JPH06506588A - オートインデューサー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 オートインデューサー オートインデューサーは、微生物により代謝に際して産生され、次いでその微生 物の遺伝子の発現を高める作用をする化学分子であって、しばしば極めて小さな 分子である。

Ｎ−（β−ケトカプロイル）ホモセリンラクトン［３−オキソ−Ｎ−（テトラヒ ドロ−２−オキソ−３−フラニル）へ牛サンアミド〕　（式２）は、以前から海 洋微生物であるビブリオ・フィッシエリ　（Ｌ工さＬ１旦ｆ　ｉ　ｓ　ｃ　ｈ　 ｅ　ｒ　ｉ　）においてｌｕｘ遺伝子、従って生物発光表現型の発現を調節する オートインデューサーとして認識されてきた（ニーベルハルト（Ｅｂｅｒｈａｒ ｄ）ら、１９８１）。

それは細菌フェロモンであることか解明されたが（ニーベルハルト（Ｅｂｅｒｈ ａｒｄ）、１９７２）、生物発光性細菌の１種において同定されたにすぎず、信 号伝達、たとえば他の細菌への栄養生育性の伝達（ニーベルハルト（Ｅｂｅｒｈ ａｒｄ）ら、１９８１）におけるそれより広い役割については科学的証明の基礎 はこれまで得られていない。ビブリオ・フィッシエリのオートインデューサーは 八−因子（式４）、すなわちストレプトマイシス・グリセウスＣ３ｔｒｅｐｔ。

ｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ）により産生され（シルバーマン（Ｓｉｌｖｅｒｍ ａｎ）ら、１９８９：ｖイゲン（Ｍｅ　ｉｇｈｅｎ）、１９９１）　、胞子形成 およびストレプトマイシン合成の自己誘導を起こす調節分子に構造が類似するこ とが観察された。考え方においては、これは数人の研究者かこれらの分子に関し てより広い役割を示唆するものとして採用している。現在理解されている水準を 示すために、２人の最近の概説者から下記を引用する・“恐らくこの化学的関係 は、細菌が自己の環境を感知するために用いるメカニズムが共通の起源をもつこ と、ならびに構造および作用様式の類似する広範な両群の信号伝達分子、すなわ ち′細菌ホルモンがあることを示唆するものであろう。″（ンＩレバーマン（Ｓ 　ｉ　Ｉ　ｖｅ　ｒｍａｎンら、１９８９）。

るために用いられる広範な一計の信号伝達分子（アロモノ、フェロモンまたはホ ルモン）の一部であるという可能性が示唆された。′　（マイゲン（Ｍｅｉｇｈ ｅｎ）、１９９１）。

これらの２つの主張は広範な一計の信号伝達分子の可能性を示しているが、上記 の仮説を確認する実験的基礎はなく、Ｎ−（β−ケトカプロイル）ホモセリンラ クトン（式２）がビブリオ・フィッシエリおよびその近縁のビブリオ・ロゲイ（ Ｖｉｂｒｉｏ　ｌｏｇｅｉ）以外の微生物の遺伝子調節に直接に関与するという 証明は全く無いことを再度強調すべきである。さらに非発光種を含めた他の細菌 につきそれらが関連のビブリオ・ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ　ｈａｒｖｅｙｉ）の ｌｕｘ系に関するオートインデューサー（Ｎ−β−ヒドロキシブチリルホモセリ ンラクトン）　（式３）を産生ずる可能性についての研究は、地球上に相補性を 有する供給源を同定することができなかった（グリーンバーブ（Ｇｒｅｅｎｂｅ ｒｇ）　ら、１９７９）。

原核生物におけるカルバペネム合成の研究を目的とした研究企画において、本発 明者らは最近、式２の化合物がエルウィニアＩＩ（Ｅｒｗｉｎｉａ）のカルバペ ネム合成の発現を調節することを見出した。式２および３ならびにそれらの同族 体を含めて、種々の微生物において遺伝子の発現を制御する（増強または減縮） 一群の化合物があると思われる。この群を以下において場合によりＮ−（β−ケ トカプロイル）ホモセリンラクトンまたは同族体′と呼ぶ。詳細には式２および ３の化合物を含めたこの一計の化合物のうち若干は、それらがオートインデュー サーとして作用する種々の微生物により産生される。

本発明者らは、この一群の化合物のうち多数の量子を合成した。それらにはその 光学活性異性体が含まれる。本発明には、これまで報告されていないこの群の量 子が新規化合物として含まれる。また本発明には、この一群の化合物を微生物に おける遺伝子発現の制御に使用する用途も含まれる。この用途に実際に含まれる もののうち若干について以下に述べる。

たとえば１観点においては、本発明はビブリオ・フィッシエリ、ビブリオ・ロゲ イおよびビブリオ・ハーベイ以外の微生物の遺伝子発現を制御するために下記式 １の化合物を使用する用途を提供する：ＹはＯｌＳまたはＮＨであり、 ＸはＯｌＳまたはＮＨであり、 Ｒは５を換されていてもよいＣＩ　Ｃ１！アルキルまたはアシルである。

好ましくはｎは２であり、従って環は５員である。ＹとＸが同一である必要はな いが、式２および３の化合物の場合のように両者は好ましくは０である。好まし くはＲはＣ２Ｃｍアシルである。好ましくはＲはβ−位にケト基またはヒドロキ シル基を保有する。

他の観点においては、本発明は新規化合物として前記式１の化合物の光学活性異 性体を提供する。好ましくは光学活性異性体はＬ−異性体である。これらは遺伝 子発現の増強において対応するＤ−異性体より活性であることが証明されたから である。Ｄ−異性体は異性体発現の抑制に有用となる場合がある。

これらの化合物は微生物において遺伝子発現を制御するために用いられる。行わ れる制御は遺伝子発現を減縮させるものであってもよいが、増強させろ方か普通 である。関連する微生物には細菌−一グラム陰性およびグラム陽性双方−−１酵 母および菌類が含まれる。本発明は、その発現か一計の化合物のうち少なくとも １種類により何らかの形で影響されるある遺伝子を多様な微生物がもつというこ とに基づく。この制御技術は、自身ではこの一計の化合物のに含まれるオートイ ンデューサーを産生ずることかできないが、外性オートインデューサーの存在下 では一般に容易に検出しうる様式で遺伝子を発現することができる微生物の利用 を伴う場合がしばしばある。後に詳述するこれらの微生物の２例は下記のもので ある 一遺伝子構成体ｐＳＢ２３７゜これは生物発光表現型を大腸菌（Ｅ、Ｃｏ１１） において発現することができるが、ただしインデューサー、好ましくは式２の化 合物の存在下においてのみである。

−突然変異菌株Ｂ１０００２／ｍｕ２２．エルウィニア・カロトボラ（Ｅ、ｃ± 匹刃」−９−ツａ）ＡＴＣＣ３９４８の突然変異により形成。母体と異なり、突 然変異体２２はイノデューサー、たとえば式２の化合物の存在下においてのみカ ルバペネム抗生物質を合成することかできる。

このような技術の一例において本発明は、試料中のＮ−（β−ケトカプロイル） ホモセリノラクトンまたは同族体の検査法であって、そのラクトンまたは同族体 による遺伝子発現の増強のために選ばれた検定細菌と接触させた状態で試料をイ ンキュベートし、そのラクトンの検査法としそ遺伝子発現を検出することによる 方法を提供する。大腸菌［ｐＳＢ２３７］由来の生物発光表現型を利用した検出 限界は、インデューサーに対する細菌培養物のａ露時間に依存する。後記の実施 例４に示すように、Ｌｏｎｇ／ｍｌ（培養物）を越える濃度においては生物発光 の誘導に要するのは１０分未満である。より低い濃度では誘導が徐々に遅くなり 、ただし８０ｐｇ／ｍｌ程度の低い製炭でも約２０時間のインキュベーション後 に上口濃度の対照と区別することができる。

このような技術の他の例において本発明は、特定の条件下でＮ−（β−ケトカプ ロイル）ホモセリンラクトンまたは同族体を産生ずることが知られている第１細 菌の、試料中における存在を検査する方法であって、この特定の条件下でそのラ クトンまたは同族体による遺伝子発現の増強のために選ばれた検定細菌と接触さ せた状態で試料をインキュベートし、第１細菌のラクトンの試験法として遺伝子 発現を検出する方法を提供する。

このような試験法は細菌全般、または特定の条件下でオートインデューサーを産 生ずることが知られている特定の細菌に利用することができる。たとえば緑膿菌 （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）は特定の増殖条件下でのみ （実施例４参照）、詳細にはＦｅ（ＩＩＩ）を補充した制限または最少増殖培地 の使用下でのみオートインデューサー（式２）を産生ずる。同様にリステリア・ モノサイトジェネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）が低温 ＨＡＮ後にのみラクトンまたは同族体を産生ずることが先に証明されている。特 定の細菌のこれらの特色は、微生物の混合物中におけるこれらの細菌に対する特 異的試験法の基礎を与える。

緑膿菌は薬剤組成物、特に注射用薬剤の調製に用いる１００ｍ１のＨｚＯ中に存 在しないことが要求されるべき細菌である。従ってこの細菌に関する迅速アッセ イ系を開発することが強く要望されている。既存の迅速アッセイ法、たとえばＤ ＮＡプローブまたは抗体プローブは、生細胞と死細胞を区別し得ない。これは受 け入れられない限界であって、微生物を増殖させたのちに初めて避けることがで きる。新しい方法、たとえば緑膿菌に対して特異的な、上旦五ＡＢ遺伝子を含む 遺伝子工学的に形成されるハタテリオファーシの構５３２法は１つの可能性では あるが、開発費か高い。

生するという事実が、迅速試験法の基礎となる。

期に近づくまでは高水準の光を発しないであろう。しかしこれらの細胞を低濃度 のゲル中に固定化すると、細菌は極めて速やかに発光するであろう。これはオー トインデューサーの拡散が制限される結果であると推定される。

緑膿菌に関するアッセイの概念は下記のとおりである。水を濾過し、細菌が含ま れる場合にはこれを採集し、大腸菌［ｐＳＢ２３７］を含むゲル（寒天、アガロ ースまたはゼラチン）でフィルターを覆う。生存緑膿菌細胞により産生されるイ ンデューサーは拡散が制限され、周囲の大腸菌細胞中において速やかに生物発光 を活性化するＩｍ炭に達する。有効光線中においてプラークが現われ、これを検 出および計数することができる。相補活性を生じる最適な培地条件を制御しうる ことにより、アッセイをかなり特異性なものにすることができる。

この技術のさらに他の例においては、他の場合には発現されない特定の遺伝子を 発現させるために、式１の化合物を微生物培養物に添加することができる。たと えばこの化合物を用いて抗生物質の産生を誘発することかできる。

さらに他の例においては、微生物の代謝、増殖および／または採取（これらの現 象を本明細書ではまとめて増殖と呼ぶ）を刺激または促進するのに有効な濃度の オートインデューサーを含有する、微生物、たとえば細菌の増殖培地を調製する ことかできる。これには存在するすべての生物が包含され、または場合によりそ れは試料中の特定の群の生物を他より優先して促進するであろう。

ビブリオ・フィノンエリのｌｕｘオペロンの調節につき多数の研究かなされた。

この場合は式２のオートインデューサーが重要な役割を果たす。添付の図面の図 １が参照される。以下の段落（ｐａｒａｇｒａｐｈｓ）はｌｕｘオペロンの制御 におけるオートインデューサーの役割に関する現在の知見水準につき述へたもの であり、図１と合わせて読まれたい。

自己誘導現象は、まずネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ）ら、（１９７０）により、ビブ リオ・バーヘイおよびビブリオ・フイツシエリが高い細胞密度においてのみ発光 し、これらの細菌は低い細胞密度の培養に際しては生物発光を誘導する物質を産 生ずるという所見に基づいて報告された。′オートインデューサー′と呼ばれる 物質が増殖培地中に蓄積し、生物発光系の成分の合成を誘導する（その濃度が細 菌細胞当たり１−２分子に達した時点で）と仮定された。従って生物発光に影響 を及ぼすのは細胞密度自体ではなく、オートインデューサー分子の蓄積である。

精製されて構造決定された最初のオートインデューサー分子はビブリオ・フイツ シエリにより産生されるものであり、これがＮ−（β−ケトカプロイル）ホモセ リンラクトンであることが見出された（エーベルノ１ルト（Ｅｂｅｒｈａｒｄ） ら。

１９８１）。この分子はアミノ酸代謝の中間体であるホモセリンラクトンと脂肪 酸代謝の中間体の関連物質であるβ−ケトカプロン酸が結合したものであるため 、それは恐らく化学走性反応を誘導するために他の細菌と連絡する栄養生存性の 信号である可能性があると推測され、従ってオートインデューサーは集団感知の 役割をもつ細菌フェロモンであると考えられるようになった（ニーベル／＼ルト （Ｅｂｅｒｈａｒｄ）、１９７２）。

サーを産生ずるのに関与すると考えられた（エンゲブレヒト（Ｅｎｇｅｂｒｅｃ ｈｔ）ら、１９８３）が、これらの前駆物質か何であるかは正確には明らかでな い。他の発光細菌において上ｕｘ［に類する遺伝子に関して系統的探索が試みら れたという証拠はない。

１９８７年にケプランおよびグリーンバーブ（Ｋｅｐｌａｎ、Ｇｒｅｅｎｂｅｒ ｇ）は生物発光（上旦五ＣＤＡＢＥ）およびオートインデューサー合成（土旦ｘ ■産物）に関する構造遺伝子の転写を活性化するためにオートインデューサーと 共に必要とされる正の調節要素を、ビブリオ・フイツシエリにおいて同定した。

この調節蛋白質は↓旦五Ｒ１すなわち上ｕｘｌの上流にあるが、他の士旦五遺伝 子とは反対方向に転写される遺伝子によりコードされる２８ｋＤポリペプチドで あることが見出された。上ｕｘＲ産物はＤＮＡ結合性蛋白質であることが示され たが、採用された条件下では結合は↓ｕｘＤＮＡ特異性ではなかった。これに対 して示唆された理由は、精製に際しての蛋白質の不適正な再生であった。この説 明は、オートインデューサーの結合を証明することを試みた際の再現性の問題（ こより支持された。−１ｕｘＲの突然変異分析から、上ｕｘＲポリペプチドの中 心付近の１領域がオートインデューサー結合ドメインを構成し、一方ポリベブチ ドのカルボキシ末端方向の１頭域がｌｕｘオペレーターＤＮＡ結合／認識ドメイ ンをｍ＋ｉすることか示された（スロック（Ｓｌｏｃｋ）ら、１９９０）。次い でオートインデューサー結合部位の位置かビブリオ・フイツシエリ↓ｕｘＲ蛋白 質のアミノ酸残基７９−４２７に決定された（シエイデル（Ｓｈａｄｅｌ）ら、 １９９０）。従ってこれは↓ｕｘＲ同族体内の高度に保守された領域を表すもの と思われる。

より最近になって、ｌｕｘ構造遺伝子に結合していない領域がビブリオ・ノ・− ベイにおいて生物発光を制御する遺伝子座として同定された。これはビブリオ・ フィッノエリとは異なり、生物発光に必要な内性オペロンの一部としての↓ＵＸ 調節遺伝子を保有しない（マーチン（Ｍａｒｔｉｎ）ら、１９８９）。それにも かかわらず、ビブリオ・ノー−ヘイのｌ　ｕｘＣの上流には強い誘導性プロモー ターを含む領域があり、これは細胞密度により調節され、かつグルコース抑制性 である（ミャモト　（Ｍｉｙａｍｏｔｏ）　ら、１９９０）。ビブリオ・ノ１− ペイからの結合していない調節遺伝子座（ｌｕｘＲと称する）がクローニングさ れ、配列決定された（シｇｒフルター（Ｓｈｏｗａ　ｌ　ｔ　ｅ　ｒ）ら、Ｌ９ ９０）。その結果は、あるＤＮＡ結合性蛋白＋ｊｔ（すなわちＣｒｏ一種蛋白質 のＤＮＡ結合ドメイン）との構造上の関連性を示す。しかしビブリオ・フイツシ エリの±ｕｘＲ遺伝子との配列類似性はない。さらにビブリオ・ノー−ベイから クローニングされた′上旦五Ｒ′は外部から供給されたオートインデューサーに は反応せす、オートインデューサー活性の合成を指令しない。この調節遺伝子座 を上ｕｘＣＤＡＢＥと共に大腸菌中ヘクローニングしても、ビブリオ・ｌ＼−ベ イを反映するｌｕ五調節系を再ｍ［ｉｊ２しない。従って、既に他のレプリコン 上に±ｕｘＲＣＤＡＢＥを含む大腸菌中へさらにビブリオ・バーヘイＤＮＡをク ローニングすることにより、さらに欠如した機能を同定しうろことが示唆された 。

現在の制御系の要約 一す−を形成する。

（Ｒ／ＡＩ）を形成する。

４、　Ｒ／ＡＩコンプレックスが土ｕｘＲと−Ｌ見Ｘ［の間の−Ｌ■五オペレー ター領域に結合する（恐ら＜ＬｅｘＡを置換して、またはＳＯ８反応によりＬｅ ｘＡが開裂したのち）。

５、　Ｒ／ＡＩの結合が右オペロノ（上旦五ＩＣＤＡＢＥ）の転写をσ”（ｈｔ ｐＲ蛋白質）により促進する。

本発明は理論よりむしろ結果に基づくものであるが、本発明者らは現在では化合 物１が細菌その他の微生物における種々の機能の制御に際して主要な役割を果た す細菌フェロモン群を形成すると考えている。これらの易溶性かつ拡散性の低分 子量分子は、微生物量伝達のセンサーとして作用すると思われる。それらは密度 センサーとして、維持遺伝子発現の開始を制御すると思われる（シグマ３２）。

隔離を感知すると、それらは接合性遺伝子系の発現を阻止し、再び密度を感知し 、それらは胞子形成に際してのシグマカスケードに先立つ、バチルスにおける初 期シグマ因子の変化の引き金を引くと思われる。

以下の実施例は本発明の種々の観点を説明するものである。

実施例１は、オートインデューサーを検出するためのエルウィニア・カロトボラ の突然変異菌株、またはオートインデューサーを産生ずる細菌を用いるバイオア ンセイにつき記載する。この場合の検出可能な表現型はカルバペネムの産生であ る。

実施例２は、エルウィニア・カロトボラの１菌株の培養上清からのＮ−（β−ケ トカプロイル）ホモセリンラクトンの単離につき記載する。これは、生物発光ト インデューサーを産生ずる証明として興味深い。

実施例３は、カルバペネム抗生物質の形成能を欠如する多数のエルウィニア・カ ロトボラ突然変異菌株の調製につき記載する。この例は、これらの突然変異菌株 のうち幾つかは外性オートイノデューサーの添加により抗生物′Ｍ産生能を口復 しうることを証明する。

実施例４は、遺伝子構造体ｐＳＢ２３７に基づく、オートインデューサーの異な るパイオアγセイ：こつきｇ己載する。このバイオアッセイは、オートインデュ ーサーの存在を試験するために生物発光を輌用し、すなわちオートインデューサ ーを形成する微生物を用いる。このアッセイ法を用いて、多数の細菌がオートイ ンデューサーの産生菌として同定される。

実施例５は、Ｎ−（β−ケトカプロイル）ホモセリンラクトンおよび同族体（ラ セミ体ならびにＤ−異性体およびＬ−異性体の双方）の調製および解明につき記 載する。

実施例６は、実施例５に記載した同族体を検出するための、実施例１の方針に沿 ったバイオアッセイにつき記載する。

実施例７は、大腸菌［ｐＳＢ２３７］を指示菌株として用いる緑膿菌の計数法１ こつきＪ己載する。

実施例８は、オートインデューサーのし−およびＤ−異性体によるカルバペネム 産生の誘導を示す。

実施例９は、細菌の増殖速度の促進におけるオートインデューサーの作用を証明 するための実験につき記載する。

実施例１０は、発光の誘導における種々の同族体の活性を証明する。

実施例１１は、エルウィニア・カロトボラにおけるオートインデューサーにょる カルバペネム産生の初期誘導を証明する。

実施例１２は、＃１蓄を受けた微生物の回復におけるオートインデューサーの効 果を示す。

害鬼例ユ オートインデューサーのバイオアッセイ１、このハイオア・／セイ法は、ＥＭＳ によって誘導された、エルウィニア・カロトボラのオートイノデューサーを産生 じない突然変異菌株　ＢＩＯ００２／ｍｕ２２−一以下、略称　突然変異体２２ で呼ぶ〔その調製については実施例３に記載する〕−一に基づく。カルバペネム 抗生物質の生合成はオートインデューサー化合物により誘導される。突然変異体 ２２はオートインデューサーの生合成のある段階において遮断される。従ってオ ートインデューサー化合物を含有する試料を添加すると、この遺伝的障害か相補 され、その突然変異体が由来する菌株において観察された抗生物質の生合成か行 われる。

２　最高５０μｌ容量の試料を、大腸菌カルバペネム超感受性菌株（大Ｉｌ！菌 ＥＳＳ）を接種したオキソイド（Ｏｘｏ　ｉ　ｄ）ＤＳＴ寒天平板中に切り取ら れた直径約１０ｍｍのウェルに添加する。ＤＳＴ寒天は指示に従って調製される 。オートクレーブ処理後にＤＳＴ寒天を４５℃に冷却し、次いで３．０ｍｌ／Ｌ 　（ＤＳＴ寒天）の大腸菌ＥＳＳを添加する。これをオキソイドブレインハート インツユ−シランブロス中で３７℃において一夜増殖させる。

３、　突然変異体２２の接種体をオートインデューサーにつきアッセイすべき試 料を入れたウェルの縁に沿って置く。陽性および陰性対照には下記が含まれるｌ ）抗生物質産生菌株（エルウィニア・カロトボラＡＴＣＣ３９０４８）：　ｉ　 ｉ）合成オートインデューサーを含む突然変異体２２；１ｉｉ）試料を何ら添加 しない突然変異体２２：ｉｖ）抗生物質または残留溶剤の存在につき試験するた めに、突然変異体２２の不在下で抗生活性につき試験した各試料。

４、　平板に菌を接種して２６°Ｃで一装置く。ウェル内に突然変異体２２と共 に入れた試料中にオートインデューサーが存在する場合、産生された抗生物質が 平板を透明化する。

実施例２ エルウィニア・カロトボラを栄養寒天斜面上に維持した。接種段階培地（中和し た大豆ペプトン１％ｗ／ｖおよび蔗１１０．　１％ｗ／ｖからなる）中へ１白金 耳の培養物を接種し、２６°Ｃで２４時間、回転振盪器上においてインキュベー トした。１ｍｌを、それぞれ５００ｍ１の生産用（ＥＣＰ）培地を入れた４個の エルレノマイヤーフラスコそれぞれに添加した。これは下記よりなっていたＬ− グルタミン酸　０・２％　ｗｌｖ ＆ｌ！酸アノモニウム　□、Ｉ％　ｗ／ｖオルトリン酸水素二カＩＪｒ７ム　０ ．３７％　Ｖ／Ｖオルトリン酸二水素カリウム　０．６２％　ｖ／ｖ塩化ナトリ ウム　０．０２％　ｗ／ｖ カサミノ酸（ディフコ）ｏ、２％　ｗ／’ｖグルコース　０４％　ｖ／ｖ 硫酸第一鉄・５水和物　０．００１％ｗ／ｖ＠酸マグネシウム・５水和物０．０ １％　Ｗ／Ｖ培養物を２６°ＣＣ１２２０ｒｐで１６時間、回転振盪器上におい てインキュベートした。遠心分Ｈ（１０，ＯＯＯｒｐｍ、１０分）により培養物 を透明化し、上清を採取し、４００ｍ１の酢酸エチル（炭酸カリウム上で蒸留） で２回抽出した。酢酸エチル層を採取し、３０ｍ１の蒸留水を添加し、３５℃で の回転蒸発により酢酸エチルを除去した。

こうして得た水溶液を、疎水性樹脂（スチレノーシヒニルベンセンコポリマーＣ ＨＰ３Ｃ１ミッヒシ社）を収容したカラムに２回導通した。カラムを蒸留水（６ ０ｍｌＬ次いて水中３ｏ％ｖ　／　ｖメタノール（６０ｍｌ）、次いで水中７ｏ ％Ｖ　／′Ｖメタノール（６０ｍｌ）で溶離した。全体を通して画分を相補性バ イオアッセイにより、生物学的活性につき監視した。

７０％画分（検出可能な生物学的活性をすへて含む）を採取し、３５℃での回転 蒸発により３ｍｌの容量に濃縮した。さらに実質的な精製を下記に従って設定し たＨＰＬＣにより行った カラム　半調製用、逆相 （Ｓ５０ＤＳ２、ハイークロム社） 移動相　水中１５％ｖ／ｖメタノール 流量　２ｍｌ／分 監視用波長　２１０ｎｍ 注入容量　０．　５ｍｌ オートインデューサーは約１７５分で溶出した。

画分をプールし、３５°Ｃでの回転蒸発によりメタノールを除去し、水溶液を凍 結乾燥して、１ｍｇの９９十％純１ｆＮ−（β−ケトカプロイル）ホモセリンラ クトンを凍結乾燥白色粉末として得た。

実施例３ エルウィニア・カロトボラＡＴＣＣ３９０４８におけるメタンスルボン酸エチル （ＥＭＳ）突然変異誘発による、オートインデューサーを産生じない突然変異菌 株 １　エルウィニア・カロトボラＡＴＣＣ３９０４８を、１０Ｍｇ／ｍｌのカナマ イシン、５０Ｍｇ／ｍＩのテトラサイタリンを含有するＬＢ培地（マニアチス（ ＭａｎｉａＬｉｓ）ら、１９８２）中で、回転振ｒＩ！器中において２６℃で増 殖させる。０Ｄｓｏｏを測定して、培養が定常期（ＯＤ６ｏｏ＞２．０）に達し たことを確認する。

２、　上記の培養物１．０ｍｌを５０ｍ１の新鮮な複合培地に接種する。２６℃ の回転振盪器に乗せる。ＯＤ　６ｏ　ｏが約０．　７になるまで増殖させる。

３、１．０ｍｌの培養物を無菌のマイクロフユーシ試験管中で１２Ｋ　ｒｐｍに おいて２分間、室温で遠心分離する。細胞を１．０ｍｌの無菌ｓＰｃ緩衝液に再 懸濁する（ＳＰＣ緩衝’ｍ：０．１５Ｍ　ＮａＣ１，１０，８ｍＭ　ＮａＨ７Ｐ ０＋、９．０ｍＭクエン酸（ｐＨ７，０））。細胞を上記に従ってペレット化し 、上清を廃棄し、そして細胞を１．０ｍｌの無菌ＳＰＣ緩衝液に再懸濁する。

４、２５μｌのメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）を、１．０ｍｌの無菌ＳＰＣ 緩衝液に懸濁した細胞に添加して、ＥＭＳの２，５％溶液を得る。次いで細胞を ＥＭＳと共に、振盪せずに１時間、室温でインキュベートする。

５、　細胞をマイクロフユーシにより１２Ｋ　ｒｐｍにおいて２分間、遠心分離 する。上清を除去し、細胞を１．０ｍｌの無菌５％チオ硫酸ナトリウム（ｐＨ７ ゜０）に再懸濁する。細胞を１．０ｍｌの無菌ＳＰＣ緩衝液で２回洗浄して、痕 跡量のチオ硫酸ナトリウムがある場合にはこれを除去する。

６、　細胞を１．０ｍｌのＬＢ培地に再懸濁する。２６℃のインキュベーターに 振盪せずに１時間入れておく。

７、　無菌水中に細胞を希釈し、１００μｌ容量を、１０ａｇ／ｍｌのカナマイ シン、５０ａｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する栄養寒天平板上に広げる。

平板を２６℃で４８時間インキュベートする。

８、コロニーを無菌のつまようじで平板からつまみ上げ、大腸菌ＥＳＳ株を接種 したＤＳＴ寒天寒天上板上種体を乗せる（オキソイドＤＳＴ寒天は指示に従って 調製される。オートクレーブ処理後に寒天を４５℃に冷却し、オキソイドブレイ ンハートインフュージョンブロス中で一夜培養した大腸菌ＥＳＳ株３．０ｍｌを ＩＬのＤＳＴ寒天に添加する）。平板を２６℃で２４時間インキュベートする。

カルバペネム抗生物質がエルウィニアコロニーにより産生されると、透明化が観 察される。カルバペネム抗生物質の非産生菌を選択する。これらにはオートイン デューサーを産生じない突然変異体コロニーが含まれる（全体のうち約２０％が 抗生物質−非産生の表現型を示す）。

９、　オートインデューサーを産生じない突然変異菌株は、全細胞、フィルター 滅菌された培養上清を用いる相補性分析、および培養上清のＨＰＬＣ分析により 同定された。

突然変異体の相補性試験 １　大腸菌超感受性菌株（ＥＳＳ）を接種したオキソイドＤＳＴ寒天を用いて、 エルウィニア・カロトボラＡＴＣＣ３９０４８に由来するある突然変異体がもは やカルバペネム抗生物質を合成し得ないことを証明することができる。これらに は、カルバペネム生合成に必須であるオートインデューサーを合成し得ない突然 変異体が含まれる。オートインデューサー分子が拡散性であるため、この化合物 の生合成が欠如する突然変異体は、カルバペネム生合成経路における突然変異ま たは調節性オートインデューサー結合蛋白質を含む菌株−一これらは機能性オー トインデューサー生合成機構を備えていると思われるｍ−により相補されるであ ろう。

２、　相補性は、突然変異菌株ＢＩＯ００２／突然変異体２２（以下突然変異体 ２２と呼ぶ）の全細胞を他の突然変異体、たとえば突然変異菌株Ｂｌｌ　００１ ／突然変異体２６（以下突然変異体２６と呼ぶ）と混合することにより見られる 。

３、　大腸菌ＥＳＳを接種したＤＳＴＳ大寒で突然変異体を混和する。混合する と、抗生物質の産生および同時に透明な帯域が平板上に見られる。それぞれの突 然変異体を別個に接種すると抗生物質は産生されない。

４．１突然変異体の培養物からのフィルター滅菌した上清を別個の相補グループ の突然変異体に供給した場合にも、同じ効果が見られる。５０μｌの試料を、大 腸菌ＥＳＳを接種したＤＳＴ寒天平板中に切り取られたウェル内に装入し、選ば れた突然変異体をウェルの縁に沿って接種する。平板を２６℃で２４時間インキ ュベートしたのち、抗生物質の存在により生じた透明な帯域が見られるであろう 。

５、　突然変異体、たとえば突然変異体２６からの上清を突然変異体２２に供給 すると、後者において抗生物質の産生か誘導される。突然変異体２２からのフィ ルター滅菌した上清をバイオアッセイ平板上で突然変異体２６と共にインキュベ ートした場合は、カルバペネムの誘導は見られない。

次表に調製された突然変異菌株を挙げる。

艮」 ＾０５００２　Ｂ　ＮＴＧ　ＢＯ３００１４堕Ｓ＾０５００３　９　１ＪＴｃ　 Ｂ１０００２　２２　韻５ＡＯ５００５１０ＮＴＧ　８１０００３　２３　ＤＩ Ｓ＾０５０２０　ＩＩ　ＮＴＧ ＡＯ５０２６１２槓℃ ＡＯ６００１１３ＮＴ（： ＡＯ７００５＋４　ＮＴ（： ＾０７０３７　１５　組℃ ＡＯ１１００３１６１１７ｃ 八〇１１００４　１７　８Ｔ（： ＾０１１０１７　ＩＳ　ＮＴＣ 八〇へ１０２０　１９　ＮＴＣ ＾０８０２２　２０　ＮＴＣ ＢＩｏ　００１　２１　訃Ｓ ！１ｌｏｏｏｉｉ　２１ａ　ＥＭＳ ＢＩｏ　００５　２５　訃５ １１１１００１　２６　本Ｓ 生した突然変異体の総、Ｈ１７３ 実施例４ 且旦ｌス良１の構成　大腸菌において生物蹟人青星墾登與！するビメ生ｔ・フィ ッピーを含む大腸菌ベクターｐＳＢ２２６は先に報告されている（ヒル（Ｈｉｌ ｌ）つ先にエンゲブレヒトおよびシルバーマン（Ｅｎｇｅｂｒｅｃｈｔ、Ｓｉｌ ｖｅｒｍａ　ｎ）　（１９８７）により同定された配列に対する相同性をもつべ く設計された下記のプライマーを用いるＰＣＲにより得られた。

ＡＡＧ　ＣＴｒ　ムト＝ＣＣ１１：　に（ＴτＡＡ　ＴｒＴ　ＴｒＡ　ＡＡＣτ ＾τａｃｅ　ＣＡＡτＣ＾＾買ＴｒＴ　’ｒＡｒ　ＣＡＡエエΩ　ＴＡＣＣＴＡ 　ＡＣＣＡＡＣＣＴＣＣＣＴ　ＴＣＣＣＴＴ　τ＾τ　ＴＣＣ＾ｐＳＢ２２６の ユニークＥｃｏＲ１部位に挿入した。組換えクローンを、ドデカナール蒸気およ び合成ビブリオ・フィγシエリオートインデューサーの存在に依存する生物発光 表現型に基づいて選択した。このような組換え体の１つをｐＳＢ２３７と表示し た。

この例では大腸菌［ｐＳＢ２３７］、すなわち前記のように外性Ｎ−（β−ケト カプロイル）ホモセリンラクトン（または同族体）の存在下でのみ生物発光が発 現する細菌を用いる。この表現型が、合成オートインデューサー、またはオート インデューサーを産生ずる可能性がある他の細菌に関する試験の基礎として用い られる。

このパイオアフセイ法は、上記の大腸菌［ｐＳＢ２３７］に基づくものである。

大腸菌［ｐ　Ｓ　Ｂ　２３７］の一夜ＬＢ培養物（マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉ ｓ）ら。

１９８２）を用いて、新鮭なＬＢ＠地中に適宜希釈することにより指数的培養を 開始する。１．００μｍの指数的培養物をマイクロタイタートレーフォーマット 内のマイクロタイターウェル中へ装入する。１００μｍの無細胞培養上清または 適宜希釈したＮ−（β−ケトカプロイル）ホモセリンラクトンをウェルにそれぞ れ添加し、これにより大腸菌［ｐＳＢ２３７］からの生物発光を誘導する効力を 評価することができる。マイクロタイタートレーを３０℃でインキュベートした のち生物発光を測定するが、それに先立って各ウェルにエタノール中の１％ドデ カナール５μｍを添加しなければならない。大腸菌［ｐＳＢ２３７］に由来する 生物発光表現型を用いるオートインデューサー検出の限界は、細菌培養物をイン デューサーに！ＩＮする期間に依存する。ｌＯｎｇ／ｍｌ（培養物）を越える濃 度においては、生物発光の誘導か速やがである（１０分未ｍ）。これより低いｆ Ｍ廣においては、誘導か次第に低速になるが、２０時間のインキュヘーンヨン後 には８゜ｐｇ／ｍｌ程膚の低いａＩｆでも上口濃度の対照と区別することができ る。これによってこの生物発光アッセイ法は、インデューサーの高感度かつ簡単 なモニターとして確立される。

暖鷹夛 緑膿菌は特定の増殖条件下でのみ相補活性（オートインデューサーとして確認さ れた）を生しる。富栄養培地、たとえばＬＢまたはプレインハートインフユーソ Ｊンブロスの場合、相補活性の程度が低い。制限または最少培地、特に１ｍｇ／ ｍｌのＦｅ（［ｌ［）を補充した培地の場合、相補活性の産生は著しく高い。

標準濃度のオートインデューサー（Ｌ−異性体）と比較することにより、このよ うな緑膿菌培養物の上清はほぼ１０ｎｇ／ｍｌのオートインデューサーを含有す ると推定することかできる。相補活性の培地依存性は、その産生が調節されてい ること、および好ましい条件下では産生量が先に廂洋細菌において報告されたも の（ニーベルハルト（Ｅｂｅｒｈａｒｄ）、１９８１；Ｉμｇ／ｍｌ）に匹敵す る可能性があることを強く示唆する。

蟇Ｗ−（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）霊菌は大腸菌［ｐＳＢ２３ ７］に対して緑膿菌と同様な水準の相補活性を生じることができる。主な相異は 、この場合培地による変動性がなく、ＢＨＩｆ、清から著しく高い相補性が得ら れることである。これはオートインデューサーの構成性発現を示唆すると思われ る。これはビブリオ・フィッシユｌＪにつき先に報告された特色である（ニーベ ルハルト（Ｅｂｅｒｈａｒｄ）ら、１９８１）。

奇怪変形菌（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｍ１ｒａｂｉｌｉｓ）およびシトロバクタ−・フ ロインディ　（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄｉｉ）これらの細菌は双 方とも制限増殖培地（ＣＣＹ；スチュワード（Ｓｔｅｗａｒｔ）ら、１９８１） において相補活性を生じる。生物発光アッセイによって詳細に調べられた活性は 、比較的低い水準のインデューサー形成、あるいはルシフェラーゼ−１ｕｘＲ生 成物に対する比較的低い活性をもつインデューサー同族体の産生を表す。それに もかかわらず、活性の出現通産は相同化合物に対ｌ、てｌｎｇ／ｍ１を越えるイ ンデューサー水準を反映する。

低いが検出可能な活性を伴う微生物 表２および添付の図３に、大腸菌［ｐＳＢ２３７］に生物発光の活性化に対する 相補性を備えた微生物を挙げる。一般に活性かバックグラウンド対照を越えて測 定可能な水準になるまでに０．５−６時間を要する。低い水準のオートインデュ ーサーの検出が時間に依存するとすれば、これらの長いインキュベーション期間 は微生物培養物中のインデューサー水準の低さを反映する可能性がある。富栄養 培地においては相補活性を示した培養物はほとんどなかったが、制限ＣＣＹ培地 は特に産生が高かったことは、特に興味深い。

大腸菌［ｐＳＢ２３７］に対する低い固有活性をもつインデューサー同族体が産 生されるというのが上記に代わる説明となる可能性はあるが、同様にこれらの結 果は基礎的水準のオートインデューサー産生の検出を反映するものである可能性 もある。これらが適宜な生理学的引き金となる事象ののち、遺伝子制御機能に関 して高い産生へ移行するという可能性がある。

他の試験が下記の微生物により同様に陽性の結果（すなわちオートインデューサ ーの産生）を示した　ハフニア・アルベイ（Ｈａｆｎｉａ　ａｌｖｅｉ）、セラ チア・リクエファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　１ｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、 エンテｏハククー・アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｆｅｒ　ａｇｇｌｏｍ ｅｒａｎｓ）およびラーネラ・アクアチリス（Ｒａｈｎｅ　ｌ　ｌ　ａ　ａｑｕ ａ　（ｉｌ【ｓ）。

表２ ＾１　＾・ｒ−−ａｓ　ｌ１％ｌ’１Ｘｌｈｌ　＋畠　エーロモナス！ヒドロフ ィラ１、Ｃ０ＩＩＴ暇　対照 〔１１ａζ…υＩＣ愉ｒ閉　セレウス菌０、ａａｅＨｌｕｓ　ｅｏａｇｉ＋ｉｎ ｓ　バチルス？コアギユランスＥ、Ｓａｃ…ｕｓ　ｍｇ自ｒ＋＋Ｊａ　巨大国Ｆ 、ｌ曇（…嚇ｗｇａｌ＊ｒ１ｍ　ＫＮ　巨大国　ＫＭＧ、＠ａｃｌｌｌＩＩｓＩ ｕｅｔｌｌ１１　枯草菌Ｎ、＠ｒｏｃ＋Ｉｏｔｈ山＋ｖｒｗ＋５ｘｅｃｔａ　ブ ロコトリックスーサーモスファクタムｚ（ｌＩＰ帥ａ（１１ｒｆｒｔｍａＮ　６ ６７１　ントロバククー・フロインディ　６０７１１４　ζ１Ｉｒｏ６ａｃｔｅ ｒ　ｒｒｅ＋ＪＴ＋＋ｌｌ＋　９７５６　シトロバクタ−、フロインディ　９７ ５６Ｃ２Ｃ１ｔｒｏ６ａｃｌｅｒ　ｋｏ１ｅｒ＋　１０８４９　ントロバクター ーコセリ　１０８４９０、＊ａｃ…ｕＩ　Ｃｏａｑ％＋１ａｎｚ　／（チルス争 コアギユランス（ｚＳａｃ…ｕｓ　ｃｅｒｅｓ＋ｓ　ｍｕ　セレウス♂　８６６ Ｆｚ１ａｃＮｌｕｓ　１ｌｃｈｅＩｌ＋ｌｏｒｗｌｓ　バチルスψライケニホル ミスＧｚｌｌａ（１１１ｕ％＆ＩＨＩＩ’１ｌｌ１１　バチルス・マセランスＸ 、８Ａｅｌｌｌｕｌ　Ｈ９畠＋ｅｒｌｕｍ　９ｆｉｌＳ　巨大国　９８８５＾、 Ａｌｃａ１１９ｅＭｌ　１ａｅｃａｌｌｓ　フル力ＩＪ　大便１１１１、Ｅｌｅ Ｍｌ＊ｌＩａ　ａｅｒｏｇ３″６　クレブシェラ・エロゲネスＣ，Ｌｌｓｌｅｒ ｌａ　ｇｒａｙｌ＋　リステリア・グレイｅ、ＬＩＳｔｅｒｌａ　簡瞑ｙｔｏｇ ｅ＋’＋ｔｓ　４＠Ｓ９　９球［、Ｊ　スｆ　、Ｊア４８５９Ｅ、Ｌｌｓｌ＠ｒ ｌａ□八窄＃１２３０へ４　単球症リステリア　２３０７４Ｆ、ＬＩＳｔｅｒｌ ａ　−■ｙｔｏｇｅｍｓ　５３４＠　単球症リステリア　５３４８’Ｊ　””” ”””””’　モ／：Ｉ７７’７ス４テ’７スＩｔ、Ｃ＠マー帆　対照 ”５　Ｐｌ’６ｔｅ”ａｌｒａｌ＋“Ｉｏ“　奇形変形菌’５　ｐＩ″Ｌ＋ｔｅ ｕｌ　ｖ＋ｉ１ｇａｒｌｓ　尋常変形菌Ｃ１ＣＯＩＩＴＩ帆　対照 ０、ｐｓｅｕｍｗｙ＋ａｉ　ａａｒｑ＋ｍｓａ　＄１０１　１ｉ１１１１　ｐ　 Ａ　Ｑ　ｌ　（死）Ｅ５ｐｌｅｕ−嗜ａｓ　ｎｕａｒｅｓｃ闘　蛍光画ｒ５ｐｓ ■−ａｓ　ｐ＋＋ｌ１ｄａｓ　シュードモナス・ブチダスｃ、ｅ詩ｕｍａｓ　ｏ ｕｔ＋ｍａ　＞ａｏ　シ、−トモナス−プチダ　３４ＯＮ％　ｐｓｅ−ａｓｐｕ ｔ＋ａｍ＋ｃａａ　シューＦモ＋ス、フチタＩＣ４Ａ“６ｐｓｅｕｅｍｏｅａｓ 　ｅ”６°ＪＴＩ　シュードモナス・プチダ　ＪＴＩ＠６Ｓａ　’″′。ｆ′＠ ｌ　’　ａ　ｍ’Ｉ　ｚｏ″′ａｅ　サ、レモ＊　ラ、　ｙ　ｌ　ソ＋”　”” ”””　１″′”””　サル％＊う”　イン７　ｙ　ンティ７゜０６Ｓａ＋−１ １“−１＠ｖ１６ｏ　サルモネラ・モノテビデオｔ、Ｓａｌ″６′＋ｅｌ　１４ 　ｔｙｐＮＩ″″Ｍｍ　ｔｒｚ　＊　スミチア　ス菌　ＬＴ２五、５ｔｒｅｏｔ ｏｃｏｃ朝ＩＩＩＩｔ暑ｎｓ　ストレプトコッカス伊ミュータンス０７　５Ｉａ Ｏ″７＋０ｃｕ％ａｕｒ輻１１色フＦｆ）ｎＷｌｔ、ｖ＋ｈｒ＋ｏ　ｃｈａ＋ｅ ｒａｅ　ｗ　ａ＋　、レラ菌　ｎｏｎ　０１１７　Ｅｓｃｘｒ＋ｃｒｓａ　ｃａ ｌｌ　Ｋｌｚ　大腸菌　Ｋ１２’７　’　Ｍ　ａｓ＋ｔａｔ−＊ｒ世ＬＥＱＩ　 ５ｎｇオートインデューサーＮｔ’−−−− 実施例５ （化合物Ｎｏ、１．２．３．４．１４．１５および１６）一般法 トリエチルアミン（１ｍｍｏ　ｌ）を、塩酸ホモセリンラクトン（Ｌ−異性体も しくはＤ−異性体またはうセミｉＭ合物）（Ｌｍｍｏｌ）の、水（２ｍｌＪ中に おける溶液に撹拌下に添加し、次いて３−オキソアルカン酸のエチレングリコー ルケタール（１ｍｍｏ　ｌ）および塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ プロピル）カルボジイミド（Ｌｍｍｏｌ）を添加した。混合物を２０時間撹拌し 、次いで約３５°Ｃて回転蒸発により乾固させた。淡橙色の残渣を温酢酸エチル （５Ｘ５ｍ１）で抽出し、抽出液をプールしておき、水（１ｘ３ｍｌ）　、５％ 炭酸水素ナトリウム溶液（ＩＸ３ｍｌ）　、ＬＭ硫酸水素カリウム溶！（１ｘ３ ｍｌ）、そして最後にブライン（ＩＸ５ｍｌ）で順次洗浄した。乾燥させ（Ｍ　 ｇ　Ｓ　Ｏ４）、溶剤を真空中で蒸発させて、３−オキソアルカノイル化ホモセ リンラクトンのエチレングリコールケタール（４０−５０％）を得た。

過塩素酸（６０％、０．２５ｍ１）を、ノクロロメタン（１５ｍｌ）中のアルカ ノイル化ラクトン（０，５ｍｍｏ　ｌ）の水冷溶液に添加した。混合物を０℃で ０．５時間撹拌し、次いて室温で１５時間撹拌した。溶剤を真空中で除去し、残 渣を酢酸エチル（２０ｍｌ）に再溶解した。溶液を冷水（２ｘ５ｍｌ）およびブ ライン（ＩＸ５ｍｌ）で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳ○４〕、回転蒸発させて、目 的とするＮ−（３−オキソアルカノイル）ホモセリンラクトン（５５−６０％） を得た。

化合物１６はホモセリンラクトンの代わりにホモシステイレラクトンから誘導（ 化合物Ｎｏ、５．６．７．８および９）二鮒佳 トリエチルアミン（Ｌｍｍｏｌ）を、塩酸ホモセリンラクトン（１−一異性体も しくはＤ−異性体またはラセミ混合物）（Ｌｍｍｏｌ）の、水（２ｍｌ）中にお ける溶液に撹拌下に添加し、次いて酸無水物（３ｍｍｏｌ）（化合物５．６およ び７〕または酸（１，５ｍｍｏ　ｌ）および塩酸１−エチル−３−（３−ジメチ ルアミノプロピル）カルボジイミド（１，５ｍｍｏｌ）　（化合物８および９） を添７１１０した。混合物を室温で一夜撹拌し、次いで真空中で蒸発乾固させた 。残渣を水（５ｍｌ）と酢酸エチル（２０ｍｌ）の間で分配し、有機層を５％Ｎ 　ａ　ＨＣＯ＋ｌ容ｅ　（２×５ｍ１）　、ＬＭ　ＫＨ３Ｏ４溶液（ＩＸ５ｍｌ ）およびブライン（１ｘ５ｍｌ）で順次洗浄した。乾燥させ（Ｍ　ｇ　Ｓ　０４ ）　、溶剤を除去して、表題の（化合物１０．１１．１２および１３）二鮒迭 Ｎ−（３−オキソアルカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン（０，２ｍｍｏ　ｌ ）をメタノール（５ｍ１．）に溶解し、この溶液を２Ｍ　ＨＣｌ−メタノールで 酸性（ｐＨ３−４）となした。ナトリウムンアノボロヒドリド（０，５ｍｍｏ　 ｌ）を撹拌下に１０で添加し、２ＭＭＣｌ−メタノールを時々添加することによ り反応混合物をｐＨ３−４に維持した。２時間後に溶剤を真空中で除去し、残渣 の酢酸エチル抽出液（３Ｘ５ｍｌ）を合わせて乾燥させ（Ｍ　ｇ　Ｓ　０４）　 、蒸発させて、表題のｈＦｏ±／誘導体を得た。生成物をシリカプレート上でＣ ＨＣｌ　３Ｍ　ｅＯＨ（９：　１）中において調製用Ｗｉｒｉｉクロマトグラフ ィーにより精製し、そしてＨＰＬＣにより再精製した。化合物１０および１１の 場合はこれを分割し、ジアステレオマーを分離した。

これらの方法により製造されたオートインデューサーおよびその同族体は純度９ ０％以上であり、さらにｌＸ２５ｃｍの５５０Ｄ８２半調製用カラムを使用し、 １５−２０％　Ｍ　ｅ　ＯＨ−Ｈ２０混合物により無勾配溶離し、かつ２１０ｎ ｍにおいて監視する逆相ＨＰＬＣによって精製した。生成物を凍結乾燥し、０℃ より低温で保存した。

すべての化合物（表３参照）が下記のとおりＩＲ，質量スペクトル（Ｅｌ、）お よび高電磁ｔａＮＭＨにより解明された。

理論値　ｍＨｚ　２１３．１００ｉｌ、＋８５　（’Ｄ）、＋７０　（８）、１ ５５　（）ｌ、＋４３（３コｌ、　＋２８　（８１，０３（＋９）、＋０２　（ ５６１，１０１（３５１，７１（１１２］。

５７　（ＴＯＯ）。

δＨ（ＣＤＣ１３１（４００Ｍ）ｌｚｌ　Ｏ，９（３Ｈ，ｔ、　ＣＨ３１，Ｃ６ ４（２Ｈ，５ｅｘｔｅｔ、　ＣＨ３，Ｃ１１２１，２，２２（ＩＨ，ｃｉｄｄｄ 、　４ａ−Ｈ）、　２．５＋　（２Ｈ。

ｔ、　ＣＯ２，ＣＯ）、　２．７７　（＋Ｈ，ｄ（ｉｄ、　４β−Ｈｏ、　３． ４７　（２Ｍ、　ｓ。

ＣＯ，Ｃ）＋２．ＣＯｌ、　４．２Ｂ　（１）１．　ｄ（１（１，５α−Ｈ）、 　４．４８　［１Ｍ、　ｄ（１，５ｐ−Ｈｌ。

４．５９　（１Ｈ，ｄｄｄ、　：１−Ｍｌ、　７．６５　（１）１．　ｂｓ、　 ＮＨＩ。

５１３（（ＣＤＣ１３１１コ、５８　（ＣＨ３１，＋６．９１　（ＣＨ２）、２ ９．９４（Ｃ）＋２１．　＋６６．３８　（ＣＯ，ＮＨｌ、　＋７４．８３　ｆ ｒｉｎ９　Ｃ−０１，２０６，５４（Ｃ−０１゜ｒａｆｔ　（Ｅｒ）　＋＄１　 ＋９９．０１１４５　＋２５．　Ｍ”、　Ｃｇ）１１３ＮＯ４理論値　ｍＨｚ　 ＋９９．０８４５）、＋７０　（９）、＋５４　（７）、＋４１　（６１，＋２ ５−（ＣＨ１４［Ｎ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトン］ｍ ／ｚ　（ＥＩＩ　（％１　＋８５．０７０１　（３，Ｍｏ、　Ｃ３）１１．Ｎｏ ４理論値　ｍＨｚ　＋８５．０６８７１．　＋４０　（４１，１２７（７）、＋ ０２　（４）、＋０１（Ｈｌ、　５７　（７２）、　４３　（ｊｏｏｌ。

ｒｏｏｚ（ＩＪＩ　（％ｌ　１７＋、０９２２　（１２，Ｍ”、　Ｃ８Ｍ、３Ｎ ｏ３理論値　ｍｉＺ＋７＋、０８９６１．　１５３　（４１，１４３（６５１， １２８（５１゜＋２５　ｆｓｌ、＋０２　（１０）、＋０１　（ＴＯ）、７１　 （５７１，５）　（６５１，４３（１ｏｏ）、 ろＨ（ＣＤＣ１３１（４００Ｍ）ｌｚ）　０．９６　（３Ｈ，ｔ、ＣＨ３１，１ ，６８＋２Ｈ，５ｅｘｔａｔ、　ＣＨ３，ＣｋＬ２）、　２ｊ９　（１８，（１ （１（！ｄ、　４ａ−Ｍｌ、　２．２４　（２Ｎ。

ｔ、　ＣＨ２，ＣＯｌ、　２．８２　（ＩＨ，＋ｉｄＪ叩−Ｆ４１．４．２９　 （１１４，ｄ（１（１，５α−Ｈｌ。

４．４７　（１Ｍ、ｄｔｆｌ、５β−Ｍｌ、４．５９　（＋Ｈ，ｄ＋：１ｃｉ、 ：ｌ−Ｍｌ、６．２６　（１Ｈ，ｂｓ。

ＭＨＩ。

ｍＨｚ　（Ｅｌ）（％ｌ　＋４３．０５４６　（６，Ｍ”、　Ｃ６１４ｇＮＯ３ 理論値　＋４３．０５８２１．　＋２５　（５１，１１６（２）、１０１　（３ １，９８１１１１゜５７　（９３１，４３（１００１゜ δＨ（ＣＤＣ１３）　（４００Ｍ）Ｉｚｌ　２．０６　（３Ｈ，ｓ、　Ｃ）＋３ ）、　２．１９（１Ｍ、　ｄ（ｌｄｄ、　４α−Ｍｌ、　２．７８　（１Ｍ、　 ｄｄ（１，４ｐ−Ｈ）、　４．２９　（１８，ｄｅｌｃｌ。

５α−１４）、４．４フ　（１Ｍ、（１（１，５ｐ−Ｈ）、４．６２　（ＩＨ， （１（！ｄ、３−Ｈ）、６．５７ｔ１ｏ、ｂｓ、Ｎ）１１゜ 化合物８　［Ｎ−［（Ｅ）−ヘキサ−２−エノイル］−Ｌ−ホモセリンラクトン ］ｍａｔ　（ＥＩ）　（％）　１９７．１０８ｇ　（ＩＩ、　Ｍ”、　Ｃ１０８ １５ＮＯ３理論値　ｍ／ｚ　１９７．＋０５２１．　＋５４　（９１，９７（１ ００１，８５（３１゜６Ｈ（ＣＤＣ１３１＋４００　ＭＨｚｌ　Ｏ，９４（ＩＨ ，ｔ、　ＣＨ３１，Ｃ４８（２Ｈ，Ｓ＠Ｋｔｆｌｅ、　ＣＨ３，Ｃ１１２）、　 ２．１７　（３Ｈ，ｍ、　４Ｑ−Ｈａｎ＋１Ｃ）Ｉ−Ｃ４ｉ、ＣＯｌ、　６．Ｎ 　（＋Ｈ，ｄ、　ＮＨＩ、　６．９０　ｔｌＨ，（１切Ｃ１１−ＣＨ，ＣＯ）　 。

ｍ／ｚ　（Ｉｌｌ　（１１＋９９．１２５６　＋５．　Ｍ”、　ｃ、ｏｎ、、Ｎ ｏ３理論ｉｉＩ　ｍ／ｚ　１９９．＋２０８）、ｌフＯ（５）、＋５６　（Ｉｌ ｌ、Ｔｏ　（１００１，８５６，４３（＋Ｈ，ｄ、　ＮＨＩ。

ｍ／ｚ　（ＥＩ）　（％ｌ　＋９７．０９９５　＋９．　Ｍ”−Ｈｌ０．　Ｃ， ＯＨ，５Ｎｏ３理論値　ｍ／ｚ　＋９７ｊ０５２）、＋７２．０６２９　＋５２ ．　Ｍ”−Ｃ３Ｈ７，、Ｃ７Ｈ１ＯＮｏ４ｅｉｅｉｄ、　５ｐ−Ｈｌ、　４．５ ７１＋Ｈ，ｄｄｄ、　３−Ｈｌ、　６．５５　（１）１．　ｂｒ　ｓ、　ＮＨＩ 。

化合物１ｉ　［Ｎ−［（Ｒ）−３−ヒドロキシヘキサノイル］−Ｌ−ホモセリン Ｎ論値ｒａｆｔ　＋７２．０６＋Ｏ１，＋４３　（２）ｌ、＋０２　（＋００１ ゜６Ｈ（ＣＤＣ１３）　（４００８Ｈｚ）　０．９４　（３Ｍ、　ｔ、　ｃｏ３ ）、１４３（２Ｈ，ｍ、　ＣＨ３，Ｃ１１２１，＋、ｓｓ　＋２）１．　ｍ、　 Ｃ１１２，ＣＨ，ＯＨ１，２，１９（ＩＮ。

４．５５　（ｌ）ｌ、　ｄ＋ｉｄ、　３−Ｈｌ、　６．５０　（ＩＨ，ｂｒ　ｓ 、　Ｎ）ｌ）。

（２Ｈ，ｑｕｌｎｔｅｔ、　ＣＨ３，Ｃ１１２１，２，＋５　（＋Ｈ，ｍ、　４ ａ−Ｈｌ、　２．３３　（２Ｈ。

（１８，ｂｒ　ｓ、　０２０　互換性　、ＮＨｌ。

５ｏ　（Ｃ２０１（９０Ｍｏｚ）　１．２０　（３Ｍ、　ｄ、　ＣＨ３１，２， ２０（１Ｍ、　ｍ、　４Ｑ−Ｈ）、　２．４０　（２Ｈ，ｄ、　Ｃ１１２，ＣＯ ）、　２．５７　（１Ｍ、　ｍ、　４Ｃ！−Ｈ）、４．０−４．７０　＋４１４ ．ｍ、５−Ｈｌ、３−ＨおよびｃＨ，ｏｏ）。

化合物１４　［Ｎ−ベンゾイルアセチル−Ｌ−ホモセリンラクトン］理論値　ｍ ／ｚ　２４７．０８４４１．　１４フ（１２１，１０５（１００１，７７（３７ １゜６Ｈ（ＣＤＣ１３／ＤＭＳＯ−ｄ６）　（９０８Ｈｚｌ　２．２０−２．８ ０　（２Ｈ。

ｍ、４−Ｈｌ１．　３．９４　（２Ｈ，ｓ、ＣＯ，Ｃ１１２，ＣＯ）、４．１０ −４．８０　（３Ｈ，ｍ。

５−Ｈｌおよび］−Ｈ）、７．３０−７．７０　（３Ｈ，ｒｅ、　Ａｒ１４１． 　７．９５　（２Ｈ，ｄｄ。

ＡｒＨｌ、８．５６　（１Ｈ，ｄ、ＮＨＩ。

表３ オートインデューサーおよびその同族体Ｎｏ、　ＲＣ−３ホモセリンラクトン における　からの キラリティー　全収率 ｌ　ＣＨ３，ＣＨ２，ＣＨ２，ＣＯ，ＣＨ２，ＣＯＬ　２５に２　Ｃ）！３．Ｃ Ｈ２，ＣＨ２，ＧＯ，ＣＩ’＋２．ＣＯＤ　２６ｒ。

３　Ｃ１（３，ＣＨ２，ＧＯ，ＣＨ２，ＣＯＬ　２８χ４　ＣＭ）、ＣＯ，ＣＨ ２，ＣＯＤ、Ｌ　２♂２５　ＣＨ）、ＣＨ２，ＣＨ２，ＣＯＤ、Ｌ　３９！６　 ＣＨ３，ＣＨ２，ＣＨ２，ＣＯＬ　４０！７　Ｃ）＋３．ＣＯＬ　２０！ ａ　ＣＨ３，ＣＨ２，ＣＨ２，Ｃ）１ｍ（：Ｈ，ＣＯＬ　コ５χＱ　Ｃ）＋３． ＣＨ２，ＣＨ２，Ｃ）＋２．Ｃｌ４２．ＣＯＬ　６０χ＋０　ｒｓｌ−ＣＨ３， ＣＨ２，ＣＨ２，ＣＨ（ＯＨ１，Ｃ）＋２．ｃｏ　Ｌ　５χ＋Ｉ　（Ｒ）−ＣＨ ３，ＣＨ２，ＣＨ２，ＣＩ（（ＯＨ＋、Ｃ）！２．ｃｏ　Ｌ　５χ１２　（Ｒ５ ）−ＣＨ３，ＣＨ２，ＣＭ（Ｏ）＋１　、ＣＨ２，ＣＯＬ　δχ１３　ＴＲ５） −ＣＨ３，ＣＨ（ＯＨ１，ＣＨ２，ＣＯＬ　７：＋＆　Ｐｈ、ＣＯ，ＣＨ２，Ｃ ＯＬ　、　２０；１５　ＣＨ３、ＣＨ２，Ｃ）＋２．ＣＨ２，ＣＯ，Ｃ町、ＣＯ ｌ６”　ＣＨ３，Ｃ１１２，ＣＨ２，ＣＯ，ＣＨ２，ＣＯ★　この化合物におい ては環酸素原子がイオウで置換されている。

実施例６ エルウィニア突然変異体ＰＮＰ２２を、寒天平板中に切り取られた、大腸菌ＥＳ Ｓを接種した３ｍｍのウェルの縁の周りに接種した。実施例５の各同族体の一定 範囲澗廣の溶液を蒸留水中に調製し、フィルター滅菌し、各ウェルに５０μＩを 添加した。平板を２６℃で一夜インキュベートし、生じた阻止帯域の直径を測定 した（ｍｍ）。図４は阻止帯域の直径（これはカルバペネム抗生物Ｎ産生の誘導 を表す）を種々の化合物の濃度に対して示したグラフである。化合物１．１４． ３．１１．１２．９．１０および６につき用量応答曲線を示す。この系列の残り の化合物は、約１０％の活性を示すＤ−異性体（データは示されていない）を別 として、このアッセイにおいてほとんど、または全く活性を示さなかった。

実施例７ 木場ＩＮ　［ｐＳ８２３７ト舎街か菌株として用いる緑膿堕の肚舞大腸菌［ｐＳ Ｂ２３７］　（図５）を指示体として用いて緑膿菌の計数法につき研究した。ｐ ＳＢ２３７は大腸菌にオートインデューサー依存性の生物発光表現型を付与した ものであり（外性アルデヒドを添加した際）、従って緑膿菌からのオートインデ ューサーの産生を検出することかできる。この実験は緑膿菌の一夜培養物を必要 とし、これを１０倍ずつ順次希釈して約２．２０および２００コロニーかニトロ セルロース膜上に濾過されるようにする。本発明者らは、注入平板法より膜の使 用の方が好ましいことを見出した。膜は緑膿菌が増殖するための温気的環境を与 えるからである。上記の膜を大腸菌［ｐＳＢ２３７］の菌叢に乗せる。緑膿菌か らのインデューサーが膜を通して拡散し、緑膿菌コロニーの大きさに等しい局部 的頭載の大腸菌［ｐＳＢ２３７］の菌叢の生物発光の引き金を引く。

発先頭域数が緑膿菌コロニー数に正確に相関する。混合培養においては、オート インデューサーを産生ずる細菌コロニーのみが大腸菌［ｐＳＢ２３７］の菌叢に おいて発光し、従ってこれは他の点では近似する細菌間の極めて明瞭な区別を与 ｕｒｉａ）ブロス中において増殖すせた。

２、　ルリアブロスを用いてｔｉ−膿菌一夜培養物の１０倍希釈系列を調製し、 コロニーを計数するために試料をルリアブロス寒天に乗せた。

３、０．５ｍｌの大１１Ｊｉ菌［ｐＳＢ２３７］−夜培養物を４ｍｌの溶融（４ ５℃フルリアブロス寒天に添加し、ルリアブロス寒天平板上に広げた。

４、１ｍｌの緑膿菌希釈系列−８、−７および−６（二重試験）を別個にゲルマ ン０．４５μｍニトロセルロース膜上に濾過した。次いでこれらを別個に、上記 の（３）で調製した大腸菌［ｐＳＢ２３７］寒天菌叢に乗せた。

５、　平板を３０℃で数時間インキュベートし、ノナナール蒸気にａｉｉｔ、た のちハママッ・アーガス１０１００Ｖｉカメラで機影した。

−６多すぎて計数できない　多すぎて計数できない突然変異体ＰＮＰ２２をＥＣ Ｐ培地培地−夜増殖させ、２％の接種物（ｖ／ｖ）を１００ｒｎ　ｌの新鮮なＥ ＣＰ培地に添加した。これを回転振盪機（２２Ｏｒ　ｐｍ）上で２６°Ｃにおい て６時間インキュベートした（ＯＤ＞２．０になるまで）。

カルバペネムのＨＰＬＣアッセイ 細菌を１１０００Ｏｒｐで１０分間の遠心分離により採取した。上清を蒸留ジク ロロメタン中４％のアリファツト（ＡＬｉｑｕａｔ）３３６　（アルトリッヒ） の溶液で抽出した。逆相、半調製用カラムを用いるＨＰＬＣにより試料を分析し た。

ＰＮＰ２２における外性オートレギュレーターの添加によるカルバペネム生合成 合成により製造されたオートレギュし一夕一を０−７５μｇ／ｍｌの濃度範囲で 添加し、用量応答曲線を作成した。カルバペネム産生の誘導に関する閾値は約０ ５μｇ／’ｍｌである。最適濃度は１．　０μｇ／ｍｌである。この′ａ度を越 えるとカルバペネムの生合成が阻害されるように思われる。

Ｌ−異性体の代わりにＤ−異性体を用いて（すなわち化合物１の代わりに実施例 ５で得た化合物２）、この実験を反復した。この場合、カルバペネム産生の誘導 に関する閾値は約２μｇ／ｍｌであり、最適濃度は３０μｇ／ｍｌであった。

微生物代謝の測定は幾つかの方法により監視することかでき、その１つはインピ ーダンス監視法として知られている。細菌を培地中で増殖させた場合、代謝の最 終産物は一般に最初の増殖基質より高く帯電することか示されている。生したイ ンピーダンスの変化を監視し、′増殖″または代謝曲線を作成することができる 。異なる基質中での増殖により得られた曲線を基質の増殖性に関して比較するこ とかできる。これらの曲線をｆｉｌ用して、与えられた試料中の細菌の個数を判 定し、阻害物質、たとえば抗生物質に対する微生物の感受性を推定し、また増殖 物質の有用性を判定することもてきる。

実験 マルサス（Ｍａ　ｌ　ｔ　ｈｕｓ）ＡＴ増殖分析装置を用いて得られる曲線に対 して培地中のオートインデューサーか没ぼす影響を調へるために実験を行った。

栄養ブロス（Ｌａｂ　Ｍ、ｌａｂ　１４）中における霊園の４時間培養物の系列 １０倍希釈液を、無菌の０．９％塩類溶液中に調製した。１０−４または１０′ 希釈液０．０２ｍ１を下記に詳述する培地の試験管６本に添加した。試験管を混 合し、次いでマルサスシステムに取り付けた。

オートクレーブ処理前に５ｇ／Ｌのトリメチルアミノ−Ｎ−オキシドを添加した イースター・アント・ギブソシ培地（Ｌａｂ　Ｍ、ｔａｂ　１３７）を、全体を 通して用いた。亜セレン酸ナトリウムを除外し、製造業者の指示に従って培地を 調製した。インデューサー（Ｎ−（β−ケトカプロイル）ホモセリンラクトンの 合成品）溶液を無菌水中に調製し、マルサス試験管に添加して、最高８０ｎｇ／ ｍｌの種々の最終濃度を得た。

９ｉｆｌの実験のうち８紐か、オートインデューサー濃ｔｆ５−２０ｎｇ／ｍｌ において３００−５００マイクロンーメンスの最大出力増大を示した（オートイ ンデューサーかセロの場合の出力と比較）。これらの結果は、インデューサーの 存在下では細菌増殖の増殖か得られたことを明瞭に証明する。

表３に記載したオートインデューサーおよび種々の同族体を、実施例４に記載し たアッセイ法により大腸菌［ｐＳＢ２３７］におけるそれらの発光誘導能につき 試験した。

他の実験において、オートインデューサーおよび種々の同族体の１０倍希釈液を 、大腸菌［ｐＳＢ２３７］におけるそれらの発光誘導能につき試験した。上記と 同様に発光水準で表して下記の結果が得られた　−希釈液　化合物 −２＋＋＋＋　＋＋＋＋＋＋ −３＋＋＋＋　＋十＋　＋＋＋＋ −４＋＋＋＋＋＋−＋＋＋＋ −６＋＋＋＋　− エルウィニア・カロトボラＡＴＣＣ３９０４８を実施例２の場合と同様に増殖さ せ、ただし最終濃１１５μｇ／ｍｌのオートインデューサーを含有するが、また は含有しない５０ｍ１のＥＣＰ中へ接種用−夜培養物Ｌｍｌを接種した。培養物 を２６℃で振盪式インキュヘーター中において２４０ｒｐｍでインキュベートし た。１００μＩの上清試料を採取し、スフエリソルブ（Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ） Ｓ５０ＤＳ２　ＨＰＬＣカラムに注入し、１００ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４により２ｍ ｌ／分で溶離した。カルバペネムのピークは約７．８分で溶出し、２５４ｎＭに おける吸光賀により測定された。オートインデューサーの添加は、カルバペネム の産生（３−６時間）を対照（５−８時間）より数時間早期に移行させた。

富国の一夜培養物：ルリアブロス中で３７℃において静止増殖。

マクシマム・リカバリー・グイリューエンド（ＭＲＤ）（オキソイトＣＭ７３３ 、ロットＮｏ、２０３　４０７６４）　製造業者の指示に従って調製。

ルリア寒天（ＬＡ）平板。

バイオレットレット胆汁グルコース寒天（ＶＲＢＧＡ）（オキソイドＣＭ４８５ ゜ロットＮｏ、１３８　４０７６８）平板・製造業者の指示に従って調製。

オートインデューサー原Ｍ：ＤＬ−Ｎ−（３−オキソヘキサノイル）−Ｌ−ホモ セリンラクトン、酢酸エチル中１０ｍｇ／ｍｌ。

方法 オートインデューサー２０ｎｇ／ｍｌ　（寒天）を含有する平板を下記の方法で 調製した オートインデューサー溶液４μｇ／ｍｌを、４μｌの原液と１０ｍ１のマクシマ ム・リカバリー・グイリューエンドの混合によりＦａ！した。

予め注入し、乾燥させた寒天平板をほぼ２ｇ秤量し、オートインデューサー溶液 ５μＩ／ｇ　（寒天）を分配し、無菌の使い捨てし一字形スブレグーにより表面 に広げた。次いで平板を暗所で４°Ｃに一夜保存したのち、使用前に乾燥させた 。

オートインデューサー溶液の代わりに無菌のマクシマム・リカバリー・グイリュ ーエンドを用い、同様にしてオートインデューサーを含有しない対照平板を調製 した。

一夜培養物を、無菌のビシヨー氏液（Ｂｉｊｏｕ’　ｓ）中に、下記の混合によ り１０倍系列希釈法で１０−４に希釈した５００μｌ培養物　＋　４５００μｌ 　ＭＲＤ　（＝１０−’）５００μＩ　１０＝　＋　４５００μｌ　ＭＲＤ　（ −１０−２）５００μＩ　１０−’　＋　４５００μｌ　ＭＲＤ　（＝１０−” ）１０１希釈液を後続実験において使用懸濁液として用いた。

ぢ照 １００μｌの使用懸濁液を上記に従って１ｏｏｏμｌ容量に系列希釈し、得られ た１０−１．１０”２および１０°３希釈液を下記の培地上で二重試験法により 表面ルリア寒天（ＬＡ） ルリア寒天　＋　２０ｎｇオートインデューサー（ＬＡ＋１）バイオレットレッ ト胆汁グルコース寒天（ＶＲＢＧＡンバイオレソトレッド胆汁グルコース寒天　 ＋　２０ｎｇオートインデューサー（ＹＲＢＧＡ＋Ｉ） 凍結ショック試料 残り４９００μｍの使用懸濁液をフリーザーに移し、−２１℃で保存した。２１ ０分後にこれを３１．５℃の水浴中で１５分間融解し、１００μｌの融解した使 用液、およびＭＲＤ中における融解した使用液の１０−１希釈液（二重試験）を 、上記４種類の寒天に乗せた。

２２℃で２４時間および４８時間インキュベートしたのち、平板を計数した。

結果 結果は、回復したコロニー形成単位／ｍｌ（使用液）として示される。表４は４ ８時間のインキュベーション後の培養密度を示す。

表５は、オートインデューサーを含有する、および含有しないルリア寒天上にお ける、２４時間および４８時間のインキュヘーンヨン後の培養密度を示す。

結論 オートインデューサーを含有する、および含有しない複合培地および選択培地の 間では、損傷を受けていない細胞の回復に差がない。

インデューサーを含有する、および含有しない複合培地（ルリア寒天）間では、 ４８時間後には損傷を受けた細胞の回復に差がないが、オートインデューサーを 含有するルリア寒天上では、オートインデューサーを含有しない同じ培地と比較 して、増殖／回復がより速やかである傾向かある（２４時間後のコロニー数が高 い）。

インデューサーを含有する選択培地（ＶＲＢＧＡ）上ではインデューサーを含有 しないＶＲＢＧＡと比較して、損傷を受けた細胞の回復が有意に増大する。

インデューサーを含有しない場合の回復。

ＶＲＢＧＡ＋１上テノ回復率％−２，８／１１＝２５％インデューサーを含有す る場合の回復 ＶＲＢＧＡ＋を上テノ回復率％−５．１／１１−４６％２４時間後のＬＡ上での 回復率 インデューサーを含有する場合−８，５／１１−７７％インデューサーを含有し ない場合−６，９／１１−６３％考察 選択寒天上における損傷を受けた生物の回復率が高いことは、選択寒天（胆汁酸 塩およびクリスタルバイオレット）に対する耐容性の改善および／または損傷を 受けた生物の修？Ｈの向上を示す。

２４時間後にオートインデューサーを含有するルリア寒天上で見られたコロニー 数がオートインデューサーを含有しない対照と比較して高いことは、オートイン デューサーの存在下での回復／増殖がより速やかであることを意味する。

２２°Ｃで４８時間後の４種類の異なる寒天上における培養密度跋−文型 Ｅｂａｒｈａｒｄ、Ａ、（１９７２）。

細菌ルシフエラーセ合成の阻害および活性化　Ｊ、　Ｂａｃｔ、＋０９４３１よ ＋ｔｏｔ−ｓ Ｅｂｅｒｈａｒｄ、　Ａ、、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、　Ａ、　Ｌ、、　Ｋｅｎｙ ｏｎ、　Ｇ、　Ｌ。

Ｎｅａｌｓｏｎ、　Ｋ、　Ｈ，＆　Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒ、　Ｎ、　Ｊ、（＋ ９８１）。

フォトバクテリウム・フィランエリ　ルシフェラーゼのオートインデューサーの 構造同定　ａｉｏｃｈｅｍ、　２０（９１；　２４４４−２４４９゜Ｅｎｇｅｂ ｒｅｃｈｔ、Ｊ、　＆　Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ、　Ｍ、（１９８７１゜生物発光に 対する細菌遺伝子の発現を制御する調節遺伝子座のヌクレオチド配列　Ｎｕｃ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、ｌ５（２４）＋　１０４５５−１０４６７゜Ｅｎｇｒｅｂ ｒｅｃｈｔ、　Ｊ、、　Ｎｅａｌｓｏｎ、　Ｋ、　＆　Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ、　 Ｍ。

（１９８３１、細菌性生物発光・ビブリオ・フィランエリからのファンクション の単離および遺伝的分析Ｃａ１ｌ　３２；　７７３−７８Ｌ Ｇｒｓａｎｂｅｒｇ、Ｅ、Ｐ、、）ｌａｓｔｉｎｇｓ、Ｊ、Ｗ、＆　υ１エセｚ ｕｒ、Ｓ。

（＋９７９）、他の海洋細菌によるベネッケア・ハーベイにおける）Ｌ’７Ｖエ ラーゼ合成の誘導　社」二出工ｚ社江−−Ｌ泣、８７−９Ｌ Ｈｌｌｌ、！’、Ｊ、、５ｗ１ｆｔ、Ｓ、＆　Ｓｔｅｗａｒセ、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｂ 。

（１９９＋＋−ビブリオ・ハーベイＩｕｘオペロンおよび大腸菌ｔｒｐオヘロン のＰＣＲによる　遺伝子工学が、生物学的に機能性である天然および融合遺伝子 産物を提供 比法、　＆　ｍ、　ココ壮、　ｉｎ　ｐｒｌｌ！Ｉｉ。

Ｋａｐｌａｎ、　Ｈ，Ｂ、　ａｎｄ　Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ、　Ｅ、　Ｐ、（＋９ ８７１゜１ｕｘＲ遺伝子産物の過剰産生および精製・ビブリオ・フィッシエリ発 光系の転写活性化 ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　！３ｃｉ。

υＳＡ　８４：　６６３９−６６４１ Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、　Ｆ、　ａｎｃｉ　Ｓａｍ ｂｒｏｏｋ、　Ｊ、（＋９８２１　、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ；　 八Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　ｐ４４０゜Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｃｏ １ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ。

Ｍａｒｔｉｎ、　Ｍ、、　Ｓｈｏｗａｌ七ｅｒ、　Ｒ，＆　５ｉｌｖ＠ｒｍａｎ 、　Ｍ、（１９８９）。

ビブリオ・ハーベイにおける発光遺伝子の発現を制御する遺伝子座の同定Ｊ、Ｂ ａｃセ、＋７１（５１： ２４０６−２４１４゜ Ｍｅｉｇｈｅｎ、　Ｅ、　Ａ、［＋９９１１．　細菌性生物発光の分子生物学出 工２溢二江、ム■、■、＋２３−１４２゜Ｍｉｙａｍｏｔｏ　Ｃ，Ｍ、、　Ｍｅ ｉｇｈｅｎ、　Ｅ、　Ａ、　＆　Ｇｒａｈａｍ、　Ａ、　Ｆ。

（＋９９０）、ビブリオ・ノ１−ペイ内へ転移させた上■工遺伝子の転写調節Ｊ 、Ｂａｃｔ、１７２（４）： ２０４６−２０５４゜ Ｎｅａｌｓｏｎ、　Ｋ、　Ｈ，、Ｐｌａｔｔ、　？、　＆　Ｈａｓｔｉｎｇｓ、 　Ｊ、　ｗ。

（１９７０）。

細菌性生物発光系の合成および活性の細胞性制御　Ｊ、　Ｂａｃｔ、＋０４（１ ）；ビブリオ・フィランエリＡＴＣＣ７７４４からの↓ｕｘＲ蛋白質のオートイ ンデューサー結合領域の同定 Ｊ、　Ｂａｃｔ、１７２（７）：　３９８０−３９１３７゜Ｓｈｏｗａｌセｓｒ 、Ｒ，！、、Ｍａｒｔｉｎ、Ｍ、Ｏ，＆　ＳＩｌｖｅｒｍａｎ、Ｍ。

Ｒ，（＋９９０１．ビブリオ・ハーベイの生物発光を制御する調節遺伝子である ＩｕｘＲのクローニングおよびヌクレオチド配列Ｊ、　Ｂａｃｔ、１７２（６１ ＋　２９４６−２９５４゜Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ、Ｍ、、Ｍａｒｔｉｎ、Ｍ、＆　 Ｅｎｇｅｂｒｅｃｈ七、　Ｊ。

（＋９８９１．　海洋細菌における発光の調節工ｎニー１１瀉本ＱＬ！ｌａｃロ 匡ムハｍエム１」＝（Ｈｏｐｗｏｏｄ、　Ｄ−Ａ−＆Ｃｈａｔｅｒ、Ｋ、Ｆ、ｅ ｃｌｓｌ、、ｐｐ　７１−１３６．　入ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄ ｏｎ、５ｌｏｃｋ、　Ｊ、、　ＶａｎＲｅｉｔ、　Ｄ、、　Ｋｏｌｉｂａｃｈｕ ｋ、　Ｄ、　＆Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ、　Ｅ、　Ｐ、（＋９９０）、＋突然変異分 析により決定されたビブリオ・フィランエリＩｕｘＲ蛋白質の臨界領域　Ｊ、　 Ｂａｃｔ、　１７２（７）：　３９７４−３９７９゜Ｓｔｅｗａｒｔ、　Ｇ、　 Ｓ、　Ａ、　Ｂ、　Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ、　Ｋ、、　Ｈａｇａｌｂｅｒｇ、　Ｅ ＆　Ｅｌｌａｒ、　Ｄ、　Ｊ、（１９８１１、細菌胞子の発芽の始動、トリガー 反応の尺度シー曲」しシー、口Ｕ、１０１−１０６゜インデエーサーラｔ７Ｌ　 （ｎｑ） マ　−〜　ロ ー−１’ｌ’ｌ−ｅ’−Ｃｈ　％　％Ｇ（ＬＬＩＩｔｌ）　“勘１７専４７１ 国際調査報告　ｏｒＴＩＱＱ　Ｑｔ／ｎｎ７１１フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号／／（Ｃ１２Ｑ　１１０ ２ Ｃ１２Ｒに３８５ （７２）発明者　ウィリアムス、ボールイギリス国ノツチインガム　エフジ−８ １エイチアール、ウラトン、ラネラフ・グローブ　４１ （７２）発明者　スチュアート、ゴートン・シトニー・アンダーソン・バーニー イギリス国レスターシャー　エルイー１１０キユーエル、ラクポ町ジェームズ・ アベニュー　１４ （７２）発明者　チャブラ、シリ・ラムイギリス国レスターシャー　エルイー１ １０ニーニー、ラクポロ、ニュートン・クロース　９ （７２）発明者　ステッド、ボール イギリス国ドーセット　ビーエイチェ８９ビーデイー、ブロードストーン、ウィ ッドウオーシイ・ドライブ　４４ Ｉ （７２）発明者　ウィンソン、マイケル・ケネスイギリス国ノツチインガム　エ フジ−２フテイービー、ウェスト・ブリッジフォード、ビューフォート・コート 　１０ （７２）発明者　ヒル、フィリップ・ジョンイギリス国ノツチインガム　エフジ −８５ジエイエヌ、アスプレー、ウェンドーバー・ドライブ　１４５ （７２）発明者　リーズ、キャサリン・エリザベス・ダンイギリス国ノツチイン ガム　エフジ−１２５ジエイピー、キーワース、ホーソーン・クロース　２３ （７２）発明者　バイントン、ナイジェル・ジョンイギリス国ノツチインガム　 エフジ−９３エイエフ、プラムコート、デーピッド・グローブ　２６

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．式１の化合物をビブリオ・フィッシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ　ｆｉｓｃｈｅｒｉ ）、ビブリオ・ロゲイ（ｖ．ｌｏｇｅｉ）およびビブリオ・ハーベイ（Ｖ．ｈａ ｒｖｅｙｉ）以外の微生物における遺伝子発現の制御のために使用する用途であ って、式１が ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中のｎは２または３であり、 ＹはＯ、ＳまたはＮＨであり、 ＸはＯ、ＳまたはＮＨであり、 Ｒは置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキルまたはアシルである）である用 途。
2. ２．ＹがＯであり、ＸがＯであり、ｎが２であり、Ｒがアシルである、請求の範 囲第１項に記載の用途。
3. ３．Ｒがケト基またはヒドロキシル基を保有する、請求の範囲第１項または第２ 項に記載の用途。
4. ４．Ｒがβ位にケト基を保有する、請求の範囲第３項に記載の用途。
5. ５．化合物がＮ−（β−ケトカプロイル）ホモセリンラクトンである、請求の範 囲第４項に記載の用途。
6. ６．遺伝子発現により生物発光が生じる、請求の範囲第１項ないし第５項のいず れかに記載の用途。
7. ７．遺伝子発現により抗生物質が産生される、請求の範囲第１項ないし第５項の いずれかに記載の用途。
8. ８．該化合物が細菌の増殖培地に含有され、これが細菌の増殖を促進する、請求 の範囲第１項ないし第５項のいずれかに記載の用途。
9. ９．請求の範囲第１項ないし第５項のいずれかに記載の式１を有する化合物の光 学活性異性体。
10. １０．異性体がＬ−異性体である、請求の範囲第９項に記載の光学活性化合物。
11. １１．試料中のＮ−（β−ケトカプロイル）ホモセリンラクトンまたは同族体を 検査するための方法であって、このラクトンまたは同族体により遺伝子発現が増 強されるべく選ばれた検定細菌と接触させた状態で試料をインキュベートし、該 ラクトンの検査法としてその遺伝子発現を検出することによる方法。
12. １２．特定の条件下でＮ−（β−ケトカプロイル）ホモセリンラクトンまたは同 族体産生することが知られている第１細菌の、試料中における存在を検査するた めの方法であって、このラクトンまたは同族体により遺伝子発現が増強されるべ く選ばれた検定細菌と接触させた状態で、この特定の条件下に試料をインキュベ ートし、第１細菌の検査法としてその遺伝子発現を検出することよりなる方法。
13. １３．第１細菌が縁膿金（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、 霊菌（Ｓｅｒｒａｔｌａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、奇形変形菌（Ｐｒｏｔｅｕ ｓ　ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、シトロバクター・フロインディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃ ｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄｉｉ）および腸内細菌属菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｓ ｐｐ．）から選ばれる、請求の範囲第１２項に記載の方法。
14. １４．第１細菌を含有する可能性がある流体試料を濾過し、検定細菌を含む栄養 培地をフィルターに乗せ、そしてインキュベートする、請求の範囲第１２項また は第１３項に記載の方法。
15. １５．遺伝子発現により生物発光が生じる、請求の範囲第１１項ないし第１４項 のいずれかに記載の方法。
16. １６．遺伝子発現により抗生物質が産生される、請求の範囲第１項ないし第１５ 項のいずれかに記載の方法。
17. １７．微生物の代謝、増殖および／または回復を刺激または促進するのに有効な 濃度で添加された、請求の範囲第１項ないし第５項のいずれかに記載の式１の化 合物を含有する、微生物の増殖培地。
18. １８．異性体がＤ−異性体である、請求の範囲第９項に記載の光学活性化合物。
19. １９．微生物の代謝、増殖および／または回復を刺激または促進するのに有効な 濃度で添加された、請求の範囲第１項ないし第５項のいずれかに記載の式１の化 合物を含有する、ビブリオ・フィッシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ　ｆｉｓｃｈｅｒｉ） 、ビブリオ・ロゲイ（ｖ．ｌｏｇｅｉ）およびビブリオ・ハーベイ（Ｖ．ｈａｒ ｖｅｙｉ）以外の微生物の増殖培地。
20. ２０．添加される化合物が請求の範囲第９項、第１０項または第１８項のいずれ かに記載の光学活性化合物である、請求の範囲第１７項または第１９項に記載の 増殖培地。