JPH06505160A

JPH06505160A - 殺生物性蛋白質

Info

Publication number: JPH06505160A
Application number: JP4506033A
Authority: JP
Inventors: デ・ボル，ミゲル; ブロケルト，ウイレム，フランス; カムエ，ブルノー，フイリツプ，アンジエロ; ヴアンデルレイデン，ヨセフ; リース，サラ，ブランウエン
Original assignee: ゼネカ・リミテッド
Priority date: 1991-03-11
Filing date: 1992-03-10
Publication date: 1994-06-16
Anticipated expiration: 2018-05-26
Also published as: CA2106092A1; BR9205760A; DK0576483T3; US5689048A; WO1992015691A1; DE69232005D1; EP0576483B1; AU1366492A; US5942663A; DE69232005T2; AU652430B2; ATE204328T1; EP0576483A1; ES2162796T3; US5482928A; JP3410734B2; NZ241910A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】殺生物性蛋白質本発明は殺生物性蛋白質（ｂｉｏｃｊｄａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ）、その製造方法及び使用方法及びこれをコードするＤＮＡ配列に関する。特に、本発明は５ｐｅｃｉｅｓ）からなり、その多数のものが庭園植物としてのその観賞的偏値のために栽培されている。ミラビリス　ヤラパ（Ｍｉｒａｂｉｌｉｓｊａｌａｐａ）はオシロイバナ（−ｆ□ｕｒ　ｏ°Ｃ１ｏｃｋ＋又は＋ｍａｒｖｅｌ　ｏｆ　Ｐｅｒｕ−）として一般的に知られており、白色、黄色又は赤色の花を有する。

組ヤラバの塊根（ｔｕｂｅｒｏｕｓ　ｒｏｏｔ）はヤラッパＵａｌａｐ）の代替品として使用される瀉下剤（ｐｕｒｇａｔｉｖｅ　ｄｒｕｇ）の供給源である。

植物は、通常、菌類生物（ｆｕｎｇａｌ　ｏｒｇａｎｉｓ■）に著しく冨む基質（ｓｕｂｓｔ　ｒａｔｅ）上で成長するが、感染した状態にあることが希にある。

潜在的な侵入物（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　１ｎｖａｄｅｒ）を排斥するために、植物はその構成要素として又は誘導可能な形で、広い範囲の抗菌性化合物を産生ずる。これらの抗菌性化合物の中で最も研究されているものはフィトアレキシン、即ち、適当な防御関連信号分子（ｄｅｆ’ｅｎｃｅ−ｒｅｌａｔｅｄ　ｓｉｇｎａｌ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の知覚（ｐｅｒｃｅｐｔｉｏｎ）に基づいて特異的に合成される、広範囲の抗菌活性を有する二次代謝産物（ｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏ　ｌ　ｉ　ｔｅ）である。フィトアレキシンの産生は、フィトアレキシン生合成経路の酵素をコードする一連の遺伝子の転写活性化（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）に基づいている。しかしながら、最近の１０年間に幾つかの植物蛋白質は植物病原性菌類（ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｊｃ　ｆｕｎｇｉ）の制御においてより直接的な役割を果たし得ることが次第に明らかになった。現在では、キチナーゼ、ベーター−１，３−グルカナーゼ、リポソーム−不活性化蛋白質、チオニン（ｔｈｆｏｎｌｎ）　、キチン結合レクチン（ｃｈｉｔｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｉｅｃｔｉｎ）及びゼアマチン（ｚｅａａａｔｉｎ）を包含する、抗菌性を有する種々の蛋白質が確認されている。

日本たばこ産業株式会社（Ｊａｐａｎ　Ｔｏｂａｃｃｏ　Ｉｎｃ）の研究者は以前にミラビリス　ヤラバ懸濁細胞（最初、葉から誘導されたカルス）から及び根及び葉の組織から抗ウイルス性蛋白質を抽出している（Ｔｓｕｔｏｍｕ　Ｉｋｅｄａ等：　１９８７：　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ、８．２１Ｂ− ２１８）　、この“ミラビリス抗植物ウィルス蛋白質″″（”Ｍｌｒａｂｉｌｉｓ　ａｎｔｉ−ｐｌａｎｔｖｉｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ”）　（ＭＡＰ）は２４　ＫＤａの分子量を有する。ＭＡＰのアミノ酸配列は決定されており、２５０アミノ酸からなる。７５９塩基対の合ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２Ｂ４（１２）、６Ｂ２９−８８３７）　、下記の特許が許可すｔＬテイル：　Ｊ８８０８１３１７　及ヒＵＳ４７０１５２２１：：ヨリミラヒ’）　７．　ＭＡＰ蛋白質抽出物が保護されている。　Ｊ８７０２７７９７にょリカルスを培養することによるＭＡＰの製造が保護されている。下記の特許出願も行われている：カルス細胞をクローニングすることにより得られるＭＡＰに抗ウイルス性ペプチド（ＮＯＧ−２２）についてのＪＯ１２９４８９４、同様の合成ペプチド（ＮＯＧ−５３）についてのＪＯ１２９４Ｂ９３及び抗ウイルス性蛋白質をコードする遺伝子についてのＥＰ４１４１３４゜更に日本たばこ産業株式会社はブーゲンビレア（Ｂｏｕｇａｉｎｖｉ　Ｉ　１ｅａ）　（ミラビリスと同一の密接に関連する科）から抽出された２種の抗ウイルス性蛋白質を保護するための特許出願を行っている：　ＢＡＰ−１は３３　ｋＤａの分子量を有しており（ＪＯ１２７２５９ｇ）　、ＢＡＰ−２は約３０ｋＤａの分子量を有している（Ｊ０１２７２５９９）。

今般、本発明者は新規な種類の重要な抗菌性蛋白質を精製した。

本発明によれば、ミラビリスの種子から単離することができる抗菌性蛋白質（ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｐｒｏｔｅ［ｎ）が提供される。

別の要旨によれば、本発明は本発明による蛋白質をコードするｉ　ＤＮＡ配列を含有するベクターを包含する。このＤＮＡはコードされた（ｅｎｃｏｄｅｄ）蛋白質の発現を可能にする生物学的な系にクローンするか又は形質転換し得る。

本発明は、更に、本発明による抗菌性蛋白質をコードする組換え体ＤＮＡを使用して形質転換した植物も包含する。

本発明は、更に、菌類（ｆｕｎｇｉ）又はバクテリア（ｂａｃｔｅｒｉａ）を本発明による蛋白質に暴露することにより菌類又はバクテリアを撲滅する方法も包含する。

新規な種類の強力な（＋）ｏｔｅｎｔ）抗菌性蛋白質をミラビリス　ヤラパの種子から単離した。この種の蛋白質は以下において、それぞれ、Ｍｊ−ＡＭＰＩ　［ミラビリス　ヤシパー抗菌性蛋白質１　（Ｍｉｒａｂｉｌｌｓｐｒｏｔｅｉｎ　２　）　］と称する蛋白質因子（ｐｒｏｔｅｆｎ　ｆａｃｔｏｒ）を有する。

両者共、二量体状蛋白質である；Ｍｊ−ＡＭＰＩは２個の４　ｋＤａサブユニットからなす、Ｍｊ−ＡＭＰ２は２個の３．５　ｋＤａサブユニットからなる。その起源にかかわらず、これらの蛋白質の一次構造（＋）ｒｌｉａｒｙｓｔ　ｒｕｃｔｕｒｅ）は他の全ての既知の植物蛋白質と異なり、無を椎動物の毒液中に見出だされる昆虫神経毒との相同性を示す。Ｍｊ−ＡＭＰＩとＭｊ−ＡＭＰ２のアミノ酸配列は決定されている。これらのアミノ酸配列は標準ペプチドシンセサイザー（ｐｅｐｔｉｄｅ　ｓｙｒ＋ｔｈｅｓｉｓｅｒ）を使用して蛋白質を製造することを可能にしている。

Ｍｊ−ＡＭＰＩとＭｊ−＾ＭＰ２をコードするｃＤＮ＾を単離し、配列決定を行った。このＤＮＡは標準核酸シンセサイザーを使用して製造することができ、或いは、適当なプローブ（既知の配列から誘導）を使用して植物ゲノムから実際のＭｊ−ＡＭＰ遺伝子と制御配列を単離し得る。ついでこの遺伝物質を構造プロモーター（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ　ｐｒｏｓｏｔｅｒ）又は誘導性プロモーター（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の制御下での蛋白質の発）　現を可能にする生物学的系にクローンし得る。従って、蛋白質を適当な微生物又は培養細胞（ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｃｅｌｌ）中で製造し、抽出しついで単離して使用し得る。適当な微生物としては大腸菌及びシュウトモナス（Ｐｓｅｕｄｏｓｏｎａｓ　）が挙げられる。適当な細胞としては培養昆虫細胞及び培養哺乳動物細胞が挙げられる。このＤＮＡを使用して既知の方法により任意の植物種を形質転換し、その結果、抗菌性蛋白質をこの植物内で発現させることができる。

本発明による植物細胞は、本発明による構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を使用して多数の既知の方法［アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｓ　）ＴＩ　プラスミド、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｌｏｎ）　％フィクロインジェクション（■１ｃｒｏｉｎｊｅｃｔ１ｏｎ）、マイクロプロジェクテイルガン（ｓｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｌｌｅ　ｇｕｎ）等〕により形質転換し得る。ライで、適当な場合には、形質転換細胞を全植物（ｗｈｏｌｅ　ｐｌａｎｔ）中で再生させ、この植物内に新規な核物質をゲノム中に安定に組込むことができる。この方法によりモノコツト（−ｏｎｏｃｏｔ）及びジコット（ｄｌｃｏｔ＞植物を得ることができるが、通常、後者の方が再生がより８昆である。

本発明に従って遺伝的に修飾した（ｇｅｎｅｔｉｃａｌ　Ｉｙ　５ｏｄｉｒｉｅｄ）植物の例としては次のものが挙げられるニドマド、マンゴ−、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ及びメロンのごとき果実；カノラ（ｃａｎｏｌａ）、ヒマワリ、タバコ、テンサイ、小麦、大麦及び米のごとき小粒穀類、トウモロコシ及び綿のごとき屋外作物（ｆｉｅｌｄ　ｃｒｏｐ）　；及びニンジン、レタス、キャベツ及びタマネギのごとき野菜。

町−ＡＭＰ蛋白質は広範囲の抗菌活性を示し、グラム陽性バクテリアに対しても活性である。旧−＾ＨＰ蛋白質は植物体部分に適用することにより殺菌剤又は抗生物質として使用し得る。その抗菌活性は塩依存性（ｓａｌｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）であり、組成中に存在するイオンの種類と濃度により変動し得る。特に、抗菌活性はカチオンの存在によって低下するようである。Ｍｊ−ＡＭＰ蛋白質は植物体内で発現させることにより菌類及びバクテリアを撲滅するのにも使用し得る。

Ｍｊ−ＡＭＰ蛋白質はミラビリス　ヤラバ種子から単離し、精製するか、その既知のアミノ酸配列から人工的に合成するか又は組換え体ＤＮＡの発現により適当な微生物内で製造し得る。この蛋白質はトランスジェニック植物（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｊａｎｔ）内でも発現させ得る。

本発明は図面を参照することにより更に理解されるであろう：図ＩＡは抗菌性蛋白質についてのゲル濾過クロマトグラムとこれに付随する菌成長抑制率についてのグラフを示す。

図ＩＢは抗菌性蛋白質についてのカチオン交換クロマトグラムとこれに付随する菌成長抑制率についてのグラフを示す。

図２Ａは精製Ｍｊ−ＡＭＰＩのＨＰＬＣプロフィールを示す。

図２Ｂは精製Ｍｊ−ＡＭＰ２のＨＰＬＣプロフィールを示す。

図３は精製抗菌性蛋白質の５Ｏ９−ＰＡＧＥ分析を示す。

図４ＡはＭｊ−ＡＭＰＩとＭｊ−ＡＭＰ２の完全アミノ酸配列を示す：差異は矢印によって示されている。

図４Ｂは神経毒のアミノ酸配列と並列させた、Ｍｊ−ＡＭＰＩとＭｊ−ＡＭＰ２のアミノ酸配列を示す。

図５は抗菌性蛋白質の濃度を変化させて測定した、時間依存性成長抑制率曲線を示す。

図６はクローンＭＪ　１　（Ｍｊ−ＡＭＰＩ）のヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列（ｄｅｄｕｃｅｄ　ａｇｏｎｏ　ａｃｉｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）を示す０図７はクローンＭＪ２（Ｍｊ−ＡＭＰ２）のヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列を示す。

１１１Ｊ８は発現ベクターｐＭＤＢＩの構成（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）を示す。

図９はｐＢｌｎＲＩの構成を示す。

図１０は植物形質転換ベクターｐＭＤＢ２の構成を示す。

図１１はｐＶＴＯの構成を示す。

図１２は植物形質転換ベクターｐＶＴ１の構成を示す。

図１３は植物形質転換ベクターｐＶＴ２の構成を示す。

以下の実施例は本発明を例示するものである。

実施例　ＩＣｈｉｌｔｅｒｎ　５ｅｅｄｓから購入）をコーヒーミル中で粉砕し、得られた粗い粉末を、ｌＯｍＭ（７）ＮａＨＰＯ１５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、ｌｏｏｓＭのＫＣｆｆ　。

２４ゝ２ｇＭのＥＤＴＡ、　２ｇＭのチオ尿素、１ｇＭのＰＭＳＦ及び１ｍｇ＃！のロイペプチンを含有する水冷抽出緩衝液（ｅｘｔｒａｃｔｌｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ）　２４７を使用して４℃で２時間抽出した。ホモジネート（ｈｏｌｏｇｅｎａｔｅ）をチーズクロス（ｃｈｅｅｓｅｃｌｏｔｈ）を通して絞り、遠心分離により清澄化した（５０００　ｘ　ｇで５分間）。上澄液に固体硫酸アンモニウムを添加して相対飽和度（ｒｅｌａｔｆｖｅ　５ａｔｕｒａｔｉｏｎ）を３５％とし、室温で１時間放置後に生成した沈殿を遠心分離により除去した（５０００　ｘ　ｇで１０分間）。

上澄液の硫酸アンモニウムの相対飽和度を６５％に調節しついで室温で一夜放置して生成した沈殿を遠心分離により捕集した（５０００　ｘ　ｇて３０分間）。

ペレットを１ｈＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６）に再度溶解させた後、溶液を７５℃で１０分間加熱した。凝集した不溶性物質を遠心分離の後に排棄しく５０００　ｘ　ｇで２０分間）、上澄液を２００００ａの分子量カットオッフ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｃｕｔ　ｏｆＴ）を有するベンゾイル化セルロースチューブ（ｂｅｎｚｏｙｌａｔｅｄ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ｔｕｂｌｎｇ）（Ｓｉｇｏ＋ａ）を使用して蒸留水に対して長時間（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙ）透析した。透析後、１０倍に濃縮した緩衝液（ｔｅｎ（ｏｌｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｒｅｄ　ｂｕｆＴｅｒ）を添加することにより溶液を５０　ｍＭ　Ｔｒｌｓ−ＨＣＲ（ｐＨ９）に調整し、ついで、５０ｄ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＲ（ｐＨ９＞と平衡なＱ−セフ７０−スフ７ストフロー（Ｑ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ）カラム（Ｐｈａｒｓａｃｉａ）（１２ｘ　５　ｃｌｌ）上を通過させた。７５％の相対飽和度になるまで硫酸アンモニウムを添加することにより非結合フラクション（ｕｎｂｏｕｎｄ　ｆｒａｃｔｉｏｎ）中の蛋白質を沈殿させた。沈殿を遠心分離により捕集しく５０００　、　ｇで２０分間）、ペレットを１５１の燐酸塩緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆ’ｆｅｒｅｄ　５ａｌｉｎｅ）（ＰＢＳ）に再溶解させた。この材料によりＭセラ３種子の塩基性熱安定性蛋白質フラクションが提供され、これをＨヤラパ抗菌性蛋白質の単離と精製のための出発原料として使用した。

実施例　２抗菌活性の評価。

抗菌活性は従来の文献（Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ　、　ＷＦ等：１９９０；ＦＥＭＳ　ＭｔｃｒｏｂｉｏｌＬｅｔｔ　、　８９　、５５−６０）に記載されているごとき顕微分光分析（ｍｉｃｒｏｓｐｅｃｔｒａｐｈｏｔｏｍｅｔｒいにより測定した。試験は、慣用的に、２０ｄｇの（フィルター−殺菌）試験溶液と、１／２濃度の（ｈａｌｆＳｔｒｅｎｇｔｈ）馬鈴薯デキストロースブロス（Ｐｏｔａｔｏ　Ｄｅｘｆｔｒｏｓｅ　Ｂｒｏｔｈ）（Ｄｌｆｃｏ）中の菌胞子懸濁液（胞子数２　ｘｉ（１’　／１ｉｌｌ　）　８Ｑｔｔ（ｌを使用して行った。対照ミクロ培養液（ｃｏｎｔｒｏｌ　ｗｉｃｒｏｃｕｌｔｕｒｅ）は２０μＮの（殺菌）蒸留水と８０ｄｇの菌胞子懸濁液を含有していた。特に説明がない限り、供試微生物はフサリウム　クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍｃｕｌｇｏｒｕｉ）であり、インキュベーションは２５℃で４８時間行った。生長抑制率（％）は５９５ｎａ＋における対照ミクロ培養液の修正吸光度（ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ　ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）に対する、対照ミクロ培養液の修正吸光度から供試ミクロ培養液の修正吸光度を差し引いたものの比のＬＯＯ倍と定義される。修正吸光度値は４８時間後に測定した培養液の５９５μｍでの吸光度から、３０分後に測定した５９５ μｗでの吸光度を差し引いたものに等しい。１０％より低い生長抑制率の値はクロマトグラムに示されない。

実施例　３種子から抽出した塩基性熱安定性蛋白質フラクションを使用した。

図１＾には抗菌性蛋白質をゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した結果が示されている。１−のフラクションを予めＰＢＳで平衡化したスーパーロース−１２（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ−１２）カラム（５０ｘ　１．８　ｃｍ）上に充填した。

移動緩衝液（ｒｕｎｎｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ）はＰＢＳであり、その流率はＬｍ（１／分であった。溶出液を２８ｏｎ−での吸光度について監視し、２．５−ｇフラクションを捕集し、その２μｇを実施例２で記載した顕微分光分析による抗菌活性の評価に使用した（その結果は図ＩＡの上方パネルに示されている）。分画の際に、混合物は３個のピークに分離しくｒｅｓｏｌｖｅ＞　、それによって、抗菌活性は最も遅延したピーク（ｍｏｓｔ　ｒｅｔａｒｄｅｄ　ｐｅａｋ）と共に共溶層（ｅｏｅｌｕｔｅ）　した。抗菌活性を含有するフラクション（上記した最も遅延したピークからの材料）を集め、５０１ＭのＮａ−ＭＥＳ（ｐＨ５）に対して透析しついでカチオン交換クロマトグラフィーにかけた。３つの平行的なゲル濾過クロマトグラフィー操作からのものを一緒にした活性フラクションを、５０畦のＮａ−ＭＥＳ（ｐＨ５）で平衡化したＳ−セファロース高性能カラム（Ｓ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｔ’ｏｒｉａｎｃｅ　ｃｏｌｕＩｎ）　（１０ｘ　Ｌ、Ｓ　ｃＩｌ）上に充填した。カラムの溶離は全体で４５０　１ＩｆｌのＮａ−ＭＥＳ（１）Ｈ５）を使用しかっＮａＣ９の濃度を軸Ｍから１５０ｍＭまで直線的な勾配で変動させて、３ｉｊ７／分の速度で行った。溶出液は２８０ｎ■での吸光度を測定することにより蛋白質について監視しくその結果は図ＩＢの下方パネルに示されている）　、１５１１（ｌのフラクションを捕集し、その２μｇを顕微分光分析による抗菌活性評価試験で試験した（その結果は図ＩＢの上方パネルに示されている）。非結合フラクション（ｕｎｂｏｕｎｄｆｒａｃｔｉｏｎ）では抗菌活性は認められなかった。ＮａＣ１の濃度を直線的な勾配で変動させることにより抗菌活性を有する２種の因子（ｆａｃｔｏｒ）が分離された。Ｍｊ−ＡＭＰＩ　［ミラビリス　ヤシバー抗菌性蛋白質１　（ＭｉｒａｂＮｊｓ　ｊａｌａｐａ−ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｐｒｏｔｅｔｎ　１）　］　と称される第１の因子は５（ｌ　ｍＭ付近のＮａＣ１濃度で主ピークとして溶離され、これに対して、同様にＭｊ−ＡＭＰ２と称される第２の因子は１００叶のＮａＣｆｆ濃度て溶離された。

単離した抗菌活性因子の純度を逆相クロマトグラフィーにより確認した。２００ μｇの量のＭｊ−ＡＭＰｌ及び２００μｇの量のＭｊ−ＡＭＰ２を０．１％ＴＦＡで平衡化したＰｅｐ−３（多孔質シリカＣ２１Ｃ１８）カラム（２，５ｘ　Ｏ，４ｃ＋ａ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に充填することにより、精製Ｍｊ−ＡＭＰのＨＰＬＣプロフィールを得た。カラムの溶離は１−７分の速度でかつ下記の濃度勾配で行った（溶剤Ｂは０．１％ＴＦ＾を含有するメタノールであル）：　０−１分、８０％；　ｌ−３分、Ｂ　０−３０　％　：　３−２３分、Ｂ　３０ −８０％：２３−２５分、Ｂ　８０−１００％。溶出液は２８０ｄｍでの吸光度を測定することにより蛋白質について監視した。溶出液の１　ｓｊｌのフラクションを捕集し、凍結乾燥し、最後に１００μｇの蒸留水に溶解させた；その２０ｄｇを顕微分光分析による抗菌活性評価試験で使用した。クロマトグラフィーはウォータース（Ｗａｔｅｒｓ）　８００　ＨＰＬＣステーション上で行った。

図２Ａ及び図２Ｂに、それぞれ、精製Ｍｊ−ＡＭＰＩ及びＭｊ−ＡＭＰ２のＨＰＬＣプロフィールが示されている。下方パネルには２８０止での吸光度を測定することによる溶出液の蛋白質についての監視結果が示されている。顕微分光分析による抗菌活性評価の結果は上方パネルに示されている。Ｍｊ−ＡＭＰＩ及びＭｊ−ＡＭＰ２の両者から、抗菌活性と共に正確に共溶層される、単一の、十分に分離された（ｒｅｓｏ　Ｉ　ｖｅｄ　）主ピークが得られた。

実施例　４精製抗菌性蛋白質の分子構造。

更に、Ｍｊ−ＡＭＰｓの分子構造を分析した。ファストシステム（ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ）　（Ｐｈａｒｓａｃｉａ）電気泳動装置を使用して、プレキャストした市販のゲル［ファストゲル　ハイ　デンシティ（ＰｈａｓｔＧｅｌ　Ｈ４ｇｈＤｅｎｓ１ｔｙ）、Ｐｈａｒｍ；ＩＣｊ２製〕上製電上泳動を行った。試料緩衝液（ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒ）は２００　ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ８り、１％（ｖ／ｖ）のＳＤＳ　。

１ｍＭのＥＤＴＡ、　０．００５％のブロムフェノールブルー及び、特に説明のない限り、１％（ｗ／Ｖ）のジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含有していた。ゲル中の蛋白質の銀染色（ｓｉｌｖｅｒ　ｓｔａｉｎｉｎｇ）をファストシステム（スエーデン、ウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）　、Ｐｈａｒ＊ｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｌｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の開発技術ファイル（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　Ｆ１］ｅ）　Ｎｏ、２１０に従って行い、ブ０７ト（ｂｌｏｔ）の拡散ブｏ、ｙティング（ｄｉｆＴｕｓｉｏｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ）とその後の銀染色とをファストシステムの開発技術ファイルＮｏ、２２２に記載されるごとく行った。

非還元（ｕｎｒｅｄｕｃｅｄ）　Ｍｊ−ＡＭＰｓのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動は蛋白質の存在を示さなかった。しかしながら、上記のゲルからニトロセルロースプロットを調製した場合には、Ｍｊ−ＡＭＰＩ及びＭｊ−ＡＭＰ２は、それぞれ、８　ｋＤａ及び７　ｋＤａの分子量についての単一バンドとしてプロット上に出現した。非還元蛋白質試料（２００μｇ）をＤＴＴを含有していない試料緩衝液に溶解し、ファストゲル　ハイ　デンシティ（ＰｈａｒＩＩａｃｉａ　）上で分離し、ニトロセルロース上でプロットしついでプロット上で銀染色した。ミオグロビンフラグメントを分子量マーカー（ｇｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｍａｒｋｅｒ）として使用した。還元されたＭｊ −ＡＭＰｓはゲル内で５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で直接的に染色する（ｓｔａｉｎ）ことができ、むしろ、３〜４　ｋＤａの見掛分子量帯域に拡散バンド（ｄｌｆｆｕｓｅ　ｂａｎｄ）を示す。蛋白質試料（２００ｎｇ）をＤＴＴを含有する試料緩衝液中で還元し、ファストゲル　ハイ　デンシティ上で分離し、ついでゲル中で銀染色した。図３は精製抗菌性蛋白質の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示している。図３のパネルＡは非還元蛋白質試料ニレイン（ｌａｎｅ）　１、Ｍｊ−ＡＭＰ２　、レイン２、Ｍｊ−ＡＭＰＩ　。

レインＲ１パネルＢの右側にｋＤａで示される分子量を有するミオグロビンフラグメントを示す。図３のパネルＢは還元蛋白質試料ニレイン１、旧−ＡＭＰ２　；レイン２　、　Ｍｊ−ＡＭＰＩ　、レインＲ１分子量マーカーとしてのミオグロビンフラグメントを示す。

従って、抗菌性因子はジスルフィドブリッジにより安定化された二量体状蛋白質からなり、その各々は２個の同一のサブユニット（それぞれ、Ｍｊ−ＡＭＰＩ及びＭｊ−ＡＭＰ２について、約４　ｋＤａ及び３．５ｋＤａ　）からなると考えられる。スーパーロース−１２又はスーパーロース（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）上でのゲル濾過により天然Ｍｊ−ＡＭＰｓの分子量を測定することを試みたところ、恐らく、ゲルマトリックスとの相互反応によると思われる、明らかに過少な値（ｕｎｄｅｒｅｓｔｉｍａｔｅｄ　ｖａｌｕｅ）（１〜２　ｋＤａ）が得られた。

５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離された還元ＭＪ−ＡＭＰｓの定期的アシッドシッフ（ＰＡＳ）染色（Ｐｅｒｌｏｄｌｃ　Ａｃ１ｄ　５ｃｈｌｆｆ’ｓ　（ＰＡＳ）ｓｔａｉｎｉｎｇ　）は陰性であり、そのポリペプチドはグリコジル化されていない（ｎｏｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）ことを示していた。陽性対照試料としてオボアルブミン（３，２％炭水化物）を使用して、Ｚａｃｈａｒｉｕｓ等の方法（１９８９゜＾ｎａｌ　Ｂ１ｏｃｈｅ＊、１０，１４８−１５２）に従７て、糖蛋白質についてのＰＡＳ染色（ＰＡＳ　ｓｔａｉｎｉｎｇ）を行った。Ｍｊ −ＡＭＰＩ及びＭｊ−ＡＭＰ２のｐＨ値を等重点電気泳動により測定したところ、両者の蛋白質について約１０．５であることが判った。等電点電気泳動はｐ＋範囲が４．７〜１０．６のマーカー蛋白質（Ｐｈａｒｗａｃｉａ）を使用してプレキャスト　インムービリン　ドライ　ストリップ（ｐｒｅｃａｓｔ　Ｊｉｇｏｂｌｌｌｎｅ　Ｄｒｙ　５ｔｒｉｐｅ）　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で行った。

非還元Ｍｊ−ＡＭＰ２は遊離のチオール基を含有していないので、Ｍｊ−ＡＭＰ２の全てのシスティン残基はジスルフィド結合に関与している思われた。同様に、Ｍｊ−ＡＭＰ　１だけがその非還元状態ではなしに、還元状態でチオール反応剤と反応した。チオール基の測定は、Ｅｌｌｍａｎ、ＧＬのジチオニトロ安息香酸法（１９５９；　Ａｒｃｈ　ＢｉｏｃｈｅａＢｉｏｐｈｙｓ、８２．７Ｏ−７４）によりｌＯｎモルの蛋白質を使用して行った。還元蛋白質試料は、１ｈＭのＤＴＴと４５℃で１時間反応させついで２ｋＤａの分子量カットオッフを有するベンゾイル化セルロースチューブ（Ｓｉｇｍａ）を使用して蒸留水に対して長時間の透析を行うことにより調製した。

実施例　５Ｍｊ−ＡＭＰｓのアミノ酸配列。

抗菌性蛋白質のシスティン残基を以下に述べるごとくＳ−カルボキシアミドメチル化（Ｓ−ｃａｒｂｏｘｙａｓｉｄｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）により変性した＝１００μｇの量の精製蛋白質を、３０−ＭのＤＴＴを含有する０、３　ＭＴｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ８，６）　１５０μＮに溶解し、４５℃で１時間反応させた。

ヨードアセトアミドを最終濃度が１００　ｍＨになるまで添加し、混合物を３７ ℃で１時間暗所に放置した。最終的に、ＤＴＴを最終濃度が１００１Ｍになるまで添加することにより反応を沈静化しくｑｕｅｎｃｈ）ついで３７オル酢酸（ＴＦＡ）から、０．１％のＴＦＡを含有する２−プロパツールへと直線的に変化させてカラムを溶離させることによりカルボキシアミドメチル化蛋白質を回収した。得られた蛋白質フラクションを１２ＯＡアナライザー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｓ）中でのフェニルチオヒダントインアミノ酸誘導体のオン−ライン検出を行う４７７Ａ蛋白質シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｌｏｓｙｓｔｅ議）中でのアミノ酸配列分析にかけた。

ピログルタメートアミノペプチダーゼ（ブロックされたＮ−末端残基を除去するために使用）とトリプシン（内部ペプチドを形成するために使用）で処理した後にＭｊ−ＡＭＰＩの３７残基についての、アミノ酸配列データーを得た。Ｍｊ− 八ＭＰＩの分子量を迅速原子衝撃質量分光分析（ｆａｓｔ　ａｔｏ＋ｍ　ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ　ｍａｓｓ　５ｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）により確認した結果、予測した分子量に正確に一致する３７９Ｂダルトン（ｄａｔｔｏｎ）であることが判った。アミノ酸配列はＭｊ−ＡＭＰ２と類似しており、アミノ酸２８（アスパラギンがグリシンにより置換されている）、アミノ酸８３（バリンがチロシンにより置換されている）及びアミノ酸３５（アルギニンかりシンにより置換されている）において相違するとを特徴とする。更に、アミノ酸１においてグルタミンが確認された。

両者のペプチドは６個のシスティン残基を含有している。図４ＡはＭｊ−ＡＭＰＩとＭｊ−ＡＭＰ２の完全アミノ酸配列を示している：両者における相違は矢印で示されている。

Ｍｊ−ＡＭＰのアミノ酸配列はクモ（ｓｐｉｄｅｒ）　アゲレノブシス　アペルタ（＾ｇｅｌｅｎｏｐｓｉｓ　ａｐｅｒｔａ　）からのμｍｍアトキシン（４− ａｇａｔｏｘ　ｉ　ｎ）（ＳｋｉｎｎｅｒｌｌＳ等；　１９８９：　Ｊ　Ｂｌｏｔ　Ｃｈｅｗ、２６４，２１５（１−２１５５）、海産巻貝（ｓａｒｉｎｅ　５ｎａｉｌ）　コヌス種（Ｃｏｎｕｓ　ｓｐ）からのコノトキシン（ｃｏｎｏｔｏｘｉｎ）　（Ｏｌｉｖｅｒａ、ＢＭ等；　１９８５，５ｏｃｊｅｎｃｅ、２３０．１３３８−１３４３）、ブトラス（Ｂｕｔｈｏｔｕｓ）サソリからの毒素（Ｆａｚａｌ　Ａ等；　１９８９．ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ、２５７，２８０−２）及びクルタトキシン（ｃｕｒｔａｔｏｘｉｎ）　（Ｓｔａｐｌｅｔｏｎ等；１９９０、Ｊ　Ｂｌｏｔ　Ｃｈｅｌｌ、２６５（４）、２０５４−２０５９）を包含する無を椎動物の毒素中で見出だされる神経毒に類似することが認められた。図４ＢはＭｊ−ＡＭＰＩとＭｊ−ＡＭＰ２のアミノ酸配列とこれと並列して神経毒のアミノ酸配列を示す。相同アミノ酸（ｈｏａ＋ｏｌｏｇｏｕｓ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ）は四角で囲まれている。点線はアミノ酸配列の最適な整列（ａ＋　ｉｇｎａ＋ｅｎｔ）のために導入されたギャップを示す。

実施例　６Ｍｊ−ＡＭＰｓの抗菌活性の安定性。

町−ＡＭＰｓの抗菌活性の安定性を更に試験した結果が表１に要約されている。

抗菌活性の試験は実施例２に記載の評価方法に従って、殖培地で５倍に稀酌した２０μｇの試料を使用して行った。対照試料は１０　ｗＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐｆ（７）中に５００μｇ／　ＩＮのＭｊ−ＡＭＰＩｔ　又は１００μｇ／會ｇのＭｊ−ＡＭＰ２を含有していた。２．５−ＭのＤＴＴを添加しついで３７℃ で２時間インキュベートすることにより還元反応を行わせた。下記の緩衝液：　２０　ｍＭのグリシン−ＨＣｆＪ（ｐＨ２及び３）；２０　ｄのジェタノールアミン−ＨＣＩＩ　ＣｐＨ１０）；及び２０　ｓＭのグリシン−ＮａＯＨ（ｐＨ１１）中でＩ）Ｈ安定性を試験した。適当な緩衝液中で１時間インキュベートした後、試料を１０　ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）に対して１６時間透析した。消化（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）のためにプロテアーゼを１００μｇ／　ＩＩｎ添加し、３７℃で１６時間インキュベートした。

表１Ｍｊ−ＡＭＰｓの抗菌活性の安定住処　理　相対的抗菌活性（対照の活性に対する％）Ｍｊ−ＡＭＰ　Ｌ　Ｍｊ−ＡＭＰ　２対照　１００　１００還元　＜６＜６８０℃、１０分　１００　１００９０℃、１０分　ｉｏｏ　ｔｏ。

１００℃、１０分　１００　１００ｐＨ２，６０分　１００　１００ｐＨ３，１３０分　１００　１００ｐＨ１（１，６０分　１００　１００ｐＨ１１，６０分　１００　１００プロナーゼＥ消化　５０２５キモトリプシン消化　１２５０トリプシン消化　７５　ｔｏ。

プロテアーゼに消化　１．００　１００Ｍｊ−ＡＭＰｓはそのジスルフィド結合を還元した後にはＦクルモルムに対する抗菌活性を完全に失った。しかしながら、天然蛋白質は１００℃まで１０分の熱処理により影響を受けず、２〜１１のｐ）Ｉに亘って安定であった。Ｍｊ−八ＭＰＩはプロテアーゼのキモトリプシンに対して感受性であったが、プロナーゼＥ　（Ｐｒｏｎａｓｅ　Ｅ）、トリプシン及びプロテアーゼＫによる消化に対しては殆ど完全に耐久性であった：これに対して、Ｍｊ−ＡＭＰ２はプロナーゼＥによる処理に対して最も感受性であった。

実施例　７Ｍｊ−ＡＭＰｓの抗菌効力（ａｎｔｌｆｕｎｇａｌ　ｐｏｔｅｎｃｙ）。

Ｍｊ−ＡＭＰｓの抗菌効力を１３種の植物病原菌（ｐｌａｎｔ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｆｕｎｇｕｓ）について試験し、２種の既知の抗菌性蛋白質、ウルチ力チオニン（β−ｐｕｒｏｔｈｉｏｎｌｎ）（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｌｕｃａｓ、　Ｃ等；　１９７４　；＾ｐｐｌ　Ｍｉｃｒｏｂｌｏｌ、２８．１６５−１６８）の抗菌効力と比較した。菌類を白色蛍光灯の下で６個の穀類アガー（ｃｅｒｅａｌ　ａｇａｒ）上で生長させ、胞子を回収し、従来の方法で貯蔵した（ＢｒｏｅｋａｅｒｔＪＦ等；　１９９０　；　ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｌｅｔｔ、６９．５５−６０）。下記のごとき菌株を使用した：離した（Ｐｅｕｍａｎｓ　ＷＪ等；　１９８３　；ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、１７７．９９（０３）　、β−プロチオニン（β−ｐｕｒｏｔｈｉｏｎｆｎ）はＲｅｄｉａｎ　、　ＤＧ及びＦｆｓｈｅｒＪの方法（１９６９；　Ｊ　Ｓｃｉ　Ｆｄ　Ａｇｒｉｃ、２０，４２７ −４３２）により小麦の内胚乳（ｅｎｄｏｓｐｅｒａ＋）から精製した。

１　表２に結果を要約して示す。Ｍｊ−ＡＭＰＩ　、Ｍｊ−ＡＭＰ２　、ＵＤＡ及びβ−プロチオニンの一連の稀釈物（ｓｅｒｉａｌ　ｄ４１ｕｔｆｏｎｓ）を菌類に適用し、顕微分光分析（実施例２に記載）により成長抑制率（％）を測定した。

４８時間のインキュベーションの後に成長を５０％抑制するのに必要な濃度をＩＣ５ｏ値とし、これを投与一応答曲線から算定した。成長の遅い菌、ベンツリア　インアエクアリスのＩＣ５ｏはＩＯ日日間インキュベーションの後に測定した。

４８時間のインキュベーションの後に菌の成長を５０％抑制するのに必要な濃度（ＩＣ５ｏ）は、供試微生物の種類に応じて、Ｍｊ−ＡＭＰＬについては６〜３００μｇ／　ｔｘｌ）　、　Ｍｊ−ＡＭＰ２については０．５〜２０μｇ／　ｒｎり、β−プロチオニンについては０５〜１５μｇ／−Ｎ　、　ＵＤＡについては２０〜１．０００μｇ／　ｒｓＤの範囲で変動した。平均的には、得られた抗菌活性の順列は次の通りであった：　Ｍｊ−ＡＭＰ２−β−プロチオニン〉Ｍｊ −八〇Ｐ２に対して明らかに感受性であった。これと反対に、β−ジブ試験た抗菌性蛋白質の全てについて、成長抑制の程度はインキュベーション時間が増大するにつれて減少する傾向を示した。例えば、ＣリンデムチアヌムについてのＭｊ −ＡＭＰＩのＩＣ５ｏ値は、４８時間のインキュベーションの後の６μｇ／　ｄから、７２時間後には１２μｇ／　ｓＮに上昇した。しかしながら、時間依存性の抗菌活性の低下はＭｊ−ＡＭＰＩ又はＵＤＡについてより、Ｍｊ−ＡＭＰ２及びβ−ブロチオニンについてより少なかった。また、Ｍｊ−ＡＭＰ２及びβ−プロチオニンは、特徴的に、Ｍｊ−ＡＭ円又はＵＤＡより急勾配の投与一応答曲線を生じた。図５は次の蛋白質：　Ｍｊ−ＡＭＰＩ　（パネルＡ及びＢ）、Ｍｊ− ＡＭＰ２（パネルＣ及びＤ）、ＵＤＡ　（パネルＥ及びＦ）及びβ−プロチオニン（パネルＧ及びＨ）の濃度を変化させて測定した、菌類、即ち、コレトトリクム　リンデムチアヌム（パネルＡ、Ｃ，Ｅ、Ｇ）及びアルテルナリア　ブラシコラ（パネルＢ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）の時間依存性成長抑制率曲線を示す。成長抑制率は４８時間後（・−ｍ−−・）、６０時間後（０−＝−０）及び７２時間後（−ｍ −−■）に記録した。

表２種々の植物病原菌に対するＭｊ−入神及び他の抗菌性蛋白質の抗菌活性ＩＣ５ｏ（μｇ／　ａ＋ｊｌ　）譲−ＡＭＰＬ　）ｌｌｊ−＾ＭＰ２　ＵＤＡ　β−プロチオニンＡブラシコラ　２０　［１２００３Ａビシ　２００　Ｂ　１０００　３Ｂシネレア　６０　２　＞１０００　１２Ｃリンデムチアヌム　６　１　２０　１５Ｆクルモルム　３０　３　＞１０００　１Ｆオキシスポルムｆ、ｓｐ、　ビシ　１５　５　＞１０００　０．５Ｆオキシスポルムｆ、ｓｐ、リコベルシシ　２００　１０　＊ＮＤ　ＮＤＮハエマアトコカ　１５　０．５　２００　１Ｐベタエ　２５　６　５０　４Ｐトリチシーレペンチス　３００　２０　２００　４Ｐオリザエ　６　０．５　ＮＤ　ＮＤＶダリアエ　１２　０．５８０　０．５Ｖイン７１り７’）７．　１２　１　１０００　５＊ＮＤ−測定せず実施例　８葉の病害に対するＭｊ−ＡＭＰｓの抗菌作用：生体内試験。

ミラビリス　ヤラパからの塩基性熱安定性蛋白質フラクシヨンとＭｊ−八ＭＰＩの純粋な試料を下記の方法を使用して菌による植物の葉の病害について試験した。

植物を直径４ｃｍの小鉢内のジョンインネス（ＪｏｌＨｌ　１ｎｎｅｓ）堆肥中で成長させた。蛋白質製剤の調製は殺菌脱イオン水に溶解しついで適当な濃度まで稀釈することにより使用直前に行った。蛋白質抽出物は約１％の活性成分を含有しているものと推定された。Ｍｊ−八ＭＰＩの純粋な試料を同様の方法で調製した。製剤は葉噴霧物として植物に施用した。噴霧物は個々の小滴の滞留が最大になるまで噴霧した。

噴霧物を穀類に適用する場合にはトウイーン（Ｔｖｅｅｎ）　２０を最終濃度が０．０５％になるまで添加した。植物に病原菌を接種する１日又は２日前に蛋白質製剤を葉に（噴霧により）施した（保護用噴霧）。葉の病原体は胞子懸濁物として供試植物の葉に適用した。接種後、植物を適当な環境中に置いて感染を進行させついで病害の評価が容易になるまでインキュベートした。接種から評価までの期間は病害と環境に応じて４〜１４日の間で変動させた。

表した＝４−病害なし；　３−痕跡〜非処理植物の病害の５％：２−非処理植物の病害の６〜２５％；１−非処理植物の病害の２６〜６０％；〇−非処理植物の病害の６０〜１００％。

表３供試微生物　葉への噴霧濃度粗蛋白質抽出物　Ｍｊ−ＡＭＰｌｌｏ　ａ＋ｇ／　ｄ　２．５　ｍｇ／　ｔａｎ　非処理　１００　ｍｇ／　ｍΩ 対照Ｓノドルム　２−３　０　０　− Ｐビチコラ　４　４　０　− Ｃベチコラ　−−０３これらの結果から、ミラビリス蛋白質抽出物又は精製Ｍｊ−ＡＭＰＩペプチドは、葉噴霧物として適用した場合、生体内で殺菌剤として作用し得ることが確認される。

実施例　９葉の病害に対するＭｊ−ＡＭＰｓの抗菌作用：生体外試験。

実施例８に記載したごとき蛋白質製剤を種々の病原菌に対する活性について生体外で試験した。計量した製剤物質（ｒｏｒｍｕｌａｔｅｄ＊ａｔｅｒｉａｌ）のアリコートをアガー培地（ａｇａｒ　ｍｅｄｉｕｍ）［１０００ｔａｌｌの水中に２ｇのＣａ（Ｎｏ　）　、０．７２５ｇのＭｇＳＯ４，０，７２５ｇのＫＨ２ＰＯ４，０，６ｇのＫＣ（１、１７，２ｇのＮａＨ２ＰＯ４及び１７．７２５ｇのＮａ２ＨＰＯ４を含有する塩溶液と、８００　１１Ｄの水中にｌＯｇのテクニカルアガー（Ｔｅｃｈｎ　ｉｃａ　ｌａｇａｒ）　ｎｏ　３　（Ｏｘｏｉｄ）及び５０ｇのスクロースを含有するアガー溶液とからなるベトリス（ｐｅｔｒｉｓ）最小培地］中に分散させた。ついでこのアガー培地に胞子懸濁液を使用するか又は菌糸体プラグ（ｓｙｃｅｌｉａｌ　ｐｌｕｇ）を使用しである範囲の病原体を接種した。つ０でアガープレートを評価する前に５日目まで接種した（ｉｎｏｃｕｌａｔｅ）。

その結果を表４に示す。病害の抑制は次の等級で表した：４−病原体の成長なしく完全な抑制）：３−病原体の成長が痕跡程度；２−病原体の成長が制限されるか又は中程度：〇−病原体の成長が抑制されない；ｎ−結果は誤り。

供試微生物　粗蛋白質抽出物の濃度１０　ｉｇ／■ｇ２．５ｓ＋ｇ／−非処理対照ペニシリウム　ピノフィルム（Ｐｅｎｉｃｌｌｌｉｕｉ　ｐｉｎｏｐｈｉｌｕａ）　４　２　０アウレオバシジウム　プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）　４　２　０アスペリギルス　ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）　２　３０ペニシリウム　ジギタツム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｌｕｍ　ｄｉｇｉｔａｔｕｍ）　４　４　０コレトトリクム　ムサエ（Ｃｏｌ　ｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｇ　ｍｕｓａｅ）　２　２　０ボトリチス　シネレア（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ　ｃｉｎｅｒｅａ）　４　３　０フサリウム　クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｓ　ｃｕｌｍｏｒｕａ）　４　４　０ゲオトリチウム　カンジウム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｉｕｍ　ｃａｎｄｉｕｍ）　４　３　０ベルチシリウム　アルボーアトルム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｓ　ａｌｂｏ−ａｔｒｕｍ）　Ｍ　２　０蛋白質抽出物は試験した割合の両者において広範囲の抗菌活性を示した。

実施例　１０Ｍｊ−ＡＭＰｓの酵母に対する抑制活性。

酵母サツカロミセス　セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に対するＭｊ−ＡＭＰｓの抑制活性も試験した。表５に示す結果はＭｊ−ＡＭＰｓは５００μｇ／　ｄ又はそれ以上の濃度で酵母の成長を抑制することを示している。

表５精製Ｍｊ−ＡＭＰｓの抑制活性濃度（μｇ／　ｔＡｎ　）Ｃａ／Ｋ　存在　Ｃａ／Ｋ　不存在）ｌｊ−ＡＭＰＬ　＋＋＋　＋＋＋　＋　＋＋＋　−−１＋ｌｊ−ＡＭＰ２　＋＋＋　＋＋＋＋＋＋　＋＋＋　＋＋＋　−＋＋＋：完全な抑制＋＋：若干抑制 −：抑制せず実施例　１１Ｍｊ−ＡＭＰｓの抗菌活性：生体外試験。

ある範囲のグラム陰性及びグラム陰性バクテリア：バシルス　ｌ及びエルウィニア　カロトボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）に対するＭｊ−ＡＭＰｓの抗菌活性を試験した。比較のため、β−プロチオニンとＵＤＡも試験した（実施例７参照）。試験は１％のトリプトンを含有する軟質アガロース培地中で、１ｍＭのＣａＣｆＩ２及び５０μＨＭのＫＣＪ７の存在下と不存在下で行った。４８時間後に培地の吸光度、５９５　ｎｍを測定した。結果を表６に示す。

微生物　ＩＣ５ｏ（μｇ／麿ｇ）Ｍｊ−ＡＭＰＩ　Ｍｊ−ＡＭＰ２　β−ｐｔ　ＵＤＡ培地　−Ｃａ／ＫＢメガテリウム　６　２　１　２５０Ｓルテア　１００　５０　Ｉ３　＞５００Ｅコリ　＞５００　＞５００　２００　）５００Ｅカロトボラ　＞５００　＞５００　）５００　）５００培地　＋Ｃａ／ＫＢメガテリウム　２０　１０　１　＞５００Ｓルテア　＞５００　：）５００　２０　＞５００Ｅコリ　＞５００　’　＞５００　＞５００　＞５００Ｅカロトボラ　＞５００　＞５００　＞５００　＞５００これらの結果は、Ｍｊ−ＡＭＰｓはグラム陰性バクテリアに対しては活性を示さないが、グラム陰性バクテリアの成長は抑制することを示している。

実施例　１２Ｍｊ−ＡＭＰ　ｃＤＮＡの分子クローニング及び配列。

十分に成熟させたミラビリス　ヤルバの種子を屋外で成長させた植物から回収し、直ちに液体窒素中で凍結し、−８０℃で貯蔵した。

Ｄｅ　Ｖｒｌｅｓ等の方法（１９８８，Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｂｅ。

１−１３）により、１５ｇの粉砕した種子から全ＤＮＡを抽出した。

５ｊｌｒｌｏｖ等により文献に記載されたオリゴ（ｄＴ）−セルロースアフイニテイク０７トグラフイー　（１９７９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１８．２７２５−２７３１）によりポリ　（Ａ）”　ＲＮＡを精製して、約１０ｇのポリ　（Ａ）”　ＲＮＡを得た。

ｉ　Ｇｕｂｌｅｒ及びＨｏｆｆｍａｎの方法（１９８３，Ｇｅｎｅ、２５，２８３−２６９）に従って、アメルシャム（＾ｍｅｒｓｈａＩｌりのｃＤＮＡ合成システムプラス（ｃＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅＩＩＰｌｕｓ）を使用して２ｇのポリ　（＾）”　ＲＮＡから二重鎖ｃＤＮＡｓを調製した。ｃＤＮＡｓを製造業者（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の取扱説明書に従ってＥｃｏＲＩ　リンカ− （Ｉ　１ｎｋｅｒ）に連結させた後、λｇｔｌＯファージ中にクローンした。ファージＤＮＡをギガパックＩＩゴールドバッキングシステム（（Ｊｇａｐａｃｋ　ＩＩ　Ｇｏｌｄ　ｐａｃｋｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して生体外にパッケージ（ｐａｃｋａｇｅ）　した＠ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのためのＤＮＡプローブを以下の方法でポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により製造した＝２個の縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）オリゴヌクレオチド：０ＷＢ３（５°ＴＧＹＡＴＨＧＧＮＡＡＹＧＧＮＧＧＮＭＧＮＴＧ）　及び０ＷＢ４（５°ＡＣＮＣＣＲＴＡＮＣＣＹＴＧＲＴＴＮＧＧＹＴＧ）を合成した。０ＷＢ３はＭｊ−ＡＭＰ２のアミノ酸１〜８に相当し、センス配向（ｓｅｎｓｅ　ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）を有する。０ＷＢ４は１４ｊ−ＡＭＰ２のアミノ酸２５〜３２に相当し、アンチセンス配向（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ｏｒｌｅｎｔａＨｏｎ）を有する。ＰＣＲはアンブリファイア−としテＣＩＷＢ３及び０ＷＢ４を使用し、ターゲトＤＮＡとしテ２５ｎｇノｃＤＮＡを使用してかつＴａｑポリメラーゼを使用して標準的な条件下（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、＋９８９．Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂ　Ｐｒｅｓｓ　）で行った。温度プログラムは９４℃で５分間の初期工程、３０サイクル（９４℃で１分間；４５℃で２分間；７２℃で３分間）及び７２℃で１０分間の最終工程から構成した。ｔｏｏｂｐ　Ｐｃｔ？増幅生成物（ａｍｐｌ　１ｒｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔ）を３％アガロース（ＮｕＳｉｅｖｅ、ＦＭＣ）ゲル上で精製しついて反応混合物に２００μＨのｄＴＴＰの代わりに１３０μＨのｄＴＴＰと７０μＨのジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ−１１−ｄＵＴＰ）を含有させたこと以外、前記と同一の条件下でＰＣＨにより再増幅させた。ジゴキシゲニン標識した（ｄｉｇｏｘｌｇｅｎｆｎ−１ａｂｅｌ　１ｅｄ）ＰＣＲ生成物を３％ヌシーブアガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ　ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｔ）上で精製した。

約１００，０００プラ一ク形成単位（ｐｌａｑｕｅ　ｒｏｒａｉｎｇ　ｕｎｉｔ）のλｇｔｌｏ　ｃＤＡＮライブラリーを、ナイロン膜［ハイボンド−Ｎ　（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ）　Ａｍｅｒｓｈｕ］を使用するその場でのブラークハイブルダイゼーション（ｐｌａｑｕｅ　ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ）によりジゴキシゲニン標識ＰＣＲ生成物を使用してスクリーンした。膜を風乾し、ＤＮＡを膜上でＵｖ光線（０，１５Ｊ／Ｃｍ２）の下で架橋させた。ハイブルダイゼーションは６８℃で１６時間、５　ｘ　ｓｓｃ　、１％ブロッキング剤（ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｌｍ）　、０．１％Ｎ−ラウリルサルコシン、ＬＯｎｇ／ｄの熱変性（ｈｅａｔ−ｄｅｎａｔｕａｔｅｄ）ジゴキシゲニン標識プローブを含有する０、０２％ドデシル硫酸ナトリウム中で行った。２　ｘ　５ＳＣ１０，１％ＳＤＳ中で２５℃で５分間、２回及び０．１　ｘ　５ＳＣ７０，１％ＳＤＳ中で６８℃で１５分間、２回、洗浄することにより、非特異的に結合した（ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌ　ｌｙ　ｂｏｕｎｄ）プローブを除去した。プローブの検出（ｄｅｔｅｃｔｌｏｎ）はアルカリ燐酸塩及びその基体、５−ブロム−４−クロル−３−インドリルホスフェート（Ｂｏｅｈｒｌｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に結合されたアンチージゴキシゲニン抗体（ａｎｔｉ−ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｆ）を使用してその製造業者の使用説明書に従って行った。正のプラーク（ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｐｌａｑｕｅ）を同一のプローブを使用してかつ同一の条件下で２回の追加的なスクリーニング工程を行うことにより精製した。

精製プラークからのインサートをｐＥＭＢＬｌｇのＥｃｏＲ１部位（Ｄｅｎｔｅ等。

１９８３、Ｎｕｃｌ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、１１．１１４５−１１５５）中にサブクローンした。ヌクレオチドの配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ＞は、フルオレセイン標識ＭＬ３前進及び逆行ブライ７−（Ｍ１３　ｒｏｒｖａｒｄ　ａｎｄ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ）（Ｐｈａｒｓａｃｉａ）を使用するＡＬＦ自動自動シークテンサー用して行った。配列分析はｐｃ−遺伝子ソフトウェア−（ＰＣ−ｇｅｎｅ　ｓｏｒｔｗａｒｅ）　（Ｉｎｔｅｌ　Ｉ　ｉｇｅｎｅｔｔｃｓ）により行った。

２種の正のクローン、ＭＪＩ及びＭｊ２からのインサートをヌクレオチド配列分析にかけた。

ＭＪＩは３６０ヌクレオチドの長さであり、５°末端でトランケート（ｔ　ｒｕｎｃａｔ　ｅ）されていると考えられる。コード領域はカルボキシ末端部分にＭｊ−ＡＭＰＩの３７アミノ酸を包含する６１アミノ酸を含有する。同様に、アミノ末端部分（２４アミノ酸）は単一ペプチドの全ての特徴（ｆｅａｔｕｒｅ）を有するが、最初の（ｉｎｉｔｉａｌ）メチオニンに欠けているのでトランケートされている。３゛非翻訳領域は１７２ヌクレオチドの長さであり、位置３２６における推定上のポリアデニル化シグナル（ｐｕｔａｔｉｖｅ　ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ　ｓｉｇｎａｌ）（ＡＡＴＡＡＧ）と１２−ヌクレオチドポリ（Ａ）テイルを含有している。

Ｍｊ２は４３３ヌクレオチドの長さであり、６３アミノ酸のオーブンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｌｎｇ　ｆｒａｍｅ）を含有する。３６カルボキシ末端アミノ酸はＭｊ−八ＭＰ２のアミノ酸配列に正しく一致するが、２７アミノ末端アミノ酸は（−１，−３）−ルール（ｗｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ、１９８５．Ｍｏｌ　、Ｂｊｏｌ　。

１８４．９９−１０５）に従った、予測された（ｐｒｅｄｉｃａｔｅｄ）シグナルペプチド構造を有する。Ｍｊ２は５゛及び３′末端に、それぞれ、３４ヌクレオチド及び２１０ヌクレオチドの非翻訳領域を有する。推定上のポリアデニル化シグナル（ＡＡＴＡＡＧ）は位置３９９にあり、１１ヌクレオチド下流に１８− ヌクレオチドポリ（Ａ）テイルが続いている。

図６及び７は、それぞれ、クローンＭＪＬ及びＭｊ２のヌクレオチド配列と推定（ｄｅｄｕｃｅｄ）アミノ酸配列を示す。解放されている四角形は成熟Ｍｊ−ＡＭＰｓのアミノ酸配列に相当する。停止コドンには星印が付されており、重要な（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）ポリアデニル化部位にはアンダーラインが付されている。

実施例　１３発現ベクターｐＭＤ阻の構築。

インサートＭＪ２（Ｍｊ−ＡＭＰ２配列を含有）をＢａｍ旧消化（ｄ　ｊｇｅａｔ　ｔｏｎ）によりｐＥＭＢＬ　１８＋ベクターから除去し、発現ベクターｐＦＡＪ３００２のＢａ■ＨＩ部位にサブクローンした。ｐＦ＾Ｊ３００２は発現ベクターｐＦ’Ｆ１９の修飾物（麿ｏｄｉｒｌｃａｔｌｏｎ）　（Ｚｉｍｇ＋ｅｒｓａｎｓ等、１９９０Ｊ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４゜３３３−３４４　）であり、ＥｃｏＲ１部位のＨｉｎｄ　ＩＩＩ置換とＣａＭＶ３５Ｓ二重エンハンサ−配列（ｄｏｕｂｌｅ　ｅｎｈａｎｃｅｒ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）を含有する。センス配向のＭｊ２を含有するクローンをｐＭＤＢｌと称する：その構造は図８に示されている。

実施例　１４Ｍｊ−ＡＭＰ　２の細胞外発現のための植物形質転換ベクターｐＭＤＢ　２の構築。

Ｍｊ２　ＣａＭＶ３５ＳプロモーターインサートをｐＭＤＢＬからＨｉｎｄ　ＩＩＩ消化し、ｐＢｉｎＲｌのユニークＨｉｎｄ　ｌ１１部位（ｕｎｉｑｕｅ　Ｈｌｎｄ　ＩＩＩ　５ｉｔｅ）にサブクローンした。ｐＢｉｎＲｌは植物形質転換ベクターｐＢｉｎ　１９の修飾型（ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｖｅｒｓｉｏｎ）　（Ｂｅｖａｎ、１９８４．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　。

１２：２２．８７１１−８７２１）であり１、ユニークＥｃｏＲ１とＨｉｎｄ　ｌ１１部位がスイッチ（ｓｗｉｔｃｈ）されておりかつ野生型（ｗｉｌｄ　ｔｙｐｅ）　ｎｐｔ遺伝子が図９に示されるごとく包含されている。新規な植物形質転換ベクターをｐＭＤＢ２と称し、図１０に例示する。

実施例　１５Ｍｊ−ＡＭＰ２の空胞発現（ｖａｃｕｏｌａｒ　ｅｘｐｒｅｓｓｆｏｎ）のための植物形質転換ベクターｐＶＴ２の構築。

Ｍｊ−ＡＭＰ２のトランスジェニック植物の空胞（ｖａｃｕｏｌｅ）への適当なプロセッシング（ｐｒｏｃｅｓｓ　ｉｎｇ）と輸送（ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）を行うために構築を行った。成熟蛋白質からのプロペプチドの切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）を促進するための追加のアミノ酸を有する、１５アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（Ｂｅｄｎａｒｅｋ　Ｓ、Ｙ、等、１９９１．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　３．１１９５−１２０６）を合成した。ＰＣＲ技術を使用して、プロペプチドについての新規な合成配列をＭｊ−へＭＰ２ペプチドとシグナルペプチド（Ｍｊ２）をコードする植物ｃＤＮＡに連結して、５゛末端にｋｐｎ　Ｉ部位及び３”末端にＰｓｔ１部位を含有する、ＶＴと称するインサートを得た。ｋｐｎｌ−Ｐｓｔｌフラグメント（ＰＣＲにより生成）をｐＥＭＢＬ　１ｇ＋のｋｐｎｌ−Ｐｓｔ１部位中にクローンして、図１１ニ示すｐｖＴｏを得た。ｐＶＴＯノｋｐｎｌ−Ｐｓｔ１７　ラグメ：ｚ１４−Ｗｉ物発現カセットｐＦＦ１９のｋｐｎｌ−Ｐｓｔ１部位にクローンして、図１２に示すｐＶＴｌを得た。ついて、ｐｖＴｉのＨｉｎｄ　ＩＩＩ　−ＥｃｏＲｌ　７ラグメントをｐＢｉｎＲｉのＨｉｎｄ　ＩＩＩ−ＥｃｏＲ１部位中にクローンして、図１３に示されるＰＶＴ２と称する植物形質転換ベクターを得た。

実施例　１６植物形質転換。

を形質転換してベクターｐＭＤＢ２又はｐＶＴ２のいずれかを含有させた。

を使用してタバコの形質転換を行い、ｐＭＤＢ２又はｐＶＴ２を含有するニグロバクテリウム菌株と共に共培養した。共培養は１００μｇ／−のカナマイシンの選択圧（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ）下で行った。

トランスジェニック植物（ｐＭＤＢ２又はｐＶＴ２て形質転換）を再生した。標準ウェスタンブロッティング技術を使用して、これらのトランスジェニック植物を、新規に導入された遺伝子の発現について分析した。導入された遺伝子の構成的発現を行うことのできる植物が選択され、白花受粉して種子を与えるであろう。トランスジェニック植物のＦ１苗木（Ｆｌ　ｓｅｅｄｌｉｎｇ）は更に分析されるであろう。

図ＩＡ溶離容量（ｍｌ　）図ｌＢ５−セファロース上でのＩＥＣ図２Ａ溶離容量（ｍｌ　）図２Ｂ溶離容量（ｍｊ　）図３図５蛋白質濃度（μＧ／菖Ｌ）図８図１１国際調査報告　ＰＣＴ／Ｇ８９２１００４２３、−−ＰｋＰＣＴ／ＧＢ　９２１００４２３フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，Ｓ　識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　３１０２１３１００　８３１８−４ＨＣ１２Ｎ　５／１０（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ５，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ、ＲＵ、　ＳＤ、ＳＥ、　ＵＳＩ（７２）発明者　カムエ、プルノー、フィリップ、アンジエロベルギー国、ビイ−１６５２・アルセンベルク、ジエイ、ビイ、ウーテルストラート。

１０９エイ（７２）発明者　ヴアンデルレイデン、ヨセフベルギー国、ビイ−３００１・へヴエルレー。

カスタンエラーン、１２（７２）発明者　リース、サラ、ブランウエンイギリス国、バークシャー・アルシイ１２・３エツクスエツクス、ブラックネル、フォーレスト・パーク、マイケルデヴアー・ウェイ、３２

Claims

【特許請求の範囲】

１．ミラビリスの種子から単離された抗菌性蛋白質。
２．ミラビリスの種子から単離することのできる、純粋な蛋白質、Ｍｊ−ＡＭＰ１。
３．ミラビリスの種子から単離することのできる、純粋な蛋白質、Ｍｊ−ＡＭＰ２。
４．請求の範囲１〜３のいずれかに記載の蛋白質のアミノ酸配列を有する純粋な蛋白質。
５．合成物である、請求の範囲４に記載の蛋白質。
６．請求の範囲１〜５のいずれかに記載の蛋白質をコードする組換え体ＤＮＡ配列。
７．請求の範囲６に記載のＤＮＡ配列を含有するベクター。
８．植物ゲノムから単離されたＤＮＡ配列を含有する、請求の範囲７に記載ベクター。
９．コードされた蛋白質の発現を可能にする、請求の範囲６に記載のＤＮＡを含有する生物学的系。
１０．微生物である、請求の範囲９に記載の生物学的系。
１１．植物である、請求の範囲９に記載の生物学的系。
１２．請求の範囲６に記載の組換え体ＤＮＡを使用して形質転換した植物。
１３．蛋白質Ｍｊ−ＡＭＰ１をコードする組換え体ＤＮＡ配列を使用して形質転換した植物。
１４．蛋白質Ｍｊ−ＡＭＰ２をコードする組換え体ＤＮＡ配列を使用して形質転換した植物。
１５．請求の範囲６に記載のＤＮＡの発現から誘導される蛋白質。
１６．請求の範囲１２〜１４のいずれかに記載の植物内での組換え体ＤＮＡの発現により産生される抗菌性蛋白質。
１７．請求の範囲１〜５又は請求の範囲１５〜１６のいずれかに記載の蛋白質の１種又はそれ以上を含有する抗菌性組成物。
１８．菌類又はバクテリアを、請求の範囲１〜５又は請求の範囲１５〜１７のいずれかに記載の蛋白質又は組成物に暴露することからなる、菌類又はバクテリアの撲滅方法。
１９．請求の範囲１〜５又は請求の範囲１５〜１６のいずれかに記載の殺生物活性を有する蛋白質を、これを含有する有機材料から製造するための抽出方法であって、上記有機材料をマーセレーション及び溶剤抽出にかけることからなる、殺生物活性を有する蛋白質を製造するための抽出方法。
２０．蛋白質を引続いて遠心分離、クロマトグラフィー及び透析により精製する、請求の範囲１９に記載の方法。
２１．有機材料がミラビリスの種子からなる、請求の範囲１９又は２０に記載の抽出方法。
２２．有機材料が請求の範囲１０に記載の微生物からなる、請求の範囲１９又は２０に記載の抽出方法。