JPH06505642A - 合成骨マトリックス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 合成骨マトリックス 本発明は骨形成用具、より詳細には８！！■四で骨形成を誘導する合成インブラ ントに関する。さらにより詳細には本発明はｉｎ　ｖｉｖｏで軟骨内での骨の成 長を促進する生物適合性、バイオリゾ−バブル（ｂｉｏｒｅｓｏｒｂａｂｌｅ） な合成マトリックスに関する。

肋■正で軟骨内の骨形成を誘導できる骨形成用具の潜在的利用性が広く認識され ている。そのような用具の入手容易性は整形外科医薬、ある種の形成外科技術お よび種々の歯根膜及び脳顔面頭蓋再構成法に革新をもたらすことが企図されてい る。

哺乳類の骨組織において骨分化の発達カスケードは技術的によく証明されていと なる正確な機構は明らかではないが、骨マトリックスの本来の軟骨内骨分化活性 は分離して抽出でき、不活性な残存コラーゲン状マトリックスで再構成して活性 を誘導する完全な骨に回復しつる（サンパスら；Ｓａｍｐａｔｈ　ｅｔ　ａｌ、 　、　（１９Ｕ）、Ｐｒｏｃ。

ＮａｔＬＡｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７８ニア５９９−７６０３）。

哺乳類の骨組織は、細胞性の出来事である発生カスケードを誘導し軟骨内骨形成 を生じることができるひとつまたはそれ以上のタンパク質様物質の活性因子を含 むことが知られている。この活性因子は文献中で骨形態形成または形態発生タン パク質、骨誘導の（ｂｏｎｅ　１ｎｄｕｃｔｉｖｅ）タンパク質、骨形成タンパ ク質、オステオジェニン（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｎ）、または骨誘導タンパク質（ ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ）として様々に取り上げられて きた。最近、骨形成タンパク質（ＯＰ）と呼ばれるタンパク質因子は骨生成の誘 導の原因であるが、精製されて、組み替え宿主細胞中で発現し、そして適当にマ トリックスに吸収された時、真に骨誘導性であることを示した。（米国特許第１ ７９．４０６号）。

骨誘導性タンパク質は種を越えて活性であるという研究が示される一方、軟骨中 の骨形成を誘導することに要求されるコラーゲン状骨マトリックスはこれまで種 特異的である（サンバスおよびレディ（Ｓａｗｐａｔｈ　ａｎｄ　Ｒｅｄｄｉ（ １９８３）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８０：　 ６５９１−６５９４）。脱塩され、抽出された異種個体の骨マトリックスのイン ブラントおよびＯＰには、おそら（骨マトリックス中の免疫原性タンパク質成分 によると思われる骨マトリックス中での骨生成を阻害する強い炎症応答力坏変的 に生じた。従って同種の骨マトリックスの使用を必要とする骨の誘導は、ヒトの 骨はすぐに入手できずまた費用的にも効果的ではないのでヒトの臨床的使用に関 して重大な限界である。

骨の不足をレカンターリング（ｒｅｃｏｎｔｏｕｒｉｎｇ）または補完すること などの誘導性骨修復を必要とする外科的手法に使用されている材料の技術的な現 状は、デサラージ（Ｄｅａｔｈｅｒａｇｅ）により開示されている（Ｊ、０ｒａ ｌ　Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ、　Ｓｕｒｇ、（１９８８）１７：３９５−３５９） 。説明されたすべての既知のインブラント材料（ハイトロキシルアパタイト、凍 結−乾燥骨、または内因的な骨移植片）は骨誘導性をわずかに持つか、または全 く持たなかった。明らかに骨生成を誘導する能力は、骨誘導に関する多くの方法 のために好ましい。

米国特許第４．７９５．４６７号はリン酸カルシウム無機物および再構成された 架橋フィブリルコラーゲンであるテロペプチドを含む骨修復組成物を開示する。

米国特許第４．５６３．３５０は骨−誘導抽出物および約９０％のトリプシン処 理つシ骨マトリックスおよび１０％ウシ皮膚コラーゲンから構成されたコラーゲ ン状マトリックスを含む骨形成用具を開示する。米国特許第４．７８９．６６３ 号は、欠失を新しい骨に暴露することから成る誘導性の骨修復を行う方法、およ び骨および／または皮膚からの異種個体のコラーゲンの使用法を開示し、ここで はコラーゲンは酵素的に処理されて、テロペプチドを除去するが、そして人工的 に架橋される。欧州特許第３０９．２４１号は、骨形成抽出物を含む軟骨内での 骨形成を誘導する用具、および６０−９０％無機質成分および２−４０％コラー ゲンからなるマトリックス担体を開示する。デアサージら（Ｄｅａｔｈｅｒａｇ ｅ　ｅｔ　ａｌ、　、　）は（Ｃｏｌｌａｇｅｎ　Ｒｅ１．　Ｒｅｓ、　（１９ ８７）　７：２２２５−２２R１）、ウ シ骨マトリックス抽出物およびタイプＩヒト皮膚コラーゲンを含む明らかに異種 個体からの埋め込み可能な用具を開示することを目的とする。１９８９年１０月 １７日に出願され、「異種個体用骨コラーゲンマトリックス」という表題をつけ られた一部係出願番号第４２２．６１３号では脱塩処理されたウシ骨から調製さ れ、ならびに骨形成タンパク質を含む異種個体用インブラントを開示する。

哺乳類の宿主に重大な阻害免疫原応答を生じない埋め込み可能な生物適合性、生 分解性骨マトリックスを提供することが本発明の目的である。もうひとつの目的 は、ヒトを含む哺乳動物中に骨形成タンパク質が包含された時、骨生成を誘導で きる生物適合性、生分解性のマトリックスを提供することである。さらにもうひ とつの目的は、ヒトを含む哺乳動物中で誘導性の骨成長を促進することである。

さらに他の目的は埋め込み可能なプロセリ−な（ｐｒｏｔｈｅｔｉＣ）用具を被 覆するための卓越した材料、ならびに細胞をそのような用具中へ内部成長を増加 させることを提供することである。さらに本発明のもうひとつの目的はそのよう なマトリックス材料の製造方法を提供することである。

これらの及び他の目的、ならびに本発明の特徴は以下につづく説明、図面および 請求の範囲から明らかとなろう。

発明の要約 コラーゲンおよびグリコサミノグリカンを含む多孔性、バイオリゾ−バブル（ｂ ｉｏｒｅｓｏｒｂａｂｌｅ）なマトリックス内に分散された骨形成タンパク質は 肋尋１四で骨生成を誘導できることが発見された。この知見はここに開示された 新規な骨形成用具を開発するために使用され、この用具は哺乳類宿主中で軟骨内 での骨形成を、実質的に用具の形と同じ形に誘導する。この用具はまた細胞の内 部成長を促進する埋め込み可能なブロセオリーな用具のための表面被覆としても 使用できる。

骨形成用具の多孔性マトリックスはコラーゲンおよびグリコサミノグリカンを含 む架橋重合体である。コラーゲンはを椎動物及び無を椎動物における結合組織の 主要タンパク質成分である。タイプ１コラーゲン、タイプ夏コラーゲンまたはそ れらの混合物は好ましい骨形成用具のマトリックス材料である。好ましくはコラ ーゲンはマトリックスの８０−９５重量％から成る。

グリコサミノグリカン（ＧＡＧｓ）は動物起源のムコ多糖である。それらはグリ コシド的に結合したヘキソサミン残基から作られ、ならびにヘキスロン酸または ヘキソース部分のいずれかで多少規則的な様式で変化している。ＧＡＧｓは好ま しくは重合体の少な（とも約５％、およびさらに好ましくは約６％から約１５重 量％がら作られる。有効なＧＡＧｓは、コンドロイチン４−硫酸、コンドロイチ ン６−硫酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパリ ン硫酸、およびそれらの組み合わせのような硫酸基を含むものである。好ましく はマトリックスはコンドロイチン６−硫酸を含む。

コラーゲン−ＧＡＧ重合体は架橋されマトリックスの溶解性および機械的性質を 制御される。マトリックスの架橋−結合は約８００から約６０．０００のＭｃ値 、好ましくは５．０００からｉｏ、　ｏｏｏの間のＭｃ値（架橋間の数平均分子 量）に決定され、これが骨形成用具には最も便利である。

本発明は生存哺乳類の骨を架橋コラーゲン−ＧＡＧマトリックスと接触させるこ とを含む誘導により骨を成長させる方法として具現される。骨誘導は存在する生 存骨からの骨の成長であり、ならびに骨から隣接する骨の領域への骨芽細胞の移 動が関与する。本発明のひとつの観点において、マトリックス材料は生存骨と接 触するように配置されたインブラント上の被覆物として提供される。有用なイン ブラントはセラミック、金属、または重合体のような不活性物質から成る。本発 明のもうひとつの観点は、誘導導骨の成長は、骨を骨マトリックス（その中に有 効量の接着剤が分散され、これは哺乳類中に埋め込まれた時、または３７℃にお かれた時マトリックスを固化するのに十分である）と接触させることにより生存 哺乳類の骨から誘導される。有効な接着剤はメチルセルロースである。マトリッ クスは実質的に埋め込まれたインブラントの形に固化する。

もうひとつの態様は、骨形成タンパク質は多孔性マトリックス中に分散される。

骨形成タンパク質は酸化条件で安定な二量体を構成するサブユニットの対から成 る。タンパク質はＤＮｆｆｌみ替え技術を使用しても生産でき、または天然資源 の精製された物質からも抽出できる。好ましい観点において、このタンパク質の サブユニットのひとつは、ＯＰｌのアミノ酸配列と十分に近似したアミノ酸配列 を有し、ここに開示され、サブユニットは例えば第二の適当なサブユニットと酸 化条件下で混合した時、哺乳動物に埋め込まれた該マトリックス中に配置された 時、哺乳動物に軟骨内の骨を誘導するサブユニットである。ＯＰＩは以下に説明 するアミノ酸を有するタンパク質サブユニットである。

６０　７０　８０　９０　Ｚｏ。

ＱＤＷＸ　ＸＡＰＥＧＹＡＲＹＹＣＥＧＥＣＡＦＰＬＮＳＹＭＮＡＴＮＨＡ！Ｖ ＱＴＬＶＨＦ工ＮＰＥＴＶＰＫＰＣＣｋＰＴＱＬＮＡＸＥＶ’ＬＹｎ）ＤＳＳＨ ＶＸＬＷ３αＩＭ＾八ｍｃＧｃＨＰｏｔが二量へになりホモニ量体を、または特 定の他のタンパク質配列とへテロニ量体を形成し、軟骨中の骨形成を誘導でき。

本発明のもうひとつの観点は骨形成タンパク質を含む骨形成用具の生産方法を含 む。この方法はコラーゲンおよびＧＡＧを架橋−結合したＭｃ値が約８００から 約６０．０００の重合体から成る多孔性マトリックスを提供し；ならびに宿主に 埋め込まれた時、実質的にマトリックスの形に軟骨内の骨形成を誘導するに十分 な量の骨形成タンパク質をマトリックス中に分散させる、ことを含む。

１　分散工程は骨形成タンパク質を緩衝化塩溶液またはアセトニトリル中に分散 させることを含む。もし不溶性コラーゲンをマトリックス中に包含させるならば 、それもまた溶媒に分散できる。本発明のひとつの観点において、溶媒は酸性化 された、約３０％から約５５％のアセトニトリル、好ましくは約５０％のアセト ニトリルを含有する水性溶液である。この分散工程は骨形成タンパク質およびコ ラーゲン−ＧＡＧ重合体を含む混合物を脱水することにより行うことができる。

または分散工程は混合物を凍結乾燥することによって達成できる。凍結乾燥は真 空下における凍結物質の脱水である。

分散工程に先立ち、マトリックスは骨形成タンパク質を分散させた溶媒中で予め 平衡化される。この方法はさらに、分散工程の製品を定められた寸法の形に成型 する工程：そして成型された製品を哺乳類に埋め込む工程を含む。用具の埋め込 みは成型製品の本質的な形を有する軟骨内の骨の誘導を生じる。

最後に、本発明は哺乳類中で軟骨内の骨の成長を誘導する方法、これは骨の形成 が望まれる部位に外科的またはその他の方法でここに説明される性質の分散され た骨形成タンパク質を含む多孔性マトリックス材料を哺乳類中へ埋め込む工程か ら成る。

図面の簡単な説明 本発明の前述の、および他の目的、それらの種々の特徴は本発明自体と同時に以 下の説明を図面とともに読む時により完全に理解でき、その図面には；図１は骨 形成タンパク質を含まないコラーゲン−ＧＡＧイブラントの顕微鏡写真であり、 間充繊細胞のみの浸潤が示されている、そして図２は骨形成タンパク質を含むコ ラーゲン−ＧＡＧマトリックスの顕微鏡写真であり骨芽細胞（矢印）、骨形成お よび血管侵入の存在が示されている。

詳細な説明 本発明は、哺乳類体内に埋め込まれた時、デノボ骨生成を誘導できる骨形成用具 を提供する。ここに可能となり、開示された用具により、医師は例えば後天的お よび先天的な頭蓋、骨格または歯の異形を矯正するための至適な予想できる骨形 成を得ることができるであろう（グロバキーら（Ｇｌｏｗａｃｋｉ　ｅｔ　ａｌ 、　（１９８１）　Ｌａｎｃｅｔｌ　：９５９−９６３）。この用具は、骨の形 成が必要とされる場所である非−癒着性骨折および歯根膜の応用を含む、他の臨 床的適用において局部的な軟骨内の骨形成を誘導するために使用できる。他の有 力な臨床的応用はカンターアーギュメンテーション（ｃｏｎｔｏｕｒ　ａｒｇｕ ｍｅｎｔａｔｉｏｎ）、背骨融合及び整形外科的な再構成手術である。

合体の架橋マトリックス内に分散された骨形成タンパク質を含む。骨形成タンパ ク質は米国特許出願第１７９．４０６．１９８８年４月８日出願（”骨形成タン パク質”と命名された）、ＰＣＴ出願第１１ｓ８９１０１４６９（生物合成骨形 成タンパク質およびそれらの含む骨形成用具と命名された）、およびＰＣＴ出願 第ＵＳ１０１４５３（”骨形成用具“と命名された）に記載された方法で得るこ とができる。双方のＰＣＴ出願とも１９８９年４月１７日に出願された。または 用具を作成することにおいて有用である骨形成タンパク質が豊富な抽出物をウィ ルスト（Ｕｒｉｓｔ）に発効された米国特許第４．２９４．７５３に開示された ように得ることができる。これらの書類の中の開示は参照により編入される。ま たは哺乳類中で骨形成活性を持つもうひとつのタンパク質を使用できる。さらに 遺伝子工学の当業者は、適当なアミノ酸配列をコードする遺伝子をｃＤＮ＾また はゲノムライブラリーから単離でき、すなわちオリゴヌクレオチドからＤＮＡを 構築し、次に真核および有核細胞を含む種々の宿主細胞中でそれらを発現でき、 ヒトを含む補乳動物中で骨形成を誘導しつる大量の活性タンパク質を生産する。

マトリックス材料はコラーゲン重合体およびグリコサミノグリカンから成る。

ヤナスら（Ｙａｎｎａｓ　ｅｔ　ａｌ、　）によって米国特許第４．２８０．９ ５４および４．４４８，７１８に記載されるような技術が本質的に好ましく、そ の教示は参照によりここに編入される。

またはＧＡＧ−コラーゲン多孔性材料は市販のものを得ることができる。例えば 、ｉｎ囚μ巴使用を意図したコラーゲン−ＧＡＧ架橋共重合体（Ｉｎｆｏｒｍａ ｔｒｉｘ”）の多孔性マイクロキャリアーはバイオマット社（Ｂｉｏｍａｔ　Ｃ ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ベルモントマサチューセッツ州：Ｂｅ１ｍｏｎｔ、、Ｍ ＾）から入手しつる。この物質はもとは医療用外科材料として開発されたもので あり、ウシ皮から抽出したコラーゲン、および８％（ｖ／曹）コンドロイチン６ −硫酸を含む。他のＧＡＧ種は例えばヘパリンまたはヒアルロン酸などであるが 、習慣に基づき包含され得る。

すなわち、コラーゲンは結合組織の主要構成要素であり、様々な医療用および外 科的応用、例えば外科用プロセス（ｐｒｏｔｈｅｓｅｓ）および移植片作成にお いて広く使用されて来た。このタンパク質は埋め込み部位に存在するコラ−ゲナ ーゼによるタンパク質分解に対する感受性により容易に吸収される。これは非− コラーゲン様組織成分から化学的および機械的に分離できる顕微鏡的繊維の形状 でありうる。任意の起源のコラーゲンが本発明の使用に適しており、それは不溶 性コラーゲン、酸−可溶性コラーゲン、中性および塩基性水溶液に可溶なコラー ゲンおよび市販されているこれらのコラーゲンである。典型的な動物源は子ウシ 皮、ウシアキレス腿、家畜骨、およびネズミ尾朧である。

グリコサミノグリカン（ＧＡＧｓ）またはムコ多糖は、動物起源のへキソサミン ー含有多糖である。化学的にＧＡＧｓはグリコシド結合し、多少規則的な様式で ヘキスロン酸またはヘキソース部分において変更したヘキソサミン残基から作ら れている（例えばドグソンら（Ｄｏｄｇｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　）による炭水化 物代謝およびその疾患（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｍｅｔａｂｏｌｆｓａ＋　 ａｎｄ　ｉｔｓ　Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）（デケンズら編集：Ｄｉｃｋｅｎｓ　ｅ ｔ　ａｌ）第１巻A アカデミツクプレス（１９６８）参照）。有用なＧＡＧｓはヒアルロン酸、ヘパ リン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン６−硫酸、コンドロイチン４−硫酸、デル マタン硫酸、ケラタン硫酸である。ここに記載されるマトリックス形成用の他の 適当なＧＡＧｓも適し、ならびに当業者は、日常的に使用しているにすぎない他 の適当なＧＡＧｓも知り、ならびに確定することができるであろう。ムコ多糖に 関するさらに詳細な記載はアスピナール（Ａｓｐｉｎａｌｌ）の多糖（Ｐｏｌｙ ｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）バーガモン出版（Ｐｅｒｇａ＋ｎｏｎＰｒｅｓｓ）、 オツクスホード（１９７０）を参照せよ。

コラーゲンはＧＡＧと酸性水溶液中で反応できる。このような反応は室温で行わ れる。典型的には、少量のコラーゲン、例えば０．３重量％、を希釈した酢酸酸 性溶液中に分散し徹底的に撹拌する。ＧＡＧを次に水性コラーゲン分敷物、例え ば滴下してゆっくり加え、これによりコラーゲンおよびＧＡＧの共沈を生じさせ る。共沈はＧＡＧ被覆コラーゲン繊維のもつれた塊である。この繊維状のもつれ た塊は均一化して細かい繊維状の均一分散体となることができ、次に濾過および 乾燥される。

有意な部分変性（ゼラチン化）無く、ＧＡＧｓのコラーゲンへの最大付着条件は 、約ｐＨ１３および約３７℃の温度であることが分かった。これらの条件が好ま しいが、コラーゲンとムコ多糖の間の十分な反応を生じる他の反応条件も好まし い。

上記の共沈法が好ましいが、コラーゲンおよびＧＡＧｓは他のようにも反応でき る。

本質的に必要なことは、ＧＡＧｓばコラーゲン鎖に付くような条件下でふたつの 物質が直接的に接触することである。もうひとつの適当な技術はコラーゲンをＧ ＡＧｓで被覆することであり、例えばコラーゲンから形成された物品をＧＡＧの 溶液に浸すことによる。後者の適当な技術には例えば合成、天然、または天然重 合体を修飾した非−コラーゲン様物質から作成された物品、シート、フィルム、 又は管をコラーゲンであらかじめ被覆し、続いてコラーゲン−被覆物品、シート 、フィルムまたは管をＧＡＧ溶液中に浸す事を含む。さらにもうひとつの方法と しては乾燥粉末形態の各成分であるコラーゲンとＧＡＧを直接混合することであ る。

上記のように生産されたコラーゲン−ＧＡＧ製品は、最終的な適用のためのシー ト、フィルム、管および他の物品の形に成型できる。

コラーゲン再吸着に対する抵抗性を有意に増加させることを得るために、コラー ゲン鎖に結合した少な（とも０．５重量％のＧＡＧを有することが必要である。

上限は、ＧＡＧ付着について有効なコラーゲン部位により定められる。成分につ いては、ＧＡＧがコンドロイチン６−硫酸、約２８重量％水準に達したニ一方ヒ アルロン酸では達成された上限は約２５％である。

ＧＡＧｓとの反応はコラーゲンにもうひとつの価値ある性質を提供する、すなわ ち他の動物宿主からの免疫反応（外来体反応）を誘発できないことである。コラ ーゲンを埋め込んだ時に外来体であると認識されない材料へ転換するために、そ れを少なくとも約１重量％のＧＡＧと反応させる必要がある。

コラーゲン−ＧＡＧ製品の不溶性は、これらの材料を共有結合的に架橋−結合す ることにより所望の程度まで上げることができる。一般的に、コラーゲン架橋− 結合に適する任意の共有架橋−結合法がこれらの合成材料にも適当である。この ような共有架橋−結合は溶液中のムコ多糖の解離を防ぐために役立ち、これによ って材料を外科的ブロセシス等に有用とする。

共有架橋−結合はまたこれらの材料の再付着（ｒｅｓｏｒｂｔｉｏｎ）に対する 抵抗性を上昇させるためにも役立つ。この架橋−結合の厳密な機能はこの点に関 しては理解されていないが、架橋−結合が通常コラ−ゲナーゼにより攻撃される コラーゲン鎖上の部位にＧＡＧ単位を固定するのであろう。もうひとつの可能な 説明は架橋がコラーゲン繊維の網状態をきつくしめ、コラーゲンを分解できる酵 素の拡散を物理的に制限するというものである。

架橋−結合した合成物は約８００と約６０．０００の間のＭｅを有するべきであ ることが分かった。Ｍｃ値が約８００以下、または約６０．０００以上の材料は その機械的性質の有意な損失を受ける。Ｍｅが約５．０００及び約１０．０００ の間である合成物は機械的特性の良好な均衡を有する事が分かり、それゆえにこ れはそのような特性の均衡が必要である製品についての好ましい範囲である。

共有架橋−結合は化学的、照射および脱水熱（ｄｅｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌ　 ）法の一般的範鴫の種々の特定の技術で達成できる。意図される多くの架橋−結 合技術の利点は、グルタルアルデヒド架橋−結合および脱水熱架橋結合があるが 、それらはまた材料上の細菌繁殖を防ぐことに役立つということである。すなわ ち合成物は架橋結合されるのと同時に殺菌される。

コラーゲン−ＧＡＧ合成物の架橋結合に関するひとつの適当な方法は、アルデヒ ド架橋結合として知られている。この工程では、物質を水性アルデヒド溶液と接 触させ、これは物質の架橋結合を行う。適当なアルデヒドはホルムアルデヒド、 グルタルアルデヒド、およびグリオキサールである。グルタルアルデヒドは他の アルデヒドよりも早く所望する水準の架橋結合密度を産し、ならびに架橋結合密 度を比較的高い水準にまで上昇することもできるのでので好ましいアルデヒドで ある。合成物をグルタルアルデヒドに浸すことは溶解による多糖成分の部分的除 去を引き起こし、これにより最終製品中の多糖の量を減少させる。残存アルデヒ ド゛　は大変有毒であるので、未反応のアルデヒドはコラーゲン−ＧＡＧ物質か ら除去されるべきである。

他の適当な化学的技法はカルボジイミドカップリング、アジドカップリングおよ びジインシアネート架橋−結合がある。

好ましい架橋−結合法は本明細書中では脱水熱法と言う。脱水熱架橋−結合にお いて、外部の架橋−結合試薬を加える必要はない。製品を脱水する鍵は、約１％ 未満の湿潤含量まで架橋−結合することである。除去されるべき水の量は多くの 因子で変化するであろうが、所望する架橋−結合の程度を達成する十分な量の水 が除去されなければならない。例えばコラーゲン−ＧＡＧ製品を、上昇した温度 および／または真空状態に、湿潤含量が極端に低水準になるまで供することがで きる。

真空でない場合には、約８０℃より高い温度、およびより好ましくは約９０℃よ り高い温度を使用できる。２３℃で、少なくとも約１０−’ｍｄｇ、および好ま しくは１０−’ｆｉｇ以下が適当である。上昇した温度および真空は組み合わせ ても使用できる；これは、実際、最も迅速な経路でありそれゆえ好ましいもので ある。少な（とも約１０−’ｍｍ１１ｇの真空で、少なくとも約３５℃の温度の 使用が好ましい。一般的に、材料は上昇した温度および真空状態に、所望の不溶 性が得られるまで供せられる。与えられた架橋結合密度に到達するためにより高 温ではより低い真空が必要であり、逆も同様である。約５．０００と１０．００ ０の間のＭｃに達するための典型的な架橋−結合法は、コラーゲン−ＧＡＧ材料 を９５℃の温度、かつ０．０１ｍｍＨｇの真空に２４時間供することを含む。こ の脱水熱架橋−結合法はアルデヒド架橋結合のある種の不利を克服し、ならびに コラーゲ鎖に結合した比較的大量のＧＡＧを有する製品を生産する。

Ｍｃ、架橋結合間の平均分子量が５．０００から１０．０００の間の純粋なコラ ーゲン材料に関して至適な機械特性が得られる。脱水熱架橋−結合法により調製 された特定のコラーゲン−ＧＡＧ合成物は、同様なＭｃ値を持つコラーゲンと比 較して分解、強度および靭性において卓越した伸長度を有する。

再付着に対する抵抗性、外来体反応が無いこと、機械特性ならびに血液−適合性 に基づき、架橋結合合成物は少な（とも約０．５％の結合ＧＡＧを含むべきであ る。

約６％と約１５肋間の硫黄−含有ＧＡＧを含有する合成物は、その血液−適合性 を含む顕著な特性ゆえに特に好ましい。ここに特定されるＧＡＧの割合は、架橋 −結合直後に測定された時得られたものである。徹底的な洗浄で、共有結合して いない如何なるＧＡＧも除去できる。

乾燥時に、市販の多孔性マイクロキャリアーはビーズの内部容量（リットル）あ たり約５ｇのコラーゲンを含有する。それらは水和およびリン酸緩衝化塩溶液（ ＰＢＳ）中に再懸濁後、容積で約２０％の収縮を示す。Ｆ’ＢＳ中の１グラムの 水和マイクロキャリアーは約２５０■１の固定ベット容積を占有する。この物質 はおおざっばに９９．５％の排除体積である。これはダラムあたりのマイクロキ ャリアーに生育できる有力な細胞塊という点で大変効果的である。

粒子は本質的に直径約５００１１ｍの球状である。電子顕微鏡によるスキャンは 、表面上に約２０１１−の、内部に約４ｈｍの孔を示す。内部は繊維状およびシ ートのような両方の構造からできており、細胞付着用の表面を提供する。排除体 積は相互に連結して、粒子の内部を通って細胞への接近を提供する。

ＰＢＳまたは培養培地中に懸濁した時、マイクロキャリアーはほとんど自然に浮 揚性である。少量のトラップされた空気または溶液中の温度変化は粒子を浮遊ま たは沈めること対して十分である。球状コラーゲン−ＧＡＧ物質は７０％エタノ ールで沈殿し、ビーズ中の空気を溶液に交換する。こ、のエタノールは、次に緩 衝化塩溶液またはトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）または他の酸で酸性化した３０％ −５５％アセトニトリルに交換される。アセトニトリル（ＡＣＮ）は有機溶媒で あり、タンパク質を一次構造を変化させずに変性させることができる。これは高 速液体クロマトグラフィーにおける通常の試薬であり、疎水的相互作用を不安定 にすることによりタンパク質をシリカを基本としたカラムから溶出するために使 用される。

もしマトリックス物質が骨形成タンパク質を含むのであれば、タンパク質にはト リス緩衝化塩溶液（ＴＢＳ）またはアセトニトリル／ＴＦＡが加えられ、次に同 じ緩衝液で平衡化されたコラーゲン−ＧＡＧ物質に加えられる。混合物は４℃で インキュベーションされ、次に凍結乾燥される。このマトリックス材料はウシ不 溶性コラーゲンを添加することによりより重（作成できる。生成したマトリック ス材料は微細付着を増強する負の表面電荷を有する。さらに、骨芽細胞はフィブ ロネクチンを合成し、これはコラーゲンに結合する細胞の接着タンパク質である が、これにより移動する骨芽細胞がインブラントに接着する能力を増強させる。

骨形成の過程において、マトリックス材料は体によりゆっくりと吸収され、そし てインブラントの形またはインブラントにきわめて近い形の骨に代わる。マトリ ックス材料はまた骨誘導を誘導し、持続したキャリアーを放出するものとして使 用され得る。

前原性用具は、緩（接着した粒子材料でてきた形態を維持した固体を含むことが できる。それはまた成型された多孔性固体、または周囲の組織に囲まれて設置さ れた気密に詰め込まれた粒子の単なる凝集体も含むことができる。不溶性コラー ゲンまたはコラーゲン−ＧＡＧ骨原前原ンパク質粒子に加えた不活性重合体は用 具の密度を増すことができる。加えて、メチルセルロースを含む（例えばメトセ ル、ダウケミカル社・Ｍｅｔｈｏｃｅｌ、　Ｄｏｔ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、 　）接着剤または固化剤を添加できる。

新しい骨の所望の形態にマトリックスを成型することが好ましく、非−癒着性骨 折にまたがる寸法を有することが好ましい。

上記の任意の方法で製造された種々のマトリックスの機能は上記参照の特許出願 中に記載されたｉｎ　ｖｉｖｏラットバイオアッセイで評価できる。つまり凍結 乾燥したマトリックスインブラントを皮下の傷の中に置き、これを次に金属のク ランプで綴じる。インブラントをラットから埋め込み１２日後に取り出し、骨形 成の証拠を形態学的に評価する。図１は唯−間充繊細胞がコラーゲン−ＧＡＧイ ンブラントに結合するであろう事が実証され、これは前原性タンパク質を含まず 、一方図２は前原性タンパク質を含むインブラント中に最終的な軟骨内の骨の発 達を示す。

インブラントが新しく誘導された骨を含むかどうかを決定するためには、１２日 のインブラントで通常十分である。

アルカリホスファターゼ活性は骨生成に関するマーカーとして使用できる（レデ ィら（Ｒｅｄｄｉ　ｅｔ　ａｌ、　（１９７２）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（Ｕ、Ｓ、Ａ、　）　６９：１６０Q−１６０５）。

酵素活性はインブラントの均一化の後、分光光度的に定めることができる。肋■ 正での活性は９−１０日にピークに達し、その後ゆっくり下降する。組織学的に 骨の発育を示さないインブラントは、これらのアッセイ条件ではアルカリホスフ ァターゼの活性をわずかに示すか、または全く示さない。アッセイはインブラン トをラットから取り出した直後に骨形成の定量、ならびに予想を得るために有用 である。

別の方法として、骨形成の量はインブラントのカルシウム含量を測定すること　 ′により決定できる。

このような研究はコラーゲン−ＧＡＧ粒子が１２日後もｉｎ　ｖｉｖ□で依然と して存在することを確立した。図１および表２に示されるように、前原性タンパ ク賀のない対照マトリックスは肋■正で骨の成長を誘導しなかった：しかじ、マ トリックスにより補充された間充織の細胞が存在した。これと比較して、コラー ゲン−ＧＡＧマトリックスは、ＴＢＳまたはアセトニトリル／ＴＦＡのいずれか で形成された前原性タンパク質調製物を配合した時、図２および表２に示すよう にインブラント上に骨の分化を誘導した。

表２ 配合方法　（＋）成長／＃試料　％骨成長アセトニトリル／ＴＦＡ （＋）　ＯＰ　３１５　６０ （−）　ＯＰ　Ｏ１５０ トリス−緩衝塩溶液 （＋）　ＯＰ　３／３　８０ （−）　ＯＰ　Ｏ／３　０ 好結果のインブラントはマトリックスが誘導した軟骨の骨発達が経過を通じて制 御された経過を表す・（１）１日の多形核白血球による一過性の浸潤物：（２） ２日および３日の間充繊細胞の移動および増殖；（３）５日および６日の軟骨細 胞の出現；（４）７日の軟骨マトリックス形成；（５）８日の軟骨の石灰化；（ ６）９日および１０日の血管侵入、骨芽細胞の出現および新しい骨の形成（図２ ）参照。もし１２日以上経つと、１２日から１８日に骨芽細胞の出現および骨の 再編成および埋め込んだマトリックスの溶解があり；ならびに２１Ｂに造血骨髄 分化。この結果は新しい骨の形が実質的に埋め込まれたマトリックスの形と同様 になることを示す。

コラーゲン−ＧＡＧマトリックスは再吸収されて、新たに形成された骨が占める 空間を作る。形成された骨の寸法は、製造されたインブラントの寸法である。材 料が１部に局在した時、インブラントは陽性であると考えられる。反応の多様性 は移植込手順における困難性により説明される、何故ならば原型のマトリックス 材料は低比重であり、それを皮下に維持することが難しいからである。

本発明の材料をいかに作成し使用するかということの詳細は、以下に開示される 。

架橋−結合コラーゲンーＧＡＧ材料は以前公開されたヤナス（Ｙａｎｎａｓ）の 手法により調製した（米国特許第４．３５０．６２９）。簡単にこれは以下の手 順を伴う。

１、コラーゲンの調製 ウシコラーゲンをコマノフスキーらの方法（Ｋｏｍａｎｏｖｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ 、　：　Ｊ、　Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅａ＋１ｓｔｓ　Ａｓ５ｎ、　（１９７４）　 ６９：４１０−４２２）により調製する。０．５５ｇの凍結乾燥コラーゲンをウ ィリーミル（ｌｌｉｌｅｙ　ｍ１ｌｌ；　トーマス社　フィラデルフィア、ペン シルバニア州（Ａ、　Ｈ，Ｔｈｏｍａｓ　Ｃｏ、　、　Ｐｈ１ｌａ、　ＰＡ、　 ））で６０メツシユの粒子サイズに挽く。これを２０ｈｌの０、０５Ｍ酢酸水に 加える。この溶液を、氷−外套ブレンダ−（ｉｃｅ−ｊａｃｋｅｔ　ｂｌｅｎｄ ｅｒ；エバーバッハ社アンアーバー、ミシガン州；Ｅｂｅｒｂａｃｈ、、　Ａｎ ｎ　Ａｒｂｏｒ、　ＭＩ）中で、６０ボルトに減じたライン電圧（ワーリング社 、ハートホード、コネクチカット州；ｌｌａｒｉｎｇ　Ｃｏ、　、　［１ａｒｔ ｆｏｒｄ、　ＣＴ）で高速に設定した２−スピードパワ一単位で、６０分間撹拌 する。この撹拌工程の後、この溶液をきつく閉めたがラスジャー中に置き、コラ ーゲンを４℃で７２時間膨潤させる。

２、コラーゲン−コンドロイチン６−硫酸共沈の調製０、０５Ｍ酢酸に分散させ た０、３％（ｗｔ／ｖｏｌ）コラーゲンを２３℃にてテフロン撹拌棒で激しく撹 拌する。分散物を混合する間、０．０５Ｍ酢酸、ｐＨ３，２中の１％コンドロイ チン６−硫酸（ｗｅｔ／ｖｏｌ）をビユレットから毎秒的０１１１の速度で滴下 する。コンドロイチン６−硫酸の添加は、コラーゲユ／の共沈を生じ、ＧＡＧで 被覆されたコラーゲン繊維状のもつれた塊を形成する。９０重量％のコラーゲン が１０重量％のコンドロイチン６−硫酸とこのように共沈した時、系統質量平衡 （ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ｍａｓｓ　ｂａｌａｎｃｅ）は加えたコンドロイチン ６−硫酸の約９５％が共沈することを示す。

共沈後、もつれた繊維の塊をワーリジグブレンダーで繊維が約１ｍｍ＋の長さに なるまで均一化する。０．０５Ｍ酢酸中の繊維の混合物は、５分以上撹拌せずに 置いた時２相に分かれ、したがって濾過前に混合が必要である。コラーゲン−ム コ多糖分散物をシュライヒャーおよびシ、ｚル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ 　５ｃｈｕｅｌｌ；キーニー、ニューハンプシ＋　−（Ｋｅｅｎｅ、　Ｎｅｗ　 Ｈａａ＋ｐｓｈｉｒｅ）の濾紙Ｎｏ、　５７６を含むブフナー漏斗を通して真空 下で濾過することにより濾過を行う。共沈は、環境条件下で湿潤含量が約２０重 量％となるまで脱水させる。

高い多孔性の製品を所望するならば、複合体を凍結乾燥できる。典型的な条件は 温度が一５０℃、０．０６ｄｇの真空である。

３、アルデヒド架橋−結合 方法Ａ 実施例２のように調製された、共沈したコラーゲン−コンドロイチン６−硫酸を グルタルアルデヒドの０．０２Ｍ溶液中に浸すことにより共有的に架橋−結合さ せる。

この処理は効果的に多糖成分画分をコラーゲン繊維または分子に固定化する。架 橋−結合は、０．４Ｍ塩化ナトリウムを含有するリン酸緩衝液、ｐＨ７，４（こ れはコンドロイチン６−硫酸のよ（知られている溶媒）で長時間洗っても多糖が アルデヒド処理フィルムから取り出せないことにより証明される。未反応のアル デヒドを５．５ジメチル−１，３−シクロヘキサンジオン（ジメドン）の溶液で 処理することにより除去する。水の蒸発により、最高約１０重量％の多糖を含有 するフィルムとなる。

方法Ｂ 蒸留水中に２５％グルタルアルデヒド溶液（”バーカー分析”試薬級、パーカー 社、フィラデルフィア、ペンシルバニア州；”Ｂａｒｋｅｒ−ａｎａｌｙｚｅｄ ″ｒｅａｇｅｎｔ　ｇｒａｄｅ、　Ｊ、　Ｔ。

Ｂａｒｋｅｒ　Ｃｏ、、　Ｐｈ１ｌａ、　ＰＡ）を調製する。この溶液を酸性コ ラーゲン溶液に十分加え、０．５％（ｖｏｌ／ＶＯＩ）グルタルアルデヒド溶液 とする。この分散物が、６０ボルトに減じたライン電圧で低速に設定したオーバ ーへッドブレンダー中で１時間混合される間、このグルタルアルデヒド溶液が加 えられる（スコビル、ワシントンのハミルトンビーチ部、Ｎ、　Ｃ，；Ｈａ＠１ ｌｔｏｎ　Ｂｅａｃｈ　Ｄｉｖ、　ｏｆ　５ｃｏｖｉｌｌ、　ｆａｓｈｉｎｇｔ ｏｎ、　Ｎ、　Ｃ，）。

Ｑ、　０５７８ｇのコンドロイチン６−硫酸を１０ｍ１の０．０５Ｍ酢酸に溶解 する。この溶液を１７５ｍ１のグルタルアルデヒド−処理コラーゲン分敷物に加 える。この添加は５分間にわたって行われ、この間分散物はオーバーへッドブレ ンダー中で混和される。

そのすぐ後に分散物はブフナー漏斗中で濾過される。この濾過工程は約２０分で 完了する。生成した湿った膜を次に風乾し、６０メツシユの粒子寸法に挽（。こ れは生理食塩水中に分散される（０．１５　Ｍ　ＮａＣ１、ｐＨ７）。

４、脱水熱架橋−結合 実施例３の製品を真空オーブン中に置いて、１１５℃の温度に暴露し、真空は少 なくともＱ、３ｍａ＋　Ｈｇで４８時間である。この処理の終わりに、フィルム に初めに含有された１０重量％以下の多糖に４８時間の蒸留水浸漬することによ って、（これはコンドロイチン６−硫酸用溶媒である）除去できる。

Ｂ、前原性材料の調製 前原性タンパク質は、米国特許出願第１７９．４０６号、１９８８年４月８日出 願、ＰＣＴ出願第Ｕ３９１０１４６９ｆ「生合成前原性タンパク質およびそれを 含有する前原性用具」と表題をつけられた）、およびＰＣＴ出願ＵＳ８９１０１ ４５３ｆｆ骨原前原具」と表題をつけられた）に開示された方法を使用して得る ことができる。双方のＰＣＴ出願は１９８９年４月７日に出願された。別の方法 として、用具の製造に有用な前原性タンパク質が豊富な抽出物はウィルストに対 して発効された米国特許第４．２９４．７５３に開示されたように得ることがで きる。

Ｃコラーゲン−ＧＡＧ材料中の前原性タンパク質配合小さいビーズ形と予想され るコラーゲン−ＧＡＧ材料は、７０％エタノール中で膨張しビーズ中の空気を液 体と交換する。このビーズは次のように調製される。約１００■１の７０％エタ ノール（ｖｏｌ／ｖｏｌ　：滅菌水中）をコラーゲン−ＧＡＧビーズの５ｏ■１ 瓶に加える（バイオマット社、ベルモント、マサチューセッツ州：Ｂｉｏｍａｔ 　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｂｅｌ■ｏｎｔ、　ＭＡ）。このビーズを４℃に 置（。エタノールの上層を傾け、新しい７０％と交換する。この工程をすべての 粒子が沈むまで繰り返す。別の方法として、粒子は低速（例えばＸ５００ｇ）で 遠心により調製できる。

７０％エタノールを次１．：５０ｇ１ｍ　ト’Ｊ　スー塩酸、０．１５　Ｍ　Ｎ ａＣ１，ｐＨ７，０（ＴＢＳ）＊タハ０．１％のトリフルオロ酢酸（τＦＡ）含 有の３０％から５０％のアセトニトリルと交換してビーズから取り出す。エタノ ールと緩衝液との交換は低速遠心、デカントおよび緩衝液の交換を繰り返して完 了する。これは調製工程促進のためおよびコラーゲン−ＧＡＧ材料に起こり得る 分解を避けるために４℃で行われる。

前原性タンパク質は次にマトリックス材料に吸着する。マトリックス材料に吸着 する前原性タンパク質の調製物は（１）セファクリル活性画分（この画分はラッ トにおいて骨の成長をインブラントあたり５から２０ｇｇで誘導する：および（ ２）ヘパリン−セファロース画分（この両分はラットにおいて骨の成長をインブ ラントあたり１から１０μｇで誘導する）。前原性タンパク質は以下の一つの方 法にょリコラーゲンーＧＡＧマトリックス中に配合される。

１、アセトニトリル／ＴＦＡ凍結乾燥 アセトニトリル／ＴＦ＾緩衝液で予め平衡化した０、　２−０．３ｍｌのマトリ ックスに、０．１％のＴＦ＾を含有する５０％アセトニトリル中の２００ｇｇの 前原性タンパク質画分を加える。

このマトリックスを４℃で１６時間インキュベーションする。次に凍結乾燥する 。

２、　ＴＢＳ結合化／凍結乾燥 ＴＢＳ緩衝液で平衡化した０、　２−０．３ｇ＋１のマトリックスに２０ｈｌの ＴＢＳ緩衝液を加える。

０．１％のＴＦ＾を含有する５０％アセトニトリル１０μｍ、（これは前原性タ ンパク質調製物を濃縮した量で含む）を加える。ｐＨを次に７．０に合わせる。

この混合物を２４℃で２時間、次に４℃で１６時間、凍結乾燥前にインキュベー ションする。

Ｄ、骨誘導に関するバイオアッセイ 骨誘導に関するバイオアッセイはサンパスおよびレディー（Ｓａ＋＊ｐａｔｈ　 ａｎｄ　Ｒｅｄｄｉ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ（ １９８３）　８０：６５９１−６５９５）により記載され、ここに参照として編 入され、軟骨内の骨分化活性を監視するために使用できる。このアッセイは、ウ シの試験試料をエーテル麻酔下の受容体ラットの皮下部位に異種個体的に埋め込 むことから成る。オスのロング−エバンスラット（Ｌｏｎｇ−Ｅｖａｎｓ　ｒａ ｔ）、年齢２８−３２日齢を使用した。垂直の切開（１ｃｍ）を滅菌条件で胸部 領域の皮膚について行い、ポケットを短い太い針の切開により作る。約２５ｍｇ の試験試料をポケットを奥深くに埋め込み、切開を金属の皮膚クランプで綴じる 。従属栄養の部位はオルソトロピック（ｏｒｔｈｏｔｒｏｐｉｃ）部位の使用に より起こり得るあいまいさなしに骨の誘導研究を可能とする。埋め込みの日は実 験の１日と称する。

インブラントをラットから移植１２日後に取り出し、骨誘導の証拠を形態的に評 一部を削除したインブラントをポーインス溶液（Ｂｏｕｉｎｓ　５ｏｌｕｔｉｏ ｎ）で固定し、パラフィンに浸け、６−８ｍｍの区分に切り、そしてトルイジン ブルーまたはヘモトキシリン／エオンンで染色する。

本発明はその精神または本質的な特徴から逸脱する事なく他の特別な態様におい て具体化しうる。それゆえにこの実施例は説明であって限定ではなく、本発明の 観点は以上の説明よりむしろ添付の請求の範囲に指示され、請求の範囲と均等の 意味および範囲中にあるすべての変更はゆえにそれらに包含される。

ＦＩＧ、　２ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成　４年１１月３０８−

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．移植用の骨原性用具であって実質的に該用具の形に適合する形に哺乳動物の 軟骨形成の誘導が可能であり、該用具は多孔性マトリックス中に分散された骨原 性タンパク質を含み、該マトリックスはコラーゲンおよびグリコサミノグリカン が架橋−結合して約８００から６０，０００のＭｃ値の重合体を含む用具。
2. ２．上記グリコサミノグリカンは上記重合体の少なくとも５重量％から成る請求 項１に記載の用具。
3. ３．上記グリコサミノグリカンは上記重合体の約６から約１５重量％から成る請 求項２に記載の用具。
4. ４．上記グリコサミノグリカンがコンドロイチン４−硫酸、コンドロイチン６− 硫酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸 およびそれらの組み合わせから成る群から選択される請求項１に記載の用具。
5. ５．上記グリコサミノグリカンが硫酸塩群を含む請求項１に記載の用具。
6. ６．上記グリコサミノグリカンがコンドロイチン６−硫酸を含む請求項５に記載 の用具。
7. ７．上記重合体が架橋−結合して５，０００と１０，０００との間のＭｃ値であ る請求項１に記載の用具。
8. ８．上記骨原性タンパク質が酸化状態で二量体を構成するサブユニットの対を含 み、該サブユニットのひとつが以下のＯＰ１のアミノ酸配列に十分近似している アミノ酸配列を有し： 【配列があります】 但し第二の該サブユニットと組合わされて、該サブユニットは上記哺乳動物に埋 め込まれた上記マトリックス中に分散された時、哺乳動物中で軟骨の形成を誘導 する請求項１に記載の用具。
9. ９．上記重合体がタイプＩコラーゲン、タイプＩＩコラーゲンおよびそれらの混 合物から成る群から選択される請求項１に記載の用具。
10. １０．哺乳動物中で骨の成長を誘導する方法であって：（ａ）コラーゲンおよび グリコサミノグリカンが架橋−結合してＭｃの値が約８００から約６０，０００ の重合体を含む多孔性マトリックスを提供し；（ｂ）該マトリックスの実質的な 形に軟骨形成を誘導するために該マトリックス内に骨原性タンパク質を、十分な 量で分散させ；そして（ｃ）工程ｂの製品を哺乳動物中に埋め込みｉｎｖｉｖｏ の骨形成を誘導する；ことから成る方法。
11. １１．工程（ｂ）は上記骨原性タンパク質および上記重合体の粒子を含む混合物 を脱水させることにより行われる請求項１０に記載の方法。
12. １２．工程（ｂ）は上記混合物を凍結乾燥することにより行われる請求項１１に 記載の方法。
13. １３．上記分散工程はさらに上記マトリックス中に不溶性コラーゲンを分散させ る工程から成る請求項１０に記載の方法。
14. １４．工程（ｂ）の製品を予め定めた寸法の形に形成するさらなる工程から成り 、埋め込みは本質的に該形を有する軟骨の誘導を生じる、請求項１０に記載の方 法。
15. １５．哺乳類の骨を成長させる方法であって、以下の工程：（ａ）コラーゲンお よびグリコサミノグリカンが架橋−結合して約８００から約６０、０００のＭｃ 値の重合体を含む多孔性マトリックスを提供し；そして（ｂ）哺乳類の生きてい る骨を該マトリックスに接触させて、該骨から該マトリックスヘの骨−生産骨芽 細胞の移動を誘導する；から成る方法。
16. １６．インプラントを工程（ａ）の多孔性マトリックスで被覆するさらなる工程 から成り、ここで工程（ｂ）は生きている骨を該マトリックスー被覆インプラン トと接触させることから成る請求項１５に記載の方法。
17. １７．上記インプラントがセラミック、金属および重合体から成る群から選択さ れた不活性な材料から成る請求項１６に記載の方法。
18. １８．上記マトリックスは上記哺乳動物に埋め込まれた時、該マトリックスを固 化するに十分な量の接着剤を含む請求項１５に記載の方法。
19. １９．上記接着剤がメチルセルロースを含む請求項１８に記載の方法。