローニングベクターから得られる ヌクレオチド配列とは関係のない部分が、任意のＤＮＡ含量について試験した対 応する乳頭腫ウィルス又はその変形の一種の試料中に場・合によって含まれる他 の核酸と厳密な条件下でハイブリッド形成する危険性がないことは言うまでもな い。

従って、生殖器の腫瘍、特に子宮頸管癌、外陰癌又は陰茎癌を引き起こし得るか 又は引き起こした乳頭腫ウィルス５染を、通常ヒトの患者から得た被試験生物試 料で１ことを特徴とする。

本発明の各プローブ又はこのプローブを含んでいる混合物を特に以下のように使 用することができる。当然、説明する診断試験は、これらのプローブ又はプロー ブ混合物が実際に使用され得る使用条件を制限するものではない。

考察する実施例では、例えば生検、病巣をかき取って得られた細胞又はＣａｒｎ ｏｙ混合物（エタノール、クロロホルム、酢酸６：３：１）で固定し、パラフィ ン内に封入した生検の切片でＨＰＶを同定する一二　゛　。試験では、本発明の ＲＰＶ又はこのＲＰＶを含んでいるＤＮＡ若しくはＨＰＶの混合物から製造した 放射性プローブ（３２ｐ又は１５Ｓでマーキング）を用いて厳密な又はあまり厳 密でない条件下で実施する分子ハイブリッド形成実験によるＤＮＡの分析を問題 とする公知の原理からなる方法に従って、ＤＮＡを試料から予め抽出する必要が ある。

幾つかのハイブリッド形成方法を使用することができる。

例工ば、スポット（ｓｕｒ　ｔａｃｈｅ　）ハイブリッド形成方法を使用するこ とができる。この方法は、ＤＮＡの変性後に、多量のＤＮＡアリコートをにトロ セルロース、即ち”　（：ｅｎｅｓｃｒｅｅｎｐｌｕｓ”）膜上に付着させ、通 常の条件下で各層をプローブ混合物とハイブリッド形成し、膜をレントゲ′　ン フィルムと接触させて放射性ハイブリッドを検出することからなる。複製（ｓｕ ｒ　ｒｅｐｌｉｑｕｅ）ハイブリッド形成方法を使用することもできる。この方 法は、ＩＮＮ＾を制限酵素で処理した後に産生したＤＮＡ断片を電気泳動によっ てアガロ上（゛ −スゲル昌しノルカリ変性後に断片をにトロセルロース゛’Ｇｅｎｅｓｃｒｅｅ ｎｐｌｕｓ”　）膜状に移動させ、これらの断片を通常の条件下で適切なプロー ブ混合物とハイブリッド形成することからなる。放射性ハイブリッドの形成は、 膜をレントゲンフィルムと接触させた後に検出する。

放射性プローブは、ニックトランスレーション法によってマーキングしたＨＰＶ のＤＮＡから、又は例えばＳＰｅ型のベクター内に挿入されたウィルスＤＮへの 転写によって製造したＲＮＡからなっている。放射性プローブの使用は、高感度 であるという利点を有するが、これは、非放射性プローブ、例えばそれ自体がマ ーキングされるか又は酵素マーカー、蛍光マーカー等を担持する抗体によって認 識され九抗体によって認識され得るビオチニル化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｅｓ）プ ローブの使用を排除しない。

本発明は更に、前述した型の組換えＤＮＡ、特にＨＰＶ３９のＤＮＡ４こ対応す るヌクレオチド配列又はＤＮＡ配列が細胞培養内でこのヌクレオチドの転写調節 要素の制御下に置かれているＤＮＡで形質転換したコンピテント細胞培養に関す る。

従って、本発明は更に、対応するコンピテント細胞宿主内での前記組換えＤＮＡ の発現物質及びこれらの発現物質に対する物質になり得る対応抗体に関する。

例エバ本発明ハ、特４．：　ＤＮＡ−ＨＰＶ３９ノ遺伝子Ｅｌ、Ｅ２．Ｅ４．Ｅ ６゜Ｅ７．Ｌｌ、Ｌｌの各発現から得られるポリペプチドに関する。

従って、本発明に基づくこれらのポリペプチドの製造方法は、前述したタンパク 質の一種に対応するヌクレオチド配列がこの細胞宿主内で発現され得るように、 コンピテント細胞培養をＨＰＶ３９から産生した対応ヌクレオチド配列を含む組 換えＤＮＡで形質転換し、コンピテント細胞宿主で合成した物質からこれらのポ リペプチドを回収し、（例えば細胞培養又は細胞培養が展開された培地から予め 抽出した発現物質を、このようなポリペプチドに対して予め形成した抗体と接触 させて）精製することからなる。

しかしながら、本発明に基づく乳頭腫ウィルスの各ゲノムの配列し２の発現物質 は、とりわけ問題となる種の調製物が予め固定されたときに、ＨＰＶ３９型又は その変形の乳頭腫ウィルスの生物学試料中で遺伝子Ｌ２の発現物質を認識し得る 抗体をｉｎ　ｖｉｖｏ産生ずるために使用され得るという点て特に重要である。

本発明は更に、それぞれがＨＰＶ３９から誘導された前記ポリペプチド、例えば 他のポリペプチド配列がタンパク質Ｌ２の免疫原特性を本譬的に変えない限り、 これらのポリペプチド配列に融キされるタンパク質Ｌ２を含んでいるハイブリッ ドポリペプチドに関する。このような他のポリペプチド断片の存在は特に、例え ば遺伝子的特性によるこれらのハイブリッドポリペプチドの製造方法の使用に起 因する。例えばこれらのハイブリッドポリペプチドは、β−ガラクトシダーゼか ら誘導された配列を含んでいる。特に、オペロン−ラクトースの全て又は一部分 によって修飾され、更にはＨＰＶ３９から産生した遺伝子Ｌ２から誘導されたヌ クレオチド配列がオペロン−ラクトースプロモーター（又は他の適切なプロモー ター、例えばλファージ）の下流に挿入されている適切なベクター（ファージ又 はプラスミド）でＥ、ｃｏｌｉを形質転換してこのような物質を製造することが できる。

オペロン−ラクトースのβ−ガラクトシダーゼの遺伝子の少なくとも一部分を含 んでいるこの型のプラスミド又はファージを使用するのが有利である。

本発明のポリペプチドは更に、精製すれば、特にこれらのポリペプチドによって 免疫感作した動物血清からのポリペプチドに対応する抗体の精製技術で使用する ことができる。特にこれらのポリペプチドをアフィニティーカラム上で固定する ことができる。抗体の精製処理は、抗体を含んでいる血清を前記ポリペプチドを 担持するアフィニティーカラムに通すことからなる。次に、適切なイオン強度を 有する適切な緩衝液、例えば酢酸アンモニウムのような塩の水溶液を用いて抗原 抗体複合物を解離して、これらのカラム上で選択的に固定された抗体を回収する ことができる。

酸性化溶液を使用することもできる。

本発明は更に、前述したポリペプチド、特に１（ＰＶ３９の遺伝子Ｅ６、Ｅ７又 は好ましくはＬｌの発現物質に対する抗体の産生方法に関する。本方法は、適切 なリビング宿主を前述したポリペプチドで免疫感作し、特に免疫感作した宿主の 血清を精製状態の対応ポリペプチドと接触させ、生成された抗原抗体複合物から 抗体を回収することによってこの血清から形成した抗体を回収することからなる 。

特に本発明は、適切な医薬ビヒクルとの会合によって予め精製させた抗体に関す る。この組成物は、病人から得た組織学的又は細胞学的試料でのｉｎ　ｖｉｔｒ ｏｉ断試験後に所定の疾患が臨床学的に診断されるとすぐにこの疾患の治療に使 用され得る。（特に血清形態の）この組成物は好ましくは腸管外経路によって投 与することができる。この血清は、ＨＰＶ３９型乳頭腫ウィルスによって引き起 こされた感染の退行を引き起こし得る。

これらの抗体は特に、感染したヒトから得た組織学的切片が更に幾つかの構造遺 伝子、特に第２の発現物質を含み得る限り、ＨＰＶ３９又は同種の乳頭腫ウィル ス（又はこの乳頭腫ウィルスの変形）への感染の診断試験で使用することができ る。

従って、本発明は更に、特に子宮預管癌、外陰癌又は陰茎筋の生殖器腫瘍のｉｎ 　ｖｉｔｒｏ診断方法に関し、本方法は、抗原抗体複合物の生成を可能とする条 件下で、関係するヒトが患った病巣から得た組織病理学的切片を接触させ、この 抗原抗体複合物を検出することからなる。解離条件下において、例えば前述した ＣＡＲＮＯＹの培地又は混合物（Ｌ。

ＬＩＳＯＨの著書”Ｈｉｓｔｏｃｈｉｍｉｅ　ｅｔ　ｃｙｔｏｃｈｉｍｉｅ　ａ ｎｉｍａｔｅｓ”にも記載されている）で予め固定した調製物上で検出するのが 有利である。

場合によって固定された抗し２抗体は、この抗体に対して形成された他の抗体に よって認識され得る。これらの他の抗体は、好ましくは非放射性の適切なマーカ ーを担持する。

これらのマーカーは例えば酵素型又は蛍光型である。

従って、このように選択した抗体ζよ、この抗体に対応する先に定義したハイブ リッド形成用プローブと同様に、対応する疾患の型のｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断に使 用することができる。

最後に本発明は、選択した投与法、特に腸管外経路による投与法に適した医薬的 に許容し得るビヒクルとの会合によって、一種又は好ましくは他の複数のタンパ ク質Ｌ２を含んでいる対応する予防接種用組成物に関する。ＨＰＶ３９又はその 対応型の乳頭腫ウィルスに感染する危険性の高いヒトを保護するためにこれらの 組成物を使用することができる。

表１ ０ＲＦ　第１の　第１の　＃！結コドシの前の　ＯＲＦ　分子！ヌクレオチド　 八ＴＧ　ヌクレオチＦ　寸法　（ｐｂ）　（ｋＤ）第６　４４　１０７　５８０ 　５３７　１８．７Ｅ７　４９３　５９２　９１８　４２６　１２．５Ｅｌ　９ ２２　９２８　２８６８　１９４７　７３．ＯＦ２　２７８０　２７９８　３９ ０７　１１２８　４３．Ｏ第５　３９５８　３９５８　４１７３　２１６　９． ＯＬ２　４１７２　４２５０　５６５９　１４８８　４９．９ＬＬ　５６１０　 ５６４３　７１５７　１５４８　５６．０表２ ＨＰＶとＨＰＶ３９とのタンパク質の比較（同一アミノ酸の割合）。

ＨＰＶ１８　ＨＰＶ３３　ＨＰＶ１６　ＨＰＶＩＩ　ＦＩＰＶ８Ｅ６６８％　５ １％　４８％　３８％　２６％Ｅ１７１％　５５％　４８％　５１％　４０％Ｅ ２５３％　４７％　４９％　４７％　３３％第２７１％　５３％　５６％　５０ ％　３７％し１７７％　６６％　６５％　６５％　５４％”　Ｎｅｅｄｌｅｍａ ｎｎ及び阿ｕｎｓｃｈのアルゴリズムに基づくコンピュータープログラムを用い て配列の比較を行った（４１）。

′壬Ｌｔｅ＞文Ｍ　１１　’１１　Ｊ、ｍ害中１：　５１ＭＳｔｉＭのであろ： １．　Ｄａ　Ｖｉｌｌｉｅｒｓ、三、、ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６３，４８９８−４９ ０３　（１９８９）。

＋ｇ＋−＋ｇｓ　（１９８力。

３、　Ｃａｆｅ、Ｓ、Ｔ、ｕｄＤ＆ｎｏｓ、Ｏ，、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１９ ３．５９９−６０８（１９ｒ７）。

Ａ、　Ｇｏｌｄｓｌｘ＋ｒｏｕ（ｈ、　Ｍ、Ｄ、、ＤｉＳｉｌｖａｓυｅ、　Ｄ 、、Ｔｅｒｎｐｋ、　Ｇ、Ｆ、　ａｎｄ　ＬｏＳｎｃｘ、人A７．、　Ｖｉｒｏ ｌｏｇｙ ］フｌ、３Ｃ）６−３ＩＩ　（１９８９）５、　Ｂｗｕｄｅｎｏｎ、　Ｓ、、Ｋ ｒｅｒｎｓｔｂｒｆ、　Ｄ、、　０ｂａＪｅｋ、　Ｓ、Ｊｍｌｏｎｓｂ、　ｉ、 Ｐｅｈａｕ−Ａｒｎａ浮р■煤A　Ｇ、。

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７、　Ｃｈｅｎ、　Ｌ　Ｈａａｔｉｅｙ、　Ｐ、Ｍ、、　Ｌｅｉｎｓｏｎ、人、 Ｄ、、　Ｓｃｔｂｕｒｇ、　Ｐ、Ｈ，、Ｎａｔｕｒｅ　２９X．５２９−５３４ （１９８２）。

＋１．　Ｄａｎｍａｍ、に、、５ｃｈｖｕ＝、Ｅ、、Ｇｉ皿県、Ｌ−ＺｕｒＨｚ ｕｓｅｅ＋、Ｈ，、Ｖｉｒｏ１ｏｇｙ１５１，１２←１３０　（１９８６）。

９、　Ｆｕｃｈｘ、　Ｐ、Ｇ、、　Ｉｆｍｅｒ、　ｒ、、Ｗｅｎｉｎｇｅｒ、　 Ｊ、　ａｒｉｄ　Ｐｆｉｓ＋ｅｒ、　Ｈ，、Ｊ、　ＹｕｏｌA　５８．６２６− ６３４　（１９８６）。

１０、　Ｇｉｒｉ、　１．、　Ｄｘｏｓ、Ｏ，＝ｔｄ　Ｙａｎｉｖ、　Ｍ、、　 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｄ、人ｃａｄ、　ＳｃＬ　ＵＳ八　ｇ２．P５８０−１５３４ （１９８５）。

Ｉｌ、Ｇｒｏ（ｒ、　Ｄ、Ｌ　ｕｄ　Ｌａｎｅｚ＋ｅｒ、　Ｗ、Ｄ、、Ｊ、　Ｖ ｉｒｏｌ、　５６．　Ｕ−９１（１９Ｌｉ）。

１２、Ｃｏ１ｅ、　Ｓ−τ、ｘｎｄ　５（ｕｘ’ｚ　Ｒ，Ｅ−、Ｊ、　Ｖｉｒｏ ｌ、　５８．９９１−９９５　（１９ｇ６）。

！３．Ｓｃｈｗａｒｚ、Ｌ、ＤＱｎ＋、Ｍ、、Ｄｅｍｘｋｏｗｓｋｉ、Ｃ−、Ｌ ａ＋＋ｃΣ「Ｉ！１；糺ｒｌｘ１，０．．Ｚｅｃｈ、Ｒ，，vｏｌｆｓｐｃｒｚ ｅｒ。

Ｅ、、　５ｕｌｕｉ、　Ｓ、　ａｎｄ　Ｚｕｒ　Ｈａｕｓｅｎ、　Ｈ，、ＬＭＢ ＯＪ、　２．２３４１−７３４８　（１９ｇｉ。

＋４．　Ｚａｃｈｏｗ、　Ｋ、Ｒ，、ＯｓＬｒｏｗ、　Ｒ，Ｓ−、Ｆａｍ、人Ｊ 、−Ａｒｏｌｃｙｐ　１５１１，２５ド２５４　（１９ｆ乃B １５、ＨｅＪｌｉｋｏＨ，Ｓ、、Ｍｅｌｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｒ＋ｚｙｍｏｌｏｇ ｙ　１５５．１５６−１６５　（１９Ｑ。

＋６．　Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ、、Ｎ１ｅｋｌａｎ、Ｓ、ａｎｄＣｏｕｌｓｏｎ、＾ 、Ｒ，，Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．人ｃｓＡ−Ｓｃｉ、　０５l７４．５４６３− １７、２Σ二ｎ巳、Ｈ，、Ｓｃｋ、ｏｕ、Ｌ、Ｅｒｏｗｓｅ、Ｊ、ｗｔ　Ｓｏｍ ｕ＠に、Ｃ，Ｎｕｃ１人ｃｉｄｚ　Ｒｅ５−　１６．１２２O （１９８ｇ）。

１８、　Ｃｈｏｗ、ＬＴ、を七じｋｎ、Ｍ、、Ｗｏｌｉ＾ｉ７．Ｓ、Ｍ、ａｍＢ ｒｏｋｅｒ、丁、Ｒ−、Ｊ、Ｙｍｌ、６１．２５３１−２５O （１９８７）。

１９、　ＥｎＨｅｌ、　ＬＷ、、）ｉｉｍｚ　Ｃ，人−ｕ−Ｈｏｗｉｅｙ、　Ｐ 、Ｍ、、Ｊ、　ＶｉｍＬ　４７．５１６−５２３　（１９０j。

２０、　Ｂｅｎｏｉｓｔ、Ｃ，ｘｄ　Ｏｕｍｂｏｎ、Ｐ、、Ｎａｔｕｒｅ　ｚ９ ０．コ０４−３１０　（１９ｇ１）。

２１、Ｗｉｎｇｅｎｄｅｒ、　Ｅ、、Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　＋６． １ｍ−１９０２（１９８１゜２２、Ｐｒｏｕｄｒｏｏｔ、　Ｎ、、Ｎａｔｕｒｅ 　２９８．５１６−５１７　（１９ｆｆｌ。

１３、　５ｐａｊｈｏｌｚ、Ｂ人、Ｙａｑ、Ｙ、ａｒ＋ｄＨｏ＊＋ｅｙ、ｒ’、 Ｍ、、Ｃｅｊ１４２．１ｇ３−１９１（１９８５）。

２４、　Ｈｉｒｏｃｈｉｋａ、Ｈ，、Ｂｒｏｋｅｒ、丁、Ｒ−ｘｄ　Ｏ，ｏｗ、 ＬＴ、、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６１．２５９９−２６０６（１９■V）。

Ｌｉ、Ｇｌｏｕ、Ｂ、、０ＩｏｎＨ，Ｔ、ａｎｄｋ眉Ｉｄ、Ｈ，−１Ｊ、、Ｊ、 ’ＡｒｏＬ６３．１１４２−１１５２（１９８９）。

２６、Ｔｈ１ｅｒｒｙ、　Ｆ、、　’；ｃｓｒｏ、　Ｊ、Ｍ、、　Ｄ虞−ｎ、　 Ｋ、　−ｄ　Ｙａｉｖ、　Ｍ、、　Ｊ、　ＶｉｒａＬ　６１D１３４−１４２ （１９８７）。

２７、Ｃｔｕｎ、Ｗ、、に１ｏ＝ＬＧ、ａｎｄｋ二ｄ、Ｈ，−Ｕ、、Ｊ、Ｙ＜１ ．６３．３２６１−３２６９（１９１ｔ９）。

２３、　Ｃｈｉｎ、　Ｍ、Ｔ、、　Ｂｒｏｋｅ、　Ｔ、Ｌ　ａｎｄ　Ｃｂｏｖ、 　ＬＴ、、Ｊ、　ＶｉｒｏＬ　６３．２９６７−２９７６　i＋９１ｉｆ９）。

２９、　Ｃｒ１ｐｅ、丁、Ｐ、、ＨｘｕＨｅｎ、Ｔ、Ｈ，、Ｔｕｒｋ、ＪＪ、、 丁ａｂａｕｍ、Ｆ、、Ｓｄｙｍｄ、Ｐ、Ｇ、、Ｄｕｓｔ、Ｍ|。

Ｇ’ａｓｍｘｎｎ、　Ｌ、Ｒｏｒｒｗ、人、−Ｔｕｒ氏ＬＰ−、ＥＭＢＯＪ、　 ６．３７４シ３７！’３　（１９ｇ７）。

３０、　ＣｈｏｎＨ，丁、、Ｃｈｍ、Ｗ、に、ｘｄ　Ｂｅｍａｒｄ、Ｈ，−Ｕ、 、ＮｕａＡｃｉｄｔＲｅｓ−１８，４ｅシ４７０（１９９Ｃe）。

３１、Ｇｌａｓｓ、　Ｂ、、　Ｙｅｅ−Ｇｉｏａ　Ｍ−、Ｍｅｉｓ＋ｕｅｒｒａ ｘ、　Ｍ、、　Ｒｏｍｅ、　Ｌ、　’＋’／１ｒｕｕｃｋｅ秩A　Ｅｌ　ａｎｄ Ｂｅｎｕｒｄ、　）Ｌ−Ｕ、、　Ｎｙｃｌ、　Ａｃ１ｄｚ　Ｒｔｓ−１７，３５ １９−３５３３（１９ＦＡ３２、＾ｎｇａｌ、　Ｐ、、Ｉｍｘｐｗａ、　Ｍ、、 Ｃｈｉｎ、　Ｌ、Ｓ＋ｅｉｎ、　Ｂ、、１ｍｂｒ４　ＲＪ、、−励−ｍｌ、　Ｒ Ｊ、、iｏｒＪ ３４、　１ｒｒ＊ｇａｖａ、　Ｍ、、Ｃｈｉｎ、　Ｒ，ａｎｄ　）Ｃａｒｉｎ、 　Ｍ、、　Ｃｅ１１５１，２５１−２５１　（Ｉ５Ｆ）。

３５、　５ｒｎｏｔｋｉｎ、Ｄ、、ｌ’ｒｏｋｏｐｈ、）Ｌ　ａｎｄ　Ｗａ＋ｔ ローｎ、Ｆ、Ｏ−、Ｊ、ＶｉｒｏＬ　６３，１４４１−１４S７（１９ＪＥ！す 。

）６．　５ｒｎｏＬｋＪｎ、Ｄ、　ｕｄ　Ｗｃｔｕ＋ｅｉｎ、Ｆ、Ｏ，、Ｐｒｃ ｃ、　ＮｘＬ　八０２！Ｌ　ＳｃＬ　０５人　０．４６＆０|４６＆４ （１９８６）。

３７、ＭＱｎｇｅｒ、に−０Ｐｈｅｌｐｓ、　Ｗ、Ｃ，，３ｕｂｂ、　Ｖ、、Ｈ ｏｗｉｅ７．　Ｐ、Ｍ、−５ｃｈｌｅ（ｅｌ、　Ｌ　Ｊ、　Yｒｏ１．６３゜ ４４１７＋２１　（１９ｇ９）。

３ｇ、Ｅｖｍ、　Ｒ，Ｍ、　ｕｄ　ＨｏＬｌｅｎｃｃｒｚ、　Ｓ、Ｍ、、Ｃｅ１ ｌ　５２．１−３　（１９１１り。

３９、Ｅｄｍｏｎｄｓ、Ｃ，ｘｄ　Ｖｏｕｓｄｅｒ＋、に、Ｈ，、Ｊ、　ＶＸｒ ｏｉ、　６３．２６５０−２６５６　（１９ｑ。

４０、　Ｆ：ｇｇｅ、Ｊ、ａｎｄ　Ｓｍ１ｔ、τ、Ｆ、、Ｎａｔｕｒｅ　コ３４ ．Ｊ）９　（＋９０）。

４１、Ｎｅｅｃｌｌｅｍ：ｕｒ、Ｓ、Ｂ、ｘｄＷｕｎｓｃｈ、Ｃ，Ｄ、、Ｊ、Ｍ ｏ１．Ｂｉｏｌ、４Ｌ４４３Ｊ５０（１９７０）。

国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号ＧＯＩＮ　３３１５３　 Ｄ　８３１０−２Ｊ３３１５６９　Ｌ　９０１５−２Ｊ ３３１５７４　Ｃ９０１５−２Ｊ （７２）発明者　ポルペルス、クリストフドイツ連邦共和国、デー−６２００・ ビスバーデン、ロイドリンガ−・シュトラーセ・１２Ｉ （７２）発明者　シュドレーク、ロルフ・ニードイツ連邦共和国、デー−６２０ ０・ビスバーデン、フリードリツヒ・ラング・シュトラーセ・３

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．本質的に図１のヌクレオチド配列全体若しくはその一部分からなるＤＮＡ若 しくはその断片、又は厳密な条件下で前記ＤＮＡ若しくはその断片とハイブリッ ド形成する対応するＤＮＡ若しくはＤＮＡ断片からなることを特徴とする乳頭腫 ウイルスＨＰＶ３９に由来するか又はそれから誘導されるＤＮＡ。
2. ２．配列が、図１のヌクレオチド２０５０からヌクレオチド７７６まで伸びてい る１．３ｋｂの大きいＯＲＦの配列、又はこの配列に含まれるか若しくはこの配 列から誘導される断片に対応し、この断片が少なくとも１５のヌクレオチドを含 んでいることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ。
3. ３．配列が、ヌクレオチド４２０４からヌクレオチド３８７５まで、更にはヌク レオチド４２２７からヌクレオチド３８７５まで伸びている小さいＯＲＦの配列 、又はこれらの配列に由来するか若しくはそれから誘導される配列に対応するこ とを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ。
4. ４．少なくとも１５のヌクレオチドを含み、またヌクレオチド６３６７のレベル で十分に保存されたＧＲＥ要素内に含まれるＧＡＣＡ配列を含んでいることを特 徴とする請求項１に記載のＤＮＡ。
5. ５．配列が、以下の配列： コンセンサス：【配列があります】 ＨＰＶ３９（ＨＣＲ）：【配列があります】ＨＰＶ３９（Ｌ１）：【配列があり ます】のいずれかを含んでいることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ。
6. ６．前記断片が、ＨＰＶ３９の以下の遺伝子：Ｅ１，Ｅ２，Ｅ４，Ｅ６−Ｅ７， Ｌ１，Ｌ２のいずれか又は遺伝子間領域ＮＣ全体若しくはその一部分に対応する ことを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ。
7. ７．請求項１から６のいずれか一項に記載のＤＮＡから誘導されたＤＮＡからな るハイブリッド形成用プローブ。
8. ８．請求項１から６のいずれか一項に記載の乳頭腫ウイルスの一種のＤＮＡの一 種の構造遺伝子の発現産物に対応するポリペプチド。
9. ９．特に乳頭腫ウイルスＨＰＶ３９のゲノムの配列Ｌ２の発現産物からなること を特徴とする請求項８に記載のポリペプチド。
10. １０．請求項６又は８に記載のポリペプチドに対する抗体。
11. １１．請求項７に記載のような対応するプローブを、好ましくは厳密なハイブリ ッド形成条件下で、場合によっては予めプローブがアクセスできるようにした試 料の核酸と接触させ、試料中に存在し得る探求するウイルスＤＮＡと前記プロー ブとの間で形成されたハイブリッドを検出することを特徴とするＨＰＶ３９型乳 頭腫ウイルス感染の被試験生物試料でのｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出方法。
12. １２．生殖器腫瘍、特に子宮頚管癌、外陰癌又は陰茎癌の検出のためにｉｎ　ｖ ｉｔｒｏ診断を実施することを特徴とする請求項１１に記載の方法。
13. １３．請求項１０に記載のような抗体を、ｉｖ　ｖｉｔｒｏ診断するヒトから得 た生物試料と接触させて、生成された抗原抗体複合体を検出することを特徴とす る生殖器腫瘍及び子宮頚管癌を誘発し得る型の乳頭腫ウイルスヘの感染のｉｖ　 ｖｉｔｒｏ診断への請求項８に記載の抗体の適用。