JPH06506233A - 病原体から得られる抗原多糖から誘導されたオリゴ糖 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 病原体から得られる抗原多糖から誘導されたオリゴ糖本発明は病原体（ｐａｔｈ ｏｇｅｎｉｅ　ａｇｅｎｔ）から得られる抗原多糖（ａｎｔｉｇｅｎｊｃ　ｐｏ ｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）から誘導されたオリゴ糖、その製造方法、及び、特 に、そのワクチン製剤（ｖａｅｃｉｎａｌ　ａｇｅｎｔ）としての使用に関する 。

バクテリア及び酵母のごときカビ（ｒｕｎｇｌ）はその表面構造中に多糖を含有 している。即ち、大部分のバクテリアは、多かれ少なかれ強固にバクテリアに結 合しているが、厳密にいえば、包膜（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）ではない多糖質の滲出 物（ｅｘｕｄａｔｅ）で被覆されている。

この滲出物は莢膜（ｃａｐｓｕｌｅ）又は糖衣（ｇｌｙｅｏｃａｌｙｘ）と呼ば れている。

更に、グラム陰性バクテリアの外膜（ｏｕｔｅｒ　ｍｅｍｂｒａｎｅ）は、特に 、リポ多糖化ＰＳ）からなる。最後に、多糖はカビの細胞壁（ｗａｌｌ）にも存 在する。これらの多糖は、実際には、感染哺乳動物において免疫応ｆ（１ｍｍｕ ｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を誘発する表面抗原（ｓｕｒｆａｃｅ 　ａｎｔｉｇｅｎ）である。

かかる多糖は、その構成成分と結合か明確に規定されている（ｄｅｒｉｎｅ）、 かつ、各々、考慮しているカビ又はノくクチリア種の特性である反復単位に基づ いて形成されている。これらの反復単位はエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）　、即 ち、抗原性決定構造体（ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｊｎｇ　 ５ｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）を含有している。例示として、莢膜状（ｅａｐｓｕｌａ ｒ）多糖又はリポ多糖から得られる種々の形式の反復単位が図１に示されている 。反復単位は、しばしば、例えば、分子の肴洛中又は分岐した位置中に存在する ホスフェート官能基並びに０−アセチル基及びピルビン酸基（ｐｙｒｕｖａｔｅ 　ｇｒｏｕｐ）のごとき非常に移動し易い（Ｉａｂｌ１８）官能基を含有してい る。

多糖は、実際には、一つの分子から他の分子へと変動し得る量のグリコシド単位 を含有する重合体分子の組合せからなる。従って、多糖は平均分子量のみによる 分子量によって記載し得る。ホモ多糖の場合にはグリコシド単位は単糖である。

ペテロ多糖の場合にはグリコシド単位は一定の方法で連結された構成成分の鎖を 形成している。

多糖の平均分子量に関して、これはゲル濾過（ｇｅｌ　ｆｉｌｔｒａＨｏｎ）に よって決定し得る。この場合、分子量はＧｒａｎａｔｈ等によりＪ、Ｃｈｒｏｍ 、（１９６７）　２８　：６９に記載の方法に従って、溶離定数（ｅｌｕｔｉｏ ｎｃｏｎｓｔａｎｔ）（ＫＤ）又はデキストラン当量（ｄｅｘｔｒａｎ　ｅｑｕ ｉｖａｌｅｎｔ）（ＤＥ）で表される；この方法は以下のごとく要約し、得る。

多糖溶液を、構成成分をその分子量に従って分離する拡散−排除ゲルクロマトグ ラフィ−（ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ−ｄｉｆＴｕｓｊｏｎ　ｇｅｔｃｈｒｏｌｌｌａ ｔｏｇｒａｐｈｙ）カラム上で分析する。この種のゲルは例えばセファデフクス （Ｓｅｐｈａｄｅｘ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　、バイオ−ゲル（Ｂｉｏ−Ｇｅ ｔ）　（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、フラクトゲル（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ）（東洋ソーダ ）、セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　（Ｐｈａｒｍａｃｊａ）及びセファ クリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）（Ｐｈａｒｍａｅｉａ）の商品名で商業的に入手 される。ゲルの分画（ｒｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）の領域は、分析すべき分子 母集団（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｏｐｕ　ｌ　ａｔ　ｔｏｎ）内で表される分子量 の範囲に適合させるべきであることは明らかである。例えば、ゲル濾過カラム　 セファロース２ＢＣＬ　。

４ＢＣＬ及び６ＢＣＬは、デキストラン当量で測定して、それぞれ、２０．００ ０．０００〜１００．０００　：　５．０００．０００〜２０．０００及び１． ０００．０００〜１．０．０００の分画の領域を有する。一般的には、塩溶液、 例えば、０．２Ｍ塩化ナトリウム溶液が溶離剤として使用される。溶離定数は下 記の式： ［式中のＶｅは、考慮されている溶液（ｐｒｅｐａｒａｔ　１ｏｎ）の溶離容量 （ｅｌｕＨｏｎ　ｖｊ！ｕｓｅ）であり、Ｖｔはカラムの全容量であり、Ｖｏは カラムの死容量（ｄｅａｄ　ｖｏｌｕｓｅ）である〕に基づいて計算される。

例えば、図２ａ及び２ｂは、それぞれ、セファロース４ＢＣＬカラム上でのサル モネラ　チフィ（！１ｉａｌ■ｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｌ）及びストレブトコ力 ス　プニュウモニアｘ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｉｏｎｉａｅ） 　１型の多糖の溶離図（ｅｌｕｔＬｏｎ　ｐｒｏｒｌｌｅ）を示している。従っ て、Ｓ、チフィの多糖はセファロースＡＢＣＬ上では最大分子量を決定し得ない 重合体からなる。同様に、Ｓ、ブニニウモニアエｌ型の多糖は分子量が０〜０， ４５Ｉ　のに、の範囲で変動する重合体から本質的になる。定義により、多糖の 平均溶離定数は溶離図のスロープの接線（ｔａｎｇｅｎｔ）の交差点において； 又は、概略的には、溶離図の頂点において決定される。従って、図２ａ及び２ｂ において示される多糖の平均溶離定数は、それぞれ、０及び０．０４である。

１　デキストランを使用して作成した検量線（ｃａｌｉｂｒａＨｏｎ　５ｅｒｆ ｅｓ）に基づいて、溶離定数をＤＥ、で表わされる分子量に変換し得る。例えば 、図３は検量線の一例を示す。

病原体、例えば、バクテリア又はカビの表面抗原である多糖は、その抗原性（ａ ｎｔ　ｉｇｅｎｊｃｉｔｙ）のために、ワクチン剤として良好な候補１　者であ る。実際に、多糖抽出物からなるワクチンは成人においては効果があることが証 明されている。しかしながら、このことは小児については適用されない。この重 要な問題を排除するために、多糖を蛋白質に共有結合させ、それによって、かく 得られる分子にＴ−依存特性（Ｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｈａｒａｃｔｅｒ） を付与し、その免疫原性（ｆｍｕｎｏｇｅｎｊｃｉｔｙ）を増大させることが提 案され、成功している。

多糖に基づくワクチンとしては、従来、ネイセリア　メニンギチジス（Ｎｅｆｓ ｓｅｒｌａ　ｍｅｎｌｎｇｌｔｊｄｆｓ）　Ａ、Ｃ，Ｙ又はｗ１３５群、ストレ ブトコカス　プニュウモニアエ、ハエモフィルス　インフルエンザエ（Ｈａｅｓ ｏｐｈｉ！ｕｓ　ｊｎｆｌｕｅｎｚａｅ）　Ｂ型及びサルモネラ　チフィニヨッ テ惹起される感染に対するワクチンがある。

病原体の抗原多糖は免疫原（ｉｓｓｕｎｏｇｅｎ）として潜在的に有利なもので あるが、数百刃デキストラン当量という大きさであり得る、その大きな分子量の ために、その使用が困難である。特に、これを複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の 形、即ち、蛋白質とカップルさせた形で使用することを希望する場合には、解決 することが困難な技術的な問題に遭遇する。カップリング工程中に、ゲル又は凝 集物質が形成され、このことが、複合体を濾過により殺菌することを困難にして いる。

この問題を排除するために、多糖の大きさを減少させ、その取扱いを容易にする ことが既に提案されている。この目的のために種々の開裂（分解）（ｃｌｅａｖ ａｇｅ）方法が提案されている。即ち、例えば、これらの方法は超音波による断 片化（フラグメント化）（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｌｏｎ）又は酸性、塩基性又は 酵素媒体中でのアルカリ性加水分解による断片化である。しかしながら、これら の断片化は全く満足し得ないものである。実際に、これらの方法においては抗原 特異性（ａｎｔｉｇｅｎ　５ｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）に必要な化学的官能基が失 われることにより、特徴的なエピトープが全体的に或いは部分的に破壊される。

例えば、Ｓ、チフィ又はＮ　メニンギチジスＡ群の莢膜状多糖の酸性又はアルカ リ性加水分解により、多糖の抗原特異性に必要なアセチル基が除去される。更に 、アルカリ性加水分解によって得られた断片の正確な再アセチル化（ｒｅａｃｅ ｔｙ＋ａｔｔｏｎ）は、不可能ではないにしても、極めて困難である。

更に、アルカリ性加水分解による断片化法については、比較的均一な寸法の断片 を得ることは必ずしも可能ではなく、一方、医薬の製造においては一定なかつ標 準化された均一な製品が要求される。

超音波による断片化においては、例えば、Ｈ，インフルエンザより型の多糖の末 端ホスフェート基が超音波処理により失われることが示されている。このことに より、多糖鎖の分岐した位置にあるホスフェート基がかかる処理中に除去される 恐れが生じ得る。

更に、超音波を使用することにより比較的均一な大きさの断片を得ることができ るが、超音波法により十分に小さい寸法の断片を製造するためには非常に長い処 理時間を必要とし、これにより他の不利益、即ち、装置の急速な劣化を生じ得る 。その効率は限定されており、工業的な規模での超音波の適用は回避すべきであ る。

最後に、多糖の酵素解重合の使用は適当な酵素が知られている多糖に限定される 。しかしながら、この重大な不利益は酵素のその基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）に 対する高度の特異性に固有のもの（ｉｎｈｅｒｅｎｔ）である。

従って、ワクチンの分野においては、重要な技術的なかつ経済的な進歩は、従来 の方法の種々の不利益をもはや生ずるこのない解重合法を提供し得るものでなけ ればならない。換言すれば、特に、有利な性質を組合せて有する、抗原多糖の解 重合法を提供し得ることが必要である：その理由は下記の通りであるニーこの方 法は減少した数のグリコシド単位を有するオリゴ多糖であって、しかも、断片化 されるべき多糖の少なくとも１個のエピトープの必須の構造決定因子（ｓｔｒｕ ｃｔｕｒａｌ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）を保存しているオリゴ多糖を得ること を可能にする。

−この方法は意図する任意の抗原多糖構造体に使用し得る。

−この方法は十分に均一な寸法の断片を得ることを可能にする。

−この方法は安価でありかつその使用が極めて簡単である。

驚くべきことに、今般、これらの目的は酸化−還元解重合反応によって達成され ることが見出だされた。

今日まで、英語においては、しばしば、ＯＲＤの略号で記載されるこの方法は、 ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン及びＤＮＡを断片化するために、かつ、 本発明によって達成される目的とは全く異なる目的のために使用されていた。そ の目的は例えば生成物の粘度を低下させること、或いは、ヘパリンのごとき線状 分子の場合には異なる抗凝集活性（ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ　ａｃｔｉｖｉ ｔｙ）を有することが知られている、寸法のより小さい断片を得ることであった 。勿論、この方法を適用した物質は免疫学的に重要なものではないので、得られ た断片の反復単位の結合性（ｌｎｔｅｇｒｉｔｙ）の研究は行われなかった。

更に、ＯＲＤ反応はホスフェート基を破壊する（ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅ）が又 は炭水化物環の炭素−炭素結合の開裂（ｃ　Ｉ　ｅａｖａｇｅ）により炭水化物 環を破壊すると記載している多数の公知刊行物、例えば、Ｋ、Ｕｃｈｆｄａ、　 Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、（１９８ｇ）　１７３　：　１ １９−９９＋Ｈ，Ｕｃｈｉｙａｍａ、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃ ａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、（１９９０）　２６５　ニア７５３−７７５９　； 　Ｓｊｌ、Ｇｒｅｅｎ、Ｔｈｅ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ　Ｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ　ａｎｄＰｒｅｓｓ（１９８０）：１２７８　；　Ｋｏｃｈｅｔｋｏｖ等、 　Ｒａｄｉａｔｉｏｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ 、　Ｐｅｒｇａｍｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ、＜１９７９＞が存在す る〇この分野の従来の状態から受ける全体的な印象は、ＯＲＤ反応は一般的に破 壊的（ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅ）であると認識されていたということである。

従って、所望の目的、即ちエピトープの保存という目的のために、ＯＲＤ反応は 例えばアルカリ加水分解又は超音波処理を使用する方法より良好であり樗るとい うことを示唆するものは存在しなかった。

従って、本発明以前においては、個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）の免疫防御性（ ｉｍｍｕｎｅ　ｄｅｆｅｎｃｅ）を強化することを可能にする活性化剤としてオ リゴ糖を製剤中で使用することを可能にするために、特徴的な反復単位構造が保 存されているオリゴ糖をそれぞれの多糖の酸化−還元断片化により得ることが可 能であることは明らかにされてぃながったことである。

今般、原料多糖の抗原決定基の少なくとも１個が保存されているオリゴ糖を傳る のにＯＲＤ法を使用し得ることが発見された。

更に、酸化−還元解重合法は、抗原多糖に適用した場合には、ＯＲＤ反応は多糖 を不規則な方法で開裂せる遊離基生成反応であるという事実にも拘らず、寸法の 均一性の観点から完全に満足し得る断片を好ましい条件下で製造することを可能 にすることが認められた。

従って、本発明によればこ病原体（ｐｈａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ａｇｅｎｔ）がら 得られた抗原多糖の抗原決定基（ａｎｔｉｇｅｎｌｃ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ）の少なくとも１個が保存（ｐｒｅｓｅｒｖｅ）されているオリゴ糖であって、 （ｆ）上記抗原多糖を酸化−還元解重合反応にかけ、（ｉｆ）かく得られたオリ ゴ糖を回収し、ついで、所望ならば、（ｉｌｌ）このオリゴ糖を複合体パートナ −（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ　ｐａｒｔｎｅｒ）又は担体（ｃａｒｒｉｅｒ）と カップルさせて、オリゴ糖を複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）形で得るか又は担体 と結合させる工程によって得られたものであることを特徴とするオリゴ糖が提供 される。

“オリゴ糖”は分子の組合せを意味すると理解される；各分子は原料多糖と比較 して、減少した数のグリコシド単位を有しており、例えば、４〜５００個のグリ コンド単位を含有している。

オリゴ糖の平均分子量は多糖について前記した規則に従って定義される。一般的 には、本発明のオリゴ糖は０．３〜０９、特に、０．４〜０．８、例えば、０． ６〜０７の、セファ０−スＡＢＣＬカラム上での平均溶離定数を有し得る。換言 すれば、かかるオリゴ糖は２００，０００〜２，０００　ＤＥ９、特に１５０． ０００〜１０．０００　ＤＥｑ、特にｅｏ、ｏｏｏ〜３０，０００ＤＥ９の平均 分子量を有する。

本発明の好ましい要旨によれば、抗原多糖は、カビ（Ｆｕｎｇｕｓ）並びに、特 に、スタフィロコカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレブトコカス （Ｓｔ　ｒｅｐｔｏｅｏｅｃｕｓ）属、クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌ　ｌａ ）属、サルモネラ（Ｓａ　ｌ　ｔａｏｎｅ　Ｉ　Ｉ　ａ）属、ニジエリシア（Ｅ ｓｃｈｅｒｉｃｈｌａ）属、ネイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属、シゲラ（Ｓ ｈ　ｉｇｅ　Ｉ　Ｉ　ａ）属及びハエモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉ　Ｉｕｓ） 属のグラム陰性又はグラム陽性バクテリアであり得る病原体から得られる表面抗 原である。

バクテリア性病原体（ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｐａｔｈｏｇｅｎｊｃ　ａｇｅｎｔ 　）は、例えば、ストレプトコ力ス　プニュウモニアエ、ネイセリア　メニンギ チジス、サルモネラ　チフィ又はハエモフィルス　インフルエンザエである。

カビ性病原体（ｆｕｎｇａｌ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ａｇｅｎｔ）は酵母、又 は、特に、カンジダ（Ｃａｎｄ　ｆｄａ）属、クリプトコカス（Ｃｒｙｐｔｏｃ ｏｃｃｕｓ）属、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、リポミセス（Ｌｉｐｏ ｓｙｃｅｓ）属、リンコクラジエラ（Ｒｈｉｎｃｏｃｌａｄｉｅｌ　Ｉａ）属及 びロードトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属から選ばれ得る。

本発明の目的のためには、酸化−還元反応は、特に、チオール、例えば、グルタ チオン、システィン；酸素；ヒドロキノン：多価金属のイオン、例えば、鉄及び 銅のイオン：アスコルビン酸、過酸化水素；から選ばれ得る酸化−還元系の少な くとも１種の存在下で行われる；最後の二つが好ましい。

反応の活動性（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）に影響する種々の実験パラメーター（生成物 濃度、ｐＨ１温度、反応時間）は、原料多糖の特性、選択された酸化−還元系及 び取得することを希望する断片の平均寸法に従って当業者により容易に決定し得 る。これらの断片が特にワクチンを目的とする場合には、適当な平均寸法を有す る断片、即ち、良好な抗原性を保存しているかつ、適当な場合には、複合体の使 用に適合する寸法を有する断片、例えば、前記で定義した大きさの程度を有する 断片が得られるように種々のパラメーターを調節するために当業者により特に注 意が払われるであろう。一般的には、最適な反応条件は日常試験により決定し得 る。しかしながら、指針として、良好な結果を得ることを可能にする実験値は後 記の実施例において特定されている。

本発明の方法に使用されるべき多糖は既知の方法、特に、アルコール又はセチル トリメチルアンモニウムブロマイドを用いる沈殿又はゲル濾過により抽出１７、 精製し得る。これらの方法についの文献と１．では、特に、Ｒ，１，Ｗｈｉｓｔ ｌｅｒ、　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＣｈｅ＋＋＋１ｓｔ ｒｙ、（１９６５）　Ｉ：３−６２を参照し得る。

多糖は５ｍｇ／ｍΩの濃度の水溶液の形で調製することが有利である。

有利な濃度は０５−・−５０１Ｔ１ｇ／　ｍＤ　、特に、０５〜１０　ｓｇ／− の範囲で変動させ得る。かかる水溶液を出発原料として使用１．得る。

」二π己て定義（７た酸化−還元系は全部を一回で、又は、連続的な又は非連続 的な方法で、かつ、酸化−還元系：多糖の最終重量比が００１〜１０、特に、０ １〜５、例えば、０１〜ｌになる量で、多糖溶液（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄ ｅ　ｐｒｅｐａｒａｆ、１ｏｎ）に添加される。

本発明の方法は３〜８５、特に、３〜６．５のｐＨて使用（、得る。同様に、反 応媒体の温度は臨界的ではない：この温度は４〜６０℃、特に、１８〜４０℃の 間で変動し得る。

多糖の所望の断片化を達成するのに必要な時間は、特別な場合を除いて、一般的 には、３０分〜１時間である；例えば、Ｓチフィの多糖■１については、反応時 間は実質的により長い。反応時間は取得することを希望する断片の寸法に従って 調節し得る。

特別な態様においては、０５〜５０　ｅｇｇ／　ｓｉｔ　、特に、０５〜１０ｍ ｇ／ｎｉｌの濃度を有する多糖の水溶液に、最終製産が０．０１〜２５ｍｇ／ａ Ｊ　、　特に、０１〜１０　ｍｇ／　ｔｎβになるまでの量のアスコルビン酸を 添加する。酸素は反応媒体中に本来溶解している量で十分である；もし不十分な 場合には、反応媒体に酸素を更に吹込むことかできる。

反応を促進させるために、本発明の方法を種々の酸化状態の金属、例えば、鉄又 は銅の可溶性塩の存在下で行い得る。金属塩は１μＭ〜１００　ｍＭ、特に、１ 〜１０　ｍＭの濃度で添加し得る。

上記した態様の更に別の態様によれば、アスコルビン酸を過酸化水素で置換する ことができ、この過酸化水素は、場合により金属塩の存在下、ｏ、ｉ〜１００　 ｍＭ、特に、０．５〜１０　ｉＭまでの濃度で添加し５得る。

多糖をＯＲＤ解重合反応にかけることにより調製されたオリゴ糖は、このオリゴ 糖を断片化により誘導するのに使用された多糖の平均溶離定数より低い平均溶離 定数を有する分子の組合せからなる（この平均溶離定数の比較は明らかに同一の クロマトグラフィーカラ人を使用して行われたものである）。オリゴ糖は慣用の 方法、例えば、適当な沈殿剤、例えば、アヒトン又はアルコールによる沈殿、適 当な分離限界（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を有する膜上ての 濾過、排除−拡散又はイオン交換クロマトグラフィーを使用して単離１−２得る 。ついで、平均溶離定数に等しいか又はこれに近い溶離定数を有する分子を含有 するある種のオリゴ糖フラクシ旦ンた１」を使用するために選択を行い得る。

本発明のオリゴ糖は、特に晴乳動物におけるオリゴ糖の免疫原性を増大させるこ とのできる複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を形成させるために、場合により、ペ プチド又は蛋白質系の化合物又は他の有機重合体、例えば、ポリアクリレートと 共有結合によりカップルさせ得る。複合体のパートナ−は、特に、バクテリア蛋 白質、例えば、トキシン、対応するアナトキシン又はマルチマー状（ｓ＋ｕｌｔ ｉｉｅｒｉｅ）　ｔ・キシンのサブユニット並びに膜蛋白質、マルチマー状膜蛋 白質のサブユニット又は細胞質蛋白質であり傅る。例えば、ペルツシス（Ｐｅｒ ｔｕｓｓｉｓ）　トキシン、コレラ（ｃｈｏｌｅｒａ）　トキシン、テタナス（ Ｔｅｔａｎｕｓ）　ｌ・キシン及びジフテリアトキシンが挙げられる。これらの 蛋白質は元のバクテリアから抽出するか又は組換え法（ｒｅｃｏ＠ｂｊｎａｎｔ 　ｒｏｕｔｅ）により得ることができる。

ワクチンとして使用し得る複合体を得るためのオリゴ糖と複合体パートナ−との 共有結合によるカップリング反応は慣用の方法を使用して行い得る。例えば、複 合体パートナ−の官能基と反応し得る官能基をオリゴ糖上に形成させ得る。二官 能性カップリング剤を第１　リボ糖と反応させ、ついで複合体パートナ−と反応 させるか、又はこの逆のことを行い得る。これらの種々のカップリング方法を検 討するためには、特に、Ｊ、Ｍ、Ｃｒｕｓｅ、　Ｒ，Ｅ、Ｌｅｗｉｓ、Ｊｒ、編 、Ｃｏｎｔｒｉｂ。

ＭＩｃｒｏｂｉｏｌ、ｌ５ｓｕｎｏ１．　Ｂａ５ｅｌ、Ｋａｒｇｅｒ（１９８９ ）　１０　：　４ｇに掲載のＣｏｎｊｕｇａｔｅｓ　Ｖａｃｃｉｎｅｓと題する Ｖ、Ｅ、Ｄｉｃｋ及びＭ、Ｂｅｕｒｒｅｔの報文が参照される。更に、酸化−還 元断片化法においては、特に、Ｓ、ブニュウモニアエ６Ｂ型及び１９Ｆ型、Ｈ， インフルエンザエ及びＮ、メニンキチジスＡ群の多糖から誘導されたオリゴ糠中 に還元性基が導入される。従って、このことは、還元的アミノ化複合技術を使用 することを可能にする。

本発明のオリゴ糖の免疫原性は担体リポソームを使用し、これにオリゴ糖を共有 結合させることによっても増大させ得る。免疫原性は例えばシクロデキストリン 、リポソーム及びＩＳＯＯＭＳのごとき、イオン力又は疎水性力（ｈｙｄｒｏｐ ｈｏｂｉｃｆｏｒｃｅ）による組込み（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔ４ｏｎ）によりオ リゴ糖を保持するベクターによっても増大させ得る。

従って、本発明は種々の形、特に、複合体の形、担体リポソームとカップルさせ た形又はベクター中に組込まれた形で提供されるオリゴ糖に関する。本発明の好 ましい要旨によれば、オリゴ糖は複合体の形である。

本発明のオリゴ糖は、例えば、病原体によって誘発される感染、例えば、バクテ リア感染又は真菌症（ｍｙｃｏｓｉｓ）の影響を排除又は減少させるために、哺 乳動物、特に、ヒトの個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）の免疫防御性（Ｉａｎｕｎ ｅ　ｄｅｆｅｎｃｅ）を強化させるのに特に有用である。種々の抗原多糖から誘 導される本発明のオリゴ糖の混合物並びに本発明のオリゴ糖と、本発明のオリゴ 糖以外の活性成分との混合物も有用である。かかる混合物は多価ワクチン（ｐｏ ｌｙｖａｌｅｎｔ　ｖａｃｃｉｎｅ）を調製するのに適当である。

従って、本発明によれば、更に、 一本発明のオリゴ糖の少なくとも１種を活性成分として含有する医薬組成物。こ の医薬組成物は特にワクチンである；一本発明のオリゴ糖の治療における使用； −個体の免疫防御性を強化させる方法、例えば、予防接種方法（ｖａｃｃｉｎａ ｔｉｏｎ）であって、本発明のオリゴ糖の少なくともｌＮをかかる処置、例えば 予防接種を必要とする対象者（ｓｕｂｊｅｃｔ）に治療の観点から十分な量投与 することからなる、個体の免疫防御性の強化方法； 一個体の免疫防御性を強化させるための医薬組成物中における活性成分としての 本発明のオリゴ糖の使用；−（１）原料多糖を酸化−還元解重合反応にかけ、（ ｉｔ）所望ならば、得られたオリゴ糖を複合体パートナ−又はリポソームとカッ プルさせるか、又は、上記のオリゴ糖をリポソーム、ｌＳＣ０Ｍ５又はシクロデ キストリン中に組込み、ついで、（［ｉｉ）得られた生成物を適当な医薬の形に する、前記医薬組成物の製造方法；が提供される。

好ましい医薬組成物は少なくとも１種のオリゴ糖を複合体の形で含有している。

本発明の医薬組成物は慣用の方法で調製し得る。特に、本発明のオリゴ糖を薬学 的に許容される稀釈剤又は担体、例えば、発熱物質を含有していない（＋）ｙｒ ｏｇｅｎ（ｒｅｅ）生理的食塩溶液と組合せる。更に、本発明の医薬組成物は緩 衝液、保存剤又は安定化剤、補助薬及び適当な場合には凍結乾”燥賦形剤のごと き慣用の成分を含有し得る。本発明のオリゴ糖は稀釈剤、担体又は前記したごと き成分の存在下で保存される、別法として、稀釈剤、担体又は成分は使用直前に 添加し得る。

従って、本発明によれば、更に、 ａ）活性成分としての本発明のオリゴ糖の少なくとも１種から本質的になる医薬 組成物： ｂ）Ｍ学的に許容される稀釈剤又は担体、緩衝力（ｂｕｆｆｅｒｊｎｇ　ｐｏｗ ｅｒ）を有する化合物、保存剤又は安定化剤及び補助薬から選ばれた少なくとも １種の成分からなる組成物； Ｃ）上記ａ）及びｂ）の組成物の、例えば混合物の形での同時的投与（ｃｏｎｃ ｏｓｉｔａｎｔ　ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）のための取扱説明書（ｉｎｓ ｔｒｕｃｔｉｏｎｓ）　； を含有するキット（ｋＩｔ）が提供される。

本発明の医薬組成物は任意の慣用の経路、特に、例えば注射可能な懸濁液の形で 、皮下、筋肉内又は静脈内に投与するか又は経口投与し得る。投与は単一投与に より、又は、ある時間間隔の後に一回又は数回反復して行い得る。適当な投与量 は種々のパラメーター、例えば処置を受ける個体又は投与方法によって変動する 。しかしながら、良好な結果は１〜２００μｇのオリゴ糖を約０．５−の容量で 単位投与することにより得られ得る。

本発明を以下の実施例によりかつ図１〜４を参照して詳細に示す。

図１はＳ、ブニュウモニアエ１４型（ａ）、ｌ型（ｂ）、Ｓ、チフィ（Ｃ）、Ｓ ブニュウモニアエ６Ｂ型（ｄ）、Ｈ，インフルエンザ二Ｂ型（ｅ）、Ｓ。

ブニュウモニアエ１９Ｆ型（ｆ）、Ｎ、メニンギチジスＡ群（ｇ）、Ｓ、ブニュ ウモニアエ１８Ｃ型（ｈ）、２３Ｆ型（ｉ）、クレブシェラ　オザエナエ（Ｋｌ ｅｂｓｊｅｌｌａ　ｏｚａｅｎａｅ）血清型（ｓｅｌｏｔｙｐｅ）　Ｋ４　（ｊ ）　、シゲラ　フレクスネリ（Ｓｈｌｇｅｌｌａ　ｒＩｅｘｎｅｒ＋＞血清型１ ｂ　（ｋ）及びクリブトコカスネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　 ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）菌株９８　（１）の莢膜状（ｃａｐｓｕｌａｒ）多糖の 反復単位の式を表わす。（ａ）は中性多糖に相当すること、（ｂ）及び（Ｃ）は 多糖鎖中にウロン酸を含有する多糖に相当すること、（ｄ）　〜（ｉ）はリン酸 化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ）多糖に相当すること、（ｊ）及び（ｋ）は 、それぞれ、アニオン性又は中性のリボ多糖に相当すること及び（１）はアニオ ン性カビ多糖に相当することが観察され得る。

図２ａ及び２ｂはセファロースＡＢＣＬカラム上でのＳ、チフィ（２ａ）及びＳ 、プニュウモニアエｌ型（２ｂ）の溶離図を表わす。クロマトグラフィーの条件 は下記の通りである：５１ｇ／−の多糖溶液ｒ　２ｅｌを、予め０．２　Ｍ　Ｎ ａＣ（ｌを用いて平衡化したセファロースカラム上に負荷する。溶離は０．２　 Ｍ　ＮａＣＮを用いて４２　ｓｊ！　／ｈの速度で行われる。光学濃度を２０８ ｎｍで測定することにより溶離図を自動的に分析する。図２ａ及び２ｂにおいて カラムの死容量は７６．５６ｓｊ７であり、全容量は２０１．８４　ｍｆ）であ る。

図３はデキストランについての５００，０００〜２０．０００の検量線である。

図４ａおよび４ｂはＳ、チフィ　（４ａ）及びＳ、ブニュウモニアエｌ型（４ｂ ）の酸化−還元断片化により得られたオリゴ糖の、セファロースＡＢＣＬカラム 上での溶離図である。クロマトグラフィーの条件は図２について述べたものと同 一である。

実施例　１： アスコルビン酸の存在下でのＳ、チフィの多糖Ｖｌの断片化。

Ｐｒｏｇ、ＩａｓｕｎｏＭｏｌ、５ｔａｎｄａｒｄ、（１９７２）　５　：　４ ８５に記載のＧｏｔｓｃｈ　Ｉ　ｉｃｈ等の方法に従って得られた多糖Ｖｔの乾 燥粉末を、発熱物質を含まない水（ｐｙｒｏｇｅｎ−ｆ’ｒｅｅ　ｗａｔｅｒ） に１ｍｇ／ｇ１の量で溶解させた。この多糖の平均分子量（ＭＹ）はセファロー スＡＢＣＬカラム上での零のＫＤに相当する。

３７℃に予熱したこの溶液５００１に、１００箇Ｍのアスコルビン酸、１０　ｉ ＭのＣｕ５Ｏおよび１０　ｄのＦｅＳＯ４を含有する水溶液１２．５ｄｌを２時 間にに亘って、連続的にゆっくり添加した；最終アスコルビン酸濃度は０．４４ −ｇ／ｍＮに相当する。かく得られた反応溶液のｐＨは約ｐＨ４であった。穏や かに攪拌しながら３７℃で約３時間（反応剤の添加時間を含む）反応を行った。

ついで反応混合物を３に限外濾過膜（カットオッフ＝３キロダルトン）上で濾過 した。残留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を０．５　Ｍ　ＮａＣｇ溶液で一回洗浄し ついで水で２回洗浄した。残留物を約１００−ｇの水に溶解しついで凍結乾燥し て保存した。

開裂（ｃｌｅａｖａｇｅ）の水準は、セファロース４ＢＣＬゲル上での濾過によ って得られた曲線（図４ａ）の積算（１ｎｔｅｇｒａｔｊｏｎ）により計算して 、９５％程度である。更に、かく得られるオリゴ糖の平均ＭＶをＧｒａｎ８ｔｈ 等の方法（前記参照）により決定した。平均溶離定数として表される平均ＭＷは ０．６程度であり、これは６０．００００Ｅ９の暇と等量である（デキストラン を参照として使用）。

ＮＭＲ（核磁気共鳴）スペクトル分析によるオリゴ糖の分析は、多糖の反復単位 に特有の構造は断片化後においても保持されていることを明らかに示した。特に 、分岐した官能基、又は、糖（ｓｕｇａｒ）は多糖骨格から失われていなかった 。

多糖ｖｌの反復単位に特有の化学的官能基は比色分析法（ｃｏｌｏｒｉｓｅｔｒ ｌｃ　ａｓｓａｙ）により分析した。分岐した位置の０−アセチル基はＢｉｏｌ 、Ｃｈｅｍ、（１９４９）　１８８　：　２４９に記載のＨｅ５ｔｒｉｎの方法 により検定し、線状構造体のポリ酸（ｐｏｌｙａｃｉｄ）はＣｌ１ｎ、Ｊ、Ｍｉ ｃｒｏｂｉｏｌ　。

（１９１１８）　２８　：　７１９に記載の５ｔｏｎｅ等の方法により検定した 。検定は非断片化多糖ｖ１と形成されたオリゴ糖とについて平行的に行った。

多糖とオリゴ糖とについて測定した［０−アセチル］／［ポリ酸］比は同一であ った。このことは多糖の断片化法が移動し易い０−アセチル基の全てを保存する ことを可能にしていることを示している。

過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の存在下でのＳ、チフィの多糖Ｖｔの断片化。

Ｇｏｔｓｃｈｌ　ｌｃｈ　等の方法（前記参照）に従って得られた多糖Ｖｉの乾 燥粉末を、０．２Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ７，５ニ０．４　ｍｇ／ｅＤｅＤ量で溶 解させた。この多糖の聞はセファロースＪＢＣＬカラム上で測定して、零のＫＤ に相当する。

３７℃に予熱したこの溶液１００　ｄに、０．３　ｍｇｈＩのＨ２Ｏ２を含有す る水溶液　ｌｌｌｌ１ｇ及び２．６　ｍｇ／　ｍｌ　（７）ＣｕＳＯ４溶液１１ 　ｔａｎ　Ｇ穏やかに攪拌しながらゆっくり添加した。穏やかに攪拌しながら３ ７℃で約１時間反応を行った。

反応時間を１時間の代わりに２時間としたこと以外、同一の条件下で実験を繰返 した。

両者の場合に、かく得られたオリゴ糖を回収し、実施例１と同様に精製した。

同様に、かく得られたオリゴ糖の特性を実施例１に記載の方法で測定した。その 結果は下記の通りであるニー両者の場合において、多糖Ｖｔの開裂の水準は１０ ０％である。

−１時間および２時間後に形成されたオリゴ糖の平均ＭＹは、それぞれ、０．７ 及び０．８　ノＫＤｊ：：相当する；これは、３０．０００及び１０．０００　 ＤＥ　と等量である。

一両者の場合において、反復単位の構造に変化は認められなかった。

実施例　３： Ｎ、メニンギチジスＡ群の多糖の断片化。

Ｇｏｔｓｃｈｌｌｃｈ　等の方法（前記参照）に従って得られたＮ、メニンギチ ジスＡ群の多糖の乾燥粉末を、０．２　Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ７，５にＩ　Ｉ１ ｇ／−の量又は５ｍｇ／ｄの量で溶解させた。この多糖の平均ＭＷはセファロー スＡＢＣＬカラム上で測定して、０．１５のＫＤに相当する。

ｌＩｇ／ｌＩｇ及び５　Ｉ１ｇ／ｌａｐの溶液を３７℃に予熱した。

３ａ）　ｌ　ｍｇ／ｉｇの溶液１００−に、１００　ｍＭのアスコルビン酸、１ ０　ｓＭのＣＬＩＳＯ４及び１０　ｍＨのＦｅＳＯ４を含有する反応溶液０．７ ５ｍ、１７を添加した。攪拌しながら３７℃で１時間３０分反応を行った。つい で、上記反応溶液０．７５１．１？を再び添加した；かくして、０．２６　ｍｇ ／−の最終アスコルビン酸濃度が得られた。反応を同一の条件下で更に１時間３ ０分行った。

３ｂ）　５　Ｄ／−の溶液１００　ｍｌに、１００　ｍＭのアスコルビン酸、１ ０　ｓＭのＣＬＩＳＯ４及び１０　ｄのＦｅＳＯ４を含有する反応溶液１．５　 ｒａｐを添加した；最終アスコルビン駿濃度は（１，２８ｍｇ／１ｎｆｌに等し かった。

攪拌しながら３７℃で１時間３０分反応を行った。

３ａ）及び３ｂ）で得られたオリゴ糖を実施例１に記載したごとき方法で回収し 、精製した。同様に、実施例１に記載したごとき方法で分析を行った。両方の場 合に、開裂の水準は１００％であり、ＮＭＲにより分析した場合に、反復単位の 構造の劣化は認められなかった。

３ａ）で得られたオリゴ糖の平均ＭＶは０．７のＫＤ（３０，０００ＤＥ９と等 量）に相当し、３ｂ）で得られたオリゴ糖の平均Ｍ１は０．４のＫＤ（１１０， ０００ＤＥ９と等量）に相当した。

これらの結果は、全体として、実験条件（多糖及び反応性酸化−還元剤濃度並び に反応剤の添加方法及び反応時間）を変化させることにより、実質的に異なる平 均間を有するオリゴ糖が得られるが、１００％の開裂水準は保持されることを示 している。

最後に、この実施例と実施例２は、この断片化は中性に近いｐＨテ行ワしている ので、断片化は酸化−還元によるものであって、酸又はアルカリ加水分解による ものではないことを実際に示している。

実施例　４： Ｓ、フ：ユウモニアエ１型及び１９Ｆ型の多糖及びＨ，インフルエンザ二Ｂ型の 多糖の緩衝媒体中での断片化。

１９８２年６月１８日発行のフランス特許出願ＦＲ２，４９５，９３９号に記載 の方法で得られたＳ、プニュウモニアエ１型及び１９Ｆ型の多糖及びＧｏｔｓｃ ｈ　Ｉ　ｉｃｈ　等の方法（前記参照）に従って得られたＨ、インフルエンザ二 Ｂ型の多糖を使用して、実施例３（３ａ及び３ｂ）を繰返した：その結果は下記 の通りである： ＮＤ＋　測定せず　□ 川　（核磁気共鳴）スペクトル分析による芽すゴ糖の分析は、多糖の反復単位に 特有の構造は断片化後においても保存されていることを明らかに示していた。

実施例　５： Ｎ、メニンギチジスＡ群の多糖及びＳ、ブニュウモニアエｌ型、１４型、Ｌ８Ｃ 型、１９Ｆ型及び２３Ｐ型の多糖の非緩衝媒体中での断片化。

（１）　５　ｍｇ／−ｇの濃度の多糖溶液を発熱物質を含まない水中で調製した こと、（ｉｌ）反応溶液の全てを２．５−ｇｈりの最終濃度になるまで一回で添 加したこと及び（１１ｉ）反応を１時間だけ行ったこと以外、実施例３及び４に 記載の方法で多糖溶液の調製と反応を行った。

得られたオリゴ糖を実施例１に記載の方法で回収し、精製した。

その特性を実施例１に記載の方法で調べた。多糖の各々につ０ての開裂水準は１ ００％であり、反復単位の構造の劣化は認めれらな力）つた。この最後の点は比 色分析によっても示された二ヘキ゛ノースの分Ｇａｔｔ等の方法により、ラムノ ースの分析はＪ、Ｂｉｏｌ　、Ｃｈｅ−、（１９４ｇ）より行った。Ｓ、プニュ ウモニアエ１４型の多糖と、断片化１こよりこれから誘導されるオリゴ糖の場合 には、［ヘキソース］／［ヘキ゛ノースアミン］比は実質的に同一であった。こ のことは、Ｓ、プニュウモニアエ１８ｃ型及び２３Ｆ型の場合における、それぞ れ、［ラムノース〕ｌ［ヘキソース］比及び［ホスフェ−トコｌ［ヘキソース］ 比についてもあてはまった。

オリゴ糖のＮＭＲスペクトル分析によっては反復単位の不均一性を示す（言号は 検出されず、オリゴ糖は変化していな’−Ｘ（ｉｎｔａｃｔ）反復単位からなる ことを示していた。

最後に、オリゴ糖の平均ＭＹに関しては、その結果は下記の通りである： Ｓ、チフィのオリゴ糖Ｖｉ／コレラトキシンのＢサブユニ・ノド複合体の調製。

６ａ）オリゴ糖Ｖｉ中へのＮ１３基の導入実施例１で得られたオリゴ糖Ｖｔの凍 結乾燥生成物をリン酸塩緩衝液ｐＨ８に１０　ｇ／ｍｊ７の量で溶解した。この 溶液にジアミノヘキサンとＮａＣＮＢ）Ｉ、、とを、各々、最終濃度が１２．５ −ｇ／■ｇになるまでを溶解して添加した。室温で６日間反応を行った。ついで 、反応溶液を水に対して透析し、凍結乾燥させた。＾ｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｓ、 （１９７５）　６４二２８４に記載の５ｈｎｙｄｅｒ等の方法に従って分析を行 って、Ｎ１３基が実際に導入されたことを確認した。同様に、）ｌｅｓｔｒｉｎ の分析方法により０−アセチル基が依然として保存されていることが示された。

Ｂｂ）反応性官能基の導入 ８ａ）で得られた凍結乾燥生成物を４０　ｍｇ／−の量で溶解させた。

この溶液２０−に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中のジスクシンイミジル スベレート（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｙｄｙｌ　５ｕｂｅｒａｔｅ）　（ＤＳＳ） の４ｈｇ／ｍｕの溶液ｌ１ｌＯ−を添加した。室温で１時間反応を行つｔ、−０ つ（１て、生成物を開Ｓｏ／ジオキサン混合物中で沈殿させた。

Ｂｃ）復＾ ６１〕）で得られた沈殿を０．５　ＨＮａ（Ｊ）溶液中に４０　ｍｇ／ｍΩの量 で溶解させた。これと羽行的に′、０４２Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ６，５中の、ニ ー７レラトキ＝ン】・のＢサブユニ・月の１ｈＨ／ｍ、ｌＪの溶液を調製した（ Ｔａｙｏｔ等、ｌミｕｒ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、（１９８１）　１１３：　２４９ 参照）。

かく調製したニ一つの溶液を混合１−７た。オリゴ糖／蛋白質重量比は約１であ った。室温で１５時間反応を行った。

６ｄ）精製 ついて、混合物を分離限７ｉ　（ｓｅｐａｒａｔ、　ｉｏ口↑ｈｒｅｓｈｏｌｄ ）か５°１０４り′ルト一の膜を取付けた隔夕）ａ過ミニカー　トリ・ソジ（Ｍ ｉｌｌｉｐｏｒｅ）ｌｆ濾過］２で、カップル１．ていない蛋白質たオリゴ糖を 除去した。残留物を０．３ＭＮａＣβで洗浄し２ついて、滅菌濾過を行った後、 ＮａＣｊ７１／ｌｏｔ’ｌＯ、メルチオレーｔ−（ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｐ）　 ｌ／１０．１１１００中に２００ｇｇ　／ｍΩの魚で、４℃で保存した。

実施例　７ オリゴ糖／テ々ナス　アカトキシン複合体の調製実施例５におい’ＵＳ、ブニコ ウ玉ニアエ１４ｃ型及び２３Ｆ型の多糖から得たオリゴ糖及び実施例１において Ｓ　チフィの多糖■１から得たオリゴ糖を複合させた。操作は実施例６に述べた 方法と同様（こ行い、コレラトキシンのｌブユニットの代わりに、Ｊ、ＢａＣｔ 、　（１９５４）６７：　６７１に記載のＭｕｅｌｌｅ＋及びＭｉｌｌｅｒの方 法に従って調製したテタナス　アナトキシンを使用した。

Ｓ　ブニュウモニアエから得られた複合体を２５０ｇｇ　／ｌａｎの量で複合体 の免疫原性の例証 ＯＦＩマウス（ＩＦＦＡ　Ｃｒｅｄｏ）を８個のバッチに分割した。バッチから の各マウスに実施例６及び７て調製した溶液の一つを０．５　ｔａ（ｌを投与す るか、又は、これと平行して、対応する天然多糖０．５−を投与した。注射は皮 下に行った。これらの注射を１４後に繰返した。これと平行して、対照には生理 的食塩水だけを投与した。

最初の注射から１４日及び２８日後に、第１の血液試料を採取し抗多糖抗体（ａ ｎｔｉ−ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）　１ｇＧをＥＬＩ ＳＡ法によって滴定した（滴定プレートには非断片化多糖を被覆した）。１４Ｂ 及び２８日後の抗、体水準は複合体か免疫原性（ｉｍｓｕｎｏｇｅｎｉＣ）であ ることを示した。上記複合体の各々において、抗体水準は対応する天然多糖によ って誘発されるものより高かった。更に、Ｔ−依存性抗原の特徴である反発効果 （ｒｅｂｏｕｎｄ　ｅｆＴｅｅｔ）も認められた。

実施例　９ 活性成分と１．て複合体を含有するワクチン製剤組成物。

実施例７て得られたＳ、チフィのオリゴ糖Ｖｉ／テタナス　アカトキシン複合体 を、ヒトの皮下に注射するための、０．５　−のワクチン投与剤に製剤した。単 位投与剤当りの組成は下記の通りである。

−８チフィのオリゴ糖ｖ１ の複合体　１０μｇ −リン酸塩緩衝液　ｐＨ７４７５μｇ （Ｐ０４イオンとして） −ＮａＣＤ４２５Ｄμｇ −メルチオレー１−　０．０５μｇ −注射用水　全体が０．５　−に なる量 ｂ＞　−［−〉ｊ）−Ｑ−５ｕ−１−＞４＠羽輛１−〉３トーｘ呻Ａ＜１÷０Ｆ ｉｇｕｒ＠　ｌ　（ｃｏｎｔｉｎｕａｔｉｏｎ）ａ・にｄａ 鳴　−一　々噛　ｍ− −１中−−−１−１１−ｍ−神１−１−一φ−鴫や一一中−−昏４神争−■や− 一φ８１ｕτｅ２＆

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．病原体から得られた抗原多糖の抗原決定基の少なくとも１個が保存されてい るオリゴ糖であって、（ｉ）上記抗原多糖を酸化一還元解重合反応にかけ、（ｉ ｉ）かく得られたオリゴ糖を回収し、ついで、所望ならは、（ｉｉｉ）このオリ ゴ糖を複合体パートナー又は担体とカップルさせて、オリゴ糖を複合体の形で得 るか又は担体と結合させる工程によって得られたものであることを特徴とするオ リゴ糖。
2. ２．セファロース４ＢＣＬカラム上で測定して、０．１〜２の平均溶離定数を有 する、請求項１に記載のオリゴ糖。
3. ３．セファロース４ＢＣＬカラム上で測定して、０．４〜０．８の平均溶離定数 を有する、請求項２に記載のオリゴ糖。
4. ４．セファロース４ＢＣＬカラム上で測定して、０．６〜０．７の平均溶離定数 を有する、請求項３に記載のオリゴ糖。
5. ５．病原体から得られた抗原多糖は、病原体バクテリアから得られた莢膜状多糖 である、請求項１〜４のいずれかに記載のオリゴ糖。
6. ６．病原体バクテリアは、スタフィロコカス属、ストレプトコカス属、クレブシ エラ属、サルモネラ属、エシエリシア属、ネイセリア属及びハエモフィルス属か ら選ばれる、請求項５に記載のオリゴ糖。
7. ７．病原体バクテリアは、Ｓ．チフィ、Ｓ．プニュウモニアエ、Ｎ．メニンギチ ジス及びＨ．インフルエンザエから選ばれる、請求項６に記載のオリゴ糖。
8. ８．複合体の形で提供される、請求項１〜７のいずれかに記載のオリゴ糖。
9. ９．複合体パートナーは、ペプチド、蛋白質及び有機重合体から選ばれる、請求 項８に記載のオリゴ糖。
10. １０．複合体パートナーは、ペルツシストキシン、コレラトキシン、テタナスト キシン及びジフテリアトキシンから選ばれる、請求項９に記載のオリゴ糖。
11. １１．哺乳動物の免疫原性を増大させることのできるベクター中に組込まれてい る、請求項１〜７のいずれかに記載のオリゴ糖。
12. １２．リポソーム中に組込まれている、請求項１〜７のいずれかに記載のオリゴ 糖。
13. １３．病原体から得られた抗原多糖の抗原決定基の少なくとも１個が保存されて いるオリゴ糖を製造する方法であって、（ｉ）上記抗原多糖を酸化一還元解重合 反応にかけ、（ｉｉ）かく得られたオリゴ糖を回収し、ついで、所望ならば、（ ｉｉｉ）このオリゴ糖を複合体パートナー又は担体とカップルさせて、オリゴ糖 を複合体の形で得るか又は担体と結合させることを特徴とするオリゴ糖の製造方 法。
14. １４．酸化一還元解重合反応をアスコルビン酸又は過酸化水素であある酸化一還 元剤の存在下で行う、請求項１３に記載の方法。
15. １５．酸化一還元解重合反応をアスコルビン酸又は過酸化水素であある酸化一還 元剤の存在下及び鉄又は銅塩の存在下で行う、請求項１４に記載の方法。
16. １６．請求項１〜１２のいずれかに記載のオリゴ糖の少なくとも１種を活性成分 として含有する医薬組成物。
17. １７．ワクチン組成物を構成する、請求項１６に記載の組成物。
18. １８．個体の免疫防御性を強化するための、特に予防接種を行うための医薬組成 物の調製における、活性成分としての、請求項１〜１２のいずれかに記載のオリ ゴ糖の使用。