JPH06505332A - 総白血球表面抗原を用いた治療法及び診断法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、総白血球の表面抗原、例えばＴ細胞レセプターやＴ細胞分化抗原ある いはそれの断片の測定に向けられ、及び疾患や障害の診断や治療におけるかかる 測定の応用に向けられる。本発明はまた、総白血球表面抗原の測定と共に、可溶 性白血球抗原あるいはそれの断片の測定及び疾患や障害の診断及び治療における このような二重の測定の応用に向けられる。このような分子、好ましくは複数の このような分子の測定は、治療的処置の効果を観察し、疾患を発見し及び／又は 診断するのに用いられ得る。

Ｃ１ｕｓｔｅｒｓ　ｏｆ　ｄｉｆ４ｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　（ＣＤ）は、分化 抗原に対して向けられたモノクローナル抗体の反応性の比較によって、ヒト白血 球分化抗原を定義づけるものとして確立された（Ｂｅｒｎａｒｄ　ａｎｄ　Ｂｏ ｕｍｓｅｌｌ。

１９８４、Ｈｕｍ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１１：１−１０；　ｋｎａｐｐ　ｅｔ　ａ ｌ、、１９８９．　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

Ｔｏｄａｙ　ＩＯ：２５３：３５８；　Ｇｅｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８ ．　ＡＳＨＩ　Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ　１２：１１；Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ｔｙｐ ｉｎｇ　Ｔｌｌ：　Ｗｈｉｔｅ　Ｃｅ１ｌ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　 Ａｎｔｉｇｅｎｓ。

Ｅｄ、、　ＭｃＭｉｃｈａｅｌ、　Ａ、Ｊ、　１９８７．０ｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉ ｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ）。

Ｔ細胞表面抗原、エピトープで定義したサブグループへのそれらの分類、及びＴ 細胞上でのそれらの分布は、ヒトＴ細胞に対して向けられたモノクローナル抗体 の使用によって研究されてきた（Ｃ１ａｒｋｅｔ　ａｌ、、１９８３．　１ｍｍ ｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　１８：５９９−６１５；　Ｈａｎｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ 、、１９８４、ｉｎ　Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ　Ｔｙｐｉｎｇ、Ｂｅｒｎａｒｄ、Ａ 、、ｅｔ　ａｌ、、ｅｄｓ、、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｎｅｗ　Ｙ ｏｒｋ、　ｐｐ、　１９５−２１２）。いくつかのＴ細胞のＣＤ分類及び、他の 細胞の細胞表面分子は、表■に掲げである。

これらの細胞表面マーカーは、細胞系統、Ｔ細胞が属する機能的Ｔ細胞サブセッ トの同−性及びＴ細胞の活性化状態のマーカーとして役に立つ。細胞表面分子の いくつかは詳細に研究され、免疫機能を開始しそして調節するのに重要であり、 免疫細胞間での伝達過程に対して非常に不可欠であることが判明した。

表　ｒ 白血球表面分子 ２．２　白血球表面分子特異的抗体 ここ数年の間、マウスやヒトＴＣＲの決定基に対する抗体が創り出された。

これらの抗体の一部は、■領域ファミリーの全てのメンバーを認識するように思 われ、一部は１つのファミリー内のＶ領域のサブセットを認識し、そして一部は 特定のＶ領域のみを認識するらしい（表■）。これらのＴＣＲ抗体は、末梢血Ｔ 細胞（ｌ−５％）の小集団を同定し、ＴＣＲＶ領域の使用に基づいて新方法によ りＴ細胞を更に分ける。

表■ 表Ｈに対する引用文献リスト １、Ｂｏｙｌｓｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６．　Ｊ、　１ｍ１ｌｌｕｎｏ ｌ。

１３７：７４１−７４４゜ ２、Ｔｉａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．　ＦＡＳＥＢ　Ｊ、　３：Ａ４８６ 　Ａｂｓｔｒ。

３、　８１ｇ１ｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３．　Ｊ、　Ｂｘｐ、　Ｍｅｄ。

１５８：１０００−１００５゜ ４、Ｐｏ５ｎｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８３ニア８８８−７８９２゜５、Ｊａｎｓｏｎ　ｅｔ 　ａｌ、、　１９８９．　Ｃａｎｃ、　［ｍｍｕｎｏｌ。

Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、　２８：２２５−２３２゜６、Ｍａｅｃｋｅｒ　＆　Ｌ ｅｖｙ、　１９８９．１９８９　Ｊ、　Ｉ＋＋ｍｕｎｏｌ。

１４２：１３９５−１４０４゜ これらの試薬は、多くのｉｎ　ｖｉｖｏやｉｎ　ｖ＋±四の条件のもとで発現さ れたＴＣＲのレパートリ−を研究するのに貴重であることが証明された。例えば 、あるバクテリアのエンテロトキシン（過抗原）による、単核細胞のＬ！す１印 刺激は、限られた数のＴＣＲＶβファミリーを表現するＴ細胞の増加へ導く（に ａｐｐｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９、５ｃｉｅｎｃｅ　２４４＋８１１− ８１３）。特定のＶβ領域を持っているＴ細胞の１ｎｖｉｖｏ増加は、自己免疫 疾患のある動物モデルにおいて探知された。

他の抗体は、全てのαβ又はγδ　ＴＣＲ上の共通の決定基を認識する。これら は、ＴＣＲ−γタンパクを特異的に認識することがわかったモノクローナル抗体 であるＣγＭｌを含む（Ｈｏｃｈｓｔｅｎｂａｃｈｅｔ　ａｌ、、　１９８８． 　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６８ニア６１）。このモノクローナル抗体は、 定常部コード化ペプチドに対して生成され、ＣγＩ及びＣ１０の両方をコード化 するＴＣＲ−γ鎖と反応する。

これは、全てのＴＣＲ−γポリペプチドに対する枠組み構造反応性を保有するら しい。

ＴＣＲδ１　（Ｂａｎｄ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．５ｃｔｅｎｃｅ　２３８ ：６８２）及びδＴＣＳ　ｌ　（Ｗｕ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８．　Ｊ、Ｉｍ ｍｕｎｏｌ、　１４１：１４７６）は、ヒトγδＴＣＲのβ鎖に対して特異的な モノクローナル抗体である。クローン特異的又はイディオタイプ抗ＴＣＲ抗体と 違って、ＴＣＲδｌは、γδＴＣＲを表現する全てのＴ細胞を同定するようだ。

δＴＣ８１は、これらγδＴ細胞の少数のサブセットを同定する。

Ｔ細胞レセプターガンマ及びデルタ鎖に対する、別のモノクローナル抗体もまた 報告された（１９８８年１１月２日に発行された欧州特許公開＃ＥＰ２８９２５ ２；　１９８８年１月１４日に発行された国際特許公開＃ＷＯ３８１００２０９ ）。

βＦ　Ｉ　（Ｂｒｅｎｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ ｏｌ、　１３８＋１５０２−１５０９）は、枠組み構造すなわち、αβＴＣＲの β鎖上において共通の又は非多型の決定基に対して特異的なマウスモノクローナ ル抗体であり、αβＴＣＲを表現する全てのＴ細胞を同定する。αＦ、１　（Ｈ ｅｎｒｙｅｔ　ａｌ、、　１９８９．　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　８：５７７）は、 α鎖の枠組み構造に対して特異的なモノクローナル抗体であり、αβ　ＴＣＲを 表現する全Ｔ細胞を同定する。

ＣＤ４に対する抗体は、広く記述され（Ｋｕｎｇ、　Ｐ、Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、、 　１９７９、５ｃｉｅｎｃｅ　２０６：３４７−３４９）　、市販されている。

ＣＤ４分子上の、非競合エピトープと反応する一連のこのような抗体が開示され ている。このようなセットは、０ＫＴ４．０ＫＴ４Ａ、０ＫＴ４Ｂ、０ＫＴ４Ｃ ，０ＫＴ４Ｄ、０ＫＴ４Ｅ、及び０ＫＴ４Ｆと名付けられている（Ｒａｏ、　Ｐ 、Ｅ、、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３．　Ｃｅ１１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　８０ 　：３１０）。

ＣＤ４又はＣＤ８抗原に対して向ｉ１られた抗体は、細胞の機能を阻止すること がわかった。ＣＤ’　４に対する抗体は、はとんどのヘルパ・−丁機能、混合リ ンパ球反応及びＴヘルパー活性の誘導を抑える（Ｂｉｄｄｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ 、、　１９８４．　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１５９ニア８３）　、　ＣＤ　 ８に対する抗体は、ＣＤ８陽性の細胞障害性Ｔリンパ球の細胞障害活性を迎える （Ｓｗａｉｎ、　Ｓｊ、、、　１９８１．　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ 、　Ｓｅｔ、Ｕ、Ｓ、Ａ、７８ニア１０１−７１０５　）。ＣＤ４に対する抗体 はまた、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化する能力があると記載されている。

ＣＤ４はホルボルエステルによる細胞の処理とその結果生じるリン酸化によって 内在化する。（Ｈｏｘｉｅ、　Ｊ、Ａ、、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６．　Ｊ、 　Ｉｎｌ１ｕｎｏ１゜１３７＋１１９４−１２０１）。

ＣＤ３５に対する抗体もまた報告されている（Ｗｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　１９ ８５゜Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　８２：８０３；　Ｍｏｏｎ　＆ 　Ｆｅａｒｏｎ、　１９８５．１３４：３３３２；５ｃｈｒ：ｅｂｅｒ、　ＵＳ 　Ｐａｔｅｎｔ　＃４，６７２．０４４１ｓｓｕｅｄ　Ｊｕｎｅ　９．１９８７ ）。

（本頁以下余白） ２．３　臨床応用 これらの様々なリンパ球細胞表面マーカーは、リンパ球集団及びそれらの機能状 態の同定について莫大な臨床応用の可能性を有する（Ｋｒｅｎｓｋｙ、　Ａ、Ｍ 、　ａｎｄ　Ｃｌａｙｂｅｒｇｅｒ、　Ｃ，、１９８５，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ 。

３９　（４）　：３３９−３４８；　Ｋｕｎｇ、　Ｐ、Ｃ，、ｅｔ　ａｔ、、　 １９８４．　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｉｎ　Ｃ１１ｎｉ ｃａｌ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ、Ｃｌ１ｎｔｅａｌ　８ｉｏｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ−Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ　Ｔｈｅｏｒｉｅｓ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎ ｉｑｕｅｓ、　Ｖｏｌ、　３．　Ａｃａｄｅｍｉｅ　Ｐｒｅｓｓ、　ｐｐ、　８ ９−１１５：にｕｎｇ、　Ｐ、Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、、　１９８３．　Ｉｎｔ、　 Ｊ、　Ｄｅｒ＋ｎａｔｏ１．２２　（２）　：６７−７３３；　Ｃｏ５１ｍ１　 ｅｔ　ａｌ、、　１９８１．　Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　ｏｆ　Ｍｅｄ、　３０ ５：３０８；　Ｋｎｏｗｌｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３．　Ｄｉａｇｎｏｓ ｔｉｃ　［＋＋＋＋ｎｕｎｏ１．　ｌ：１４２；　Ｈｏｆｆｍａｎ、　１９８４ ．　Ａｒｎｅｒ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　Ｌａｂ　２：３９）。

Ｔ細胞の型を決める現存する臨床的方法には、Ｔ細胞表面マーカーを定義してＴ 細胞表面上の特異的細胞表面マーカーを検出するモノクローナル抗体の利用法を 含む。表面もしくは膜上にマーカーを発現しているＴ細胞の総数の測定は、リン パ球の癌の性質決定及び分類に有効であった（Ｇｒｅａｖｅｓ、　Ｍ、、　ｅｔ 　ａｌ、、　１９８１．　Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃ、　３ 　（３）　：２８３−３００）　ｏ　Ｔヘルパー及びＴ抑制性／細胞障害性細胞 の相対的パーセント率の変化は、ウィルス感染（Ｃｏｌｖｉｎ、　Ｒ，Ｂ、、　 ｅｔ　ａｌ、、　１９８１．　Ｐｒｏｃ、　８ｔｈ　Ｉｎｔ、　Ｃｏｎｇｒ、　 Ｎｅｐｈｒｏｌ、、　Ａｔｈｅｎｓ、　ｐｐ、　９９０−９９６）　、自己免疫 疾患（Ｖｅｙｓ、　Ｅ、Ｍ、。

ｅｔ　ａｌ、、　１９８１．　Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃ、 　３　（３）　：３１３−３１９）　、及び、エイズ（Ｇｕｐｔａ、　Ｓ、、　 １９８６．　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、ＩｎａｌｕｎｏｐａＬｈａｌ。

３８：９３−１００；　Ｅｂｅｒｔ、　Ｅ、Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、、　１９８５． 　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１ｍｍｕｎｏｐａｔｈａ１．３７−２８３−２ ９７）に起因する腎臓移植における免疫事象と関連していることが見いだされて いる。

Ｔ細胞表面マーカー類の発現は叉、患者の免疫状態の査定のためにも用いられて きた。個別の機能的Ｔ細胞サブセットの相対的数、及び／叉は、末梢血もしくは 組織中の活性化されたＴ細胞の相対的数を測定することにより、患者の免疫学的 な状況の査定が可能になるということが確立されている。

ＨＩ　Ｖ−感染している個体中においては、明白なエイズの進行についての最も 有効な単一の予測標識は、全血のＣＤ　４　”Ｔ細胞／ｍｍ３の絶対数である。

現在、ＣＤ４”Ｔ細胞の正確な測定には、流動式細胞計数計の利用が必要であり 、これは、高価であり、広くは普及していないものである。更に、連邦政府基準 は、エイズに感染した個体に対するＡＺＴ投与の適格性を、総合的症状にかかわ らず、単にＣＤ４＋Ｔ細胞数（５００ＣＤ４”Ｔ細胞／ｍｒｎ’以下になるＴ細 胞数）に基づいて定義している。ペンタミジン治療の分割細胞数は２００細胞／ 　ｍ　ｍ　”である。しかしながら、この、高価で広くは普及していない流動式 細胞計数計は、大多数の臨床医及び患者を、適切な免疫状況の評定方法がなく従 ってＡＺＴ治療のない状態にしている。

ＣＤ４”Ｔ細胞数が５００細胞／　ｍ　ｍ　”以下（ＡＺＴ治療）もしくは２０ ０細胞／　ｍ　ｍ　”以下（ペンタミジン治療）になる場合には（Ｃｏｔｖｌｅ ｙ　ｅｔ　ａｔ、　Ｊｕｎｅ　２５．１９９０．　Ｎｅｗｓｗｅｅｋ、　ｐｐ、 　２３−２７；　ＭｉＩＩｓ　＆　Ｍａｓｕｒ、　Ａｕｇｕｓｔ、　１９９０． ５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ、　ｐｐ、　５０−５７；Ｆａｈｅｙ 　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３２２ ：１６６−７２；　Ｇｏｅｄｅｒｔｅｔ　ａｌ、、　１９８９．　Ｎｅｗ　Ｅｎ ｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３２１：１１４１−８）　、患者は治療の関与を必要 とする。

ＣＤ４陽性もしくはＣＤ８陽性Ｔ細胞の測定は、疾患の検出もしくは診断、ある いは、疾患治療を監視するのに使用することができ、これは、ＵＳ　４，７０９ ，０１５　ＵＳ　４，７２５，５４３．　ＵＳ　４，３６１，５５０．　ＵＳ４ ．９０８，２０３．　ＷＯ９１／１０７２２．　ＷＯ３９１０８１４３，ＷＯ９ １１０７９８５，ＢＰ　４２１，３８０、　ＷＯ９１１０９９６６、ＷＯ９１１ ０３４９３，ＥＰ　４０３，９３５．１０８８１０４３２７．　ＵＳ　４，６９ ５、４５９．及びＵＳ　４．６４９．１０６の特許及び特許公開公報において記 載されている。

２．４　試料中の白血球表面分子の測定方法疾患を検出し、その段階を決定し、 もしくは、診断する、あるいは、上記の疾患の療法の進行を監視する方法は、試 料中の成分の分離を必要とする。

例えば、疾患を有する患者の診断もしくは監視の方法は、可溶性白血球抗原量の 検出、そして、患者の試料中の可溶性白血球抗原量と、正常な個体からの試料中 の量もしくは初期の時期における同−個体中の量との比較に依存する。例えば、 特許公開公報ＷＯ３７１０５９１２、及びＷｏ　９０１０４１８０を参照せよ。

しかしながら、このアッセイ試料は細胞及び細胞破片から単離されている必要が あり、これには、時間がかかる。

本発明の以前に、白血球マーカーについて陽性である白血球の量の測定を細胞の 直接的分析により行った。今日まで、研究者は主に、全血に由来する強化された 細胞集団中における細胞表面マーカーの量を測定してきた。これには、全血の、 血清（もしくは血漿）及び細胞成分への分離、更にその後、赤血球細胞の溶菌に 係わる方法そして続いてフィコール−ハイバークのようなポリマーの密度勾配を 用いた白血球細胞の単離方法により所望の細胞の強化をする。この強化された細 胞集団を、その後、流動式細胞計数計もしくは蛍光顕微鏡を用いる直接的、ある いは、間接的免疫蛍光法のいずれかにより分析するか、または、適切な緩衝液で 溶菌し、その後、全溶菌液もしくは膜のいずれか、及び、シトツル成分を、個々 に分析する。これらの方法の限界には、（１）新鮮な試料の必要性、（２）全血 よりはむしろ強化した細胞集団を用いる必要性、（３）高価な装置の必要性、（ ４）試料を調製するのに必要とする時間、及び、（５）分析のためのかなり大き い試料サイズもしくは細胞数の必要性が含まれ、これは、細胞は試料調製段階中 に損失するためであり、更に、流動式細胞計数計分析は、信頼に価する測定値を 得るためには統計学的に有意な数の細胞を分析することを必要とするためである 。問題となっている細胞が着実に減少して行く疾患においては、（例えば、ＨＩ Ｖ感染及びエイズへの進行中におけるＣＤ４細胞数の減少）、有意な数の細胞を 取得して強化された細胞集団において分析するためには、より大きい量の試料を 使用する必要がある。

３、　本発明の概要 本発明は、白血球抗原を検出し、特定の白血球マーカーについて陽性である細胞 数を推定する、以前の方法の欠陥を、信頼性のある、定量的な、利用しやすい方 法を提供し、細胞を取得する生物学的液体中に細胞を含む試料中の白血球マーカ ーの総量を測定することにより、克服している。また、試料が細胞のみを含むこ とができる。

驚くべきことに、濃厚な洗剤で試料中の細胞の処理し、その後、その試料の希釈 により、この試料中の白血球マーカーの全量が可溶化されることを発見した。従 って、試料中の白血球マーカーの総量の測定方法は、濃厚な非イオン性洗剤溶液 を試料に添加して洗剤処理したサンプルをつくり、その洗剤で細胞を溶菌、及び ／叉は、膜を破壊させることを含む。この方法において、任意の細胞内及び／叉 は膜結合性マーカーを放出させた後、この試料中の白血球マーカーの総量（すな わち、このように放出させられたマーカー、並びに、この試料中にもともと存在 していた任意の可溶性マーカーを含む）を検出することができる。細胞を溶解さ せた後、試料を希釈して洗剤濃度を低くする。試料中の白血球マーカーの量の検 出は、例えば、免疫アッセイのような免疫学的な検出方法による。

顕著なことには、総白血球マーカーの測定を用いて、試料中の白血球マーカーに 陽性を示す白血球の概数の決定をする。例えば、全白血球マーカーの測定を用い て適切な相関を有するその抗原を発現する細胞を計数する。更により顕著なこと は、本発明の方法に従って取得される測定と、従来の方法により達成される細胞 計数値との間の相関の直線性である。従って、本発明は、以前の技術の、より厄 介な方法に代わり、非常に有利な代替となることが示される。

総白血球マーカー類の測定は、被験者の治療の効果性を監視し、治療法の結果も しくは疾患の予後を予測し、更に、患者の免疫状態を評価及び監視するのに有効 である。総白血球マーカー類の測定は、膜、細胞質内及び可溶性コンパートメン トに存在する白血球マーカーの総量を測定することができるように試料を処理す るサンドイッチ酵素免疫アッセイにより実行することができる。

特別な実施態様においては、本発明は、総ＣＤ４抗原の量の測定に関する。総Ｃ Ｄ４抗原測定は、ＣＤ４＋細胞の絶対数が疾患の進行もしくは治療の結果の最良 の標識である疾患において特に有効である。このような疾患はエイズを含むが、 これに限定はされない。

他の実施態様においては、本発明は、ＣＤ８抗原の総量の測定に関する。総ＣＤ ８抗原測定は、白血球のＣＤ８＋サブセツトの変化に関連する疾患において特に 有用である。これらは感染性疾患、自己免疫疾患、及び、移植拒否症を含むが、 これらに限定はされない。

更に他の実施態様においては、本発明は、試料中に存在するＴ細胞抗原レセプタ ー（Ｔ　ＣＲ）の総量の測定に関する。総ＴＣＲ測定は、任意のαβもしくはγ δＴＣＲを発現するすべての細胞上の総ＴＣＲの測定を含み、かつ、特異的Ｖα 、Ｖβ、Ｖγ、及び／叉は、Ｖγペプチドを発現するサブセットを含むが、これ らに限定はされない細胞の特定のサブセット上の総ＴＣＲの測定を含む。

更に別の実施態様においては、本発明は、総白血球マーカーの　−量、及び、同 一の可溶性白血球マーカー量の両方の測定、及び、測定したレベルの比較に関す る。疾患の進行もしくは疾患治療中での、総レベル及び可溶性レベルにおけるそ の相対的変化は、総レベルもしくは可溶性レベルのいずれかの、それのみでの測 定より勝る。このような測定は、疾患もしくは障害の検出、診断、もしくは、監 視に有用である。

更に別の実施態様においては、本発明は、２つもしくはそれを越える量の白血球 マーカーの総量の測定、及び、そのマーカーの量の比較を提供する。疾患進行中 における、マーカーの相対量、もしくは、そのマーカーの相対量における時間依 存性の変化を使用して、疾患も（２くは障害の治療もしくは進行を検出、診断、 もしくは、監視することができる。重大なことには、総白血球マーカーの測定を 使用して、各マーカーについて陽性を示す細胞数を推定することができる。総白 血球マーカー、もしくは、各白血球マーカーについて陽性を示す細胞の概数の比 率を、正常個体における同一比率と比較することができ、更に、この比較を、疾 患の検出、診断、もしくは、その段階決定、あるいは、疾患もしくは障害の治療 を監視するのに使用することができる。

マーカーの総数の同時測定は、以下に述べる理由のために、細胞結合性、細胞溶 菌物、もしくは、可溶性マーカーを個別に測定することの改良法である。第■に 、この測定法は、３つの全てのコンパートメントに存在するマーカーの総量を含 み、１種類もしくは２つのコンパートメントに存在するものの量のみではない。

第２に、総マーカーの測定は、より大量の試料調製、複雑な装置、及び、より多 くの段階を含む他の方法よりも、より簡単である。第３に、例えば１００μｍの ような少量の試料、及び、５−１０μｌのような非常に少ない量の全血を、試料 を予め強化させることなしに、単純な免疫アッセイフォーマットにおいて直接的 に分析することができる。少量の全面が必要であることは、幼児もしくは小さい 子供での小児科的応用において主要な利益を有する。このことは、分析する試料 当たりの有意な費用低減、及び、高価な装置の必要性の除去を示し、これにより 、この分析法は多数の研究室もしくは医院に広く普及する。第４には、総マーカ ーの測定はある改良法であり、それは、この方法が、最低限の試料調製を必要と し、更に、患者からの感染性試料の場合においては有害である気膠質を作成しな いためである。最も重要な、ＨＩＶを含むもののような感染性試料に・ついては 、可溶化法、つまり、濃厚な洗剤での処理は、ウィルスを不活性化させ、それに よって、その後の分析を安全なものにする。第５には、総マーカーアッセイは新 鮮な試料を必要と（７ない。各患者試料を処理し、凍結保存することができる。

これは、長い期間の研究におけるような、一定期間に渡り同一患者から取得した 一連の試料について特に有用である。各試料を迅速に処理及び凍結することがで きるため、全ての試料を同時に解凍及び分析することができる。このことは、細 胞が新鮮かつ完全なままであることを必要とする流動式細胞計数計に対して明確 な改良点である。更に、全てのアッセイを同時に行うことができるため、アッセ イ間の変動性から生じる、アッセイ結果において取得される変化を除去する。

３．１　定義 本明細書中に使用されているように、以下に示す用語類は、示される意味を有す る。

総白血球マーカー　試料中に存在する白血球抗原もしくはその断片の総数（膜結 合性、細胞内、及び、細胞外、のちのを含む）。

ＷＢＣＣ＝　白血球細胞数 ＡＺＴ　−アジド−デオキシチミジン ＨＴＬＶ　ＩＩＩ／ＬＡＶ／ＨＩＶ ＝　ヒトＴ細胞白血病のウィルスタイプ１／リンパ節症関連ウィルス／ヒト免侵 不全ウィルス ０ＰＤ＝Ｏ−フェニレンジアミン ｍＡｂ　−モノクロ−六ル抗体 自発的放出　細胞の正常もしくは病理学的な生理学的過程による放出 エイズ（ＡＩＤＳ）　＝　後天性免疫不全疾患症候群 ＴＣＡＲ＝　Ｔ細胞抗原レセプター ４、　図の説明 図１．　ＣＥＬＬＦＲＥＥ＊ＣＤ４アッセイを使用した（後述の、５．１項を参 照せよ）、本発明の方法に従った全血中の総ＣＩ）　４抗原の測定。３種類の曲 線は、３人の正常個体の血液からの総ＣＤ４　（０，Ｄ、４９０）の検出を示す 。

図２．　本発明の方法に従うＣＤ４免疫アツセイにおいて測定された総ＣＤ４抗 原と、血液のＣＤ４陽性細胞／　ｍ　ｍ　３の総数との間の相関。総ＣＤ４　（ ０，Ｄ、４９０）は、５人の異なる正常個体からの２．５μｍの全血から、ＣＥ ＬＬＦＲＥＥ＊ＣＤ４アッセイを使用して測定した。ＣＤ４陽性細胞／　ｍ　ｍ 　’の数は、試料からの総ＣＤ４抗原の決定３日後に、血液試料で測定した。従 って、血液の総ＣＤ４”細胞／ｍｍ３の数は、正常個体について期待されるより も低いと思われる。しかしながら、取得された曲線は、総ＣＤ４抗原と、ＣＤ４ ＋細胞の数との間の直線的な関連性を示している。

図３．　ＨＩＶに感染している個体及び−人の正常人対照の全面から測定した総 ＣＤ４抗原と、血液の総ＣＤ４＋細胞／ｍｍ”との間の相関。ＨＩＶに感染して いる個体を一重の四角で示し、正常人を二重の四角で示した。

図４．　ＨＩＶに感染した個体及び正常人対照の全血から測定した総ＣＤ４抗原 と、血液の総ＣＤ４＋細胞／　ｍ　ｍ　”との間の相関。ＨＩ　Ｖに感染した個 体を一重の四角で示し、正常人を二重の四角で示した。

図５．　総ＣＤ４抗原法の標準曲線。

図６．　９５の正常及び疾患試料における、総ＣＤ４抗原法及び流動性細胞計数 系による、ＣＤ４陽性細胞の計数能力の比較。

図７．　９５の正常及び疾患試料における、総ＣＤ８抗原法及び流動性細胞計数 系による、ＣＤ８陽性細胞の計数能力の比較。

図８．　３０人の正常人及び１１人の癌患者の全血中におけるＣＤ８関連性細胞 （総ＣＤ８抗源マイナス可溶性ＣＤ８抗原）。

図９．　正常で健康なドナーの全血中の総Ｔ細胞抗原レセプターβ鎖抗原。

図１０．　総Ｔ細胞抗原しセプター■δｌ鎖抗原、及び、免疫アッセイの標準曲 線。

５、　本発明の詳細な説明 本発明は、総白血球表面抗原、総Ｔ細胞分化抗原に関し、あるいは、総マーカー もしくはその断片、及び、疾患及び障害の診断及び治療におけるそのような測定 法の用途に関する。

本発明に従う総マーカーの測定は、細胞の計数、細胞の型の決定、被験者に対す る治療的処置の効果の監視、被験者中の疾患の検出及び／叉は診断において、治 療結果もしくは疾患の予後の予想において、さらに、患者の免疫状況の評定及び 監視において重要である。複数の総マーカー例えば総ＣＤ４抗原及び総ＣＤ８抗 原を測定することができる。エイズに関連した好ましい実施態様においては、総 ＣＤ４及び総ＣＤ８抗原を同時に測定することができるようにアッセイを行う。

本明細書中に使用しであるように、用語「総」は、試料中に存在するマーカーの 総量を意味する。例えば、全血を含む試料のような特別な試料においては、総マ ーカーは、細胞膜、細胞質内、及び、可溶性血清コンパートメント内に存在する マーカーの量を含む。この可溶性コンパートメントは、自発的に放出される可溶 性マーカー、並びに、治療的処置として投与される可溶性の組換えマーカーを含 むことができる。組織培養物中に細胞を含む試料中のような他の試料においては 、総マーカーは、その試料の、膜、細胞質内、及び、細胞培養培地コンパートメ ント中に存在するマーカーの量を含む。その試料が例えば、生検試料のような組 織を含む、更に別の実施態様においては、総マーカーは、膜、細胞質内、及び、 間質コンパートメントに存在するマーカーの量を含む。

本明細書中に使用しであるように、試料の膜、細胞質内、及び可溶性要素により 修飾されている用語「コンパートメント」は、試料中に含まれる、全ての膜の総 量、細胞質成分の総量、及び、可溶性物質の総量を意味する。

本明細書中に使用しであるように、用語「白血球マーカー」は、白血球の細胞表 面上に見いだされる抗原もしくはポリペプチドを意味する。このようなマーカー は、細胞表面抗原類、ＣＤ（分化の解団）抗原、レセプター、もしくは他の細胞 表面ポリペプチドもしくは蛋白質類を含むが、これらに限定はされない。用語白 血球マーカーは、更に、上述の分子の、免疫学的に活性な断片、例えば、エピト ープ等を含む。本発明に従う検出法のための白血球マーカー、及び、これらのマ ーカーを発現することが知られている特別な細胞を、２．　１項の表■　（前述 ）にまとめた。具体的な実施態様においては、この白血球マーカーは、ＣＤ４、 ＣＤ８、もしくはＴ細胞抗原レセプター（Ｔ　ＣＡ　Ｒ）であることができる。

本明細書中に使用しであるように、用語［白血球」は、その用語類の通常の意味 を意味し、つまり、造血幹細胞から由来する免疫関連性細胞であり、それらは、 リンパ球（Ｂ細胞及びＴ細胞）、及び、骨髄系細胞（好中球、マクロファージ、 好酸球、巨核球、赤血球、肥満細胞）である。

本明細書中に使用しであるように、「試料」は、それらが取得された環境におけ る細胞の集合体であり、すなわち生物学的液体あるいは、細胞の膜及び／叉は細 胞質内成分を意味する。総白血球抗原を、生物学的液体から由来する試料中で測 定することができ、それらは例えば、全血、血漿、血清、血液細胞、唾液、尿、 滑液、胸膜の浸出液、腫瘍及び組織湿潤液、羊水、を髄液、もしくは、頭蓋液で ある。他の実施態様においては、生物学的液体は、細胞培養液であることができ る。この試料は、間質性液を始めとする組織を含むことができる。この試料が組 織試料である場合には、好ましくは、この組織を処理して接続性組織床を例えば 、トリプシン消化もしくは均一化により破壊するが、他の実施態様においては、 試料は、前述の源泉から由来する細胞を含む。

（本頁以下余白） ５．１．総白血球マーカーの検出および測定白血球マーカーの総量は、３区画、 即ち、膜、細胞質内区画および放出／可溶性区画に存在する（「総白血球マーカ ー」）。本発明は、試料の調製方法に応じて、３区画全て、または膜および／ま たは細胞内区画に存在する白血球マーカーの総量を同時に測定する免疫検定法を 包含する。

白血球マーカーの総量を測定するためには、全血または血球のような「元の」試 料をまず処理して細胞成分を可溶化する（第１段階）。

免疫特異的結合を妨害することなく試料中の細胞を可溶化するための好ましい方 法は、細胞を濃厚な非イオン界面活性剤で処理して細胞を効果的に溶解し、これ により「処理」試料を形成することである。細胞を溶解した後、処理試料を希釈 して検定する。

本発明で使用する非イオン性洗剤は、−例を挙げれば、トリトンＸ−１００、／ 　：デットＰ−４０（ＮＰ−４０）　、’ツイーン−２０、ＣＨＡＰＳなどであ るが、これらに限定されない。好ましい実施態様においては、細胞をトリトンｘ −ｔｏｏ、ノニデットＰ−４０、ツイーン−２０および／またはＣＨＡＰＳで可 溶化する。より好ましい実施態様では、細胞を濃厚洗剤で可溶化する際の最終洗 剤濃度は、洗剤処理試料巾約２〜４％である。

本発明によれば、試料に添加する非イオン性洗剤の総容量は、試料中の何れの白 血球マーカーをも希釈するような容量であってはならない。好ましくは、洗剤の 容量は試料の容量の約２５％を超えず、更に好ましくは、約２０％を超えない。

非イオン性洗剤は元の試料に直接添加でき、あるいは、濃厚溶液として調製でき る。非イオン性洗剤の外に、濃厚洗剤溶液は蒸留水または緩衝剤を含有できる。

非イオン性洗剤の溶液中の濃度は、好ましくは試料添加後の、即ち洗剤処理試料 中の、非イオン洗剤の最終濃度の５倍、より好ましくは６倍である。

より好ましい実施態様においては、複数の非イオン性洗剤を用いて細胞を溶解す る。例えば、高濃度のツイーン−２０とＩ・リドンＸ−１００、またはトリトン Ｘ−１００とＮＰ−４０またはＮＰ−４０とツイーン−２０を用いる。

各洗剤の濃度は試料への添加後で約１〜約２％であり、洗剤処理試料中の洗剤の 総濃度は約２〜約４％である。より好ましくは、総洗剤濃度は約２へ一約３％、 更に好ましくは約２〜約２．５％である。特定の実施態様においては、試料中の 最終洗剤濃度は１．５％ｌ・リドンｘ−ｉｏｏおよびＩ％ＮＰ−４０である。こ れはＣＤ４とＣＤ８の両方を検定する場合に好ましい濃度である。

別の実施態様においＣは、洗剤濃度はウィルス、特に旧Ｖを不活性化するような 濃度である。例えば上記したような好ましい範囲の、非イオン性洗剤の溶解性濃 度は、同時に１フィルス不活性化濃度でもあることは、特に本発明の利点である 。

細胞可溶化のための別の方法、例えば反復凍結解凍ナイクル、音波処理、低張処 理、または低濃度の洗剤の添加等は、それほど有効ではない。ＳＤＳのようなイ オン性洗剤は、その後の抗体−抗原結合を妨害するため好ましくない。

少なくとも約１分間、好ましくは約１〜約５分間可溶化を行な−〕た後、試料を 緩衝液で希釈しく第２段階）、その後、免疫検定に付す。希釈は２倍希釈、好ま しくは５倍以上に希釈する。緩衝液は白血球抗原の検出のための免疫検定に適合 するものを選択する。種々の免疫検定のために好ましい緩衝液は当該分野でよく 知られ”Ｃいる。

特定の実施態様においては、試料緩衝液は、リン酸緩衝溶液（ＰｌｌＳ）中１％ ウシ血清アルブミン、０．２５％ＮＰ−４０および０．Ｏ１％チメロサールであ る。

本発明の方法は入手可能な試料の量による制限を受けない１．１つの実施態様に おいては、全血の洗剤処理試料的ｌＯＯμｌの総白血球抗原を測定してよい。よ り好ましい実施態様においては、全面の洗剤処理試料的２．５〜約２５７ｚｌを 使用してよい。同様の量の培養懸濁液、胸膜浸出液またはその他の生物学的液体 の試料を用いることができる。検定する試料の実際の量は希釈係数を調節するこ とにより変えることができる。特定のパラメーターの決定は単純な連続希釈検定 により行なうことができ、これは当該分野における通常の技術水準である。

更に、可溶化された試料を凍結保存（７、異る時間に採取された試料を１回の実 験で検定（７てよい。１つの実施態様においては、試料は約−２０℃で保存する 。好ましい実施態様においては、試料は約−７０℃で保存する。

白血球抗原を検出し、測定するための何れかの方法を、本発明の実施において用 いてよい。このような方法は、例えば、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ　（ 酵素標識免疫吸着検定）、ｒサンドイッチ」免疫検定、イムノラジオメトリック アッセイ、蛍光免疫検定、およびプロティンＡ免疫検定のような方法を用いた競 合的または非競合的検定系である。［細胞を含まないＴ細胞抗原レセプター関連 分子の検出のための検定系および検定の臨床用途Ｊと題される！９８９年７月４ 日発行の米国特許第４．８４５．０２６号および［可溶性Ｔ細胞表面分子を用い た治療診断方法」と題される１９９１年４月９日発行の米国特許第５．００６． ４５９号は、好ましい免疫検定方法を開示している。これらの開示は参照により ここに組み込まれる。

（本頁以下余白） 好ましい実施態様において、サンドイッチ酵素免疫アッセイを用いることができ る。そのような実施態様のひとつの記載は次の様である。白血球マーカーに対す る抗体（捕獲抗体Ａｂ　ｌ）を固体の培養基板に吸着する。試料中に存在する白 血球マーカーは抗体に結合し、未反応試料成分は洗浄により取り除かれる。白血 球マーカーの第２エピトープに対する酵素結合抗体（検出抗体Ａｂ２）はｒｎＡ ｂｌにより捕獲された抗原に結合しサンドイッチを完成する。洗浄により未結合 Ａｂ２を取り除いた後、基質溶液をウェルに加える。試料中に存在する抗原の量 に比例して発色生成物が形成される。反応をストップ溶液の添加により終了させ 、吸光度を分光光度計により測定する。標準曲線を白血球マーカーの既知の濃度 により調製し、その標準曲線により未知の試料の値を決定する。

全ＣＤ８抗体レベルの測定のための好ましい実施態様において、サンドイッチ酵 素免疫アッセイでは抗ＣＤ８　ｍＡｂ　４Ｃ９および５Ｆ４をそれぞれ捕獲およ び検出抗体として用いることができる；さらに好ましい実施態様においては、Ｃ ＥＬＬＦＲ［？Ｈ’　ＣＤ　８アツセイ（Ｔ　Ｃｅ１ｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　 Ｉｎｃ、、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　ＭＡ）を用いることができる（米国特許５ ．００６．４５９に記載、下記８項参照）。全ＣＤ４抗原レベルの測定のための 好ましい実施態様において、サンドイッチ酵素免疫アッセイでは抗ＣＤ４　ｍＡ ｂ　８Ｆ４およびＲ２Ｂ７を、それぞれ捕獲および検出試薬として用いることが できる；さらに好ましい実施態様において、ＣＩ！ＬＬＦＲＥＥｏＣＤ　４アツ セイ（Ｔ　Ｃｅ１ｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ、、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　 ＭＡ）を用いることができる（米国特許公告Ｗ０９０１０４１８０、下記６およ び７項参照）。全Ｖδｌ抗原レベルの測定のための好ましい実施態様において、 サンドイッチ免疫アッセイでは抗ＴＣＲδｍＡｂ　ＴＣＲδｌおよびδＴＣＳ　 ｌを用いることができる（下記９項参照）。全βＴＣＲ抗原レベルの測定のため の好ましい実施態様において、サンドイッチ酵素免疫アッセイでは抗βＴＣＲｍ Ａｂ　βＦｌおよびＷ４を用いることができる（下記１０項参照）。上述の抗体 は、下記１０項に記載されているように、ＡＴＣＣに寄託されている。

当業上知られている種々の方法を白血球マーカーに対する抗体の生成に用いるこ とができる。そのような抗体はポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単一 鎖、ＦａｂフラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリーを含むがこれらに限定さ れない。抗体の生成のためには、例えばウサギ、マウス、ネズミ等を含むがこれ らに限定されない種々の宿主動物が白血球マーカーを注射することにより免疫化 される。ひとつの実施態様において、白血球マーカーは免疫原性担体と結合する 。別の実施態様において、白血球マーカーエピトープ（例えばハブテン）を担体 に結合する。ここで用いられるように、“エピトープ”とは特異的免疫活性（例 えば抗体結合）のできる抗原のフラグメントである。宿主の種によるが、例えば フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのような無機質ゲル、リ ゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キ ーホール・リムベット・ヘモシアニン、ジニトロフェノールのような界面活性剤 およヒＢＣＧ　（ｂａｃｊｌｌｅ　Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）やＣｏｒ ｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍのような有用なヒトアジュバントとな りうるちのを含むがこれらに限定されない種々のアジュバントを用いて免疫応答 を増加させる。

白血球マーカーに対するモノクローナル抗体は培養した連続継代細胞株による抗 体分子の生成を提供する、任意の方法を用いることにより調製できる。これらは 、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ　（１９７５゜Ｎａｔｕｒｅ　２５６　 ：　４９５−４９７）により最初に記載されたハイブリドーマ法、さらに最近の Ｂ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｓｂｏｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３゜１ｍｍｕ ｎｏ１ｇｙ　Ｔｏｄａｙ　４ニア２）およびＥＢＶハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅ ｅｔ　ａｌ、、　１９８５．　ＭｏｎｏｃＪｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　 ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ。

Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、Ｉｎｃ、、　ｐｐ、７７−９６）を含むがこれらに限 定されない。

本発明の別の実施態様において、白血球マーカーに特異的なモノクローナル抗体 を最近の技術（ＰＣＴ１０３９０１０２５４５）を用いた無菌動物中で生成する ことができる。本発明によると、ヒト抗体を用いることができそしてヒトハイブ リドーマ（Ｃｏｔｅ　ｅＬ　ａｌ、、　１９８３゜Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８０：２０２６−２０３０）を用いること によりまたはｉｎ　ｖｉｔｒｏでヒトＢ細胞をＥＢＶウィルスで形質転換するこ と（Ｃｏｌｅ　ｅｔ　ａｌ、　１９８５．　ｉｎ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎ ｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄＣａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ、　Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌ ｉ５ｓ、　ｐｐ、７７−９６）によりヒト抗体を得ることができる。事実、本発 明によると、白血球マーカーに特異的なマウス抗体分子からの遺伝子を適切な生 物学的活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子とを接合させることにより“キメ ラ抗体”（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８４．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ。

８１　：　６８５１−６８５５　：　Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ　ｅｔａｌ、、　１９ ８４．　Ｎａｔｕｒｅ　３１２：６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａ　ｅｔ　ａｌ、 、　１９８５．　Ｎａｔｕｒｅ　３１４　：　４５２−４５４）の生成のために 開発された技術を用いることができる；そのような抗体はこの発明の範囲内であ る。

本発明によると、単一鎖抗体（米国特許第４．９４６．７７８号）の生成のため に記載された方法を採用して白血球マーカー特異的単一鎖抗体を生成できる。本 発明の別の実施態様はＦａｂ発現ライブラリー（Ｈｕｓｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１ ９８９．５ｃｉｅｎｃｅ　２４６　：　１２７５−１２８１）の構築のために記 載された技術を用いて、白血球マーカーに所望の特異性を有するモノクローナル Ｆａｂフラグメントの迅速で簡単な同定を可能にする。

白血球マーカーに特異的な部位を含む抗体フラグメントを既知の技術により生成 することができる。例えば、そのようなフラグメントは、抗体分子のペプシン消 化により生成されるＦ（ａｂ’）ｔフラグメントおよびＦ（ａｂ’）ｔフラグメ ントのジスルフィド架橋を還元することにより生成されるＦａｂフラグメントを 含むがこれらに限定されない。

上記の方法はまた任意の全白血球表面マーカー（例えば上記２１項に記載された マーカー）をアッセイするために用いることができる。例えば、限定するもので はないが、全ＣＤ４、全ＣＤ８または全ＴＣＲはこの発明の実施により測定され る。別の実施態様においては、２つ以上の複数の全白血球表面分子またはマーカ ーを測定できる。さらに別の実施態様においては、１つのマーカーの相対量を他 と比較できる。

５．２．マーカーに陽性な白血球の計数本発明による全白血球マーカーの測定法 は、試料中の白血球マーカーに陽性の白血球数を計数する方法を提供する。他の 実施態様において、アッセイ中の白血球マーカーの活性を白血球マーカーに陽性 な既知の細胞数を含む標準の活性と比較できる。

本発明のこの一面は試料中の全白血球マーカーレベル（白血球マーカーに関する アッセイにおける白血球マーカーの活性に比例している）がそのマーカーに陽性 の細胞数と直接相関関係しているという発見に基づいている。下記（７項）の実 施例に示されているように、本発明により測定されたＣＤ４＋細胞の数と蛍光標 示式細胞分取器（ＦＡＣ３）により測定された細胞数との相関関係は相関係数０ ．９４６であり、このことは、本発明の全白血球マーカー法による白血球マーカ ー陽性細胞の計数がフローサイトメトリーによる計数と同程度に信頼できるもの であることを示す。さらに、上記、本発明の要約において指摘しているように、 本方法は複雑な試料調製、慎重な保存条件または高価な分析器具を必要としない 。

別の実施態様において、試料中の膜および／または細胞質内区画（すなわち可溶 性白血球マーカーを含まない）における白血球マーカーの量は試料中の細胞数と 相関関係がある。下記の８項、実施例において示されるように、白血球マーカー に陽性な細胞数と膜および細胞質内区画における白血球マーカー量との相関関係 は良好である。

本発明によると、試料中の白血球マーカーに陽性の細胞数は、＋１＋試料中の白 血球マーカーの全量を測定し、（２）白血球マーカーの全量から白血球マーカー に陽性の細胞の全数を計算することにより決定できる。ひとつの実施態様におい て、計算は全白血球マーカーに対する白血球マーカーに陽性な細胞の全数との標 準曲線から推定することによりなされる。別の実施態様において、公式を標準曲 線から得て白血球マーカーの全量を公式にはめ込む。さらに別の実施態様におい て、全白血球マーカーに関するアッセイの活性だけがマ・−カーに陽性な細胞の 全数を計算するために用いられる。この実施態様において、白血球マーカーの全 量は検出アッセイにおける相対的活性に反映される。細胞の全数を計算する方法 （例えば補性推定または公式）は同じである。

本発明は標準を計算するために簡単でわかりやすい方法を提供する。ひとつの実 施態様において、白血球マーカーの全量はマーカーに陽性な細胞の全数に関係す る。さらに好ましい実施態様において、マーカーに陽性の全細胞数に対する全白 血球マーカーの線形回帰分析を行う。線形回帰分析は、まっすぐな−直線、誤差 の推定、ぞ（７て全白血球マーカー量からの全細胞数を計算する公式を得る。

別の実施態様において、界面活性剤処理試料における白血球マーカーの活性は免 疫学的検出方法により検出でき、標準試料における白血球マーカーの既知の量の アッセイと比較でき、そしてその比較から白血球マーカーに陽性な細胞数を決定 する。さらに好ましい実施態様において、界面活性剤処理試料での白血球マーカ ーのアッセイにおける活性をマーカーに陽性な既知の細胞数を含む標準での白血 球マーカーのアッセイにおける活性と比較し、試料中の白血球マーカーに陽性な 細胞数をその比較により決定する。

別の実施態様において、全白血球マーカーとそのマーカーに陽性な細胞数との相 関関係を可溶性または全区画における過剰量の白血球マーカーについて訂正でき る。可溶性白血球マーカーの量を同じ免疫学的検出方法（例えば同じ免疫アッセ イを用いて）によりアッセイできる。可溶性マーカーの量を全マーカーの量から 引き算する。訂正された細胞関連白血球マーカー値は細胞数とさらに正確な相関 関係がある。特別な実施態様において、ＣＤ８’細胞の総数はＣＤ８−可溶性Ｃ Ｄ８の総員と相関関係がある（下記８項参照）。

標準を調製することにおいて、全細胞数を５業」二知られ°Ｃいる任意の方法、 例えば２−３例を挙げるとＦ　Ａ　ＣＳ　、、免疫蛍光顕微鏡法および補体溶解 アッセイにより別々に測定できる。好ましい実施態様において、個別の全細胞数 はＦＡＣ８により得られる。

全ＣＤ４アツセイは患者の試料中のＣＤ４”　Ｔ細胞の数を推定するために用い られる。試料中のＣＤ４”　Ｔ細胞の数の推定は治療処置（例えばエイズ患者の ための）診断または監視のために用いることができる。

好ましい実施態様において、ＣＤ８＋細胞は試料中のＣＤ８抗原の全量を測定し 、同じ試料中の可溶性ＣＤ８抗原の量を引き算することにより計数できる。その ような分析により免疫系活性化とＣＤ８＋細胞数の両方に関する情報を得る。

さらに別の実施態様において、αβまたはγδＴＣＡＲに陽性なＴ細胞の全数を 測定できる。同様に、サブセットのＶα、Ｖβ、ＶγまたはＶδに陽性のＴ細胞 の全数を測定できる。従って、Ｔ細胞の特定のサブセットの数に関して全血試料 を今では迅速に、安全に、信頼して分析できる。

５．３、キット 本発明を実施するために必要な試薬はキット中に便利なように提供される。本発 明のキットの重要な要素は、濃縮非イオン性界面活性液と抗原の存在を免疫学的 に検出する方法である。

キットは５業上知られている任意の免疫学的検出方法、例えば上記５．１１項で 記載しているものを含むことができる。好ま（７くは、免疫学的検出方法は、白 血球マーカーに特異的な第１の捕獲抗体、そして白血球マーカーに特異的な第２ の検出可能抗体である。第１の抗体は、例えばガラスまたはプラスチックビーズ 、膜、プラスチック棒、ミクロウェル、ガラスまたはプラスチック試験管または 免疫アッセイのための、５業」二知られている他の固体の支持体のような固体の 支持体上に提供される。また、第１の抗体を後での固定化のために提供できる。

第１および第２抗体を再構成のために凍結乾燥調製としてまたは濃縮液として提 供できる。

第２抗体は標識手段により検出可能である。好ましい実施態様において、標識手 段は酵素である。

界面活性剤液は充分な容量のある容器に提供されキットにより意図されたアッセ イの数に必要な溶液の量を保持する。好ましくは、界面活性剤液は２またはそれ 以上の非イオン系界面活性剤を含む。好ましい実施態様において、界面活性剤液 は蒸留水中の９％トリトンＸ−１００および６％Ｎｕ’−４０を含む。特定の界 面活性剤液濃度が、ＣＤ４およびＣＤ８両方のアッセイに関して最適である。

好ましくは、キットは溶液としてまたは再構成のために凍結乾燥として白血球マ ーカー標準物を含む。さらに好ましくは、キットは関心のある白血球マーカーに 陽性な既知の数の細胞を含む標準を含む。従って、未知の試料中の白血球マーカ ーに関するアッセイにおける活性は既知の試料と直接比較でき、白血球マーカー に陽性の未知の試料中の細胞中の数はそれにより計数できる。

キットは、第２抗体が抗体に対する標識の添着により検出可能である場合、標識 と反応する試薬をさらに含むことができる３１例えば、標識が酵素である場合、 キットは酵素の基質を提供することができる。キットはまた希釈緩衝液、最終濃 度液、希釈のための高濃度液または再構成のための乾燥物を提供することができ る。

さらに別の実施態様において、キットは１以上の白血球抗原の免疫学的検出方法 を提供する。好ましい実施態様においては、キットはＣＤ４およびＣＤ８両方の 免疫学的検出方法を含む。

本発明の他の実施態様において、全白血球マーカーの測定を用いて患者の疾患ま たは障害の検出、診断または段階を調べる。全白血球マーカーの測定量をベース ラインレベル（すなわち正常な人の全白血球マーカーの量）と比較する。このベ ースラインレベルは疾患の兆候の前に患者の体液中に正常に存在する確立された 量であるか、または疾患の寛解期に存在する量である。

本発明により、患者中に検出され、診断されまたは段階を決められる疾患または 障害は表■に一覧されたものを含むが、これらに限定されない。

表■ 本発明により患者中に検出および／または診断および／または監視される疾患お よび障害■、ウィルスにより誘発された感染性疾患−ヘルペスウィルス ーシトメガロウイルス −エプスタイン・バールウィルス −ＨＴＬＶ−１ −ＨＴＬＶ−Ｉ１１／ＬＡＶ／ＨＩ　Ｖ　Ｃエイ：Ｘ）■、癌 −ＢまたはＴ細胞白血病 −ＨＴＬＶ−１関連成人Ｔ細胞白血球 −ＢまたはＴ細胞リンパ腫 一バーキットリンパ腫 −へアリ−・セル白血病 一セザリー症候群 一ホジキン病 一慢性リンパ性白血病 一非ホジキンリンパ腫 −Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病 一固形腫瘍 ■、自己免疫疾患 一すウマトイド関節炎 一糖尿病 一多発性硬化症 一全身紅斑性狼癒 ■、臓器同種移植拒絶 白血球マーカーに陽性の患者からの試料中の細胞数に基づし）で疾患または障害 を検出する方法は上記２．３０項およびそこで引用されている参考文献に記載さ れている。これらの方法は本発明の本方法により、これまで可能と考えられたも ののように安価にそして簡単に実施できる。

一実施態において、全ＣＤ４抗原の量を用いてＣＤ４陽性細胞を計数し、それを 次にエイズを診断するために用いることができる。過去において、ＨＩＶ陽性で ある患者が１またはそれ以上の日和見感染の存在下でＣＤ４陽性細胞数＜５００ 細胞／＋ａｍ”を示した場合、エイズの診断が決定された。このエイズの定義は 日和見感染のあるなしにかかわらず＜２００細胞／＋ｎ＋ｎ”の存在によりＨＩ Ｖ陽性と変わることが予想される（上記２．３１項参照）。

ウィルス感染に対する応答はまた患者中の全ＣＤ８レベルを測定することにより 監視できる。例えば、ヘルペスウィルスまたはエイズウィルスに感染した患者は 全ＣＤ８の変化レベルを示す。

他の実施態様において、移植患者における全レベルを測定し同種移植拒絶の診断 的指標として用いることができる。全ＣＤ８の増加レベルの検出はりウマトイド 関節炎およびＥＢＶ誘発性単核細胞症のような感染性の疾患と関連している。Ｃ Ｄ８抗原の上昇レベルの検出は、免疫活性化とは異なり、特定の病理学的事象を 伴いかなりの数のサプレッサー／細胞障害Ｔ細胞にかかわることを示す。

さらに別の実施態様において、細胞培養物中の全ＣＤ４の測定は存在するリンパ 球のＣＤ４＋発現型の指標として信頼できる。

例えば、ＣＤ４＋白血病またはリンパ腫を全ＣＤ４抗原測定を用いて分類できる 。別の実施態様において、全ＣＤ４抗原の測定を用いてＣＤ４＋細胞を検出し、 それらを計数することができる。

本発明の同様の実施態様は、全ＣＤ８抗原の測定を含み、ＣＤ８”白血病または リンパ腫を分類し、ＣＤ８＋細胞を検出し、それらを計数する。

５　、４．２．監視の方法 本発明は治療処置を受けている患者に対する治療処置の作用を監視する方法を提 供する。この方法は適当な時間間隔で全白血球マーカーの量を測定することを含 む。全白血球マーカーの量のいかなる変化または変化なしを同定し患者に対する 治療の作用と相関させることができる。

一実施態様において、全ＣＤ４を測定しくそしてＣＤ４＋細胞を計数し）そして 、例えばＡＺＴ、インターフェロンまたはＣＤ４のような治療用化合物の投与の 後でエイズ患者の治療成果の予想に用いることができる。

別の実施態様において、全ＣＤ８抗原を測定し、疾患の進行または治療成果と相 関させることができる。

全Ｔ細胞抗原レセプターの測定はＴ細胞レセプター特異的抗体のような薬剤での 治療の効果を監視するのに特に有用である。特定の実施態様において、特定の可 変領域を発現するＴ細胞の特定のサブセットにおける全ＣＤ抗原が測定でき、治 療成果と相関できる。

本発明により評価できる治療処置は放射線療法、薬物投与、ワクチン投与、免疫 抑制または免疫増強養生等を含むがこれらに限定されない。免疫抑制養生は、例 えばサイクロスポリンＡ、クロラムブシル、シクロホスファミドまたはアザチオ プリンのような薬剤の投与および、例えば抗Ｔ３モノクローナル抗体、抗Ｔ細胞 抗原レセプター抗体および抗胸腺細胞グロブリン等のような抗Ｔ細胞抗体の投与 を含むが、これらに限定されない。免疫増強養生はインターロイキン１１インタ ーロイキン２、インターロイキン４および他のＴ細胞増殖因子の投与を含むがこ れらに限定されない。

（本頁以下余白） ５、４．３．複数の白血球マーカーの検出に基づいた診断または治療の本発明は 、複数（少なくとも２種類）の総白血球マーカーを測定するごとにより、病気の 検出または治療、または治療のモニターについても備えるものである。例えば、 複数のＴ細胞マーカーを（例えばごくわずかなものを挙げると、ＣＤ４およびＣ Ｄ８およびＴＣＡＲがあるがこれらに限定されない）いずれも完全な形で測定し て、病気または障害の治療を診断、検出、またはモニターすることができる。そ のような病気または障害として、表ＩＩＩに示されるものがある。総マーカーレ ベルは、免疫系機能の尺度（基準）を表すことができ、病気の経過や治療効率に 対応するものである。

好適な実施態様において、予後の指標は、いずれかの時間に存在するマーカーの 絶対レベルで観察される経時変化よりも、むしろ互いに比較したときのマーカー の異なるレベルで観察される経時的変化にある。ＣＤ４　、ＣＤ８およびＴＣＡ Ｒは、免疫系機能の指標であるために、これら指標は病気もしくは障害の多様な 段階における免疫系の相対的な健康状態のかなり向上した尺度を提供するはずで ある。

特別な実施態様においては、ＨＩＶ　（エイズの原因となるウィルス）感染によ り引き起こされた病気および障害を複数のリンパ球表面マーカーの測定によりモ ニターできよう。エイズの治療としては、ＡＺＴ　（アジド−デオキシチミジン ）、γまたはβインターフェロンなどの薬剤により、また可溶性ＣＤ４、または そのフラグメントおよび誘導体によるエイズ患者の治療が挙げられる。もう一つ 別の実施態様において、複数のマーカーをモニターすることによ・って、ｇｐ１ ２０ペプチドなどの潜在的なエイズワクチンの効能の試験が可能である。エイズ 治療の専門家にとっては、これらの治療またはワクチンの効能のモニターに用い ることのできる手法を非常に必要としている。現在までのところ、旧Ｖ抗原ｐ２ ４のレベルは、十分に感度が高いとは証明されていない。総ＣＤ８に比較した総 ＣＤ４は、病気の異なる徴候を示す旧Ｖ感染患者において検出することができ、 エイズ治療およびワクチンをモニターする感度の高いイムノアッセイを提供する ものである。総ＣＤ４と総ＣＤ８の測定は、費用のかからない容易なイムノアッ セイ・フォーマットであり、エイズ患者における病気の予後と治療の成果を予測 するための価値のある臨床的道具である。エイズ病因の進展で、ＣＤ４陽性のＴ 細胞の相対レベルは、ＣＤ８陽性細胞の総数に較べて劇的に減少するために、本 発明の方法による総ＣＤ４と総ＣＤ８の検出は、１１１■感染およびエイズ治療 を追跡する特に有用な方法を提供する。

好適な面において、採用できるアプローチは、ある期間にわたる研究において総 ＣＤ４レベルと総ＣＤ８レベルの量を決定し、これらの値とベースラインレベル と比較することである。ベースラインレベルとは、通常の病気を持たない個人に 存在するマーカーのレベルか、治療前または、病気の緩和中、または安定してい る時期に、患者中に存在するレベルである。次に、これらのレベルは病気の経過 または治療の結果に関連付けることができる。

本発明は、試料中の総白血球マーカー量と可溶性白血球マーカー量を測定し、そ の２種類の測定値を比較することにより、病気の検出か診断または治療のモニタ ーに備えるものでもある。白血球マーカーの互いのレベルの変化は、向上した予 後の指標となりうるちのである。一つの実施態様において、可溶性ＣＤ８　（免 疫系活性化の尺度については、１９８７年１０月８日に公告された国際特許公告 ＷＯ８７１０５９１２および１９９０年４月１９日に公告されたＷｏ　９０１０ ４１．８０を参照）を、総ＣＤ８抗原の量から可溶性ＣＤ８抗原の量を引いて得 られたＣＤ８抗原の量と比較する（例えば、この差は細胞膜に結合（７たＣＤ８ プラス細胞質ＣＤ８を与え、細胞関連性の総ＣＤ８に等（７い）。そのような比 較は、免疫系活性化の相対的レベルに関する情報とＣＤ陽性細胞のサブセット中 の細胞数の変化に関する情報を提供するものであり、それら情報はともに病気の 進展または治療のモニターに有用である。好適な実施態様において、可溶性ＣＤ ８抗原レベルと総ＣＤ８抗原レベルの両者を、アッセイ前の異なる試料処理によ るが、−・種類のイムノアッセイ構成を用いて決定することができる。

本発明は以下の実施例によりさらに明らかとなるであろうが、これらは発明の純 粋な代表例として記載されているのであって、発明の限定を意図するものではな い。

６、実施例：総ＣＤ４抗原のアッセイ 本実施例は、総ＣＤ４値を試料中のＣＤ４＋細胞数に関連させるアッセイの開発 を示１−ものである。

試料・患者試料は、血清陽性の旧Ｖ感染の２６人と健康な成人ボラン１イアの１ ３人を含むものであった。血液は、静脈注射で血液採取管に採取して得た。

試料の処理：アッセイ前に全血試料を以下のように処理した。

段階ｌ： １００μｌの抗凝固血液を血液採取管から出して、１２ｘ　７５　＋＋ｏｎのガ ラスチューブ中で、２０μＩの濃縮６倍洗剤（蒸留水中の６％トリトンＸ−１ｏ ｏ　、６％ＮＰ−４０）と混合した。次に、この混合物を１分間室温でインキュ ベートした。１分後、この処理した試料をＣＤ４イムノアツセイに用いるか、も しくはアッセイするまで一７０℃で保存した。−７０℃で保存した試料は、使用 前に室温にて解凍した。

段階２： この処理した試料をＣＤ４イムノアツセイによる検定の前に、洗剤の濃度を希釈 するために、該試料を結果の箇所で示したように試料緩衝液（１％ウシ血清アル ブミン、リン酸緩衝溶液、０．２５ＸＮＰ−４０および０、Ｏ１％チメロサール ）を使って希釈した。イムノアッセイに添加された全試料体積は、５０μ艶に維 持した。

６．１．２．　ＣＤ４のイムノアッセイ捕獲抗体（ｃａｐｔｕｒｅ　ａｎｔｉｂ ｏｄｙ）で前もって一晩被覆したマイクロタイタープレートを用いる、一段階の ３時間のフォーマットからなるＣＤ４に特異的な・イムノアッセイにより総ＣＤ ４抗原を測定ｊ、５た（１９８７年１０月８日に公告の国際特許公告ＷＯＢ７１ ０５９１２を参照）。簡単に述べると、９６ウエルマイクロタイターウエルプレ ートのそれぞれのウェルに１００μｌのネズミ抗ＣＤ４被覆抗体をリン酸緩衝溶 液（ＰＢＳ　）中で一晩４℃で被覆した。残、っているタンパク結合部位を１ウ エルあたり３００μｌの阻止緩衝液（ＰＢＳ中、０．５％カゼイン、ｏ、　ｏｏ ｓ％ＮＰ−４０，０，００５％ＥＤＴＡ　）で２時間、３７℃で阻止した。ウェ ルをｌウェルあたり３５０μｍの洗浄緩衝液（０゜０５％のトウイーン２０を含 むＰＢＳ　、　ｐＨ７，４）で３回洗浄した。最終洗浄緩衝液をウェルからアス ピレータ−で除去し、５０μｌの西洋ワサビパーオキシダーゼ−（ＨＲＰ　’） に結合したネズミモノクローナル抗体抗ヒトＣＤ４抗体（１５％　ＦＣＳおよび ０．１５％　ＮＰ−４０を含有するＰＢＳ中）および５０μＩの試料もしくは標 準品をマイクロタイタープレートのそれぞれのウェルに２通りに加えた。試料と ＨＲＰ結合抗体を一緒にした容積は１００μｌであった。試料と抗体は３時間室 温でインキュベートした。上記のようにプレートを洗浄した後に、１００μｌの ＯＰＤ基質［ＯＰＤタブレット、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ　Ｉｎｔｌ、カタログ＃　 Ａ４５１０４Ｔの１タブレツトを４　ｍ　ｌのクエン酸緩衝液・パーオキシダー ゼ（ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ　Ｉｎｔｌ、Ｋｅｎｎｅｂｕｎｋｐｏｒｔ　、Ｍａｉｎ ｅ、カタログ番号Ａ４５１０５［１）に溶解したちの］をすべてのウェルに添加 して、３０分間室温でインキュベートした。この最後のインキュベーションの終 わりに、２規定の５０μＩの硫酸をそれぞれのウェルに添加して反応を止め、そ れぞれのウェルの４９０　ｎｍにおける吸光度を読んだ。結果をそれぞれの試料 のＯ，０，４９０で得られた値として、総ＣＤ４　”　Ｔ細胞／ｍｍ’または試 料の総容積に対してプロットした。相関係数は直線回帰分析を用いて計算した。

正常および旧Ｖ感染患者からの全血試料の絶対ＣＤ４　”　Ｔ細胞／ｍｍ３を下 記の式を用いて検定した。

絶対ＣＤ４　＋Ｔ細胞／ｍｍ’＝ ＷＢＣＸ％リンパ球Ｘ％ＣＤ４　”　Ｔ細胞。

ＷＢＣ（白血球数）は血球計算器により決定した。％リンパ球は、示差カウント により決定し、％ＣＤ４　”　Ｔ細胞はオルト・サイトフルオログラフＩＩおよ びＬｅｕ−３ａ　（抗ＣＤ４　）フルオレセイン結合抗体（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉ ｃｋｉｎｓｏｎ、　Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ　、カリフォルニア州）を用い て決定した。

６．２．実験結果 実験ｌ：全血中の総ＣＤ４抗原の測定。この研究は、全血の洗剤処理がＣＤ４イ ムノアツセイによる総ＣＤ４抗体の信頼できる測定を生むのかどうかを決定する ために行なった。全血の試料は１００μｌの抗凝固全血に対して２０μＩの洗剤 の比率を用いて、６倍洗剤溶液により処理した。これらの試料から段階的希釈物 を作って、総ＣＤ４抗原の減少していく量を含む一連の試料を作った。次に、こ れらの試料をＣＤ４アツセイで分析して、どの希釈物が試料希釈により直線とな る値をもたらすのかを決定した。アッセイの構成が過剰のＣＤ４で飽和するにし たがって、総ＣＤＪ値を示す光学的密度値は非直線となった。

この実験の結果は図１に見ることができる。３人の健康なボランティアより作っ た総ＣＤ４調製物を、非イオン性の濃縮洗剤で処理し、段階的にｌ：２の増分（ ■／２よりＩ／３２まで）で希釈した。

試料容積は試料緩衝液中に希釈することにより５０μｌに保った。

直線回帰分析において、２０μＩ未満の、好適には５〜ｌＯμｌの洗剤処理全血 を含む試料は直線範囲に入るために、総ＣＤ４測定に最適であることが示された 。２０μｍ以上の全血を含む試料はアッセイを飽和し、総ＣＤ４を正確に測定す ることはできなかった。

実験２：　総ＣＤ４抗原測定の特異性。３つの正常の対照の全血試料中に検出さ れた総ＣＤ４シグナルを阻止する抗ＣＤ４抗体の能力を表ＩＶに紹介した。この アッセイは、１（ＲＰ結合ネズミ抗ＣＤ４モノクローナル抗体をウェルに添加す る前に、被覆法で用いた５μｍの非結合ネズミ抗ＣＤ４モノクローナル抗体をウ ェルに添加し、続いて）ＩＲＰ結合抗体を添加した以外は、既に述べたように実 施した。

試料希釈液を使って、試料を５０μｌの最終体積まで希釈した。非結合の抗体は 、＃ｌ、２、および３の試料中において、用いられた競合抗体のレベルでそれぞ れ５０％、５１％および５１％だけ総ＣＤ４の検出を阻止することができた。こ のことは、総ＣＤ４を検出するアッセイの特異性を示すものである。全血試料の 洗剤溶解の間に放出された他のタンパク質（例えば、ヘモグロビン）はこのアッ セイを妨げなかった。

表１■ 洗剤処理した全血中の総ＣＤ４検出の特異性０．０．　４９５ 試料＃ＩＯμＩ”ｌＯμｍ＋抗ＣＤ４　”　％阻止１　０．４３３　０．２１６ 　５０％ ２　０．９２８　０．４７２　５１％ ３　０．８３３　０．４２２　５１％ ＊正常の非凝固全血から調製した洗剤処理済の１０μｍの全血ＨＣＤ４アツセイ からの抗ＣＤ４被覆抗体５μｌも結合競合のために添加した。

実験３：　総ＣＤ４値を用いる細胞数のカウント。この研究は、処理された全血 試料中の総ＣＤ４レベルの測定が絶対ＣＤ４陽性細胞数に関連性があるものかを 決定するために行なった。図２のデータは、全血試料中の測定された総ＣＤ４と ＣＤ４＋細胞／血液ｍｍ”の総体数との統計学的に有意な相関を示すものである （ｒ　＝０．９０４）。

このアッセイで測定された試料は、全部で５つの正常な対照からの、５０μｌの 最終容積まで希釈した洗剤処理済の全血２．５μｌを含んでいた。ＣＤ４＋細胞 ／ｍがの通常の範囲は、８００〜１０００細胞／ｍｍ’である。このアッセイの 通常の値は、ＣＤ４細胞数／ｌｌｌｌ１１″の決定に用いたＷＢＣカウントをＣ Ｄ４アツセイの実施後の３８目に非凝固の血液試料について行なった事実のため に、通常よりも低いように見える。このアッセイで検出された総ＣＤ４と個人の ＣＤ４”細胞／　ｍｍ　３との関係は直線回帰分析により決定し、統計学的に有 意の０．９０４のｒ値を得た。このことは、総ＣＤ４抗原の測定がＣＤ４陽性細 胞を直接に数えるために用いることができることを示している。

実験４：総ＣＤ抗原の測定を用いることよる、ＨＩＶに感染した個人および正常 な個人中のＣＤ４＋細胞のカウント。総ＣＤ４法の特質を健康なドナーを用いて 確立した後、ＥＬＩＳＡにより測定された総ＣＤ４の、旧Ｖ感染個人中のＣＤ４ ”　Ｔ細胞の総体数との関係を確立するためにさらに研究を行なった。

Ｈｌに感染の個人のおよび正常人の総ＣＤ４抗原値は、総ＣＤ４法を用い、２つ の別個の場合について決定した。これらの実験の結果は、図３および図４に示し た。病気群または対照群からのｌＯμｌの全血試料を５０μｌの全試料体積まで 希釈して、これを全ＣＤ４抗原値を決定するために用いた。この総ＣＤ４＋細胞 ／ｍが細胞をＣＤ４アツセイの当日に新しい非凝固血液試料について決定した。

図３および図４に、ともにこのアッセイで測定された総ＣＤ４抗原と旧■感染群 （シングルスクエア）と対照群（ダブルスクエア）の両方の総ＣＤ４＋細胞／Ｉ ＩＩＷ１′との間の統計学的に有意な相関を示す（図３および図４のそれぞれに ついて、ｒ・０．８６０および０．８６７）。したがって、洗剤処理済の全血か らの総ＣＤ４抗原の測定はく正常および旧Ｖ感染の個人の全血中のＣＤ４”　Ｔ 細胞の絶対数を正確に反映するものである。

６．３．考察 ここに記載のように、我々は、患者試料中の総ＣＤ４抗原のレベルの測定法を開 発した。全血試料は洗剤で処理し、一段階の３時間フォーマットのＣＤ４イムノ アツセイを用いてこれを検定した。

単純な洗剤溶解段階とＣＤ４イムノアツセイにより正常な個人の全血試料中にお いて総ＣＤ４抗原を検出できることを示した。洗剤で処理したｌＯμＩまたはそ れ以下の全血試料を用いて適切な検出の測定ができた。正確で再現性のある測定 が２．５μＩから５μｍまでの全血で達成できる。ネズミ抗ＣＤ４モノクローナ ル抗体が、アッセイフォーマットに添加されたときに、総ＣＤ４抗原シグナルを ブロックできるように、総ＣＤ４抗原の検出は特異的であった。全血の洗剤処理 中の他のタンパク質の放出は、アッセイの特異性を阻害しなかった。さらに、Ｅ ＬＩＳＡで得られた総ＣＤ４抗原値は、正常なドナーの全血中の全ＣＤ４”　Ｔ 細胞／ｍｍ”に相関性があることが示された（ｒ・０．９）。

ＣＤ４　ＥＬＩＳＡで得られた総ＣＤ４抗原と全血のＣＤ４”　Ｔ細胞／ｍｕｎ ”の総体数との比較は旧Ｖ感染の個人と正常人との両方において統計的に有意な 相関を与えた。この比較は、ＨＩＶ感染の個人と正常人の２つの異なる群を用い る２つの別個の場合において行なわれた。両方の比較は、総ＣＤ４抗原値と総Ｃ Ｄ４１Ｔ細胞／ｍｍ’との間の統計的に有意な相関を与えた（「・０．８６およ び０．８７）。総ＣＤ４抗原の測定は、ＣＤ４陽性の細胞数を正確に反映してい るので、総ＣＤ４法を用いてＣＤ４陽性細胞数の測定を行うことが可能であり、 また病気診断や治療のモニター等でＣＤ４陽性細胞数の決定が可能この実施例は 、ＣＤ４陽性細胞数を数える総ＣＤ４法の発展および特徴をさらに概説するもの である。この方法は３段階からなる：濃縮洗剤による試料の処理、濃縮洗剤溶解 物の希釈およびＣＤ４イムノアツセイである。

７．１．材料と方法 試料：バキュテイナーチューブ（ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ　ｔｕｂｅｓ）を含むＥ ＤＴＡ中に全血の９５の試料を集めて完全に混合した。流動細胞計測法により試 料の白血球の数と差およびＣＤ４＋リンパ球を分析した。

試料の処理：　試料は第６節で既述したように処理したが、以下の点で異なって いる： 段階ｌ： １体積分の濃縮洗剤溶液を５体積分の新鮮なＥＤＴＡ全血に添加した後、静かに 撹拌した。通常は１００μｌの全血を２０μｌの洗剤溶液で処理した。異なる濃 度の洗剤の比較において、最も良い結果がトウイーン２０などの洗剤とトリトン Ｘ１００またはＮＰ４０を含有するトリトンＸ−１００との組み合わせを用いて 得られた。この３種類の洗剤はどれも単独ではあまり効果的ではなかった。洗剤 処理済の試料（１００μｌの試料プラス２０μｌの濃縮洗剤）は、２．５％の最 終合計洗剤濃度となった。同じ濃縮洗剤を用いて総ＣＤ４および総ＣＤ８の両方 を測定する最適な洗剤溶液は、９％のトリトンＸ−１００および６％のＮＰ４０ であり（濃縮洗剤溶液中、合計で１５％）、これは処理された試料中では１．　 ５％トリトンＸ−１００と１％ＮＰ４０（合計で２．５％）に対応している。他 の実験において、処理試料中の洗剤の最終濃度は、１〜１．５％のＮＰ４０と組 み合わされた少なくとも１〜２％のトリトンＸ−１ｏｏの範囲にわたって同じよ うに有効であった。

細胞の溶解、可溶化または破壊の他の方法、例えば蒸留水による低浸透圧処理、 超音波処理、または、より低い濃度の洗剤の添加（例えば、処理試料中の１％濃 度の一種の洗剤）を試験し、これらは効果的でないことがわかった。

段階２： ５分後、１００μｌの処理した試料を４００μｍの希釈緩衝液で希釈（、で、ｌ ：５の希釈物を作った。この希釈試料の５０μＩ　（約１０Ｂ　ｌの全血）をそ れぞれのアッセイ・ウェルに用いた。このアッセイの構成により、得られた結果 が標準曲線の範囲内に入ったために、５−２５μｍの全血体積物の測定が可能と なった。血液容量は、これ以上まｔ、−はそれ以下の量でも、標準曲線の範囲外 の値を与えた。段階２の重要性は、処理（７た試料中の洗剤濃度の希釈にあり、 後続のアッセイの「ストリッピングＪおよびシグナルの低下を防止している。５ ０７ｚｌの全面に相応する試料は、ＣＤ４イムノアツセイではうまくいかないが 、これは、得られた値がアッセイ範囲の列側（こあるためであり、洗剤濃度は抗 体のサンドイッチ形成または抗体の安定性を壊すためであった。

アッセイ：アッセイの前に試料を一７０℃で保存した。これら試料を、第６節で 既に記載したように一段階のサンドイッチイムノアッセイで検定する。総ＣＤ４ 値は、標準曲線を用いて決定する。

標準は可溶性の組換えＣＤ４抗原であるが、これはＣＤ４遺伝子のトランスメン ブラン領域を除去した後に、端を切り取った遺伝子を哺乳類の細胞中で発現させ て、細胞培養物の上清中から組換えＣＤ４抗原を回収することにより調製したも のである（国際特許公告ＷＯ３８１０１３０４およびＷＯ３９１０２９２２を参 照）。

７．２．実験結果 実験５：　総ＣＤ４抗原法のための標準曲線は、組換えＣＤ４レセプターを含む 培養物上清を用いて作成した（図５を参照）。用いられるアッセイの構成のため に、標準の範囲は、０．９９９の相関係数を有するθ〜２００単位／μ■と決定 された。

実験６：ＣＤ４抗原のアッセイの特異性。血液試料を４人の正常なボランティア から採取して、以下のように処理した：それぞれの人の試料の白血球の数と差（ リンパ球であったＷＢＣのパーセント；第６．１．２．節の式を参照）を分析し た。試料の残りを分割した；１／２は、抗ＣＤ４を被覆したダイナビーズ（Ｄｙ ｎａｌ。

Ｉｎｃ、　Ｇｒｅａｔ　Ｎｅｃｋ、　Ｎ、Ｙ、）による吸着によりＣＤ４”細胞 を除去する一方で、残りの半分は未処理とした。除去を受けた試料および未処理 の試料を再び分割して、一つのフラクションを流動細胞計測法で分析し７、他方 のフラクションを総ＣＤ４法を用いて処理（７た。

流動細胞計測法により、第６．１゜２、節に記載の式を用いて、白血球細胞数、 リンパ球差、ＣＤ４細胞のパーセントからＣＤ４陽性細胞の数を計算した。ＣＤ ４陽性細胞数と総ＣＤ４抗原との比較は表■に示した。

表Ｖ。

ＣＤ４抗原の総ＣＤ４抗原アッセイの特異性未処理のフラクション　除去を受け たフラクション流動細胞計測法　総ＣＤ４抗原　流動細胞計測法　総ＣＤ４抗原 ＃細胞／μ夏　単位／μｍ　細胞／μｍ　単位／μ１２　９３４　４４５　０　 １１．５ 流動細胞計測法および総ＣＯ法の両方の方法において、除去を受けた全てのフラ クションからＣＤ４陽性細胞が除去されていることが示されており、このことは これらアッセイがＣＤ４レセプターに特異的であることを示している。

実験７：アッセイの希釈と直線性。この研究はアッセイの感度を実証するために さらに行なわれた。正常なボランティアからの全血試料をＥＤＴＡ中に集めた。

試料マトリックスをできるだけ正常に保ったための試料希釈液として用いるため に、それぞれの一部からＣＤ４陽性細胞を除去した。試料は希釈しないか、濃縮 洗剤により１／２　、ｌ／４　、ｌ／８に希釈して調製し、これらをＣＤ４イム ノアツセイに供した。表ｖ１に異なる６試料についてのこの実験の結果を示す。

値はこのアッセイで実施した生のデータとして示した。

ゼロの値は、試料希釈液として用いた除去部分について得られたアッセイ値を示 している。この値は、期待値の計算に包含されるものである。

表ｖ１ アッセイの希釈と直線性 これらの結果によれば、正常の全血試料は、本アッセイにおいて直線的に薄くな っている。アッセイのバックグラウンドは、〈２０単位である。希釈しない正常 試料はアッセイの範囲の中間に入ったので、ｌ：２の希釈でさえほとんど必要と されないであろう。

実験８：　総ＣＤ４法を用いる細胞数の測定。この研究により、総ＣＤ４法によ り全血中ＣＤ４陽性細胞数の測定が可能であることが確かめられた。採取して２ ４時間以内の正常および異常な血液試料について、流動細胞計測法と総ＣＤ４抗 原アッセイの両方をメリーランドメディカルラボラトリ−において実施した。流 動細胞計測法はコウルター・エビックス流動細胞計測機（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｅｐ ｔｃｓＦｌｏｗ　Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を用いて行ない、ＣＤ４イムノアツセイ はＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ　ＶＭＡＸ　ＥＬＩＳＡリーダーを用い て読み取った。低いＣＤ４陽性細胞数を有する試料を旧■陽性試料から選択した 。流動（ＦＩＯＷ）によりカウントされた細胞はＣＤ４陽性Ｔ細胞であることを 確かめるために、細胞を抗ＣＤ４抗体と抗ＣＤ２抗体により二重に染色した。全 部で９５試料（４６の正常試料と４９の異常試料）について、その白血球数、リ ンパ球差、およびＣＤ２＋ＣＤ４＋細胞パーセントを流動細胞計測法により、Ｃ Ｄ４の量を総ＣＤ４抗原法により検定した。ＣＤ４”　Ｔリンパ球の数は、細胞 の数、差およびフロー・データから計算し、総ＣＤ４法から得られたデータと直 線回帰により比較した。２種類の試料の分布は以下のとおりである：正常な４６ 試料 ＣＤ４”　Ｔ細胞数　５００〜１６００細胞／μｌ総ＣＤ４抗原　２２２〜６０ ０６００単ｒ１ｌ異常な４９試料 ＣＤ４”　Ｔ細胞数　１〜６９０細胞／μｍ総ＣＤ４抗原　４８〜２９５単位／ 鵬１直線回帰分析の結果は図６に示したが、ここで、総ＣＤ４抗原法の単位／ｍ ＋を流動細胞測定法の細胞／μｍと比較している。直線ノ勾配と（０，２６）お よびＹ切片（８９，７）　ハ、Ｙ　＝　０．２６Ｘ＋　８９．７（ここで、総Ｃ Ｄ４抗原単位／ｍｌは、全細胞数／μｍの０．２６倍プラス８９．７と算出され る）の直線回帰曲線方程式を規定する。その比較の相関係数は０．９４６であり 、このことは、総ＣＤ４抗原法によるＣＤ４陽性細胞数の測定は流動細胞計測法 による同じ細胞数の測定と同様に信頼性があることを示している。

７．３．考察 全血の処理試料中のＣＤ４レセプタータンパク質の定量は、ＣＤ４陽性Ｔリンパ 球数を測定する、流動細胞計測法に匹敵することが示されいる（「・０．９４６ ）。用いられたアッセイの構成のために、感度は１００単位／ｍｌまたは５０細 胞／μｌであり、このことが総ＣＤ４抗原法を試料の広い範囲（５０〜１６００ 細胞／μｌ）にわたる使用を可能にしている。試験された９５試料において、Ｃ Ｄ４陽性単球の存在は、アッセイ結果を妨害しなかった。１試験あたりわずかに ｌＯμｌの全血が必要となるだけなので、総ＣＤ４法が、得られ難い試料中のＣ Ｄ４＋Ｔ細胞を検出するために有用であろう。総ＣＤ４法は、流動細胞計測法の 手段なしに実験室で実施することができる。本方法は単純であり、４時間以内に 終了することができる。バッチ試験のために、試料は迅速に処理ができ、すぐに 検定または処理でき、および凍結して保存できる。治療過程後のある期間にわた る患者試料のそのようなバッチ試験は、試料が別個に異なる日に扱われる場合流 動細胞計測法で得られる誤差がない。総ＣＤ４法の洗剤処理段階も、エンベロー プのあるウィルスの不活性化という、操作者の安全性を増加させる付加された利 点を提供している。

（本頁以下余白） ８、　実施例：総ＣＤ８法によるＣＤ８陽性細胞の計数試料：　患者試料は２８ −２９８３細胞／μｌの範囲のＣＤ８”細胞カウント数を有する４９人の血清陽 性ＨＩＶ感染者と４６人の健康な成人ボランティアを含んでいた。

試料の処理：　全血試料は上記第７節に記載したように調製した。２００μｌの 濃厚洗剤溶液（９％トリトン−Ｘ１００および６％ＮＰ−４０）を１ｍＬの全血 に加えた。穏やかに混合した後、検定前に試料を希釈剤でｌ：５（５０μｌの処 理試料＋２００μｍの希釈剤）に希釈した。検定に先立って処理試料を一７０℃ で貯蔵した。

検定：　総ＣＤ８は１段階３時間フォーマットを使ってＣＥＬＬＦＲＥＥ　（商 標名）ＣＤ８イムノアツセイ（Ｔ　ｃｅｌｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ社）により洗剤 処理済の全血において測定した。簡単に述べると、９６ウエルーマイクロタイタ ープレートの各ウェルにリン酸緩衝液中の１００μｍのネズミ抗ＣＤ８被覆抗体 を４℃で一晩被覆した。被覆緩衝液を除き、ウェルあたり３００μｌの阻止緩衝 液（ＰＢＳ中の０．５％カゼイン、０．００８％ＮＰ−４０Ｓ　Ｏ，００５％Ｅ ＤＴＡ）を加え、３７℃で２時間インキュベートした。

ウェルを４００μｌの洗浄緩衝液（０，０５％トゥイーン２ｏを含むＰＢＳ、ｐ Ｈ７，４）で３回洗った後、ブランクとして使用したものを除いて、全てのウェ ルに５０ｕ１の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ネズミモノクローナ ル抗ヒトＣＤ８抗体（トリス緩衝液ＴＢＳ中のｌＯ％ＦＣ３，０，０２５％チメ ロサール、０．０１％ゲンタマイシン、０．０５％トウイーン）を加えた。５０ μｍのＣＤ８標準または処理済の全血を２００μｌの希釈剤（１％ウシ血清アル ブミン、リン酸緩衝液、０．２５％ＮＰ−４０および０．Ｏ１％チメロサール） に加え、５０μｌのこれを適当なマイクロタイターウェルに加えた。プレートを プレートシーラーで覆い、１５０ｒｐｍで振とうしながら２０℃で３時間インキ ュベートした。上記のようにプレートを洗った後、全ウェルに１００μｍのＯＰ Ｄ基質を加え、プレートを２０℃で３０分間インキュベートした。５０μｌの２ Ｎ硫酸を全ウェルに加えて反応を停止させ、４９０ｎｍで吸光度を測定した。標 準曲線（相関＞０．９９９．範囲０−２３００単位／μｌ；検定バックグラウン ド〈１００単位）は、標準の濃度に対してＯＤをプロットすることにより作成し た。その後標準曲線から全血試料中の総ＣＤ８の濃度をめた。相関係数は一次回 帰分析を使って計算した。

正常およびＨＩＶ感染患者からの全血試料は、絶対ＣＤ８”　Ｔ細胞／　ｍ　ｍ 　’について次式を用いて検定した：絶対ＣＤ８”　Ｔ細胞／ｍｍ３− ＷＢＣＸ％リンパ球Ｘ％ＣＤ８”　Ｔ細胞ＷＢＣ（白血球数）は血球計数器を使 って測定した。％リンパ球は白血球百分率（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｃｏｕ ｎｔ）で測定し、％ＣＤ８”　Ｔ細胞はオルソ・サイトフルオログラフ１１およ びＬｅｕ−２ａ（抗ＣＤ８）フルオレセイン結合抗体（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋ ｉｎｓｏｎ、　ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ、　ＣＡ）を使って測定した。

８．２．　実験結果 実験１．　ＣＤ８検定の特異性および直線性は、第７節に記載したような類似の 枯渇および希釈実験を用いて決定した。総ＣＤ８抗原値は４３人の正常者と４３ 人のＨＩＶ感染−血清陽性個体の全血から得られ、全血１ｍｍ”あたりのＣＤ８ ”　Ｔ細胞の総数と比較した。表ＶＩＩにはフローサイトメトリーおよび総ＣＤ ８法による正常および異常試料の集団統計を要約しである。正常試料はｒ＝０． ７７２の直線相関を有し、ＨＩＶ＋試料はｒ＝ｏ。

７１８の直線相関を有する。

表ＶＩＩ ４５人の正常患者試料の平均範囲 男性であった　女性であった ４９人のＨＩＶ＋患者試料の平均範囲 ４５人は年齢が２４−６５才の　４人は２１−４３才の男性であった　女性であ った 図７は、検定で測定した総ＣＤ８抗原とＣＤ８＋細胞の総数との統計学的に有意 な相関（ｒ＝０．７５）を示す。８６人のこの実験において、総ＣＤｄ値が正常 である場合は、総ＣＤＢ値もそうであることがわかった。ＨＩＶ＋患者ではＣＤ ４値が低下したので、総ＣＤａ値は広範に変化した。低いＣＤ４（＜１８０単位 ／ｍｌ）および低いＣＤＢ値を有する試料は一般に低い白血球カウント数を有し ていた。ＨＩＶ＋患者の中には、おそらく減少し実験２．　実験ｌの総ＣＤ８法 （ｒ＝０．　７５）を使ってＣＤ８陽性細胞を計数できるだろうが、この計数は 総ＣＤ４法（ｒ＝０．９４６）によるＣＤ４陽性細胞の計数はど正確ではなかっ た。

ＣＤ８陽性細胞の活性化は結果的に大量の可溶性ＣＤ８抗原の放出をもたらすの で、５ＣＤ８のレベルが総ＣＤ８抗原レベルとＣＤ８陽性細胞カウント数との相 関に影響を及ぼしていたと思われる。この仮説を試験するために、総ＣＤ８抗原 と可溶性ＣＤ８抗原を３０人の正常患者および１１人のガン（主にメラノーマと リンパ腫）患者の全血試料において測定した。総ＣＤ８抗原の測定は洗剤処理、 希釈およびイムノアッセイに関して上記したように行い、そして可溶性ＣＤ８レ ベルは血漿調製物のイムノアッセイにより直接測定した。総ＣＤ８抗原と可溶性 ＣＤ８抗原の両方に対して同じＣＤ８イムノアツセイを採用した。１容量の血漿 （試料サイズ）は等しいサイズの全血試料の２倍の血漿量を有するので、血漿中 の可溶性ＣＤＢ量は２で割った。細胞関連ＣＤ８　（膜結合＋細胞質）の量は、 総ＣＤ８抗原の量から（２で割った）ＣＤ８の可溶性レベルを引くことによりめ た。この分析の結果を図８に示す。このデータの一次回帰分析は、総ＣＤ８抗原 だけのときの０．７５に対して、０．８５９の改良された相関係数を与えた。細 胞計数は次の方程式： ％式％） ここに記載したように、我々は患者試料中の総ＣＤ８抗原のレベルを測定する総 ＣＤ８法を開発した。全血試料を洗剤で処理し、希釈し、１段階３時間フォーマ ットでＣＤ８イムノアツセイにより検定した。総ＣＤ８法で得られた総ＣＤ８抗 原値は、全血中の総ＣＤ８＋Ｔ細胞数（ｒ＝０．　７５）と相関していた。総Ｃ Ｄ８抗原のレベルから（活性化細胞から放出された）可溶性ＣＤ８抗原のレベル を差し引いたときに、全血中のＣＤ８＋細胞を計数する能力の顕著な改善が見ら れた（ｒ＝０．　８５９）。可溶性抗原と総抗原の関係をモニターすることは、 細胞計数と免疫活性化についての改善された情報を提供した。従って、総ＣＤ８ 検定は、単独でまたは他の可溶性あるいは総マーカー検定と組み合わせて、患者 の免疫プロフィールをモニターするために使用できる。

９、　実施例：総ＴＣＲ法によるＴＣＡＲ陽性細胞の計数縁ＴＣＡＲβ実験：　 総Ｔ細胞抗原レセプター（Ｔ　ＣＡ　Ｒ）β鎖または総Ｖβ５特異的ＴＣＡＲ鎖 を検出する検定法は、総ＴＣＲ法において洗剤処理済の全血を用いて行った。簡 単に述べると、９６ウエルプレートの各ウェルに、陰性対照抗体（γδＴ細胞レ セプターのＶδ１領域に特異的なδＴＣ８Ｉ）またはβ　鎖の定常部（Ｃβ）を 認識するＷ２ＢあるいはＷ　１１２　（Ｔｉａｎｅｔ　ａｌ、、　１９８９．　 ＦＡＳＥＢ　Ｊ、　３：Ａ４８６　Ａｂｓｔｒ）のようなＶβ５特異的モノクロ ーナル抗体から成る５μｇ／ｍｌの被覆抗体を被覆した。

Ｗ２Ｂとは異なるβ鎖定常部（Ｃβ）のエピトープを認識する西洋ワサビペルオ キシダーゼ結合（ＨＲＰ）−βＦｌ抗体を検出抗体として用いた。全血溶解液は 上記の第７節に記載したように調製した。検定フォーマットは１９８９年７月４ 日に発行された「細胞を含まないＴ細胞抗原レセプター関連分子を検出するため の検定系および検定の臨床的有用性」と題する米国特許第４．８４５゜０２６号 に記載されるものと類似していた。さらに、上記の第７節に記載した１段階３時 間フォーマットを実施して、同様の結果を得た。２５μｌの全血溶解液を１＝４ の出発希釈率のために７５μｍの試料希釈液で希釈した。得られた全ての値から 、陰性対照ウェルからのＯＤ値を差し引いた（被覆抗体としてδＴＣ３Ｉを用い た陰性対照ウェルの平均値は０．１０であり、抗体を含まないブランクウェルの 平均値は０．０９５であった）。

総ＴＣＡＲ検定の結果を図９に示しである。ＴＣＡＲβ鎖はｌ：４およびｌ：８ の希釈率で最適に検出された。Ｖβ５特異的ＴＣＡＲも低いレベル（１：１６の 希釈率）で検出された。細胞のＶβ５陽性サブセットは全てのβＴＣＡＲ陽性Ｔ 細胞のほんの小部分を表すにすぎないので、より低いレベルのＶＢ２が予想され た。この検定はバックグラウンドとして良好な特異性を示し、ＯＤは被覆抗体を 含まないブランクウェルから得られたＯＤ値と比べて、被覆抗体として対照抗体 δＴＣ８Ｉを用いたときに、決して高くなかった（それぞれ０．１００と０．０ ９５）。

これらのデータは、β鎖の定常部の異なる領域を認識する２つのモノクローナル 抗体を用いることにより、全血試料中のＴＣＲβ鎖の総量を検出するために総Ｔ ＣＡＲ法を使用できることを示している。β鎖の総量は試料中のβ陽性Ｔ細胞の 総量の指標となる。さらに、正常血液中の総ＴＣＡＲβ鎖の１−５％にすぎない Ｖβ５ファミリーのような特定のサブセットも検出できる。

総ＴＣＡＲＶδ１実験：　試料の処理は第７節と同様であったが、Ｉ　ＸＰＢＳ 中の９％トリトンＸ−１００および６％ＮＰ４０の濃厚な洗剤溶液を全血に濃厚 洗剤溶液２００μｍ対全血１ｍＬの比で加えた。その後、イムノアッセイに先立 って試料をｌ：２に希釈した。イムノアッセイの手順はＣＤ４やＣＤ８イムノア ツセイと類似していたが、捕獲抗体として抗体ＴＣＲδ１を、検出抗体としてδ ＴＣ８ｌを用いた。ＴＣＡＲδ陽性細胞系ＰＥＥＲを陽性対照として用いた。標 準曲線を作成（２、−７０℃で貯蔵され、２０，０００単位の値を指定されたＰ ＥＥＲ細胞試料に基づいて単位を任意に割り当てた。ＴＣＡＲδ鎖の検定の特異 性は抗体−アフィゲル（ａｆｆｉｇｅｌ）ストリッピング法を使って測定した。

アフィゲルｌＯをＢＳＡ、抗ＣＤ８抗体４Ｃ９（イソタイプ対照抗体）、δＴＣ Ｓ　１．ＴＣＲδ１．、ＶＢ２またはＶ７２に１ｍｇ／ｍｌの濃度でカップリン グさせた。それぞれの試料から５０１５０スラリーを調製した。３００μｌの洗 剤処理済のＰＥＥＲ細胞試料を５０μＩの各抗体−アフィゲルスラリーに加えた 。試料／ゲルを４℃で１時間インキュベートした。その後試料をＩＯＫで５分間 遠心した。上清を分離し、５０μｍ以上の抗体−アフィゲルスラリーに加えた。

試料／ゲルを４℃でさらに１時間インキュベートした。このプロセスを合計３回 の試料／アフィゲルインキュベーションにおいて繰り返した。最後の遠心のあと に上清を分離し、試料として検定にかけた。ＰＥＥＲ試料を抗体−アフィゲルス トリッピングの前に試料希釈緩衝液で１＝２５に希釈したので、検定に先立って 上清を１＝２に希釈しなかった。抗体−アフィゲルでストリッピングされない試 料は、他の試料がストリッピングされている間、４°Ｃに保った。試料からＴＣ Ｒδ反応性を完全に奪うたった２つの抗体はＴＣＡＲδ鎖特異的鎖体異的抗体Ｒ １とＴＣ８δ１であり、このことは検定がＴＣＲδ鎖に特異的であることを示し ている。８つの試料を総ＴＣＡＲδ鎖法で実験したとき、総ＴＣＡＲδは５５− １０８単位の範囲であった（図１．０）。これらは全て標準曲線の比較的低い末 端にとどまった。

総βまたは総δＴＣＲ抗原量を測定するこれらの総ＴＣＡＲ法の成功は、同様に 、総Ｖα、総γδ、総αβ、または総Ｖγおよび関連サブセットの検定法にも拡 張することができる。上記βおよびδ抗原の総量の検出は、細胞型を決めるのに 、または症状や治療結果に特異的Ｖ領域発現を関連させるのに有用である。

ｉｏ、ハイブリドーマの寄託 表示したモノクローナル抗体を産生ずる次のハイブリドーマ細胞系はメリーラン ド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託され、 以下の受託番号を指定された：寄託 細胞系４Ｃ９４Ｃ９（抗ＣＤ８）　ＨＢ　９３４０細胞系５Ｆ４／７Ｂ１２　５ Ｆ４／７Ｂ１２　（抗ＣＤ８）　ＨＢ　９３４２細胞系８Ｆ４　８Ｆ４（抗ＣＤ ４）　）ＩＢ　９８４３細胞系Ｒ２Ｂ７　Ｒ２Ｏ３（抗ＣＤ４）　ＨＢ　９８４ ２細胞系８Ａ３．３１　８Ａ３．３１　（βＦｌ）　ＨＢ　９２８３細胞系δＴ Ｃ８ｌ　δＴＣＡＲ３＝δＴＣ３Ｉ　ＨＢ　９５７８細胞系Ｗ１１２　Ｗ１１２ （ＶＢ２）　ＨＢ　９９２７細胞系Ｗ４Ｆ、５Ｂ　Ｗ４Ｆ、５Ｂ　（抗Ｃβ’） 　ｌ（Ｂ　９２８２細胞系５Ａ６．　Ｅ９　ＴＣＲδｌ　ＨＢ　９７７２（本頁 以下余白） 寄託された態様は本発明の一面の単なる例示であるので、本発明は寄託された細 胞系によって範囲を限定されるものではなく、機能的に等しいあらゆる細胞系が 本発明の範囲に含まれる。実際、当分野で習熟した者には、ここに示したものの ほかに、本発明の種々の変更が前述の説明および添付の図面から明らかとなろう 。

かかる変更も添付した請求の範囲に入るものである。

本明細書中で多数の文献が引用されているが、これらの記載内容は参照によりそ のままここに組み込むものとする。

（本頁以下余白） Ｆｉｇｕｒｅ　５ ＣＤ４単位／ｍｌ Ｆｉｇｕｒｅ　６ 細胞／ｍｍ ・＝正常試料　Ｘ：Ｈｒ　ｖ１試料 Ｆｉｇｕｒｅ　７ 細胞１口１０１３ 、：正常試料　Ｘ＝ＨＩＶ”試料 ＼　臼 Ｌ＼ Ｙ回 も壜 １啼 口高 さＵ Ｐ 口部 に衆 Ｎ蓼

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．白血球マーカーをもつと思われるもとの試料中の白血球マーカーの総量を測 定する方法であって、もとの試料が細胞および生物学的液体（細胞が得られる） を含むものであり、（ａ）もとの試料に非イオン洗剤を加えて洗剤−処理試料を 調製し、 （ｂ）洗剤にその中の細胞を溶解させ、（ｃ）洗剤−処理試料を少なくとも２倍 に希釈し、そして（ｄ）洗剤−処理試料中の白血球マーカーの量を免疫学的検出 手段により測定し、それからもとの試料中の白血球マーカーの総量を計算する、 ことから成る方法。 ２．洗剤−処理試料中の非イオン洗剤の濃度が約２％〜約４％である、請求項１ 記載の方法。 ３．非イオン洗剤が１種より多くの非イオン洗剤を含む、請求項１記載の方法。 ４．非イオン洗剤がトリトンＸ−１００、ノニデットＰ−４０、トゥイーン−２ ０およびＣＨＡＰＳより成る群から選ばれる、請求項１または３記載の方法。 ５．非イオン洗剤が約１％〜約２％の濃度のトリトンＸ−１００と約１％〜約２ ％の濃度のノニデットＰ−４０を含み、トリトンＸ−１００とノニデットＰ−４ ０の濃度が洗剤−処理試料中のそれらのそれぞれの濃度である、請求項１記載の 方法。 ６．洗剤−処理試料中の非イオン洗剤の濃度が非イオン洗剤のウイルス不活化濃 度である、請求項１記載の方法。 ７．非イオン洗剤が細胞を少なくとも約１分間で溶解する、請求項１記載の方法 。 ８．段階（ｂ）の後で洗剤−処理試料を約−２０°またはそれ以下で貯蔵する、 請求項１記載の方法。 ９．洗剤−処理試料を約−７０°またはそれ以下で貯蔵する、請求項８記載の方 法。 １０．もとの試料が全血、血漿、血清、血球、唾液、尿、滑液、胸膜滲出液、腫 瘍および組織浸潤物、羊水、脊髄液、頭蓋液、組織および組織培養液より成る群 から選ばれる、請求項１記載の方法。 １１．試料が全血である、請求項１０記載の方法。 １２．免疫学的検出手段がラジオイムノアッセイ、酵素結合イムノアッセイ、“ サンドイッチ”イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノ アッセイ、およびプロテインＡイムノアッセイより成る群から選ばれる、請求項 １記載の方法。 １３．免疫学的検出手段が“サンドイッチ”イムノアッセイである、請求項１２ 記載の方法。 １４．白血球マーカーがＣＤ４、ＣＤ８およびＴ細胞抗原レセプターより成る群 から選ばれる、請求項１記載の方法。 １５．白血球マーカーがＣＤ４であり、免疫学的検出手段がＡＴＣＣに受託番号 ＨＢ９８４３として寄託された第一抗体８Ｆ４、およびＡＴＣＣに受託番号ＨＢ ９８４２として寄託された第二抗体Ｒ２Ｂ７を用いるサンドイッチイムノアッセ イである、請求項１記載の方法。 １６．白血球マーカーがＣＤ８であり、免疫学的検出手段がＡＴＣＣに受託番号 ＨＢ９３４０として寄託された第一抗体４Ｃ９、およびＡＴＣＣに受託番号ＨＢ ９３４２として寄託された第二抗体５Ｆ４／７Ｂ１２を用いるサンドイッチイム ノアッセイである、請求項１記載の方法。 １７．白血球マーカーがβＴ細胞抗原レセプターであり、免疫学的検出手段がＡ ＴＣＣに受託番号ＨＢ９９２７として寄託されたＶβ５特異的抗体Ｗ１１２、お よびＡＴＣＣに受託番号ＨＢ９２８２として寄託されたＣβ特異的抗体Ｗ４Ｆ． ５Ｂより成る群から選ばれる第一抗体、およびＡＴＣＣに受託番号ＨＢ９２８３ として寄託された第二抗体８Ａ３．３１（βＦ１）を用いるサンドイッチイムノ アッセイである、請求項１記載の方法。 １８．白血球マーカーがδＴ細胞抗原レセプターであり、免疫学的検出手段がＡ ＴＣＣに受託番号ＨＢ９７７２として寄託された第一抗体ＴＣＲδ１、およびＡ ＴＣＣに受託番号ＨＢ９５７８として寄託された第二抗体δＴＣＳ１を用いるサ ンドイッチイムノアッセイである、請求項１記載の方法。 １９．白血球マーカーをもつと思われるもとの試料中の白血球マーカーの総量を 測定する方法であって、もとの試料が細胞を含むものであり、 （ａ）試料に非イオン洗剤を加えて洗剤−処理試料を調製し、（ｂ）洗剤にその 中の細胞を溶解させ、（ｃ）洗剤−処理試料を少なくとも２倍に希釈し、そして （ｄ）洗剤−処理試料中の白血球マーカーの量を免疫学的検出手段により測定し 、それからもとの試料中の白血球マーカーの総量を計算する、 ことから成る方法。 ２０．もとの試料中の白血球マーカーについて陽性の白血球のおよその数を計数 する方法であって、 （ａ）請求項１、３、５、１３または１９の方法に従って、もとの試料中の白血 球マーカーの総量を測定し、そして（ｂ）段階（ａ）で測定した白血球マーカー の総量からもとの試料中の白血球マーカーについて陽性の細胞のおよその数を計 算する、 ことから成る方法。 ２１．さらに、 （ｉ）もとの試料中の可溶性白血球マーカーの量を別個に測定し、そして （ｉｉ）段階（ａ）で測定した白血球マーカーの総量からもとの試料中の可溶性 白血球マーカーの量を差し引き、そして段階（ｂ）において、段階（ｉｉ）の引 算の残りからもとの試料中の白血球マーカーについて陽性の細胞のおよその数を 計算する、ことを含む、請求項２０記載の方法。 ２２．白血球マーカーがＣＤ８である、請求項２１記載の方法。 ２３．もとの試料中の白血球マーカーについて陽性の白血球のおよその数を計数 する方法であって、 （ａ）もとの試料に非イオン洗剤を加えて洗剤−処理試料を調製し、 （ｂ）洗剤にその中の細胞を溶解させ、（ｃ）洗剤−処理試料を少なくとも２倍 に希釈し、（ｄ）洗剤−処理試料中の白血球マーカーの活性を免疫学的検出手段 で検出し、そして （ｅ）洗剤−処理試料中の白血球マーカーの活性を、白血球マーカーについて陽 性である既知数の細胞を含む標準試料の活性と比較する、 ことから成る方法。 ２４．試料中の白血球マーカーについて陽性の白血球のおよその数を計数する方 法であって、 （１）請求項１９の方法に従って試料中の白血球マーカーの総量を測定し、そし て （２）段階（１）で測定した白血球マーカーの総量から白血球マーカーについて 陽性の細胞のおよその数を計算する、ことから成る方法。 ２５．段階（ｂ）の計算は、 （ｉ）白血球マーカーの量対白血球マーカーについて陽性の白血球の数の標準曲 線から推定する、および（ｉｉ）次式： 白血球数＝ｍ（総白血球マーカー）＋ｂに従って、白血球マーカーの総量に相関 係数ｍを掛け、相関係数ｂを加える、 ことより成る群から選ばれる計算である、請求項２０または２４記載の方法。 ２６．病気をもつ疑いのある患者からの試料において、白血球マーカーの総量を 請求項１、３、６、１３または１９の方法に従って検出し、そして検出した量を 正常個体の総白血球マーカーの量と比較することから成り、これらの量の差異が 病気の状態を示すものである、病気の診断、検出または病期決定方法。 ２７．患者試料中の白血球マーカーについて陽性の白血球のおよその数を請求項 ２０、２３または２４の方法に従って計数し、そして白血球のおよその数を正常 個体に存在する白血球の数と比較することから成り、これらの数の差異が病気の 状態を示すものである、病気をもつ疑いのある患者における病気の診断、検出ま たは病期決定方法。 ２８．白血球マーカーがＣＤ４、ＣＤ８およびＴ細胞抗原レセプターより成る群 から選ばれる、請求項２６または２７記載の方法。 ２９．白血球マーカーがＣＤ４であり、病気が後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ ）、ＡＩＤＳ関連症候群、およびＣＤ４＋白血病またはリンパ腫より成る群から 選ばれる、請求項２８記載の方法。 ３０．白血球マーカーがＣＤ８であり、病気がＡＩＤＳ、移植拒絶、慢性関節リ ウマチ、および感染症より成る群から選ばれる、請求項３０記載の方法。 ３１．病気をもつ疑いのある患者における病気の診断、検出または病期決定方法 であって、 （ａ）患者からのもとの試料において、少なくとも２つの白血球マーカーの総量 を請求項１、３、５、１３または１９の方法に従って測定し、 （ｂ）段階（ａ）で測定した白血球マーカーの量の比を求め、そして （ｃ）段階（ｂ）で求めた白血球マーカーの比を正常個体の同じ比と比較し、こ れらの比の差異が病気の状態を示すものである、ことから成る方法。 ３２．病気をもつ疑いのある患者における病気の診断、検出または病期決定方法 であって、 （ａ）患者からの試料において、少なくとも２つの白血球マーカーについて陽性 の白血球のおよその数を請求項２０、２３または２４の方法に従って計数し、 （ｂ）段階（ａ）で計数した白血球マーカーのそれぞれについて陽性の白血球の 比を求め、そして （ｃ）段階（ｂ）で求めた白血球の比を正常個体の比と比較し、これらの比の差 異が病気の状態を示すものである、ことから成る方法。 ３３．白血球マーカーがＣＤ４とＣＤ８であり、病気がＡＩＤＳである、請求項 ３１または３２記載の方法。 ３４．病気の治療を受ける患者からの試料において白血球マーカーの総量を請求 項１、３、５、１３または１９の方法に従って検出し、検出した量を正常個体の 総白血球マーカーの量と比較することから成り、これらの量の差異が病気の状態 の変化を示すものである、病気の治療効果をモニターする方法。 ３５．患者からの試料において白血球マーカーについて陽性の白血球のおよその 数を請求項２０、２３または２４の方法に従って計数し、白血球のおよその数を 正常個体に存在する白血球の数と比較することから成り、これらの数の差異が病 気の状態の変化を示すものである、病気の治療を受ける患者において病気の治療 効果をモニターする方法。 ３６．白血球マーカーがＣＤ４、ＣＤ８およびＴ細胞抗原レセプターより成る群 から選ばれる、請求項３４または３５記載の方法。 ３７．白血球マーカーがＣＤ４であり、病気が後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ ）、ＡＩＤＳ関連症候群、およびＣＤ４＋白血病またはリンパ腫より成る群から 選ばれる、請求項３６記載の方法。 ３８．白血球マーカーがＣＤ８であり、病気がＡＩＤＳ、移植拒絶、慢性関節リ ウマチ、および感染症より成る群から選ばれる、請求項３６記載の方法。 ３９．病気の治療を受ける患者において病気の治療効果をモニターする方法であ って、 （ａ）患者からのもとの試料において、少なくとも２つの白血球マーカーの総量 を請求項１、３、５、１３または１９の方法に従って測定し、 （ｂ）段階（ａ）で測定した白血球マーカーの量の比を求め、そして （ｃ）段階（ｂ）で求めた白血球マーカーの比を正常個体の同じ比と比較し、こ れらの比の差異が病気の状態の変化を示すものである、 ことから成る方法。 ４０．病気の治療を受ける患者において病気の治療効果をモニターする方法であ って、 （ａ）患者からの試料において、少なくとも２つの白血球マーカーについて陽性 の白血球のおよその数を請求項２０、２３または２４の方法に従って計数し、 （ｂ）段階（ａ）で計数した白血球マーカーのそれぞれについて陽性の白血球の 比を求め、そして （ｃ）段階（ｂ）で求めた白血球の比を初期の患者の比と比較し、これらの比の 差異が病気の状態の変化を示すものである、ことから成る方法。 ４１．白血球マーカーがＣＤ４とＣＤ８であり、病気がＡＩＤＳであり、初期の 頃の患者に対して患者のＣＤ４対ＣＤ８陽性白血球の比の増加が病気の快方を示 すものである、請求項３９または４０記載の方法。 ４２．試料中の白血球マーカーの総量を測定するキットであって、（ａ）濃厚な 非イオン洗剤の溶液、および（ｂ）白血球マーカーに対し特異的な免疫学的検出 手段、をそれぞれ適当な容器内に含むキット。 ４３．濃厚な非イオン洗剤の溶液が蒸留水中に９％トリトンＸ−１００と６％ノ ニデットＰ−４０を含む、請求項４２記載のキット。 ４４．免疫学的検出手段がサンドイッチイムノアッセイである、請求項４２記載 のキット。 ４５．白血球マーカーについて陽性の、既知数の細胞を含む標準品をさらに含む 、請求項４２記載のキット。 ４６．１種より多くの白血球マーカーの免疫学的検出手段を含む、請求項４２記 載のキット。 ４７．白血球マーカーがＣＤ４であり、免疫学的検出手段がＡＴＣＣに受託番号 ＨＢ９８４３として寄託された第一抗体８Ｆ４、およびＡＴＣＣに受託番号ＨＢ ９８４２として寄託された第二抗体Ｒ２Ｂ７を用いるサンドイッチイムノアッセ イである、請求項４２記載のキット。 ４８．白血球マーカーがＣＤ８であり、免疫学的検出手段がＡＴＣＣに受託番号 ＨＢ９３４０として寄託された第一抗体４Ｃ９、およびＡＴＣＣに受託番号ＨＢ ９３４２として寄託された第二抗体５Ｆ４／７Ｂ１２を用いるサンドイッチイム ノアッセイである、請求項４２記載のキット。 ４９．白血球マーカーがβＴ細胞抗原レセプターであり、免疫学的検出手段がＡ ＴＣＣに受託番号ＨＢ９９２７として寄託されたＶβ５特異的抗体Ｗ１１２、お よびＡＴＣＣに受託番号ＨＢ９２８２として寄託されたＣβ特異的抗体Ｗ４Ｆ． ５Ｂより成る群から選ばれる第一抗体、およびＡＴＣＣに受託番号ＨＢ９２８３ として寄託された第二抗体８Ａ３．３１（βＦ１）を用いるサンドイッチイムノ アッセイである、請求項４２記載のキット。 ５０．白血球マーカーがδＴ細胞抗原レセプターであり、免疫学的検出手段がＡ ＴＣＣに受託番号ＨＢ９７７２として寄託された第一抗体ＴＣＲδ１、およびＡ ＴＣＣに受託番号ＨＢ９５７８として寄託された第二抗体δＴＣＳ１を用いるサ ンドイッチイムノアッセイである、請求項４２記載のキット。