JPH06505478A - 家禽にｉｎ ｏｖｏで直接供給微生物をデリバリーする方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 家禽にｉｎ　ｏｖｏで直接供給微生物をデリバリ−する方法発明の分野 本発明は動物にｉｎ　ｏｖｏで生存微生物細胞をデリバリ−する新規方法に関す る。

背景に関する情報 “プロバイオティクス（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ）”という用語はＰａｒｋｅｒ（ ２０）によるもので、彼はそれを補足食物として用いられる場合“腸のバランス に寄与する生物及び物質”として定義した。この出版物及び本文に引用する他の すべての出版物及び特許をここに参照として挿入する。後にＦｕｌｌｅｒ（１１ ）は、それは細胞培養物及び微生物の代謝物を含む他に抗生物質調剤も含み得る のでこの定義を広すぎると考えた。より近年になって、生産動物（ｐｒｏｄｕｃ ｔ　ｉｏｎ　ａｎｉｍａ　Ｉ　ｓ）のための腸接種材料としてプロバイオティク スを利用するための科学的基礎を記載した多（の要約が文献中に現れた（１０． ２６）。

“プロバイオティクス”という用語を“直接供給微生物”、又はＤＦＭ’ｓとい う用語で置き換えることが示唆された。

胃腸管に補足食物として生存無害乳酸菌を与えるという考えは、Ｍｅｔ　ｃｈｎ 　＋　ｋｃＭ　ｆ　（１６）により最初に認識され、彼はブルガリア農民がヨー グルｒを消費することが長い寿命を与えていると考えた。何人かの研究者は、そ のような発酵乳製品の摂取から導かれる治療的価値がこれらの製品中に存在する 生存菌に関連していると主張した（１２．２７）。Ｍｅ　ｔ　ｃｈｎ　１ｋｏｆ 　ｆの初期の報告以来、いくつかの研究が乳酸菌の能力、例えば腸内バクテリア の成長の抑制などを示してきた。之（３）、排泄物中の乳酸菌の数が増加し、腸 内バクテリアの数が減少することが示された（４）。これらの発見は、ラクトバ シルス　アシドフイ／ｌ／Ｘ（８，１３）を与えることから、又はラクトバシル ス　アシドフイとができなかった他の研究者の発見と対照的である。

Ｍｕｒａｌ　１ｄｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ、（１８）による詳細な研究において、 誕生後最高８週間ラクトバシルス　ラクチス濃厚液を与えられた子豚は、排泄物 試料中の腸内バクテリアの数が徐々に減少した。これらの動物における下痢は無 視できるものであったが、標準の豚では特に離乳時に明白である。Ｕｎｄｅ　ｒ ｄａｈ　Ｉ　ｅ　ｔ　ａ　１．　（３２）は、人工的な木１１ＪＪｔｆｉ（Ｅｓ ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）感染の前に各上−４日間続くのみであるのを観 察した。同様の研究において、木問司を同様にして注入するがａ叫Ｈａ　（Ｓｔ 　ｒｅｐｔｏｃｏｃｕｓ）微生物により予防処Ｗ＠；テわなかった豚において、 持続性の下痢が起こった。

プロバイオ料りス（後文ではＤＦＭ’　ｓと呼ぶ）は、経口的に投与されるか又 は飼料に加えられるバクテリア又は酵母調剤である。最も普通に用いられるＤＦ Ｍ’ｓは乳酸菌（Ｌ　Ａ　Ｂ　）の株、特に之りしＮＫ火ス、ラクトコックス（ Ｌａｃ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ）及びエンテロコックス例えばストレスなどにより抵 抗力の低い期間に望ましくない微生物が人を含む動物の胃腸管内で増殖すること ができると一般に考えられている。微生物の正常で健康的なバランスの維持がそ のようなストレスの多い期間には重要であるとされている（１０）。従ってＤＦ Ｍ’　ｓの使用の基礎となる概念は、（ｉ）ストレス及び／又は病気の時、（ｉ ｉ）誕生時、又は（ｉｉｉ）抗生物質処置の後（Ｌ、　Ａ　Ｂの存在が最少の時 ）に、十分な数の適した微生物が腸管内に導入されれば、微生物のアンバランス の負の結果を最小とするか、又は克服することができるということである。その ような生きた、天然に存在する微生物の使用は、ストレス、病気及び抗生物質治 療後の間に胃腸管の有益な微生物の正しいバランスを取り戻し、維持するのを助 ける（１０）。この概念、提案された作用様式の説明、及びすべての生産動物の 場合にＤＦＭ’　ｓが有効に使用される証拠がＦａｘ　（１０）　、５ｉｓｓｏ ｎｓ　（２６）及び種々の著者（２２）によるレビュー中にまとめられている。

商業的規模で動物にＤＦＭ’　ｓを適用する場合に遭遇する主要な問題又は限界 の１つは、（ｉ）適したデリバリ−系の利用性、及び（ｉ　ｉ）動物に誕生後で きるだけ〒くプロバイオティック調剤を与える可能性である。これは家禽産業の 場合のようにペレット化された飼料を用いる場合特にあてはまる。ペレット化法 は一般に、飼料成分の低温殺菌又は滅菌に十分な高温を含む１回か又はそれ以− １−の加熱段階を含み、それがペレット化の前に生存微生物をこれらの飼料に挿 入できなくしている。

本発明は、生存Ｉ）ＦＭ’ｓをｉｎ　ｏｖｏでデリバリ−することによりこれら の問題のい（つかを克服するための新規方法及び過程にっき配挿は、家禽におけ ＱＣＦ　Ｍとして有効であることが示されたので選んだ（２１）。この種の４瘉 特の性質に関連する先行特許出願が提案されている。これらの出願は：１９８８ 年９月１９日出願のＵ、Ｓ、出願番号０７／２６８，３６１より優先権を主張し ており、１９８７年５月Ｉ　Ｂ出願のｔＪ、ｓ、出願番号０７１０４６．０２７ の一部継続出願である１９８７年９月２２日出１ｉ（７）Ｕ、Ｓ、出願番号０７ ／１０２，８３０の一部継続出願である１９８８年４月２８日出願、１９８８年 １１月３日公開ノＰｃＴ／ＵＳ　８８１０１４２３　；及び１９９０年６月１５ 日出願のＵ。

Ｓ、出願番号０７１５３９．０１４である。これらの出願の開示をここに参照と して挿入する。

ラクトバシスル　レウテリは、２０世紀の半ばから認識されている乳ｍｅｎｔｕ ｍ）生物型［ＩＬ　１９８０年に別の種としての身分を得、ベルギー便覧（Ｂｅ ｒｇｅｙ’　ｓ　ｍａｎｕａｌ）の１９８８年版に登録されている（１４．１５ ）。これは食物、特に酪農製品及び内申に見られるが、人を含む健康な動物の胃 腸管に主に存在する（１．　６．　７゜１４．１５．２３．２４．２５．３３） 。

ラクトバシルス　とりＦ’）は、胃腸管に棲息する主要へテロ発酵之り−上バン ルスである（２３，２４．２５）。これは典型的なペテロ発酵体（ｈｅｔｅｒｏ ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）であり、糖を、ラクトバシルスー７−ｙドフィノするなど の種によって行われるホモ発酵代謝の主要最終生成物である乳酸の他に酢酸、エ タノール及びＣＯ２に変換する（３１）。

これは、グルコースから最終生成物への変換にホスホヶ訃ラーゼ経路を用いる。

グルコース又は他の利用可能な炭素及びエネルギー源（例えばラクトース）と共 に、代わりの水素受容体であるグリセロールが培地中に存在する場合、エタ、ｙ −ルより酢酸塩が蓄積し、グリセロールは代謝中間体である３−ヒｉキシプロピ オンアルデヒド（３−ＨＰＡ）を経て１．３−プロパンジオールに還元される。

３−ＨＩ）　Ａは有力な抗微生物活性を有することが示されており、ラクトバシ ルス　レウテリはレウテリンと名付けられたこの物質を回りの培地中に分泌する その能力により、今日までに調べられた微生物の中で独特であることがわかる（ ２゜５、　７．　２８．　２９．　３０．　３１）。この独特の抗微生物活性は 、胃腸管生態系におけるこの種の競争的生存、及び／又はこの生態系における他 の微生物の成長及び活性を調節するその能力において役割を果すことができる（ ７）。従って初期にこの微生物を動物中に確立することが非常に重要である。従 って、５’ｙｊｔ＜ｉう臀各などのＤＦＭ’ｓを鳥類にデリバリ−する方法の提 供が本発明の目的である。他の目的及び利点は、以下の開示及び添付する請求の 範囲からより１−分に明らかになるであろう。

発明の概略 −ｙ　久トツ？ノ鼾−冬　レウテリの純粋な培養物を卵に、その岬化率に悪影響 を与えずに注入する。本発明は一般に、ラクトバシルス及び他のＤＦＭ’　ｓを 部類の卵にデリバリ−し、岬化時に鳥の胃腸系にこれらの微生物を十分に確立す る手段を提供する。

本発明の他の側面及び特徴は以下の開示及び添付する請求の範囲からより十分に 明らかになるであろう。

発明及びその好ましい具体化の詳細な説明本発明は卵生の鳥の胚にＤＦＭ’　ｓ を与え、岬化したばかりの鳥の胃腸管でＤＦＭ’　ｓを確定する方法を提供する 。抗生物質のデリバリ−のために以前に暁光されたデリバリ−法（例えばＵ、Ｓ 、特許４．　６８１゜０６３及び４’、９０３，６３５を参照）、又は卵の気腔 中に手動針で刺卵の気腔中にデリバリ−する。

本発明の特徴及び利点は、以下の実施例を参照することによりさらに明確に理解 されるであろう。以下の実施例は本発明の制限と理解してはＬ面％（Ｉｌｃｈｏ ｌａｓ）又は鶏の卵に、好ましくは町化の約２日前に、気腔の上で無菌状態で針 を刺す。シリンジ及び針を用い、ラクトク？悲不　レウテリの株Ｔ−１（七面鳥 から単離）又は株１１２８４（鶏から単離）の、約ｌＯｎ、■（）７又は１０’ 細胞の株を含む墾濁液１００／７１を気腔に注入する。これらの株のそれぞれは 、Ｒｏｃｋｖ　ｉ　Ｉ　Ｉｅ。

ＭａｒｙｌａｎｄのΔｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃを卵の岬 化率に影響を与えずに成功裏に生荏鳥類卵生に導入できることを示す。岬化率の パーセンテージはこの接種により影響を受けなかった。

類似の結果が鶏の場合に得られる。

未処理杯　９６　８１ ホスフエート注入（−齢　９７　８１ Ｌ、レウテリ気腔注入）１０’ＣＦＵ　９８　８５Ｌ、レウテリ気腔注入、１０ ’ＣＦＵ　１００　７８Ｌ、レウテリ気腔注入、１０’ＣＦＵ　９４　８３この ｉｎ　ｏｖａ法は、ラクトバシルス　レウテリの純粋な株などの限定された有益 な微生物を初期の段階で家禽の胃腸管に導入する新規手段となる。胚のひよこ又 はひなは羊水に浸っており、それは胃腸管と接触している。従ってｉｎ　ｏｖａ で接種された微生物を鳥の胃腸管で確立することができる。

の微生物を有することを示す。この実施例の場合、鳥の盲腸に存在するラクトバ シルスの合計数を各処理に関して決定した。この種が阻害剤であるレウテリンを 製造する能力により同定される、ラクトバシルス中のり、レウテリのパーセント も決定した。

ラクトバシルスの合計存在数は、参照文献２．５及び７に記載の固体（１，５％ 寒天）ラクトバシルス選択培地（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｅｌｅｃｔｉ ｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＬＢＳ））を用い、切り出して均質化した盲腸当たりのコ ロニー形成単位（ＣＦＵ）として決定した。

１４２３に記載の通りに決定した。この試験では、ＬＢＳ寒天寒天上地上クトバ シルスのコロニーに、０．５Ｍのグリセロール及びμ、２５乞タルム接種材料を 含む１％液化寒天の１０ｍ１を重ねる。３７℃で２４時間、嫌気（Ｇａｓ−Ｐａ ｃｋ　Ｓｙｓｔｅｍ）培養した後、グリセロールからレウテリンを製造↓たコロ ニーの回りに成長阻害の領域が見られる。かくしてこれらのイワ二一をμ、レウ テリであると同定し、数える。

表２は、岬化時に見られる合計ラクトバシルス及びり、レウテリであが、少数の 他のラクトバシルスが見いだされたことがわかる。異なる接種量のμ、レウテリ を含む処理の場合、この微生物はすべての盲腸で見いだされ、単離されたコロニ ーの３３％となる。

表２ 処理　合計　％Ｌ、レウテリ 未処理胚　３．３ｘｌＯ’　０ ホスフエート注入　＜５．０ｘｌＯ’　ＯＬ、し’ｙ−ｒ’）（１０’ＣＦＵ） 　３．３ｘｌＯ’　３３気腔注入 り、レウテリ（１０’ＣＦＵ）　１．２ｘ１０’　３３気腔注入 本発明をその特定の具体化に言及して記載したが、多数の変更、修正及び具体化 が可能であり、従ってそのような変更、修正及び具体化は本発明の精神及び範囲 内とみなすべきである。

本発明を行うための最も良い様式 ラクトバシルス］レウテリの純粋な培養物を、気腔上で無菌的に卵に針を刺すこ とにヨメ卵生に注入する。本発明は一般に、ラクトバシルス及び他のＤＦＭ’　 ｓを鳥類の卵生にデリバリ−し、これらの微生物を瞬化時に鳥の胃腸系で十分に 確定できるようにするための手段を提供する。

産業適用性 本発明は、ラクトバシルス　レウテリの純粋な株などの限定された有益な微生物 を家禽の胃腸管に初期の段階で導入するためのｉｎ　ｏｖ。

鳥などの家禽の体重増加を向上させる。

参照文献 １、Ａｘｅｌｓｓｏｎ　Ｌ、Ｌｉｎｄｇｒｅｎ　ＳＥ、１９８７．Ｃｈａｒａｃ ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ＤＮＡ　ｈｏｍｏｌｏｇｙｏｆ　Ｌａｃｔｏｂ ａｃｉｌｌｕｓ　ｒｅｕｔｅｒｉ　５ｔｒａｉｎｓｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ 　ｐｉｇ　１ｎｔｅｓｔｉｎｅ、Ｊ、Ａｐｐｌ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、６２： ４３３−４４０゜２、Ａｘｅｌｓｓｏｎ　Ｌ、Ｃｈｕｎｇ　ＴＣ，Ｄｏｂｒｏｇ ｏｓｚＷＪ、Ｌｉｎｄｇｒｅｎ　ＳＥ、１９８９．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　。

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１４、Ｋａｎｄｌｅｒ　Ｏ，５ｔｅｔｔｅｒ　Ｋ、Ｋｏｈｌ　Ｒ，１９８０、Ｌ ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒｅｕｔｅｒｉ　ｓｐ、ｎｏｖ。

ａ　ｎｅｗ　５ｐｅｃｉｅｓ　ｏｆ　ｈｅｔｅｒｏｆｅｒｍｅｎｔａｔ　ｉｖｅ 　Ｉ　ａｃｔｏＱａｃｉ　Ｉ　Ｉ　ｔ、ｚｂｌ、Ｂａｋｔ、Ｈｙｇ、Ａｂ　ｔ、 　Ｏｒ　ｉ　ｇ、　Ｃ１・ｖ２６４−２６９゜１５、Ｋａｎｄｌｅｒ　Ｏ，Ｗｅ ｉｓｓ　Ｎ、１９８６．Ｒｅｇｕｌａｒ　ｎｏｎｓｐｏｒｉｎｇ　Ｇｒａｍ　ｐ ｏｓｉｔｉｖｅ　ｒｏｄｓ。

Ｂｅｒｇｅｙ’　ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅ ｒｉｏｌｏｇｙ　（Ｅｄｓ、：５ｎｅａｔｈ　ＤＨＡ、ＭａｉｒＮＣ，５ｈａｒ ｐｅ　ＭＥ、Ｈｏ１ｔ　Ｊｌ（）、ｖｏｌ、２：１２０８−１２３４．ｗｉ　Ｉ 　Ｉ　ｊａｍｓ　ａｎｄ　Ｗｉ　Ｉｋｉｎｓ、ＮＹ。

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ｎａ！　Ｐｏｕｌｔｒｙ　Ｔｒａｄｅ　Ｓｈｏｗ、５ｏｕｔｈｅａｓｔｅｒｎ　 Ｐｏｕｌｔｒｙ　ａｎｄ　Ｅｇｇ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ。

Ａｔ　Ｉａｎｔａ、ＧＡ、Ａｂｓ、Ｓｃ　ｉ、Ｍｅｅｔ、、Ｊａｎ、３Ｏ−Ｆｅ ｂ、１，１９９１゜ ２２、ＲＥＶＵＥ：５ｃｉｅｎｔ、１ｆｆｑｕｅ　ｅｔ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、 Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ　Ｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ　ａｎｄ　Ｂｉｏｒｅｇｕｒａｔｉ ｏｎ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　０ｆｆｉｃｅ　。

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ｎ　ｏｆ　ｇｌｙｃｅｒｏｌ　ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ｌａｃｔｏ ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒｅｕｔｅｒｉ、Ａｐｐｌ、Ｅｎｖｉｒ。

ｎ９Ｍ１ｃｒｏｂｉｏ１．．５６：１１９５−１１９７゜３１、Ｔａ１ａｒｉｃ ｏ　ＴＬ、Ａｘｅｌｓｓｏｎ　Ｌ、Ｎｏｖｏｔｎｙ　Ｊ、Ｆｉｕｚａｔ　Ｍ、Ｄ ｏｂｒｏｇｏｓｚ　ＷＪ、１９９０．Ｕｔｉｆｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｌｙｃ ｅｒｏｌ　ａｓ　ａ　ｈｙｄｒｏｇｅｎ　ａｃｃｅｐｔｏｒ　ｂｙ　Ｌａｃｔｏ ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒｅｕｔｅｒｉ：Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　１．３ −ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ：ＮＡＤ　ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ、Ａｐｐｌ 、Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、５６：９４３−９４８゜３２、Ｕｎ ｄｅｒｄａｈｌ　ＮＲ，Ｔｏｒｒｅｓ−Ｍｅｄｉｎａ　Ａ。

ｈｏｅａ　ｉｎ　ｇｎｏｔｏｂｉｏｔｉｃ　ｐｉｇｓ、Ａｍｅｒ、Ｊ。

Ｖｅｔ、Ｒｅｓ、、４３：２２２７−２２３２゜３３、Ｖｅｓｃｏｖｏ　Ｍ、Ｍ ｏｒｅｌｌｉ　Ｌ、Ｃｏｃｃｏｎｃｅｌｌｉ　ＰＳ、　Ｂｏｔｔ４＃ｚｚｉ　Ｖ 、　１９８４．　Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ｒｅｇｅｎｅｒａ ｔｉｏｎ、ａｎｄ　ｐｌａｓｍｉｄｃｕｒｉｎｇ　ｉｎ　Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌ ｌｕｓ　ｒｅｕｔｅｒｉ、ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｌｅｔｔ、、２３＋ ３３３−３３４゜ 国際調査報告

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. １．徴生物の生きた細胞を卵の孵化前に鳥類生物の卵に注入することを含む、鳥 類生物の胃腸管で直接供給徴生物を確定する方法。
2. ２．徴生物がラクトバシルスレウテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｅｕｔｅ ｒｉ）である、請求の範囲１に記載の方法。
3. ３．鳥類生物が鶏である、請求の範囲２に記載の方法。
4. ４．鳥類生物が七面鳥である、請求の範囲２に記載の方法。
5. ５．各卵に加えられる徴生物の数が１０５−１０８である、請求の範囲２に記載 の方法。