JPH06505980A

JPH06505980A - 新しい蛋白質・ポリカチオン結合体

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Publication number: JPH06505980A
Application number: JP4506520A
Authority: JP
Inventors: ビルンスティール　マックス　エル; コッテン　マシュー; ワーグナー　エルンスト
Original assignee: ベーリンガーインゲルハイムインターナショナルゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング; ジェネンテック　インコーポレイテッド
Priority date: 1991-03-29
Filing date: 1992-03-24
Publication date: 1994-07-07
Anticipated expiration: 2019-08-18
Also published as: ATE202485T1; DE4110409A1; CA2101332A1; DE59209905D1; CA2101332C; EP0577648A1; ES2157900T3; US20030027773A1; GR3036634T3; EP0577648B1; DE4110409C2; WO1992017210A1; DK0577648T3; JP3556214B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】新しい蛋白質・ポリカチオン結合体本発明はポリカチオンに対するアフィニティーを有する化合物、特に核酸、をヒトまたは動物細胞に輸送するための新しい蛋白質・ポリカチオン結合体に関する。

近年、核酸は治療活性物質としての重要性を有するようになってきた。

アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡは、特定の遺伝子配列を選択的に阻害することを目的とする有効な試薬であることが分かった。これらの活性様式はこれらが生体内において特定の遺伝子（調節不能なオンコジーンまたはウィルス遺伝子等）を阻害する治療薬として使用されることを可能にした。既に、短いアンチセンス・オリゴヌクレオチドが細胞内に輸送され、核酸の強い負の電荷による細胞膜を介した取り込みの制限によりその細胞内濃度が低いにもかかわらず、それらが阻害活性を示すことが明らかにされた（Ｚａｍｅｃｎｉｋ等、１９８６）。

選択的に遺伝子を阻害する別の方法にはりボザイムの使用が含まれる。ここでも、細胞内への輸送が律速因子の一つであることから、細胞中の活性リボザイムの濃度を出来るかぎり高める必要がある。

治療を目的として使用の制限因子の一つである生細胞内への核酸の輸送を改善する多くの解決法が提案されている。

細胞内に阻害性核酸を輸送する問題を解決するための従来法の一つには、例えば、荷電リン酸ジエステル基を非電荷の基で置換する事による等、核酸の直接的修正が含まれる。直接的修正の別の方法にはヌクレオチド・アナログの使用が挙げられる。しかし、これらの提案には、標的分子への結合の減少、阻害効果の減少および毒性等の種々の欠点がある。

また、遺伝子治療における生細胞への核酸の導入に関する有効なシステムには特別の需要がある。ここでは、例えば遺伝的欠陥の場合、欠陥遺伝子を置換するために等、治療的に活性な遺伝子生産物の合成を生体内で行うために遺伝子を細胞内に閉じ込める。「古典的」遺伝子治療は単一の治療により長期間の救済を行うという原則にもとづいている。しかし、必要に応じて一回または反復して投与される医薬（「遺伝子治療薬」）として治療的に活性なりＮＡ　（またはＲＮＡ）を使用しうる治療法も必要である。遺伝子治療が期待される遺伝的病気には、血友病、アデノシン・デアミナーゼの遺伝的欠陥により引き起こされるベータ・サラサミアおよび［重度合併免疫疾患Ｊ　（ＳＣＩＤ）がある。その他の応用には、分泌型蛋白質抗原、または非分泌型蛋白質抗原をコードする機能性核酸の投与がワクチン化により体液性または細胞内免疫を達成する免疫調節がある。欠陥遺伝子をコードする核酸の投与が、例えば、個々に特定の必要条件に応じて仕立てられた形で与えられる遺伝的欠陥の例には、筋ジストロフィー（シストロフィン遺伝子）、ジスティック・フィブロシス（システィック・フィブロシス・コンダクタンス調節遺伝子）、ハイバーコレステローラミア（ＬＤＬレセプター遺伝子）がある。また、遺伝子治療法は、ホルモン、成長因子または細胞毒性または免疫調節効果を有する蛋白質が体内で合成される場合にも潜在的に非常に重要である。

これまで、遺伝子治療に核酸を利用する目的で発展してきた技術は、細胞内への遺伝子の転移にレトロウィルス・システムを利用している（ウィルソンＣ１１ｌｓｏｎ）等、１９９０、カシド（Ｋａｓｉｄ）等、１９９０）。しかし、レトロウィルスの使用は、少なくとも低い割合でウィルス感染（内在的ウィルスとの組み換え、および引き続く病原型への突然変異による）またはガンの発生等の副作用を起こすことがら当面の問題となっている。さらに、例えば、もし、副作用が起こるならば治療がより回復しがたい物にするかもしれないので、レトロウィルスにより行われる患者の体細胞のトランスホーメーションは、全ての場合に望ましいものではない。

さらに、細胞における非複製ＤＮＡの発現を可能にする別の方法が探究されてきた。

インビトロでの哺乳類細胞の遺伝的トランスホーメーションに関する種々の方法が従来から知られているが、それらのインビボにおける使用は制限されている（それらには、リポソームによるＤＮＡの導入、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＦ！ＡＲデキストランまたはリン酸カルシウム法が含まれる。）。

インビボにおける遺伝子転移に関する方法を開発するための最近の努力は、カチオン性脂質試薬すボフェクチンに集中している。この試薬によって注入されたプラスミドは、体内で発現しうろことが示された（ナベル（Ｎａｂｅｌ）等、１９９０）。

最近開発された別の方法は、ＤＮＡを吸着したタングステンまたは金の微粒子を使用しており、これを高エネルギーで細胞に衝突させる（ジョンストン（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ）。

１９９０、ヤング（Ｙａｎｇ）、　１９９０）。このＤＮＡの発現は種々の組織で示された。

標的の細胞にＤＮＡ輸送するためにインビボで使用しつる可能なシステムが肝細胞で開発され、このシステムは、肝細胞表面に提供されているレセプターが応答する糖蛋白質にポリリジンを結合させ、これにＤＮＡを添加して、細胞内に吸収させ、一度吸収されればＤＮＡの発現が可能となる可溶性糖蛋白質・ポリリジン・ＤＮＡ複合体を生成する原則に基づいている（つ（Ｗｕ）およびつ（Ｗｕ）、１９８７）。

このシステムは肝細胞に特異的であり、その機能は、アシアロ糖蛋白質・レセプターによる比較的良く分かった吸収メカニズムにより限定される。

広く応用可能で有効な輸送システムは、細胞内に核酸を輸送するのにトランスフェリン・ポリカチオン結合体を使用するトランスフェリン・レセプターを利用している。このシステムはヨーロッパ特許出願ＡＩ　３８８７５Ｂの主題である。

トランスフェリン・ポリカチオン／ＤＮＡ複合体は、種々の重合度のポリリジンおよびプロタミンを該複合体のブリカチオン成分として使用し、細胞内に効率的に吸収およびインターナライズされる。取り分け、このシステムを使用することにより、ｅｒｂＢ−オンコジーンを阻害するりポザイム遺伝子がニワトリのｅｒｂＢ−形質転換細胞に導入され、ｅｒｂＢ−阻害効果が示された。

本発明の目的は、高等真核細胞への核酸の選択的輸送を可能とするシステムの構築である。

意外にも、細胞表面蛋白質と結合する抗体は、それらがポリカチオンと結合体を形成するなら高等真核細胞への核酸の輸送に使用しうることが分かった。

感染の際にＨＩＶウィルスによって使用される細胞表面蛋白質ＣＤ４は、蛋白質部分がＣＤ４に対する抗体である蛋白質とポリカチオンの結合体と、輸送すべき核酸の複合体を形成させ、ついで、生成した蛋白質・ポリカチオン／ＤＮＡ複合体をＣＤ４発現細胞と接触させることにより、細胞内に核酸を輸送するのに使用しうる。

ある。（ＣＤ７は、胸腺細胞および成熟Ｔ−細胞上に検出される、まだ生理学的役割の分かっていない細胞表面蛋白質である。ＣＤ７は急性Ｔ−細胞白血病の信頼できるマーカーである（アルフｔ（Ａｒｕｆｆｏ）およびシード（Ｓｅｅｄ）、１９８７）　、　）。

ラットの膵臓ガン細胞の膜フラクションに対する抗体を含む抗体・ポリカチオン結合体に関して、その結合体と複合体を形成するＤＮＡをそのような細胞に導入し、その中で発現させたことが示された。

本発明の範囲において、種々の抗体成分を用いた抗体・ポリカチオン結合体を使用して、該抗体が指向する特定の表面抗原を発現する細胞内でＤＮＡのインターナリゼーションおよび発現を達成しうることが示された。

従って、本発明は、核酸と複合体を形成しうる新しい蛋白質・ポリカチオン結合体であって、該蛋白質成分が細胞表面蛋白質に結合しうる細胞表面蛋白質に対する抗体であり、その結果、形成される複合体がその細胞表面蛋白質を発現する細胞に吸収される結合体に関する。

以後標的細胞の細胞表面蛋白質に対する抗体を「抗体」と呼ぶ。

さらに、本発明は、抗体が指向する細胞表面抗原を発現する標的細胞に輸送すべき核酸と本発明の結合体との複合体である抗体・ポリカチオン／核酸複合体に関する。

本発明において、本発明に従う複合体の要素としてのＤＮＡが該抗体が指向する特定の抗原を発現する細胞に効率的に吸収、かつ、発現され、並びに、該細胞へのＤＮＡの取り込みは、結合体含量の増加とともに増加することが示された。

適当な抗体は、細胞表面抗原、例えば、Ｆａｂ’フラグメントに結合する細胞表面抗原に対する全ての抗体、特にモノクローナル抗体、またはそのフラグメントである（ペルチェン・マチユース（Ｐｅｌｃｈｅｎ−Ｍａｔｔｈｅｗｓ）等、１９８９）。

従来のモノクローナル抗体またはそのフラグメントの代わりに、重鎮および軽鎖のセグメントの組み合わせ、または重鎮自体のセグメントの組み合わせを含む抗体変異体またはその一部を使用することもできる。ポリメレース・チェーン・リアクションおよび大腸菌における発現を用いたクローニングによるこれらの「代替」抗体の調製法に関しては、簡単な報告がある（サストリー（Ｓａｓｔｒｙ）等、１９８９、オランジ（Ｏｒｌａｎｄｉ）等、１９８９、チョーダリー（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ）等、１９９０）　。特に、インビボ治療で長期間にわたりヒトの治療に使用する場合、免疫応答を避けるために、ヒューマナイズド抗体（例えば、コ（Ｃｏ）およびクイーン（Ｑｕｅｅｎ）、１９９１）またはヒト抗体が望ましい。遺伝子工学で生産したモノクローナル抗体および抗体変異体の探索は、ワルドマン（Ｗａｌｄｍａ曲）、１９９１によって提供されている。

ヒト白血球上の表面抗原に対する抗体は、チップ（Ｋｎａｐｐ）等、１９８９に報告されている。

抗体の選択は、特に標的細胞、例えば、ある細胞型に特異的または概ね特異的であり、従って、このタイプの細胞に核酸を導入しうる特定の表面抗原またはレセプターによって行われる。

本発明の結合体は、該結合体中に含まれる抗体が指向する表面抗原に依存して核酸で処理される細胞に関してより狭い、またはより広い選択性を許容し、治療的または遺伝子治療的に活性な核酸の柔軟な使用を可能にしている。

本発明の範囲において、該結合体成分は細胞に結合する抗体またはそのフラグメントを含み、その結果として、特にエンドサイト−シスにより結合体・ＤＮＡ複合体がインターナライズするか、もしくは抗体（フラグメント）の結合・インターナライジングが細胞膜要素との融合によって行われる。

本発明における抗体（抗体フラグメント）の適性に重要な事は、ａ）核酸を導入する特定の細胞によって認識され、かつポリカチオンと結合した時に結合能力が影響を受けないか、または実質的に影響を受けない事、およびｂ）この性質の範囲で、これらが使用する経路により核酸を背負って細胞中に輸送もしも、先のａ）およびｂ）の条件が満足されれば、理論的に表面抗原を指向するどの抗体も本発明の目的に使用しうる。これらには特定のタイプの細胞に特異的に発現される細胞表面タンパク質に対する抗体、例えば、本発明をＴ−細胞系列の細胞に応用する場合、この細胞に特徴的なＣＤ４またはＣＤ７抗原に対する抗体が含まれる。

本発明の目的に適した別の抗体は、本発明の範囲内で定義「細胞表面タンパク質」に則したレセプターに対する抗体である。レセプターの例には、トランスフニリン・レセプター、ヘバトサイト・アシアロ糖蛋白質レセプター、ホルモンまたは成長因子（インシュリン、ＥＧＦレセプター）に対するレセプター、ＴＦＭなどの細胞毒的に活性な物質に対するレセプターまたは、フィブロネクチンレセプターまたはビトロネクチンレセプター等の細胞外マトリクスに結合するレセプターがある。また、そのレセプターに結合するリガンドの能力が影響を受けないならば、細胞表面レセプターに対するリガンドを指向する抗体も適する。腫瘍細胞に関する指向的使用には、問題の腫瘍細胞に発現されている特異的細胞表面タンパク質、いわゆる腫瘍マーカーに対する抗体が特に適している。

本発明に適しているポリカチオンには、例えば、ポリリジン、ポリアルギニスボリオルニチン等の均一なポリカチオン、または２つ以上の異なる正電荷アミノ酸を有するポリカチオンであって、種々の鎖長の不均一なポリカチオン、およびポリエチレンイミン等のペプチド合成ポリカチオンが含まれる。その他の適当なポリカチオンには、ヒストンまたはプロタミン等の天然のポリカチオン性ＤＮＡ結合タンパク質、またはそのアナログ、またはそのフラグメントがある。

ポリカチオンのサイズは重要ではない。ポリリジンの場合、正電荷の総計が約２０乃至１０００であり、かつ、輸送される特定の核酸に匹敵することが望ましい。所定の長さの核酸に対するポリカチオンの長さは重要ではない。例えば、もしＤＮＡが６０００塩基で１２．０００の負電荷を有している場合、ポリカチオンの量は、例えば６゜１１１０１ノポリリシン２００、ま７’＝　Ｇ；ｔ３０ｍｏ　Ｉ（７）ポリリシン４００．またＧｔ　１２０＋ｎｏ＋　（７）ポリリジン１００等である。また、平均的熟練者は、容易に行える所定の実験によりポリカチオンサイズおよびモル量の別の組み合わせを選択することが出来る。

本発明の抗体・ポリカチオン結合体はペプチドのカップリングに関する従来法を用いて化学的に調製しうるし、また、必要ならば各成分をリンカ−物質（もしもメルカプト基またはアルコール基等のカップリングに適した官能基が無いならばこの手段が必要となる）とのカップリング反応の前に提供しつる。リンカ−物質は、先ず各成分の官能基と反応し、その後修飾された各成分がカップリングする。

結合体の望ましい性質、特に安定性に関する性質に依存して、カップリングはａ）還元条件下で再び切断しつるジスルフィド結合（例えば、スクシンイミジル・ピリジルジチオプロピオネート（ジャンク（Ｊｕｎｇ）等、１９８１）、ｂ）生物学的条件下で非常に安定な化合物の使用（例えば第２の成分に結合したリンカ −のスルフィドリル基とマレイミド・リンカ−を反応させることによるチオまたはアセタール結合またはケタール結合、以上ａ）乃至Ｃ）のいずれかにより行いうる。

先に述べたように遺伝子工学で生産した抗体を使用する時、組み換え法により本発明に従う結合体を調製することも可能であり、この事は正確に定義された均一の化合物を入手しつるという利点を有している一方、化学的結合は分離しなければならない結合体の混合物を与える。

本発明の結合体の組み換え的調製は、キメラポリペプチドの調製法として知られている方法で行いうる。ポリカチオン性ペプチドのサイズおよびアミノ酸配列は変化しつる。また、遺伝子工学による生産は、例えば細胞表面タンパク質への結合能を増加すること、適当な突然変異、または細胞表面タンパク質への結合を担う分子の一部分に短縮された抗体成分を使用することにより結合体の抗体部分を修正しうる利点を有する。特に、抗体成分をコードする配列を含むベクター、およびポリカチオン性ペプチドをコードする所望される配列を挿入するポリリンカーを使用する事が本発明の結合体の組み換え的生産に適している。この様にして一組の発現プラスミドが得られ、この中から本発明の結合体の発現に必要なものを選択しうる。

もし抗体が適当な炭水化物鎖を含んでいるなら、これらの１つ以上の炭水化物鎖を介して抗体をポリカチオンに結合しつる。この種の結合体は、従来のカップリング法で調製した結合体よりも使用されるリンカ−物質に由来する修飾を含まないという利点を有する。糖蛋白質・ポリカチオン結合体の適当な調製方法は、ドイツ特許出願Ｐ　４１１５０３８．４に公開されており、ワグナ−（Ｗａｇｎｅｒ）等、１９９１に簡潔に報告されている。

ポリカチオンに対する抗体のモル比は、凝集物が生成することを頭に入れておく必要があるが１０　：　１乃至１：１０が望ましい。しかし、核酸の複合体化が起こる条件であり、形成された複合体が細胞表面タンパク質に結合し、細胞内に輸送されることが確認されるならば必要に応じてこのモル比の範囲を拡げることも可能である。この事は、例えば細胞表面抗原を発現する細胞系列を本発明の複合体と接触させ、ついで、例えばサザンプロット分析、放射能ラベルした相補的核酸分子によるハイブリダイゼーション、ＰＣＲ増幅、またはレポーター遺伝子の遺伝子産物の検出により細胞中の核酸または遺伝子産物の存在を検定することにより個々のケースで行われる簡単なテストでチェックしうる。

特定の用途、特に適当な抗体を発見するためのスクリーニングに対しては、抗体をポリカチオンに直接結合させない方が望ましい。効率的な化学的カップリングには原料の抗体を大量（１ｍｇ以上）に使用する事が一般的であり、さらに、カップリングが場合によっては抗体の結合ドメインを不活性化することもあり得る。

この問題を回避し適当な抗体を迅速にスクリーニングするためには、先ず、プロティンＡのＦ、結合ドメインにより、細胞のトランスフェクション直前に、続いて抗体を結合させるプロティンＡポリカチオンであって、場合によっては既に核酸と複合体を形成させたプロティンＡ・ポリカチオンを調製する（スロリア（Ｓｕｒｏｌ　ｉａ）等、１９８２）。プロティンＡ結合体との核酸複合体は、処理した特定の細胞への核酸輸送の適性に関する抗体の迅速なテストを可能にする。

関連するポリカチオンとプロティン八とのカップリングは、抗体への直接的カップリングと同様に行う。プロティンＡ・抗体・ポリカチオン結合体を使用するとき、先ず、過剰の抗体から細胞を開放するために抗体で処理する細胞をインキュベートし、次いでプロティンＡ・ポリカチオン・核酸複合体で処理することが望ましい。場合によっては、抗体に対するアフィニティーを増加させるためにプロティンＡを例えば大量のプロティンＧで修飾する。

細胞に輸送する核酸はＩＮＮ八でもＲＮ八でも良く、ヌクレオチド配列に制限はない。

修正が核酸のポリカチオン性に影響しないならば核酸の修正が可能である。これらの修飾には、例えばホスホジエステル基のホスホロチオエートによる置換、またはヌクレオチドアナログの使用などがある。このような修正は当分野では一般的なものである。代表的様式で修正された核酸および一般に核酸アナログと呼ばれる核酸およびそれらの作用の原則はシン（ＺＯｎ）（１９８８）に報告されている。

また、核酸のサイズに関しても本発明は広い範囲を許容している。もし、抗体− ポリカチオン・核酸複合体が細胞内に輸送されることが保証されるならば本発明の結合体の理論的な上限は無い。下限は、例えば、約ｌＯヌクレオチド以下のアンチセンスオリゴヌクレオチドは特異性が低いことから使用できない事など、特定の用途に特異的な理由から提示される。本発明の結合体を用いてプラスミドも細胞内に輸送しうる。例えば、場合によってはタンデムでのアンチセンス的用途に使用する小さい核酸も細胞内で転写される大きい遺伝子構築物の統合要素として使用しうる。

また、本発明の結合体により同時に異なる核酸を細胞に輸送しうる。

阻害効果を有する核酸の例は、先に述べたアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはウィルス複製に重要な遺伝子断片への相補性によるウィルス阻害効果を有するリボザイムがある。相補性による阻害効果を有する本発明の抗体・ポリカチオン・核酸複合体の望ましい核酸成分は、アンチセンスＤＮＡ　、アンチセンスＲＮＡまたはりボザイムまたはこれらをコードする遺伝子である。リポザイムおよびアンチセンス的用途を用いる時は、場合によってはキャリヤー遺伝子と共にこれらをコードする遺伝子を使用する事が望ましい。ＲＮＡ自身を導入するよりも遺伝子を細胞に導入する方がかなりの該ＲＮＡの増殖をもたらし、結果的に目的の生物学的反応の阻害に十分な供給が保証される。特に適したキャリヤー遺伝子は、ポリメラーゼＩＩ＋による転写に必要な転写単位、例えばｔＲＮＡ遺伝子である。例えば、リボゾーム遺伝子をその中に挿入すると転写が行われたとき、リボザイムがコンパクトなポリメラーゼＩ１１転写物の一部となっている。ポリメラーゼＩＩ＋によって転写されるリボゾーム遺伝子およびキャリヤー遺伝子を含む適当な遺伝子単位はヨーロッパ特許出願Ａｔ　０３８７７７５に公開されている。本発明の輸送システムは、細胞中での該遺伝子の初期濃度の増加を保証することでこの遺伝子単位の効果を増強しつる。

原則として、その阻害がウィルス複製および発現の阻害を引き起こすＨＩＶ遺伝子の全ての配列は、ＡＩＤＳの治療に使用しつる相補的アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはりボザイムまたはこれらをコードする遺伝子を構築するための目標配列に適している。最も重要な目標配列は、調節機能を有する配列、特にｔｘｔ−１ｒｅｖ−またはｎｅｆ−遺伝子である。他の適当な配列には、開始、ポリアゾニレ−ジョン、ＬＴＲ配列のスプライシング側ＲＮＡプライマー結合部位（ＰＢＳ　）またはｔａｒ−配列がある。

ウィルス遺伝子への相補性の結果として阻害する核酸分子とは別に、例えば、所謂トランスドミナント突然変異を含むウィルスタンパク質をコードする遺伝子等別のメカニズムの活性を有する遺伝子を使用することも出来る。細胞中での該遺伝し産物の発現が、その機能により対応する野生型のウィルスタンパク質を抑制するタンパク質を生じ、その結果後者はウィルス複製に対する通常の機能を遂行できず、ウィルスの増殖が効率的に阻害される。基本的に、例えばＨＩＶ複製に関する阻害効果を有することが示されているｇａｇ−１ｔａｔ−およびｒｅｖ− 変異体等（トロバＴｏｒｏｎｏ）等、１９８９、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）等、１９８９、マリム（１＋ｌａｌｉｍ）等、１９８９）、復製および発現に必要なウィルスタンパク質のトランスドミナント変異体が適している。

治療的に活性な核酸の別の例にはオンコジーンへの阻害効果を有するものがある。

また、本発明に従い、例えば、ＣＤ４＋細胞、より特定するとＴ−細胞およびそれによるＴ−細胞の生存率の増加等、その発現産物が目標細胞へのシグナル・トランスミッ７ョンの正の効果を与えるためのシグナルの伝達に関する機能を遂行する遺伝子またはその断片を細胞に輸送することも可能である。

理論的に細胞表面タンパク質を発現し、細胞中で治療的、または遺伝子治療的効果を有する全ての遺伝子または遺伝子断片が本発明の目的に適している。

遺伝子治療に使用でき、かつ、本発明により細胞中に導入しつる遺伝子の例には、因子Ｖｌｌｌ　（例えば、ウッド（Ｗｏｏｄ）等、１９８４）　、因子ＩＸ　（血友病で使用される。

例えばクラチ（Ｋｕｒａｃｈｉ）およびデビー（Ｄａｖｉｅ）　、１９８２）　、アデノシン・デアミナーゼ（ＳＣＩＤ、例えばバレリオ（Ｖａｌｅｒｉｏ）等、１９８４）　、ａ−１−アンチトリプシン（肺気腫、例えばシリベルト（Ｃｉｌ　１ｂｅｒｔｏ）等、１９８５）または「嚢胞性線維症トランスメンブレン調節遺伝子」　（リョウダン（Ｒｉｏｒｄａｎ）等、１９８９）がある。これらの例はいかなる制限も構成していない。

結合体に対する核酸の比は広い範囲で変化でき、核酸の全ての電荷を中和する必要は必ずしもない。この比は輸送される核酸のサイズおよび構造、ポリカチオンのサイズ、その電荷の数および分布などの基準に従い個々の場合で調節しなければならず、その結果、特定の用途に関して核酸の輸送性と生物学的活性との間で好ましい比が存在する。最初にこの比は、おそらくゲル中（例えばアガロースゲルにおける移動度シフト）または密度勾配遠心におけるＤＮＡの移動速度の遅延などにより調節しつる。この予備的比をめた後、細胞における核酸の最大使用活性を得、かつ、おそらく、残存する核酸の負電荷が細胞への輸送を妨害しないように結合体部分を減少する観点から放射能ラベルした複合体を用いたテストを行うことが望ましい。

抗体・ポリカチオン・核酸複合体の調製は、とりわけ、ポリイオン性化合物の複合体化に関する従来法で行いうる。制御不可能な凝集または沈殿を避ける１つの可能な方法には、高い希釈率（≦１００μｇ）で両成分を混合する事が含まれる。

エンドサイト−シスにより高等真核生物に吸収されうる抗体・ポリカチオン・核酸複合体は、さらに、結合体によって達成される核酸のインターナリゼーションおよび／または発現を増加する目的で結合体中のポリカチオンと同じ非共有結合型の１つ以上のポリカチオンを含みうる。

未公開の国際特許出願Ｎｏ、　９２１００２１７の主題であるこれらの手段を用いることにより、少なくとも同等のトランスフェクション・発現効率を達成するための細胞に輸送される核酸の量に基づく抗体・ポリカチオン結合体の必要量はより少なくて済み、この事は合成の経費がより少ないことを意味している。また、複合体において大量の抗体分子により占有され、結果として、それらがもはや他の複合体に対して使用不能となる、いくつかの隣接する「ドツキング部位」を有する効果を避けたいときには、結合体が少量であることは望ましい。複合体中に含まれる抗体量を必要最小限に制限すること、即ち、結合体量を出来るかぎり少なく維持し、かつ、それを遊離のポリカチオンで希釈することは、処理する標的細胞上の細胞表面タンパク質の数が少ないときは特に都合がよい。

このような手段を用いることにより、特に効率的ではなかった結合体の性能が実質的に増加し、かつ、既に高い効率を示す結合体の性能をさらに増加することが出来る。

本発明の複合体の定性的組成に関しては、一般的に先ず、細胞に輸送される核酸および抗体が決定される。核酸は基本的に細胞中で達成される生物学的効果、例えば、阻害または欠陥遺伝子を置換する目的で発現される（遺伝子治療に使用する時）遺伝子または遺伝子断片の標的配列により限定される。場合によっては、特定の用途に関する安定性の必要等から核酸は修正されつる。核酸および抗体の決定から始まり、核酸のサイズが特に負電荷の実質的中和に関して重要であることからこれらのパラメーターにポリカチオンが対応付けられる。

複合体中に含まれつる非共有結合ポリカチオンを選択する時、これらの物質の付加が結合体のみの場合に比べて核酸のインターナリゼーション・発現の増加をもたらすことは重要なことである。

定性的組成と同様に複合体の定量的組成も、例えば、核酸を濃縮する必要性およびその程度、複合体全体の電荷、特定の細胞に対する結合能およびインターナライジング能の程度およびその能力を増加する必要性の程度等、機能的に互いに関連する多くの基準により決定される。複合体の組成に関する他のパラメーターには、重要な因子は抗体が細胞と相対的な複合体内に存在する様式であることから細胞表面タンパク質に対する抗体の接近可能性が挙げられる。別の重要な性質は、所定の機能を行うための細胞内における核酸の接近可能性である。

複合体内に非共有結合的に含まれるポリカチオンは、結合体中に含まれる物と同じでも異なっていても良い。これらを選択する為の基本的基準は、特に凝縮に関する核酸のサイズである。小さい核酸分子の場合は一般に凝縮する必要がない。

結合体中に含まれるポリカチオンに特に配慮されるので性質や量に関するポリカチオンの選択も結合体に従って行われる。例えば、もし、ポリカチオンがＤＮＡ凝縮する能力を全くまたは少ししか持たないなら、複合体の効率的なインターナライジングを行う目的にはこの性質がより大きいポリカチオンを使用することが望ましい。もし、結合体中に含まれるポリカチオンがそれ自身核酸を凝縮する物質であり、かつ、もし効率的なインターナライジングのための核酸の適当な凝縮が達成されるならば、他のメカニズムで発現の増加をもたらすポリカチオンを使用することが望ましい。

場合によっては、複合体中に含まれうる非共有結合ポリカチオンにとって重要なことは、核酸を凝縮する能力、および／または細胞中での不都合な分解から核酸を保護する能力である。さらに、本発明はヒトまたは動物細胞に核酸を導入する方法に関し、その方法では生理学的条件下で可溶性の抗体・ポリカチオン・核酸複合体を細胞に接触させることが望ましい。

本発明の範囲において使用したＤＮＡ成分はレポーター遺伝子としてのルシフェラーゼ遺伝子である（レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を使用したトランスフェリン・ポリカチオン・ＤＮＡ複合体を用いた予備実験の結果に基づき、ルシフェラーゼ遺伝子の取り込み効率は他の核酸の有用性の指標となり、かつ、定量的には使用した核酸がタンパク質・ポリカチオン・ＤＮＡ複合体の使用に関する制限因子ではない事が示された。

本発明の特定の態様に対しては、細胞中の核酸の分解が阻害される条件を作ることが有効である。

核酸の分解が阻害される条件は、いわゆるリソツマトロピック物質の添加で提供される。これらの物質はリゾソーム中のプロテアーゼおよびヌクレアーゼの活性を阻害し、核酸の分解を防ぎうることが知られている（ラスマン（Ｌｕｔｔ＋ｍａｎｎ）およびマグヌソン（Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ）　、１９８３）　。

これらの物質にはクロロキン、モネンシン、ニゲリシン、塩化アンモニウムおよびメチルアミンが含まれる。

本発明の範囲においてリソツマトロピック物質の群から選択される物質を使用する必要性は特に処理する細胞のタイプに依存し、また、種々の抗体を使用する場合は複合体を細胞に吸収させる種々のメカニズムに依存する。従って、例えば本発明の範囲において種々の抗体（モノクローナル抗ＣＤ４抗体）を使用した場合の細胞へのＤＮＡの取り込みはクロロキンにより様々な影響を受けることが分かった。

どの様な場合にも予備実験により本発明の物質の必要性または適性をテストする必要がある。

さらに、本発明は抗体・ポリカチオン結合体と複合体を形成した１つ以上の治療的または遺伝子治療的に活性な核酸を活性成分として含む医薬組成物に関する（抗体・ポリカチオン結合体と核酸は別々に存在し、治療直前に複合体を形成させることもできる）。例えば、食塩水、リン酸緩衝液等本発明の組成物が必要とされる溶解特性を有する全ての医薬的に許容されるキャリヤーも使用しうる。成形に関してはレミントン医薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’　ｓ　Ｐｈａｒｍｃｅｕｔｊｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ、　１９８０）を参照せよ。

治療的に活性な核酸の例にはこれまで述べてきたアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはりポザイム、またはこれらをコードする遺伝子、または特定の標的細胞中に含まれる内在性または外来性遺伝子または遺伝子産物に関する阻害効果を有するトランスシミナンド変異体をコードする遺伝子が含まれる。これらには例えば配列特異性により（トランスドミナント変異体をコードする標的配列に相補的な（ヘルスコウィッッ（Ｈｅｒｓｋｏｗｉ　ｔｚ）、　１９８７）　ＨＩＶにたいして細胞内免疫をもたらしくバルチモア（ＢａｌｔｉｌＩＩＯｒｅ）、　１９８８）　ＡＩＤＳ治療や感染後のウィルスの活性化の予防に使用しつる遺伝子が含まれる。

この医薬製剤はヒトまたは動物体内の、例えばＨｆｆまたは関連するレトロウィルスなどのウィルス配列の阻害に使用しつる。関連レトロウィルスの阻害による治療的用途の例は、ＨＴＬＶ−１ウイルスによって起こる増殖性Ｔ−細胞白血病の治療である。

また、ウィルス性Ｔ−細胞白血病の治療に加えて、本発明は非ウィルス性白血病の治療にも使用しうる。最近、リンパ性白血病の発病におけるオンコジーンの関連が示されてきた（ａｂｌ、　ｂｃｒ、　Ｈａｑ　Ｋｉ、　ｒａｓ、　ｃ−ｍｙｃ、　Ｎ−ｍｙｃ）。観察される特異的染色体トランスロケーションに基づき、その他のオンコジーンも存在すると考えられている。これらのオンコジーンのクローニングはオンコジーン阻害核酸の構築および本発明の治療的用途の拡大の基礎を与える。

他の重要な用途は遺伝子治療である。理論的に本発明による遺伝子治療では、例えば遺伝的に起こる欠陥の置換または免疫応答の刺激により、その発現が導入された細胞内で治療効果を上げる全ての遺伝子またはその断片を使用することが出来る。

治療的用途で使用する医薬製剤は静脈注射などにより全身的に投与しつる。標的組織には肺、膵臓、骨髄および腫瘍などがある。

局所的使用の例には、肺（注入用の本発明の医薬製剤または吸入用のエアロゾルの使用）、筋肉組織、腫瘍または肝臓への直接的注射、または消化器管またはする体外治療にも使用できる（例えば、ボンダー（Ｐｏｎｄｅｒ）等、１９９１）。

（図面の簡単な説明）第１図：　ＣＤ４”″−ＣＩＯ細胞への抗ＣＤ４−ポリリジン／ｐＲ８Ｖｓ複合体の導入。

第２図：　ＣＤ４“−ＣＩＯ細胞への抗ＣＤ４−ポリリジン／ｐＲ３Ｖｓ複合体の輸送。

第３図、第４図：抗ＣＤ７−ボリリジン１９０結合体によるＨ９細胞におけるＤＮＡの転移および発現。

第５図：　ｍＡｂｌ、　ＩＡＳＭＬ−ポリリジン１９０結合体による膵臓癌細胞へのＤＮＡの転移。

第６図：抗体プロティンＡ−ポリリジン結合体によるＣＤ４＋細胞へのＤＮＡの転移。

第７図：抗体Ａ／Ｇ−ポリリジン結合体によるに５６２細胞へのＤＮＡの転移。

本発明を以下の実施例で説明する。

実施例１抗ＣＤ４−ポリリジン９０結合体の調製カップリングは文献で知られている方法と同様にスクシンイミジル−ピリジルジチオプロピオネート（ＳＰＤＰ、ジャンク（Ｊｕｎｇ）等、１９８１）による修飾後のジスルフィド結合の導入により行った。

５０蘭リン酸ナトリウムバツフｙ　（ｐｌ（７，８）中１．７ｍｇの抗ＣＤ４抗体（ＯＫＴ４Ａ　。

オルト・ダイアグノスチック・システムズ）の溶液を１１μｌの１０ｄｄＳＰＤＰ　（ファルマシア）エタノール溶液と混合した。　室温１時間後、混合物をセファデックスＧ２５ゲルカラムで濾過しく溶出液１００　ｍＭ　ＨＥＰＥＳバッフｙ　ｐｌ（７，３）　、７５ｎｍｏｌのピリジルジチオプロピオネート基で修飾された抗ＣＤ４　１．４＋ｎｇを得た。同様にポリ化）リジン９０（平均重合度９０リジン残基（シグマ）　、ＦＩＴＣによる蛍光ラベル）を５ＰＤＰで修飾し、ジチオスレイトールによる処理およびゲル濾過により遊離したメルカプト基で修飾された形にした。０．５ｍｌの２０ｍＭ酢酸バッファ中１２０　ｎｍｏｌのメルカプト基で修飾された３８ｎｍｏ　ｌのポリリジン溶液を酸素を排除して上述の修飾した抗ＣＤ４と混合し、室温に一晩放置した。この結合体をゲル・パーミェーション・クロマトグラフィー（スパロースＩ２．５００鴫酸グアニジン、ｐＨ７，３）で単離した。２５ｄｌ　ＨＥＰＥＳ　（ｐ）１７．３　）に対する透析後、１１　ｎｍｏ　ｌのポリリジン９０で修飾された１、１ｎｇの抗ＣＤ４抗体を含む結合体が得られた。

実施例２抗ＣＤ４−ポリリジン１９０結合体の調製０、３ｍｌの５０＋ｎＭ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，８）中、１．０　ｍｇ　（６，２５ｎｍｏｌ）の抗ＣＤ４抗体（ＯＫＴ４Ａ　。

オルト・ダイアグノスチック・システムズ）溶液を３７μｌの１−　スクシンイミジル・ピリジルジチオ・プロピオネート（ＳＰＤＰ、ファルマシア）エタノール溶液と混合した。室温１時間後、混合物をセファデックス０２５カラム（溶出液ｉｏｏ　ｍＭＨ［！Ｐ［！Ｓ／　＜ッファ、ｐＨ７，３）で濾過し、３０ｎｍｏ　Ｉのピリジルジチオプロピオネート基で修飾された抗ＣＤ４抗体Ｑ、８５ｍｇ　（５，３ｎｍｏｌ　）を得た。同様にポリ（Ｌ）リジン１９０（平均重合度１９０リジン残基（シグマ）　、ＦＩＴＣで蛍光ラベル）を５ＰＤＰで修飾し、ジチオスレイトールにより処理およびゲル濾過により遊離したメルカプト基で修飾した形とした。０．１３ｍ１の３〇−酢酸ナトリウムバッファ中、２５ｎｍｏｌのメルカプト基で修飾された７、　７ｎｍｏｌのポリリジン１９０の溶液を酸素を排除して上述の修飾された抗ＣＤ４　（０，５ｍｌの３００　ｏ＃　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７，９中）と混合し、室温で一晩放置した。

この反応混合物に５　Ｍ　ＮａＣｌを添加して約０．６Ｍとした。結合体はイオン交換クロマトグラフィーで単離した（Ｍｏｎｏ　Ｓ、ファルマシア、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐ）１７．３、塩濃度勾配０．６Ｍから３　Ｍ　ＮａＣｌ　）　、　１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７，３）に対する透析後、３．９ｎｍｏｌのポリリジン１９０で修飾された抗ＣＤ４抗体０．３５ｍｇ（２，２ｒ＋ｎ＋ｏｌ）を含む目的の結合体が得られた。

実施例３抗ＣＤ７−ボリリジン１９０結合体の調製５０　ｍ　）ＩＥＰＥＳ（ｐＨ７，９）中、１．３ｍｇの抗ＣＤ？抗体（イムノチク社）溶液を４９μｍのｌｎＭｓＰＤＰ（ファルマンア）エタノール溶液と混合した。室温、１時間後、混合物をセファデックス０２５カラム（溶出液５０ｍＭ　ＨＥｐＨｔＳバッファｐＨ７，９）で濾過し、３３ｍ＋＋ｏｌのピリジルジチオプロピオネート基で修飾された抗ＣＤ７抗体１．１９ｍｇ（７，５ｎｍｏｌ）を得た。同様にＦＩＴＣで蛍光ラベルしたポリ（Ｌ）リジン１９０を５ＰＤＰで修飾し、ジチオスレイトールによる処理およびゲル濾過で遊離したメルカプト基で修飾された形とした。

０．２ｍｌの３〇−酢酸ナトリウムバッファ中、３５ｎｍｏｌのメルカプト基で修飾されたｌｌｎｍｏｌのポリリジン１９０の溶液を酸素を排除して上述の修飾された抗ＣＤ？（０，５ｍｌの３００１１＃　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７，９中）と混合し、室温で一晩放置した。この反応混合物に５ＭのＮａＣｌを添加して約０．６Ｍに調整した。イオン交換クロマトグラフィーにより（Ｍｏｎｏ　Ｓ、ファルマシア、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７，３、塩濃度勾配０．６Ｍから３１４）単離した。ＩＭ　ＥＩＥＰＥＳ　ｐＨ７，３に対する透析後、６．２ｎｍｏｌのポリリジン１９０で修飾された０、　５１ｍｇ　（３，２ｎｍｏｌ　）の抗ＣＤ？抗体を含む目的の結合体を得た。

実施例４ｍＡｂｌ、　ＩＡｓＭＬ−ポリリジン１９０結合体の調製本実施例では結合体の調製に鯖吐ＩＡＳＭＬと命名されたラット膵臓ガン細胞系列ＢＳｐ７３ＡＳＭＬの膜タンパク質調製物に対するモノクローナル抗体（マヅク（Ｍａｔｚｋｕ）等、１９８３）を使用した。０．５ｍｌの５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７，９中、２．０ｍｇの鯖吐ＩＡＳＭＬ溶液を７５μｌの１蘭５ＰＤＰ（ファルマシア）エタノール溶液と混合した。室温、１時間後、この混合物をセファデックスＧ２５カラムで濾過しく溶出液５０ｍＭ　Ｈ［！Ｐ［！Ｓバッフｙ　ｐＨ７，９）　、３９ｎｍｏｌのピリジルジチオプロピオネート基で修飾されたｍＡｂｌ、　ＩＡＳＭＬ　１．３ｍｇ　（８ｎｍｏｌ）を得た。ＦＩＴＣで蛍光ラベルしたポリ（Ｉ、）リジン１９０を同様に５ＰＤＰて修飾し、ジチオスレイトール処理およびゲル濾過により遊離のメルカプト基で修飾された形にした。２１０μｍの３０酬酢酸ナトリウムバツフア中、３７ｒｕｏｏｌのメルカプト基で修飾された１２ｎｍｏｌのポリリジン１９０の溶液を酸素を排除して上述の修飾された鯖比ＩＡＳＭＬ　（０，９ｍｌの１００　ｍ　ＨＥＰＥＳ　ｐｌ（７，９中）と混合し、室温で一晩放置した。この反応混合物に５　Ｍ　ＮａＣ１を添加することで約０．６Ｍに調整した。結合体はイオン交換クロマトグラフィー（Ｍｏｎｏ　Ｓ、ファルマシア、５０＋ｎＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７，３、食塩濃度勾配０．６Ｍから３Ｍ）で単離した。分画および２０蘭ＨＥＰＥＳ　ｐ）１７．３に対する透析後、０．４５ｒｕｅｏ＋のポリリジン１９０で修飾された０、　１６ｍｇ　（ｌｒｕｏｏｌ　）を含む結合体フラクションＡが得られ、また０、９ｒｕｏｏｌのポリリジンで修飾された０、　２３ｍｇ（１４μｗｒ　ｌ　）のｍＡｂｌ、　ＩＡＳＭＬ　（フラクションＢ）または３．９ｎａｏｌのポリリジン１９０で修飾された０、９２ｍｇ　（５，８ｒｕｎｏｌ　）のＩ＆Ａｂ１．　ＩＡＳＭＬ　（フラクションＣ）も得られた。

実施例５プロティンＡ−ポリリジン１９０結合体の調製０．５ｍｌの１００　ｔｒＭ　Ｈ［！ＰＥＳ　ｐ）１７．９中、４．５μｇのプロティンＡ（ピアス、Ｎｏ、２１１８２、＋０７　ｎ５ｏｌ）溶液を３０μｌの１０ｍＭ　５ＰＤＰエタノール溶液と混合した。室温２時間後、反応液をセファデックスＧ２５カラムで濾過しく溶出液５０ｍＭ　ＨＥＰ［！Ｓバッファ　ｐＨ７，９）、２４５　ｎｍｏｌのピリジルジチオプロピオネート基で修飾された３、９５ｍｇ　（９４μｍｏｌ）のプロティンＡが得られた。ＦＩＴＣで蛍光ラベルしたポリ（Ｌ）リジン１９０を同様に５ＰＤＰで修飾し、ジチオスレイトール処理およびゲル濾過により遊離のメルカプト基で修飾された形にした。０，８ｍｌの３０ｍ１Ｊ　酢酸ナトリウムバッファ中、１５０　ｎｍｏｌのメルカプト基で修飾された５３ｒ＋＋＋＋ｏｌのポリリジン１９０溶液を酸素を排除して上述の修飾されたプロティンＡと混合し、この反応混合物に５ＭのＮａＣｌを添加することで約０．６Ｍに調整した。

結合体はイオン交換クロマトグラフィー（Ｍｏｎｏ　Ｓ、ファルマシア、５０ｍＭ　１（ＥＰＥＳ　ｐｉ（７，３、塩濃度勾配０．６勤１ら３Ｍ）で単離した。

分画および２５＋ｎｌＪ　ＨＥＰ［！Ｓ　ｐ）１７．３に対する透析後、各々５　ｎｍｏｌポリリジン１９０で修飾された１、　１５ｗ　（２７μｍｏ１）のプロティンＡおよび４０ｒ＋ｍｏｌのポリリジン１９０で修飾された２、　６　ｍｇ　（６，２ｎｍｏｌ）のプロティンＡを含む２つの結合体フラグメントＡおよびＢが得られた。

実施例６抗体・ポリカチオン結合体とＤＮＡとの複合体の調製複合体はＤＮＡの希釈溶液（１５０ｍｌＪ　ＮａＣｌ、　２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７，３中３０μｇ／ｍ１以下）を実施例１，２および４　（１００μｇ　７ｍｌ以下）で得られた抗体・ポリリジン結合体と混合することで調製した。使用したＤＮＡはＴｒｉ　ｔｏｎ−Ｘ分解標準法（マニアラス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）　、１９８２）およびＣｓＣｌ／ＥｔＢｒ平衡密度勾配遠心、ブタノール−１による脱色オヨび１０ｍＭ　ｌ−！Ｊ　Ｘ／ＨＣＩ　ｐＨ７，５、ｌ　ｍ　ＥＤＴＡ　ｉ：対する透析テｉｉｔ製しりｐＲ３ＶＬブラスミ’ＦＤＮＡである（ドウウェット（Ｄｅ　Ｗｅｔ）等、１９８７）。ＤＮＡ複合体の沈殿を防ぐために、無リン酸バッファを使用した（リン酸は結合体の溶解度を低下する）。

実施例７抗ＣＤ４・ポリリジン９０結合体によるＣＤ４”　ＣＨＯ−細胞へのＤＮＡの転移および発現本実施例および以下の実施例では、遺伝子転移および発現を調べるためにレポーター遺伝子としてフォチナス・ビラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ　ｐｙｒａｌｉｓ）のルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを使用した。実験結果を示す図では、ルシフェラーゼ活性を示す値が全細胞試料の活性と関係付けられる。

ＣＤ４　”　ＣＨＯ−細胞（ラスキー（Ｌａｓｋｙ）等、１９８７）をｌＯ％ＦＣＳ　（ウシ胎児血清）を含むハムズＦ−１２培地（ハム（Ｈａｍ）　、１９６５）のＴ−２５バイアル当たり５　ＸＩＯ’個の割合で植種した。１８時間後、細胞を血清を含まないハムズＦ−１２培地を洗浄し、この培地中（５ｍｌ）　３７℃で５時間インキュベーションした。

抗ＣＤ４・ポリリジン／　Ｉ）Ｒ８ＶＳ複合体は、実施例６で述べたように最終濃度１５０ｖＭ　ＮａＣ１，２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７，５５００μＩあたり１０／ｌＺｇの［ｌＮＡとなるよう調製した。抗ＣＤ４　ポリリジン１９０　（８，４μｍｏｌポリリジン１９０／■抗ＣＤ４　）　は特定された質量比で使用した（抗ＣＤ４の質量で表して１．９乃至８．１）。サンプルｌ乃至４では、複合体は１００μＭのクロロキンを含む無血清ハムズＦ−１２培地中の細胞に添加した。

サンプル５および６ではクロロキンを省いた。４時間のインキュベーション後、細胞をｌＯ％ＦＣ３を含む培地を２回洗浄し、この培地中でインキュベーションした。

サンプル５および６では、等容量の血清含有培地を細胞に添加した。２０時間後、全ての細胞を新鮮な血清含有培地で洗浄し、４８時間後に収穫した。抽出物の一部（同量のタンパク質に対応する各サンプルの約１１５）のルシフェラーゼ活性を検定した（ドウウェット（Ｄｅ　Ｗｅｔ）等、１９８７）。クリニルメート（バーシールド、ワイルドバック、ＦＲＧ　）を用いて生物発光を測定した。この実験の結果は第１図に示す。本発明の結合体によりＤＮＡがＣＤ４＋細胞に輸送され、輸送されたＤＮＡが発現しており、またＤＮＡの輸送効率は抗ＣＤ４／ポリリジン１９０リジン含量に比例することか分かった。

実施例８抗ＣＤ４−ポリリジン１９０結合体によるＣＤ４”　Ｃ１（０細胞へのＤＮＡの転移および発現先ず、ＣＤ４’　ＣＨＯ細胞を実施例７て述べたように培養した。第２図に示したようニＩＯμｇ　（７）Ｉ）Ｒ５ＶＬ　、および、２：１また＋；！３：１（７）過剰量抗ＣＤ４−ポリリジン９０を含む実施例６で示したように調製した結合体／　ＤＮＡ複合体を１００μＭのクロロキン有無の条件下で細胞に添加した。さらに３７℃で４時間後、クロロキンを含むサンプルをＩＯ％ＦＣ５を含むハムズ培地で２回洗浄し、一方では同培地５ｍｌをクロロキンを含まないサンプルに添加した。この細胞をさらに３７℃で２０時間インキュベーションし、その部分標本のルシフェラーゼ活性を実施例７で述べたように検定した。このテストの結果を第２図に示す。

実施例９ＣＤ７−ポリリジン１９０結合体によるＨ９細胞へのＤＮＡの転移および発現ａ）Ｔ−細胞系列Ｈ９細胞（マン（Ｍａｎｎ）等、１９８９）を２０％ＦＣＳ、　ｍｌ当たり１００ユニツトのペニシリン、１００μｇ　／　ｍｌのストレプトマイシンおよび１酬のグルタミンを補ったＲＰＭ１１６４０培地で培養した。トランスフェクション直前に遠心で細胞を回収し、ｍ１当たり１００．０００細胞となるように新鮮な培地に移して（サンプル当たり１、０００．０００細胞）これをトランスフェクションに使用した。抗ＣＤ？結合体との比較物としてトランスフェリン結合体を使用した。トランスフェリン・ポリリジン結合体は、ＥＰ−Ａ　Ｉ　３８８７５８に示されているように調製した。使用したＣＤ７結合体は実施例３て述べたものである。ＤＮＡとの複合体形成は実施例６で述べたように行った。Ｈ９細胞での一時的なトランスフェクションのために、使用したＤＮＡはルシフェラーゼをコードする配列と組み合わせたＨＩＶ−ＬＴＲ配列とそれに続＜　５Ｖ４０−イントロン／ポリＡ部位を含むプラスミドｐＨＬｕｃｉである。

ｐＨＩＶ／２Ａ由来のプロテアーゼ２八遺伝子を含むＨｉｎｄｌ［Ｉフラグメント（サン（Ｓｕｎ）およびバルチモア（Ｂａｌｔｉｍ。

ｒｅ）、１９８９）は除去し、ルシフェラーゼをコードする配列を含むｐＲ３ＶＬのＨｉｎｄｌｌｌ／５ｎ１ａｌフラグメント（ドウウェット（Ｄｅ　Ｗｅｔ）等、１９８７）で置き換えた。２つのフラグメントをＨｉｎｄｌ１１部位で連結しくクレノーポリメラーゼで平滑末端としだ後）、次いで平滑５Ｉ１１ａ１部位を介して平滑化したＢｉｎｄｌ１１部位に結合した。正しい方向のルシフェラーゼ遺伝子配列を有するクローンを選択した。このプラスミドは強い転写活性にＴＡＴ遺伝子産物を必要とする。これは、Ｃｌ１ＩＶ初期プロモーターの調節下にあるＨＩＶ−ＴＡＴ遺伝子をコードするプラスミドｐｃＭＶＴＡＴをコトランスフエクションすることにより調製した（ヤコボビッツ（Ｊａｋｏｂｏｖｉ　ｔｓ）等、１９９の。トランスフェクションに使用したＤＮＡ複合体は、５μｇのｐｌ（ＬｕｃｉおよびｌμｇのｐｃＭＶＴＡＴの混合物を含んでいる。１０＋ｎｌの細胞サンプルにＤＮＡ　／ポリカチオン複合体（５００μ■）を添加し、１００μＭのクロロキンの存在下で４時間インキュベーションした。その後、細胞を新鮮な培地で洗浄し、４０時間後収穫して先の実施例で述べたようにルシフェラーゼ活性を測定した。結果（ルシフェラーゼ光単位）を第３図に示す。６μｇのＤＮＡと複合体を形成する抗ＣＤ？−ポリリジン結合体の量が増加するにつれルシフェラーゼ活性が増加することが分かった（サンプル１，２および３）。６μ ｇのＤＮＡを複合体形成に用いた遊離のポリリジンｌμｇと共に使用した時さらに活性の増加が見られ（サンプル４）、また、さらにポリリジンを添加すると遺伝子輸送が阻害された（サンプル５）。（トランスフェリン−ポリリジン結合体を用いて行った比較テストは、サンプル６および７である）ｂ）さらに、プラスミドｐＳＳＴＮｌ？Ｏを用いて抗体結合体によるトランスフェクションの一連のテストを行った。マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を含む該プラスミドを、抗ＣＤ４　、抗ＣＤ７および（比較のため）トランスフェリン・ポリリジン１９０結合体を用いてＨ９細胞に導入した（ｔｏ’細胞当たり６μｇのＤＮＡを使用した。

至適トランスフェクション条件は、一時的なルシフェラーゼ検定による予備テストで決定した）。プラスミドｐＳＳＴＮＥＯは、Ｈ３Ｖ　ＴＫ−ｎｅｏ単位を含むｐＵｃｕ部位の大きい方のＳＳｔフラグメントを含んでいる（コリス（Ｃｏｌ　Ｉｔｓ）等、１９９０）。単一のＮｄｅ　１部位を含む６３ｂｐのフラグメントをＡｓｐ７１８部位に導入した。トランスフェクトした細胞の一部（特定の細胞数を含む）を１０００μｇ／　ｍｌの０４１８を含む半固形メチルセルロース培地で希釈した。これを行うためにＤＮＡによるトランスフェクション後３臼目に、細胞の一部を通常の要求物に加えて０．５−１　ｍｇ／　ｍｌのＧ４１８および２０ｍｇ／　ｍｌのメチルセルロースを含む半固形培地であってネオマイシン・マーカーを含む培地にブレーティングした。（半固形選択培地を調製するためには、４６０ｍ１の水に２０ｇのメチルセルロースを含む溶液を無菌状態で調製した。）また、二倍濃度の補填栄養培地５００ｍ１を無菌的に調製し、メチルセルロース溶液と合わせた後、容積を１リツトルとし４℃で一晩攪拌した。場合によっては一２０℃での保存後、この培地５０ｍ１を１０＋ｎｌの血清と混合し、血清を含まない完全な培地で１００　ｍｌに調整した。この段階でＧ４１８を添加した。このメチルセルロース培地２．５ｍｌを５０−１００μｍの細胞懸濁液と混合し、この混合物１ｍｌを培養皿に注いだ。ＣＯ２雰囲気下、３７℃でインキュベーションした。１０−１４日後、Ｇ４１８耐性細胞を計数した（２００個以上の細胞を含むコロニーのみをポジティブとして計数した）。この結果を第４図に示す（これは抗生物質培地にブレーティング後ｌＯ日目の１０００個の細胞当たりのＧ４１８耐性コロニー数を示している）。

実施例１ＯｉＡｂｌ、　ＩＡＳＭＬ−ポリリジン１９０結合体による膵臓ガン細胞へのＤＮＡの転移１０ＸＦｃｓを含むＲＰＭ１１６４０培地２ｍｌ中の転移性ラット膵臓ガン細胞系列ＢＳｐ７３ＡＳＭＬ（マズク（Ｍａｔｚｋｕ）等、１９８９）の細胞をファルコン製の２４穴プレートに５　ＸＩＯ’個の割合でブレーティングした。この細胞を実施例４で調製したｍＡｂｌ、　ＩＡｓＭＬ−ポリリジン１９０結合体（または比較としてトランスフェリン・ポリリジン２００結合体またはポリリジン自体）と接触させ、１００μＭのクロロキン存在下、以下に示す結合体・ＤＮＡ比でｐＲ３ＶＬ−ＤＮＡと複合体を形成させた。３７℃、４時間の複合体とのインキュベーション後、培地を除き、新鮮な血清含有培地（クロロキン無し）を添加してさらに３７℃、２０時間インキュベートした後細胞を収穫した。

細胞抽出物から同じタンパク質含量で標準化した部分標本のルシフェラーゼ活性を検定した。

第５図に示されている光単位の値は６μｇのＤＮＡでトランスフェクトした細胞５×１０６個のルシフェラーゼ活性に匹敵する（図中、ｍＡｂ−ｐＬ１９０ｃは１８ｇｇのｐＡｂｌ、　ＩＡＳＭＬ−ｐＬｌ　９０Ｃ結合体を示す。ＩＩＡｂ− ｐＬ１９０ｃ＋ｐＬは９μｇのｍＡｂｌ、　ＩＡＳＭＬ−ｐＬ１９０ｃ結合体＋１．５μｇ１７）非結合ポリ（Ｌ）リシン９０を示す。ＴｆＰＩ２００　ハ１８ μｇ　ノＴｆｐＬ２００ｃ（トランスフェリン・ポリリジン２００結合体）を示し、ｐＬは２．５μｇ　（またはｌ−４μｇ）のポリリジン（Ｌ）リジン９０を示す。）。

実施例１１抗体プロティンＡ・ポリリジン結合体によるＣＤ４＋細胞のトランスフェクション′ｒ２５バイアル当たり６　ＸＩＯ’細胞の割合でＣＤ４発現ＨｅＬａ細胞（実施例７参照）を植種し、１０％のＦｅ２を含むＤＭＩ！培地で培養した。第６図に示したように、細胞を抗体（抗ＣＤ４ｇｐ５５ｋＤ、　ｌ０Ｔ４、イムノチク社、サンプル当たり３μｇ）と室１１ｉテ１時間ブレ・インキュベーションした。その間に６μｇのｐＲ８ＶＬおよび実施例６に示したようにさらに遊離のポリリジンを含む指定量のプロティンＡ・ポリリジン１９０を含む５００μｍの）ＨＢＳ中でプロティンＡ・ポリリジン１９０　／ＤＮＡ複合体を調製した。１時間のインキュベーション後、細胞を新鮮な培地４．５ｍｌに移し、３７℃で５００μｌのＤＮＡサンプルを細胞に添加した。４時間後、１００μＭのクロロキンを含むサンプル（サンプル９−１２）を新鮮な培地を洗浄し、一方、１−８のサンプルは収穫するまでＤＮＡとインキュベートした。ルシフェラーゼ検定のため２０時間後に細胞を収穫した。検定結果は第６図に示す。ルシフェラーゼ活性は、ＤＮＡ複合体中のプロティンＡ・ポリリジンの存在に依存する事が分かった（サンプル１−４．５．６）。サンプル５−８．１１．１２では、抗体での前処理無しにプロティンＡ複合体によりＤＮＡの輸送が起こっている。しかし、細胞表面タンパク質ＣＤ４を認識する抗体で細胞を前処理した場合にはＤＮＡの導入が約３０％増加した（サンプルｌ−４，９，１０）。また、クロロキンの存在がＤＮＡ発現の増加の原因とはならないことが分かった（サンプル１−８とサンプル９−１２の比較）。

実施例１２抗体・プロティンＡ／Ｇポリリジン１９０結合体によるに５６２細胞のトランスフェクションａ）プロティンＡ／Ｇポリリジン１９０結合体の調製０、５ｍｌの１００　ｍＭ　ＨＢＰＥＳ　（ｐＨ７，９）中４．５ａ＋ｇの組み換えタンパク質Ａ／Ｇ　（ピアス、Ｎｏ、２１１８６．１０２ｎ＋ｏｏｌ　）溶液を３０μ！の５ＰＤＰ　（ファルマシア）１００ＩＩｉｌエタノール溶液と混合した。室温２時間後、この混合物をセファデックスＧ２５ゲルカラムで濾過しく溶出液５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳバッフｙ　（ｐＨ７，９）　）　、２９０　ｎｍｏｌのピリジルジチオプロピオネート基で修飾されたプロティンＡ／Ｇ　３．４５ｍｇ　（７５ｇｍｏｌ）を得た。ＦＩＴＣで蛍光ラベルしたポリリジン１９０を同様に５ＰＤＰで修飾し、ジチオスレイトールによる処理およびゲル濾過で遊離したメルカプト基で修飾された形とした。

０．８ｍｌの３０−酢酸ナトリウムバッファ中、１３０　ｒ＋ｍｏｌのメルカプト基で修飾された４２ｒｍｏｌのポリリジン１９０溶液を酸素を排除して上述の修飾されたプロティンＡ／Ｇと混合し、室温で一晩放置した。この反応混合物に５ＭのＮａＣＩを添加して約０．６Ｍに調整した。結合体はイオン交換クロマトグラフィー（Ｍｏｎｏ　Ｓ、ファルマシア、５Ｍ　ＨＩｌ！ＰＥＳ　（ｐＨ７，３）　、塩濃度勾配０．６Ｍ乃至３　Ｍ　ＮａＣ１）で単離した。分画および２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，３）に対する透析後、１２ｔ＋＋ＩＩｏｌのポリリジン１９０で修飾された１、０２ｍｇ　（２２ｇｍｏｌ）のプロティンＡ／Ｇを含む結合体フラクションが得られた。

ｂ）抗体−プロチインＡ／Ｇ−ポリリジン１９０　／ＤＮＡ複合体の調製ＨＢＳ中７μｇのａ）で調製したプロティンＡ／Ｇ結合体の溶液を攪拌しながらトランスフェリン・レセプターを指向するＣＤ７モノクローナル抗体（３μｇ１クローンＢＵ５５、ＩｇＧＩ、ザ・パインディング・サイト・リミテッド社、バーミンガム、イギリス）に結合させた。ＤＮＡ複合体は、２００μＩのＨＢＳ中の抗ＣＤ７１結合プロティンＡ／Ｇ−ポリリジン結合体溶液を３００μｌのＨＢＳ中の６μｇのプラスミドＤＮＡ（レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を含む、先の実施例参照）溶液と混合して調製した。

ｃ）Ｋ５６２細胞への遺伝子転移トランスフェリン遺伝子に富むに５６２細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ２４３　’）を１０％　Ｆｅ２５１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ　／ｍｌストレプトマイシンおよび２ｄｌグルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０培地（ギブコＢＲＬ、２　ｇ　／Ｉの炭酸水素ナトリウム添加）に懸濁し、細胞密度５００．０００細胞／ｍｌとなるまで培養した。トランスフェクション２０時間前、細胞に５０ｇＭのデフエリオキサミン（シグマ）を含む新鮮な培地を添加した。細胞を収穫し、２５０．０００細胞／ｍｌとなるようにｌＯ％ＦＣ３（および５０ｇＭデフエリオキサミン）を含む新鮮な培地に懸濁してから２４穴プレートにブレーティングした（ウェル当たり２ｍ１）。この実験の最初の４時間までは培地に１００μＭのクロロキンを含ませた。細胞をクロロキンを含まない新鮮な培地で洗浄し、２４時間後に収穫した。先の実施例に示した方法でルシフェラーゼ活性を測定した。

その実験結果を第７図に示す。

参考文献アル７ｔ　（Ａｒｕｆｆｏ）んおよびシード（Ｓｅｅｄ）　Ｂ、、　ＥＮＢＯＪ、　６．　Ｎｏ、１１．３３１３−３３１６バルチモア（Ｂａｌｔｍｒｅ）　Ｄ、、　１９８８．　Ｎａｔｕｒｅ　３３５．３９５チヨーダリー（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ）　Ｖ、に、等、１９９０．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８７．１０６６シリベルト（Ｃｉｌｉｂｅｒｔｏ）　Ｇ、等、１９８５．　Ｃｅ１ｌ　４１．５３１−５４０：Ｉ（Ｃｏ）　Ｍ、Ｓ、およびクイーン（Ｑｕｅｅｎ）　Ｃ，，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ　３５１．５０１−５０２コリス（Ｃｏｌｉｓ）　Ｐ、等、１９９０．　ＥＭＢＯＪ、　９．２３３−２４０ドウウエツト（Ｄｅ　Ｗｅｔ）等、１９８７．　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　７．７２５−７３７グリーン（Ｇｒｅｅｎ）　ｋ等、１９８９．　Ｃｅ１ｌ　５８．２１５−２２３ハム（Ｈａｍ）　Ｒ，Ｇ、、　１９６５．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　５３．２８８ヘルスコウイツツ（ｌ（ｅｒｓｋｏｗｉｔｚ）　１．、１９Ｂ？、　Ｎａｔｕｒｅ　３２９．２１９ヤコポビツツ（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ）　ｋ、等、１９９０．　ＥｌｉｌＢＯＪ、　９．１１６５−１１７０ジヨンストン（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ）　Ｓ、Ａ、、　１９９０．　Ｎａｔｕｒｅ　３４６．７７６−７７７ジヤング（Ｊｕｎｇ）等、１９８１．　Ｂｉｏｃｈｅｕ　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　１０１．５９９カシツド（Ｋａｓｉｄ）　Ａ、等、１９９０．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８７．４７３−４７７ナツプ（Ｋｎａｐｐ）　’１．等、１９８９．ｌ＋ｍ＋ｕｎｏ１．　Ｔｏｄａｙ　１０．２５３−２５８クラチ（Ｋｕｒａｃｈｉ）　Ｋ、およびデビー（Ｄａｖｉｅ）　Ｅ、Ｖｌ、、　１９８２．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ` ７９、６４６１−６４６４ラスキー（Ｌａｓｋｙ）等、１９８７．　Ｃｅ１ｌ　５０，９７５−９８５ラスマン（Ｌｕｔｈｍｎｎ）　Ｈ，およびマグヌソン（Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ）　、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１１゜マリム（Ｍａｌｉｍ）　ＩＬ等、１９８９．　Ｃｅ１ｌ　５８．２０５−２１４マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、　１９８２．　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒマン（Ｍａｎｎ）　Ｄ、　Ｌ、等、１９８９．　ＡＩＤＳ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｒｅけｏｖｉｒｕｓｅｓ、　５，２５R マズク（Ｍａｔｚｋｕ）　Ｓ、等、１９８３．　Ｉｎｖａｓｉｏｎ　Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ　３．１０９−１２３マズク（Ｍａｔｚｋｕ）　Ｓ、等、１９８９．　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４９．１２９４−１２９９ナベル（Ｎａｂｅｌ）　Ｅ、Ｇ、等、１９９０．５ｃｉｅｎｃｅ　２４９．１２８５−１２８８オルランジ（Ｏｒｌａｎｄｉ）　Ｒ，等、１９８９．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８６．３８３３−３８３７ペルチエン・マチユース（Ｐｅｌｃｈｅｎ−Ｍａｔｔｈｅｗｓ）等、１９８９．　ＥＭＢＯＪ、８．３６４１−３６４９ボンダー（Ｐｏｎｄｅｒ）　ＬＰ、等、）９９１．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｌ　ＵＳＡ　８８．１２１７−１２２１リダーダン（Ｒｉｏｒｄａｎ）　Ｊ、Ｒ，等、２９８９．５ｃｉｅｎｃｅ　２４５．１０６６−１０７３サストリー（Ｓａｓｔｒｙ）　Ｌ、等、１９８９．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、、　ＵＳＡ　８６．５７２８−５７R２サン（Ｓｕｎ）　Ｘ、−）Ｌおよびバルチモア（Ｂａｌｔｉｗ！ＩＪｒｅ）　Ｄ、、　１９８９．　Ｐｒｏｃ、Ｎａ比八へｃａｄ、　Ｓｅｔ、ＵＳＡ　８６．２１４３−２１４６スロリア（Ｓｕｒｏｌｉａ）　Ａ、等、１９８２．　Ｔ［Ｂ３　２月号、７４− ７６トロノ（Ｔｒｏｎｏ）　Ｄ。等、１９８９．　Ｃｅ１ｌ　５９．１１３−１２０バレリオ（Ｖａｌｅｒｉｏ）　Ｄ、等、１９８４．　Ｇｅｎｅ　３１．１４７−１５３ワグナ−（Ｗａｇｎｅｒ）　Ｅｉ、等、１９９１．　Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２，２２６−２３１ワルドマン（Ｊａ［ｄｍｎｎ）　Ｔ、Ａ、、１９９１．５ｃｉｅｎｃｅ　２５２．　１６５７−１６６２ウイルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）　ＪＩＬ等、１９９０．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８７．４３９−４４３ウツド（Ｗｏｏｄ）　 ’Ｉ１．　ｌ、等、１９８４．　Ｎａｔｕｒｅ　３１２．３３０−３３７つ（ｌｕ）　Ｇ、Ｙ、およびつ（Ｊｕ）　Ｃ，Ｌ、　１９８７．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅａ　２Ｂ３．１４６２１−１４６２４ヤング（Ｙａｎｇ）　Ｎ、Ｓ、等、１９９０．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８７．９り６８−９５７２ザメクニク（Ｚａｍｅｃｎｉｋ）等、１９８Ｂ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　８３．４１４３シン（Ｚｏｎ）　Ｇ、　、　１９８Ｂ、　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ、　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５．　Ｎｏ、　９゜５３９−５４９　Ｒｅｍｉｎｇ戟Aｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｅａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、マック出版社、イーストン、Ｐ＾、オソル（Ｏｓ。

ｌ）編、１９８０Ｆｉｇ、１Ｆｉｇ、２Ｆｉｇ、３コロニー／１０００　細胞Ｆｉｇ、５Ｆｉｇ、　６Ｆｉｇ、７　’ 国際調査報告ＥＰ　９２００６４２ＳＡ　５７６０８フロントページの続き（７２）発明者　ビルンスティール　マックス　エルオーストリア　ア−１１００ウィーン　グルンデツケルガッセ　４９（７２）発明者　コツテン　マシューオーストリア　ア−１１３０ウィーン　マックシングシュトラーセ　２２−２４ −３−８（７２）発明者　ワーグナー　エルンストオーストリア　ア−２１０３ランゲンツェルスドルフ　ヴイーネル　シュトラーセ

Claims

【特許請求の範囲】

１．核酸と可溶性複合体を形成し、ヒトまたは動物の細胞に吸収される新しいタンパク質・ポリカチオン結合体であって、該結合体のタンパク質成分が標的細胞の細胞表面タンパク質に対する抗体またはそのフラグメントであって該細胞表面タンパク質に結合する能力を有し、その結果、形成された複合体が該細胞表面タンパク質を発現する細胞に吸収されることを特徴とする結合体。
２．前記抗体がモノクローナル抗体またはそのフラグメントであることを特徴とする請求項１記載の結合体。
３．前記抗体がＴ細胞系列の細胞上に発現される細胞表面タンパク質を指向するものであることを特徴とする請求項１または２記載の結合体。
４．前記抗体がＣＤ４を指向することを特徴とする請求項３記載の結合体。
５．前記抗体が腫瘍抗原を指向することを特徴とする請求項１または２記載の結合体。
６．前記抗体がＣＤ７を指向することを特徴とする請求項３記載の結合体。
７．前記抗体が直接ポリカチオンに結合することを特徴とする請求項　１乃至６のいずれか１項記載の結合体。
８．ポリカチオンに結合し、かつ、場合によっては修飾されたプロテインＡが結合した抗体を含むことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項記載の結合体。
９．請求項８記載の抗体結合体を調製するためのプロテインＡ・ポリカチオン結合体。
１０．前記ポリカチオンが同種または異種の合成ポリペプチドであることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか１項記載の結合体。
１１．前記ポリペプチドがポリリジンであることを特徴とする請求項１０記載の結合体。
１２．前記ポリカチオンが場合によっては修飾されたプロタミンであることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか１項記載の結合体。
１３．前記ポリカチオンが場合によっては修飾されたヒストンであることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか１項記載の結合体。
１４．前記ポリカチオンが約２０乃至１０００の正電荷を有することを特徴とする請求項１０乃至１３のいずれか１項記載の結合体。
１５．ポリカチオンに対する抗体のモル比が約１０：１乃至１：１０であることを特徴とする請求項１０乃至１４のいずれか１項記載の結合体。
１６．ヒトまたは動物の細胞に吸収される新しいタンパク質・ポリカチオン／核酸複合体であって、結合体のタンパク質成分が標的細胞の細胞表面タンパク質に対する抗体またはそのフラグメントであって該細胞表面タンパク質に結合する能力を有し、その結果、形成された複合体が該細胞表面タンパク質を発現する細胞に吸収され、また該抗体が直接ポリカチオンに結合しているか、または場合によっては修飾されたプロテインＡを介して結合していることを特徴とする結合体。
１７．前記結合体成分として請求項１乃至８または１１乃至１５に定義されている結合体の１つを含むことを特徴とする請求項１６記載の複合体。
１８．さらに、場合によっては結合体のポリカチオンと同じ非共有結合ポリカチオンを含むことにより、該結合体によって達成される核酸のインターナリゼーションおよび／または発現が促進されることを特徴とする請求項１７記載の複合体。
１９．アンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはリボザイムの形の阻害性核酸または、場合によってはキャリヤー遺伝子と共に該核酸をコードする遺伝子を含むことを特徴とする請求項１６乃至１８のいずれか１項記載の複合体。
２０．該核酸がウイルス阻害性核酸である請求項１９記載の複合体。
２１．ＨＩＶ−１ウイルスまたは関連レトロウイルスの複製および発現を阻害する核酸を含むことを特徴とする請求項２０記載の複合体。
２２．トランスドミナント変異を有するウイルスタンパク質をコードする核酸を含むことを特徴とする請求項２０または２１記載の複合体。
２３．オンコジーン阻害性核酸を含むことを特徴とする請求項１９記載の複合体。
２４．遺伝子または遺伝子断片の形で治療的または遺伝子治療的に活性な核酸を含むことを特徴とする請求項１７または１８記載の複合体。
２５．高等な真核細胞に核酸を導入する方法であって、望ましくは生理学的条件下で可溶性の請求項１９乃至２４で定義されている複合体の１つを、場合によっては非共有結合ポリカチオンの存在下、請求項１乃至８または１０乃至１５のいずれか１項で定義されている抗体結合体および核酸から形成し、該抗体が指向する細胞表面タンパク質を発現する細胞を、場合によっては細胞中の核酸の分解が阻害される条件下で該複合体と接触させる方法。
２６．高等な真核細胞に核酸を導入する方法であって、複合体を場合によっては修飾されたプロテインＡおよび請求項１０乃至１４で定義されているポリカチオンの１つからなるプロテインＡ・ポリカチオン結合体および請求項１６乃至２４で定義されている核酸の１つから形成し、ついで標的細胞の細胞表面タンパク質に対する抗体であって該複合体の結合体成分に結合している抗体の存在下、該複合体を該細胞表面タンパク質を発現する細胞と接触させる方法。
２７．前記細胞をプロテインＡ・ポリカチオン／核酸複合体と接触させる前に該抗体で前処理することを特徴とする請求項２６記載の方法。
２８．活性成分として請求項１６乃至２４で定義されている複合体の１つの形で１つ以上の治療的または遺伝子治療的に活性な核酸を含んでいる医薬製剤。