JPH06504682A - タンパクｓ発色原アッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 タンパクＳ発色源アッセイ 主生皿公立団 本発明は、一般的には発色原アッセイの分野に、そしてさらに詳しくは血漿また は他の流体中に含まれるタンパクＳのレベルを決定するための発色原アッセイに 関する。

本生五夏ｉ量 血液凝固カスケードもしくは系は、限られたタンパク分解によって活性酵素へ変 換される一群の酵素源を含む。この酵素活性カスケードは最終的にフィブリノー ゲンからフィブリン凝塊を生成する。

この凝血カスケードは二つの経路、外因性および内因性に分けられる。酵素源を 酵素へ変換する反応のシリーズは、血液因子■およびＶのような種々のタンパク 助因子を必要とする。　Ｈｉｇｈ、　Ｋ、　Ａ、、Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ一 旦＝Ｐｒｏユｅｉｎ　Ｃａｎｄ。

Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓ　Ａｒｃｈ、Ｐａｔｈｏｌ、Ｌａｂ、Ｍｅｄ、（１９８８） ；Ｖｏｌ、１１２：ｐｐ、２Ｂ−３６゜タンパクＳは天然の抗凝固タンパクであ る。これは二つの形、遊離およびＣ４Ｂへ結合して循環する。このタンパクの約 ４０％が遊離形で発見され、６０％が結合形で存在する。Ｂｌａｎｃ、Ｐ、。

ｅｔ　ａｌ、Ｄｅｆｉｃｉｔ　Ｃｏｎ５ｔｉｔｕｔｉｏｎ　ｅｎｒｏｔｅｉｎｅ 　Ｓ　ａ　Ｉ’Ｏｒｉ　ｉｎｅ　ｄｅ　Ｔｈｒ。

ｍｂｏｓｅ　Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｄｉ　ｅｓｔｉｖｅ、Ｌａ　Ｐｒｅｓｓ　Ｍｅ ｄｉｃａｌ　（１９９０）：Ｖｏｌ、１９：ｐｐ、４１６−４１９゜ タンパクＳおよびタンパクＣは凝血カスケード系内因性経路においてそれらの効 果を発揮する。タンパクＳは他の因子による活性化を必要としないが、しかしト ロンビン（因子１［ａ）によって活性化される活性化されたタンパクＣの存在に おいてのみ活性である。活性化されたタンパクＣは因子Ｖおよび■を不活性化す ることにより抗凝固剤として作用する。タンパクＳはタンパクＣの抗凝固効果を 増進する。

Ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ　因子は活性化タンパクＣおよびタンパクＳによ る因子■の不活性化を減らし、そしてその効果は因子Ｄ＜ａの活性部位によって 増進される。Ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子は因子■を結合し、それによっ て不活性化から保護することによって作用する。Ｒｉｃｋ、Ｍ、Ｅ、、Ｆａｃｔ ｏｒ　ＩＸａａｎｄ　ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒｎｄ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｍｏｄｉｆ ｔｈｅ　Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆａｃｔｏｒ　■ｂ　Ａｃｔｉｖａ ｔｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃ，Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｌａｂ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｅｄ、（ １９９０）：Ｖｏｌ、１１５　（４）：ｐｐ、４１５−４２１゜ タンパクＳの欠乏は多数の病的状態に関連している。例えば、減少したタンパク Ｓレベルを有する個人は静脈血栓の増加したリスクを有する。事実タンパクＳ欠 乏は若年者の静脈血栓の８〜１０％に責任がある。Ｐｒｅｄａ、Ｌ、ｅｔ　ａｌ 、Ａ　Ｐｒｏｔｒｏｍｂｉｎ　Ｔｉｍｅ−Ｂａｓｅｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　 Ａｓ５ａｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓ、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ 　１９９０；Ｖｏｌ、６０：ｐｐ、１９−３２゜二つのタイプのタンパクＳ欠乏 症がある。第１のタイプは総タンパクＳの中程度に減少したレベルに関連するが 、しかし遊離タンパクＳの顕著に減少したレベルに関連し、タンパクＳ欠乏症の 第２のタイプは遊離および総タンパクＳ両方のレベルの著しい減少を有する。Ｗ ｏｏｄｈａｍｓ、Ｂ、Ｊ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｆｕｎｃｔｉ。

ｎａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓ　Ａｓ５ａ　Ｓｈｏｗｓ　Ｉｎ　ｒｏｖｅｄ　Ｃｏ ｒｒｅｌｅｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　Ｃ１１ｎｉｃａｌＳ　ｍ　ｔｏｍｓ　ｉｎ　） （ｅｒｅｄｉｔａｒ　Ｄｅｆｉｃｉ１ユ且り、Ｔｈｒｏｍｂｏｓ　ｉｓ　Ｒｅ５ ｅａｒｃｈ　（１９９０）：Ｖｏｌ、５７：ｐｐ、６５１−６５７゜タンパクＳ 欠乏症の唯一の知られている治療法はワルファリンナトリウムによる生涯療法で ある。Ｈｉｇｈ、に、Ａ、、Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ　ｍ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　 Ｃａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓ、Ａｒｃｈ、Ｐａｔｈｏｌ、Ｌａｂ、Ｍｅｄ、１ ９８８；１１２：ｐｐ、２８−３６゜個人のタンパクＳレベルを測定するのに利 用し得る多数の方法が存在する。これらの方法は二つのクラスに分けられる。第 １のクラス、タンパクＳ抗原レベルアッセイは遊離および結合（総）タンパクＳ を測定する。第２のクラス、機能的タンパクＳアッセイは、遊離タンパクＳのみ がどんな機能性活性をも有するので遊離タンパクＳのみを測定する。

抗原レベルアッセイにおいては、タンパクＳレベル（総タンパクＳ）は、ＥＬＩ ＳＡ、ＲＩＡ、ＩＲＭＡ、および電気免疫拡散（Ｌａｕｒｅ　Ｉ　Ｉ　ロケット 技法）を含む、種々の技法を使用して測定される。これら技術のすべてはこの抗 原に対するポリクローナル抗体を使用する。しかしながらセれら方法に関連する 一つの難点は、遊離および結合タンパクＳに対する相対的親和性が機能性タンパ クＳの実際濃度を決定するために既知でなければならないことである。それ故、 抗原レベルアッセイは、これらはタンパクＳの機能的活性または遊離形を機能的 に活性でない結合形から明確に区別できないから、限られた価値しかない。Ｂｅ ｒｔ　ｉｎａ、Ｒ，、旦Ｌｌ且１ｆｉｔ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃａｎｄ　Ｐ ｒｏｔｅｉｎＳ　Ａｓ５ａ　ｓ、Ｒｅｓ、Ｃｌ１ｎ、Ｌａｂ、（１９９０）；Ｖ ｏｗ、２０：ＰＰ、１３２　１３４゜さらに、この総タンパクＳの測定はタンパ クＳ欠乏症の二つのタイプを区別しない。さらに抗原レベルアッセイは高いサン プル希釈と長いインキュベーシゴン時間を必要とする。

代わって機能的タンパクＳアッセイにおいては、凝固時間またはトロンボプラス チン時間を使用して機能的もしくは遊離タンパクＳを測定する。一つの機能的タ ンパクＳアッセイは因子Ｘａ誘発凝固時間の延長に基づいている。このアッセイ において、活性化タンパクＣを必要とするタンパクＳは、活性化タンパクＣが因 子Ｖａを不活性化し、それ故凝固時間を延長する助因子として作用する。他の機 能的タンパクＳアッセイのいくつかは蛇毒アクチベーターを用いてタンパクＣを 活性化する。他の機能的タンパクＳアッセイは、活性化トロンボプラスチン時間 （ＡＰＴＴ）に基づいている。この方法は、血液凝固の活性化タンパクＣ依存阻 害のための助因子として機能的タンパクＳの必要性に基づいている。このタイプ のテストに関連する主要問題は、ヘパリンのような抗凝固剤を受けている患者に 対するその適用不可能である。タンパクＳテストを必要とする大部分の患者はサ ンプル採取時経口抗凝固剤を使用しているから、これらタイプのテストは正確に 用いることができない。Ｂｅｒｔｉｎａ、Ｒ，、Ｓ　ｅｃｉｆｉｃｉｔ　ｏｆ　 Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓ　Ａｓ５ａ　ｓ、Ｒｅｓ、Ｃｌ １ｎ。

Ｌａｂ、；２０：ＰＰ、１２７゜ＡＰＴＴタイプアッセイに関連する他の問題は 、正常血漿はトロンボプラスチン時間において１００％矯正を与えるものとの推 定に依存していることである。凝固時間の延長の活性化タンパクＣ濃度に対する 依存性が存在することが認められている。このため、このアッセイを実施する人 々はアッセイを行う度毎に完全な標準曲線を作成しなければならない。さらにこ のアッセイは非常に費用がかかり、そして測定に長時間が必要であるが、凝固時 間はたった１０秒延長できるだけである。これらの要因は誤差の余地を残し、そ して実験室効率を低下させる。

上記問題の多くを解決するため、われわれは機能的タンパクＳの活性レベルを測 定するため、発色原基質を使用するテストを開発した。発色原基質は因子■レベ ルの決定に以前から用いられている。

これら因子■アッセイは、因子Ｘａｉ１度は凝固カスケード系を利用することに よって因子■ａヘリンクできることを認識する（Ｄａｄｅ因子■発色アッセイ： Ｂａｘｔｅｒ　ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＩｎｃ、）。タンパクＣも活性化タンパ クＣによって開裂される発色原基質によって決定され、タンパクＣの直接の簡単 な測定を形成する。Ｈｉｇｈ、に、Ａ、、Ａｎｔ　ｉｔニｈｒｏ旦上ユｎ　ｍ　 Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓ、Ａｒｃｈ、Ｐａｔｈｏｌ、Ｌ ａｂ、Ｍｅｄ、（１９８Ｂ）；Ｖｏｌ、１１２：ｐｐ。

２８−３６゜タンパクＳは酵素ではないので、しかしながらそれは発色原基質を 使用して直接測定することができる。このように本発明は、′タンパクＳと他の 血液凝固タンパクとの関係を利用する。

本発明方法は、タンパクＳの機能的レベルのみを定量的に測定し、タンパクＳ濃 度測定する費用のかかる抗体技法を使用しないアッセイを提供する。この方法は 、正常プールを１００％凝固と勝手に指定しそして正常プール値を他のサンプル ベースとすることに関連する問題を有しない点で他のタンパクＳアッセイを上履 る利益を有する。このことは妊娠は遊離タンパク活性を低下させるから特に真理 である。鉛末ら、Ｐｌａｓｍａ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓ　Ａｃｔｉｖｉｔ　Ｍｅａ ｓｕｒｅｄ　Ｕｓｉｎ　Ｐｒｏｔａｃ　Ａ　５ｎａｋｅ　Ｖｅｎｏｎ　Ｄｅｒｉ ｖｅｄ　Ａｃｔｉｖａｔｏｒ　。

ｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（１９８ ８）；Ｖｏｌ、４９：ｐｐ、２４１−２５１゜妊娠している婦人のサンプルをプ ールへ含めることは明らかに最終プール値を低下させ、結果をゆがめるであろう 。

本発明は、血清、血漿および他の流体中に含まれるタンパクＳのレベルの測定の ための高度に感受性の、再現性あるそして便利なアッセイを提供する。本発明は 、正確なそして再現性ある結果を得るためにはｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ　 因子を除去しなければならないことを認識する。再び、タンパクＳは酵素ではな いので、その機能濃度は発色原基質によって直接測定することができる。代わり に、タンパクＳが活性化タンパクＣによる因子■の不活性化を増進する能力が利 用される。残存因子■が活性化され、そして因子Ｘを活性化するように因子ＩＸ ａと共に作用する。因子Ｘａに対する発色原基質のような指示薬はその時因子Ｘ ａによって測定し得る信号分子へ変換される。この信号分子はその時サンプル中 のタンパクＳへ関連させることができる。

主主里二量！ 本発明においては、血清、血漿または他のタンパクＳ含有液のサンプルは、ｖｏ ｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子の効果をなくすことができる試薬と、そして活性 化したタンパクＣ（ＡＰＣ）、リン脂質およびカルシウムイオン（最も好ましく 具体例においてはカルシウムは塩化カルシウムとして存在する。）の溶液と共に インキュベートされる。このタンパクＳ含有溶液は、次にｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒ ａｎｄ因子の効果を除去するのに十分な時間インキュベートされる。その後この タンパクＳ含有溶液の適切な希釈液が、天然または組換え８原の因子■と混合さ れる。混合物中のタンパクＳの濃度は不活性化される因子■の量と直接相関する 。残存因子■活性は、以下のように天然または組換え源からの因子ＩＸａ、因子 Ｘおよびカルシウムイオンの添加によって測定される。残存因子■は因子Ｕａに よって活性化される。活性化された因子■および因子ＩＸａは因子Ｘを因子Ｘａ へ活性化する。因子Ｘａに対して特異性の指示薬もしくは基質が反応混合物へ添 加される。指示薬はそのように生成した因子Ｘａと反応し、分光分析的に測定で きる信号分子を放出する。

本発明方法に従えば、機能的タンパクＳ濃度について高度の感受性と再現性を有 するアッセイが提供される。本発明の他の目的は、ヘパリンおよび他の血液凝固 相互活性物質の存在によって影響されないタンパクＳのためのアッセイを提供す ることである。本発明の他の一目的は、タンパクＳ含有液体の日常的なアッセイ の便利な実施のためのキットを提供することである。本発明のさらに他の目的は 、テストサンプルの多数のアッセイを処理することができる自動化機器の作動を 容易化するため、アッセイ成分のバルク源を提供することである。

本発明の利益および性能は１．以下の詳細な説明および実施例を参照することよ り良く理解されるであろう。

ましい亘　の−な量゛Ｈ 本発明のアッセイ方法は以下のステップを含む。

■、　タンパクＳを含んでいる体液サンプルまたは対照中へ、後でもっと詳しく 記載しているｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子の効果を排除する試薬と、そし てあらかじめ定めた量の因子■の一部分を不活性化するのに十分な量の活性化し たタンパクＣをリン脂質およびカリシラムイオン（Ｃａ−）の存在下に加える。

ｖｏｎＷｉｌＩｅｂｒａｎｄ因子の効果を排除するために使用される試薬は、サ ンプル中に存在するｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子の実質上全部を不活性化 するのに十分な量で存在しなければならない。活性化したタンパクＣ（出発濃度 として）は好ましい具体例において約０．５ｎＭないし約５０ｎＭ、そして最も 好ましくは約２ｎＭないし約２０ｎＭの範囲でなければならない。好ましい具体 例におけるカルシウムイオン濃度（出発試薬として）は、約１ｍＭないし約２０ ｍＭ、そして最も好ましくは約５ｍＭないし約１５ｍＭの範囲内でなければなら ない。因子■不活性化の間、最終カルシウムイオン濃度に約１ないし約５ｍＭが 最も好ましい。

２、因子■とのｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子の相互反応を排除するのに十 分な時間混合物をインキュベートする。好ましい具体例においては、インキュヘ ーション時間は約０．１分ないし約５分、最も好ましくは約０．５分ないし約２ 分の範囲内でなければならない。

３、　インキュベーション混合物を既知量の因子■と混合する。好ましい具体例 においては、因子■（出発濃度として）は好ましくは約０．０１μ／Ｉ１１ない し１μ／Ｉｄ、そして最も好ましくは０．１μ／ｉないし約０．３μ／ｄの範囲 内でなければならない。

４、　因子■の一部分を不活性するのに十分な時間混合物をインキュベートする 。好ましい時間は約１分ないし約１５分、最も好ましくは約３分ないし約８分の 範囲内でなければならない。

５、　因子ＩＸａ、リン脂質、因子Ｘ、囚因子［ａおよびカルシウムイオンをイ ンキュベーション混合物と合わし、それにより残りの因子■を活性化するのに十 分な量の因子Ｕａおよびカルシウムイオンと、そして因子Ｘを活性化するのに十 分な量の因子ＩＸａ、リン脂質およびカルシウムが存在する。因子ＩＸａ（出発 試薬として）は約１０ｎＭないし約１１０００ｎ、最も好ましくは約１１００ｎ ないし約３００ｎＭの範囲内でなければならない。因子Ｘ（出発試薬として）は 好ましくは約５０ｎＭないし約３０００ｎＭ、最も好ましくは約３００ｎＭない し約１１０００ｎの範囲内でなければならない、因子１１ａ（出発試薬として） は、好ましくは約１ｎＭないし約２００ｎＭ、最も好ましくは約２０ｎＭないし 約１１００ｎの範囲内でなければならない。

６、　混合物を因子Ｘの一部分を因子Ｘａへ変換するのに十分な時間インキュベ ートする。好ましい時間は約０．２分ないし約１０分。

最も好ましくは約１分ないし約３分の範囲内でなければならない。

７、　因子ＩＸａ活性に影響することなくトロンビン活性を阻止するのに十分な 量のトロンビン阻害剤を加え、トロンビン阻害剤添加と同時または後で、後でも っと詳しく記載するように、信号分子を放出するように因子Ｘａと反応すること ができる支持薬試薬を加える。

支持薬試薬の量は検出することができる量で信号分子を発生するのに十分な量で ある。トロンビン阻害剤（出発試薬として）は約１μＭないし約５００μＭ、最 も好ましくは約１０μＭないし約５μＭの範囲内でなければならない。支持薬試 薬（出発試薬として）は好ましくは約０．１ｍＭないし約５ｍＭ、最も好ましく は約０．２ｍＭないし約１ｍＭの範囲内でなければならない。

８、信号分子の測定 信号分子の最終濃度は実施例を参照し、そして他の標準技術によって便利に決定 することができる。

以上の方法は参照のため以下の式へ例示することができる。

本発明方法の実施において、試薬は上述の式と一致する任意の順番で添加するこ とができる。加えて、因子１１ａ、■、ＩＸａおよびＸは実質上任意の動物また はヒトソースから得ることができ、そして分野で既知の分画または濃縮方法によ って調製することができる。

例えばＭｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　８０（１９８１）、Ａｃ ａｎｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、を見よ。そのような因子の高度に精製さ れたソースは適当な宿主細胞ラインに伝播された組換えベクターからのものであ る。Ｌｉｎ　Ｓ、Ｗ、ｅｔａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、（１９９０）Ｖｏ ｌ、２６５（１）：ＰＰ、１４４−１５０゜動物または組換えベクターソースか らの因子を使用することの一利益は、製品因子が肝炎ＡおよびＢ、ＨＴＬＶ−Ｉ ＩＩまたは他のそのようなウィルスで汚染されていないとの保証である。本発明 方法の好ましい具体例においては、血液凝固因子はウシ起源のものである。

本発明の目的に対しては、タンパクＳアッセイを妨害する物質の効果を除去もし くは排除することが必要である。このため、ｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子は 因子■を結合し、そして活性タンパクＣおよびタンパクＳによるその不活性化を 減するため、および因子■の不活性化はサンプル中の機能的遊離タンパクＳの量 に正比例するため、ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子の因子■結合を排除する 試薬を加えなければならない。そのような試薬は抗ｖｏｎ　Ｗｉ　１１ｅｂｒａ ｎｄ抗体、不活性化因子■、ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子へ結合する因子 ■の任意のフラグメント、ｖｏｎ　ｗｉ　ｌ　１ｅｂｒａｎｄ因子へ結合する合 成ペプチド、または特異性酵素（例えば蛇毒酵素）を含むが、それらへ限定され ない。ｖｏｎＷ　ｉ　１１　ｅ　ｂ　ｒ　ａ　ｎ　ｄ因子の効果を排除するのに 使用される試薬の量は約１０ｎＭないし約２０００ｎＭ、最も好ましくは約１１ ００ｎないし約１１０００ｎの範囲内でなければならない。最近ｖｏｎＷｉ　ｌ 　１ｅｂｒａｎｄ因子を結合しない変異■因子が製造された、ＬｅｙｔｅＡ、ｅ ｔ　ａｌ、５ｕｌｆａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔ　ｒ１６８０　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｂ ｌｏｏｄ　Ｃｏａ　ｕｌａｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ　ＶＩＨｉｓ　Ｅｓ５ｅｎｔ ｉａｌ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｖｌ ｌ　ｗｉｔｈ　ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ　Ｆａｃｔｏｒ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ（１９９１）；２６６　（２）：ｐＰ、７４０−７４６゜この因子■を 操作に代えて用いることができ、そしてｖｏｎＷｉ１１ｅｂｒａｎｄ因子を排除 するステップは必要としないであろう因子Ｘの因子Ｘａへの変換および活性化タ ンパクＣおよびタンパクＳによる因子■の不活性化は、リン脂質および脂質の存 在下で最も効率的に進行する。米国特許Ｎ１１４，６６６．８３１および４，６ ９８．２９９は診断アッセイにある種のリン脂質の使用を記載する、本発明の脂 質およびリン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、またはコ レステロールおよび種々の割合のそれらの混合物のような、前記特許に記載され ている代表的化合物を含むが、それに限定されない。他の脂質およびリン脂質組 成物を同様に代替できるが、許容し得る組成範囲は、ホスファチジルセリン５な いし４０モル％、コレステロール１ないし２０モル％、およびホスファチジルコ リン５０ないし９０モル％である。

因子■およびＸの変換を効果的とするために任意のカルシウムの化学的ソースが 使用できる。因子■を活性化および不活性化因子■へそして因子Ｘを因子Ｘａへ 変換する反応を駆動するのに十分なカルシウムイオンをもとのインキュベーショ ン混合物へ加えることもできるし、またはもっと少ない量をもとのインキュベー ション混合物へ加え、２番目の量のカルシウムイオンを因子Ｘを変換すべき時点 において加えることもできる。カルシウム陽イオン（Ｃａ”）の源はＣａ　Ｃｌ ｘ　、Ｃａ　（Ｎｏｔ　）ｔ　、Ｃａ５Ｏａまたは他の無機もしくは有機カルシ ウムイオン含有化合物を含み、それに限定されないが、好ましいソースはＣａＣ １ｚである。

本発明の指示薬は血液凝固因子Ｘａと反応することができる分子である。そのよ うな反応において、測定し得る信号部分を産出する化学反応副産物が発生しなけ ればならない、米国特許Ｎｌ１４，４４０．６７８；４，４Ｂ０，０３０ｉ４． ５６８，６３６および４，６２２．３８９は因子Ｘａと反応することができる発 色源化合物のクラスを記載する。本発明の指示薬はこれら特許に記載されている そのような代表的化合物を含むがそれに限定されない。指示薬は、測定すること ができ（例えば目視的にまたは螢光のように測光的に）、そして因子Ｘａの濃度 へ相関させることができる信号分子を得るように因子Ｘａと反応しなければなら ない、指示薬化合物のこのクラスの最も好ましいメンバーは、以下の式に従って 因子Ｘａと反応する。

因子Ｘａ ＣＨｆｆ　ＯＣＯ−Ｄ−ＣＨＡ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ　−ＣＨ５ＯＣＯＤ　 ＣＨＡ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　ＯＨ＋ｐ　＋−トロアニリン式中、Ｄは右旋性立体異 性体を表わし、ＣＩＡはシクロヘキサンアルギニン、Ｇｌｙはグリジン、Ａｒｇ はアルギニン、そしてｐＮＡはｐ−ニトロアニリンである。因子Ｘａとの反応時 、信号分子ｐ−ニトロアニリンが遊離し、それは４０５ｎｍにおいて率またはエ ンドポイント分析のどちらかを使用して分光測光測定によって便利に測定するこ とができる。

本発明に適用することができる他の指示薬も入手し得る。以上の開示から、当業 者にとっては標的指示薬の信号部分は好ましくはトリチウムまたは炭素１４で放 射標識することができ、そして放出される時信号分子ゲル排除クロマトグラフィ ー、透析、免疫吸着、または他の慣用の分離技術によって単離することができる ことが自明であろう。

因子Ｘａのための発色原基質に対するトロンビン活性をブロックするため、トロ ンビン阻害剤が使用される。有用なトロンビン阻害剤はＮ−α−（２−ナフチル スルホニルグリシル）−Ｄ、Ｌ−アミジノフェニルアラニンピペリジド（α−Ｎ ＡＰＡＰ）およびヒルジンを含むがそれに限定されない。好ましい具体例におい ては、トロンビン阻害剤α−ＮＡＰＡＰが指示薬組成物と共に含められる。α− ＮＡＰＡＰは好ましくは約１０ｎＭないし約５０００ｎＭ、最も好ましくは約５ ００ｎＭないし約２０００ｎＭの範囲内にある。

本アッセイの随意ステップは、因子Ｘを因子Ｘａへ変換する反応の開始後固定時 点において停止剤をインキュベーション混合物へ加えることよりなる。この時間 は約０ないし６０分、最も好ましくは０ないし２０分の範囲にある。好ましい具 体例の停止剤組成物はカルシウムイオンを結合するキレータ−を含む緩衝組成物 である。典型的なキレータ−はＥＤＴＡまたはＥＧＴＨである。好ましい組成物 の停止剤組成物はトリス、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、塩化ナト リウム、およびアジ化ナトリウムを含む緩衝溶液である。代わってそして好まし い具体例においては、ＥＤＴＡは指示薬組成物と共に含められる。ＥＤＴＡは約 ２ｍＭないし１００ｍＭの範囲内、最も好ましくは約１０ｍＭないし２０ｍＭの 範囲内でなければならない、塩化ナトリウムは１０ｍＭないし１０００ｍＭの範 囲、最も好ましくは１００ｍＭないし４００ｍＭの範囲内でなければならないが 、しかしＮａＣ１は臨界的ではない。

加えて、４０５ｎｍにおけるＰ−ニトロアニリンまたは任意の他の測定可能産物 の出現率の測定に代えて、指示薬添加後一定時点においてクエン酸または酢酸の ような酸を加え、そして４０５　ｎｍまたは適切な波長における吸光度を読取る ことにより、エンドポイント分析を実施することができる。この時間は約０ない し５分および最も好ましくは約０ないし１分の範囲である。

他の随意ステップは、活性化タンパクＣに代えて天然タンパクＣを使用し、タン パクＣを蛇毒アクチベーターまたは他のタンパクＣアクナベ−ターを使用して活 性化することであろう、この方法はタンパクＣアクナベ−ターを添加し、そして タンパクＣを活性化するのに十分な時間インキュベートする余分のステップを必 要とするであろう。

タンパクＳアッセイの成分が多数回のそのようなアッセイの便利なそして日常的 な実施のためのキットとして提供できることが本発明の範囲内に意図される。出 発材料としての成分の濃度は上に指示されている。このアッセイキットは、サン プル中のｖｏｎＷｉｌＩｅｂｒａｎｄ囚子の作用を排除するのに因子な量の試薬 と、因子■のあらかじめ定めた量を一部分を不活性化するのに十分な量の好まし い具体例ではヒトソースからの活性化されたタンパクＣと、そして因子■の不活 性化を容易化するのに十分な量のリン脂質およびカルシウムイオンを収容してい る第１の容器、固定した既知量の因子■を収容している第２の容器、残存因子■ を活性化するのに十分な量の因子Ｕａおよびカルシウムイオンと、そして活性化 された因子■の存在下因子Ｘを因子Ｘａへ活性化するのに十分な量の因子Ｘおよ びＩＸａを収容している第３の容器、因子Ｘａと反応することができそして測定 可能な信号を発生するのに十分な量の指示薬と、そして因子Ｘａ活性に影響する ことなくトロンビン活性を阻害するのに十分な量のトロンビン阻害剤を収容して いる第４の容器、および任意に因子Ｘの因子Ｘａへの変換を停止するのに十分な 量の停止剤を収容する第５の容器よりなる。量は１回または複数回のタンパクＳ アッセイを実施するのに十分である。

本発明のアッセイの実施において、タンパク濃度、インキュベーシゴン時間、試 薬濃度および温度に大きな変動を採用し得る。特定のアッセイパラメーターの選 択はアッセイすべきサンプルのソース、タイプおよび寸法、その中に含まれてい るタンパクＳの予期されるレベル、そして所望の感度しきい値によって影響され るであろう。これらの状況を考慮に入れ、当業者にはアッセイパラメーターの選 択は自明であろう。好ましい具体例に従ってこのアッセイを当業者の誰でも実施 可能とするアッセイパラメーターは、以下の実施例に述べられている。

実施例１ 各ウェルへ、サンプル２５μ２．０．１６μ！−リス−（ヒドロキシメチル）ア ミノメタン（トリス）緩衝液ｐＨ８，０２５μ！。

出発試薬２５μｌを加えることによってマイクロタイタープレートを準備した。

出発試薬は、活性化ヒトタンパクＣ３０ｎＭ、リン脂質３０ｎＭ、塩化カルシウ ム１５ｎＭ、抗ｖｏｎ　Ｗｆｌｌｅｂｒａｎｄ因子１．４．Ｍ、０．０１６Ｍ） リス緩衝液ｐＨ８，０゜５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧン６０００．１％ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）および１２５ｍＭ　ＮａＣ１を含んでいる水復元 凍結乾燥製剤よりなっていた。ｖａｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子の作用を排除 するため、プレートを３７°Ｃで２分間インキュベートした。インキュベーシゴ ン後支持試Ｎ２５μｌを各ウェルへ加えた。支持試薬は、ウシ因子■０．２単位 ／１１１および０．０１６トリス緩衝液ＰＨ８，０，５％ＰＥＧ、１％ＢＳＡ、 ＮａＣ１２５ｍＭおよび塩化カルシウム１．０ｍＭを含有する水復元凍結乾燥調 製品からなっていた。プレートは次に３７°Ｃで５分間インキュベートした。そ の後メディエータ−試薬２５μ２を添加した。メディエータ−試薬はウシ因子Ｘ ａ約３００ｎＭ、ウシ因子Ｘ０２５μＭ、ウシ因子ＴＪ　ａ　１００μＭ、２− （Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）ＩＩ衝液、ｐＨ５，６，１０ｎ Ｍ、ＰＥ００．５％、Ｂ５Ａ１％およびＮａＣ１１２５ｍＭを含んでいる水復元 凍結乾燥調製物からなっていた。次にプレートは３７°Ｃで１分間インキュベー トした。インキュベーション後基質溶液１００μｌを添加した。基１を溶液は、 ＣＨＩ　０−Ｃｏ−Ｄ−ＣＨＡ−Ｇ　１　ｙ−Ａｒ　ｇ−ｐＮａｏ、４ｍＭ、） ロンビン阻害剤であるＮ−α−（２−ナフチルスルホニルグリシル）−Ｄ、Ｌ− アミジノフェニルアラニンピペリジド（α−ＮＡＰＡＰ）、ＥＤＴＡ　１５ｍＭ 、ＮａＣｌ　０．２５０Ｍおよび０．０２０ＭトリスｐＨ８を含んでいる水復元 凍結乾燥調製物よりなっていた０次にプレートは３７°Ｃで１分間インキュベー トした。このインキュページジン後ＩＭクエン酸５０ｕ１．を加え、分光光度計 を用いて４０５ｎｍにおける吸収を得た。

実施例２ 各ウェルへ、サンプル５０μｊｌ！、０．１６Ｍ）リス−（ヒドロキシメチル） アミノメタン（トリス）１１衝液ｐＨ８，０，出発試薬５０μｌを加えることに よりセミマイクロクベットを準備した。出発試薬は、活性化ヒトタンパクＣ３０ ｎＭ、リン脂質３０ｎＭ、塩化カルシウム１５ｍＭ、抗ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒ ａｎｄ因子１゜４μＭ、０．０１６Ｍ１−リス緩衝液ｐＨ８，０，５％ポリエチ レングリコール（ＰＥＧ）６０００．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および ＮａＣ１１２５ｍＭを含んでいる水復元凍結乾燥調製物からなっていた。ｖｏｎ 　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子の作用を除去するため、クベットを３７°Ｃで２分 間インキュベートした。インキュページジン後各ウェルへ支持試薬５０μｌを加 えた。支持試薬５０μｌを加えた。支持試薬は、ウシ因子■０．２単位／ｄ、０ ．１６Ｍトリス緩衝液ＰＨ８，０，５％ＰＥＧ、１％ＢＳＡ、１２５ｍＭ、Ｎａ Ｃ１および１．０ｍＭ塩化カルシウムを含んでいる水復元凍結乾燥調製物からな っていた。次にクベットを３７°Ｃで５分間インキュベートした。インキュベー ション後メディエータ−試薬５０μｌを添加した。メディエータ−試薬は、ウシ 因子ＩＸａ約３００ｎＭ、ウシ因子Ｘ約０．５μＭ、ウシ因子Ｉ［ａｌｏｏｎＭ 、１０ｎＭＭＥＳ緩衝液ｐＨ５，６，０，５％ＰＥＧ、１％ＢＳＡ、およびＮａ Ｃｌ　１２５ｍＭを含んでいる水復元凍結乾燥調製物からなっていた０次にクベ ットを３７℃で１分インキュベートした。インキュベーション後、基質溶液２０ ０μｌを加えた。基質溶液は、ＣＨｓ　０−Ｃｏ−Ｄ−ＣＨＡ−Ｇ　１　ｙ−Ａ ｒ　ｇ−ｐ　Ｎａ　約０．４ｍＭ、トロンビン阻害剤であるＮ−α−（２−ナフ チルスルホニルグリシル）　−Ｄ、Ｌ−アミノフェニルアラニンペピリジト（α −ＮＡＰＡＰ）、ＥＤＴＡ　１５ｍＭ、ＮａＣｌ　０．２５０Ｍおよび０゜２０ ＭトリスｐＨ８を含んでいる水復元凍結乾燥調製品であった。

クベット中の反応の動力学的測定は、基準添加直後４０５ｎＭにおける光学密度 を１分間読むことによって実施された。

実施例３ 各ウェルへ、サンプル５０μｆ、０．０１６Ｍ　）リス−（ヒドロキシメチル） アミノメタンｐＨ８，０５０μ！、および出発試薬５０μｌを加えることにより セミマイクロクベットを準備した。

出発試薬は、活性化ヒトタンパクＣＣ５０ｎ、リン脂質３０μＭ。

塩化カルシウム１５ｍＭ、抗ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子１、゛４μＭ、 ０．０１６Ｍｌ４μス緩衝液ｐｌ（ａ、ｏ、５％ポリエチレングリコール（ＰＥ Ｇ）、１％ＢＡＳおよびＮａＣ１１２５ｍＭを含んでいる水復元凍結乾燥調製物 からなっていた。ｖｏｎＷｉ１１ｅｂｒａｎｄ因子の作用を排除するため、クベ ットを３７℃で２分間インキュベートした。クベットへタンパクＣを活性化する のに十分て量の蛇毒アクチヘーターを加えた。インキュベーション後各ウェルへ 支持試薬５０μ！を加えた。支持試薬は、ウシ因子■０．２単位／ｄ、０．１６ Ｍトリス緩衝液ｐＨ８，０，５％ＰＥＧ。

１％ＢＳＡ、１２５ｍＭ　ＮａＣ１および１．０ｍＭ塩化カルシウムを含んでい る水復元凍結乾燥調製物からなっていた。次にクベットを３７℃で５分間インキ ュベートした。インキュベーション後メディエータ−試薬５０μｌを添加した。

メディエータ−試薬は、ウシ因子ＩＸａ約３００ｎＭ、　ウシ因子Ｘ約０．５μ Ｍ、　ウシ因子ＩＩａ１００ｎＭ、１０ｎＭ　ＭＥＳ緩衝液ｐＨ５，６，０，５ ％ＰＥＧ、１％ＢＳＡ、およびＮａＣ１１２５ｍＭを含んでいる水復元凍結乾燥 調製物からなっていた。次にクベットを３７℃で１分インキュベートした。イン キュベーション後、基質溶液２００μｌを加えた。基質溶液は、ＣＨｙ　０−Ｃ ｏ−Ｄ−ＣＨＡ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ａｒ　ｇ　−ｐＮａ　約０．４ｍＭ、トロンビン 阻害剤であるＮ−α−（２−ナフチルスルホニルグリシル）−Ｄ、Ｌ−アミノフ ェニルアラニンベピリジト（ｃｒ−ＮＡＰＡＰ）、ＥＤＴＡ　Ｉ　５ｍＭ、Ｎａ 　ＣＩ　０．２５０Ｍおよび０．２０ＭトリスｐＨ８を含んでいる水復元凍結乾 燥調製品であった。クベット中の反応の動力学的測定は、基準添加直後４０５ｎ Ｍにおける光学密度を１分間読むことによって実施された。

実施例４ ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子を結合する試薬（抗ｖａｎＷｉｌｌｅｂｒａ ｎｄ因子抗体）およびｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子の作用を排除するため のインキュベーションステップを省略し、添加する因子■がｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅ ｂｒａｎｄ因子を結合しない変異因子■であることを除き、実施例１を繰り返す 。

実施例５ ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子を結合する試薬（抗ｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａ ｎｄ因子抗体）およびｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子の作用を排除するため のインキュベーションステップを省略し、添加する因子■がｖａｎ　Ｗｊｌｌｅ ｂｒａｎｄ因子を結合しない変異因子■であることを除き、実施例２を繰り返す 。

実施例６ ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子を結合する試薬（抗ｖｏｎＷｉ　ｌ　１ｅｂ ｒａｎｄ因子抗体）およびｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子の作用を排除する ためのインキュベーションステップを省略し、添加する因子■がｖｏｎ　Ｗｉｌ ｌｅｂｒａｎｄ因子を結合しない変異因子■であることを除き、実施例３を繰り 返す。

国際調査報告　５．Ｔ／ＩＩｃ　Ｏ，／ｌ’１ＱＱ７＋６ｒＴ／ＩＩ（Ｑ）／ｎ ＱＱフ１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ａ）妨害物質の作用を排除し、 ｂ）サンプルを、活性化したタンパクＣ，因子ＶＩＩＩ，リン脂質およびカルシ ウムイオンとインキュベートし、ｃ）混合物を、因子ＩＩａ，ＩＸａおよびＸと インキュベートし、ｄ）インキュベーション混合物へ因子Ｘａ特異性基質を添加 し、 ｅ）機能的タンパクＳの測定として基質の開裂によって生成した指示薬の量を測 定することよりなるタンパクＳ含有サンプル中の遊離もしくは機能的タンパクＳ のレベルの決定方法。 ２．ａ）タンパクＳ含有サンプルを、（１）タンパクＳ含有サンプル中に存在す る実質的にすべてのｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子の作用を排除する試薬、 （２）因子ＶＩＩＩの固定量の一部分を不活性化するのに十分な量のタンパクＣ ，（３）リン脂質，および（４）因子ＶＩＩＩの不活性化を容易化するのに十分 な量のカルシウムイオンと混合し、 ｂ）混合物をｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子の作用を排除するのに十分な時 間インキュベートし、ｃ）インキュベーション混合物を因子ＶＩＩＩのあらかじ め定めた量と混合し、 ｄ）混合物を因子ＶＩＩＩの一部分を不活性するのに十分な時間インキュベート し、 ｅ）インキュベーション混合物を、残りの因子ＶＩＩＩを活性化するのに十分な 因子ＩＩａおよびカルシウムイオン、および因子Ｘを活性化された因子ＶＩＩＩ の存在下活性化するのに十分な量の因子ＩＸａが存在するように、因子ＩＩａ， 因子ＩＸａ，因子Ｘおよびカルシウムイオンと混合し、 ｆ）混合物を因子Ｘの一部分が因子Ｘａに変換されるまでインキュベートし、 ｇ）インキュベーション混合物へ因子Ｘａ活性へ影響することなくトロンビン活 性を阻害するのに十分な量のトロンビン阻害剤を添加し、 ｈ）インキュベーション混合物へ因子Ｘａと反応することができる指示薬を添加 し、 ｉ）信号分子を測定する ことよりなるタンパクＳ含有サンプル中のタンパクＳのレベルを決定する方法。 ３．因子ＶＩＩＩに対するｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子の作用を排除する ための試薬は、抗ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子抗体、ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅ ｂｒａｎｄ因子へ結合する不活性化因子ＶＩＩＩ，ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎ ｄ因子へ結合する因子ＶＩＩＩフラグメント、因子ＶＩＩＩとのｖｏｎ　Ｗｉｌ ｌｅｂｒａｎｄ因子相互作用を防止する合成ペプチド、または生成タンパク分解 産物が因子ＶＩＩＩへ結合しないようにｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子をタ ンパク分解する酵素からなる群から選ばれる請求項２の方法。 ４．因子ＩＩａ，ＶＩＩＩ，ＩＸａおよびＸは動物源より得られる請求項２の方 法。 ５．因子ＩＩａ，ＶＩＩＩ，ＩＸａおよびＸは宿主細胞ラインへ伝播された組換 えベクターから得られる請求項２の方法。 ６．因子ＶＩＩＩは、ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子が因子ＶＩＩＩを結合 しないように宿主細胞ラインへ伝播された組換えベクターから得られ、それによ りステップａ）およびｂ）が排除される請求項２の方法。 ７．指示薬は発色原物質である請求項２の方法。 ８．指示薬はＣＨ３ＯＣＯ−Ｄ−ＣＨＡ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＰＮＡである請求項 ２の方法。 ９．トロンビン阻害剤は、Ｎ−α−（ナフチルスルホニルグリシル）−Ｄ，Ｌ− アミジノフェニルアラニンピペリジドである請求項２の方法。 １０．信号分子はｐ−ニトロアニリンである請求項２の方法。 １１．リン脂質は、フォスファチジルセリン５ないし４０モル％，コレステロー ル０ないし２０モル％，フォスファチジルコリン５０ないし９０モル％よりなる 請求項２の方法。 １２．リン脂質は、フォスファチジルセリン２０モル％，およびフォスファチジ ルコリン８０モル％よりなる請求項２の方法。 １３．ステップｇ）の指示薬は反応停止剤組成物を含有し、反応停止剤組成物は 因子Ｘの因子Ｘａへの変換を防止するのに十分な量で添加される請求項２の方法 。 １４．反応停止剤組成物はエチレンジアミンテトラ酢酸を含んでいる請求項１３ の方法。 １５．指示薬添加後固定時点において、インキュベーション混合物へタンパク媒 介反応を停止する酸を加える付加ステップを含んでいる請求項１３の方法。 １６．酸は酢酸およびクエン酸よりなる群から選ばれる請求項１５の方法。 １７．因子Ｘを因子Ｘａへ変換する反応開始後固定時点において反応停止剤組成 物を添加するステップを含み、反応停止剤組成物は因子Ｘの因子Ｘａへの実質上 すべての変換を防止するのに十分な量である請求項２の方法。 １８．反応停止物質はエチレンジアミンテトラ酢酸を含んでいる請求項１７の組 成物。 １９．インキュベーションステップ（ｆ）はすべての因子Ｘが因子Ｘａへ変換さ れるまで継続される請求項２の方法。 ２０．ａ）タンパクＳ含有サンプルを、（１）タンパクＳ含有サンプル中に存在 する実質上すべてのｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子の作用を排除する試薬、 （２）因子ＶＩＩＩの固定量の一部分を不活性化するのに十分な量のタンパクＣ ，（３）リン脂質、および（４）因子ＶＩＩＩの不活性化を容易化するのに十分 な量のカルシウムイオンと混合し、 ｂ）混合をｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子の作用を排除するのに十分な時間 インキュベートし、 ｃ）混合物を、タンパクＣを活性化するのに十分な量の蛇毒アクチベーターと混 合し、 ｄ）混合物をタンパクＣを活性化するのに十分な時間インキュベートし、 ｅ）インキュベーション混合物をあらかじめ定めた量の因子ＶＩＩＩと混合し、 ｆ）混合物を因子ＶＩＩＩの一部分を不活性するのに十分な時間インキュベート し、 ｇ）インキュベーション混合物を、残りの因子ＶＩＩＩを活性化するのに十分な 因子ＩＩａおよびカルシウムイオン、および因子Ｘを活性化された因子ＶＩＩＩ の存在下活性化するのに十分な量の因子ＩＸａが存在するように、因子ＩＩａ， 因子ＩＸａ，因子Ｘおよびカルシウムイオンと混合し、 ｈ）混合物を因子Ｘの一部分が因子Ｘａへ変換されるまでインキュベートし、 ｉ）インキュベーション混合物へ、因子Ｘａ活性に影響することなくトロンビン 活性を阻害するのに十分な量のトロンビン阻害剤を添加し、 ｊ）インキュベーション混合物へ因子Ｘａと反応することができる指示薬を添加 して信号分子を遊離させ、ｋ）信号分子を測定する ことよりなるタンパクＳ含有サンプル中のタンパクＳのレベルを決定する方法。 ２１．ａ）サンプル中のｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子の全部の因子ＶＩＩ Ｉに対する作用を排除するのに十分な量の試薬、あらかじめ定めた量の因子ＶＩ ＩＩの一部分を不活性するのに十分な量のタンパクＣ、および因子ＶＩＩＩの不 活性化を容易化するのに十分な量のリン脂質およびカルシウムイオンを収容した 第１の容器、ｂ）固定量の因子ＶＩＩＩを収容した第２の容器、ｃ）残りの因子 ＶＩＩＩを活性化するのに十分な量の因子ＩＩａおよびカルシウムイオン、およ び活性化された因子ＶＩＩＩの存在下因子Ｘを因子Ｘａへ活性化するのに十分な 量の因子Ｘおよび因子ＩＸａを収容した第３の容器、 ｄ）因子Ｘａと反応することができる十分な量の指示薬、および因子Ｘａ活性に 影響することなくトロンビン活性を阻害するのに十分な量のトロンビン阻害剤を 収容した第４の容器よりなるサンプルのタンパクＳアッセイを実施するためのキ ット。 ２２．第４の容器はまた、因子Ｘの因子Ｘａへの変換を防止するのに十分な量の 反応停止剤組成物を含んでいる請求項２１のキット。 ２３．指示薬は、酵素、放射性、螢光または発色原指示薬よりなる群から選ばれ る請求項２１のキット。 ２４．指示薬は発色原である請求項２１のキット。 ２５．指示薬はＣＨ３ＣＯ−Ｄ−ＣＨＡ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡである請求項 ２１のキット。 ２６．因子ＩＩａ，ＶＩＩＩ，ＩＸａおよびＸは動物源より得られる請求項２１ のキット。 ２７．因子ＩＩａ，ＶＩＩＩ，ＩＸａおよびＸは、宿主細胞ラインに伝播された 組換えベクターより得られる請求項２１のキット。 ２８．ａ）サンプル中のｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子の全部の因子ＶＩＩ Ｉに対する作用を排除するのに十分な量の試薬、あらかじめ定めた量の因子ＶＩ ＩＩの一部分を不活性するのに十分な量のタンパクＣ、および因子ＶＩＩＩの不 活性化を容易化するのに十分な量のリン脂質およびカルシウムイオンを収容した 第１の容器、ｂ）固定量の因子ＶＩＩＩを収容した第２の容器、ｃ）残りの因子 ＶＩＩＩを活性化するのに十分な量の因子ＩＩａおよびカルシウムイオン、およ び活性化された因子ＶＩＩＩの存在下因子Ｘを因子Ｘａへ活性化するのに十分な 量の因子Ｘおよび因子ＩＸａを収容した第３の容器、 ｄ）因子Ｘの因子Ｘａへの変換を停止するのに十分な量の反応停止剤を収容して いる第４の容器、 ｅ）因子Ｘａと反応することができる十分な量の指示薬、および因子Ｘａ活性に 影響することなくトロンビン活性を阻害するのに十分な量のトロンビン阻害剤を 収容した第５の容器からなるサンプルのタンパクＳアッセイを実施するためのキ ット。 ２９．反応停止物質はエチレンジアミンテトラ酢酸を含んでいる請求項２８のキ ット。