JPH06506205A - 創傷治療 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 剋温冶遼 本発明は、創傷の治療に関するものであり、動物の組織、特に（と言って限定す るつもりはないが）、たとえば、偶発的な傷害、外科手術その他の傷害で生じる 創傷によって損傷を受けた皮膚その他の上皮組織の修復、治療を容易にする薬剤 および技術に関する。本発明は、特に、人間その他のを椎動物の創傷の治療に関 係する。

周知のように、皮膚のような組織における創傷の治療は、一般に、少なくとも成 体の人間その他の晴乳動物では、細胞間基質（ＥＣＭ）生合成・転換・器質化法 で行う。この方法は、普通、線維性結合組織の密痕を生じさせ、その結果、正常 組織の機能喪失を招（。

外科の分野では、廠痕組織形成および狭窄は重大な問題であるが、現在のところ 完全に満足できる解決策はない。同様に、事故による火傷その他の傷害によるΦ 痕形成、線維化は、特に子供の場合、重大な結果となることが多く、機能障害、 成長阻害、醜い傷跡を招き、ここでも重大な問題である。

箒痕で生じた醜い傷跡の関しては、普通、傷を隠して外観を改善するために美容 措置や美容手術を試みる必要性が生じる。さらに、入れ墨その他の皮膚の欠陥を 陣すにも美容措置の必要性が同様にしばしば生じる。しかしながら、現在のとこ ろ、このような美容措置、手術を満足な状態で実施することは難しく、不可能で すらある。というのは、−Ｍ的に成る程度の外科手術を伴い、それ自体が新たに 醜い搬痕組織を生じさせる創傷の原因になりがちだからである。

成体の人間その他の晴乳を椎動物では、皮膚のような組織での創傷治療は、一般 的には、胎児組織および肝組織の創傷で生じると思われる再生過程と逆に、補綴 法である。創傷修復過程の転帰は、内因性パラメータ（たとえば、組織酸素化） および外因性パラメータ（たとえば、創傷ドレッシング）の両方を含む種々の要 因によって影響を受けると思われる。しかしながら、必要な細胞間連絡を含む創 傷損傷組織の治療および修復の全過程は、成体の人間その伯の晴乳動物では、多 数の特殊な可溶性成長因子の協調によって調整されることを示す重大な証拠があ る。可溶性成長因子は、創傷環境内へ（特に脱顆粒血小板および到来マクロファ ージによって）放出され、とりわけ、創傷内で血管新生、白血球走化、線維芽細 胞増殖、コラーゲンその伯の細胞外基質分子の移動および付着を生じさせると思 われる。識別され、分類されているこのような成長因子は、一般的に、特殊化し た可溶性タンパク質またはポリペプチドであり、形質転換成長因子アルファ（Ｔ ＧＦ−α）、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−Ｂ１．ＴＧＦ−／３２、ＴＧＦ −Ｂ３等）、血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦＩ、上皮細胞成長因子ｆＥＧＦｌ　 、インスリン様成長因子１．　Ｉ　Ｉ　＋ＩＧＦ１．　ＩＧＦＩＩ）および酸性 、塩基性線維芽細胞成長因子（酸性ＦＧＦおよび塩基性ＦＧＦ）を含む。これら の成長因子の多くは、ＤＮＡ再結合技術を用いる遺伝子工学によってすでに作ら れている。

これらの成長因子についての総括的な評論が、Ｃｈｉｎ江ｓ　ｉｎ　Ｐｌａ匹匹 」凹肚豆、第１７巻、第３号、１９９０年７月号の第４２１−４３２頁のＭａｒ ｙ　ＨＭｃＧｒａｔｈの論文およびＡｎｎｕａｌ　Ｒｅ　ｏｒｔｓ　ｉｎ　Ｍｅ ｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ　、　１９８８年、第２４章（Ａｃａｄｅｍ ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｉｎｃ　発刊）のＧｅｏｒｇｅ　Ａ　Ｋｓａｎｄｅｒの論 文に見られる。これらの文献は参考資料として本文に援用する。

創傷治療管理におけるこれら成長因子の役割の重要性についての認識によって、 創傷の治療、特に、不完全な創傷治療状態での治療の促進のための外生的成長因 子治療剤として臨床用とおよび応用のための種々の提案がなされている（たとえ ば、５ｐｏｒｎ等、５ｉｃｅｎｃｅ　（１９８３１２１９，１３２９−１３３１ ；　Ｂｒｏｗｎ等、Ｌ」任、血Ｌ（１９８６１１６３，１３１９−１３２４；　 ＆５ｔｏｅ等、５ｃｉｅｎｃｅ　ｆ１９８７１２３７．１３１９−１３２４参照 されたい）。これが、これら成長因子について獲得された知識の治療への応用を 発展させる努力における主たる趨勢であった。

本発明によれば、治療中の瘤痕組織形成を抑制するように創傷治療で用いるため の組成物であって、線維成長因子に対しての特効のある有効活性抑制量の１種類 または複数種類の成長因子中和剤と製薬上許されるキャリヤとからなる組成物を 得ることができる。

たとえば、ＴＧＦ−〇成長因子群は、特に成体の動物における創傷の修復におい て、箱痕組織の生成に伴われるマクロファージ浸潤、線維細胞弁移動および線維 芽細胞による細胞外基質合成、特にコラーゲン合成、沈着の刺激剤として特に重 要な調整役割を持つと考えられる。他の成長因子、たとえば、ＰＤＧＦもまた、 この過程では重要であり、成る程度まで、創傷治療に伴う複雑な調整過程全体に おいて互いに協調して作用すると考えられる。実際、ＰＣＴ／ＵＳ９０１０５５ ６６が、ＴＧＦ−βに抗体を用いてラットの腎臓ネフローゼ誘導モデルで線維増 多を低下させることを開示している。しかしながら、ＴＧＦ−β成長因子のすべ てが線維性であるわけではなく、特にＴＧＦ−Ｂ３の活性を抑制すると逆効果で あることが新たにわかった。

ＰＣＴ／ＵＳ９０１０５５６６は、ＴＧＦｆｌ−１およびＴＧＦβ−２を、細胞 外基質産生量を増加させる機能を有すると記載しているが、なんらかの特定のＴ ＧＦβがこのような効果を持たないということは示唆していない。

成長因子中和剤は、成長因子中和抗体、たとえば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−Ｂ２ およびＰＤＧＦに対する抗体であってもよい。

成長因子中和剤は、成長因子レセプタ遮断薬、たとえば、成長因子ＴＧＦ−β１ 、ＴＧＦ−Ｂ２またはＰＤＧＦのレセプタ結合部を含むペプチドであってもよい 。

成長因子中和剤は、また、たとえば、成長因子をＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−Ｂ２か ら選んだ場合にレセプタ結合を抑制するように成長因子に結合する分子を包含し てもよい。この分子はＤｅｃｏｒｉｎおよびＢｉｇｌｙｃａｎがら選んでもよい 。

成長因子中和剤は、また、成長因子ｍＦｔＮＡにアンチセンス・オリゴヌクレオ チドまたはｒｉｂｏｓｙｍｅｆｓｌ　（共に、ｍＲＮＡをトランスレートするの を防ぐように作用する）であってもよい。

成長因子中和剤は、レセプタの可溶性形態あるいはレセプタの成長因子結合領域 であってもよい。

成長因子中和剤は、活性形態で組成物内に存在していてもよい。あるいは、成長 因子中和剤は、不活性形態で存在していてもよい。

成長因子中和剤を不活性化する１つの方法はカプセル化であり、カプセルを必要 に応じて外部刺激剤によって分解させて活性成長因子中和剤を放出するようにす ることができる。

外部刺激剤としては、紫外線、生体内酵素、超音波、熱がある。

成長因子中和剤を不活性化する第２の方法としては、結合分子の添加がある。

ここで再び、紫外線、生体内酵素、超音波または熱による外部刺激によって結合 分子を錯体から外し、活性成長因子中和剤を放出させてもよい。

製藁上許容できるキャリヤとは、局所適用の中性滅菌クリーム、ゲルまたは粉末 あるいは注射、潅流、吸入、エアロゾル用の滅菌溶液からなるものであってもよ いし、創傷を局所的に覆う滅菌ドレッシングからなるものであってもよいし。

腸内投与の錠剤またはカプセルの形をしたものであってもよいし、移植用の生体 高分子バッチまたは遅放出装置からなるものであってもよい。

組成物は、また、創傷嬢痕を減らず１種類または複数種類の成長因子中和剤に加 λて、創傷治療を促進するに充分な率で、活性サイトカイン、たとえば、１種類 または複数種類の線維芽細胞成長因子あるいは他の細胞増殖、細胞移動刺激もし くはｇｌｙｃｏ−ａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ刺激因子を含むものであってもよい。

本発明は、また、１種類または複数種類の成長因子中和剤を含む薬剤組成物であ り、普通は、クリーム、ゲル、粉末またはドレッシングとして、注射、潅流、吸 入またはエアロゾル用の溶液とし５て、または、腸内投薬用の錠剤またはカプセ ルの形で適用できる組成物を製造する方法を提供する。この製薬薬剤は、初期に 大皿に放出し、後にゆっくりと放出する、外科手術で有用なパッチを形成する生 体分解性高分子または移植可能な管理放出装置を包含してもよい。明らかなよう に、このリストはすべてではなく、当業者にとって容易に思いつけるような多く の他のタイプの組成物が可能である。

この組成物の製造法は、また、活性サイトカインを含む組成物も包含し得る。

本発明は、また、創傷の治療中に搬痕組織形成を抑制する方法であって、組織創 傷を受けたホストの創傷部位に、治療中に搬痕組織の形成に通じる過程に伴う１ つまたはそれ以上の成長因子の活性度を減らすに有効な投与量で１種類または複 数種類の成長因子中和剤を投与することからなる方法も提供する。

好ましくは、阻害剤またはこの目的で用いる薬剤混合物は、１つまたはそれ以上 の当該成長因子に特効のある、あるいは、これらの成長因子の前駆物質に特効の あるｌｆｌ類または？Ｉ数種類の中和抗体を包含する。このような抗体あるいは 各抗体は、組換えＤＮＡ技術によって得られる単クローン性抗体であると有利で ある。しかしながら、たとえば適当なホストに関連のある１種類または複数種類 の成長因子を注射して調製した抗血清からアフィニティークロマトグラフ法で精 製した多クローン性抗体を代替物として用いても非常に満足できる。これはたい ていの予備実験検査の場合に行われている。望むならば、完全抗体の代わりに、 特定の抗原結合特性を保持しているその断片（Ｆａｂ’ｓｌ　も使用できる。こ れらの断片は、本明細書において用いる「抗体」なる用語の範囲内に含まれると 考えられる。

これらの成長因子の前駆物質に関して、多くの場合、成長因子は、最初は、大型 のタンパク質分子の一部としであるいは大型タンパク質分子に結合したリガンド として不活性状態で存在し、たとえば、酵素作用によって活性形態で放出される ときにタンパク質分子から分離することは公知である。したがって、抗体のよう な中和剤のこのような不活性タンパク質前駆物質への結合が、タンパク分解作用 、したがって、活性成長因子の放出を阻止または抑制することができ、これが、 阻害剤の活性成長因子分子それ自体あるいはこれら成長因子の細胞レセプタ部位 への直接的な結合をなす代替過程と同じやり方で全体的な中和効果および活性度 の抑制に通じることになる。

成長因子中和抗体を用いる代わりに、阻害剤または薬剤混合物が、なんらかの細 胞間［第２メツセンジヤー」応答を招くことなく、たとえば、細胞レセプタ部位 でのｌｆ！類または複数種類の成長因子の遮断結合によって成長因子活性度に拮 抗するかあるいはそれを阻害するように作用し得る１種類または複数種類の合成 ペプチドからなるものであってもよい。このようなペプチド「阻害剤」は、潜在 的な免疫原性副作用を持たないという利点を有し、抗体よりも容易に膜バリヤを 通過することができ、局所適用の製薬製剤または組成物を構成するのに最も適し ている。これら「阻害」ペプチドは、当該成長因子のアミノ酸配列または、この 配列の、細胞レセプタに結合する際に伴う部分についての知識がら容易に設計す ることができる。これは配列のこの結合部分をｒｉＩｌ！するＪ必要があるから である。たとえば、ＴＧＦ−Ｓｌの場合、レセプタ結合に関係するのは分子のＣ 末端であるということは公知である。同様に、ＴＧＦ−〇の場合のレセプタ結合 に関係する領域は、システィン３３とシスティン４２の間の領域であり、ＥＧＦ の場合には、システィン２０とシスティン３１の間、チロシン１４とシスティン ３１の間、ロイシン１５とアルギニン５３の間のそれぞれの領域が関係する。Ｆ ＧＦの場合には、重要なレセプタ結合領域はアミノ酸１０５．１１５の間である 。

さらなる可能性として、阻害剤としての１種類または複数種類の成長因子中和剤 は、ＩＩＩ類または複数種類のの成長因子またはその前駆物質に直接結合してそ れを不活性にすることによって作用する他の分子単位からなってもよい。この種 の中和剤または阻害剤の一例は、Ｄｅｃｏｒｉｎであり、これは、Ｎａｔｕｒｅ 　（１９９０１，３４６、２８１−２８４でＹａｍａｇｕｃｈｉ等によって報告 されているように、ＴＧＦ−βと強く結合すると知られている小りロドロイチン ーデルマタン硫酸プロテオグリカンである。

あるいは、阻害剤としての１種類または複数種類の成長因子中和剤は、分子レベ ルでは活性であってもよく、成長因子のｍＲＮＡに対して活性である分子からな るものであってもよい。このような分子としては、トランスレーションを防ぐよ うに１種類または複数種類の成長因子ｍＲＮＡ配列に対して合成された１種類ま たは複数種類のアンチセンス・オリゴヌクレオチドがあり、あるいは、ｍＲＮＡ を破壊し、再びそのトランスレーションを防ぐようにｌ　ｆｉｌまたは複数種類 の成長因子ｍＲＮＡ配列の特殊な配列に的を絞った１種類または複数種類のｒｉ ｂｏｓｙｎ＋ｅであってもよい。

創傷治療中に搬信組織の形成に関係する１つの成長因子に関してだけ、特にＴＧ Ｆ−β１．ＴＧＦ−β２またはＰＤＧＦにだけ中和効果を有する抗体または他の 薬剤は多少とも搬信組織が生じるのを防ぐにまったく充分なものであるが、成る 場合には、当該成長因子の２種類またはそれ以上の種類に対して中和効果を有す る２つまたはそれ以上の異なった抗体その他の阻害剤を組み合わせて投与すれば 、特に比較的大きな切除創傷にとって、さらにまた有効であることがわかった。

この場合、これらの阻害剤は個別に投与してもよいし、同時にあるいは順次に投 与してもよいし、あるいは、単一の製薬製剤内で混合物または「カクテル」とし て構成してもよい。

少なくともＴＧＦ−β群およびＰＤＧＦを含むこれら一連の成長因子は、通常は 、互いに協調してオーケストうのように作用して搬信組織の生成に通じる諸段階 を含めて全創傷治療過程を調節すると考えられるが、搬信組織の生成に作用して 任意の１つの成長因子の活性度を低下あるいは中和する効果は、その成長因子の 性質または同一性および結果として生じる活性成長因子プロファイルの形態に依 存して変わると思われる。したがって、ＴＧＦ−βまたはＰＤＧＦあるいはこれ ら両方の活性度の抑制はこの点については非常に有効であり得るが、他の成長因 子のうち成る種の成長因子の活性度の抑制は、たとえこの成長因子が少なくとも 創傷治疹を促進することに関してまだ必要であるかも知れないか、あるいは、少 なくとも成る種の有利な効果を持つかも知れないにしても、搬信組織形成を低下 させるという同様の条件の下では、少なくともそれ自体については、効果は低い 。

したがって、本発明の応用に際しては、廠痕組織の形成に主要な役割を有する１ 種類または複数種類の成長因子、たとえば、ＴＧＦ−βまたはＰＤＧＦあるいは これら両方の活性度を低下させるのに有効な１種類または複数種類の阻害剤また は中和剤を、多少とも独立して搬信組織形成を促進することはないが、同時に、 独立して創傷治疹を促進するかあるいは治癒程度に関して有利な効果を奏するこ とのできる別の外生的成長因子と組み合わせて用いる別の可能性があり得る。少 なくとも成る種の場合、たとえば１種類または複数種類のＴＧＦ−βまたはＰＤ ＧＦ中和剤と組み合わせても用いるためのこのような他の付加的な外生的成長因 子は、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）によって提供され得る。したがって、活性 ｃｙｋｔｏｋｉｎｅ　Ｆ　Ｇ　Ｆ対ＴＧＦ−βまたはＰＤＧＦあるいはこれら両 方の中和剤の成る種の比率を有する製薬製剤を提供することによって、創傷の搬 信生成を防ぐばかりでなく、創傷治療の全過程を促進する薬剤を得ることができ る。

ＩｉＩ痕組織組織形成限または阻止するなんらかの措置を、早期の治療段階で生 じたフィブリンと交換する肉芽組織の形成に続いて生じる組織リモデリングまた は再構築の段階中、比較的遅い治療段階で適用するのが最も効果的であるかも知 れないと予恕された可能性があった。しかしながら、このような予測に反して、 驚（べきことには、本発明を適用した際、１種類または複数種類の成長因子中和 剤での処置は、早期治療段階で実施してこそ効果的となり得るということがわが った。一般的に言って、この処置の最良の実施は、フィブリンがまだ存在してい る肉芽位相前またはその最中あるいはこの両方で、すなわち、フィブリンが完全 に肉芽組織と入れ換わってしまう前である。これは、通常、創傷の初期発生後約 １４日の期間内である。しかしながら、処置はより早くに、７日以内あるいはで きるならば創傷を受けた後３日以内またはもつと早くに開始すると好ましい。実 際、創傷を受けた同じ日あるいは少なくとも翌日に開始すると最良であることが 多く、外科手術創傷の場合、この処置の開始は、すなわち、創傷領域へ適用され た製薬薬剤での１種類または複数種類の成長因子中和剤の局所的すなわち非経口 的な適用による処置の開始は、外科手術の一部に組み込まれ、外科手術の前また は主手術の完了直後、縫合の前後に適用される。

また、幾分驚くべきことには、処置を必ずしも繰り返して創傷治療位相を通じて 継続させる必要がないということもわかった。効果的であるためには、創傷治療 の早期段階で一回あるいはせいぜい数回適当な投与量で１種類または複数種類の 成長因子中和剤を投与すれば充分であることが多い。これは、もちろん、タンパ ク質のような薬剤が関係しており、免疫反応を誘発する傾向がある場合に重要で あり、また、他の実用的、経済的な利点も与える。

成る場合に創傷の完全治癒を達成する時間全体をこの処置を適用した際に幾分延 ばす可能性があるが、治癒した創傷の質が改善されるので、それを補ってありあ まるものがある。しかしながら、今までに行った実験の注目すべきかつさらに驚 くべき特徴によれば、全治短時間には現実に多少とも延長が観察されず、治疹時 になんら創傷強度の障害もなかった。実際、この後者の点に関して、少なくとも 、創傷が通常搬信組織の形成を伴って治癒するときに普通に見られるように皮膚 外面に対して大きな角度、一般的には直角になることなく、皮膚外面に対してほ ぼ平行に位置する、未損傷組織のそれに非常に類似した切開皮膚創傷の場合には 、治療中に形成される新しいコラーゲン線維すなわちフィブリルの配向が観察さ れたという点で創傷強度さえ改善され得ることがわかった。

発明のさらなる背景説明のために以下の実施例で発明の開発時に行った検査およ びそこで得た結果のいくつかを示すが、当業者であればこれから発明の性質を認 識し、発明を実施することは容易であろう。

まず、説明している検査および実施例において一般的に用いられた材料、方法お よび技術のアウトラインまたは概要を、引き続いて説明しないかぎり、最初に説 明する。

これらの検査での予備実験作業は、モデル実験動物としてラットを用いて実施し たが、その結果は人間その他の動物にもほぼ適用できる。

体重２００−２５０グラムの成長した雄のＳｐｒａｑｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット にはロタン／亜酸化窒素／酸素吸入で麻酔をかけた。局部的に毛を刈り取った後 、４つの直線長さ１０ｍｍの全層切開部を正中線から等距離で四肢に隣接してラ ットの背側皮膚に作った。

各ラットにおいて、１つの創傷（対照）は何もせず、もう１つ（見かけ対照）に は無関係の抗体を注射し、１つ（正対照）には以下に詳しく述べる成長因子を注 射し、１つく実験創傷）には１種類または複数種類の適切な成長因子中和抗体の 薬剤を注射した。実験をこれらの動物の群について行い、該当群に従って、創傷 を受けた日あるいは次の日から数えて中断なしに３日間あるいは７日間にわたっ て毎日注射（１００ｕＪ２毎）を実施し、２．３の群では、かなり遅い段階、た とえば、創傷受傷後７日または１９日で注射を実施した。

各群において、創傷受傷後、７日、１４日、２８日、４２日でクロロホルムの過 剰投与によって少なくとも２匹ずつラットを殺し、成る場合には、創傷受傷後７ ０日、１１２日、１６８日にもこれを行った。各ラットの死亡直後に４つすべて の創傷を（それぞれの側縁に０．５ｍｍの縁を残して）切り取り、通常の免疫組 織化学技術、組織染色技術および生化学技術によって組織分析を行った。

一般に、この分析を行うには、各創傷を三等分して２つのサンプルを作り、凍結 または固定あるいはこれら両方の処理を行い、コラーゲン■、ＩＩＩ、ＩＶ、ラ ミニンおよびフィブロネクチンに対する抗体を用いて免疫細胞化学染色のために 処置するか、あるいは、種々の結合組織染色を用いて通常の組織検査のために処 置するか、もしくは、顕微鏡切開後の生化学分析のために直ちに凍結乾燥した。

免疫組織化学分析において、間接的な免疫染色のため一次、二次抗体を以下の表 に示すように用いた。

衣１　二次抗体 ラット　タイプ■■　ウサギ　ｂ　ｌ：ｌｏｏ　２コラーゲン　− 轟ヱ　ニ鵠詳 ａ　５ＥＲＯＴＥＣＬＴＤ、　０ｘｆｏｒｄ、　ＬＩＫ。

ｂ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ　Ｐａ５ｔｅｕｒ　ｄｅ　Ｌｙｏｎ、　Ｆｒａｎｃｅｃ　 ＤＡＫＯＰＡＴＴ’Ｓ、　Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、　Ｄｅｎｍａｒｋｄ　ＡＭＥ Ｒ５ＨＡＭ、　ＩＦｆｆＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　Ｐｌｃ、　Ａｍｅｒｓｈａｍ、 　ＵＫ注記二　二次抗体ｌ、２．４は免疫蛍光検出、測定のためにＦＩＴＣ接合 （フルオレセインイソチオシアネート標識付け）を行い、３はビオチン処理した 。

間接免疫染色を実施する際に、−次抗体で培養を一時間行った後、リン酸緩衝生 理食塩水（ＰＢＳ）内で３回洗浄した。ＦＩＴＣ接合した二次抗体で培養を１時 間行った後、ＰＢＳでさらに３回洗浄した。マクロファージおよび単球の免疫染 色をビオチンーストレブタビディン技術で行った。すなわち、−次培養および洗 浄後、切片を１時間ビオチン処理したヒツジ抗マウスＩｇＧで培養し、ＰＢＳで ３回洗浄し、２０分間フルオレセイン・ストレブタビディンで培養し、最終的に ＰＢＳで３回洗浄した。切片を非退色媒質、ＤＡＢＣＯｆｌ、４−ｄｉａｚｏｂ ｉｃｙｃｌｏ−ｆ２．２．２ｌ−ｏｃｔａｎｅｌ内に取り付け、Ｌｅｉｔｚ　Ｄ ｉａｌｕｘ顕微鏡およびｋｏｄａｋ　Ｅｋｔａｃｈｒｏｍｅ４００　ＡＳＡフィ ルムを用いて機影した。

各−次抗体および各創傷について、対照切片を染色し、−次抗体の代わりにＰＢ Ｓを用いた。

通常の組織染色を実施する際、組織の凍結切片（ブアン液での固定後）をＨａｒ ｒｉｓのヘマトキシリンおよびエオシンで染色して創傷の細胞充実度を検討し、 凍結切片をＭａｓｓｏ口のトリクロームおよびＭａｌｌｏｒｙのトリクローム染 料のＨｕｇｈｅｓｄｏｎの変異体で染色することによって創傷におけるコラーゲ ンの沈着度を検討した。

生化学分析のために、創傷は、それぞれから非創傷背側皮膚の一片と共に顕微鏡 下解剖し、直ちに一定重量まで凍結乾燥した。４℃、２４時間、１ｍβの１Ｍ塩 酸グアニジン、０．１５Ｍ酢酸ナトリウム、０．ＯＩＭ　ＥＤＴＡ。

ｐＨ５，８、内で均質化してグリコースアミノグリカンを抽出した。次に、ホモ ジネートを１時間ｔａ、　０００ｇの遠心力にかけた。ペレットを０．５ｍＩ２ の水で２回洗浄し、洗液を上澄み液に加えた。上澄み液はｐＨ６，５の５ｍＭ　 ＥＤＴＡで１００ｍＭリン酸緩衝液に対して透析し、パパイン２．５ｍｇ／ｍＩ ２で消化した。

洗浄後、２４時間、４℃で、０．５Ｍ酢酸内のペプシン１００μｇ　／　ｍ　１ ２で消化した。これに続いて、１時間、１８．０００ｇの遠心力をかけた。こう して得たベレットを、Ｓｔｅｇｍａｎ　ａｎｄ　５ｔａｄｌｅｒ　（１９８７１ によって述べられているようなヒドロキシプロリン・アッセイにかけた。このア ッセイのために上澄み液の若干量も使用した。タイプＩ／Ｉ　Ｉ　Ｉコラーゲン の比率を測定するために、５ｙｋｅｓ等（１９７６１の方法を用いて上澄み液を ＳＤＳ　ＰＡＧＥにかけた。

これらの実験で用いた成長因子は、Ｒ＆　ｏ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　（アメリカ合衆 国ミネアポリス）またはＢｒ１ｔｉｓｈ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｆＵ、 に、ｌまたは５ｅｒｏｔｅｃ　（１１，に、ｌから得た市販の試薬であり、次の ものを含んでいた。

１、　ブタの血小板から誘導した形質転換成長因子ベーター１　（ＴＧＦ−β１ ）−投与量１０ｎｇ／ｌ注射。

２、　ブタの血小板からの血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）−投与量Ｌｏｎｇ／ ｌ注射。

３、　マウス唾液腺から誘導した上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）−投与量Ｉｏｎｇ ／ｌ注射。

４、　ウシの脳から誘導した塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦｌ−投与量ｔ ｏｎｇ／Ｉ注射。

５、　ウシの脳から誘導した酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）−投与量１０ ｎｇ／ｌ注射。

これらの実験で使用した成長因子中和抗体もまた、上記の市販試薬であり、公知 の中和効力のものであった。次のものを含む。

１、ＴＧＦベータ中和抗体（ブタのなまの血小板ＴＧＦ−β１を対象としてウサ ギで育成した一両ＴＧＦβ−１、ＴＧＦβ−２を中和する）−投与！）５０μｇ ／ｌ注射。

２、　ＰＤＧＦ中和抗体（ヒトのなまのＰＤＧＦを対象としてやぎで育成）−投 与量２０ｕｇ／ｌ注射。

３、　ＥＧＦ中和抗体（ヒトＥＧＦを対象としてマウス内で育成した多クローン 性抗体）−投与量１０μｇ／ｌ注射。

４、　塩基性ＦＧＦ中和抗体（ウシのなまの脳塩基性ＦＧＦを対象としてウサギ で育成した）−投与量３０＋１ｇ／ｌ注射。

５、　酸性ＦＧＦ中和抗体（ウシのなまの脳酸性ＦＧＦを対象としてウサギで育 成した）−投与量３０μｇ／ｌ注射。

見かけ対照創傷について用いた無関係抗体は、成長因子への中和抗体を育成した ホストに応じてウサギＩｇＧまたはヤギＩｇＧであった。無関係抗体の投与量は 中和抗体の投与量と同じであった。

積愚の概！ 行ったすべての実験において、創傷を検査した時点のいずれでも対照創傷と見か け対照創傷の間に差異はなんら見出せなかった。このことは、外部タンパク質の 導入によってなんら主要な影響がないことを示している。また、どの創傷も欠陥 のある始値を示さず、上皮化の率もすべての処置で同じであった。

しかしながら、少なくとも、ＴＧＦ−βおよびＰＤＧＦへの中和抗体で処理した 実験創傷の場合には、創傷がまだ新鮮なうち、好ましくは、創傷を受けた時点あ るいはその直後で肉芽組織形成位相前またはその最中に治療を開始したときには 大きな影響が生じた。したがって、創傷受傷後１９日までに治療を始めなかった ときに対照創傷と実験創傷との間には大きな差異は観察されなかったが、他の場 合、特に創傷を与えたと同じ日または次の日に治療を開始したとき、実験創傷は 、いかなる時点でも、同じ動物の他の３つの創傷に比べて、実験創傷の含むコラ ーゲン■、ＩＩＩはかなり少なかった。コラーゲン・フィブリルの間隔はがなり 大きかったが、この配向は正常な皮膚のものとほとんど同じである。実際、中和 抗体処置創傷においては、（外胚葉毛嚢の喪失を除いて）この創傷の部位を検出 することはしばしば難しかった。このことは、垂直に配向し、平行に稠密に詰ま ったコラーゲン・フィブリルを持つ特異な搬信を示す他の創傷とは大きく異なる 。これらの影響は、乳頭状真皮組織および皮下組織で最も顕著であった。ＴＧＦ −βまたはＰＤＧＦに対する中和抗体で処置した創傷は、特に網様真皮でフィブ ロネクチンの顕著な低下を示し、その配向パターンはコラーゲン・フィブリルの それに類似したものであった。フィブロネクチン染色は創傷全体で顕著に低下し たが、皮膚／表皮接合部ではまだ光沢が最大であった。ＴＧＦ−βおよびＰＤＧ Ｆに対する中和抗体での処置は、また、治療している創傷内の血管、単球および マクロファージの数も減じる。これと逆に、ＴＧＦ−βおよびＰＤＧＦで処置し 、た正対時創傷は細胞外基質集積、細胞外基質充填密度および血管、単球および マクロファージの数の顕著な増加を示した。これら成長因子処置創傷における搬 痕形成は、対照と比べて、より顕著であった。

これらの結果は、選定した成長因子に対する中和抗体の、成体の皮膚創傷治療に おける搬痕組織形成を顕著に低下させる能力を表わしている。最も重要なのは、 この有利な効果が、遅い創傷治療あるいは遅い上皮化および低い創傷強度の問題 を伴わないということである。

搬痕組織形成を減らす際に、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ’ｓ）に中和抗体を投 与した後に成る程度の改善も観察されたが、予備実験作業では、中和ＴＧＦ−β およびＰＤＧＦ成長因子の場合よりも顕著さは少なかった。興味があるのは、外 生の酸性または塩基性のＦＧＦそのものが搬信を改善すると思われることである 。しかしながら、幾分程度は落ちるけれども、適当な条件の下で適切な投与レベ ルで投与した他の成長因子への中和剤でＴＧＦ−βおよびＰＤＧＦに対しても同 様な結果が達成され得るど考えられる。

密偵組織の形成に通じるコラーゲン、特に、コラーゲンＩの生成および構成に関 連して非常に活性があると思われる少なくともＴＧＦ−βの場合、通常、初期創 傷後、創傷の１境でのこの成長因子のレベルは自己触媒カスケード効果によって かなり急速に増大する可能性がある。したがって、血小板劣化から初期創傷内に 存在するＴＧＦ−βが増大濃度で単球、マクロファージおよび線維芽細胞に対す る化学誘因物質として作用するばかりでなく、それ自体のプロモータにフィード バックしてそれ自体の合成を刺激し、その結果、高レベルが直ちに現れる。炎症 細胞、特に、マクロファージは、ＴＧＦ−βを故出し、ＴＧＦ−β合成について この自己誘導効果を示す。ＴＧＦ−βは、また、他の成長因子、たとえば、ＴＧ 　Ｆ　ａ、　Ｐ　Ｄ　Ｇ　Ｆ、　Ｅ　Ｇ　Ｆ、　Ｔ　Ｇ　Ｆ−βの合成および放 出も刺激し、これら他の成長因子が、創傷線維芽細胞によって細胞外基質分子、 たとえば、コラーゲンおよびグリコースアミノグリカンの合成を刺激し、また、 これら細胞外基質分子のタンパク分解性転換、横築の程度にも影響を与える。初 期フィブリン凝塊が稠密なので、隣接する正常皮膚からの線維芽細胞は、最初、 基底膜に対してほぼ直角の方向で凝塊と創傷縁との間で上下に移動する。コラー ゲンその他の細胞外基質分子もこの異常な配向で沈着し、最終的には搬信を生じ させる。

成体での正常な創傷治癒は有害な治療条件での閉鎖速度について系統発生的に最 適化されると仮定できる。その結果、成長因子の放出量は、一般に、過剰であり 、外部有害因子をかなり緩衝する治療過程の速度を与えるが、長期にわたる０痕 の欠点も与える。現代の創傷治療法（たとえば、バンデージ）および感染の危険 を低減する方法は、この成長因子「オーバードライブ」の必要性をかなりなくし 、その結果、活性成長因子プロファイルを減じる処置が許容でき、引き続く０痕 形成を最小限に抑えることになる。

したがって、ＴＧＦ−βについて上述した自己触媒カスケード事象は、早期段階 での中和剤での処置によって低下する。しかしながら、中和剤は、この成長因子 のすべてを中和するに充分な量で適用されて、厳しい抑制なしに創傷治療を処理 するに充分に残ることはない。これは少なくともＰＤＧＦにも当てはまる。

実里牲 ここで、本発明の開発時に行った検査から得た結果が、治療分野あるいは美容分 野のいずれでも、創傷治療での搬信組織形成を制御するために臨床に直接応用で きることは明らかである。実際の用途のためには、一般的には、創傷の治療にお ける搬信組織形成の原因となる活性のある関連成長因子のプロファイルを中和ま たは改質あるいはこれら両方を行う際に有効な材料を構成する適正量の成長因子 抗体（単数または複数）または他の成長因子抑制剤（単数または複数）は、創傷 治療の必要な患者へ任意適当な要領で投与するための製薬製剤として薬剤の分野 では周知の方法のいずれかによって構成されることになる。このような製薬製剤 は、さらに、臨床で個別に供給されるばかりでなく、たとえば臨床性緊急時使用 のための救急キットの構成要素としても提供され得る。

たとえば、ＴＧＦ−βおよびＰＤＧＦ成長因子に関連して、一般には、１種類ま たは複数種類の抗体または１種類または複数種類の他の中和剤は、ｌ投与あたり １直線切開ｃｍあたりｌｐｇ−１μｇのＴＧＦ−〇（１および２）および／また はＰＤＧＦ　（好ましくは、１００ｐｇ−Ｌｌｏｏｐを効果的に中和するように 投与されなければならない（少なくとも切開性創傷について）。先に指摘したよ うに、創傷治療過程で早期の適用が必須である。通常、この時期としては、肉芽 組織形成の段陽前、その最中またはその前からその最中まで、創傷を受けたとき から約１４日以内、好ましくは、７日または３日以内あるいはそれより短い期間 となる。

製薬製剤は、普通は、創傷受傷の時点またはそれよりあまり遅くならずに、液体 、ゲル、エアロゾル、クリームまたは粉末の形態で、もしくは、ドレッシング、 生物分解性パッチまたは制御放出移植装置の形で創傷まわりの表面に適用できる と便ＩＩである。非経口投与、特に、皮下注射がしばしば好ましく、そうすれば 、ｌｆｌ類または複数種類の中和抗体または１種類または複数種類の他の薬剤を 最大効率で創傷環境へ直接導入することができる。この目的のために、調製した 製薬製剤は、常閉アンプル内に単位投与形態で収容された所定量の活性材料、た とえば、関連した１種類または複数種類の抗体の滅菌液体製剤（たとえば、リン 酸緩衝生理食塩水内にある）を包含するとよい。しカルながら、成る種の場合に 好ましい別の局所投与モードの場合、製薬上許容できるキャリヤ、稀釈剤または 添加剤を構成する少なくとも１つの他の成分と密接に組み合わせるかあるいは混 ぜ合わせた活性材料で構成して、局所適用に最も適した組成物（たとえば、クリ ーム、ゲル、軟膏等）としてもよい。この製剤は、局所適用のために滅菌ドレッ シング、生物分解／吸収バッチまたはドレッシングに適用してもよいし、初期に 放出量が大きくてその後にゆっくり放出する遅速放出移植システムに適用しても よい。

本製剤は、また、キャリヤ、たとえば、コラーゲンまたはヒアルロン酸の生体高 分子あるいは高分子（たとえば、ＰＶＣ）に取り付けた中和剤、たとえば、１ｆ ｌ類または複数種類の関連抗体からなり、創傷または組織空隙に適用あるいはそ の中に移植したときに最初は急速に放出し、長い期間にわたってゆつ（つと放出 するようにしてもよい。

上記かられかるように、本発明は多数の異なった特徴を提供し、一般的に、明言 したにしても暗示したにしても、また、単独でもあるいは組み合わせでも、ここ に開示した新規で進歩性のある特徴のすべてを包含する。さらに、本発明の詳細 な説明した実施例によっても、あるいは、単に説明のためにのみここで用いた用 語および表現によっても制限されるものではない。

国際調査報告 国際調査報告 １　。

□ ：　１ フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＦＩ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ。

ＫＲ，ＬＫ、　ＭＧ、　ＭＷ、　Ｎｏ、　ＰＬ、　ＲＯ，ＲＵ、　ＳＤ、　ＵＳ （７２）発明者　ファーガソン　マーク　ウィリアム　ジェームス イギリス国　マンチェスター　エム１３９ピー　ティー　クーブランド　サード ビルディング　ユニバーシティ　オフ　マンチェスター　デパートメント　オフ 　セル　アンド　ストラクチュラル　バイオロジー （７２）発明者　フォアマン　デヴイッド　ミカエルイギリス国　マンチェスタ ー　エム１３９ビー　ティー　クーブランド　サード ビルディング　ユニバーシティ　オフ　マンチェスター　デパートメント　オフ 　セル　アンド　ストラクチュラル　バイオロジー （７２）発明者　シャー　マムタ イギリス国　マンチェスター　エム２０　９エヌエツクス　ライジントン　ラト ム　ロード　１２

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. １．創傷の治療で用いて治療中の瘢痕組織形成を抑制する組成物であって、線維 性成長因子にのみ特効のある有効活性度抑制量の１種類または複数種類の成長因 子中和剤を、製薬上許容なキャリヤと共に包含することを特徴とする組成物。
2. ２．請求の範囲第１項記載の組成物において、成長因子中和剤が成長因子中和抗 体であることを特徴とする組成物。
3. ３．請求の範囲第２項記載の組成物において、成長因子中和抗体が、抗ＴＧＦβ −１抗体、抗ＴＧＦβ−２抗体および抗ＰＤＧＦ抗体から選んだものであること を特徴とする組成物。
4. ４．請求の範囲第１項記載の組成物において、成長因子中和剤が成長因子レセプ タ阻害剤であることを特徴とする組成物。
5. ５．請求の範囲第４項記載の組成物において、成長因子レセプタ阻害剤が成長因 子のレセプタ結合部位を含むペプチドであることを特徴とする組成物。
6. ６．請求の範囲第５項記載の組成物において、ペプチドがＴＧＦβ−１またはＴ ＧＦβ−２またはＰＤＧＦのためのレセプタ結合部位を含むことを特徴とする組 成物。
7. ７．請求の範囲第１項記載の組成物において、成長因子中和剤がレセプタ結合を 抑制するように成長因子に結合する分子であることを特徴とする組成物。
8. ８．請求の範囲第７項記載の組成物におし、て、成長因子がＴＧＦβ−１および ＴＧＦβ−２から選ばれ、分子がＤｅｃｏｒｉｎおよびＢｉｇｌｙｃａｎから選 ばれることを特徴とする組成物。
9. ９．請求の範囲第１項記載の組成物において、成長因子中和剤が成長因子ｍＲＮ Ａに対するアンチセンス・オリゴヌクレオチドであることを特徴とする組成物。
10. １０．請求の範囲第１項記載の組成物において、成長因子中和剤が成長因子ｍＲ ＮＡに対して活性のあるｒｉｂｏｓｙｍｅ（ｓ）であることを特徴とする組成物 。
11. １１．請求の範囲第１項記載の組成物において、成長因子中和剤がレセプタの可 溶性形態あるいはレセプタの成長因子結合ドメインであることを特徴とする組成 物。
12. １２．請求の範囲第１項から第１１項までのいずれか１つの項に記載の組成物に おいて、成長因子中和剤が活性形態で存在することを特徴とする組成物。
13. １３．請求の範囲第１項から第１１項までに記載の組成物において、成長因子中 和剤が不活性形態で存在することを特徴とする組成物。
14. １４．請求の範囲第１３項記載の組成物において、成長因子中和剤がカプセル封 入によって不活性化されることを特徴とする組成物。
15. １５．請求の範囲第１４項記載の組成物においてカプセルが、必要なときに、外 部刺激によって分解し、活性成長因子中和剤を放出することを特徴とする組成物 。
16. １６．請求の範囲第１５項記載の組成物において、外部刺激が紫外線光、生体内 酵素、超音波、熱を含むことを特徴とする組成物。
17. １７．請求の範囲第１３項記載の組成物において、成長因子中和剤が結合分子の 分子添加によって不活性化されることを特徴とする組成物。
18. １８．請求の範囲第１７項記載の組成物において、結合分子が、紫外線光、生体 内酵素、超音波、熱を含む外部刺激によって活性成長因子中和剤から剥離され、 それを放出させることを特徴とする組成物。
19. １９．請求の範囲第１項から第１８項までのいずれか１つの項に記載の組成物に おいて、製薬上許容なキャリヤが、局所適用のために中性滅菌クリーム、ゲル、 エアロゾルまたは粉末からなることを特徴とする組成物。
20. ２０．請求の範囲第１項から第１８項までに記載の組成物において、製薬上許容 なキャリヤが注射、灌流または吸入のための滅菌溶液からなることを特徴とする 組成物。
21. ２１．請求の範囲第１項から第１８項までに記載の組成物において、製薬上許容 なキャリヤが創傷を局所的に覆うための滅菌ドレッシングからなることを特徴と する組成物。
22. ２２．請求の範囲第２１項記載の組成物において、ドレッシングが生体分解性／ 吸収性高分子からなることを特徴とする組成物。
23. ２３．請求の範囲第１項から第１８項までに記載の組成物において、製薬上許容 なキャリヤが創傷内に移植するための生体高分子／高分子からなることを特徴と する組成物。
24. ２４．請求の範囲第１項から第１８項までのいずれか１つの項に記載の組成物に おいて、活性サイトカインからなることを特徴とする組成物。
25. ２５．線維性成長因子にのみ特効のある１種類または複数種類の成長因子中和剤 を包含する製薬組成物の調製方法であって、この組成物を局所的にクリーム、ゲ ル、エアロゾル、粉末、ドレッシング、パッチの形で、あるいは、注射、灌流、 吸入のための溶液の形で、あるいは、制御放出移植体として適用することを特徴 とする調製方法。
26. ２６．請求の範囲第２５項記載の調製方法において、組成物が活性サイトカイン からなることを特徴とする方法。
27. ２７．創傷治療中に瘢痕組織の形成を抑制する方法であって、組織創傷を受けた ホストヘ、創傷領域における線維性成長因子にのみ特効のある１種類または榎数 種類の成長因子中和剤を、治療中に瘢痕組織を形成することに通じる、この治療 過程に伴う１つまたはそれ以上の成長因子の活性度を低下させるに有効な投与量 で投与することからなることを特徴とする方法。