JPH06506191A - 加速された傷の治癒を促進する組織シーラントおよび成長因子含有組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 加速された傷の治癒を促進する組織シーラントおよび成長因子含有組成物関連出 願の前後参照 本願はここに引用して編入されている、米国特許出願第０７／６１８，４１９号 （１９９０年１１月２７日出願）の一部継続出願である。

発明の技術分野 本発明は、皮膚や骨等の加速された傷の治癒：血管プロテーゼの内皮形成：およ びインビトロでの内皮細胞や線維芽細胞等の動物細胞の増殖および／または分化 を促進する、成長因子を補充したフィブリン接着剤のような組織シーラントに関 する。本発明はさらに、成長因子（類）が補充されたフィブリン接着剤と傷、血 管プロテーゼおよびインビトロで培養されている細胞との長期的な接触を維持す る方法を提供する。

発明の背景 傷の治癒、即ち病巣の回復は、傷のほぼ直後から始まる。それには様々な細胞の 連続的な協同機能および分解および再生１稈の緊密な制御が必要である。それに はフィブリン血餅の形成、血餅の吸収、および上皮形成が含まれる。−傷の治癒 には、移しい数の毛細血管、多くの活性な線維芽細胞、および豊富なコラーゲン 原繊維の形成が含まれるが、特定の皮膚構造の形成は伴わない。

傷治癒の１稈は傷細胞から流出するトロンボプラスチンによって開始される。

トロンボプラスチンは血漿の因子Ｖｌｌと接触し因子Ｘ活性化因子を形成し、該 活性化因子と因子■とかりん脂質およびカルシウムと複合体化し、プロトロンビ ンをトロンビンに変換する。トロンビンの触媒作用でフィブリノーゲンからフィ ブリノペプチドＡおよびＢが放出されてフィブリンモノマーが形成され、それら が凝集してフィブリンフィラメントを形成する。トロンビンはまたトランスグル タミナーゼ（因子Ｘ１ｌｌａ）を活性化し、それはフィブリンフィラメントを共 有結合的にクロスリンクするためのイソペプチド形成を触媒する。アルファ、− 抗プラスミンが次いで因子Ｘ１ｌｌによってフィブリンフィラメントと結合し、 それにより、血漿によるフィラメントの分解を防御する。

組織が傷付くと、生物学的活性の配置を示すポリペプチド成長因子が、それらが 傷の治癒に重要な役割をする傷内に放出される（例、Ｈｏｒｓｏｎａｌ　Ｐｒｏ ｔｅｉｎｓ　ａｎｄＰｅｐｔｉｄｅｓ、　Ｌｉ、　Ｇ、Ｂ、　ｅｄ、、　Ｖｏｌ ｕｍｅ　７．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｉｎｃ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ A　ｐｐ、２５１ −２７７プラントら（Ｂｒｕｎｔ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇｙ　６：２５−３０　（１９８８））。これらの活性化には、白血球や線 維芽細胞のような細胞の傷領域への集合と、細胞増殖および分化の誘導が含まれ る。傷の治癒に関与する成長因子には、以下のものが含まれる：血小板誘導成長 因子（ＰＤＧＦ）　、インシュリン−結合成長因子−１（ＩＧＦ−１）　、イン シュリン−結合成長因子−２（ＩＧＦ−２）　、上皮成長因子（ＥＧＦ）　、形 質転換成長因子−α（ＴＧＦ−α）、形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）、血 小板因子４　（ＰＦ−４）およびヘパリン結合成長因子１および２（ＨＢＧＦ− １およびＨＢＧＦ−２）。

循環血小板のα顆粒に含まれるＰＤＧＦ類は、傷の血液凝固の間に傷部位に放出 される（例えば、リンチら（Ｌｙｎｃｈ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　Ｊ、Ｃ１１ｎ 、　Ｉｎｖｅｓｔ、　８４：６４０−６４６　（１９８９））。ＰＤＧＦ類には 以下のものが含まれる：　ＰＤＧＦ、血小板誘導脈管形成因子（ＰＤＡＦ）　、 ＴＧＦ−βおよびＰＦ−４、これは、好中球の化学誘因因子である（ナイトンら （Ｋｎｉｇｈｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　ｉｎ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏ ｒｓ　ａｎｄ　０ｔｈｅｒ　Ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｆ　ｆｏｕｎｄ　Ｈｅａｌｉｎ ｇ：　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｉｍｐｌｉｃａｔｉ ｏｎｓ、　Ａｌａｎ@Ｒ，Ｌｉ５ｓ。

Ｉｎｃ、、　ｐｐ、　３１９−３２９　（１９８ｇ）参照）。ＰＤＧＦはミドゲ ンチあり、線維芽細胞および平滑筋細胞の化学的誘引物質であり、線維芽細胞お よび平滑筋細胞を含む、間葉起源の細胞におけるタンパク質合成の刺激因子であ る。ＰＤＧＦはまた内皮細胞のための、非有糸分裂性化学的誘引物質である。

ＩＧＦ−１は、ＰＤＧＦと一緒になって開票培養細胞における有糸分裂およびタ ンパク質合成を促進する。皮膚傷へのＰＤＧＦまたはＩＧＦ−１単独適用では治 癒が促進されないが、両因子を一緒に適用すると、結合組織および上皮組織の成 長が促進されるようである（リンチら（Ｌｙｎｃｈ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　Ｐ ｒｏｃ　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　７６：１２７９−１２８３　（１ ９８７））。

ＴＧＦ−βはマクロファージおよび単球類の化学的誘引物質である。他の成長因 子の存在または不在に依存して、ＴＧＦ−βは多（の細胞型を刺激または阻害す る。例えば、インビボで適用されると、ＴＧＦ−βは治癒−皮膚傷の張力強度を 増す。ＴＧＦ−βはまた、内皮細胞の有糸分裂を阻害し線維芽細胞によるコラー ゲンおよびグリコサミノグリカンの合成を刺激する。

成長因子、ＥＧＦＳＴＧＦ−α、ＨＢＧＦ類およびオストゲニン等の他の成長因 子も傷の治癒には重要である。胃分泌液および唾液に見いだされるＥＧＦと、正 常および形質転換細胞の両者で生成されるＴＧＦ−αは、構造上関連しており、 同じ受容体（レセプター）を認識し、上皮細胞の細胞増殖を触媒するらしい。両 因子は皮膚の傷の再上皮形成を促進する。脱ミネラル化骨から精製されたオスト ゲニンは骨形成を促進するらしい（ルイテンら（Ｌｕｙｔｅｎ　ｅｔ　ａｌ、） 　、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、ＣｈｅＬ　２６４−１３３７７（１９８９））。

ＨＢＧＦ類、これには酸性ＨＢＧＦ−１と塩基性のＨＢＧＦ−２ポリペプチドが 含まれるが、は、内皮細胞等の中胚葉および神経外胚葉すニアージ（ｌｉｎｅａ ｇｅ）の強力な有糸分裂誘発物質である（バーゲスら（Ｂｕｒｇｅｓｓ　ｅｔ　 ａｌ、　）　、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５８：５７５−６０６ 　（１９８９））　。加えて、ＨＢＧＦ−１は内皮細胞、線維芽細胞、および大 ダリア細胞のための走化性物質である。ＨＢＧＦ−１およびＨＢＧＦ−２はいず れもヘパリンと結合し、その結果、タンパク質加水分解的な分解から保護される 。ＨＢＧＦ類によって示される生物学的活性の配置はそれらが傷に治癒に重要な 役割を果していることを示している。

成長因子は、従って、傷の治癒および組織の修復を特異的に促進するのに、潜在 的に有用である。外因性成長因子を傷に与えることが、傷の閉鎮速度、傷領域の 細胞の数、血管の成長、コラーゲン沈着の総速度、および廠痕の強度を増大する ことが示された［例えば、カーターら（Ｃａｒｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　 ｉｎ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｅｒｓ　ａｎｄ　０ｔｈｅｒ　Ａｓｐｅｃｔｓ 　ｏｆ　ｆｏｕｎｄ　Ｈｅａｌｉｎｇｓ　：　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　 Ｃ１１ｎｉｃａ戟@Ｉｓ＋ｐｌｉｃａ ｔｉｏｎｓ、Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　Ｉｎｃ、、　ｐｐ、　３０３−３１７ 　（１９８８）参照〕。血小板誘導の傷治癒形式（ＰＤＷＨＦ）　、血小板抽出 物、それは通常、局所適用のための軟膏または軟膏剤の剤形である、が記載され ている［例えば、ナイトン（Ｋｎｉｇｈｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　）、　Ａｎｎ、 　Ｓｕｒｇ、　２０４：３２２−３３０（１９８６）参照］。

しかしながら、成長因子の局所適用の有効性を試験するための実験は矛盾する結 果を与えた。別個に傷モデル系に適用されたＰＤＧＦ、ＩＧＦ−１、ＥＧＦ。

ＴＧＦ−βおよび線維芽細胞成長因子（ＦＧＦまたはＨＢＧＦ）は傷の結合組織 や上皮の再生に殆ど効果を与えなかった［リンチら（Ｌｙｎｃｈ　ｅｔ　ａｌ、 　）　、　Ｊ、Ｃ１１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　８４：６４０−６４６　（１９８ ９）］　。試験された因子の内、ＴＧＦ−βのみが大きい反応を示した。ＰＤＧ Ｆ−２ホモ２量体（ダイマー）とＩＧＦ−１またはＴＧＦ−αとの併用は、しか しながら「結合組織の再生および上皮形成」を劇的に増大した。しかしながら、 他の報告では、傷への個々の成長因子の適用によって傷治癒が刺激されたとされ ティる［例えば、Ｔｓｕｂｏｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、　１ ７２：２４５−２５１（１９９０）］。

そのような矛盾する結果が得られた理由は分からないが、これは、それらの正常 な生物学的活性の配置を示し得るような方法で成長因子を適用することが困難な ことに起因するかもしれない。そのよな矛盾した結果の故に、外部から適用され た成長因子が果す傷治癒刺激における役割は明確でない。さらに、成長因子を内 部の傷に適用し、傷と成長因子（類）との長期間の接触を産む方法は現在では、 知られていない。

血漿タンパク質を含有する外科的接着剤および組織シーラントが知られており、 血液の損失を減少し、止血を維持するために、内部および外部の傷のシーリング に用いられている。そのようなシーラント類は通常血液凝固因子と他の血液タン パク質を含む。例えば、欧州特許０．０６８，０４７は、フィブリノーゲン、線 維素溶解阻害物質、およびトロンビンまたはプロトロンビンを含有する豊富化血 漿画分から導かれた無水粉末が記載されている。これは、水を加えるや否や、血 餅が形成されるので、粉末状態でのみ適用可能である。オーストラリア特許ＡＵ −Ａ−７５０９７／８７には、フィブリノーゲン、因子ＸＩ　Ｉ　Ｉ、抗トロン ビンＩＩＩ等のトロンビン阻害物質、プロトロンビン因子、カルシウムイオンお よび所望により、プラスミン阻害物質を含有する、１成分接着剤が記載されてい る。

米国特許４．４２７．６５０および４．４２７．６５１（Ｓｔｒｏｅｔｍａｎｎ ）には、フィブリノーゲン、トロンビンおよび／またはプラスミン、および線維 素溶解阻害物質を含有する（さらに他の成分たとえば血小板抽出物をも含有して いても良い）豊富化血漿誘導体が記載されている。米国特許４．６２７．８７９ および４．９２８．６０３（Ｒｏｓｅら）には、フィブリノーゲンと因子Ｘ１ｌ ｌとを含有する低温沈澱懸濁液と、それのフィブリン（線維素）接着剤の製造に おける使用が記載されている。日本特許１−９９５６’５には、フィブリン接着 剤の製造のためのキットが記載されている。アンモニウムら（＾ｌｔｅｒｂａｕ ｍ、　Ｒ，）　（米国特許４．７１４．４５７）およびモースら（Ｍｏｒｓｅ） 　（米国特許５，０３０、２１．５）は自己由来フィブリン接着剤の製造方法を 記載している。さらに、改良されたフィブリン接着剤デリバリーンステムが記載 された［ミラーら（Ｍｉｌｌｅｒ　ｅｔａｌ、）米国特許４．９３２．９４２お よびモースら（Ｍｏｒｓｅ）らＰＣＴ出願？０９１１０９６４１）。

フィブリン接着剤はフィブリンンーラントとも呼ばれるが、最初に、臨床用局所 適用のために製剤化され出血の抑制および傷治癒の促進のために用いられた。

最近フィブリン接着剤の臨床使用の総説が出された［ピップルら（Ｇｉｂｂｌｅ 　ｅｔ　ａｌ。

）　、　Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ　３０ニア４１−７４７　（１９９０）：ラー ナーら（Ｌｅｒｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　］、　Ｓｕ窒■A　Ｒ ｅｓ、　４８・１６５−１８１　（１９９０）：ｌ。フィブリン接着剤は市販さ れているものを入手可能である。例えば、ＩＭＭＵＮＯＡＧ（オーストリア、ウ ィーン）およびＢＥＨＲＩＮＧＷＥＲＫＥ　ＡＧ　（ドイツ）は今日そのような 生産物を市場に出している（例えば、米国特許４．３７７、５７２および４．２ ９８．５９８参照、いずれもＩＭＭＵＮＯＡＧ所有）　。ＢＡＸＴＥＲＴＲＡＶ ＥＮＯＬ　（Ｗａｕｋｅｇａｎ、ＩＬ）は最近フィブリン接着剤を開発した。

フィブリン接着剤は血漿から生産される。各フィブリン接着剤の正確な成分は出 発物質として用いられた、特定の血漿画分の関数である。一般に、フィブリン接 着剤はトロンビンとの混合に際して血餅を形成するタンパク質の混合物を含有す る。例えば、フィブリン接着剤は血漿から、低温沈澱の後、分画化して、トロン ビンまたはトロンビン活性化物質と混合したとき、シーラントまたは血餅を精製 する組成物を得ることで調製される。血漿成分の分画はエタノール、ポリエチレ ングリコールまたは硫酸アンモニウムによる沈澱、およびイオン交換、およびゲ ルろ過クロマトグラフィー等の標準的なタンパク質精製法に従って行うことがで きる。

フィブリン接着剤は通常、フィブロネクチン、因子ＸＩ　Ｉ　Ｉ、νｏｎ　Ｗｉ ｌｌｅｂｒａｎｄ因子を含むフィブリノーゲン濃縮物および乾燥ヒトまたはウシ トロンビンを含有する。それは凍結乾燥した形で調製され、使用直前に塩化カル シウムと混合する。

混合すると、成分が組織表面で凝集し、交差結合したフィブリンを含む血餅を形 成する。因子ＸＩＩＩはフィブリノーゲン濃縮物に含まれ、交差結合を触媒する 。

フィブリン接着剤は、組織の面と面とをシールし、空気または液体の漏れること を防ぎ、そのことにより止血を誘導する。止血と血液の流出を阻止する能力によ り、フィブリン接着剤は傷の治癒を促進する。しかしながら、それは真の意味で の傷治癒特性をもっていない。フィブリン接着剤は、内部および外部の損傷の両 方に使用でき、かつ止血の維持に有用なので、その傷治癒特性を向上することが 望ましい。

約３９　ｇ／　ｌのフィブリノーゲン濃度を有しトロンビン濃度が２００−６０ ０Ｕ／ｍｌのフィブリン接着剤により傷のストレス、エネルギー吸収および弾力 性値が有意に増大した［バイルンら（Ｂｙｒｎｅ　ｅｔ　ａｌ、）　、　Ｂｒ、 Ｊ、Ｓｕｒｇ、　７８：８４１−８４３　（１９９１）］。加えて、フィブリン 接着剤はマウスの骨形態発生タンパク質により誘導される異所性の骨−軟骨形成 に影響しなかった［ハラトリ（Ｈａｔｔｏｒｉ、Ｔ、、　ＮｉｐｐｏｎＳｅｉｋ ｅｉｇｅｋａ　Ｇａｋｋａｉ　Ｚａｓｓｈｉ　６４：８２４−８３４　（１９９ ０）］。

しばしばポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）で製造される人工血管プロテ ーゼが、ヒトおよび池の動物で切除された血管の代わりに用いられる。これら血 管プロテーゼの能力を最大にし、血栓の生成を最小にするために、非自己由来の 内皮細胞をプロテーゼに蒔くことなど、様々な技術が用いられてきた。移植片と 内皮細胞の両方に接着する様々な基質が、内皮細胞のシーディング（は種）を増 大するために中間体基質として研究されている。これらの基質には、予め凝固さ れた血液［バーリングら（Ｈｅａｒｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　Ｓｕｒｇｅ ｒｙ　８４：４９８−５０４　（１９７８）］、フィブリン接着剤しローゼンマ ンら（Ｒｏｓｅｎｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、）　、　ＪＪａｓｃ、Ｓｕｒｇ、　２ニ ア７８−７８４　（１９８５）　；シレンクら（Ｓｃｈｒｅｎｋ、ｅｔ　ａｔ、 ）　、　Ｔｈａｒａｃ、　Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ、　Ｓｕｒｇ、、@３５ ：６−１０　（１９８６）：ケブカーら（Ｋｏｅｖｅｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　） 　、　Ｔｈａｒａｃ、　Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ、　Ｓｕｒｇ■盾氏A　。

３４：４９−５１　（１９８６）＋ンラら（Ｚｉｌｌａ　ｅｔ　ａｌ、　）　、 　Ｓｕｒｇｅｒｙ　１０５：５１５−５２２　（１９８９）R、 フィブロネクチン「ケスシーら（Ｋｅｓｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　Ｊ、Ｖ ａｓｃ、　Ｓｕｒｇ、　３：５８−６４（１９８６）、マカラクら（Ｍａｃａｒ ａｋ　ｅｔ　ａｔ、　）　、　Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　１１６：７６ −８６（１９８３）；ラマランゲオンら（Ｒａｍａｌａｎｇｅｏｎｓ　ｅｔ　ａ ｌ、　）　、　Ｊ、　Ｖａｓｃ、　Ｓｕｒｇ、　３：２６４−２７２（１９８６ ）］またはRラ ーゲン［ウィリアムスら（Ｗｉｌｌｉａｍｓ　ｅｔ　ａｌ、）　、　Ｊ、Ｓｕｒ ｇ、Ｒｅｓ、　３８：６１８−６２９（１９８５）］。しかしながら、これらの 技術における１つの一般的な問題は、非自己細胞がシーディングに用いられるこ と（例えば、５ｃｈｒｅｎｋら、前掲）、即ち、組織拒絶反応の可能性、さらに もしも樹立されるとしたら、融合性内皮を得るには、数カ月を要する。この遅延 の結果、閉塞率が高い（Ｚｉｌｌａら、前掲）。加えて、剪断ストレスによる内 皮細胞の損傷および細胞損失がある（同上）。

骨の非結合性損傷においては、自然に新しい骨の形成が起きないという最小のギ ャップがある。これらの状態の臨床での治療は骨移植である。自己由来の骨の供 給源は通常限られており、同種異系の骨の使用はウィルス混入の危険が高い。

このような状況なので、脱ミネラル化したウイルス不活化骨粉末が魅力的な解決 法である。骨膜ミネラル化マトリクス（ＤＢＭ）は成長因子と、ＤＢＭがフィブ リン接着剤（ンバルッら（Ｓｃｈｗａｒｚ　ｅｔ　ａｌ、　）　Ｃ１１ｎ、０ｒ ｔｈｏｐａｅｄ、　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｒｅｓ、　２３８２ｇ２−２８７　（１９ ８９）等の様々な物質と一緒に置かれる（ｉｍ、ｉｐまたはｓｃ）とき、動物モ デルで骨形成を誘導し得る、骨形態発生タンパク質（ＢＭＰ’　ｓ）とを含有す る。免疫原的な観点から、ＤＢＭは種特異的であり、動物の進化程度が高等な程 、その骨形成性が劣る。このような理由から、ヒトＤＢＭの適用には限界がある 。

天然の精製ＢＭＰ類［マークら（Ｍａｒｋ、　ｅｔ　ａｌ、　）　、　Ｐｌａｓ ｔｉｃ　Ｒｅｃｏｎｓｔｒ、　Ｓｕｒｇ、。

８６：６２３−６３０（１９９０）］または組換えＢＭＰ　［ドアレサンドロら （Ｄ’＾１ｅｓｓａｎｄｒｏ）　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｃｈｅ ｌｌｌ、、　１５Ｆ：　Ｑ１０５．Ａｂｓｔｒａｃｔ　（１９９０）］が全血餅 ［ウォンら（Ｗａｎｇ）　、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、　１５Ｆ：Ｑ２０　Ａｂｓｔｒａｃｔ（１９９０）］またはフィブリン接着 剤［ハラトリら（Ｈａｔｏｒｉ、ｅｔ　ａｌ、　）　、　Ｎ１ｐｐｏｎ　Ｓｅｉ ｋｋｅｉｇａｋｕ　Ｇａｋｋａｉ　Ｚａｓｓｈｉ　６４F ８２４−８３４　（１９９０）］を含む様々なデリバリ一手段で動物モデルに与 えられると、軟骨形成誘導効果を示した。

従って、本発明は、１つの目的として、成長因子が補充された、フィブリン接着 剤のような組織シーラントであって、皮膚や骨等の傷の治癒；血管プロテーゼの 内皮形成：およびインビトロでの、内皮細胞や線維芽細胞等、動物細胞の増殖お よび／または分化：を促進し得る組織シーラントを提供する。

また、本発明は成長因子（類）を傷ついた組織、血管プロテーゼ、およびインビ トロで培養された動物細胞（内皮細胞や線維芽細胞等）に投与し、成長因子と傷 ついた組織、血管プロテーゼおよび動物細胞と長時間接触させ、そのことにより 傷の治癒、内皮形成または動物細胞の増殖および分化を促進する方法を提供する ものである。

発明の要約 少なくとも１個の成長因子を有効濃度含有するフィブリン接着剤のような組織ン ーラントを提供する。この成長因子補充組織シーラントは傷の治癒、血管プロテ ーゼの内皮形成、およびインビトロでの動物細胞、とりわけ内皮細胞および線維 芽細胞の増殖を促進する。傷の治癒の加速またはさもなくば促進、血管プロテー ゼの内皮形成の生成、およびインビトロでの動物細胞、とりわけ上皮細胞および 線維芽細胞の増殖および分化の生成のために、成長因子補充組織シーラントを用 いる方法も提供する。

本発明の成長因子補充組織シーラントは、糖尿病患者の傷のように、容易に治癒 しない傷の治癒促進、および成長因子を内部の傷部位に到達させ、内部傷部位と 成ト１二「（ガリと６つ長ｍ１間接触さゼるための妃休を提供ずるのに、特に何 用こ゛あイ，。トｎ＊−１イ、）ノシ長因ｆ棺’ｌｌＡ’．組繊一・−−−ノン １・１まゼ”折部位Ａ；たは酢潰輻その仙，の内部の偶の冶帰苓加速ま，・′、 ″．Ｉ；ｔ促ｉｊｇ　．→−るた７（弓、一卸用し得る，、仮右！，　ｌｌｊｌ 　（・）’ｉ　−，−．＋のｆ−Ｊ　ｌ′ｉ−１　１ｉ、゛層．　−，＋　＋． ）　，牛Ｎ，Ｔ−２　；Ｂ〜１Ｉ、しｌE１−月−３Ｍ↓９シ、ひ精吸η３Ｍ１ ゛類θ）ｆ’ｓ百ｆ．”Ｉ　’．科ｖイｌ；　”６−　．７．，、ｌシ！　］’ ．　？．３）？’：’　．、，゛．の混．合物はし｝’＊休の細胞成■■■■■ o−｛、拐 ス午１３σビ１起，２バ必ν，ｉ３　ｔ．Ｋ　４１ｉ−結菖ｉ・１一矢損のキ・ ・　・′５′を埋ぬ６　””’　ｌ・リックス庖りぼろ。タンパク質（フ１・ブ リ７ノーゲ〕，・およ（ｙ因了ＸＩＩＩ等）、酵素（トロンビンおよびフ″ラス ：　：′５）　、ｆｔＴ′，槍憚（ｔ々］，・バク質、ｈ）（，長因子、および Ｄ　Ｂ　Ｍを、この一時的な｝〒リｊ坤５逍乞最も長命に−４−るの４こＡした ように製剤仕する。全混治物成分は生物分解的（゛あるが骨形成の■１は、該濯 ＆物１，友、新Ｌ．　＜形成される骨の形を決定し得るより、非＠壊性の足場を 提供４−る。骨の再Ｉｌ！築手術にお番３る問題である、骨の非結へ性欠損内へ の軟組織の崩壊（虞、かくして避けることができる。

好ましい態様では、傷治癒を加速および／′または促進する能力を有する成長因 子一補充組織ンーラントを得るために、有効慶度のＨＢＧＦ−１をフイブリン接 着剤に加える。他の好ましい態様では、フイブリン接着剤に有効量の血小板一誘 導抽出物を加ズる。他の奸才しい？様では、何効濃度の、少なくとも２個の成長 囚−子の；イ合物τ２・ノ，　７１ｆり゛・；ｉ，，　棺剤（一加え、成荏因了 （類）を含有する、有効員のノイブリン接ト剖を偽組織番二！’ｋ　’ｊ　ｉ　 セ”・、、成長因子に仄以一〔、薬物、ポリクロー｝ルおよびモノクローナル抗 ．体、および他の化合物．．　ｆｉｌえは、傷の治癒を加速寸る化合物，組織シ ーラント内の成長因子の活性を仲介１１″るか促進する化合物：おコ、ひ，・′ または組織／−ラント内の成長因子のｄｊ性を阻害する組織＞＝−ラシ１・成分 を阻害または干渉する化合物類、を組織２・−ラ冫１・に加ズて良い。， 本発明は１繋様とし，て、組織ンーランＩ−と有効濃度の少なくとも１個の成長 因子を含有する、ここに該濃度は傷の治癒を加速しまたはさもなくば促進するに 有効な濃度である、傷の治癒、とりわけ皮膚および骨の傷の治癒を促進する組成 物を提供する。

本発明｛．Ｌ他の態柊と１．−．　Ｔ、組熾シーラン１・と有効濃度の少なくと も１個の成長因了を含官ずる組成物を＜ｓｉ：適用，ｉ７，　．−Ｊ−からなる 、、傷の治癒．、とりわけ皮膚および骨の牛の治癒を促供する方法を提供４る。

水発明は他の態様と１一で、組織二一ランｌ・と有効濃度の少なくとも１個の成 長［ｌ｛″匁含イ，・１−ろ、、一、一己該心度は血管ブ｝二１チーぜの円皮形 成を加速し、さもなくば促進するに何効なＲａｔである、血管ブ１コ子・−ゼの 内皮形成を促進する組成物を提供ずシ，、 本発明は他の態様と１、２て、組識ンーヲントと有効濃度の少なくとも１個の成 長因子を含有する組成物を血管ブ１″Ｉア・−ゼに遺用づることからなる、血管 ブロテーどの内戊形成を促進するｉｊ法を提供する。

木発明は他の態様とし７て、組織シーラントと有効濃度の少なくとも１個の成長 因子を含有する、ここに該濃度は動物細胞のインビトロでの増殖および／または 分化を加速し２、さもなくば促進するに有効な濃度である、動物細胞のインビト ロでの増殖および／または分化を促進する組成物を提供する。

大発明は他の態様として、動物細胞のインビト口での増殖および／または分化− シ促進ずる方法てあって、該細胞を、有効濃度の少な《とも１個の成長因子を含 有する、こ、一に該濃度は動物細胞のインビ１・Ｏ′７′の増殖および／または 分化を加速し、さもなくば促進するに有効な濃度である、組織ンーラントの上お よび／まｆ：は内部に置くことを含む方法を提供する。

本発明は従来用いられていた組成物および力法を凌駕する幾つかの利点を有する 。第１の利点は、本発明の成長因子補充４１′ｉ織シーラン１・は生物分解性で あり体組織に再吸収され得る、一とである。

第２の利点は、体内の、傷または他の部位に成長因子を効率的に到達させる良い 方法を与える点にある。今日、最大限の成長因子の生物学的効果のためには、成 長因子受容体が少なくとも１２時間占有されねばならないと考えられている。

従来、体内部位では、これを行う方法は全く無かった。本発明は、成長因子とそ の受容体との長期間の接触が起きることを可能にし、強力な生物学的効果の生成 を可能にする。

本発明の第３の利点は、全タンパク質およびフィブリノーゲン濃度が従来用いら れていたものよりも薄いことてある。これにより、市販品から入手可能なフィブ リン接着剤の約１／５の濃度のフィブリン接着剤が製造される。この低濃度性に より、動物細胞は本発明の成長因子補充フィブリン接着剤内に移動し、中を通り 、中へ増殖することができる。このことは近隣の組織およびブロテーゼへの細胞 強化を助ける。市販のフィブリン接着剤は、細胞がその中へ移動し、通過し、内 部へ増殖するには、あまりに濃厚である。そして、動物細胞は市販のフイブリン 接着剤の周囲を移動し、あるいはそれを消化しなければならない。

本発明の第４の利点はその液性により、従来利用可能なデリバリーシステムに比 較して、表面をより十分かつ完全に覆うことができる点にある。これは、成長因 子補充フィブリン接着剤は血管ブロテーゼの内部、外部および孔を覆うので、本 発明を血管プロテーゼの内皮形成に用いるためには特に重要である。この結果、 自己由来の内皮細胞が血管ブロテーゼ全長にわたって同時に生じ、その結果、そ の血栓形成性および抗原性の発達を減少する。従来用いていた組織ンーランドで は、増強は血管ブロテーゼの端で生じ、その内部に進行し、かくして血栓形成性 および抗原性の発展時期が延長される。また、血管プロテーゼに従来使用されて いた組織ノーランドには、おもに非自己由来細胞が蒔かれており、これは体によ って拒絶されブロテーセを通過する血液の剥ぎ取り作用で容易に洗い流されてし まう。

図面の簡単な説明 図１はＨＢＧＦ−１βと２　５　０　Ｕ，／＋ｌ　｝ロンビンとを、増大量のヘ バリンの存在下でインキユベートしたウエスタンプロットである。ＨＢＧＦ−１ β（１０μｇ／′＋ａｌ）、トロンビン（２　５　０　ｉｔ　ｇ，／＋１）およ び増大量のヘバリン（０、０．５、５、１０，２０および５０Ｕ／ｍｌ）を３７ ℃で７２時間インキユベートした。各インキュベーション混合物から一部を定期 的にとり、レムリ（Ｌａｅｉｍｌｉ）　（Ｎａｔｕｒｅ２２７：６８０（１９７ ０））の記載に従い調製した８％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに載せ、同じく 該文献記載の方法で操作した。次いでゲルをニトロセルロースに電気ブロソトし 、ＨＢＧＦ−１βに相当するバンドをアフィニティー精製したポリクローナルウ サギ抗ＨＢＧＦ−］β血清を用いて同定した。

インキュベーション混合物中のヘバリン濃度は以下の通りである：バネルＡ）、 ０単位／ｍｌ；パネルＢ）、０．５単位／ｍ１：バネルＣ）、５単位／Ｉ１；パ ネルＤ）、１０単位／ｍｌ　；パネルＥ）、２０単位／ｍｌおよびパネルＦ）、 ５０単位／ｍｌ０バネルＡ−Ｆの各々に記載したゲルにおいて、各レーンは以下 のものを含む；レーン１はＳＤＳ−ＰＡＧＥ低分子量標準を含有する：レーン２ はビオチン化標準を含む，レーン３は１０μｇ／ｍｌのＨＢＧＦ−１βを含む： レーン４は２５０単位／ｍｌのトロンビンを含む：レーン５−１３は時間０、１ 、２、４、６、８、２４、４８および７２時間目に採取した試料を含む。

図２はＨＢＧＦ−１β濃度に比例した関数としての３Ｈチミジンの取り込みを示 す。図１および実施例２に記載のごとくトロンビン２５０Ｕ／ｍｌとヘバリン５ Ｕ／ｍｌの存在下でＨＢＧＦ−１βの試料を０時間、２４時間または７２時間イ ンキ，ベートした。これらの試料の希釈を次いでＮＩＨ３Ｔ３細胞に加え、それ を実施例３記載のごとくプレートした。ＨＢＧＦ−１濃度に対してＣＰＭをプロ ットした図である。

図３は活性な野生型ＦＧＦ−１　（１００ｎｇ／ｍｌ）を補充したフィブリン接 着剤上でヒト謄静脈内皮細胞を７日間培養した後の典型的なパターンである。多 数の細胞とそれらの伸びた形が認められる。補充されていないフィブリン接着剤 上で培養した細胞の少ないこと（図５）と対比されたい。

図４は活性な野生型ＦＧＦ−１　（１０ｎｇ／ｍｌ）を補充したフィブリン接着 剤上でヒト謄静脈内皮細胞を７日間培養した後の典型的なパターンである。多数 の細胞とそれらの伸びた形が認められる。補充されていないフィブリン接着剤上 で培養した細胞が少ないこと（図５）と対比されたい。

図５は補充されないフィブリン接着剤上でヒト謄静脈内皮細胞を７日間培養した 後の典型的なパターンである。図３および図４に比較して細胞数が少ないことが 注目され、これは増殖速度が遅いことを示す。

図６は不活性な、突然変異型ＦＧＦ−１（１００ｎｇ／ｍｌ）を補充したフィブ リン接着剤上でヒト謄静脈内皮細胞を７日間培養した後の典型的なパターンであ る。図３および図４に比較して細胞数が少ないことが注目され、これは増殖速度 が遅いことを示す。

図７は接着剤−１あたり１０５細胞の濃度でフィブリン接着剤中に２４時間包理 した後のヒト謄静脈内皮細胞の典型的なパターンである。接着剤のタンパク質濃 度およびトロンビン濃度は、それぞれ、４＋ａｇ／ｍｌおよび領６ＮＩＨ単位／ ■ｌであった。それらの伸びた、多足（ｍｕｌｔｉｐｏｄｉａｌ）形態、および それら細胞が相互に接触し得る場所でのネットワークの形成に注目されたい。フ ィブロネクチン中で同じ細胞を培養した場合の丸石形と比較して欲しい（図９） 。

図８は接着剤■１あたり１０５細胞の濃度でフィブリン接着剤中に４８時間包理 した後のヒト屓静脈内皮細胞の典型的なパターンである。培養条件は図７と同様 である。一層、伸びたかつ多足形態が強調されており、細胞ネットワークが増大 していることに注目されたい。フィブロネクチン中で培養された細胞の丸石形と 比較しく図１０）、後者ではネットワークが無いことに注目されたい。

図９はヒト謄静脈内皮細胞をフィブロネクチンで被覆した表面で２４時間培養し た後の典型的なパターンである。細胞が丸石形をしており、ネットワークが無い ことに注目されたい。図７と比較されたい。

図９はヒト屑静脈内皮細胞を、通常用いられるフィブロネクチンフィルム上で４ ８時間培養した後の典型的なパターンである。細胞が丸石形をしており、ネット ワークが無いことに注目されたい。図８と比較されたい。

図１１は７日（パネルＡ、　Ｃ，Ｅ）および２８日（パネルＢ、　Ｄ、　Ｆ）の 後に犬から体外移植されたＰＴＦＥ血管移植片の断面のマイクログラフである。

移植に先立ち、移植片を処理しない（ＡおよびＢ）、フィブリン接着剤のみで被 覆する（ＣおよびＤ）あるいはヘパリンおよびＨＢＧＦ−１を補充したフィブリ ン接着剤で被覆した（ＥおよびＦ）。

図１２は図１１の、移植２８日目の、血管移植片の内面の走査電子マイクログラ フである。移植片は処理しない（Ｇ）、フィブリン接着剤のみで被覆する（Ｈ） あるいはヘパリンおよびＨＢＧＦ−１を補充したフィブリン接着剤で被覆した（ Ｉ）。

好ましい態様の説明 定義 特に定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術および科学用語は本発明の 属する分野の当業者に通常理解されている意味と同一の意味を有する。本明細書 に記載の全特許および出版物を参考文献として本明細書に引用する。

本明細書中、傷とは、生きている生物におけるあらゆる損傷組織を包含する。

組織は胃内面または骨折等の内部組織、あるいは皮膚のような外部組織であって よい。それは膵臓のように軟い組織、あるいは骨のように硬い組織であってよい 。

傷は外傷、感染または外科的処置など任意の原因によるものであってよい。

本明細書中、組織シーラントとは、血漿タンパク質から調製され、傷に適用され たとき、血餅を生成し、その結果、傷をシールし、血液の損失を減じ、止血を維 持する組成物である。フィブリン接着剤（のり）のような組織シーラントは当業 者に既知である。

本明細書中、そのようなンーラントは、実質的な改変なしに成長因子または成長 因子混合物を傷部位に到達させるための担体ベヒクル（媒体）として作用し得、 そして、その接着性または吸着特性の故に成長因子補充組織シーラントが傷の治 癒を加速するのに十分な期間、該部位への接触を維持することができる、任意の 組織シーラントまたは接着剤を包含する。

本明細書中、成長因子補充組織シーラントとは、少なくとも１個の成長因子、ま たは傷の治癒を加速、促進または改善する他の成分が傷治癒の加速、促進または 改善に有効な濃度になるよう添加されている組織シーラントである。成長因子補 充組織シーラントはまた薬物、抗生物質、抗凝固剤および、１）組織シーラント 内の成長因子の生物学的活性を強化、刺激または仲介する、または２）シーラン ト内の成長因子（類）の生物学的活性を阻害または破壊するかもしれない、成長 因子補充組織シーラントの活性を減少する化合物等の他の成分をも含有していて よい。

本明細書中、強化化合物は組織シーラント内の成長因子の生物学的活性を仲介す るか、さもなくば増加する化合物である。ヘパリンはＨＢＧＦ−１の生物学的活 性を強化する化合物の例である。

本明細書中、阻害性化合物とは、組織シーラントの成分の好ましくない活性であ って、組織シーラント中の成長因子または因子類の生物学的活性を干渉または阻 害する活性を阻害、干渉または破壊する化合物である。阻害化合物はその効果を 、成長因子を破壊から保護することで表すであろう。しかしながら、阻害性化合 物は成長因子補充フィブリン接着剤の傷治癒特性にとって必須のいかなる活性を も阻害しない。

本明細書中、成長因子は細胞増殖、細胞分化、組織再生、傷の治癒および／また はあらゆる発展または増殖工程を制御または仲介するあらゆる可溶性因子を包含 する。成長因子は天然起源からの抽出、合成化学による製造、組換えＤＮＡ技術 またはウィルス不活化した成長因子（類）豊富化血小板放出物（ｒｅｌｅａｓａ ｔｅ）等、当業者既知の任意の他の技術を用いる方法によって製造することがで きる。

本明細書中、内皮細胞成長因子（ＥＣＧＦ）や酸性ＦＧＦという他の名称でも知 られているＨＢＧＦ−１は、ＨＢＧＦ−１αの前駆体であるＨＢＧＦ−１β、お よびＦＧＦのような頭が切断された形を含め、ＨＢＧＦ−１のあらゆる生物学的 活性形を指す。本明細書に引用する米国特許第４．８６８．１１３（Ｊａｙｅ　 ｅｔ　ａｌ、　）は各形のＨＢＧＦのアミノ酸配列を記載した。このようにＨＢ ＧＦ−１は、前駆体、頭部切断形またはＨＢＧＦ−１の生物学的活性を示す他の 改良形またはＨＢＧＦ−１のサブセットを包含する。

他の成長因子もまた、池の名称で当業者に知られている。従って、特定の成長因 子を１つの名称で引用するときは、当業者に池の名称で知られているそのような 因子、その生物学的に活性な前駆体、頭部切断形または改良形であって生物学的 に活性なものをも包含する。

本明細書中、生物学的活性とは、インビボまたはインビトロで特定の成長因子に 伴う活性の１つまたは全部を指す。一般に、成長因子は、有糸分裂誘発活性（増 殖誘発または維持の能力）並びに、分化および／または発展の維持を誘発する能 力を含む非有糸分裂誘発活性等、幾つかの活性を示す。加えて、成長因子は、そ れから増殖性および発展性工程が進む特定の細胞を送り込むが誘因することがで きる。例えば、適当な条件下、ＨＢＧＦ−１は内皮細胞を送り込み、それからの 血管の形成を指令することができる。この活性により、成長因子補充組織シーラ ントは、それにより特定の部位での血流と栄養供給を増大する手段を与える。

成長因子−補充組織シーラントの製造 本明細書に開示した、本発明の実施態様の実施に際しては、第一段階として、成 長因子および組織シーラントを選択しなければならない。それぞれは当業者既知 の方法で調製し得るか、その供給者から購入することができる。好ましい態様で は、成長因子を補充したフィブリン接着剤を調製する。

組織シーラントの調製 フィブリン接着剤のような、あらゆる組織シーラントを本発明に用いることがで きる。例えば、当業者に周知のフィブリン接着剤（米国特許Ｎｏ、　４．６２７ ．８７９．４゜３７７、５７２および４．２９８．５９８、これらを本明細書に 引用して導入する）は、ＩＭＭＵＮｏ　ＡＧ　（オーｘ　トＩＪ７、ウィーン） およびＢＥＨＲＩＮＧＷＥＲＫＥ　ＡＧ（ドイツ）のような、それの供給者また は製造業者から購入できる。あるいは、フィブリン接着剤は血漿または血漿成分 から容易に調製できる。選択した組織シーラントの特定の組成は、それがインビ ボで組織シーラントとして機能し成長因子（類）と傷を負った組織または血管移 植片との接触のための媒体として作用することができ、それにより傷の治癒また は内皮形成が促進または加速される限り、臨界的なものではない。

本明細書に例示した実験のために、新鮮な凍結血漿からの低温沈澱物からフィブ リン接着剤を調製した。成長因子のためのビヒクルとして用いたフィブリン接着 剤の成分には、以下の物が含まれる。フィブリノーゲン：フィブロネクチン：因 子Ｘｌｌ１．およびｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子。

本発明の好ましい実施態様では、フィブリン接着剤の製造に用いる溶液の全タン パク質濃度は約５−１５０ｍｇ／ｍｌである。さらに好ましい実施態様では、こ の調製溶液の全タンパク質濃度は約７−３５＋ｍｇ／＋ｍｌである。最も好まし ・い実施態様では、この調製溶液の全タンパク質濃度は約１７−２８ｗ＋ｇ／ｍ ｌである。

本発明の好ましい実施態様では、フィブリン接着剤の製造に用いる溶液のフィブ リノーゲン濃度は約４−１３５＋Ｉ１ｇ／ｍｌである。さらに好ましい実施態様 では、この調製溶液のフィブリノーゲン濃度は約６−３０ｍｇ／ｍｌである。最 も好ましい実施態様では、この調製溶液のフィブリノーゲン濃度は約１５−２５ ｍｇ／ｒａｌである。

成長因子の濃度は用いる成長因子によって変化するが、本発明の好ましい実施態 様では、成長因子の濃度はフィブリン接着剤の約１　ｎｇ／ｍ１−１　ｍｇ／ａ ＋１である。

さらに好ましい実施態様では、成長因子の濃度はフィブリン接着剤の約１μｇ／ ■１−１００　ｔｔ　ｇ／ｍｌである。最も好ましい実施態様では、成長因子濃 度はフィブリン接着剤の約５μｇ１０１−２０μｇ／ａ＋１である。加える成長 因子（類）の量は様々な濃度を試験し、どれが意図する目的、および適用部位に 有効であるものを選択することにより、実験的に決定することができる。

成長因子の調製 成長因子（類）またはその混合物は当業者既知の任意の方法で調製するか、市販 品を購入することができる。例えば、内皮細胞、線維芽細胞、上皮細胞、平滑筋 細胞、肝細胞、およびケラチノザイｉ・のようなある種の細胞型の増殖を刺激す る成長因子、および／または同じ細胞型の増殖、および平滑筋細胞の増殖をも阻 害する成長因子を含む成長因子から選択される。そのような選択は成長因子を補 充した組織シーラントを適用すべき特定の組織部位に依存する。例えば、ＥＧＦ を補充した組織ノーラットは目の傷への適用、および胃潰瘍の治癒の加速および 促進のための適用に好ましく、オステオゲニンを補充した組織シーラントは」折 および骨の破損の治癒の加速および促進のための適用に好ましい。

他の好ましい実施態様では、ＨＢＧＦ−１βを調製し、フィブリン接着剤に加え る。ＨＢＧＦ−１βまたはＨＢｃｐ−ｉαあるいはＨＢＧＦ−１の他の任意の活 性形は天然起源、遺伝子工学的に得られるＨＢＧＦ−１を発現する細胞またはそ の誘導体から精製するか、他の当業者既知の任意の方法で得ることができる。

ＨＢＧＦ−１βは組換えＤＮＡ法で調製された［ジャイら（Ｊａｙｅ　ｅｔ　ａ ｌ、　）　。

米国特許Ｎｏ、　４．８６８．１１３；ジャイら（Ｊａｙｅ　ｅｔ　ａｌ、）　 、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６２：１６６１２−１６６１７　（１９８７ ）］。簡単に述べると、ＨＢＧＦ−１βをコードするＤＮＡを原核性発現ベクタ ー（ｐＵＣ９の誘導体）にクローンし、大腸菌の細胞内で発現させた。

発現したペプチドを次いで高圧縮−説圧縮サイクルによる細胞崩壊装置ｆ（ディ スラブター）を用いて、圧力により細胞から放出させた。崩壊の後、細胞層をろ 過して除き、ヘパリンセファロースＴＭ、次いでＣＭセファロースｔによるイオ ン交換クロマトグラフィーを用いる標準的なタンパク質精製法で、上清からＨＢ ＧＦ−１βを精製した。

上記のＨＢＧＦ−１以外の、フィブリン接着剤に加えることができる他の成長因 子には、ＨＢＧＦ−２、ＩＧＦ−１、ＥＧＦ、、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−α、任意 の血小板誘導成長因子または抽出物、および任意の成長因子の混合物が含まれる が、これらに限定されない。例えば、血小板誘導抽出物は成長因子に富む供給源 であるが、これをＨＢＧＦ−１のような他の成長因子と一緒に、あるいはその代 わりに組織ノーラントに加えてもよい。

好ましい実施態様では、当業名既知の任意の方法で調製された血小板誘導抽出物 を組織シーラントに加える。そのような抽出物はフィブリン接着剤と一緒に用い るために血漿減少血小板から調製された。

ＰＤＷＨＶを調製し、フィブリン接着剤に加え〔もよい［ナイトンら（Ｋｎｉｇ ｌ＋ｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　Ａｎｎ、　Ｓｕｒｇ、　２０４：　３２２ −３３０　（１９８６）コ。簡単に述べると、ＰＤＷＨＧを調製するためには、 血液を抗凝固剤溶液にとり、血小板に富む血漿を冷蔵遠心で調製】る。血小板を 患離し、１−ロンビンで刺激すると、アルファ顆粒含有物が放出される。血小板 を除去し、有効濃度の残存抽出物を組織シーラントに加える。

成長因子−補充組織シーラントの他の成分それらは本質的に血漿画分なので、組 織シーラントは移しい数の成分を含有する成長因子と一緒に用いることが予期さ れでおり、そのあるものは、選択した成長因子（類）の活性を阻害するかもしれ ない。例えば、トロンビンはフィブリン接着剤の基本的な成分であるが、夕／・ バク質加水分解酵素としても作用し得、特異的にＨＢＧＦ−１βを開裂する。従 って、組織ノーランド中の選択した成長因子の生物学的活性を阻害、干渉または 破壊するような他の成分の作用から成長因子（類）を保護する、プロテｒ−ゼま たは阻害物質のような追加の成分を含有させることが必要である。

特定の阻害性成分（類）の選択は、以下に述べるように、組織ンーラント中の成 長因子（類）の生物学的活性を評価する方法を用いて実験的に決定されるであろ う。生物学的の評価の方法は当業者に既知である。

加えて、成長因子がその活性を確実に発揮するため１−１所望の活性を強化また は仲介する成分を包含させる必要があるであろう。例えば、ヘパリンはインビボ でＨＢＧＦ−１の生物学的活性を強化する［例えば、バーゲスら（Ｂｕｒｇｅｓ ｓ、　ｅｔ　ａｌ、　）　、　Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｂｅｔ　５８：５７ ５−６０６　（１９８９）参照ｊ。

本発明の成長因子を補充したシーラントはまた、薬物、他の化学物質、およびタ ンパク質等の他の成分を含有し２ていてもよい。これらには、抗生物質：活性化 プロティンＣ１ヘパリン、プロストラサイクリン（ＰＣｌ３）、抗トロンビンＩ Ｉ　Ｉ、　ＡＤＰａｓｅ、およびプラスミノーゲン活性化因子のような抗凝固剤 、デキサメタシンのような抗炎症性ステロイド類、カル／ラムチャンネルブロッ カ−のような心臓血管製剤、化学誘引物質、およびブビバカイン（ｂｕｐｉｖａ ｃａｉｎｅ）のような局所麻酔剤が含まれるがこららに限定されない。これらの 補充成分には、またポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはキメラ抗体 、またはその機能的な誘導体またはフラグメントが昌まれる。ぞれらは、例えば 、ＰＤＧＦ、および７・′またはＴＧＦ−βに対する抗体のような平滑筋の増殖 、または組織シーラントによる処置の領域内またはその付近の、他の望ましくな い細胞型の増殖、を阻害する抗体であってもよい。これらの抗体はまた抗がん、 抗血小板、または抗炎症性活性が必要な状況下でも有用である。一般に、その効 果または経済性が、部位特異的ナデリバリーにより改善されるような抗体であれ ば、どれでも、このフィブリン接着剤デリバリーンステムの利益を享受する。

成長因子補充組織シーラン［・の傷治癒特性を分析するだめの分析法特定の成長 因子補充組織シーラントが傷の治癒を加速または高めるが否かを確かめるために 、そしてそうするために最適な成長因子（類）濃度を選択するために、当業者既 知の、傷の冶疹を加速または促進する能力に関して組成物を試験する方法で、組 成物を試験する［例えば、ツボイら（Ｔｓｕｂｏｉ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　Ｊ 、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ。

１７２：２４５−２５１　（１９９０）；サングーら（Ｋｓａｎｄｅｒ　ｅｔ　 ａｔ、　）　、　Ｊ、＾−１＾ｃａｄ、Ｄｅｒｍａｔｏｌ。

２２ニア８１−７９１　（１，９９０）およびグリーンハーグら（Ｇｒｅｅｎｈ ａｌｇｈ　ｅｔ　ａｌ、　）　、八１．　Ｊ、　Ｐａｔｈ、　１３６：１２３５ 　（１９９０）参照］。組織シーラント中の選択した成長因子（類）の活性を評 価し得る任意のインビボおよびインビトロの両者の方法が使用できる。例えば、 ＨＢＧＦ−１βの活性は２つの独立したインビトロ分析法で評価されてきた。第 １では、成長因子を補充したフィブリン接着剤をプラスチック表面に充滴し、そ の浅い液層に懸濁した内皮細胞の内皮細胞の増殖を測定した。第２の方法では、 ＨＢ　Ｇ　Ｆ−１の存在下で培養した線維芽細胞への３Ｈチミジンの取り込みを 測定した。

インビボ分析では、モデル系としてマウスを用い、ＨＢＧＦ−１βを補充したフ ィブリン接着剤のインビボでの傷治癒促進の能力に関して試験した。この方法で はマウスの背領域で同じパンチバイオプシーを行い、それを、試験、処置対照群 および非処置対照群に分けた。試験群のマウスの傷は成長因子を補充した組織シ ーラントで処置した。処置対照群の傷は補充しないシーラントで処置した。非処 置群の傷は処置しなかった。検出可能な傷治癒が進行するに十分な期間の後、一 般に１週間から１０日後、マウスを殺し、各群の傷修復程度を組織学的に評価す るために、傷を負った組織を顕微鏡で調べた。

成長因子補充組織シーラントの細胞増殖の誘導能力、および細胞送り込み能力は 当業者既知のインビトロの方法でも評価することができる。例えば、上に記載し 、実施例で詳細に述べる成長因子の生物学的活性のインビトロ測定法を組織シー ラント組成物中の成長因子の活性の試験に用いることができる。さらに、候補の 阻害および／または強化因子の添加の効果も評価することができる。

一般に、阻害および／または強化化合物の添加の必要性は実験的に決定すること ができる。例えば、下記の実験例で記載したように、ＨＢＧＦ−１補充フィブリ ン接着剤中のＨＢＧＦ−１βは確率的な方法で開裂され、このことはフィブリン 接着剤製品の成分、多分トロンビン、がその原因であることを示している。ＨＢ ＧＦ−１と結合し、ある種のタンパク質加水分解からそれを保護することが知ら れているヘパリンを、ＨＢＧＦ−１補充フィブリン接着剤に加えた。かなり低濃 度のヘパリンを加えると、フィブリン接着剤に含まれる生物学的活性により破壊 されるはずのＨＢＧＦ−１βが開裂から保護された。従って、ＨＢＧＦ−１を含 む組織シーラント組成物はヘパリンまたはＨＢＧＦ−１のトロンビンまたはフィ ブリン接着剤中の他のタンパク質加水分解性成分によるＨＢＧＦ−１の開裂を阻 害する物質を加えなければならない。

同様に、選択した阻害勧賞の成長因子を組織シーラント組成物による分解からの 保護能力は当業者既知の任意の方法で評価することができる。例えば、ヘパリン の、フィブリン接着剤の必須成分であるＨＢＧＦ−１のトロンビンによる開裂を 阻害する能力を試験した。そのために、様々な濃度のヘパリンとＨＢＧＦ−１補 充フィブリン接着剤とを用意し、様々な時間インキュベートした。混合物中のＨ ＢＧＦ−１の生物学的活性を試験し、そのようなＨＢＧＦ−１の全体性をＳＤＳ ゲルのウェスタンプロットで確かめた。比較的低濃度、ヘパリン：　ＨＢＧＦ− １のモル比が約１：１で、ＨＢＧＦ−１のフィブリン接着剤中での分解の阻止に 十分であった。

特定の化合物を組織シーラント中の成長因子または成長因子類の生物学的活性の 強化、仲介または促進に用い得るか否かも、実験的に決定することができる。

成長因子で修飾した組織シーラントの内部の、または外部の傷への局所または内 部適用 臨床使用に先立ち、成長因子および組織シーラント、または成長因子を補充した 組織シーラントを滅菌するか、あるいは、ウィルス等のあらゆる病原性混在物を 不活化するために処置する。混在物を不活化する方法は当業者に周知であり、例 えば、溶媒−洗剤処理および熱処理［例えば、タボ−ら（Ｔａｂｏｒ　ｅｔ　ａ ｌ、　）　、　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅｓ、　２２：２３３−２３８　（１ ９８１）；　ビツキビッツら（Ｐｉｓｚｋｉｅｗｉｃｚ　ｅｔ　ａｌ、　）　、 @Ｔ ｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ　２８：１９８−１９９　（１９８８）参照］があるが、 これらに限定されない。

成長因子で修飾した組織シーラントは傷組織に直接適用される。典型的には、外 部の傷には、それを、傷の上からスプレーすることを含め、任意の手段で直接適 用することができる。それはまた、手術中に、内部へ適用することもできる。

それを骨等に、内部に適用した場合、血餅は時間と共に徐々に溶解する。

以下の実施例は例示のみを目的としており、本発明を制限する意図ではない。

実施例Ｉ ＨＢＧＦ−１を補充したフィブリン接着剤の調製血漿の低温沈澱画分から調製し たフィブリン接着剤を用いた。血漿はヒト血液を遠心して赤血球をベレット化し 、血小板を除去することで調製した。血漿を遠心し、低温沈澱物を集め、分画し てフィブリン接着剤を製造した。

ＨＢＧＦ−１をコードするＤＮＡを含有させたプラスミドを含む組換え大腸菌の ８００１１培養を調製した。誘導および３７℃１２４時間の培養の後、細胞を遠 心し上清を捨てた。細胞ペレットを０．１５Ｍ　ＮａＣ１を含有する２０ｍＭり ん酸バッファーｐＨ７，３（２５ｍｌ）に再懸濁した。懸濁した細胞を細胞ディ スラブターで破壊し、細胞質を５０００ｇで２０分間遠心して溶液から分離した 。

ペレットを捨て、可溶化ＨＢＧＦ−１βおよび他の細菌性タンパク質を含有する 上清ヘパリン−セファ０−スＴＭ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉ ｃａｌｓ、　Ｕｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）の直径２６Ｃｍ１高さｌＱｃｍの カラムに詰めた。カラムを５容量の２０ｍＭりん酸バッファー、ｐＨ７，３中の ０．１５Ｍ　ＮａＣ１で洗浄し、次いで２０ＩＩＩＭりん酸バッファー中の０． １５Ｍ　ＮａＣ１から２．０Ｍ　ＮａＣ１のグラディエンドで溶離した。

溶出液を２８０ｎｍのＵＶ吸光度により監視した。ＵＶ吸収物質の３ピークが溶 出し、それらをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。約１７．４ ００ダルトンでシングルバンドとして溶離した第３ピークは実質上純粋なＨＢＧ Ｆ−１βを含有していた。

ＨＢＧＦ−１βが混在する細菌性タンパク質を含まないことをさらに保障するた めに、成長因子活性を有する第３ピークを２０１Ｍヒスチジン、０．１５Ｍ　Ｎ ａｃｌ、ｐＨ７，５に対して１夜透析した。タンパク質２ｍｇをＣＭ−セファロ −スフ″″（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｕｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ月１１のイ オン交換カラムに詰めた。カラムを２０ＩＩＭヒスチジン、０．１５Ｍ　ＮａＣ １、ｐＨ７，５（１０カラム床容量）で洗浄し、２０＋ｏＭヒスチジン、ｐＨ７ ，５中、０．１５Ｍ　ＮａＣ１から２０ｍＭヒスチジン、ｐＨ７，５中、１．０ Ｍ　ＮａＣ１のグラディエンドで溶離した。溶出液を２８０ｎｍでのＵＶ吸収で 監視し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動でＨＢＧＦ−１βを同定した。

精製）（ＢＧＦ−１βの１−１０Ｍｇをフィブリン接着剤に加えた。

実施例２ ＨＢＧＦ−１のフィブリン接着剤中での安定性ＨＢＧＦ−１βがフィブリン接着 剤の成分であるトロンビンによって消化されることを防止するためにフィブリン 接着剤にある種の物質を加えることが必要であった。ＨＢＧＦ−１に吸着される ヘパリンを選択し、それがＨＢＧＦ−１を、トロンビンおよびフィブリン接着剤 の他のタンパク質加水分解的成分による消化から保護するか否かを決定するため に試験した。増大濃度のヘパリンの存在下でのＨＢＧＦ−１の安定性をめた。

ＨＢＧＦ−１９（１０Ｍｇ／ｍｌ）、トロンビン（２５０μｇ／ｍｌ）および増 大濃度のヘパリン（０，０，５，５，１０，２０および５０Ｕ／ｍｌ）を３７℃ でインキュベートした。インキュベーション溶液の一部を周期的にとり、凍結し 、−７０℃で以後の試験まで保存した。

インキュベージタンが完了した後、試料を解凍し、レムリ（Ｌａｅ關ｌｉ）　（ Ｎａｔｕｒｅ２２７：６８０（１９７０））の方法に従い１５％ＳＤＳポリアク リルアミドゲルで還元条件下、分離した。次いでゲルをニトロセルロースに電気 プロットし、ＨＢＧＦ−１βに相当するバンドをアフィニティー精製したポリク ローナルウサギ抗ＨＢＧＦ−１血清を用いて同定した。ウェスタンプロットは図 １に示されており、それには、１７，４００ｍｗにＨＢＧＦ−１βが認められる 。結果は、ヘパリン濃度、僅か５単位／ｍｌで、ＨＢＧＦ−１βはトロンビンに よる消化から防御されたことを示している。さらに、実施例３に記載するように 、その生物学的活性は変化しなかった。

実施例３ ヘパリンおよびトロンビンの存在下でＨＢＧＦ−１βをインキュベージタンした 後の生物学的活性実施例２に記載したように、ヘパリン５単位／ｍｌを含有する インキュベーション混合物中のＨＢＧＦ−１βの生物学的活性を、ＮＩＨ３Ｔ３ 細胞への３Ｈチミジンの取り込み分析で測定した。

ＮＩＨ３Ｔ３細胞を９６ウエルプレートに入れ、０５％ウシ血清（ＢＣ３゜ＧＩ ＢＣＯ，グランドアイランド、ニューヨーク）を加えたダルベツコの改良培地（ ＤＭＥＭ：ＧＩＢＣＯ，グランドアイランド、ニューヨーク）中で、３７℃、飢 餓条件下、細胞が３０−５０％全面成長するまで培養した。２日後、実施例２で 調製した試料から得た様々な希釈度のＨＢＧＦ−１を、培地を変えずに各ウェル に加えた。負対照には成長因子の代わりに希釈液（インキュベーション緩衝液） を加え、正対照には、ＨＢＧＦ−１試料の代わりに増殖に必要な成長因子を含有 する、１０％ＢＣ３含有ＤＭＥＭを加えた。

３７℃で１８時間インキュベーションした後、３Ｈチミジン（０，２５μｃｉ： 比活性６．７μＣｉ／ｍｌ）を各ウェルに加え、３７℃でさらに４時間インキュ ベーションした。プレートをりん酸緩衝化食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）で洗浄し、１０ ％冷トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）０．５ｍｌで、４℃で１５分間固定化した。ＴＣ Ａを除去し、プレートをＰＢＳで洗浄し、酸で沈澱可能な物質を室温で１時間、 ０．ＩＮ水酸化ナトリウムを０．５■ｌ／ウエル用いて可溶化した。試料をシン チレーションバイアルに移し、バイアルあたり、１０＋１のシンチレーション液 （Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、＾ｑｕａｓｕｒｅＴＩ′）を加え た。

結果を図２に示すが、これはトロンビンおよびヘパリンの存在下でインキュベー トされたＨＢＧＦ−１が、その生物学的活性を保っていることを示している。

観察されたチミジン取り込みの濃度依存性はインキュベーション時間に無関係で あり、成長因子の濃度の関数としての細胞増殖の依存性に関する予測の典型であ った。成長因子は、典型的に、細胞増殖が最大になる至適濃度を表している。

内皮細胞の増殖の観察により、トロンビンおよびヘパリンの存在下でのＨＢＧＦ −１の生物学的活性も測定した。ペトリ皿の表面をＨＢＧＦ−１補充フィブリン 接着剤で満たした。内皮細胞を浅い層で加え細胞の数を数えた。時間と共に細胞 の数は増えた。加えて、細胞は容器内に結集するように見えた。

従って、ＨＢＧＦ−１は、トロンビンの分解作用がらＨＢＧＦ−１を保護し、ま た、成長因子を補充したフィブリン接着剤中のＨＢＧＦ−１の生物学的活性を増 強し得るヘパリンを含有するフィブリン接着剤中でその生物学的活性を維持して いる。

実施例４ ＨＢＧＦ−１は、フィブリン接着剤凝固物から、濃度および時間の関数として拡 散する ５ｍｌのプラスチック製試験管中でＩＯＵ／ｍｌヘパリンおよびトロンビンを含 有するフィブリノーゲンコブレックス０．３ｍｌと４０ｍＭＣａＣｌ２とを混合 することにより、フィブリン接着剤凝固物が形成された。４本の試験管に下記の ものを入れた。

Ａ：　０．５Ｕ／＋＋１トロンビンおよび１０μｇ／ｍ１ＨＢＧＦ−１Ｂ　：　 ０．５ＬＴ／ｍ１）ｏンヒンオよび５（ｂＺｇ／ｍ１ＨＢＧＦ−１Ｃ：５Ｕ／Ｉ １１トロンビンおよび１０μｇ／１ｌＨＢＧＦ−１Ｄ＋　５Ｕ／ｍｌトｏンビン および５０μｇ／ｍ１ＨＢＧＦ−１凝固物を０．２Ｍヒスチジン緩衝液、ｐ）１ ７．３で覆った。２時間毎に重層した緩衝液試料３０μｍを採取し、ウェスタン プロットにかけた。

実験結果は、凝固物からのＨＢＧＦ−１の拡散は、時間およびその凝固物中の濃 度の関数であり、凝固物中のトロンビンの濃度は凝固物からのＨＢＧＦ−１の放 出速度に影響しないことを示した。

実施例５ 成長因子を補充したフィブリン接着剤中でのヒト謄静脈内皮細胞の挙動酸性線維 芽細胞成長因子（ＦＧＦ−１）を補充したフィブリン接着剤のヒト内皮細胞への インビトロでの効果を研究するために、これら細胞の浮遊液を、フィブリノーゲ ン約９ｆｆｉｇ／ｍｌおよび０．２５ＮＩＨ単位／ｍｌのトロンビンを含有する フィブリン接着剤２．５ｍｌが均等に噴霧されている直径１０ｃｍのペトリ皿に 加えた。フィブリン接着剤は下記のように補充されていた。

Ａ：成長因子不添加 Ｂ　：　１１００ｎ／＊１の活性な、野生型ＦＧＦ−１を添加；Ｃ：　１００ｎ ｇ／ｍｌの不活性な、突然変位型ＦＧＦ−１を添加：あるいはＤ　＋　１０ｎｇ ／ｍｌの活性な、野生型ＦＧＦ−１を添加。

細胞をフィブリン接着剤層に蒔き、１０％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ中で ７日間維持した。

生物学的に活性なＦＧＦ−１（図３および４）を補充したフィブリン接着剤と接 触した場合、細胞は長くなり、効率良（増殖した。補充されていないフィブリン 接着剤（図５）または生物学的に不活性なＦＧＦ−１，（図６）と接触した場合 には、細胞は長くなったが、増殖速度は比較的遅かった。

実施例６ ヒト謄静脈内皮細胞のフィブリン接着剤中での挙動ヒト謄静脈内皮細胞の増殖を 研究するために、１ｍｌあたり１０５またはそれ以上の細胞をタンパク質濃度４ ｍｇ／ｍｌのフィブリン接着剤中に包理した。フィブリン接着剤中のトロンビン 濃度は、０．６ＮＩＨ単位／ｍｌに調節した。全実験で用いた培養培地は１０％ ウシ胎児血清、１０ｕｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌベニンジン 、ｌｎｇ／ｍｌ酸性線維芽細胞成長因子およびＩＯＵ、／＋１ヘパリンを含有す るＭ１９９　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、 　ＭＯ）であった。

２４時間以内に、フィブリン接着剤中の細胞は長くなり、多足（ｍｕｌｔｉｐｏ ｄｉａｌ）となり、それらが相互に接触すると細胞ネットワークを形成した（図 ７）。この成長は少なくとも５日間持続した。図８は４８時間後のその状態を示 す。

対照として、フィブロネクチン１０μｇ／ｃｍ”で被覆した表面で同じ細胞浮遊 液を培養した。対照細胞は丸石形となりこの形態を少なくとも５日間維持した。

図９および１０は、それぞれ、２４時間および４８時間後のその状況を示す。

実施例７ フィブリン接着剤中でのＰＭＥＸＮＥＯ−３Ｔ３−２．２細胞の挙動ＰＭＥＸＮ ＥＯ−３Ｔ３−２．２細胞は遺伝子操作されたタンパク質を発現し得る、改変さ れたゲノムを有する線維芽細胞である。これらの細胞のフィブリン接着剤中での 挙動を調べるために、１０５細胞／ウエルを以下の３条件下で培養した　（１） フィブリン接着剤に包理；　（２）フィブリン接着剤の表面；および（３）フィ ブリン接着剤不在下（対照）。実験は２４ウエルプレート中、１０％ウシ胎児血 清（ＥＣ５）を補充したＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、 、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）中で２回ずつ行った。フィブリン接着剤のタ ンパク質濃度は４ｍｇ／ａ＋１であった。１．５％ＦＣ８を補充して同じ実験を 行い負対照とだ。

１０％ＦＣ３を補充した培地で３群の細胞を培養し全面成長に達した。培地に１ ５％ＦＣ３を補充した負対照実験では、細胞はフィブリン接着剤の存在下で成長 し、少なくとも５日間は生存したが、それがないと成長、生存しなかった。

しかしながら、それらの成長は１０％ＦＣ３補充フィブリン接着剤中での方が、 １．５％ＦＣ３補充フィブリン接着剤中でのそれよりも早がった。フィブリン接 着剤が存在しない場合には、１．５％ＦＣ３補充培地では、細胞は４８時間以内 に死滅した。生存の基準は被検細胞を新鮮な１０％ＦＣ３補充培地に移したとき 、増殖する能力とした。

実施例８ ヘパリン結合１型成長因子（ＨＢＧＦ−１）の予備処理による、膨張した（ｅｘ ｐａｎｄｅｄ）ポリテトラフルオロエチレン移植片の促進された内皮形成２つの 研究により、血液−接触生物材料を内皮細胞（ＥＣ）　ミｌ−ゲンで予備処理す ると内皮形成が促進されることが証明された。最初の研究は既知の脈管形成因子 であるＨＢＧＦ−１を補充したフィブリン接着剤懸濁液を、膨張したポリテトラ フルオロエチレン（ＰＴＦＥ）移植片に適用し、次いでウサギの大動脈に移植し 、そのインビボでの流失（崩壊）特性を調べた。

一般に、改良フィブリン接着剤は、移植片の内面および外面に、約ｌｎｇ／ｃｍ ２のヒト組換え”５ｌ−ＨＢＧＦ−１，２０ｎｇ／ｃｍ”ブタ腸粘膜ヘパリン、 および２．８６ｍｇ／　ｃ　ｍ２フイブリノーゲンを、２．８６ｘｌＯ−’Ｕ／ ｃｍ”の再構成された、市販のヒトトロンビン（１００ＯＵ／ｍｌ）に加え、重 合を誘導することで製造した。

１２５ＨＢＧＦ　１は特に下記のようにして調製した。

フィブリノーゲンは、フィブリノーゲン５００ｍｇをＰＢＳ２５１１１に再構成 し、ＰＢＳ中、フィブリノーゲン濃度を２０ｍｇ／ｍｌにすることで調製した。

この溶液３ｍ１（フィブリノーゲン６０■ｇ含有）を１２のプラスチック製エッ ペンドルフ管に入れ一７０℃で維持した。これら各部分を個別に用いた。

トロンビンは市販の濃度１０００Ｕ／ｍｌのトロンビン（Ａｍｏｕｒ　Ｐｈａｒ ｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｋａｎｋａｋｅｅ、　ＩＬ）を滅菌溶液で１ ：１０に希釈して濃度１００Ｕ／ｍｌに再構成した。このトロンビン溶液をさら に１．１０希釈してＩＯＵ／ｍｌ溶液を得た。

ウシヘパリン（Ｕｐｊｏｈｎ、Ｋａｌａｉａｒｅｏ、　Ｍｌ）は、］、０００Ｕ ／ｍ＋の製品を通常の食塩水で１・１０００希釈して再構成した。

再構成したフィブリノーゲン１および４８／１００　（１，４８）ｍｌｌプラス 再構成ヘパリン６３エ レーノヨン管中で混合した。混合物を次いで３ｍｌのプラスチック製注射器（シ リンジ）で吸引した。再構成トロンビン５社をガラスシンチレーション管に入れ た。

膨張したＰＴＦＥａ織移植片の１端をプラスチック製３方コック付きノズルの上 に置き、２−０絹タイ（ｔｉｅ）でその位置に確保した。次いでＰＴＦＥを、３ ｘ３ｃｍ四方のパラフィイルム１で強化し、次いで垂直な血管鉗子でそれをその 位置に止め、防水シールした。第２の２−〇絹タイをコックの隣のバラフィルム の上に位置させさらにシールした。次いで、垂直な血管鉗子を用いて２ｍｍ離れ たＰＴＦＥ／パラフィルムを縛り、この端をシールした。

上記のようにして調製した当量のフィブリノーゲン溶液およびトロンビン溶液を 混合し約３０秒間反応させると、その時点で重合が起こった。トロンビン−重合 フィブリノーゲンは不透明であった。（この時間因子はおよそであり、トロンビ ンの口・ットにより変化する。適当な重合時間の長さは混合物の不透明さを観察 することで決定できる。）トロンビン／フィブリノーゲン混合物をｌｃｃンリン ンに吸引した。（注意　この移植片の容量は０．４２ｎｌである。これ以上の容 量の移植片には、より大きいシリンジが必要である。）シリンジをコックに付け 、ＰＴＦＥの狭い隙間から「水滴」が見えるまで、手で５秒間かけて混合物を注 入し、ＰＴＦＥとバラフィルムＴ１″の間の空間を満たした。ＰＴＦＥに向けて ３方コツクを３分間閉じ、コックの上のＰＴＦＥの端の結紮糸をスケ−プル（ｓ ｃａｐｅｌ）剃刀で切断した。コックからＰＴＦＥ移植片／バラフィルムを除去 し、止血鉗子を用いてバラフィルムエンベロープからＰＴＦＥを除去した。残存 する成長因子を補充しまたフィブリン接着剤を移植片の管腔から清掃するために 、移植片の腔が完全にきれいになるまで、Ｎｏ，３塞栓切除カテーテルを５回、 移植片を通って通過させた。成長因子補充フィブリン接着剤で処理したＰＴＦＥ 移植片を約１２時間、層状流動フード（ｌａｍｉｎａｒ　ｆｌｏｗ　ｈｏｏｄ） の下で一夜乾燥させた。処理した移植片を次いで移植のために準備した。

ＨＢＧＦ−１を補充したフィブリン接着剤を内径３４ｍｍ（各端は２４ｍｍ＋５ ｍｍ）ｘ３ｍｍの薄い壁の膨張ＰＩＴＦ移植片に加圧潅流し、移植片の内腔を被 覆し節を通って移植片の外側表面に至らしめた。上記のごとく、移植片の腔を清 掃した。次いで移植片を２４頭のニューンランドホワイトラッピト（２４、３− ５Ｋｇ）の腎臓下方（ｉｎｆｒａｒｅｎａｌ）腹部大動脈に移植した。最初の研 究では、０時（手術による損失を補正するため）、および５、３ｏおよび６０分 、および１、７、１４および３０日後に動物を殺し、標本を体外移植（ｅｘｐｌ ａｎｔ）　シた。

ガンマ計測で残存放射能を測定した。突発的な遅延を補正した、残存＋２５１　 ）（ＢＧＦ−１をゼロ時の値の％ととして表した。

１２’Ｉ−ＨＢＧＦ−１の流出は古典的な動力学に従い、最初は循環のりエスタ ブリッシュメント（再達成）（％／分＝−２４．１、５−６０分の間）を伴う急 速な損失、次いで１時間後（％／分＝−０．０３）遅い損失があり、１週間後の 残存が１３．４％±６．９％、３０日後の残存は３．８％±１．１％であった。

第２の研究では、適用したＨＢＧＦ−１補充フィブリン接着剤の、犬の大動脈− 腸骨位置に移植した、広範囲に膨張した部間距離６０μｍの膨張ＰＴＦＥ移植片 の内皮形成速度．これら内皮細胞の時間の関数としての増殖速度；および観察し た内皮細胞増殖への、ＨＢＧＦ−１とフィブリン接着剤の相対的寄与の影響を評 価した。３群の、強化されていない５０ｘ４ｍｍの膨張ＰＴＦＥ移植片を１２匹 の大の大動脈腸骨部位に移植した。１群（ｎ＝６）はヘバリ：ノ２０ｕｇ／ｃｍ ２、フィブ＋）／−ゲン２．８６ｍｇ／ｃｍ２およびヒトトロン・ビニ／２．　 ８　６　ｘ　］　Ｏ−”Ｕ／ｃｍ２プラスＨＢＧＦ−１　１ｎｇ／ｃｍ２を含有 する。２群（ｎ＝３）はＨＢＧＦ−１を含有しない、同じフィブリン接着剤を含 有する。３群（ｎ＝３）の組成は同じであるが、非処理対照移植片を用いる。ト リチル化チミジン（３Ｈ−ＴｄＲ：０．５Ｃｉ／ｋｇ）を体外移植の１０時間前 に注入した。光学および電子顕微鎖、因子Ｖ　Ｉ　Ｉ　Ｉ免疫組織化学、および ランダムハイパワーフィールド（高出力電界）での内皮細胞増殖のオシファス（ ｅｎ　ｆａｃｅ）オートラジオグラフィーのために、７および２８日目に移植片 を体伺移植した。各移植片はその移植片がどの処ぼ群からのものであるかを知ら ない３人の「Ｎ目（ブラインド）」観察者により観察された。内皮細胞増殖にお ける違いを２方向ＡＮＯＶＡおよび独立を一試験で統計学的に解析した。

７ｅｉｒｔ＝：、フィブリン接着剤およびＨＢＧＦ−１補充フィブリン接着剤の 両方の３３％が内皮細胞の非接触焦点を示した（図１１）。対照移植片の表面に はフィブリン凝固が残っていた。２８日目には、各１−（　Ｂ　Ｇ　Ｆ　−　１ 補充フィブリン接着剤が、広範な毛細管の内部成長（ｉｎｇｒｏｖｔｈ）と融合 した内皮細胞が形成された血液接触表面を示し、それは、他の２群には決して見 られなかった（図１１および１２）。図１２は、２８日目の非処理移植片が表面 に認め得る内皮細胞を殆ど有していなことを示している（パネルＧ）。フィブリ ン接着剤のみで処理した移植片の表面的３３％が内皮細胞で覆われ、このことは フィブリン接着剤単独処理でも幾分、内皮細胞の再形成が促されることを示して いる（パネルＨ）。しかしながら、■（ＢＧＦ−１で補充したフィブリン接着剤 で処理した移植片（パネルＩ）は完全（〉９５％）に円石形の特性を示す内皮細 胞に覆われているようである。

このように、フィブリン接り剤による成長因子到達の組み合わせによって２、基 本的に、血管移植片を非トロンホゲン性内皮細胞による裏打ちで完全に覆うこと が１゛きた１．ｔンファスオートランオグラフィーにより、池のすべての群と比 較して、時間および移植処理の関数として、２８日目のＨＢＧＦ−４補充フィブ リン接着剤移植片におけるＥＣ類のＤＮＡへのｇＨ−ＴｄＲの取り込みの統計的 な増大（ｐく　０５）が明らかになった。

これらのデータは、ｉ開用１１１６０μの膨張ＰＴＦＥ移植片へのＨＢＧＦ−１ 補充フィブリン接着剤の加圧潅流が、毛細血管の内部成長とＥＣ増殖の増大を介 して内皮形成を促進することを示すものである。

これらの研究は、直径の小さい血管移植片のヒトでの自発的な内皮形成の促進の 可能性、および移植内皮細胞のより迅速な融合の誘発の可能性をも示している。

実施例９ フィブリン接着剤と一緒に用いる血小板−誘導抽出物の調製血漿を減少した血小 板を調製し、ペレット化した。上清血漿を除去した。ベレット血小板を洗浄し、 ５０ｍＭヒスチジンと０．　１　５Ｍ塩化ナトリウムを含有する緩衝液、ｐＨ６ ．５に懸濁し、ウソトロンビンで処理した。処理後、上清を遠心して集め、一部 を一８０℃で凍結した。抽出物を解凍し・、フィブリン接着剤または他の組織シ ーラントと混合した。

実施例１０ 成長因子補充フィブリン接着剤のインビボでの傷の治癒への効果糖尿病マウスの 傷の回復への成長因子補充フィブリン接着剤の効果を評価した。

６匹の各試験マウスの背部分から得た２個の全厚み６ｍｍの生検（バイオプシー ）を、ＨＢＧＦ−１β５μｇを加えたフィブリン接着剤で満たした。６匹のマウ スの同じ生検は無処置のままで置き、６匹の対照マウスの場合には、補充されて いないフィブリン接着剤を満たした。９日後、マウス全部を殺し、各傷部位およ び周囲の皮膚から厚さ５ミクロンの切片の病理学的標本を調製し、ヘマトキシリ ンおよびエオシンで染色した。

各試料の傷修復の程度を３人の訓練された分析者による「盲目」試験（それがど の処置群から得られたかが分からない）により評価し、彼らはコラーゲン沈着、 上皮細胞再形成、粒状組織の厚みおよび炎症細胞の密度、線維芽細胞および毛細 血管等を評定した。各試料は否から完全な修復に至るＯがら１５までの評点を課 された。補充されないフィブリン接着剤で処理した傷由来の試料は一貫しＣ最も 評点が低く、処理されない傷または成長因子で補充したフィブリン接着剤で処理 した傷から得た試料は最高の評点を与えた。

実施例１１ 骨誘導物質のデリバリ−ビヒクルとしてのフィブリン接着剤フィブリン接着剤の ＤＢＭを含有する能力および細胞をフィブリン接着剤−Ｄ８Ｍマトリックスに移 動させる能力を研究するために、フィブリン接着剤とＤＢＭの混合物から作成し たペレットを筋肉内（胸筋）およびロングエバンスラットの頭蓋冠の直径８ｍｍ の欠損に移植した。フィブリン接着剤−ＤＢＭペレットは、直径７ｍｍ、高さ０ ．７ｍｍのギャップのある円筒状プレスを用いて調製した。

ヒト骨から得たＤＢＭ２５＋ａｇをＦＧ６０ｕｇと混合し、円盤状ペレットに打 錠した。フィブリン接着剤は１■１あたりフィブリノーゲン約４５＋ａｇとトロ ンビン１５単位を含有していた。ペレットの移植から５日後、動物を殺し、ペレ ットを周囲の筋肉および骨組織と一緒に収穫した。試料を円盤の真ん中で切断し 組織学的に分析した。これら標本の組織学的解析は、移植したペレットがあらか じめ決めた形のマトリックスを与えていることを示した。マトリックスには孔サ イズの大きいチャンネルがあり、それを通して骨誘導細胞が移植内に侵入してい た。フィブリン接着剤−ＤＢＭを、フィブリン接着剤とＢＭＰ類を補充したヒト ＤＢＭを用いて作成すれば、体の骨形成細胞が多孔性マトリックス内に浸透し新 しい骨を形成するであろう。

一般に、フィブリノーゲンは、最終濃度として３　６０ｍｇ／ｍｌ、最適濃度３ ０■ｇ／ｍｌ、で存在しなければならない。ＤＢＭは、およその濃度として約５ ０５０−５Ｏ０／ｍｌ存在しなければならない。骨誘導性成長因子、またはＢＭ Ｐ類は、約１１−１Ｏ０ｕ／ｍｌの濃度で存在しなければならない。材料を注意 深く、非結合のギャップに到達させねばならない。新しい骨はほぼ４−６週間で 再生するはずである。フィブリン接着剤−ＤＢＭマトリックスの形は新しく形成 された骨の形態学の決定のために示されたものである。従って、可能なら、フィ ブリン接着剤−ＤＢＭマトリックスは予め決定した形に形成されるべきである。

液体形のフィブリン接着剤−ＤＢＭマトリックスを、不規則な形の欠損に到達さ せるか注入し、それが満たされた領域で重合し、骨の形成を促進させることがで きる。

修飾は当業者にとって自明のことなので、本発明は添付の請求項の範囲にのみ限 定される意図ではない。

Ｏｕ／ｍｌヘパリン 、・　暑噛−−−Ｉｅ− １０　ｕ／ｍＬ　ヘパリン ５０　ｕ／ｍｌ　ヘバリン ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、５ ＦＩＧ−７ ＦＩＧ、８ ＦｊＧ、９ ＦＩＧ、１０ パネルＡ　パネルＢ パネルＣパネルＤ パネルＧ 国際調査報告 ｍｌ＊ＩＲａ＋１１１１１−＾ｅｅｌ＋ｅａａａ、１Ｉｌａ　鯉１ｎ＋ｍｓ＋ｍ −１゜＋２１　ｓ　ｐｒｎｔ＝ｐ曲、　ｓｒ＋ｒｌ　ｓｎ　ｎｐｐｎｒｎｔ、ｕ ＊　ｒ＋ｒ　ｍｅａｎＲｐ＋ｐ＊ｒ１ｆｉｒｘｌ＋ｙｄｐｎ１ｑｎ−ｄｆｏｒ　 Ｉ＋１１ｒｒｙ１ｎｇ　ｎｕｔ、　ｐ＋ｓ１ｄ　ｐｒｏｅ＝ｍ部、　ｎｒ：＾ｄ ｒｌ（ｔｉｎｒ＋５ｌｌｙ、ｒ＋＋ｒｒ−１１１ｒ＋ｉ　ｒｅｄ　Ｒｔｓｔ師Ｐ ＊ｔｓ＋ｎｔ　ａｎｒ＋　Ｔ’ｒｓｒｌ＊ｍａｒｋＯｆｆ１ｒｐｒｃｓ＊ｔｒ１ ＋＋會１ｎｎ、ｐｒｐ＋ｃｒ１ｃｐｐ轡ｒ胃ｉｔ、＊↑ｈｓｆｏｌｌｎｖ１ｎｇ ｒ！１ＭＲ？１１ｒ＋ｌＩＦＭ{ｒ＋ａｒ＋ｆ ｔｈｅ　ｒｌｓｉ糟会ｄ　１ｎｖ＊ｎｔ、１ｎｎ：ｆＪｌ　ｓ　ｐｒｒＡ間ｔ、 ａｎｄ　ｓ　ｐ＋−ｎｒ＝部ｐ＋　仲５４ｉｆｉｒ：ａｌｌｙ　５ｄｓｐ陳ｄ　 ｆｒｙ　ｔｈｅ闘ｎｏｆＲ＋＋ｒｕｒｓ＋　ｎｆ　藺ｔｒｌ　ｐｒｒ＋ｄｕ酎、 　ａｎｒｌｆｉｌ　Ａ　ｐｒｎｌｌｌｌ酎、　ａｎｄ８１１＋１＋１Ｑ　ｎｆ　 ｔ、ｈｅ　ｐ＋ｓ１ｄ　ｐｒ品＋１１”ｔ　、　ＡＲＷｈｊ’ｒＰ　ｇ唐Pｄ ｕ帥ａＩＩＩｒｌｓｉｍ＊ｒｌ　ｒ：５ｎｎｎｔ　ｈｅ　ｐｒａｃ＝ｔ１ｒｐｄ ｗｉｔ）＋　ｎｎｒｎｈｍｒｍａｔｅｒｉａｌｌｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ、ｐｒ ｎｒｌｎｉｒ、。

フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３７／３６　 ＡＤＡ　８３１４−４ＣＣ１２Ｎ　５１０８ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、　ＳＥ）、０Ａ （ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ，ＳＮ 、　ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ５，ＦＩ、 　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ。

ＫＲ，ＬＫ、ＭＣ，ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ，ＳＤ、ＳＵ ＦＩ （７２）発明者　ヌネツ、ハーナン・エイアメリカ合衆国２０８５５メリーラン ド、ダーウッド、プライアープイル・ロード１６７２０番 （７２）発明者　ドローハン、ウィリアム・エヌアメリカ合衆国２２１５２バー ジニア、スプリングフィールド、オークフォード・ドライブ８４１７番 （７２）発明者　バーゲス、ウィルソン・エイアメリカ合衆国２０８５５メリー ランド、ゲイザーズバーグ、セダー・レーン１剖件

Claims (36)

【特許請求の範囲】
1. １．組繊シーラントと少なくとも１個の成長因子を有効濃度含有する、傷の治癒 、血管プロテーゼの内皮形成、またはインビトロでの動物細胞の増殖および／ま たは分化の技術を促進する組成物であって、ここに該濃度は、傷の治癒、血管プ ロテーゼの内皮形成またはインビトロでの動物細胞の増殖および／または分化を 加速し、さもなくば促進するのに有効な濃度である。
2. ２．さらに、阻害性化合物および強化性化合物からなる群から選択される少なく とも１個の化合物を有効濃度含有する請求項１の組成物、ここに該阻害性化合物 とは該成長因子のなんらかの生物学的活性に干渉する、該シーラントの活性を阻 害する化合物であり、該強化化合物とは、該成長因子のなんらかの生物学的活性 を強化、仲介または促進する化合物であり、ここに該濃度は、該阻害、強化、仲 介または促進を達成するに有効な濃度である。
3. ３．該組織シーラントがフィブリン接着剤である請求項１の組成物。
4. ４．該成長因子が血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）、インシュリン−結合成長因 子−１（ＩＧＦ−１）、インシュリン−結合成長因子−２（ＩＧＦ−２）、上皮 成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子−α（ＴＧＦ−α）、形質転換成長因子 −β（ＴＧＦ−β）、血小板因子４（ＰＦ−４）、オストゲニンおよび他の骨成 長因子、コラーゲン成長因子、ヘパリン結合成長因子−１（ＨＢＧＦ−１）、ヘ パリン結合成長因子−２（ＨＢＧＦ−２）および該成長因子類の任意のものの生 物学的に活性な勝導体からなる群から選択される請求項１の組成物。
5. ５．少なくとも１個の成長因子が血小板誘導抽出物の形で提供される請求項１の 組成物。
6. ６．該成長因子がＨＢＧＦ−１またはその生物学的に活性な誘導体である請求項 １の組成物。
7. ７．該阻害性または強化性化合物がヘパリンである請求項２の組成物。
8. ８．傷の治癒を促進する方法であって、組織シーラントと有効濃度の少なくとも １個の成長因子とを含有する組成物を傷に適用することからなる方法。
9. ９．該組成物が阻害性化合物および強化性化合物からなる群から選択される少な くとも１個の成分を有効濃度含有する請求項８の方法、ここに該阻害性化合物と は該成長因子のなんらかの生物学的活性に干渉する、該シーラントの活性を阻害 する化合物であり、該強化化合物とは、該成長因子のなんらかの生物学的活性を 強化、仲介または促進する化合物であり、ここに該濃度は、該阻害、強化、仲介 または促進を達成するに有効な濃度である。
10. １０．該組織シーラントがフィブリン接着剤である請求項８の方法。
11. １１．該成長因子が血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）、インシュリン−結合成長 因子−１（ＩＧＦ−１）、インシュリン−結合成長因子−２（ＩＧＦ−２）、上 皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子−α（ＴＧＦ−α）、形質転換成長因 子−β（ＴＧＦ−β）、血小板因子４（ＰＦ−４）、オストゲニンおよび他の骨 成長因子、コラーゲン成長因子、ヘパリン結合成長因子−１（ＨＢＧＦ−１）、 ヘパリン結合成長因子−２（ＨＢＧＦ−２）および該成長因子類の任意のものの 生物学的に活性な誘導体からなる群から選択される請求項８の方法。
12. １２．該傷が内部の傷である請求項８の方法。
13. １３．該傷が外部の傷である請求項８の方法。
14. １４．該内部の傷が骨折である請求項１２の方法。
15. １５．少なくとも１個の該成長因子がオストゲニンである請求項１４の方法。
16. １６．少なくとも１個の該成長因子が上皮成長因子である請求項１３の方法。
17. １７．該成長因子がＨＢＧＦ−１またはその生物学的に活性な誘導体である請求 項８の方法。
18. １８．該阻害性または強化性化合物がヘパリンである請求項９の方法。
19. １９．該成長因子がＨＢＧＦ−１またはその生物学的に活性な誘導体である請求 項９の方法。
20. ２０．該阻害性または強化性化合物がヘパリンである請求項１９の方法。
21. ２１．血管プロテーゼの内皮形成を促進する方法であって、組織シーラントと有 効濃度の少なくとも１個の成長因子とを含有する組成物を血管プロテーゼに適用 することからなる方法。
22. ２２．該組成物が、さらに阻害性化合物および強化性化合物からなる群から選択 される少なくとも１個の成分を有効濃度含有する請求項２１の方法、ここに該阻 害性化合物とは該成長因子のなんらかの生物学的活性に干渉する、該シーラント の活性を阻害する化合物であり、該強化化合物とは、該成長因子のなんらかの生 物学的活性を強化、仲介または促進する化合物であり、ここに該濃度は、該阻害 、強化、仲介または促進を達成するに有効な濃度である。
23. ２３．該組織シーラントがフィブリン接着剤である請求項２１の方法。
24. ２４．該成長因子が血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）、インシュリン−結合成長 因子−１（ＩＧＦ−１）、インシュリン−結合成長因子−２（ＩＧＦ−２）、上 皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子−α（ＴＧＦ−α）、形質転換成長因 子−β（ＴＧＦ−β）、血小板因子４（ＰＦ−４）、オストゲニンおよび他の骨 成長因子、コラーゲン成長因子、ヘパリン結合成長因子−１（ＨＢＧＦ−１）、 ヘパリン結合成長因子−２（ＨＢＧＦ−２）および該成長因子類の任意のものの 生物学的に活性な誘導体からなる群から選択される請求項２１の方法。
25. ２５．該成長因子がＨＢＧＦ−１またはその生物学的に活性な誘導体である請求 項２１の方法。
26. ２６．該阻害性または強化性化合物がヘパリンである請求項２２の方法。
27. ２７．動物細胞のインビトロでの増殖および分化を促進する方法であって、該細 胞を、有効濃度の少なくとも１個の成長因子を含有する組織シーラントの上およ び／または内部に置くことからなる方法であって、ここに該濃度は該細胞のイン ビトロでの増殖および／または分化を加速し、さもなくば促進するに有効な濃度 である。
28. ２８．該組成物が、さらに阻害性化合物および強化性化合物からなる群から選択 される少なくとも１個の成分を有効濃度含有する請求項２７の方法、ここに該阻 害性化合物とは該成長因子のなんらかの生物学的活性に干渉する、該シーラント の活性を阻害する化合物であり、該強化化合物とは、該成長因子のなんらかの生 物学的活性を強化、仲介または促進する化合物であり、ここに該濃度は、該阻害 、強化、仲介または促進を達成するに有効な濃度である。
29. ２９．該組織シーラントがフィブリン接着剤である請求項２７の方法。
30. ３０．該成長因子が血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）、インシュリン−結合成長 因子−１（ＩＧＦ−１）、インシュリン−結合成長因子−２（ＩＧＦ−２）、上 皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子−α（ＴＧＦ−α）、形質転換成長因 子−β（ＴＧＦ−β）、血小板因子４（ＰＦ−４）、オストゲニンおよび他の骨 成長因子、コラーゲン成長因子、ヘパリン結合成長因子−１（ＨＢＧＦ−１）、 ヘパリン結合成長因子−２（ＨＢＧＦ−２）および該成長因子類の任意のものの 生物学的に活性な誘導体からなる群から選択される請求項２７の方法。
31. ３１．少なくとも１個の成長因子が血小板誘導抽出物の形で提供される請求項２ ７の方法。
32. ３２．該成長因子がＨＢＧＦ−１またはその生物学的に活性な誘導体である請求 項２７の方法。
33. ３３．該阻害性または強化性化合物がヘパリンである請求項２７の方法。
34. ３４．該動物細胞がヒト細胞である請求項２７の方法。
35. ３５．該動物細胞が上皮細胞である請求項２７の方法。
36. ３６．該動物細胞が線維芽細胞である請求項２７の方法。