JPH06506833A - 幹細胞因子レセプターに対するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 幹細胞囚　レセプターに対するモノクローナル抗体ｉ弧へ１１ 本発明は、ヒト幹細胞因子（ｈＳＣＦ）と結合する細胞レセプターに特異的であ るモノクローナル抗体、並びにこのようなモノクローナル抗体を含有する医薬組 成物及びこのようなモノクローナル抗体の使用に係わる。

幹細胞因子（ＳＣＦ）は、多分化能性造血前駆細胞の増殖を刺激する成長因子で ある。この因子はＥ、　ｃｏｌｉ及び様々な噌乳動物細胞において遺伝子組み換 え技術で製造されている［Ｚｓｅｂｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　６３．　ｐ ｐ、　１９５−２１２　＜１９９０ン；並びに１９９０年１０月１日付、１９９ ０年８月２４日付及び１９９０年６月１１日付でそれぞれ出願された同時係属米 国特許出願第０７７５８９．７０１号、同第０７７５７３，６１６号及び同第０ ７１５３７，１９８号コ。

最近、プロトオンコジーンｃ−ｋｉｔがＳＣＦのレセプターとして同定された［ Ｚｓｅｂｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　６３．　ｐｐ、　２１３−２２４（１ ９９０）］。ｃ−ｋｉｔがＳＣＦにとってのリガンドとして同定される以前から 、ｃ−に己レセプターの存在は知られていた［Ｙａｒ−ｄｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、 　ＥＭＢＯＪ、　６．　ｐｐ、　３３４１−３３５１　（１９８７）；　Ｑｉｕ 　ｅｔａｌ、、　ＥＭＢＯＪ、　７．　ｐｐ、　１００３−１０１１　（１９８ ８）：　Ｆｌａｎａｇａｎ　ａｎｄＬｅｄｅｒ、　Ｃｅ１ｌ　６３．　ｐｐ、　 １８５−１９４　（１９９０）］。

マウスｃ−ｋｉｔに対するポリクローナル抗体が報告されている「旺旦履ｌゴｌ 旦」Ｌｌ、　１）り、　４８９６−４９０３　（１９８８）］が、この抗体がヒ トｃ−ｋｉｔと交叉反応するかどうか、ＳＣＦのそのレセプターへの結合を阻止 するかどうか、あるいはまた細胞の成長に影響するかどうかは未知である。ヒト ｃ−ｋｉｔカルボキシル末端ペプチドに対して産生されたポリクローナル抗体も 報告されている［ＥＭＢＯＪ、　６．　ｐｐ、　３３４１−３３５１　（１９８ ７）］が、この抗体はＳＣＦのレセプターへの結合を阻止しない。

ヒトＳＣＦレセプターを認識するモノクローナル抗体は報告されている［Ｌｅｒ ｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｌｏｏｃｌ　７６　Ｓｕ　＋、１．　ｐ、　２９５ ａ（１９９０）；　＾ｓｂ＋ｓａｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｒｅｓ 、１２．　ｐｐ、９２３−９２８（１９８８）；　Ｃａｍｂａｓｅｒｉ　ｅｔ　 ａｌ、、Ｌｅｕｋｅｌｌｉａ　Ｒｅｓ、１２．　ｐｐ、９２９−９３９　（１９ ８８）：　Ｇａｄｄ　ａｎｄ　Ａｓｈ＋＊ａｎ、　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｒｅｓ、 　１１．　ｐｐ。

１３２９−１３３６　（１９８５＞］。

このように、本発明が現われるまでの従来技術では、ｅ−ｋｉｔレセプターに対 するモノクローナル抗体でｅ−ｋｉｔリガンドとＳＣＦとの結合を阻止する能力 を有すると考えられるものは全く得ることができなかった。

この研究は、国立衛生研究所認可ＰＯＩ−ＤＫ−３１２３２及びアメリカ癌協会 認可ＪＦＲ＾２１７を介して米国政府より一部資金提供を受けている。

凡朋！」シ」 本発明は、ＳＣＦレセプターに結合する能力を有するモノクローナル抗体を含む モノクローナル抗体に係わる。好ましくは、モノクローナル抗体がＳＣＦレセア ターに結合することで当該ＳＣＦレセプターへのＳＣＦ分子の結合が阻害される ことにもなる。好ましくは、ＳＣＦ及びＳＣＦレセプターはヒトに由来する。

本発明の別の構成では、ＳＣＦレセプターモノクローナル抗体を造血細胞精製方 法に用い、この方法は（ａ）細胞混合物をＳＣＦレセプターモノクローナル抗体 に暴露するステップと、 （ｂン前記モノクローナル抗体と結合した細胞を前記モノクローナル抗体と結合 しない細胞から分離するステップとを含む。

本発明の別の構成では、ＳＣＦレセプターモノクローナル抗体で精製した造血細 胞を、精製細胞へのレトロウィルス媒介遺伝子移入な含む遺伝子療法に用いる。

本発明の別の構成は、正常細胞を腫瘍細胞から分離する方法に係わり、この方法 は （ａ）正常細胞及び腫瘍細胞を含む細胞混合物を本発明によるモノクローナル抗 体に暴露するステップと、（ｂ）正常細胞及び腫瘍性白血病細胞のＳＣＦレセプ ター数の差に基づいて正常細胞を腫瘍性白血病細胞がら分離するス本発明の別の 構成は、ＳＣＦレセプターモノクローナル抗体の、該抗体と結合させた抗腫傷薬 の治療有効量での投与による腫瘍細胞治療への使用に係わる。

本発明はまた、本発明のモノクローナル抗体の結合フラグメントと結合させた腫 瘍治療薬を治療有効量で投与することを含む腫瘍細胞治療方法にも係わる。

本発明の別の構成は、細胞試料においてＳＣＦレセプターの存在を決定する方法 に係わり、この方法は（ａ）細胞試料を本発明のモノクローナル抗体にａ露する ステップと、 （ｂ）前記モノクローナル抗体のＳＣＦレセプターへの結合を検出するステップ と を含む。

本発明のモノクローナル抗体は、細胞周期特異的な化学療法剤に対する感受性を 改変する方法においても有用であり、この方法は本発明のモノクローナル抗体を ＳＣＦ阻害量で投与することを含む。

Ｉ【匹Ｌｉ 第１図：　ヒト胎児肝細胞に結合する’２ＳＩｈＳＣＦのスキャッチャード分析 、　０．９ｘｌＯ’個の胎児肝細胞５：　”’ｒｈｓｃＦ（５ヒｍ１モルから２ ナノモル）及び１００倍量の未標１ｈｓｃＦと共に１５℃で４時間インキュベー トした。

第２図：　組み換え体ヒト５ＣＦ（ｒＨｕＳＣＦ）が単独で、あるいはまたイン ターロイキン３のような他の成長因子と組み合わせて投与された時に急性非リン パ性白血病細胞の増殖に及ぼす作用。

第３図：　急性非リンパ性白血病（＾ＮＬＬ）患者由来の芽細胞に結合する”’ Ｔｈ５ＣＦのスキャッチャードプロット。

第４図ご　ヒト小細胞肺癌細胞に結合する”’Ｉｈ５ＣＦのスキャッチャ〜ド分 析、　０．２Ｘ１０’個の小細胞肺癌細胞（Ｈ６９細胞系）をｌ”５ＴｈｓｃＦ （５ピコモルから２ナノモル）及び１００倍量の未標ｍｈＳＣＦと共に１５℃で ４時間インキュベートした。

第５図：　ＯＣＴＭＩ細胞に結合する＋２目ｈＳＣＦのスキャッチャードプロッ ト。

第６図：　正常なヒト骨髄に結合するＳＣＦの間接免疫蛍光分析、骨髄細胞を抗 ＣＤ３４モノクローナル抗体と、　５Ｒ−１（第６Ｂ区）またはインタイブ整合 対照モノクローナル抗体（抗Ｔｈ、　１．１．第６＾図）とで同時に標識した。

第７図：　ＳＣＦレセプターｃ−ｋｉｔのモノクローナル抗体５Ｒ−１による認 識、　ＣＯ５−１細胞をＶ１９．８、またはヒトｃ−ｋｉｔを含むＶ１９．８で トランスフェクトした。　ＣＯＳ細胞膜を、低温ＳＣＦまたは（１：　１０００ に稀釈した）ＳＲ−１腹水を伴い、または伴わない１ナノモルの１２’Ｉｈ５Ｃ Ｆと共にインキュベートし、結合した標ｍ５ＣＦを測定した。

の・　ｔ・ 本発明は、ＳＣＦレセプターに結合する能力を有するモノクローナル抗体を含む モノクローナル抗体に係わる。好ましくは、モノクローナル抗体がＳＣＦレセプ ターに結合することで当該ＳＣＦレセプターへのＳＣＦ分子の結合が阻害される ことにもなる。好ましくは、ＳＣＦ及びＳＣＦレセプターはヒトに由来する。更 に好ましくは、モノクローナル抗体はＩｇｌｌ：２ａイソタイプの抗体である。

上記のようなモノクローナル抗体は、動物を抗原または免疫原で免疫もしくは感 作し、その結果得られた抗体産生細胞を安定で長期閏生存する細胞系（不死細胞 系）と融合させてハイブリドーマを形成し、ハイブリドーマをスクリーニングし て、所望抗体を産生ずる細胞から成るコロニーを選別し、かつ産生されたモノク ローナル抗体を産生細胞から単離することを含む通常の方法で得ることができる 。

惑作は抗原を抗体産生種に注射することによって行ない得る。好ましくは、上記 注射は哺乳動物に、更に好ましくはマウスに対して行なう、普通、応答を最大化 するために、最初の注射の後にブースター注射を行なう。好ましい注射方式では 、ＢＡＬＢ／ｅマウスに対して複数回の注射を行ない、即ち例えば毎週１回の腹 腔的注射を３週間連続して行なう。

注射する抗原の量は、十分検出可能な量の抗体を産生させるのに十分でなければ ならない、好ましい注射抗原量はＳＣＦレセプター保有細胞の数で１０４〜１０ １個であり、更に好ましくは１０５〜１０７個、最も好ましくは約１０６個であ る。

くわえて、ヒトモノクローナル抗体の発生はｉｎ　ｖｉｔｒｏ免疫技術を用いて 実現し得る［ｈｏ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　Ｔｔａｔａｕｎｏｌ、　１３５゜ρ 、　３８３１　（１９８５）］、マウスモノクローナル抗体の可変部を、ヒトに おいてヒトへの異種タンパク質投与にしばしば関連する免疫原性の問題を防止す るのに好ましく用い得るヒト免疫グロブリンの不変部上に遺伝子工学的手法で配 置することも可能である。

このようないわゆる“キメラ抗体”は、ヒト抗体分子の可変抗原結合部をコード する遺伝子をヒト抗体分子の不変部をコードする遺伝子に対してスプライシング することによって得ることができる［５ａｈａＨａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　 ｒｍｍｕｎｏｌ。

ロユ、　ｐｐ、　１０６６−１０７４　（１９８６）；　Ｂｅ１ｄｌｅｒ　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉ＋ｕ＋ｕ−ｎｏｌ、　１４１．　ｐｐ、　４０５３−４０ ６０　（１９８８）；　Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎｎ。

Ｎ、　Ｙ、　Ａｅａｃｌ、　Ｓｃｉ、　５０７．　ｐｐ、　１８７−１９８　（ １９８８）］。

本発明に包含されると考えられる別の操作では、ヒトの不変部及びフレームワー ク可変部と結合したマウスの超可変部を含むキメラ抗体を製造する［Ｒｅｉｃｈ ｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａ−ｔｕｒｅ　３３２．　ｐｐ、　３２３−３２７ 　（１９８８）］。はとんどの場合、抗原特異性はＶ領域（超可変部）またはＣ ＤＲ領域（相補的決定領域）の所定のセグメントに存する。抗原結合部位は、■ 領域の残りのフレームワーク部分から伸長するＣＤＲルーズによって構成される 。宿主の免疫応答はキメラ抗体の、さほど可変性でない誓歯動物フレームワーク Ｖ領域に対して生起し得る。ヒトフレームワークＶ領域を含むキメラ抗体は、マ ウスＣＤＲ領域によって付与された抗原結合特異性を保持するが、宿主の免疫応 答を惹起するとは考えられない。総合的遺伝子合成は、誓書動物抗体由来のＣＤ Ｒをヒトフレームワークに移植したＣＤＲ？ｌ！換変異細胞を製造する最も実用 的な方法である。所望のＶ領域の配列決定に従って当該配列を化学的に合成し、 クローニングし、その後適当な発現ベクターに挿入する。

本発明のモノクローナル抗体の産生に有用な抗原は、その表面にＳＣＦレセプタ ーを有する任意の細胞系である。このような細胞系には、ヒト赤白血病細胞系Ｏ ＣＩＭ１［Ｐａｐａｙａｎ−ｎｏｐｏｕｌｏｕ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｌｏｏｄ　 ７２．　ｐｐ、　１０２９−１０３８　（１９８８）］、Ｋ５６２　（ＡＴＣＣ ＣＣＬ　２４３）、骨髄細胞系もしくは単球細胞系ＫＣＩ（ＡＴＣＣＣＣＬ　２ ４６）、ＫＧＩα　（ＡＴＣＣＣＣＬ　２４８．１＞、＾ＭＬ−１９３［５ａｎ ｔｏｌｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、ニア±３９．　ｐ、　３３４８　（１９８７） ］、０９３７　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５９３）；　リンパ球細胞系Ｄａｕｃｌｉ 　（ＡＴＣＣＣＣＬ２１３）、ｌト９（ＡＴＣＣＣＣＬ　１５９）；配溝細胞系 ［（ＭＣ−１［Ｂｕｔｔｅｒ−ｆｉｅｌｄ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｌｅｕｋｅｎ＋ｉ ａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１２．　ｐ、　３４５　（１９８８）］；膀胱癌細胞系 ５６３７　（ＡＴＣＣＨＴＢ　９）、ＣＯＳ　＜ＡＴＣＣＣＲＬ　１６５０）、 ＢＨＫ　（ＡＴＣＣＣＣＬ　１０）；胃癌細胞系ＫＡＴＯ３（ＡＴＣＣＨＴＢ　 １０３）；小細胞癌細胞系Ｈ６９（ＡＴＣＣＨＴＢ　１１９）、Ｈ１２８（ＡＴ ＣＣＨＴＢ　１２０）；及び乳癌細胞系ＤＵ４４７５　（ＡＴＣＣ１（ＴＢ　１ ２３）が含まれ、これらの細胞系はｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ １ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ。

Ｒｏｃｋｖｉ！ｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄに寄託されている。好ましい抗原はヒ ト赤白血病細胞系０ＣＩＮＩである。

感作を行なうと、感作された動物は抗原に特異的な抗体を産生及び分泌するＢ細 胞を生じさせる。このような細胞は、免疫マウスの膵臓を取り出すことにより単 離して後の使用に供することができる。

上記のようにして得られた抗体産生細胞は、安定で長期間生存する適当な細胞系 （不死細胞系）と、当業者に公知の技術を用いて融合させ得る［Ｋｏｈｌｅｒ　 ａｎｄ　Ｎｉ１ｓｔｅｉｎ、　Ｎａｔｕｒｅζ５６．　ｐｐ、　４９５−４９７ 　（１９７５）］、抗体産生細胞との融合に適した細胞系は抗体合成能に欠ける 任意の細胞系であり、そのうちで好ましいものは選択物質含有培地上で増殖する 能力にも欠け、またきわめて好ましいものは、活性なヒボキサンチン−グアニジ ンホスホリボシルトランスフェラーゼタンパク質をもたらし得ない突然変異ヒボ キサンチン−グアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＨにＰＲＴ −遺伝子）を有する。ヒボキサンチン−グアニジンホスホリボシルトランスフェ ラーゼはアミノプテリン含有培地上での増殖に必要である。上記のような細胞系 の好ましい一例に骨髄腫細胞、特にＮ５−１マウス骨Ｍ腫細胞系が有る［ＡＴｃ ｃＴＩＢ　１８；　Ｎｏｗｉｎｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｖｉｒｏｌｏ　９３． 　ｐｐ、　１１１−１２６（１９７９）］。最近では、融合相手としてヒト細胞 系を用いることにおいてさえ成果が上げられている［Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ　ｅ ｔａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２５１．　ｐｐ、７０−７２　（１９９１）コ。

得られた融合細胞をスクリーニングして、所望抗体を産生ずる細胞から成るコロ ニーを選別し得る。スクリーニング技術は当業者に公知であり、普通融合細胞を 選択物質含有培地上で増殖させることを含み、この増殖の際（１）未融合の不死 細胞が前記選択物質を免れる能力に欠ける場合そのような不死細胞は死滅するが 、（２）抗体産生細胞由来の遺伝物質が前記選択物質を免れる能力を有する場合 そのような遺伝物質を有する細胞は増殖する。好ましい不死細胞系はＨＧＰＲＴ −遺伝子を有し、また好ましい培地はアミノプテリンを含有する培地で、より好 ましくはヒボキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＦＩＡＴ）培地である。

従って、抗体産生細胞系由来の１（ＧＰＲＴ士遺伝子を有し、かつ不死細胞系由 来の不死性を具えた融合細胞のみが培地中で生存及び増殖する。

首尾よく生存及び増殖した融合細胞即ちハイブリドーマに、これらが感作に用い た抗原に対する抗体を産生ずる能力を有するかどうか決定するべくスクリーニン グを施し得る。ＳＣＦの場合、上記のようなスクリーニングはハイブリドーマ産 生物のＳＣＦレセプターに結合する能力によってか、ハイブリドーマ産生物の、 ＳＣＦがＳＣＦレセアターに結合するのを阻害する能力によってか、標準的な免 疫学的技術（例えば放射性標識した精製ＳＣＦレセプターの免疫沈澱）によって か、またはハイブリドーマ産生物の、ＥＬＩＳ＾アッセイにおいて精製ＳＣＦレ セプターを認識する能力によって可能である。好ましくは、ハイブリドーマのス クリーニングはハイブリドーマ産生物の、ＳＣＦがＳＣＦレセプターに結合する のを阻止する能力によって行ない得る。

上記のようなアッセイで有用な幹細胞因子（ＳＣＦ）には、様々な種に由来する 任意のＳＣＦが含まれる。それらのＳＣＦは普通適当なアジュバントと共に溶解 した状態であり、その際アジュバントは緩衝液、塩等を含み得る。好ましくは、 ＳＣＦはヒトＳＣＦ　（［［ｕＳＣＦ）であり、更に好ましくは組み換え体ヒト ５ＣＦ（ｒＨｕｓｃＦ）、最も好ましくはＥ、　ｃｏｌｉにおいて製造されたｒ ）ＩｕＳＣＦである。このようなＳＣＦは先に述べたようにして得ることができ る［Ｚｓｅｂｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　６３．　ｐｐ、　１９５−２１２ 　（１９９０）；並びにその該当教示に関していずれも本明細書に参考として含 まれる、１９９０年１０月１日付、１９９０年８月２４日付及び１９９０年６月 １１日付でそれぞれ出願された同時係属米国特許出願第０７７５８９．７０１号 、同第０７１５７３，８１６号及び同第０７７５３７．１９８号］。

ＳＣＦレセプターに対する抗体の分泌に関して陽性と判明したハイブリドーマは 、サブクローニングして実質的に無限に維持し得る０選別した上記のようなハイ ブリドーマはまた、該ハイブリドーマが分泌するモノクローナル抗体の製造のた めに培養することができる。このようなハイブリドーマの培養物から所望のモノ クローナル抗体を単離することは、プロティン＾−セファロースカラムクロマト グラフィーを含めた当業者に公知の技術を用いて可能である［Ｅｙ　ｅｔ　ｍｌ 、、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　１５．　ｐ、４２９　（１９７８）コ。

本発明のモノクローナル抗体は好ましくは、１９９１年４月４日イ寸で＾ｍｅｒ ｉｅａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　Ｒｏｃｋｖｉ ｌｌｅ。

Ｍａｒｙｌａｎｄ、　ＵＳ＾にＢ＾７．３Ｃ，９として寄託され、受託番号Ｈ８ １０ｎ６を付与された、’５Ｒ−１”と表記されるモノクローナル抗体である。

本発明のモノクローナル抗体は造血細胞精製方法に用い得、この方法は （ａ）＃Ｈ胞混合物を本発明のモノクローナル抗体に暴露するステップと、 （ｂ）前記モノクローナル抗体と結合した細胞を前記モノクローナル抗体と結合 しない細胞がら分離するステップとを含む。

細胞混合物の本発明のモノクローナル抗体への暴露は、蛍光活性化細胞選別の場 合のように溶解状態で行なっても、あるいはまたカラムクロマトグラフィーや直 接免疫付着の場合のようにモノクローナル抗体を固体支持体上に固定して行なっ てもよい、くわえて、抗ＣＤ３４抗体と、ビオチニル化した第二の抗体とをアビ ジンカラムに通してヒト移植組織中の乳癌細胞を除去する場合に行なわれたよう に、細胞混合物の本発明のモノクローナル抗体への暴露を溶解状態のモノクロー ナル抗体と固体支持体に固定したモノクローナル抗体との組み合わせを用いて行 なうことも可能である［Ｂｅｎｓｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ 、　Ａ　ｈｅｒｅｓｉｓ　５．　ｐｐ、　７４−７６（１９９０）；　Ｂｅｒｅ ｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｌｏｏｄ　７６、　ｐｐ、　５０９−５１５（１ ９Ｈ）］。

モノクローナル抗体に暴露するべき細胞混合物は、骨髄細胞、血液細胞または組 繊細胞の任意の溶液であり得る。

好ましくは、細胞混合物は哺乳動物の骨髄、循環血液または疑似腫瘍組織に由来 する。細胞混合物をモノクローナル抗体に暴露すると、ＳＣＦレセプターを有す る細胞はモノクローナル抗体と結合して抗体〜ＳＣＦレセプター細胞複合体を形 成する。このように生じたＳＣＦレセプター細胞複合体は複合体とならない細胞 から、当業者に公知の方法で分離することができる。好ましい分離方法には、カ ラムクロマトグラフィー、蛍光活性化細胞選別、磁気ビーズ分離及び直接免疫付 着が含まれる。

上述のようにして精製した造血細胞は、骨髄移植を含む造血細胞再構成方法に用 い得る。骨髄移植の方法は当業者に公知である［Ｈｉｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｏ ｎｅ　Ｍａｒｒｏｗ　Ｔｒａｎｓ　Ｉａｎｔ、　４゜ｐｐ、　６９−７４　（１ ９８９）］が、ＳＣＦレセプターを有する細胞のこのように同質な集団を移Ｍ物 質として用いることはこれまで可能でなかった。上記Ｎ製細胞は骨髄移植組織の 長期移植を実現し得、かつ骨髄中に存在する恐れの有る汚染性の腫瘍細胞から先 に述べた方法を用いて分離可能である。そのうえ、本発明の精製方法で精製した ＳＣＦレセプター保有細胞は、一層間質な超泡集団を得るべく更に副次的に分別 することができる０例えば、ＳＣＦレセプター保有細胞の集団を、ＳＣＦレセプ ター保有細胞の成る一定のサブ集団にしが現われない他の細胞表面タンパク質に 特異的なモノクローナル抗体に逐次暴露し得る。このような逐次精製方法に用い 得る他のモノクローナル抗体の例に、やはり造血幹細胞において発現するＣＤ３ ４抗原に対するモノクローナル抗体が含まれる［＾ｎｄｒｅｗｓ　ｅｔ　ａｌ、 、　Ｊ、上阻工肚虹ユ６９．　ｐｐ−１７２１−１７３１（１９８９）；　Ｃ１ ｖｉｎの１９９０年１０月２３日付米国特許第４．９６５，２０４号；　Ｃ１ｖ ｉｎの１９９０年１０月３１日付公開のヨーロッパ特許出願第３９５３５５号］ 。

本発明によってＷｔｌた造血＃胞は、精製＃胞へのレトロウィルス媒介遺伝子移 入を含む遺伝子療法にも用い得る。

レトロウィルス媒介遺伝子移入の方法は当業者に公知である［Ｂｏｄｉｎｅ　ｅ ｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾Ｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳ＾８６．　ｐ ｐ。

８８９７−８９０１　（１９８９）］が、ＳＣＦレセプターを有する細胞のこの ように同質な集団トランスフェクトして用いることはこれまで可能でなかった。

トランスフェクトした上記Ｎ製細胞は骨髄移植に用いることができる。

本発明は、正常細胞を腫瘍細胞から分離する方法にも係わり、この方法は （ａ＞正常細胞及び腫瘍細胞を含む細胞混合物を本発明によるモノクローナル抗 体に暴露するステップと、（ｂ）正常細胞及び腫瘍性白血病細胞のＳＣＦレセプ ター数の差に基づいて正常細胞を腫瘍性白血病細胞がら分離するステップと を含む、骨髄細胞を本発明のモノクローナル抗体で標識し、次いでビオチニル化 したヤギ抗マウス抗体で標識してアビジンカラムに通し得る。このアプローチは 細胞の積極的または消極的選択に用い得る。比較的多数のＳＣＦレセプターを有 する細胞はカラム内に留まり、一方比較的少数のＳＣＦレセプターを有する細胞 はカラムを通過する。あるいは他の場合には、多数のＳＣＦレセプターを有する 細胞と少数のＳＣＦレセプターを有する細胞との分離を直接免疫付着及び蛍光活 性化細胞選別によって行なう。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）では、ＳＣＦレ セプターを有する細胞をＳＣＦレセプターに特異的なモノクローナル抗体と混合 し得る。モノクローナル抗体を、（１）フルオレセインイソチオシアネート（Ｆ ＩＴＣ）やフィコエリトリン（ＰＥ）といった蛍光物質と結合させるか、（２） 第一の生物分子（例えばビオチン）と結合させてから、第一の生物分子に特異的 に結合する第二の生物分子（例えばアビジンやストレブタビジン）をＦＩＴＣや ＰＥといった蛍光物質と結合させたものと混合するが、または（３）ＦＩＴＣや ＰＥといった蛍光物質と結合させた、抗ＳＣＦレセプターモノクローナル抗体の 抗体種に特異的な第二の抗体く例えばヤギまたはヒツジ抗マウス抗体）と更に混 合する。このように蛍光標識した細胞は標準的技術を用いて、細胞の呈する蛍光 のレベルに従って選別することができる。

本発明のモノクローナル抗体は腫瘍細胞の治療にも有用であり得、その際前記治 療は、本発明のモノクローナル抗体と結合させた抗腫瘍治療薬を治療有効量で投 与することにより行なう、治療有効量の腫瘍治療薬とは任意量の、腫瘍細胞の増 殖及び／または発生を阻害し、好ましくは細胞の死滅を惹起して生体中の腫瘍細 胞の総数を減少させる化合物である。このような腫瘍治療薬の例に、放射性同位 体１２’Ｉ［Ｐｒｅｓｓ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　０ｎｃｏ１．７ ．　ｐｐ、　１０２７−１０３８（１９８９）］と結合させた、またはりシン［ Ｕｈｒ　ｅｔ　ａｔ、、ヒ１工Ｃｌ１ｎ、　Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｓ、　２８８．　 ｐｐ、　４０３−４１２　（１９８９＞１及びジフテリアトキシン［Ｍｏｏｌｔ ｅｎ、　Ｊ、　Ｎａｔｌ、　Ｃｏｎ、　１ｎｓｔ、　５５．　ｐｐ−４７３−４ ７７（１９７５）］などの毒素結合体と結合させた抗体が含まれる。

白血病治療薬とモノクローナル抗体との結合は、先に述べたような公知技術を用 いて実現し得る［Ｐｒｅｓｓ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、Ｃｌ１ｎ、０ｎｃｏ１．　７．　ｐｐ、１０２７−１０３８　（１９８９） ；　Ｕｈｒ　ｅｔ　ａｌ、。

ｂＬ堕Ｌし辷二ｓ、　２８８．　ｐｐ、　４０３−４１２　（１９８９）］。好 ましくは、モノクローナル抗体上の治療薬結合部位は該モノクローナル抗体のＳ ＣＦレセプター結合部位とは異なる場所に位置する。また、腫瘍治療薬上の抗体 結合部位は該治療薬の活性部位とは異なる官能基に位置することが好ましい。更 に好ましくは、治療薬と抗体との結合の部位はモノクローナル抗体または腫瘍治 療薬のコンホーメーション的変化を最小限に留めるようにも位置する。

本発明は、本発明のモノクローナル抗体の結合フラグメントと結合させた腫瘍治 療薬を治療有効量で投与することを含む腫瘍細胞治療方法にも係わる。適当な結 合フラグメントは、当該フラグメント自体のＳＣＦレセプターへの結合を可能に する十分な大きさ及び構造を保持するフラグメントである。このようなフラグメ ントは、タンパク質分解消化を含めた多くの方法で製造することができる［Ｇａ ｒｖｅｙ　ｅｔａｌ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｉ＋ｍｕｎｏｌｏｇｙ、　Ｃ ｈａｐｔｅｒ　３１．１４．＾、　Ｂｅｎｊａ−＋ｓｉｎ、　Ｒｅａｄｉｎｇ、 　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　（１９７７）］、製造した結合フラグメントは 先に述べた結合アッセイを用いて、ＳＣＦレセプターに結合する能力について評 価することが可能である。

本発明のモノクローナル抗体の別の使用は、細胞試料においてＳＣＦレセプター の存在を決定する方法に係わり、この方法は （ａ＞細胞試料な本発明のモノクローナル抗体に暴露するステップと、 （ｂ）前記モノクローナル抗体のＳＣＦレセプターへの結合を検出するステップ と を含む。

細胞混合物の本発明のモノクローナル抗体への暴露は、蛍光活性化細胞選別の場 合のように溶解状態で行なっても、生検物質などの固体組織材料上で行なっても 、あるいはまたカラムクロマトグラフィーや直接免疫付着の場合のようにモノク ローナル抗体を固体支持体上に固定して行なってもよい。モノクローナル固体に 暴露するべきａｔ胞混合物は、血液細胞または組繊細胞の任意の溶液であり得る 。好ましくは、細胞混合物は正常な哺乳動物細胞、哺乳動物の骨髄、循環血液ま たは疑似腫瘍組織に由来し、更に好ましくは正常細胞、白血病細胞及び固形腫瘍 細胞に由来する。細胞混合物をモノクローナル抗体に暴露すると、ＳＣＦレセプ ターを有する細胞はモノクローナル抗体と結合して抗体−３ＣＦレセプター複合 体を形成する。抗体−５ＣＦレセプター複合体の、従ってＳＣＦレセプターの存 在は当業者に公知の諸方法で検出することができる。それらの方法にはＥＬｒＳ ＾、免疫組織化学的方法、及び１２５ＣでＷ識した５ｔａｐｈプロテイン八を用 いるオートラジオグラフィーが含まれる。

本発明のモノクローナル抗体は、細胞周期特異的な化学療法剤に対する感受性を 改変する方法においても有用であり、その際前記方法は本発明のモノクローナル 抗体をＳＣＦ阻害量で投与することを含む、　ＳＣＦ阻害量のモノクローナル抗 体とは、ＳＣＦのそのレセプターへの結合を著しく阻害するか、または初期多分 化能性造血前駆細胞、白血病細胞、固形腫瘍細胞、骨髄細胞などのＳＣＦレセプ ター保有細胞の増殖及び発生を著しく低下させるのに十分な量のモノクローナル 抗体のことである。著しい阻害とは通常、所与の阻害測定方法の下で予想される 誤差に起因する変動を凌駕する阻害のことである。阻害によって、ＳＣＦのその レセプターへの結合を好ましくは少なくとも５０％、更に好ましくは少なくとも ７５％、更に好ましくは少なくとも９０％減少させ、最も好ましくはＳＣＦのそ のレセプターへの結合を実質的に総て阻害する。ＳＣＦレセプター保有細胞の増 殖及び／または発生の著しい低下とは通常、所与の増殖及び／または発生測定方 法の下で予想される誤差に起因する変動を凌駕する低下のことである。　ＳＣＦ レセプター保有細胞の増殖及び／または発生の低下は、ＳＣＦレセプター保有細 胞の増殖速度を好ましくは少なくとも１／２、更に好ましくは少なくとも１／１ ０、最も好ましくは少なくとも１／１００に低下させることにより好ましく実現 する。

本発明のモノクローナル抗体の投与方法には、活性成分として本発明のモノクロ ーナル抗体を含有する医薬組成物を適量投与することが含まれる。活性成分に加 えて、上記医薬組成物は適当なＭｆｌｉ液５稀釈剤及び添加物も含有し得る。１ ！１当な［衝液にはＴｒｉｓ−１（ＣＩ、酢酸塩、グリシン及びリン酸塩、好ま しくはｐｌ＋６．５〜７．５のリン酸塩が含まれる。適当な稀釈剤には、ＮａＣ Ｉ、ラクトースまたはマンニトール、好ましくはＮａＣＩと等張に調整された滅 菌水溶液が含まれる。

適当な添加物には、表面吸着を防止するアルブミンやヘラチン（ｈｅｌａｔｉｎ ）、界面活性剤（例えばＴｗｅｅｎ　２０、Ｔｗｅｅｎ　８０、Ｐｌｕｒｏｎｉ ｅ　Ｆｅ２）、可溶化剤（例えばグリセロール、ポリエチレングリコール）、酸 化防止剤（例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）及び防腐剤［例え ばチメルソール（Ｔｈｉｓｅｒｓｏｌ）、ベンジルアルコール、ノ（ラベン］が 含まれる。

好ましい添加物はＴｗｅｅｎ　８０である。

投与は、静脈内、皮下または筋肉内に投与する手段を含めた任意の通常手段によ って行ない得る。好ましし）投与経路は静脈内である。全投与量を１回で投与す ることも、適当な回数で分割投与することも可能である。

好ましくは、医薬調製物は単位投与形態とする。そのような形態では上記調製物 を、十分量、即ち例えば所期の目的達成に有効な量の活性成分を含有する１回量 ずつ（こ細分する。

実際に用いる投与量は、患者の要求及び治療する状態の重篇度次第で様々となり 得る。特定の状況下６二適正投与量を決定することは、当分野の技術の範囲内で ある１通常、化合物の最適投与量を下回る比較的少ない投与量で治療と開始する 。その後、投与量を、当面の事情下で最良の成果に到達するまで少しずつ増して ゆく０便宜上、１日当たりの全投与量を分割して実質的に連続的にか、また番よ 所望であれば１日の間に河回かに分けて投与することが可能て゛ある。投与の量 及び頻度は、患者の年齢、状態及び体格並びに治療する疾病の重篤度を考慮して 主治医が下した診断に従って調節する。

本発明の使用に関して一般に推奨される投与方式では、毎日体重１ｋｇにつき約 ０．１〜約１０ｍｇの活性成分を投与する。

去」１倒 以下の実ｈｌ！、ＰＡは、本発明の範囲を制限することなく本発明の特定の実施 態様を示すものである。引用した全ての参考文献は、関連教示の参照により本明 細書の一部を構成するものとする。

１　の感− １怒作に使用するのに適した抗原は、ＳＣＦレセプターを発現する任意の細胞で あった。ＳＣＦレセプターの存在は放射性標識ＳＣＦを使用して確認した。Ｚｓ ｅｂｏ　ｅｔａｌ、、ｃ　ｅ　！Ｉ　６３　二　１９５−２１２（１９９０）； 並びにそれぞれ１９９０年１０月１日、１９９０年９月２４日及び１９９０年６ 月１１日出願の同時係属米国特許出願第０７１５８９．７０１号、第０７１５７ ３．６１６号及び第０７１５３７．１９８号に従って、ヒト及び噌歯動物のＳ　 ＣＦ　””−口５を得た。ががるＳＣＦを、Ｈｕｎｔｅｒ及びＧｒｅｅｎｗｏｏ ｄ［：Ｎａｔｕｒｅ　１９４：４９５−４９６（１９６２）：ＩＩのクロラミン Ｔ法を使用して＋２５Ｉでａ識した。”５１１：、）ＳＣＦ（ｈＳＣＦ）の比活 性は２．０００〜２．５００Ｃｉ／ｍｍｏ　Ｉであった。１２５ＪｈＳＣＦ及び １２５（ラット５ＣＦ（ｒＳＣＦ）はイスれも５ＣＦＩ、ｆブタ−含有細胞に結 合する能力３保持していた。更に、１２’　ＪｈＳＣＦ及び非標識ｈＳＣＦによ る自己変位分析〔Ｃシ ａｌｖｏ　ｃｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、２１２２５９−２６４　（１９ ８３＞）は、ヨウ素化によって結合親和性が変性されないことを示した。多数の 他の造血増殖因子の赤白血病細胞系○ＣＩＭＩ　ＣＰａｐａｙａｎｎｏｐ。

ｕｌｏｕ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｌｏｏｄ　７２：１０２９−１０３８（１９８８） ’ｌに結合する能力を試験した。表１がら、１００倍モル過剰量の非標識ｈＳＣ Ｆは結合において極めて効果的に競合したが、種々の他の増Ｎ因子は競合しなか ったことが判る。

表１ ０１０Ｃｌ細胞１への結合における＋２ＳＩｈＳＣＦとの競合ＧＭ−Ｃ３Ｆ　１ ．７４２ エリトロポエチン　１７７５ Ｇ−Ｃ３Ｆ　１．８４３ ’ＯＣＩＭＩ細胞を２００ｐｍｏｌの１２５ＩｈＳＣＦと一緒に、１００倍モル 過剰量の表中の増殖因子の存在下ま多数の正常造血細胞、造血細胞系及び腫瘍非 造血細胞を、５ＣＦｌ／セブターの発現についてスクリーニングした。正常ヒト 骨髄単核細胞はｈＳＣＦを結合し、ヒト胎児肝初期赤芽球も同様てあった。末梢 血ＢＦＵ−Ｅを培養し、１４日後に個々のコロニーを採取することにより得られ た成人後期赤芽球もまたＳＣＦレセプターを発現した。正常ヒト骨髄細胞におけ るＳＣＦレセプターの分布を、オートラジ３１３−３２１（１９８５）’］。芽 細胞及び前骨髄細胞であると見られる核／細胞賀比が高い大細胞は、１細胞当た り約５０〜２００グレインという高密度で標識された。巨核球もまた１２５Ｉ結 合を示した。

多数のヒト造血細胞系かＳＣＦレセプターを発現した。

赤白血病細胞系○ＣＩＭ１及びに５６２はＳＣＦを結合し、骨髄様単核細胞系Ｋ Ｇ−１，ＫＧＩａ、ＡＭＬ−１９３及びＵ９３７も同様であった。リンパ細胞系 Ｄａｕｄｉ及びＩＭ−９並びに肥ａｌｌ胞系ＨＭ　Ｃ−１は全てがＳＣＦを結合 しな。ＳＣＦレセグターはまた、膀胱癌ｍ胞系５３６７、ＣＯＳ、ＢＨＫ、胃癌 細胞系Ｋ　Ａ、　Ｔ○３、小細胞癌細胞系１（６９及びＨ１２８、並びに乳癌細 胞系ＤＵ４７５含含む非造血細胞系においても認められた。

正常ヒト胎児肝細胞においてＳＣＦレセプターを定量化し、コロニーアッセイに おいてそれらのＳＣＦに対する応答を試験した。ヒト胎児肝細胞（妊娠齢５５〜 ８０日）を治療的流産から得た。かがる組織の使用の承諾を得ると共に、ワシン トン大学のｔｈｅ　ＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＲｅｖｉｅｗ　Ｂｏａｒｄに実 験許可を得た。細胞を、＋５工ｈＳＣＦ（５ｐｍｏ　Ｉ〜２ｎｍｏ則±１００倍 過剰量の非標識ＳＣＦと一緒に代謝阻害剤の存在下に１５℃で４時間インキュベ ートした。かがる条件下で、ＳＣＦに対する結合が平衡化され、インターナリゼ ーションは最少となった（く１７％）。インキュベーション終了時に、Ｂｒｏｕ ｄ’Ｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｌｏｏｄ　二旦：１６２１１６２６（１９９０）に記 載のごとくフタレート油によって細胞を沈降することにより、細胞に結合した” ’Ｉｈ５ＣＦを遊離”ＪｈＳＣＦから分離した。１または２クラスのレセプター における平衡状態は、リガンドプログラム［Ｍｕ　ｎ５ｏｎ　ａｎｄ　Ｒｏｄｂ ａｒｄ、Ａｎａｌｙｔ、Ｂｉ。

ｃｈｅｍ、１０７：２２０−２３９（１９８０））を使用したデータと適合した 。ヒト胎児肝細胞は、図１に示したように２クラスのＳＣＦレセプターを発現す ることが判った。

約１．７００レセプター／細胞について、高親和性レセプターのＫｄは１４ｐｍ ｏｌであり、低親和性レセプターのＫｄは２７ｎｍｏｌであった。

腫瘍造血ｌｌ１ｌＩ胞を、ＳＣＦに応答してＳＣＦレセプターを発現するか決定 すべく試験した。急性非リンパ性白血病（ＡＮＬＬ）の症状出現時の２０人の患 者と２人の正常成人由来の骨髄単核細胞を試験した。細胞を、１５％ウシ胎児血 清及び組換えヒトＩＬ−３を補充した寒天中で培養した。

８．１５及び２１日ローコロニー（＞４０８胞）及びクラスター（く４０細胞） をカウントした。目’Ｉｈ５ＣＦ±１００倍過剰量の非標識ｈＳＣＦを用いた平 衡結合試験によってＳＣＦレセプターを定量化した。ＳＣＦレセプターの細胞分 布をオートラジオグラフィーによって調査した。試験した２０個のＡＮＬＬ骨髄 のうち７つの骨髄と２つの正常骨髄由来のＳＣＦがコロニー増殖を刺激した。Ｓ ＣＦは、単独ではコロニー増殖に僅がな作用しが及ぼさながったが、ＩＬ−３と 相乗作用してコロニーの数及びサイズを増大した（図２＞、２０人全方のＡＮＬ Ｌ患者の芽細胞においてＳＣＦのレセプターが同定された。２０人のＡＮＬＬ患 者のうち１０人は骨髄単細胞上に２クラスのＳＣＦレセプターを示した１図３に 示したように、ＡＮＬＬ患者の１人に由来する芽細胞に結合した”５ＩｈＳＣＦ のスキャッチャードプロットは、１細胞当たり約５００個の高親和性ＳＣＦレセ ７夕一（Ｋｄ１６ｐｍｏ＋）及び約７０００個の低親和性レセプター（Ｋｄ７． ６ｎｍｏｌ）を示した。かがる結合親和性は、正常ヒト胎児肝細胞及び正常ヒト 骨髄単核細胞において認められるものと類似である。２０人の患者のうち６人は 単一クラスの高親和性レセプターを示し、残りの患者は車−の低親和性結合部位 と示した。ｍ胞当たりのレセプターの数及び１または２クラスのレセプターの存 在はいずれも、ヒトＡＮＬＬ芽細胞におけるＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ及びＧ−Ｃ Ｓ　Ｆレセプター１：Ｐａｒｋ　ｅｔ　ａｌ。

、Ｂｌｏｏｄ　７４：５６−６５（１９８９））に認められているようには、Ｓ ＣＦに応答した増殖との相関を示さなかった。

上記白血病患者由来の骨髄単核細胞は９０％以上が芽細胞であったが、正常成人 由来の骨髄単核細胞の芽細胞画分ははるかに小さかった。芽細胞の割合の著しい 差は、正常骨髄試料と白血病骨髄試料において１細胞当たりの平均レセアター数 を比較することは厳密でないことを示唆している０個々の細胞への結合を分析し 得るオートラジオグラフィーを使用すると、正常及び白血病芽細胞に結合したＳ ＣＦをより正確に比較することができる。８つのＡＮＬＬ骨髄試料において、正 常ヒト骨髄単核細胞に結合した＋２５ｉｈＳＣＦのオートラジオグラフィー分析 を、直接比較し得る単一実験において実施した。グレインカウントから、正常骨 髄試料胞は約５０〜２００グレイン／芽細胞を発現し、白血病芽細胞は２〜２０ グレイン／芽細胞を発現したことが判った。白血病芽細胞へのＳＣＦの結合は正 常芽細胞へのＳＣＦの結合より著しく低かった。

ＳＣＦレセプターは、Ｈ６９、Ｈ１２８及び１）Ｕ４７５を含む非造血源の腫瘍 細胞系においても認められた。Ｈ６９ＩＩｌｌ胞に結合した１２’Ｉｈ５ＣＦの スキャッチャードプロット（図４）は、１細胞当たり１６５０の高親和性レセプ ター（Ｋｃ１３７ｐｍｏ＋）及び１細胞当たり２２．３００のレセプター（Ｋｄ ７．２ｎｍｏｌ）を示した。

ＯＣＩＭＩは、エリトロポエチン（Ｂｒｏｕｄｙ　ｅｔａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ　８５：６５１３−６５１７（１９８８） ）、ＧＭ−Ｃ３Ｆ及びＩＬ−３に対するレセプターを発現するヒト赤白血病細胞 系である。１２’ｒｈｓｃｐを用いた平衡結合試験は、図５に示したように、○ ＣＩＭＩ細胞が１細胞当たり約２ｏｏ、ｏｏｏのＳＣＦレセプターを発現するこ とを示した。

単一クラスの高親和性ＳＣＦレセプター（Ｋｄ４５ｐｍ。

ｌ）は明らかである。ｈＳＣＦは、浮遊培養においてｏＣＩＭＩ細胞の増殖を刺 激しなかった。ＭＢ−０２は、エリトロポエチンの存在下で赤芽球に分化する増 Ｎ因子依存性ヒト赤白血病細胞系である［Ｐｅｒｒｉｎｅ　ｅｔ　ａｌ。

、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ。

１６４：８５７−８６２（１９８９）］、ＭＢ−０２はｈｓＣＦに応答して増殖 したが、赤芽球に分化せず、高親和性及び低［Ｎａ性の両ＳＣＦレセプターを発 現した。

高親和性ＳＣＦレセプターを発現することがらＯＣＩＭ１細胞を免疫原として使 用したが、ＳＣＦレセプターを発現する任意の細胞を、ＳＣＦレセプターに対す る抗体を誘導するための抗体として使用することができる。

８週齢のｆｉＢａｌｂ／Ｃマウスに１０’個のＯＣＩＭＩ細胞を１週間間隔で３ 回、腹腔的注射した。

２　：　ＳＣＦレセプ　−に・　モノ　ロー　ルの」二産 ３回目の注射の５日後、膵臓を取り出し、牌細胞をＮ５−１ネズミミエローマ細 胞と融合したＣＮｏｗｉｎｓｋｉｅｔ　ａｌ、、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　９３：１１ １−１２６（１９７９）］。全部で２８８個のハイブリドーマウェル由来の上清 を、後記実施例５に記載のごと（１２５■ｈＳＣＦの○ＣＩＭＩ細胞への結合を ブロックする能力についてスクリーニングした。陽性ハイブリドーマを同定し、 クローニングし、ブリスタン（ｐｒｉｓｔａｎｅ）怒作Ｂａ１ｂ／Ｃマウスにお いて腹水生成腫瘍として増殖させた。抗体をＩｇＧ２ａと同定し、ＳＲ−１と命 名した［：１９９１年４月４イ寸けでｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃ ｕＩｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ。

Ｍａｒｙｌａｎｄ　ＵＳＡにＢＡ７．３Ｃ，９として寄託し、ＡＴＣＣ受託番号 Ｉ（Ｂ１０７１６を与えられた〕。別のハイブリドーマをスクリーニングすると 、同様の頻度で別の抗ＳＣＦレセプターモノクローナル抗体が同定された。

３、ネズミロ　−　びヒト・１　を　る　メラモノ　ローナル　の ５Ｒ−１モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞系からゲノムＤＮＡ を調製し、Ｈｇ及びＬＭの可変域（それぞれｖ８及び■Ｌ）をコードする機能エ キソンを、サザン分析によって得られたＤＮＡ制限マツプによって同定した。ｇ ｅ　ｒｍ　ｌ　ｉ　ｎｅＶ、遺伝子を再構成し、Ｊ、遺伝子セグメントに結合す ると、結果的に機能Ｖエエキソンが得られる。同様に、■□遺伝子をＪｌ、ｌ遺 伝子セグメントに並置すると、機能■イエキソンが生成される。特異的ＤＮＡプ ローブセグメントは、再構成された表現型を再構成されていないｇｅ　ｒｍ　ｌ 　ｉ　ｎｅＤＮＡセグメントから区別する固有の制限酵素部位によって再構成Ｖ 域遺伝子を同定するよう設計される〔Ｏｉ　ａｎｄ　Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　４：２１４−２２１（１９８６））。

組換えＤＮＡ技術を使用してゲノムＤＮＡライブラリーを構築し、所望のＶ遺伝 子を単離及び配列決定して、再構成及び発現されたＶ、及びＶＬエキソンのアイ デンティティを確認した。■イエキソンをｐ　ＳＶ２Δ）（ｇＰ　ｔベクター〔 Ｍｕｌｌｉｇａｎ　ａｎｄ　Ｂｅｒｇ、５ｃｉｅｎｃｅ　２０９　：１４２２− １４２７（１９８０）；Ｍｕ　ｌ　Ｉ　ｉｇａｎａｎｄ　Ｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵｓＡ　７８：２０７２−２０７６（１９８１） ）中に挿入した。このベクターは、プラスミドをＥ、ｃｏｌｉ中に維持するため にアンピシリン耐性遺伝子を、また、ヒボキサンチン、ミコフェノール酸及びキ サンチンを含む培地中で増殖する哺乳動物細胞を選択し得るようミコフェノール 酸耐性遺伝子を含む。所望のＶ、エキソンを、ｐＡＣＹＣ１８４プラスミドから 誘導したｐｓＶ１８４ΔＨｎｅＯベクター［Ｃｈａｎｇ　ａｎｄ　Ｃｏｈｅｎ、 Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１４３：１１４１−１１５６（１９７８＞Ｅ中に挿入 した。このベクターは、プラスミドをＥ、Ｃ０Ｉｌ中に維持するために使用され るクロラムフェニコール耐性遺伝子と、このプラスミドベクターを用いて形質転 換した哺乳動物細胞を選択するために使用されるゲンタマイシン耐性遺伝子とを 含む。ゲンタマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）の転写は、ＳＶ４０初期領域プロモ ーターによって誘導される。免疫グロブリンのＨＭ及びＬｌに周知のＤＮＡ調節 配列もまた上記トランスフェクションベクターに含められるＣＣａｌａｍｅ、Ａ ｎ、ｎｕａｌ　Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、３：１５９−１９６（１９８５）：Ｍ ｏｒｒｉｓ。

ｎ　ａｎｄ　Ｏｉ、Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎ。

１．２：　２３９−２５６（１９８４）：ｌ。両プラスミドを、クロラムフェニ コール及びアンピシリン選択培地中で増殖させたＥ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ（Ｂ ｏｙｅｒ　ａｎｄＲｏｕｌ　１ａｎｄ−Ｄｕｓｓｏｉｘ、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉ。

１．４１　：４５９（１９８９））中に維持した。

リゾチーム及びＥＤＴＡを用いて処理することにより調製した上記細菌細胞の原 形質体を、ポリエチレングリコール処理またはエレクトロポレーションによって 免疫グロブリン非産生マウスＳ　Ｐ　２１０ミエローマ細胞系（：ＡＴＣＣＣＲ Ｌ　１５８１：］と融合した。トランスフェクトしたＳ　Ｐ　２１０細胞を、ゲ ンタマイシン、ヒボキサンチン、ミコフェノール酸及びキサンチンを含む培地を 使用して単離した。得られたトランスフエフトーマ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａ ）を、実施例２に記載の技術を使用してマウス：ヒトキメラ５Ｒ−１抗体の産生 についてスクリーニングし４：モノ　ローナル　のＳＣＦレセプターへの１匹五 定二二皇４ ＣＯ３−１ｍ胞を、ヒトｃ−ｋｉｔ（Ｚｓｅｂｏ　ｅｔａｌ、、Ｃｅ１１　６３ ：２１３−２２４（１９９０））の膜貫通ドメイン及び外部ドメインを含むベク ターまたはベクター単独でトランスフェクトした。まず５Ｒ−１次いでＦｒＴＣ 結合ヤギ抗マウスＩｇＧを使用して間接免疫分析すると、５Ｒ−１は、ベクター 単独でトランスフェクトしたｍｗを全く認譜せず、ｃ−ｋｉｔを用いてトランス フェクトした細胞ではその５〜１０％を認識したことが判また。これは、５Ｒ− １がｃ−ｋｉｔに結合することを示している。

間接免疫分析から更に、モノクローナル抗体（ＳＲ−１）が、ＯＣｒＭ１ｍ胞及 び少量（２〜５％）の骨髄単核細胞の両方に存在する表面エピトープを認識する ことが判った（図６Ａ）、５Ｒ−１抗体は、ＣＤ３４を発現する造血細胞の一部 （５０〜７５％）を認識したく図６Ｂ）、これらの結果は、骨髄細胞を抗ＣＤ３ ４モノクローナル抗体〔抗体１２．８゜Ａｎｄｒｅｗｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｅ ｘｐ、Ｍｅｄ、１７２：３５５（１９９０）；Ｃ１ｖｉｎ、１９９０年１０月２ ３日出願米国特許第４．９６５，２０４号；Ｃ１ｖｉｎ。

１９９０年１０月３１日公開欧州特許第３９５３５５号〕と、５Ｒ−１またはイ ソタイプ適合対照モノクローナル抗体抗Ｔｈｙ１．１．Ａｎｄｒｅｗｓ　ｅｔ　 ａｌ、、Ｊ。

Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１７２：３５５（１９９０）とで同時に標識して得られた。か かる実施例は、５Ｒ−１及び間接免疫分析を使用してｃ−ｋｉｔを発現するｍ胞 を同定し得ることを示している。５Ｒ−１抗体はＰＥに直接結合することもでき 、この調製物を使用してｃ−ｋｉｔを発現する細胞つ　が同定されている。別の 方法は５Ｒ−１抗体をビオチニル化することであり、この調製物の結合が、ＦＩ ＦＣまたはＰＥに結合したアビジンまたはストレプトアビジンを使用して検出さ れる。

５：モノ　ローナル　５Ｒ−１に　ＳＣＦのＳＣＦレセブ　−への　人の　の′ 　ツセイ：ＳＣＦレセプターを発現する細胞を、”’ＩｈＳＣＦ（１００ｐｍｏ 　＋）と−緒に、種々の量の５Ｒ−１抗体の存在下または不在下でインキュベー トした。好ましくは、５Ｒ−１腹水の１　：　１０００〜１　：　Ｚｏｏ、００ ０希釈液を使用する。インキュベーション終了時に、フタレート油によってｍ胞 を沈降することにより、細胞に結合した＋２５　■ｈＳＣＦを遊１１１′２５Ｉ ｈＳＣＦから分離した（Ｂｒｏｕｄｙｌ：１００．ＯＯＯに希釈した腹水が、　 ”’ｒ　ｈ　ＳＣＦのＯＣＩＭＩ細胞への結合をブロックする〈表２）、このモ ノクローナル抗体は、＋５■−ラットＳＣＦのネズミＭＣ／９細胞系への結合を ブロックしないことから、ヒトｈＳＣＦレセプターに特異的である。

表１ ”５ＩｈＳＣＦのＯＣｒＭＩＳＲ−１４２１’への結合の５ＦＩ−１によるブロ ック非標識Ｓ　ＣＦ　８９ 腹水に１．０００　７０ 腹水１：１０，０００　３９ 腹水１：１００，０００　１１８ 腹水１　：１，０００，０００　７６０腹水１　：　１０．０００．０００　１ ３７５’　ＯＣＩＭＩ細胞を１００１００ｐの１２５１ｈｓｃＦと一緒に５Ｒ− １腹水の希更に、Ｃ０８−１ｍ胞をＶ１９．８（Ｚｓｅｂｏ　ｅｔａｌ、、Ｃｅ １ｌ　６３：２１３−２２４（１９９０））またはヒトｃ−ｋｉｔを含むＶ１９ ．８を用いてトランスフェクトした。ＣＯＳ細胞膜をｌｎｍｏｌの”’Ｉｈ５Ｃ Ｆと一緒に、冷たいＳＣＦまたは５Ｒ−１腹水（１：１０００希釈液）の存在下 または不在下にインキュベートし２結合した標識ＳＣＦを測定した。５Ｒ−１は 、非標識ＳＣＦと同じく効果的に１２ＪｈＳＣＦのｃ−ｋｉｔへの結合をブロッ クした（図７）。

６　：　ＳＣＦの　の５Ｒ−１による ＋２５１ｈｓｃＦの細胞への結合をブロックすることに加え、５Ｒ−１は、コロ ニー増殖におけるＳＣＦの生物学的作用をもブロックする。ＳＣＦは初期赤芽球 コロニー形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）の増殖を刺激するが、５Ｒ−１はこの作用をブ ロックする。ＳＣＦは、より成熟した赤芽球コロニ−形成細胞（ＣＦＵ−Ｅ）の 増殖を変化させることはなく、５Ｒ−１はＣＦＵ−Ｅ増殖に作用を及ぼさない。

ヒト骨髄単核細胞を５半固形培地において組換えヒトエリトロポエチン（１単位 ／ｍｌ、Ａｍｇｅｎ　Ｉｎｃ、。

Ｔｈｏｕｓａｎｄ　０ａｋｓ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）及びｈＳＣＦ（５０ｎｇ ／ｍｌ＞中で、５Ｒ−１腹水（に１０００希釈液）の存在下または不在下で培養 した。７日目にＣＦＵ−Ｅをカウントし、１４４日目ＢＦ［Ｊ−Ｅをカウントし た。二重反復試験プレートを用いて３回実験し、１つの実験結果を表３に示す。

表３ ヒト赤芽球コロニー増殖における５Ｒ−１の作用コロニー／−１０’細胞 ７：モノクローナル　５Ｒ−１の２、・への　ム得られた結合体を治療及び診断 に使用するよう、５Ｒ−１は種々の薬剤にカップリングまたは結合される（Ｓｃ ｈｅｉｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ　１゜３ｌ−３７（１９８ ７））。

ｃ−ｋｉｔレセプターを発現する細胞を含む腫瘍及び腫瘍塊のｉｎ　ｖｉｖｏ造 影に使用するためには、抗体または抗体フラグメントは１２３■、１３１１．Ｉ ｌｌ■Ｄ、！ＯＹ、９１Ｔｃといった放射性同位元素に結合される。また、上記 腫瘍の治療、及び白血病のような分散型悪性病態の治療に使用するためには、抗 体または抗体フラグメントは３２ｐ、＋３’Ｉ、”Ｙ、目’Ｒｅ　、”２Ｐ　ｂ 、２１Ｊｉといった放射性同位元素に結合される（Ｓｃｈｅｉｎｂｅｒｇ　ｅｔ 　ａｌ。

、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ　１．３１　３７（１９８７）及びＨｕｍｍ、Ｊ、Ｌ、、Ｊ 、Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ２７．１４９０−１４９７（１９８６）） 。放射性同位元素の抗体への結合は、ｐｅｒｔｉｎｎｉｎｇ法（Ｓｃｈｗａｒｔ ｚ　Ｊ、、Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　２８．７２１（１９８７＞及び Ｒｈｏｄｅｓ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　２１．５４（１９８０＞’］を含む方 法によって放射性同位元素を抗体に直接結合させるか、または、抗体と放射性同 位元素を結合する、ジエチレントリアミン五酢酸＜ＤＴＰＡ）ＣＨｎａｔ。

ｗｉｃｈ　ｅｔ　ａｌ　、Ｊ、Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　２６：５０ ３−５０９（１９８５））、Ｎ２５ｚ［：Ｆｒｉｔｚｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ　ｅｎｃｅｓ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８５　：　４０２５（１９８８ ＞）もしくは大員環キレート化剤（Ｍｏｉ　ｅｔａｌ、、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ ｅａｒｃｈ（前出）　５０ニア８９５−７９３５（１９９０））を使用するよう な二官能性キレートリンカ−を介して行なわれる。

治療に使用するため、種々の他の毒性物質も抗体に結合される。その例としては 、インターカレーション（例えばダヴノマイシン、アドリアマイシン、アクラシ ノマイシン（ａｃ　Ｉ　ａｃ　ｉ　ｎｏｍｙｃ　ｉ　ｎ））またはＤＮＡ（；Ｔ Ｊ＠（例えばニスベラマイシン（ｅｓｐｅｒａｍｙｃｉｎ）、カリケアマイシン （ｃａ　Ｉ　ｉ　ｃｈｅａｍｙｃ　ｉ　ｎ）、ネオカルチノスタチン）によって ＤＮＡと相互作用することで毒性である抗腫瘍剤及び抗生物質、並びに、シスプ ラチナ、ビンブラスチン及びメトレキサートといった他の毒性細胞増殖抑制剤を 挙げることができる［：Ｓｃｈｅｉｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、、Ｏｎｃｏｌｏｇ ｙ　１：３ｌ−３７（１９８７）；Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ　ｅｔ　ａｌ、、Ａｎ ｔｉｂｏｄｙ。

Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ、　ａｎｄ　Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕ ｔｉｃａｌｓ　４：１０７−１１９＜１９９１）；Ｄｉ　Ｉ　Ｉｍａｎ　ｅｔ　 ａｌ、、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　４８：６０９７−６１０１（１９８ ８）；Ｈａｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　ｏｆ　１９ｔｈ　Ａ ｍｅｒｉｃａｎ　ＣｈｅｍｉｃａＩ　５ｏｃｉｅｔｙ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｍｅ ｅｔｉｎｇ。

Ｄａｌｌａｓ、Ｔｅｘａｓ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、Ａｐｒｉ＋　９１４．１９８９．Ａ ｂｓｔｒａｃｔ　Ｎｏ、７１Ａ；Ｙ。

Ｓｕｇｉｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、Ｔ Ｊ、Ｓ、Ａ、８６　：　７６７２−７６７６（１９８９））。上記物質は、該物 質の適当な誘導体と反応したときに共有結合を含むように結合される。

治療に使用するため、多数のタンパク質及び糖タンパク質毒素が抗体に結合され ている［：Ｂ１．１ｉｔｔｌｅｒ　ｅｔａｌ、、Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅ１ｌｓ　１ ：５Ｏ−５５（１９８９）＋　Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ、Ｅｄｉｔｅｄ　ｂ３ ’　Ａ、Ｅ、Ｆｒａｎｋｅｌ　Ｋｌｕｗｅｒ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓ ｈｅｒｓ、Ｂｏｓｔｏｎ（１９８９））、かかる例としては、ジフテリア毒素、 赤痢菌毒素及びシ、−トモナス外毒素といった細菌毒素、並びに、リジン、アブ リン、モデシン（ｍｏｃｌｅｃｃｉｎ）、ビスクミン（ｖｉｓｃｕｍｉｎ）、ポ ークライード抗ウィルスタンパク質、サポニン、モモルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ ）及びゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）といった植物毒素を挙げることができる。

毒素は触媒フラグメントを含むと共に、場合によっては、細胞表面構造を認識し たり細胞膜を横切っての転位を促進するフラグメントまたはドメインを含む、効 力を失うことなく特異性を向上し得る。適当に変性された毒素または毒素フラグ メント（例えば、結合された抗体によってのみ細胞表面認識が行われるよう認識 能は欠失しているが、効力を増強する膜貫通転位能は保持している変性毒素）が 使用される（Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｎｕｃｆｅａｒ　Ｍｅｄ ｉｃｉｎｅ　２６：５０３−５０９＜１９８５＞）、！ｌ素の抗体への結合は３ Ｎ−スクシンイミジル　３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ ）または２−イミノチオランといったベテロバイオ官能性（ｈｅｔｅｒｏｂｉｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）架橋リンカ−によって行われる（Ｃａｗｌｅｙ　ｅｔ　 ａｌ、、Ｃｅ１ｌユ　２２：５６３　５７０（１９８０）；Ｇｏｆｆ　ｅｔ　ａ ｌ、、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙｌ　：　３８１−３８６ （１９９０）；及びＴｈｏｒｐｅ　ｅｔａｌ、、Ｊ、Ｎａｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ　 Ｉｎ５ｔ、、７９：１０１１］、更に、抗体のｃ−ｋｉｔ結合成分に融合した毒 素は、連続遺伝子エレメントとして結合された毒素遺伝子及び抗体遺伝子からな る遺伝子工作エレメントの組換え発現によって生成される。

診断または治療に使用する前に、毒素効力、ターゲット特異性、ｉｎ　ｖｉｔｒ ｏ及びｉｎ　ｖｉｖｏ安定性、並びに他の特性を判定すべく、結合抗体を試験す る〔ＢＩＫｔｔｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅ１ｌｓ１　：　５Ｏ −５５（１９８９）及びＩｍｍｕｎｏｔｏｘｉ　ｎｓ。

Ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ａ、Ｅ、Ｆｒａｎｋｅｌ　Ｋｌｕｗｅｒ　Ａｃａｄｅｍｉ ｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｂｏｓｔｏｎ（１９８８））、毒性薬剤の毒性並び に抗体の結合親和性及び特異性は、使用した結合方法に最少銀にしか影響されな いことが望ましい０次いで、ＳＣＦレセプターに対する結合（実施例３参照）、 ＳＣＦのＳＣＦレセプターへの結合の阻ＩＦ（実施例４参照）について結合体を 試験する。赤白血病ＭＢ胞系ＯＣＩＭＩのようなターゲット細胞に対する毒性は 、処理した細胞培養液と未処理の細胞細胞液とにおいて高分子中に取り込まれた 標識化合物を・測定することにより、またより直接的には、クロノジェニックア ッセイ（Ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ　ａｓｓａｙ）及び細胞増殖戻し外挿アッセイ（ ｃｅ　Ｉ　ｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｂａｃｋ−ｅｘｔｒａｐｏｌａｔｉｏｎ　ａｓｓ ａｙ）において、処理した培養液中と未処理の培養液中の増殖し得る細胞の数を 測定することにより試験される。ｉｎ　ｖｉｖｏ安定性、クリアランス及び比毒 性（ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｔｏｘｉｃｉｔｙ）は、結合体を適当な被検動物に投与 することにより判定される。かかる被検動物としては、正常マウス、並びに、ヌ ードマウスまたは５ＣｒＤマウスといった免疫不全種マウスに導入されたヒト腫 瘍細胞を含むｉｎ　ｖｉｖｏ腫瘍及び白血病異種移植モデルを挙げることができ る６８：モノクローナル　５Ｒ−１を　む　・Δ凰１ 本発明の医薬組成物は、有効量の有効成分５Ｒ−１を、単独でまたは適当な緩衝 剤、希釈剤及び／もしくは添加剤と組み合わせて含む、ががる組成物は、無菌水 溶液とじてまたは凍結乾燥もしくは他の方法で乾燥した製剤として提供される。

典型的には、抗体はかかるビヒクル中に約１ｍｇ　／　ｍ　１〜１０ｍｇ／ｍｌ の濃度で配合される。

注射に適した医薬組成物の１つの実施Ｒ様は、無菌水中に一塩基リン酸ナトリウ ム（０，４５ｍｇ／ｍ＋）及びＴｗｅｅｎ　８０（０，２ｍｇ／ｍｌ＞を含むＭ ｌｌ液（ｐ　Ｈ７，０±０．５）中にモノクローナル抗体ＳＲ−１（１ｍｇ／ｍ ｌ）を含む。

９　：　ＳＣＦレセプ　−　の ａ、５Ｒ−１いｆ−＝　に　ＳＣＦレセプターの ＳＣＦレセアターを発現する細胞を直接免疫付着によって選択し、かかるｍ胞の 増殖可能性をコロニーアッセイにおいて判定した。単球欠失正常ヒト骨髄単核細 胞を５Ｒ−１を用いた直接免疫付着によって単離し、半固形培地においてエリト ロポエチン及びＩＬ−３中で１４日間培養した。

データは、３回の実験のうちの１回の二重反復試験プレートの平均をとったもの である。

結果（表４）から、５Ｒ−１付着細胞集団においてはＢＦＵ−Ｅが５０倍高いこ とが判る。ＢＦＵ−Ｅのフラクションは４〜７％に広がり、５Ｒ−１付着細胞集 団のＢＦＵ−Ｅの全回収率は７０％であった。これらの結果は、５Ｒ−１を使用 して、直接免疫付着によって前駆ｍ胞集団を精製し得ることを示している。

表４ ＳＲ−１を用いた前駆細胞の単離 コロニー／１０５細胞 １ＢＦＵ−Ｅ　ＣＦＵ−ＧＭ 骨髄単核細胞　１１７　１５１ ＳＲ−１付着細胞　５０４０　８４０ ＳＲ−１非付着細胞　６２４ ＳＲ−１付着細胞集団中により原始的な造血細胞が認められるか判定するため、 細胞を１２日間浮遊培養した。３日おきに細胞アリコートを取り出し、メチルセ ルロースコロニーアッセイにおいて再度平板培養して前駆細胞を定量化した。結 果は、５Ｒ−１付着細胞が１２日間の浮遊培養中に大量のく初期値より３倍高い ）ＢＦｔＪ−Ｅ及びＣＦＵ−ＧＭを生成したことを示している。５Ｒ−１弁材着 細胞集団中のＢＦＵ−Ｅ及びＣ−Ｆ　Ｕ　−Ｇ　Ｍの数は初期値を上回ることな く、継続的に減少した。このことは、５Ｒ−１付着細胞集団が、前記細胞を生成 し得るより原始的な造血ｍ胞を含んでいることを示唆している。

ｂ、５Ｒ−１いｔパゝ　に　るＳＣＦレセプ　−　のｉＥ 正常なヒト骨髄単核細胞を抗ＣＤ３４（モノクローナル抗体１２．８ＣＡｎｄｒ ｅｗｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｅｘｐ、ｍｅｄ、１７２−３５５（１９９０））） 及び５Ｒ−１で同時に標識し、実施例１０に記載のごと（ＦＡＣＳ上で分離した 。メチルセルロース中のコロニーアッセイによって前駆細胞フラクションを測定 した。結果から、ＣＤ３４陽性５Ｒ−１陽性細胞集団は８０％のＢＦＵ−Ｅ及び ９６％のＣＦＵ−ＧＭを含んでいたことが判った。ＣＤ３４陽性５Ｒ−１陰性＃ １１胞集団は２０％のＢＦＩＪ−Ｅ及び４％のＣＦＵ−ＧＭを含んでいた。この ことは、ＳＲ−１が、大半の骨髄前駆細胞及び赤芽球前駆細胞を含むＣＤ３４陽 性細胞のサブセットを同定することを示している。更に上記前駆細胞は、５Ｒ− １を用いた細胞選別によって明確に選択することができる。

実施例１０：ＳＣＦレセプターを発　する細胞の蛍光活性制緻凰１圀 蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣ５）において、ＳＣＦレセプターを発現する細胞を モノクローナル抗体５Ｒ−１と混合した。５Ｒ−１モノクローナル抗体は、（１ ）蛍光ラベルＦＩＴＣまたはＰＥに結合する、（２）ビオチンに結合し、ＦＩＴ ＣもしくはＰＥに結合したアビジンまたはストレプトアビジンと混合する、また は（３）抗マウスＦＩＴＣもしくはヒツジ抗マウスＦＩＴＣと更に混合する、の いずれかとした。

上記直接標識または閉接標識したＳＣＦレセプター含有細胞を、標準ＦＡＣ３法 を使用し、蛍光レベルに基づいて単離した。

ヒト胎児肝細胞のＳＣＦレセプター ＦＩＧ、　１ ＡＭＬのコロニー増殖へのｒＨｕＳＣＦの作用■ｏ　へ＝ｇコＩＬ−３口＝＝コ ＳＣＦ　匡ＩＬ−３＋　５ＣＦＡＮＬＬ芽細胞のＳＣＦレセプター 小細胞肺癌細胞のＳＣＦレセプター ＦＩＧ、４ ＯＣＩＭＩのＳＣＦレセプター ＦＩＧ、　５ ＦＩＧ、６Ａ 抗Ｔｈｙ１．１ ＳＲ−１はＣ−ＫＩＴを認識する Ｆ！Ｇ、７ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５１０６ ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｙ　８３１０−２Ｊ３３１５６９　Ｈ９０１５−２Ｊ ３３１５７７　Ｂ　９０１５−２Ｊ ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０８ ＣＩ２Ｒ１：９１） ９０５０−４Ｂ Ｉ Ｃｌ２Ｎ　１５１００　Ａ

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．ＳＣＦレセプターに結合する能力を有するモノクローナル抗体を含むモノク ローナル抗体。
2. ２．前記ＳＣＦレセプターがヒトＳＣＦレセプターであることを特徴とする請求 項１に記載のモノクローナル抗体。
3. ３．前記モノクローナル抗体がＳＲ−１であることを特徴とする請求項２に記載 のモノクローナル抗体。
4. ４．ＳＣＦレセプターにＳＣＦ分子が結合するのを抑制する能力も有することを 特徴とする請求項１に記載のモノクローナル抗体。
5. ５．前記ＳＣＦ分子がヒトＳＣＦ分子であることを特徴とする請求項４に記載の モノクローナル抗体。
6. ６．前記ＳＣＦレセプターがヒトＳＣＦレセプターであることを特徴とする請求 項５に記載のモノクローナル抗体。
7. ７．造血細胞を精製する方法であって、（ａ）細胞混合物を請求項１に記載のモ ノクローナル抗体に暴露するステップと、 （ｂ）前記モノクローナル抗体と結合した細胞を前記モノクローナル抗体と結合 しない細胞から分離するステップとを含む方法。
8. ８．前記分離がカラムクロマトグラフィーによることを特徴とする請求項７に記 載の方法。
9. ９．前記分離が蛍光活性化細胞選別によることを特徴とする請求項７に記載の方 法。
10. １０．前記分離が直接免疫付着によることを特徴とする請求項７に記載の方法。
11. １１．請求項７に記載の方法で精製した造血細胞での骨髓移植を含む造血細胞再 構成方法。
12. １２．請求項７に記載の方法で精製した細胞へのレトロイウルス媒介遺伝子移入 を含む遺伝子療法。
13. １３．正常細胞を腫瘍性白血病細胞から分離する方法であって、 （ａ）正常細胞及び腫瘍性白血病細胞を含む細胞混合物を請求項１に記載のモノ クローナル抗体に暴露するステップと、（ｂ）正常細胞及び腫瘍性白血病細胞の ＳＣＦレセプター数の差に基づいて正常細胞を腫瘍性白血病細胞から分離するス テップと を含む方法。
14. １４．白血病細胞を治療する方法であって、請求項１に記載のモノクローナル抗 体と結合させた白血病治療薬を治療有効量で投与することを含む方法。
15. １５．白血病細胞を治療する方法であって、請求項１に記載のモノクローナル抗 体の結合フラグメントと結合させた白血病治療薬を治療有効量で投与することを 含む方法。
16. １６．固型腫瘍を治療する方法であって、請求項１に記載のモノクローナル抗体 と結合させた固型腫瘍治療薬を治療有効量で投与することを含む方法。
17. １７．固型腫瘍を治療する方法であって、請求項１に記載のモノクローナル抗体 の結合フラグメントと結合させた固型腫瘍治療薬を治療有効量で投与することを 含む方法。
18. １８．細胞試料においてＳＣＦレセプターの存在を決定する方法であって、 （ａ）細胞試料を請求項１に記載のモノクローナル抗体に暴露するステップと、 （ｂ）前記モノクローナル抗体のＳＣＦレセプターへの結合を検出するステップ と を含む方法。
19. １９．前記検出を標識したモノクローナル抗体の使用によって行なうことを特徴 とする請求項１８に記載の方法。
20. ２０．細胞試料を正常細胞、白血病細胞及び固型腫瘍細胞の中から選択すること を特徴とする請求項１８に記載の方法。
21. ２１．細胞周期特異的な化学療法剤に対する感受性を改変する方法であって、請 求項１に記載のモノクローナル抗体をＳＣＦ阻害量で投与することを含む方法。
22. ２２．前記モノクローナル抗体がマウスーヒトハイブリッド抗体であることを特 徴とする請求項１に記載のモノクローナル抗体。
23. ２３．前記抗体がＩｇＣ２ａイソタイプの抗体であることを特徴とする請求項１ に記載のモノクローナル抗体。
24. ２４．請求項１に記載のモノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマ。
25. ２５．モノクローナル抗体ＳＲ−１を産生し得ることを特徴とする請求項２４に 記載のハイブリドーマ。