JPH06505673A - 磁気分離機、磁気分離方法、リガンド測定方法ならびに分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 外部磁気手段を特徴とする磁気分離のための装置および方法発明の分野 この発明は、高勾配磁気分離（ＨＧＭＳ）によって、非磁性試験媒体から、問題 となる物質を分離するのに磁気粒子（磁粉）を用いる磁気分離装置および方法に 関するものである。

発明の背景 本発明は、生体特異的親和反応に関する各種の実験室および臨床手順でとくに有 用な、非磁性媒体から磁気粒子を分離する磁気分離機および方法の改良に関する ものである。このような反応は、一般に、広範囲の目標物質、とくに細胞、タン パク質、核酸配列などの生体物質の測定のために、血液、尿などの生体サンプル の試験に用いられる。

ここで使用される用語「目標物質」とは、特異的結合ペアの物質、すなわち相互 作用親和性を示す一対の物質、または一つの物質および構造を意味し、細胞成分 、生体特異的リガンド（配位子）および受容体を含む。ここで言う「リガンド」 とは少なくとも１個の特性決定基またはエピトープを有し、受容体により生体特 異的に認知され、それに結合されるような抗原、ハブテンおよび各種の細胞関連 構造などの物質を言う。ここで言う「受容体」は、他の物質を実質的に排除して 、特定のりガントについて生体特異的結合親和性を有する物質、または物質のグ ループを言う。生体特異的親和反応によって決定される受容体には、抗原（ポリ クローナルおよびモノクローナル）、抗体フラグメント、酵素、核酸、Ｃ１ｑな どがある。生体特異的結合ペアの一部分の決定は、ペアの他の部分との選択的相 互作用によって左右される。

問題となる物質と、その特異的結合パートナ−の間の複合形成にもとづいて上記 の目標物質を決定するには、様々な方法がある。それぞれの場合に、手段が用い られ、それによって目標物質／結合パートナ−複合形成の発生や度合が決定でき る。

たとえば、抗原を測定する競合的イムノアッセイ（免疫測定法）の場合、試験サ ンプル中の、問題となる抗原は、限られた量の特異的抗体結合部位について、既 知の量の標識抗原と競合する。従って、適当な反応期間のあと、特異的抗体に結 合した標識抗原の量は、試験サンプル中の抗原の量に反比例する。標識抗原では なく標識抗体（典型的なものはモノクローナル抗体）を用いた抗体の競合的アッ セイは、同じように機能する。その結果得られる免疫複合体は、たとえば複合体 または非結合抗原の免疫吸収、物理化学的吸着または沈殿によって分離される。

次に抗体に結合した標識抗原を定量し、既知の抗原濃度から標準曲線を作成し、 これから抗体の未知の濃度を決定することができる。

これに対して、一般に「サンドイッチ」アッセイとして知られている抗原決定の ための免疫測定アッセイは標識つき分析物の代わりに標識抗体を使用する。免疫 測定アッセイを実施する場合、サンドイッチを形成するが、その「層」は、抗体 ／多価（最少限二価）抗原／抗体となっている。

完全なサンドイッチ複合体（抗体／抗原／抗体）のそれぞれに結合している標識 抗体の量は、試験サンプル中に存在する目標抗原性物質の量に直接比例する。

サンドイッチ・アッセイは、ポリクローナル抗体では多段階で、また独立した抗 原決定基に向けられたモノクローナルを用いるときはもっと少ない段階で行うこ とができる。

従来の競合的イムノアッセイでも、また上記の免疫測定アッセイでも目標物質の 定量には、自由標識リガンドまたは標識受容体から結合（したリガンドまたは受 容体）を物理的に分離する必要がある。

結合／自由（物質）の分離は重力により、たとえば沈殿によって、あるいは目標 物質に結合させた細分化した粒子またはビーズを遠心分離することによって行う ことができる。望むときには、結合／自由（物質）の分離をしやすくするために 、このような粒子またはビーズを磁性にしてもよい。磁気粒子は技術上既知であ り、また免疫あるいはその他の生体特異的親和反応に用いられている。たとえば 、米国特許４，５５４，０８８、および「臨床化学のためのイムノアッセイ」（ ｐｐ、１４７−１６２．Ｈｕｎｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、ｅｄｓ、、Ｃｈｕｒｃｈｉ 　１１　Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ、Ｅｄｉｎｂｏｒｏｕｇｈ　（１９８３）を参照 ）。

一般に、この目的のために磁気または重力分離をしやすくする材料を用いること ができる。

小さい磁気粒子は、生体機能性ポリマー、たとえばタンパク質で有利なように被 覆され、表面積がきわめて大きく、適切な反応速度を示すので、生体特異的親和 反応に関連した分析で、非常に有用であることがわかった。０．７〜１．５ミク ロンの大きさの磁気粒子が特許文献に記載されている。たとえば、米国特許３゜ ９７０．５１８．４，０１８，８８６．４，２３０，６８５．４．　２６７、２ ３４．４，４５２，７７３．４，５５４．０８８および４，６５９．６７８であ る。

これらの粒子のうちのあるものは、軽度に攪拌すると適切な懸濁特性を有し、免 疫試薬のための有用な固相支持体であることが開示されている。しかし、知られ ている限りでは、ある程度攪拌しないと現在市販されている磁気粒子は時間がた つと沈降し、使用前に再浮遊させなくてはならない。これは、このような試薬を 使用するプロセスに、もう一つ段階を加えることになる。

上記のような小さい磁気粒子は、一般に二つの広いカテゴリーに分けられる。

第一のカテゴリーは永久的に磁化された粒子を含む。第二のカテゴリーは磁場に おかされたときにのみ磁性となる粒子を含む。本書では後者を磁気反応性粒子と 呼ぶ。磁気反応性を示す物質は、時により超常磁性と呼ばれる。しかし、一部の 強磁性材料、たとえば磁性酸化鉄は、結晶の大きさが直径約３０ＯＡまたはそれ 以下では、磁気反応性として特徴づけられる。これに対して、強磁性材料の大き い結晶は、磁場に露出されたあと永久磁石特性を保持し、そのあと凝集する傾向 がある。Ｐ、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ：Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｏｅｎｇ。

ＸＶ：　６０３−０６　（１９７３）を参照。

磁気反応性コロイド状磁鉄鉱が知られている。Ｏｗｅｎ　ｅｔ　ａｌの米国特許 ４，７９５，６９８を参照。この特許は、真のコロイドと同様の特性を示すポリ マー被覆、サブミクロンサイズの磁鉄鉱粒子に関するものである。

試験媒体からの磁気粒子を含む目標物質の結合・自由分離のために用いられる磁 気分離装置／方法は、磁気粒子の性質と粒度に依存する。ミクロンサイズ強磁性 の、つまり永久的に磁化された粒子は、市販の磁気分離装置によって溶液から容 易に分離される。このような装置は、試験媒体を保持する容器の外側に、１個の 比較的廉価な永久磁石を使用している。このような磁気分離機の例は、５ｅｒｏ ｎｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社（Ｎｏｒｗｅｌ　１．ＭＡ）製造のＭＡＩＡ磁 気分離機、ＤＡＮＡＬ社（Ｇｒｅａｔ　Ｎｅｃｋ、Ｎ、Ｙ、）製造のＤＹＮＡＬ ＭＰＣ−１、Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ社（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ。

ＭＡ）製造のＢｉｏＭａｇ分離機がある。磁気固相ラジオイムノアッセイを行う この種の装置の特殊適用が、Ｌ、Ｈｅｒｓｈ　ｅｔ　ａｌ、Ｃ１１ｎｉｃａ　Ｃ ｈｅｍｉｃａ　Ａｃｔａ　６３：６９４２　（１９７５）に記載されている。Ｃ ｉｂａ−Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社（Ｗａｍ ｐ　ｏ　１　ｅ、　ＭＡ）製造の同じような磁気分離機には平行に配置された棒 磁石の列が分離機の基部に取付けられている。この装置には６０本の試験管が収 納され、各管の閉じた端部は２本の棒磁石の間の凹部にはめられている。

セルローズ被覆磁気粒子を用いた自動連続流ラジオイムノアッセイ装置が米国特 許４，１４１，６８７に述べられている。°　６８７特許に挙げられた自動装置 は、サンプル検出器の制御下にプログラマ装置により所定の順序で操作される精 巧な電磁トラップを含んでいる。

上記の磁気分離機には、磁石の方へ引きつけられる磁気粒子がサンプル容器の内 面に多層をなして形成される傾向があり、磁気粒子が不純物といっしょに捕捉さ れ、激しく洗浄しても除去するのが難しいという短所がある。

コロイド状磁性材料は、強力な電磁石を用いても溶液から容易に分離できず、そ の代わりに高勾配界磁分離法を必要とする。Ｒ，Ｒ，０ｄｅｒ　：　ＩＥＥＥ　 Ｔｒａｎｓ、Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ、１２：４２８−３５　（１９７６Ｌ　Ｃ，Ｏ ｗｅｎおよびＰ、Ｌｉｂｅｒｔｉ　ｒ細胞分離：方法と選択的用途」第５巻、Ｐ ｒｅｔｌｏｗ　ａｎｄ　Ｐｒｅｔｌｏｗ　ｅｄｓ、、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ ｓｓ。

ＮＹ　（１９８６）、Ｊ、Ｔ、ＫｅｍｓｈｅａｄおよびＪ、Ｕｇｅｌｓｔａｄｒ 磁気分子および細胞生化学Ｊ　６７．１１−１８　（１９８５）を参照。このよ うな物質を濾過するのに通常用いられる勾配磁場はきわめて大きい磁力を発生す る。このような粒子を様々に操作して、たとえば凝集剤を加えて、試験媒体から コロイド状磁気粒子の磁気分離を行うためのもう一つの有用な方法は、１９８９ 年８月４日に出願された同時系属出願、共同所有の米国特許出願３８９，６９７ の主題である。

高勾配磁気分離（ＨＧＭＳ）は、代表的には分離室を備えた装置を用いて達成さ れ、分離室内には従来型電磁石または超伝導磁石の棒の間に磁性ステンレス鋼ワ イアの塊が配置され、ワイアのまわりに大きい界磁勾配を発生させ、これが磁気 粒子を含む目標物質に強い引力を加える。

上記のような種類の市販の高勾配磁気分離機は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅ ｃ　ＧｍｂＨ（西ドイツ、Ｇｌａｄｂａｃｋ）製造のＭＡＣ３装置であり、これ は、永久磁石とともに非剛性スチールウール・マトリックスを詰めたカラム（柱 ）を使用している。操作時には、スチールウール・マトリックスの近くに発生す る高い磁場勾配が磁気粒子を引きつけて保持し、一方、非磁性試験媒体がカラム を貫流し、これにより除去される。コロイド状磁性成分を含むスラリーから、磁 性成分を分離するためスチールウール・マトリックスを用いた同じような磁気分 離機が、米国特許３，５６７．０２６．３，６７６．３３７および３．　９０２ ゜９９４に開示されている。この最後に述べた特許では、分離機は、連続移動素 子として磁場の影響下にはいったり出たりできる磁性ウール・マトリックスを備 えている。

このような先行技術の高勾配磁気分離装置のスチールウール・マトリックスは目 標物質以外の生体物質を非特異的に捕捉することが多く、これらの生体物質は充 分に洗浄し、目標物質を保持する粒子を再浮遊させないと完全除去できない。

さらに、多くの先行技術の高勾配磁気分離装置のカラムの大きさは、かなりの量 の実験物質を必要とし、これによって様々な重要な実験室規模の分離での使用が 限定される。その上、スチールウール・マトリックスは一部の感受性の高い細胞 にとっては有害である。

上記の問題を解決する有用な磁気分離機が、１９９０年９月２６日に出願された 、同時系属出願、共同所有の米国特許出願５８８．６６２の主題である。この同 時系属出願の分離機は、容器の外側に対向する一対の磁石を備えた磁気手段と、 試験媒体を保持する容器内に配置した磁気勾配強化手段とにより構成される。磁 気粒子は試験媒体から粒子を分離し、または除去する役をする容器内の磁気手段 に付着する。

米国特許４，６６３，０２９は、磁場勾配強化部として磁性ウール・マトリック スを用いる装置の改良である高勾配磁気分離装置に関するものであり、また流体 内の粒子の磁化率（磁気感受率）の差によって分離を行う装置に関するものであ る。゛　０２９特許は、非磁性容器とこの容器に隣接して伸びる磁化ワイアまた はロッドによって構成される分離機内にスラリーを通すことにより、その磁気モ ーメントによってスラリーから粒子を連続磁気分離するための装置について述べ ている。ワイアは、ワイアの縦軸に対して横方向の磁化成分をつくり出す磁場に よって磁化され、容器空間のあらゆる箇所に界磁勾配を伸ばし、容器内を通る粒 子に放射方向の力を加える。容器に対する磁場の方向に応じて、スラリー内の反 磁性粒子はワイアに向かって引きつけられ、常磁性粒子ははねつけられ、磁場を 容器の平面に対して通常９０度回転すると、その逆となる。

先行技術についての上記の考察によって、コロイド状磁気粒子に関連した生体特 異的親和反応にもとづ（医学的または生物学的分析を行う場合に、高勾配磁気分 離がある程度の利点を有することは明らかである。しかし、構造と操作が比較的 簡単であり、分離室の外側に配置した勾配強化手段だけに依拠し、しかも磁場勾 配を最大限に大きくし、非目標物質の捕捉を少なくし、剪断力や他の生体物質と の衝突によって固定化された目標物質の喪失をなくし標準マイクロタイタープレ ートウェルが使用できるような、高勾配磁気分離装置および方法を提供すること が望ましい。このような開発は各種の実験室規模の分離、とくにイムノアッセイ や細胞選別を行う上で、明らかに実用性がある。

発明の概要 本発明の目的は、試験媒体から磁気反応的コロイド状粒子を分離するため、非磁 性試験媒体内に高勾配磁場を発生できる磁気分離装置および方法を提供すること である。比較的大きい磁気粒子は水性媒体から沈降する傾向があるが、これとは 異なり、磁気反応性コロイド状粒子は、不特定の期間のあいだ、水性媒体に懸濁 状態のままとどまり、こうして目標物質に容易に接近できるようになる。

本発明の磁気分離機は、少なくとも１個の容器と、この容器内で試験媒体内に高 勾配磁場を発生することのできる磁気手段とによって構成される。容器は内部表 面部を有する周壁を備え、その中に磁気反応性コロイド状粒子を含む試験媒体を 収納する（以下、「分離する試験媒体」と呼ぶ）。下記にさらに（ゎしく述べる ように、磁場勾配発生手段が、容器の外側に配置され、容器の内側に「開いた」 界磁勾配をつくり出し、この場合、磁場は、壁から最も遠くにある試験媒体より も、容器の内側壁面に沿った試験媒体での方が強い。

分離する試験媒体が定常状態にあるとき、たとえばバッチ式操作のときは適切な 容器は、マイクロタイターウェル、試験管、一端が閉じた毛細管、望みの分離を 行うため一つの小室を区切る非磁性壁つき円筒容器を含んでいる。さらに、１個 をこえるサンプル容器を保持できるキャリア（保持体）を使用することによって 、複数の試験サンプルを同時に処理できる。一つの好ましい形態では、キャリア はキャリアの周辺部のまわりに複数の容器を保持する手段を含む。

試験媒体が連続的に分離機を通過するときは、適切な容器は両端が開いた導管ま たは管である。このような容器はできれば非磁性、たとえばガラスまたはプラス チックであり、円筒形であることが望ましい。できれば容器は一端に試験媒体を 受けるための入口があり、試験媒体が容器の中央部分で高い磁場勾配に露出され ることが望ましい。この特定の実施例では、容器はまた、両端間で容器内に間隔 をおいて配置した１個またはそれ以上の非磁性バッフル（じゃま板）を備えるこ とができる。このバッフルは、試験媒体が容器を通って軸のまわりの部分へ流れ る通路の断面積を制限するような寸法となっている。できればバッフルは流れの 方向に沿って、放射方向下方へ傾斜し、それと接触する磁気反応コロイド状粒子 を壁の方へ導くようにすることが望ましい。できれば、導管は入口と反対側の端 部に横方向に間隔をおいて配置された出口手段を備えることが望ましい。磁気粒 子を収集するため、容器の出口端の周辺部に、一つの出口手段を設けるとよい。

試験媒体を排出するために出口端に、もう一つの出口手段を中央に設ける。

と（に好ましい実施例では、磁場発生手段は、４個または６個の永久磁石または 電磁石を備える。磁石は容器を収納する中空部を区切るように配置される。この 実施例では、中空部の反対側にある磁石の極性と位置付けは、容器内の試験媒体 内部に高勾配磁場を発生させる磁束線をつくり出すようなものとする。磁石はで きれば円筒形の強磁性ヨーク（枠）内に収納し、このヨークは装置によってつく り出される磁界強さを高める役目を果たす。この「多極」配置によってつくり出 される磁場勾配の特徴は中空部の縁部近くで磁場がきわめて強く、中空部の中央 では実買上磁場がないことにある。従って、中空部の縁部近くの、容器の壁に隣 接する試験媒体内の磁気粒子は、磁界強さがゼロにまで落ちる中空部の中心の、 容器の壁から最も遠くにある試験媒体内の粒子に比べて、かなり大きい磁力を受 ける。

とくに、磁石によって区切られる中空部が、容器またはキャリア（保持体）の断 面よりもずっと大きいときには、磁束集中手段を含めると有利である。誘導磁場 によって磁化される、または磁化可能な様々な幾何学的形状のポールがこの目的 に適している。各磁石を互いに対して固定位置に保持するため、磁気手段を含む 磁石を磁気的に、あるいはたとえばエポキシ樹脂で接着して、ヨークに結合して もよい。

本発明の実施にあたって好んで用いられる、とくに比較的粒度の小さい磁気粒子 の物理的性質によって、知られている限り従来達成できなかったような効率が得 られる。さらに、試験媒体と接触する容器の壁の露出表面積に対して、試験媒体 に加える磁気粒子の量を調節することによフて、また磁場の磁束線と実質上同じ 広がりをもつこのような露出表面の方向を調節することによって、磁気粒子を容 器壁の露出表面に沿って、実質的に一つの層に付着させ、また磁気粒子およびこ れによって保持される物質または材料の大きさにほぼ対応する厚さの層にするこ とができる。このようにすることにより、固定化された磁気粒子内の非特異的結 合物質の吸収は実質上無視できる。

本発明の方法によって、非磁性試験媒体から磁気反応性コロイド状粒子を分離す る場合、粒子はまず非磁性試験媒体内に分散され、その中で安定した懸濁液を形 成する。通常は、磁気粒子は試験媒体内の目標物質に特異的に結合できる受容体 を含んでいる。定常状態で試験媒体から目標物質を分離したいときは、試験媒体 と、受容体・磁気粒子抱合体を入れた適当な容器をバッチ処理のため磁気分離機 内に入れる。容器のまわりに配置された外部磁気手段は、試験媒体内に磁場勾配 をつくり出し、これによって磁気粒子は壁の方へ移動し、これに付着する。

キャリア内に保持した複数の容器を使用する本発明の方法では、磁場勾配によっ て、試験媒体内の磁気反応性コロイド粒子は、磁気手段に最も近い各容器の壁の 方へ移動し、これに付着する。この方法によれば、キャリア内の各容器の壁の方 向は、磁気手段に対して調節することができ、これによって磁気粒子を各容器の 壁のまわりにさらに均等に付着させることができる。

本発明による方法のもう一つの実施例では、分離される試験媒体は分離機を貫流 させることができる。磁場勾配強化手段は、充分な強さの「開かれた」磁場勾配 をつくり出して、所定の速さで動く試験媒体から磁気粒子を引きつけ、それを壁 部に付着させる。非磁性試験媒体は出口端で容器から排出される。この方法の一 つの関連実施例では、容器が１個またはそれ以上のバッフル（じゃま板）を含み 、分離される試験媒体は、導管の一端にある入口へ注入される。試験媒体が導管 内を移動するにつれて、試験媒体内の磁気粒子は磁気手段によって導管の壁の方 へと引きつけられ、バッフルと接触する。バッフルは粒子を分離容器の壁の方へ 移動するよう配置されている。磁気手段は、粒子を分離容器の内壁に付着させる よう、また粒子が壁に沿って下降し入口の反対端で壁の周辺に沿って設けられた １個またはそれ以上の出口で収集されるよう操作できる。試験媒体は、入口端の 反対端部の、導管中央部にある粒子出口（１個または複数）から横方向に間隔を おいて配置された出口で除去できる。

本発明の方法を実施する場合、非磁性試験媒体は分離機から除去でき、一方で磁 気粒子は容器の壁に保持され、希望するようにその後の処理を行うことができる 。このように生体特異性親和反応に関連した分析を行うことによって、目標物質 を含む磁気粒子の再懸濁を効果的に回避することができる。従って、この方法は 生体分析試験に要する処理時間と費用を実質的に削減する。

また、本発明によれば、ここに述べた分離方法を実施するに当たって、コロイド 状磁性ヤギ抗マウスＦｃ粒子などの磁性捕捉剤を加える前に、試験媒体内に過剰 に存在するいくつかの試薬を除去する必要がないことが発見された。

このような発見は、非結合標識モノクローナル抗体の除去を回避することによっ て、たとえば分離手順を一般に簡略化できるだけでなく、細胞に対して行う生体 分析手順、たとえば臨床的に興味のある細胞分離における細胞生存率を高めるこ とができる。そこで、本発明はまた、特性決定基を有する膜含有生体成分を、次 の各段階によって試験サンプルから分離する方法を提供する。すなわち、決定基 に対する結合特異性を有する受容体を、受容体を決定基に結合させるに充分な量 だけ、また余分な受容体を試験サンプル内に提供するに充分な量だけ、試験サン プル内に導入する段階と、余分な受容体の存在下で、決定基結合受容体に結合す る多価の捕捉剤を試験サンプル内に導入する〔ここで決定基結合受容体の少くと も１つで、生体成分・受容体・捕捉剤複合体を形成し、捕捉剤はコロイド状磁気 粒子と結合している〕段階と、高勾配磁場の影響下で試験サンプルからこの複合 体を分離する段階、である。

上記の説明から、構造と操作が比較的簡単であり、試験媒体から、目標物質を含 む（保持する）磁気粒子を効率的、また効果的に分離できる分離装置および方法 を本発明が提供することが理解されるであろう。

図面の簡単な説明 図１は、説明のため装置の一部を切裂図とした本発明による磁気分離装置の透視 図である。

図２は、図１に示した装置の平面図である。

図３は、６個の磁石を有する磁気手段を備えた本発明の関連実施例の平面図であ る。

図４は、数個の容器がキャリア（保持体）内に保持された本発明の関連実施例の 断片的透視図である。

図５は、貫流試験容器が内部バッフル（じゃま板）を備えた本発明のもう一つの 実施例の透視図である。

図６は、図５の装置の垂直断面図である。

同じ参照符号は、図面内の同じ部品を示す。

好適な実施例の説明 図面を参照して本発明の好適な実施例および方法について詳細に説明する。

本発明の磁気分離装置および方法は、生体特異的親和反応に関連した各種の実験 室手順および臨床手順でとくに有用である。このような手順では、磁気反応性で コロイド状の粒子（すなわち、超常磁性であり、また非磁性試験媒体内で懸濁状 態にとどまることのできる粒子）が用いられ、またこの粒子は試験サンプル内の 、問題となる物質を結合することのできる受容体を含んでいる。この方法では、 受容体が目標物質を結合したあと、磁気分離機が高勾配磁気分離によって試験媒 体から磁気粒子を除去する。

このような生体特異性親和反応は、広範囲の目標物質を測定するため、生体サン プルの試験に用いられ、目標物質の代表的なものとしては細胞、細胞成分、細胞 並集団（真核および原核）、細菌、寄生虫、抗原、特異性抗体、ビタミンなどの 特異的生体因子、ウィルスや遺伝子プローブ分析の場合の特異的核酸配列がある 。従って本発明による磁気分離装置および方法は、細胞の分析または分離のため の細胞分離を実施するのに使用することができ、これには、たとえば、Ｔ細胞リ ンパ腫細胞株からＴ細胞を、Ｂ細胞リンパ腫細胞株からＢ細胞を、白血球からＣ Ｄ４陽性細胞を、白血球からリンパ球を、正常細胞から腫瘍細胞を、また骨髄細 胞から幹細胞を分離するのに使用できる。

また、本発明の方法は、単球、顆粒球、その他の細胞の免疫特異的分離、希有細 胞の除去、ナチュラルキラー細胞の除去、網状赤血球の測定、たとえば膜電位の 変化を測定するための好中球機能のアッセイ、酸化バースト分析、食作用、アッ セイおよびオプソニン化研究などに用いることができる。

同様に、この磁気分離装置および方法は、細菌または寄生虫の分離あるいは分析 に使用することができ、これには、糞便、尿、スラッジ、スラリーおよび水（た とえば、地下水または河川）からの各種細菌および寄生虫の分離が含まれる。ま た本発明は、食品（液体、固体）、痰および尿中の各種細菌を分離するのに使用 することができる。

この発明の実施に使用するに適した磁気粒子は、真のコロイドと同じ特性を示す 粒子である。このような粒子の特徴はサブミクロン級の粒度を有することであり 、これは一般に約２００ナノメートル（ｎｍ）（０，２０ミクロン）未満であり 、また長時間にわたって溶液からの重力分離に対して安定していることを特徴と している。（磁気粒子の）適切な物質は超常磁性物質の結晶コアと、それを取囲 む分子によって構成され、各分子は磁性コアに物理的に吸収され、あるいは共有 結合によって付着し、安定したコロイド特性を示す。コロイド粒子の大きさは、 完全な磁区を含まないほど充分に小さいものであり、そのブラウンエネルギーは 、その磁気モーメントを超えるものである。その結果、これらのコロイド状磁気 粒子の北極、南極、整列、およびそのあとの相互吸引／反撥は、かなり強力な磁 場でも起こるとは考えられず、これがその溶液安定性に貢献している。従って、 コロイド状磁気粒子は、強力な電磁石によっても溶液から容易に分離できないが 、その代わりに、離散粒子を分離できるためには、粒子が懸濁状態にある試験媒 体内に、比較的高勾配の磁場が発生することを必要とする。

上記のような性質をそなえた磁気粒子は米国特許４，７９５，６９８に述べられ たように調製することができ、その開示内容は本明細書で完全に述べられたかの ように、ここに川魚され組込まれている。

細胞分離のためには、試験媒体は通常は、血液、尿、痰、または分泌物などの適 切に準備された体液から調製される。コロイド状磁気粒子は緩衝液中の試験媒体 に加えることが望ましい。この目的に適した緩衝液はウシ血清アルブミン（ＢＳ Ａ）５％払生体親和性のリン酸塩溶液９５％からなり、場合によって比較的少量 のデキストロース、塩化ナトリウムおよび塩化カリを含む。緩衝液は等強性でｐ Ｈ値は約７とする。タンパク質は分析を妨げる相互作用を低下させる役目を果た す。目標物質は磁気粒子を導入する前、後あるいは導入と同時に試験媒体に添加 することができる。本発明による方法は、コロイド状磁気粒子の拡散制御溶液運 動を利用しており、これは試験媒体に熱を加えることによりさらに促進される。

試験媒体はその中にある受容体と問題となるリガンドの間の結合を高めるため通 常、インキュベートされる。インキュベーションは普通、室温か、または試験媒 体の凍結点くすなわち４℃）のやや上の温度で行う。時によりインキュベーショ ンは３７℃で行うことができる。インキュベーション時間は通常は、比較的短時 間（すなわち、約２〜１５分）である。受容体とリガンドの接触を容易にするた めに、試験媒体をインキュベーションの間攪拌したり、かき立てたりする。

緩衝液のごく一部を適当な陰イオン多価電解質で置換えると試験媒体内の目標物 質以外の物質への受容体の結合（つまり、非特異的結合）はずっと押さえられる 。Ｒｏｈｍ　ａｎｄ　Ｈａａｓ社（Ｐｈｉ　１ａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐ、Ａ）から 入手可能なＴａｍｏｌ　８５０の商品名で販売されている市販のスケール防止剤 を用いると、満足な結果が得られた。Ｔａｍｏｌ　８５０はポリメタクリル酸の 水性溶液として販売されており、分子量は１２，０００　（重量平均）、全固形 分２９〜３１％、密度９．９　１ｂｓ／ｇａｌ　（２５℃）、ブルックフィール ド粘度１２５〜３２５　（２５℃）、スピンドル／速度は＃２＠６０である。本 発明の実施時に非特異的結合を低下させるには一般に、リン酸緩衝液に（活性ベ ースで）約０．　１％〜３％のＴａｍｏｌ　８５０を添加するとよい。

本発明による方法を実施して、様々な生体物質を余分な受容体を含む試験媒体か ら磁気分離する場合、問題となる生体物質に選択的に結合する抗体が通常、受容 体として用いられる。この目的のためにはモノクローナル抗体を用いることが好 ましい。しかし望むときは抗体産生細胞または抗原処理細胞のための抗原、コン カナバリンＡ１大豆アグルチニン、小麦胚芽アグルチニンなどのレクチン類、ビ オチン標識試薬またはハブテン標識試薬などを含む非抗体受容体を用いることが できる。

捕捉物質は、生体物質・受容体・捕捉物質複合体を形成するため、受容体に選択 的に結合することのできる物質である。適当な捕捉物質としては、Ｉｇが受容体 として用いられるプロティンＡまたはプロティンＧ１ビオチン標識試薬が受容体 として用いられるアビジン、およびハプテン標識試薬が受容体として用いられる 抗ハブテンがある。炭水化物または糖タンパク質成分を含む膜含有生体物質に選 択的に結合するレクチン受容体（たとえば、コンカナバリンＡ１大豆アグルチニ ンまたは小麦胚芽アグルチニン）の捕捉を容易にするため、ビオチンまたはハブ テンを用いてもよい。この目的に適したハプテン／抗ハプテンのベアとしては、 ＤＮＰ　（ジニトロフェノール）／抗ＤＮＰ、フルオレセイン／抗フルオレセイ ン、またはアルサニル酸／抗アルサニル酸がある。捕捉物質は、高勾配磁場によ って分離が可能なコロイド状磁気粒子を含むことが好ましいが、望むときは受容 体はコロイド状磁気粒子を含んでよい。

問題となる物質に受容体が結合したあと、試験媒体からのコロイド状磁気粒子の 磁気分離を、本発明の装置および方法を用いて実施する。試験媒体を、希望に応 じてバッチ式処理または連続処理のための適切な分離容器に入れ、これを貫流さ せる。容器の外周のまわりに配置された磁気手段が、容器の壁に対して横方向に 、試験媒体内に高勾配磁場または磁束を発生させる。磁気手段は、容器のまわり に交互に位！する複数の北磁極と複数の南磁極を含んでいる。本発明のいくつか の好ましい実施例によれば、４個または６個の磁石が等間隔で容器を取り囲み、 磁場が容器の壁に沿って実質的に均等となるようにする。このようにして発生し た高勾配（磁場）によって、磁気粒子は容器の壁面に向かって移動し、粒子は壁 面に付着して容易に試験媒体から分離できるようになる。

図１と図２は、本発明にもとづく磁気分離機の一つの実施例を示す。分離機２１ は、周壁２５を有する容器２３と、試験媒体を受けるための開放上部によって構 成される。また、磁気分離機は４個の磁石２７を含み、これらが容器を受けるた めの中空部３３を区切っている。磁石２７は、たとえばそれらが接着によって取 付けられている円筒形強磁性ハウジングまたはヨーク３１の内面に沿って等間隔 で配置されている。希望するときは、磁石には異なる寸法の容器を収納するため に中空部３３の横方向寸法を変えることのできる極片２９など磁束集中手段を備 えることができる。また磁場をもっと均等に放射状にする極片などの磁束集中手 段を備えることができる。

図１と図２に示したように、試験媒体を保持するのに用いる容器はマイクロタイ ターウェルである。この容器は磁石の各面によって区切られた中空部３３と実質 的に同軸上に配！される。この位置で、壁部に隣接する試験媒体３５内の磁場は 、磁石によって発生する磁場に近づ（。これと対照的に、中空部３３の軸３７に 沿って配置された容器の部分、つまり、壁から最も遠くにある試験媒体内には実 質上、磁場はない。

試験媒体に露出されたマイクロタイターウェルの壁部には、コロイド状磁気粒子 を付着させるための充分な表面積がある。上記のような条件下で使用した場合、 本発明による磁気分離機の利点として、磁気コロイドの量を適切に調節すること によって、粒子は磁気勾配の高い媒体と接する表面にほぼ均等に沈着するように なる。その結果、粒子は壁の内側表面の広い部分に、効果的に単一の層となって 沈着し、これは先行技術の磁気分離機で見られるような、もっと小さい表面に形 成されるときのように潜在的干渉物質を捕捉しやすい多重層または粒子凝集物と は異なる。たとえば、ＩｇＧ保持磁気コロイドを用いた実験では酵素を混合した コロイドを分離容器の側で収集するとき、コロイドが層になって蓄積し始めるに つれて酵素が捕捉されることがわかった。これに対して、本発明ではコロイド状 磁気粒子は容器表面上に充分に薄く沈着し、潜在的干渉物質は実際上捕捉されな い。この目的のためには、はぼ連続的な単一層に沈着するときに、試験媒体内の すべての磁気粒子によって占められると思われる表面積よりも壁部の凝集物収集 表面積が約２倍大きくなるように、試験媒体と接触する容器壁面の部分を選ぶこ とが好ましい。

永久磁石装置では、極表面での外部磁気手段（図２の磁石２７）の磁界強さは、 ４〜１０ＫＧａｕｓｓの範囲にあるべきであり、より好ましくは約６〜８ＫＧａ ＵＳＳであるべきである。各磁石と、図１と図２に示す容器の間の距離は一般に 約０．　１〜２．Ｑｃｍであることが好ましく、約Ｑ、５ｃｍであることが最も 好ましい。外部磁石の磁界強さは充分に大きくあるべきであり、磁石と、試験媒 体のための容器２３の間の距離は、磁気粒子の効率的分離を行うに充分な短いも のとすべきである。電磁石を用いると、極表面で約１５〜３０ＫＧａｕｓｓのか なり高い磁界強さを達成することができる。このようにして、きわめて高勾配の 磁場が得られる。

中空部３３は、容器２３の操作のため充分な余分の空間をもワて磁石により形成 すべきである。たとえば、図に示した位置に容器２３を上昇させ保持するため昇 降装置（図示せず）を配置してもよい。

図１と図２に示した極片２９は、磁化可能な材料ならどのようなものででも作る ことができる。極片は台形断面の磁化体の形のものが図に示されているが、その 他の形、たとえば３角形断面に作ってもよい。このような形態は、各磁石２７か ら発せられる磁束の集中を助ける。極片２９は磁気吸引によって磁石２７の表面 上の定位置に保持してもよい。あるいは極片が磁石本体と一体となるように磁石 ２７を作ってもよい。

図３は、図１と図２に示した磁気分離機に類似した本発明による磁気分離機のも う一つの実施例を示している。図３の分離機１２１は円筒形または類似の形をし た容器１２３により構成されている。容器はバッチ式処理のための試験管のよう に一端が閉じられたものでよく、また連続処理のための毛細管または大径管のよ うに両端が開いたものでもよい。容器には壁部１２５と、分離する試験媒体を受 けるための開口部がある。また分離機は、容器のまわりに等間隔で配置された６ 個の磁石１２７によって代表される磁気手段を含んでいる。

図４は、図１と図２に示した本発明による磁気分離機の一つの変形例である。

図４では、分離機２２１は、キャリア２４１によって保持された複数の容器２２ ３と、キャリアの外部にある磁気手段を含んでいる。各容器には周壁２２５と開 放上部がある。磁気手段はキャリアのまわりに同心状に配置された曲面をそなえ た４個の磁石２２７により構成されている。

キャリア２４１は非磁性基部２４３と、基部に取付けた個別の非磁性小室２５３ により構成されている。各小室は容器２２３のうちの１個を直立位置に保持する ような寸法に作られている。

図５と図６は、本発明による磁気分離機のもう一つの実施例を示している。磁気 分離機３２１は円筒形容器３２３を含み、このいずれかの端部には分離する試験 媒体を容器を通して貫流させるための開口部がある。また分離機は容器のまわり にほぼ等間隔に配置された４個の磁石３２７を含んでいる。

図５と図６に示した容器には、容器内部の内部断面空間３６２を区切る周壁３２ ５がある。容器の一端には入口３６３があり、これは壁部と中央部の間の内部断 面空間の中央部分３６５へ試験媒体を入れることのできるような寸法に作られて いる。また壁部３２５への流れの方向に、バッフル下方へ傾斜している。従って 、容器内を通るとき、磁気反応性コロイド粒子は磁石３２７によってバ・ソフル へまた壁部へと引きつけられる。バッフルは、磁場勾配が粒子と壁部に付着させ るに充分強力となる点へと磁気粒子を誘導する。容器にはまた少なくとも２個の 出口がある。一つの出口３６９は粒子を収集するため壁の周辺に沿ったところに ある。第二の出口３７１は非磁性試験媒体の排出のため容器の軸と整列している 。

試験媒体が磁気粒子を容器壁部へ移動させ、それに付着させるに充分な時間にわ たって磁場を受けたあと、上記のような磁気分離機を用いて試験媒体から磁気粒 子を分離することができる。試験媒体の非磁性成分は、容器をまだ分離機に入れ たまま傾瀉または吸引によって除去できる。容器が分離機内に残っている間に緩 衝液、洗浄液などを加えて壁に接触させ、実買上、残留非磁性成分がなくなるよ うに付着している磁気粒子を洗浄する。希望するときは洗浄液を除去し、このプ ロセスをくり返す。磁気粒子を再懸濁させることが有利なときは、容器を磁場か ら取り去り、操作して、磁気粒子が壁部から外れ、適当な液状媒体内に再懸濁し て分析をしやすくすることができる。

本発明による磁気分離装置および方法によって、−次インキュベーション混合物 の拡散制御溶液運動を有利に利用することができる。さらに、磁気的に固定化さ れたコロイドに対して定量を含む各種の分析方法を実施することができる。この ような段階には非特異的結合物質を除去するための洗浄、二次免疫化学反応また は検出反応（たとえば、酵素、蛍光または化学発光反応）が含まれる。

試験媒体を除去したあと容器壁部に付着した磁気粒子を保持する能力は、かなり の実用性がある。いくつかの作業をこのようにしてさらに効率よ（行うことがで きる。たとえば個別の再懸濁段階を回避しながら行う目標物質（たとえば、細胞 、反応混合物の標識成分）の洗浄やすすぎなどである。さらに磁気粒子によって 行われる標識免疫反応性物質と目標物質の相互作用に関する反応のような二次反 応を、壁部に付着した粒子でもっと効率的に行うことができる。この場合にもコ ロイド状磁気粒子の再懸濁を回避できる。さらに、本発明にもとづ（酵素標識イ ムノアッセイを実施するに当たっては、分離装置内に固定化したコロイド状磁気 粒子に直接、基質インキュベーションを行うことが望ましい。

本発明の磁気分離方法をバッチ方式で、つまり上記のように貫流方式でな（定常 システムで行うと有利である。目標物質を保持する固定化された磁気粒子が、他 の粒子との衝突によって移動することがない。さらにバッチ方式では、流れるえ れば、壁部に対する磁気粒子の付着が充分に強力なので、磁気粒子を壁部から移 動させずに、洗浄や二次反応や他の試薬との相互作用を行うことができる。さら に、粒子が反応や処理を受ける前に容器が磁場から外されても、容器壁部に対す る磁気粒子の付着はある程度維持される。

しかし、用途によっては、貫流プロセスでの使用に適した磁気分離機を使用でき ることが、きわめて望ましい。たとえば、貫流プロセスは均一な種類の物質を大 量に分離する場合に、きわめて望ましい。驚くべきことに、本発明にもとづく分 離機は、貫通プロセスを用いた場合に通常発生する上記のような粒子移動の問題 を防止できる。

一般に、磁場から取り出したあと、磁気粒子は容器壁から比較的容易に分離でき る。改良緩衝液または浴槽音波処理器で壁部に接触することにより、粒子を移動 できる。あるいは粒子をプローブ音波処理器で壁部から取り外して収集すること ができる。

上記の多極磁気分離装置では近接する隣同士の極面が逆の極性になっているが、 これによって高勾配磁場が形成され、勾配の大きさは極面での磁界密度および反 対極の分離距離によって制限される。

外部に置いた強磁性材料（細いワイア、棒、球体など）に磁場を誘導することに よって形成される勾配磁場に比べて、本発明による多極装置は、対抗する多極の 中心における磁界強さがゼロであるため、実質的に有利である。従って、発生す る勾配はゼロを超える磁場をつ（り出す能力によってのみ制限される。

以下に示す例は、本発明を構成し、またこれに用いられる方法やプロセスを詳細 に記述し、また本発明を実施するため発明者が考える最良の形態を定めるもので あるが、本発明を限定するものと解釈すべきではない。各側で示した温度は、別 に指示しない限りすべて℃である。

実施例１ 本発明にもとづく磁気分離を実施する場合に、多極装置によつてっ（り出される 高勾配磁場の有用性を立証するために、４極および６極装置を製作し、試験した 。この目的のために希土類永久磁石を使用した（Ｃｒｕｍａｘ　３５５．Ｃｒｕ ｃｉｂｌｅ　Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ社；Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｔｏｗｎ、ＫＹ）が、 望むときには電磁石を使用することもできる。図１〜３に示したものに似た４極 および６極装置を、内径２．５インチ、長さ５ｃｍの円筒形鋼管（水道設備業者 から入手できる）の形をしたヨークと、この円筒の内壁に配置した棒磁石とで構 成した。Ｃｒｕｍａｘ　３５５棒磁石（１，２７Ｘ１．２７Ｘ５ｃｍ）（１，２ ７ｃｍの辺のうちの一方の方向に磁化）を円筒の内面に取付け、棒磁石の長い方 の辺を円筒の軸に平行にした。４極装置では、円筒の軸に直角方向の面に対して ９０６．１８０°、２７０″、３６０°に４個の棒磁石を配置した。６極装置も 同じように製作したが、６個の棒磁石は円筒形ヨークのまわりに、６０°、１２ ０°、１８０°、２４０°、３００°、３６０°で配置した。４極および６極の 両装置とも、磁石の極性はヨークのまわりで交互に変えた。このように構成した ４極および６極の装置で、対抗する磁石の各面の間隔は３．４Ｃｍ（極面ギャッ プ半径＝１．７ｃｍ）であり、各極面での磁束密度はガウスメータ（Ａｐｐｌｉ ｅｄ　Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ ）で測定して５．５ＫＧａｕｓｓであった。中央での磁場は０であり、平均磁場 勾配は３．２ＫＧａｕｓｓ／ｃｍであった。

小さい磁気粒子、または磁気粒子が結合している細胞を放射方向に分離するため の４極および６極装置の有効性をしらべるために、次のような実験を行った。

すなわち、ウシ血清アルブミンを塗布した磁性コロイド（粒子の直径６０ｎｍ） を、Ｏｗｅｎ　ｅｔ　ａｌの米国特許４，７９５，６９８゛の実施例１に述べら れた方法によって作成した。この磁性コロイドの小さい凝集体（２００〜３００ ｎｍ）をＮａＣ１を添加することによって形成した。ＮａＣ１を加えると、１９ ８９年８月４日出願の同時系属米国特許出願３８９，６９９に述べられているよ うにコロイドの部分的塩析が起こる。このような凝集体は、特異的細胞表面抗体 を保持する磁性コロイドが結合する細胞に似た磁気分離特性を示す。従って、こ の調製品は、多極高勾配磁場装置で細胞がどのように分離するかを評価するのに 有用である。この凝集体はまた、実際のコロイドの分離と比べて、もっと長時間 にわたってコロイドの分離性をしらべるのに有用である。単一のマイクロタイタ ーウェル（内径０．７ｃｍ）内に上記凝集体の部分標本２５０ｕ１を入れて、磁 場内の異なる箇所にウェルを置き、試験媒体から分離したあと（通常３〜５分） マイクロタイターウェルの壁部に凝集体が集まるのを観察して、多極装置内の局 所磁場を測定した。これらの実験から、４極および６極装置については、磁気力 は放射方向であり、極面ギャップ半径の約６０〜７０％の半径にわたってほぼ軸 対称性であることがわかった。

もっと大きい半径で分離を行った場合、マイクロタイターウェルの外側半径では 磁性凝集体は収集されないが、より小さい半径ではきわめて均等な放射方向収集 が認められた。

上記のような放射方向部分内での収集の軸対称性を実証するために、上記の磁性 凝集体を含む内径２ｃｍの上部の開いた円筒形ガラス容器を４極または６極装置 の中央に配置し、分離を観察した。これを凝集体をいくつかの希釈液について実 施し容器壁への磁気粒子の沈着がいくつかの密度（濃さ）で観察できるようにし た。いずれの場合にも、容器壁土の沈着物は実質上均等であることがわかった。

装置内に容器を中央からはずれた位置において分離を行うと、極面に最も近い円 筒壁に不均等な収集が認められた。

非凝集コロイドが同じように分離することを立証するために、Ｍｏｎｄａｙの米 国特許４，４５２，７７３に述べられたように調製したデキストラン被覆コロイ ド（直径８０ｎｍ）を、上記のガラス容器中に入れて１０分間分離させると、均 等な沈着物が容器壁土で得られた。従って、勾配磁場がこの実験の場合よりも高 い上記装置では、コロイド状磁気粒子が急速に分離できることが当然期待される 。

装置中央での磁場は測定でゼロであったが、容器の中央から磁気粒子が回収され た。従って、小さい磁気粒子の熱エネルギーが溶媒中の熱の影響による混合と組 合わされて、容器の高勾配部分への拡散を起こすと思われる。磁場の均等性と軸 対称性は理論的には多極装置の製作に用いる極面と磁石を適当な曲面にすること によって達成できる。隣接磁石間のギャップを最小限に押さえることによって、 これらの部分の近くの磁場の不規則性をさらに減少させることができる。

実施例２ 上記の実施例１の多極装置を用いて、哺乳類の細胞を分離した。この実験におけ る目標物質は、ＡＴＣＣから得られる条件下での細胞培養で維持されるヒトＴ細 胞（ＡＴＣＣ受入番号ＣＣＬ１１９．ＣＣＲＦ−ＣＥＭ）であった。細胞は、Ｇ ＧＶ　Ｋｒａｕｓの方法〔「リンパ球、実際的アプローチＪ　（ＩＲＬ　Ｐｒｅ ｓｓ　Ｌｔｄ、、ｐ、１４４　（１９８７）））によりクローム５１　（Ｃｒ５ １）で標識するか、または技術上既知の方法によってアクリジンオレンジで蛍光 標識した。いずれかの方法で標識したあと、細胞を通常のやり方で洗浄した。細 胞は、０．１％アジ化ナトリウムを含む細胞親和性等強性のリン酸緩衝液（ｐＨ ７，２）に１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを加えた液の中で約３Ｘ１０６　ｃｅｌｌｓ／ ｍｌに再懸濁させた。米国特許４，４５２，７７３に述べられたＭｏ１ｄａｙの 方法により作られ、細胞に対してきわめて高い非特異的結合を示すデキストラン 被覆コロイド（直径８０ｎｍ）を磁気標識細胞に対して用いた。このコロイドの 最終濃度は細胞懸濁液の１７ｕｇ　１ｒｏｎ／ｍｌであった。

蛍光標識した細胞を、内径がそれぞれ、１．７６．２．３８および３．１７ｃｍ の上部の開いたガラス円筒容器に入れた。これらの容器を４極または６極分離装 置の中央に入れ、装置を倒立顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ　Ａｘｉｏｖｅｒｔ　３５Ｍ； Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）のステージ上に取付け、容器のすべての部分におけ る分離が細胞の蛍光顕微鏡検査によって観察できるようにした。２個の小径容器 の場合には、容器の周壁への、磁気による細胞の移動は完全に均等であった。

直径３．１７ｃｍの容器を用いたときは、隣接磁石間のギャップに対応する位置 で周辺部上に不規則な収集が認められた。従って、４極装置では細胞が余分に収 集される部分が４つあった（９０’　、１８０°、２７０°、３６０°）。６極 装置ではそのような部分が６つあった。そこで特定の分離装置について適切な分 離容器をえらぶことによって、容器壁に磁気粒子をほぼ均等に沈着させることが できる。

実施例３ （磁場がゼロの）多極装置の中心から細胞がいかに効率よく放射方向に動かされ るかをしらべるために放射能標識した細胞を内径２．３８ｃｍの円筒容器内に入 れ、次にこの容器を上記に述べるように製作した６極装置の中央部に置いた。

試験媒体の部分標本を容器中央から定期的に、慎重に取り出し、Ｃｒ５１をカウ ントし、これからこの部分における細胞の減少量を計算した。３分で細胞の３０ ％が中央部分から除去され、７分で細胞の７７％が除去され、１２分で８６％が 除去された。従って、本質的に熱による運動を示さない細胞の場合でも、細胞は 充分に混合され、装置の中心部から引きつけられる。この実験は多極装置内に配 置された円筒形容器を貫流する細胞を効率よ（除去できることを立証するもので ある。適切な流れパラメータと適当なバッフル（じゃま板）を用いて、多極装置 を細胞の連続的除去に使用することができる。

実施例４ 内径と外径がそれぞれ５．７８ｃｍと８．３２ｃｍ、高さが５．１０ｃｍの円筒 形鋼製ヨークと、寸法が０．６３５Ｘ２．５４Ｘ５．１０ｃｍで、２．５４ｃｍ の寸法の側を通して磁化した４個のＣｒｕｍａｘ　３５５永久棒磁石から４極分 離装置を製作した。４個の磁石を円筒の内面上に９０°、１８０″、２７０°１ ３６０°で配置し、各棒磁石の５．１０ｃｍの辺がヨークの軸に平行となり、２ ゜５４ｃｍの辺が放射方向となるように揃えた。上記の４極（装置）で、対向す る磁石面は極性が同じであり、隣接する磁石は表面での極性が逆であった。各棒 磁石を適切に、つまり互いに対して９０″に配置するために、アルミニウム製の アーチ形スペーサーを製作し、各棒磁石の間の空間に適合させた。このような構 成によって、対向する極面間の間隙が０．７０ｃｍの４極（装置）ができた。ガ ウスメータを用いて、磁場が極面で５．９５ＫＧａｕｓｓであり、中央でゼロで あることを測定した。従って、この組立品の平均磁場勾配は１７ＫＧａｕｓｓ／ ｃｍである。この分離装置が溶液からコロイドサイズの磁気粒子をどのようにう まく除去するかをしらべるために長さ６ｃｍ、内径０．３０ｃｍのガラス管を４ 極内にその軸にそって挿入した。この管をシリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ　Ａ ｐｐａｒａｔｕｓ、Ｄｅｄｈａｍ、ＭＡ）に接続し、試験媒体を４極の磁場内に 直立位置に配置したガラス管内に導入し、そのあと検査のために取り出した。Ｏ ｗｅｎ　ｅｔ　ａｌの米国特許４，７９５．６９８の実施例１によって調製した 直径８０ｎｍのウシ血清アルブミン塗布コロイド磁気粒子を、２０ｍＭリン酸緩 衝液（ｐＨ７，５）中に懸濁し、これを磁場内にあるガラス管内に吸い上げ、分 離させた。鉄分２０〜１００ｕＧ／ｍｌを含むこのコロイド状物質の懸濁液を磁 場勾配露出すると、分離管からポンプで汲み出した溶液の分光光度計による測定 では、完全分離が約６分で起こったことがわかった。

分離管の内面上でのコロイド状物質の分布をしらべるため、上記と同様のコロイ ド状物質を分離し、そのあと母体となる液体を管からシリンジポンプによって汲 み上げ、磁気的に沈着した物質を管の内面上で乾燥させた。このように乾燥させ た沈着物質はそのあと磁気勾配の影響を受けなかった。これらの管を検査したと ころ、物質は分離管の内面に均等に沈着していることがわかった。

実施例５ 細胞を、細胞特異的モノクローナル抗体（ＭＡｂ）で標識することによって免疫 特異的に検索するときは、通常は細胞をＭＡｂといっしょにインキュベートし、 余分なＭＡｂをウォッシュアウトし、次に多価共通捕捉物質、たとえば磁気粒子 のような適当な固体支持体にのせた二次抗体またはアビジンといっしょにインキ ュベートする。余分なＭＡｂを除去する目的は、非細胞結合ＭＡｂと多価共通捕 捉物質の間の凝集を防止するためであり、また共通捕捉物質上の結合部位を保持 するためでもある。同時に共通捕捉磁気コロイドを加える前に余分のＭＡｂの除 去を回避しながら、免疫特異的細胞分離を実施するための外部勾配磁場装置の効 率をしらへ、次のような実験を行った。共通捕捉物質として使用するために、米 国特許４，７９５．６９８に述べられたように、コロイド磁気粒子にウシ血清ア ルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）といっしょに親和精製ヤギ抗マウスＦｃ　（ＧＡＭＦｃ ）（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂ、Ｗｅｓｔ　Ｇｒ ｏｖｅ。

ＰＡ）を塗布した。コロイド上のＧＡＭＦｃおよびＢＳＡの最終濃度は、最終コ ロイドのｍｌあたりそれぞれ０．７ｍｇおよび０．０５ｍｇであった。（ＥＭ細 胞はＣｒ５１標識し、上記の実施例２に述べたように、ＰＢＳ中に最終濃度が２ ゜５ｘ１０６／ｍＬとなるよう再懸濁した。細胞懸濁１．３５ｍＬに対して、抗 ＣＤ　４　ＭＡｂ　（Ｇｅｎ−Ｔｒａｃ、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ　Ｍｅｅｔｉｎｇ、 ＰＡ）８５ｕＬを、濃度０．１ｍｇ／ｍＬ　（ＭＡｂ総量８．５ｍｇ）　で加え 、混合し、５分間インキュベートした。次に１．３５ｍＬのＧＡＭＦｃ磁気コロ イドを加え（Ｆｅ６７．５ｍｇ）、混合し、５分間インキュベートした。この混 合物２．６ｍＬをただちにポリスチレン分離器（内側寸法１０ｍｍｘ８ｍｍＸ５ １ｍｍ　（高））内に入れた。最後にこの分離器の細胞を４極装置内に入れた。

寸法が５．ＯＣｍ（長さ）、１．６ｃｍ（幅Ｌ１．９ｃｍ（奥行）の４個の棒磁 石から４極装置を製作し、磁石の１．９ｃｍの辺に沿って磁化した。極面での磁 束密度は６．６ＫＧａｕｓｓであり、４極の半径は１．１ｃｍであった。従って 、このように製作した装置の勾配は６ＫＧａｕｓｓ／ｃｍであった。分離器の１ ０１０Ｘ５１の面を直接、極面のうちの一つに当て、分離を分離器の８ｍｍの辺 に沿って放射方向に行った。

磁気分離を各識別サンプルについて、それぞれ５分、１０分、１５分行った。

すべての作業は室温で行った。

さらに、ＧＡＭＦｃコロイド緩衝液（５％ＢＳＡを含むＰＢＳ）には、細胞への コロイド非特異的結合を防止するために１％Ｔａｍｏ１−８５０　（Ｒｏｈｍ− Ｈａａｓ、Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）を含めた。分離器の背後に（４極 の中央に最も近く）配置した２０ゲージの針を用いて分離器から細胞上澄液を除 去し、部分標本でＣｒ５１をカウントし、また血球計数器で肉眼で計数した。こ れらの実験によって、細胞の４８．８３および９０％が、それぞれ５．１０およ び１５分で極片に面する容器の表面へ引きつけられることがわかった。ＭＡｂが ないとき、あるいは非特異的ＭＡｂのときには、細胞の減少は起こらなかった。

ＭＡｂインキュベーションのあと余分のＭＡｂを細胞から洗浄し除去し、そのあ とＧＡＭＦｃコロイドを加える実験では、磁気分離時間５．１０．１５分の場合 の細胞減少はかなり低かった。

溶液内に残されたＭＡｂが細胞上のものよりもずっと多いことは興味深い。（１ 個の）細胞が５０．０００個の受容体を有し、これが同数の（それだけ多（の） ＭＡｂと結合できると仮定すると０．０５ｍｇ未満のＭＡｂが消費され、８．４ ５ｍｇが溶液内に残ることになる。溶液にこれだけの量のＭＡｂがあっても、ま た溶液中に余分のコロイドがあっても、分離は容易に行われる。細胞分離のため に使用するＧＡＭＦｃコロイドを希釈すると、溶液中に残留するＭＡｂと余分の 磁性捕捉物質の間の凝集反応は、肉眼では明らかでなく、また小さい複合体が存 在したとしても分離の妨げにはならない。

余分なＭＡｂを除去せずにこのような分離を行えることは、手順が簡単になる上 、細胞分析にとってきわめて有益である。操作を簡略化することによって細胞生 存率の改善が期待されるだけでなく、余分なＭＡｂの除去を回避することによっ て、低親和性抗体を使用し利用することができ、この種の抗体は余分に加えられ ると受容体に「強制的に加え」られるが、余分なものが除去されると容易に分離 する。さらにこの方法によれば、適当な共通捕捉磁性コロイドを選択することに よって、レクチン（たとえば、コンカナバリンＡ１大豆アグルチニン、小麦胚芽 アグルチニン）を含む比較的低親和性、非抗体受容体を、細胞標識のために使用 することができる。

上記の実験から、たとえば分析目的のために、小さい磁気粒子を含む流体からこ の磁気粒子を分離するのに多極構成が有用であることは明らかである。またバイ オ処理などの特定の用途のため望まれるときは、移動する流体からコロイド磁気 粒子を除去するために、本質的に同じ設計の連続流装置を製作することができる 。

いくつかの好ましい実施例を用いて、本発明の様々な態様について上記に説明し たが、技術精通者にとってはその他の様々な実施例が考えられるであろう。たと えば、本発明の方法は、各種工業的処理の用途、とくにバイオ処理のための大量 の物質を受け入れるため規模を大きくすることができる。従って、本発明は上記 に説明し、また例を挙げた実施例に限定されることなく、付属の特許請求の範国 際調査報告 フロントベージの続き （７２）発明者　ゴーエル、ダーネッシュ・アイアメリカ合衆国、ペンシルベニ ア州 １９１４４、フィラデルフィア、ウェスト・ハーヴエイ・ストリート６００

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　磁気粒子が懸濁状態にある非磁性試験媒体から前記磁気粒子を分離するため の磁気分離機であって、 ａ）前記試験媒体を受けるための内部表面部分を有する周壁を備えた非磁性容器 と、 ｂ）前記容器内に磁場勾配を発生させる磁気手段で、前記壁部から最も遠くにあ る試験媒体よりも、前記壁部の前記内部表面部分にそった試験媒体での方が磁場 が強く、磁場が前記試験媒体内の前記磁気粒子に作用して前記磁気粒子を前記表 面部分に引きつけ、前記粒子を前記部分に付着させ、また前記磁気手段は前記容 器の前記周壁の外面のまわりに交互に配置され、前記容器のための受容部を区切 る複数の北磁極と複数の南磁極によって構成され、前記容器が前記受容部に取外 し可能なように取付けられていることを特徴とする、磁気分離機。 ２　前記磁極が、前記容器のまわりに配置された円筒形強磁性ヨークに取付けら れ、前記磁極が前記容器と前記ヨークの中間にあることを特徴とする、請求項１ 記載の磁気分離機。 ３　前記磁気手段が、約５〜３０キロガウスの磁場を発生させることを特徴とす る、請求項２記載の磁気分離機。 ４　前記磁気手段が、多数の磁石を含むことを特徴とする、請求項１記載の磁気 分離機。 ５　前記容器が円筒形であり、前記磁石のそれぞれが曲がった極面をそなえ、前 記極面が前記容器とほぼ同心状の円内に配置されることを特徴とする、請求項４ 記載の磁気分離機。 ６　また前記磁気手段が前記磁石のうちの少なくとも１個に関連した磁束集中手 段を含むことを特徴とする、請求項４記載の磁気分離機。 ７　前記磁気手段が、前記容器を取囲み、互いに対向する同じ極性の極を有する 少なくとも４個の磁石を含むことを特徴とする、請求項１記載の磁気分離機。 ８　前記磁気手段が、前記容器の周辺部にほぼ等間隔で配置されている６個の磁 石を含むことを特徴とする、請求項１記載の磁気分離機。 ９　磁気粒子が懸濁状態にある非磁性試験媒体から前記磁気粒子を分離するため の磁気分離機であって、前記分離機が、ａ）前記試験媒体を受けるための内部表 面部分を有する周壁をそなえた複数の非磁性容器と、 ｂ）前記複数の容器のための非磁性キャリア（保持体）で前記キャリアが基部を 含み、前記基部が一般に平面状であり、前記キャリアの外縁部に前記容器をかみ 合わせるための手段を有する外縁部をそなえる非磁性キャリアと、ｃ）磁場勾配 を発生させるための、前記キャリアを取囲む磁気手段であって、各容器内の前記 試験媒体の内部の磁気粒子に作用して、前記粒子を前記磁気手段に最も近い前記 内部表面部分の方へ引きつけ、干渉物質を実質上捕捉せずにこの粒子を前記表面 に付着させる磁気手段と、 によって構成されることを特徴とする、磁気分離機。 １０　磁気粒子が懸濁状態にある非磁性試験媒体から前記磁気粒子を分離するた めの磁気分離機であって、前記分離機が、ａ）容器内に、内部表面部分と内部断 面空間を形成する周壁をそなえ、一端の入口が試験媒体を内部断面空間へ流入さ せるような寸法に作られ、前記非磁性試験媒体を排出するため出口が前記一端の 反対側の端部に設けられた非磁性容器と、ｂ）前記容器の外部にあり前記周壁に 対して横方向に磁場を加えることのできる磁気手段で、前記容器内の試験媒体内 部に磁場勾配を発生させ、断面空間の中央部にある試験媒体よりも、前記壁部の 前記内部表面部分にそった前記試験媒体での方が磁場が強く、前記磁場が前記磁 気粒子に作用して前記粒子を前記表面部分へと引きつけ、粒子を前記部分に付着 させ、前記容器の前記周壁の外面のまわりに交互に配置された複数の北磁極と複 数の南磁極によって構成され前記磁気手段と、ｃ）前記磁場と前記磁場勾配から 取外すことができ、前記内部表面部分から重力によって前記磁気粒子を排出する ことのできる前記磁気手段に取外し可能なように取付けた前記容器とによって構 成されることを特徴とする、磁気分離機。 １１　前記容器が、前記容器の内側で前記端部間に配置され、前記周壁に対して 横方向の、少なくとも１個のバッフル（じゃま板）を含み、前記バッフルが、主 として前記断面空間の中央部分を通る試験媒体の流れを制限するための上流面、 下流面および中央開口部を有し、前記上流面が前記バッフルに接触する磁気粒子 を前記壁部へ効果的に誘導することを特徴とする、請求項１０記載の磁気分離機 。 １２　周壁と開放上部を有する容器と、前記容器の外側に配置された磁気手段と によって構成される磁気分離機において、非磁性試験媒体から目標物質を磁気的 に分離する方法であって、 ａ）前記目標物質に特異的に結合することのできる受容体を含む大量の磁気粒子 を、前記目標物質に前記受容体を結合させる条件下で前記試験媒体に接触させ、 目標物質を保持する磁気粒子とする段階と、ｂ）前記磁気粒子を含む前記試験媒 体を前記容器内へ導入する段階と、ｃ）前記試験媒体内に磁場勾配を発生させ、 壁部から最も遠くにある試験媒体よりも容器の前記壁部に隣接する試験媒体で磁 場が強くなるようにし、磁場が試験媒体内の磁気粒子に作用して前記磁気粒子を 前記壁部の方へ引きつけ、粒子を前記壁部に付着させるために、前記容器の周壁 が前記磁気手段に対して横方向となるように、前記試験媒体を保持する前記容器 の位置決めをする段階と、ｄ）前記容器へ導入された大量の磁気粒子を、試験媒 体に露出された前記壁部の表面部分に対して調節し、露出された表面部分の方向 を前記磁気手段に対して調節し、前記目標物質保持磁気粒子の大きさにほぼ対応 する厚さの、実質的に単一の層となるよう前記粒子を露出壁面に付着させる段階 と、によって構成される、磁気分離方法。 １３　前記容器から非磁性試験媒体を除去しながら前記容器の露出壁面への磁気 粒子の付着を維持する段階を含む、請求項１２記載の方法。 １４　磁気粒子を含む流体から磁気粒子を分離する方法であって、ａ）前記流体 内に磁場勾配を発生させるため、周壁に対して横方向に磁場を加えることのでき る磁気手段があり前記磁場は前記壁部から最も遠くにある流体よりも前記壁部に 隣接する前記流体で強くなり、前記磁気粒子を前記壁部に付着させ、前記磁気手 段が前記容器の周辺部のまわりに交互に配置された複数の北磁極と複数の南磁極 を含み、このような磁気手段に隣接して配置された、周壁と開放上部を有する非 磁性容器内に前記流体を導入する段階と、ｂ）前記壁部に付着した磁気粒子から とは別に、前記容器から前記流体を除去する段階と、 によって構成されることを特徴とする方法。 １５　前記大量の磁気粒子が前記試験媒体に露出した前記壁部の表面部分に対し て調節され、前記磁気粒子の大きさにほぼ対応する厚さの、実質的に単一の層と なるように前記磁気粒子を前記露出表面に付着させるように、前記露出壁表面部 分の方向が前記磁気手段に対して調節されることを特徴とする、請求項１４記載 の方法。 １６　免疫反応性リガンドを含む疑いのある試験媒体中における、前記リガンド の存在または量を決定するための方法であって、ａ）前記リガンドに対する第一 受容器を含み、また含むよう適合させ、また前記リガンドに対する第二の酵素結 合受容体を含む大量のコロイド磁気粒子を前記両受容体を前記リガンドに結合さ せる条件下で接触させ、酵素とリガンドの両方を保持する磁気粒子とする段階と 、 ｂ）前記流体内に磁場勾配を発生させるため、周壁に対して横方向に磁場を加え ることのできる磁気手段があり前記磁場は前記壁部から最も遠くにある流体より も前記壁部に隣接する前記流体で強くなり、前記磁気粒子を前記壁部に付着させ 、前記磁気手段が前記容器の周辺部のまわりに交互に配置された複数の北磁極と 複数の南磁極を含み、このような磁気手段に隣接して配置された、周壁と開放上 部を有する非磁性容器内に前記流体を導入する段階と、ｃ）前記磁気粒子を前記 容器の壁部に付着させたまま、前記容器から前記試験媒体を除去する段階と、 ｄ）結合していない物質を除去するため、前記粒子を前記壁部に付着させたまま 、前記磁気粒子を洗浄する段階と、 ｅ）前記試験サンプル中の前記リガンドの存在と量の目安として前記粒子に結合 した前記酵素の活性を決定する段階と、によって構成されることを特徴とする方 法。 １７　前記リガンドが抗原であり、前記第一および第二受容体が前記抗原と特異 的相互作用を行うことができることを特徴とする、請求項１６記載の方法。 １８　前記リガンド決定が、検出可能な色彩を出す色素産生性物質に前記酸素を 接触させる段階と、基準を参照して前記色彩の外見または相対的強さを検出する 段階とによって構成されることを特徴とする、請求項１６記載の方法。 １９　前記酵素の活性が前記磁気粒子を前記容器壁部に付着させたまま検出され ることを特徴とする、請求項１８記載の方法。 ２０　前記リガンド決定が、前記磁気粒子を前記容器壁部に固定化したまま、前 記リガンドに関連した二次免疫反応または検出反応を行うことにより構成される ことを特徴とする、請求項１６記載の方法。 ２１　特性決定基を有する膜含有生体成分を試験サンプルから分離する方法であ って、 ａ）前記決定基に対して結合特異性を有する受容体を、前記決定基に前記受容体 を結合させるに充分な量だけ、また前記試験サンプルに余分な受容体を供給する に充分な量だけ、試験サンプル中に導入する段階と、ｂ）前記余分な受容体の存 在下に、前記決定基結合受容体に選択的に結合する多価捕捉物質を、前記試験サ ンプル中に導入し、前記決定基結合受容体と前記捕捉物質のうち少なくとも一つ がコロイド磁気粒子と関連をもち、生体成分・受容体・捕捉物質複合体を形成す る段階と、 ｃ）高勾配磁場の影響下に、前記試験サンプルから前記複合体を分離する段階と 、によって構成されることを特徴とする方法。 ２２　特性決定基を有する生体細胞を試験媒体から分離する方法であって、ａ） 前記決定基に対し結合特異性を有するモノクローナル抗体を、前記決定基に前記 モノクローナル抗体を結合させるに充分な量だけ、また前記試験サンプルに余分 なモノクローナル抗体を供給するに充分な量だけ、前記試験媒体内に導入する段 階と、 ｂ）前記余分のモノクローナル抗体の存在下に、前記決定基結合モノクローナル 抗体に免疫特異的に結合する抗Ｆｃを含むコロイド磁気粒子を、前記試験サンプ ル内に導入する段階と、 ｃ）高勾配磁場の影響下で、前記媒体から前記抱含体を分離する段階と、によっ て構成されることを特徴とする方法。