JPH06506928A - 抗毒免疫血清 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗毒免疫血清 本発明は、抗毒抗体およびその製造方法に関する。より具体的には、本発明は抗 蛇毒抗体およびその製造方法に関する。

蛇、アメリカドクトカゲ、クモおよびミツバチを含む多くの動物が、ヒトにとっ て危険な毒液を産生ずる。例えば、全世界で毎年およそ１００万人が毒蛇に咬ま れている。概算では、このうちの数十万人が死亡し、他の３０万人は何らかの形 の障害を死ぬまで負うことになる。これは、世界のある地域の詳細な記録がない ので、おそらく少なく見積もられた総数であろう。

本来は獲物の捕獲または防御的役割のために産生される蛇毒は、５０成分以上の 複雑な生物学的混合物である。蛇の咬み傷によって獲物が死ぬのは、種々の神経 毒、心臓前（細胞毒とも呼ばれる）、凝固因子、および単独または相乗的に作用 するその他の物質によってもたらされる呼吸不全または循環不全による。蛇毒は また多くの酵素を含み、これらは、獲物に注入されると組織の消化を開始する。

毒液は、したがって生命維持に必須の過程、例えば神経および筋機能、心臓の働 き、血液循環並びに膜透過性に影響を与えるようになっている物質を含んでいる 。蛇毒のほとんどの構成成分は蛋白であるが、低分子量化合物１例えばペプチド 、ヌクレオチドおよび金属イオンもまた存在する（１）。

毒蛇は４つの主な科、山棟蛇科（Ｃｏｌｕｂｒｊｄａｅ）　、クサリヘノー―曙 −１トー一一一―−□□−− 綱：　爬虫綱　（爬虫類） ［１山よ− 目：　有鱗目　（ヘビおよびトカゲ類）［９以■賎Ｊ 亜目′　、藍盟品よい”１類） 下目：　アレシノフィジア　（メガネヘビ）［ムれ石ぶ回五ｄ− 上科：　山棟蛇上科　（高等ヘビ） ［いｈ防瓜侮ｍｌ ビ科（■と劇Ａ阻）、海蛇科（敗釘ヨ叫立狙）および眼鏡蛇科（■吐腫牲）に分 類される（２）。これらの蛇の分類は表１゜１および表１．２に記載する。アメ リカ大陸に固有のガラガラヘビは、マムシ亜科（Ｃｒｏｔａｌｉｎａｅ）−響尾 蛇属（Ｃｒｏｔａｌｕｓ）またはシスツルスス属（Ｓｉｓｔｒｕｓｕｓ）　（ガ ラガラヘビ）、蝮蛇属（販止顧匣）、マムシ属（ｈ斜刃Ｄ４姐）およびハブ属（ Ｔｒ、を腸ｅｒｉ　５ｕｒｕｓ　）として知られている、クサリヘビ科の亜科の 毒蛇の仲間である。これら二属のガラガラヘビは、さらに種および亜種に分類さ れる。これらの蛇は、顔面にある熱感知器官、ピットを持つために、「有ビット クサリヘビ（ｐｉｔｖｉｐｅｒｓ）　Ｊ　とも呼ばれるが、それらの最も際立っ た特色は。

攻撃時のガラガラいう音で、それによって他のすべての蛇と区別される。

それぞれの種および亜種は、北および南アメリカにおいて明瞭に異なる地理的分 布に示している。ガラガラへどのそれぞれの種の毒液は、すべてのガラガラヘビ に共通の成分、より小グループについてのみ共通の成分、または単一種もしくは 単一亜種に特異的な成分を含む（３）。

杭棒抗体は、蛇毒を投与量を増加させながら注射することによって、毒液の毒性 にたいして免疫を生じた動物の血清または血清の部分精製抗体分画である。

杭棒抗体の科学的研究は、ヘンリー・シーウェル（ＨｅｎｒｙＳｅｗｅｌＪ、） 　（５）の研究で１８８７年に始まり、今世紀まで続いている。現在、非常に多 くの、多岐にわたるモノスペシフィックおよびポリスペシフィック杭棒抗体が１ 世界中で生産されている。

本明細書で使用されているように、「モノスペシフィック杭棒抗体」という用語 は、毒を分泌する動物の単一種または単一亜種の毒液に対して産生された杭棒抗 体を指す。「ポリスペシフィック杭棒抗体」という用語は、毒を分泌する動物の 異なる種または異なる亜種の２つ以上の毒液の混合物に対して産生された杭棒抗 体を指す。

本明細書では、また別の表現として同様に使用される「−価Ｊおよび「多価」抗 血清という用語を使用することによって生じる混乱を避けるために、モノスペシ フィックおよびポリスペシフィック抗血清という用語が使用されている。この用 語を用いるのは、「価数」という用語が、抗体または抗体の分解産物が有する結 合部位数を表すために免疫学者によって使用されるからである。したがってＩｇ Ｇ分子は二価で、一方、ただ−個の結合部位をもつＦ（ａ　ｂ）断片（フラグメ ント）は−価である。抗血清を表すときに「スペシフィック」という用語を使用 すれば、混乱は一切生しない。

シーウェルの先呼的研究では、ハトにガラガラヘビの毒液を致死量未満の投与量 で接種し、続いて、もし初回に注射したならば致死となる量を越える水準まで増 加させた投与量を注射した。したがって、この鳥は毒液に対して抵抗性を獲得し たことが明らかになった。１８８９年には、カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎｎ）　 （６）が、ヨーロッパの蛇、ビペラ・ペルス（Ｖｉｐｅｒａ　ｂｅｒｕｓ）を用 いて同様な結果を得、１８９２年には、コブラ毒を用いてサイボンで研究してい たカルメット（Ｃａｓｓｅｔｔｅ）　（７）が、毒液を注射するというプロトコ ールで抵抗性を付与することができるということを報告した。しかし、免疫動物 の血液と毒液とを混合することによって別の動物に抵抗性を最初に付与したのは カンタツク（にａｎｔｈａｃｋ）（８）で、彼は蛇毒の致死量に対する抵抗性を 明らかにした。

カルメットの基本的スケジュールは、毒液（通常コブラ毒）による頻回、反復、 徐々に増量する投与量に動物を慣らすことである。彼は、１６力月以上の期間に わたって免疫したウマは、当該毒液の致死量の８０倍に耐えることを発見した。

彼は、また、これらのウマから得た血液に由来する杭棒抗体は、ウサギに適用し たとき２００００ユニツトの中和効果を有する。すなわち、その血清１ｍｌがウ サギ２００００ｇに必要な毒液の最少致死量を中和することができることを示し た。

最もよく知られた杭棒抗体は、液状または乾燥形で調製されたウマ血清グロブリ ンの精製濃縮物である。杭棒抗体は。

モノスペシフィック杭棒抗体を製造するためには単一の毒液で、ポリスペシフィ ック杭棒抗体を製造するためには多くの毒液の混合物で免疫したウマから得られ る。はとんどのタイプの蛇毒中毒の治療のための杭棒抗体が調製されている。製 造方法は、前世紀の草分は時代からほとんど変化していない。

免疫ウマ血清は、通常は硫酸アンモニウムを用いてグロブリン分画を沈殿させる 大ざっばな精製工程を経るが、ある場合には、これが最終生成物の形態である。

この形態の杭棒抗体は、重大な血清反応を起こすので、主としてそのような免疫 反応に関与する免疫グロブリンのＦｃ部分を除去するためにペプシン分解を用い ることが知られている。

特異的毒液の有害な影響および見せかけの無害な影響の両方を中和することにつ いての既知の杭棒抗体の効果は、大いに変化する可能性が有り、さらに多くの要 因によって左右される。これらの要因のうちで最も重要なものは、杭棒抗体の特 異性、産生された抗体の力価および最終生成物の濃縮度または精製度である。

一般に、杭棒抗体が特異的であればあるほど、攻撃的毒液を中和する可能性は大 きい。単一の毒液に対して産生されたモノスペシフィック杭棒抗体は、したがっ て同種の毒液に対して最も有効である。しかし、そのような杭棒抗体は、攻撃し たヘビの種または亜種が同定されたときの、ヘビの咬み傷の治療にのみ有効であ る。攻撃したヘビが同定できていないとき、通常「野外」での場合はこれである が、杭棒抗体が未同定の蛇の毒液に対しても有効である可能性を高めるためには 、一連の異なる毒液に対して産生されたポリスペシフィック杭棒抗体が好ましい 。しかし、慣用的なポリスペシフィック杭棒抗体は、モノスペシフィック杭棒抗 体の特異性を欠き、したがって、毒液の薬理活性を中和するうえで効果が少ない 。

出願人は、異なる毒液に対して別々に産生された異なる抗血清の混合物を含む杭 棒抗体（本明細書中では「混合モノスペシフィック杭棒抗体」を指す）は、一連 の毒液に対して単一抗血清を産生することによって調製された慣用のポリスペシ フィック杭棒抗体よりも毒液の薬理活性をより有効に中和するが、ポリスペシフ ィック杭棒抗体の広範な特異性は保持しているという、予期し得ない驚くべき発 見を為した。

本発明の第一の特徴によれば、異なる毒液に対して産生された少なくとも二種の 異なる抗血清の混合物を含む杭棒抗体が提供される。

異なる抗血清の混合物を含む杭棒抗体は慣用のポリスペシフィック杭棒抗体より も有効で、その理由は、前者は、毒液の低分子量成分および／または低免疫原性 成分に対する抗体をより高い割合で含んでいるからであろうと考えられている。

蛇毒は、蛋白質、ヌクレオチドおよび金属イオンの複雑な多成分混合物である。

これらの成分は、分子量、抗原性の度合いおよび毒液中の濃度において異なって いる。抗血清を産生ずるために動物に毒液を注射すると、多数の抗体集団が産生 されるであろう。産生された抗体の濃度および親和性は、さまざまな基準、例え ば成分表面の抗原決定基の数、各抗原決定基の免疫原性、各成分の濃度にしたが って変化するであろう。毒液（例えばガラガラヘビ毒を含む）の致死的神経毒成 分は、しばしば、低濃度でのみ存在する低分子量で免疫原性の低い成分を含んで いる。そのような成分はほとんど高力価の抗体を誘発しないであろう。

この問題は、低濃度、低分子量および低免疫原性成分が高免疫原性成分によって さらに希釈されている毒液の混合物を含む免疫混合物を用いてポリスペシフィッ ク杭棒抗体を製造するために、一層悪化すると考えられる。したがって、ポリス ペシフィック杭棒抗体の産生によって、いくつかの成分に対する抗体が存在しな いか、またはそれらの効果が無視される程度の低濃度である杭棒抗体しか得られ ない。

対照的に、本発明の混合モノスペシフィック杭棒抗体は、別々の群の動物で異な る毒液に対して産生された抗血清の混合物を含む。別々に抗血清を産生ずること によって、各抗血清について利用できる可能な抗体集団の数は同じであるが、免 疫原の抗原決定基の数は極めて少なくなる。したがって、そのような成分抗血清 は、低分子量、低免疫原性成分に対する防御抗体を、ポリスペシフィック杭棒抗 体より高い割合で含んでいると考えられる。混合モノスペシフィック抗血清を製 造するためにモノスペシフィック抗血清を組み合わせることによって、モノスペ シフィック血清のすへての構成集団を有し、したがってより高い防御を付与する が、杭棒抗体の交差反応性が最大となるというポリスペシフィック杭棒抗体の利 点もまた有する杭棒抗体を得ることができる。

本発明の混合モノスペシフィック杭棒抗体の各成分杭棒抗体は、それ自体モノス ペシフィック抗原抗体またはポリスペシフィック杭棒抗体でもよいということは 理解しえよう。例えば、混合モノスペシフィック杭棒抗体は、毒液Ａ　＋　Ｔ３ に対して産生されたポリスペシフィック杭棒抗体と毒液Ｃに対して産生されたモ ノスペシフィック杭棒抗体との混合物を含んでもよい。

好ましくは、各成分杭棒抗体はモノスペシフィック杭棒抗体である。例えば、混 合モノスペシフィック杭棒抗体は、毒液Ａ、ＢおよびＣに対して産生されたモノ スベシフインク杭棒抗体の混合物を含んでいてもよい。

混合モノスペシフィック杭棒抗体を含む抗血清は、いずれの適切な割合で混合し てもよい。好ましくは、混合モノスペシフィック杭棒抗体は、当該モノスペシフ ィック杭棒抗体を用いようとする地域にとって適切な割合で混合された抗血清を 含む。このような「誂え」の混合モノスペシフィック杭棒抗体を製造するときに 考慮し得る要因は、特定の地域内の特定の毒をもつ動物の個体数１分布、習性お よび毒性である。

混合モノスペシフィック杭棒抗体の組成は、毒をもつ動物の特定の種または亜種 によって、特定の地域で咬まれた人を統計的に分析することによって決定するこ とができる。好ましくは、混合モノスペシフィック杭棒抗体の各成分抗血清は、 その毒液に対して抗血清が作られた当該有毒動物の特定の種または亜種によって 、特定の地域で咬まれた人の相対頻度しこ正比例して含まれる。

例えば７ダイヤモンドガラガラヘビは、ヒガシダイヤモンドガラガラヘビ（Ｃ， ａｄａ廖ａｎｔｅｕｓ）およびニジダイヤモンドガラガラヘビ（Ｃ，ａｔｒｏｘ ）として知られる二つの地理的タイプに分類される。混合モノスペシフィック杭 棒抗体は、したが−って特定の地域のヘビに供されるように製造することができ るわしたがって、その地域に見いだされないヘビに対する抗血清を包含すること は、いずれの生成物の有効性も薄める可能性が有り、必要ではない。誂え杭棒抗 体を製造することができるために、その地方のヘビの咬み傷のタイプについて統 計的に補うことによって、攻撃したヘビについての情報をもたすに本発明の混合 モノスペシフィック杭棒抗体を、同種のモノスペシフィック杭棒抗体の有効性に 近づけ、または改良さえすることができる。

杭棒抗体を含む抗血清は、いずれの適切な動物、例えばマウス、ラット、ヒツジ 、ヤギ、ロバまたはウマによっても作ることができる。好ましくは、抗血清はヒ ツジで作られる。

ヒツジでの抗血清の産生は、ウマで抗血清を産生ずる従来の方法より特に利点が ある。その理由は、ヒツジで作製した抗血清は、杭棒抗体を投与されるヒトまた は動物に望ましくない免疫血清反応を引き起こす、特に免疫原性のあるウマ抗血 清のＩｇＧおよびＩｇＧ（Ｔ）成分のいずれも含まないからである。

杭棒抗体を含む抗血清は完全な抗血清でもよい、好ましくは、抗血清は、部分的 に分解してＦ（ａｂ’）ｘまたはＦ（ａｂ）フラグメントとされたものでもよい 、Ｆｃフラグメントの除去は、杭棒抗体に対する患者の免疫反応を減少させるう えで利点がある。抗体フラグメントの調製は、慣用的な技術１例えばペプシンま たはパパイン分解（１５）によって実施してもよい。

杭棒抗体を含む抗血清は、ヘビ、アメリカドクトカゲ、クモおよびミツバチを含 むいずれの毒をもつ動物の毒液に対しても産生できる。杭棒抗体は１タイプの動 物の毒液に対して得られた抗血清１例えば異なる種または亜種のヘビの毒液に対 して得られた抗血清を含んでいてもよい。また、杭棒抗体は動物のタイプを越え て毒液に対して得られた抗血清を含んでもよい、好ましくは、毒液はヘビ毒であ る。より好ましくは、毒液はガラガラへどの毒液である。

各抗血清を作製する毒液は、完全な毒液、部分精製毒液または毒液の一つもしく は二つ以上の選択成分を含む、好ましくは、毒液は完全な毒液を含んでもよい。

本発明の第二の特徴に従えば、本発明の第一の特徴に従った杭棒抗体の調製方法 が提供される。当該方法は、少なくとも二つの異なる抗血清を混合することを含 む。

本発明の第三の特徴に従えば、本発明の第一の特徴に従った杭棒抗体の有効量を 、医薬的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物 が提供される。

好ましくは、医薬組成物は、患者に非経口投与するためのものが適切である。よ り好ましくは、医薬組成物は、静脈注射用が適切である。

本発明の第四の特徴に従えば、毒液を中和する方法が提供される。当該方法は、 毒液の影響を受けている患者に、本発明の第一の特徴に従った杭棒抗体の有効量 を投与することを含む。

本発明の第五の特徴に従えば、 （ａ）本発明の第一の特徴に従った杭棒抗体と。

（ｂ）体内に杭棒抗体を注射するための手段とを含むヒトまたは動物体に杭棒抗 体を投与するためのキットが提供される。

本発明は、以下の通りの図面を参照して実施例によって以下に詳述される。

図１は、四種のマムシ毒の１μｇのホスフェートＡ２活性を示す。

図２は、１μｇのマムシ毒のホスホリパーゼＡ２活性の５０％を中和するために 必要な杭棒抗体の量を示す。

本発明は単なる例示のために実施例を用いて詳述しており、本発明の範囲内で細 部の改変が可能であることは理解されるところであろう。

裏腹 １、杭棒抗体の調製 杭棒抗体は、シトウキ（Ｓｉｄｋｉ）ら（１１）の慣用的な免疫スケジュールに 従い、十匹のウェルシュ系雑種の畦草の一部を毒液で免疫することによって製造 された。免疫用毒液は、アリシナ大学のラッセル教授（Ｐｒｏｆ、　Ｆ、　Ｒｕ ５ｓｅｌｌ）によって提供された。毒液は、同一種の多数のヘビから集めた。年 齢および地理的分布の異なる個体が含まれ、１年間に渡って毒液が集められた。

これらの要因は毒液の組成に影響することが知られており、したがって、杭棒抗 体の効果的な産生に重要である。当該群から血液（〜３００ｍ１）を月単位で集 め、ためておく。１８時間４℃で血餅を生成させた後、血清を吸週　免疫日　免 疫原（■ｇ／羊）　サンプリング日〇　−次免疫　０．５ ４　再免疫１　１．０ ６　サンプル２ ８　再免疫２　２゜０ １０　採血１ １２　再免疫３　４．０ １４　採血２ １６　再免疫４　４．０ １８　採血３ ２０　再免疫５　４．０ ＩｇＧ濃縮物は、硫酸ナトリウム沈殿によって抗血清プールから生成する。続い て抗血清プールの硫酸ナトリウム沈殿によって免疫グロブリン分画を部分精製す る。抗血清と等しい容積の３６％硫酸ナトリウムとを混合し、生じた混合物を室 温で１．５時間撹拌し、免疫グロブリンを沈殿させる。３５００ｒｐｍで６０分 間遠心分離させた後、ペレットを１８％硫酸ナトリウムで二度洗浄し、続いて最 終ペレットをリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で最初の抗血清プールの容積と等しい容 積に再ｔｌＲＩｉ！する。その後溶液を２０容のＰＢＳに対して透析し、生成物 を必要となるまで４℃で保存する。

当該生成物は、サンプルの正確な蛋白濃度を決定するためにミクロケルプール法 （１４）による分析に付してもよい。

所望の場合には、Ｆ（ａｂ’）＊およびＦ（ａｂ）を生成するためにこのＩｇＧ の分解をそれぞれペプシンまたはパパインを用いて実施してもよい。これらの生 成物をまた。効力が維持されていることを確認するために、ＳＤＳポリアクリル アミドゲル電気泳動（１３）、ミクロケルダール、およびＥＬＩＳＡ（１２）で 分析してもよい。

２、杭棒抗体のｉｎ　ｖｉｔｒｏ比較 主工上−患に 蛇毒は、蛋白、金属イオンおよびヌクレオチドの多成分混合物である。ある特定 の毒液の厳密な性状は、いずれもその蛇の遺伝型に固有であるが、いくつかの共 通蛋白は存在する。

そのような共通蛋白の１つは、酵素ホスホリパーゼＡｍ（ＰＬＡ２）である、こ の酵素は、本来１体脂肪の分解に関与するが１例えば細胞崩壊（脂肪の加水分解 の崩壊産物を介して）および神経毒（該酵素の薬理学的活性部位によって仲介さ れる）等のその他の多くの活性を有するであろう。

マムシまたはガラガラヘビの毒液中のＰＬＡ２活性は、簡単な比色分析を用いて 評価することができる。ＰＬＡ２は脂肪を加水分解し、脂肪酸およびグリセロー ルを生じ、その分析系のｐＨの低下をもたらす。

ＰＬＡ２＋脂肪−一−−−→脂肪酸＋グリセロールｐＨのこの低下は、この系に 着色したｐＨインジケーターを取り入れることによってモニターできる。

２．２　ＰＬＡ２ 以下のアッセーは、特定の毒液のホスホリパーゼＡ２活性（ＰＬＡ２．　ＥＣ３ ，１，１，４）をモニターするために用いることができる。活性は、リン脂質基 質（ホスファチジルコリン、シグマケミカルカンパニー社製、製品番号Ｐ−９６ ７１）からの遊離脂肪酸の離脱を、ｐＨインジケーター（クレゾールレッド、シ グマケミカル社製、ｉ１品番号Ｃ−９８７７）を用いて測定することによって評 価する。

アッセー用緩衝液： １．１００ｍＭ　ＮａＣｌ ２．１００ｍＭ　ＫＣｌ ３．１０ｍＭ　ＣａＣｌ２ すべての試薬の純度は試薬級である。

日常的なアッセーについては、上記の溶液を５００ｍ１つくり、希水酸化ナトリ ウム溶液を用いてｐＨを８．６とする。

インジケーター調製： Ｌｏｎｇのクレゾールレッド（ナトリウム塩、シグマ、製品番号Ｃ−９８７７） をアッセー用緩衝液（１０ｍｌ）に溶かし、容器は錫箔で包む。

基質液調製： ホスファチジルコリン（卵黄嚢タイプＸＶ−Ｅを１．２ｇ、６０％、Ｌ−ａ形、 シグマ、　ＮＯ，Ｐ−９６７１）をメタノール（１ｍｌ）に溶かし、この溶液を アッセー用緩衝液で１０ｍ１とする（最終濃度１２０ｍｇ／ｍｌ）、この溶液は 、各実験セット毎に新しく調製する。

方法： 凍結乾燥させた一価の粗毒液を、最終濃度１０μｇ　／　ｍ　１となるように蒸 留水に溶かす１日常的には１０ｍ１の毒液溶液を各実験セット毎に調製する。続 いて基質溶液を以下の方法で作製する： １ｍｌの新しく調製した脂質懸濁液に２５ｍ１のアッセー用緩衝液を、続いて０ ．３ｍｌのトリトンＸ　−１００（ＢＤ）Ｉ。

Ｎｏ、３０６３２）を加える。透明になるまで十分に溶液を撹拌する。

希水酸化ナトリウムを用いてｐＨ８，６に調整する。調製したインジケーター溶 液１ｍｌを加え、アッセー用緩衝液で、この基質溶液の最終容積を３０ｍ１とす る。（基質溶液の色は赤くなるはずであるが、そうでない場合はアツセー用緩衝 液のｐＨを調べる必要がある）。この溶液もまた銀箔で覆わなければならない。

プラスチック製の３ｍｌキュベツトに入れた基質溶液２゜８ｍｌに１００μｍの アッセー用緩衝液を加え、　０Ｄｓ７３ｎ園を測定する。１００μｍの毒液溶液 を加え、ストップウォッチをスタートさせる。−切のバックグラウンドｐＨ低下 をモニターするために、２．８ｍｌの基質溶液および１００μｌのアッセー用緩 衝液の入った第二のキュベツトに、さらに１００μｍのアッセー用緩衝液を加え る。これは、アツセー用キュベツトと同時に進行させる。３０分の間１分毎に読 み取りを行う。その後、コントロールサンプルのバックグラウンドｐＨ低下を考 慮し、この値を毒液の添加によって生じた値から差し引き１時間に対するｏＤの グラフを作製する。続いて標準化したコントロールの読みのパーセントとして、 これらの読みを表す。

２．３−東框抜腹 中和実験は、関連抗血清のＩｇＧカットを用いて実施する。

これらの調製物は完全抗血清の塩性＃（１８％硫酸ナトリウム、２５℃、１．５ 時間）によって得られる。

これらの実験に用いるアッセー用および基質用緩衝液は。

上記の実験のものと同じである。

アッセー用緩衝液中の杭棒抗体の１０倍希釈（ストック溶液）を続いて２倍希釈 でさらに希釈し、１００μｍ容量を１００μｍの特異的毒液溶液（１０μｓ／ｍ ｌ）に加える。さらにサンプルを２セツト用意し、バックグラウンドｐＨ低下（ ２００μＩアツセー用緩衝液）、および全加水分解（１００μｍのアッセー用緩 衝液および１００μｍの毒液溶液）をモニターする。サンプルを続いて室温で３ ０分間インキュベートする。この間に、基質溶液を作製し、そのｐＨ１ｉ−調べ る。

その後、基質溶液の２．８ｍｌ容量のＯ時間ＯＤを測定する。これは、２００μ ｌの毒液／抗血清溶液を添加する直前（３０分間のインキュベーション期間後） に実施する。さらに室温で１５分インキュベートし、続いてｏＤを読む、上記に 記載したように、その後結果を処理し、毒液誘発加水分解の中和％として表す。

藍果 上記のアッセーは四種のガラガラへどの毒液を用いて実施した。これらは、マム シ属のビシボロウス（＾、　ｐｉｓｃｉｖｏｒｏｕｓ）−並びに響尾蛇属のアダ マンテラス（Ｃ，ａｄａｍａｎｔｅｕｓ）　、アトロックス（Ｃ，ａｔｒｏｘ） およびスクツラツス（Ｃ，５ｃｕｔｕｌａｔｕｓ）である。

図１は、各毒液は有効なＰＬＡ２＃素を含み、活性の順は。

ビシボロウス（ム且呈力空匪旺）〉アダマンテラス（Ｃ，ａｄａｍ−ａｎｔｅｕ ｓ）　＝　スクツラツス（Ｃ，５ｃｕｔｕｌａｔｕｓ）　＞　アトロックス（Ｃ ，ａ、、ｔｒｏｘ）である、ことを示している。上記の杭棒抗体のＩ）　Ｔ−。

Ａ２中和能が続いて確認された。

中和実験は混合モノスペシフィック杭棒抗体を用いて実施した。この杭棒抗体は 、ビシボロウス（Ａ、　１ｓｃｉｖｏｒｏｕ（転）、アダマンテラス（Ｃ，ａｄ ａ＋ａａｎｔｅｕ旦）、アトロツクス（Ｃ，ａｔｒｏｘ−）およびスクツラツス （Ｃ，５ｃｕｔｕ旦胆望）の毒液に対して四群の４羊を免疫して得られたモノス ペシフィックＩｇＧの等濃度溶液を等容量混合して作製した。濃度は窒素分析の ケルゾール法で決定し、適量のＰＢＳを添加して等しくした。

コントロール中和実験は、各毒液に対して産生されたモノスペシフィック杭棒抗 体および１：１：１：１で混合した毒液に対して産生されたポリスペシフィック 杭棒抗体を用いて実施した。コントロール実験では、毒液源、免疫法、精製およ び試験手順も合わ廿て、混合モノスペシフィック杭棒抗体実験と全く同一のプロ トコールを用いた。

結果は図２に示すが、これは、毒液のＰＬＡ２活性の中和については、混合モノ スペシフィック杭棒抗体は対応するポリスペシフィック抗血清より強いか、また は同等の効能を有することを示している。実際、調べた４種の毒液のうち３種に ついては、極めて少ない杭棒抗体が５０％中和を達成するために必要であった。

さらに、混合モノスペシフィック杭棒抗体はまた、同種のモノスペシフィック杭 棒抗体と同しか、または強い効能を有し１、これは、混合モノスペシフィック杭 棒抗体は高度の交差反応性をもつことを示している。

これらの結果によって、Ｐ　Ｌ　Ａ、　２中和の場合には、混合モノスペシフィ ック抗血清は、そのポリスペシフィック対応物よりも有効であるという驚くべき 結論に達した。

参考文献 ５ｐｒｉｎｔｅｒ−νｅｒｌａｇ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ＋Ｅｄｉｔｉｏｎ、　Ｇ ｒｅａｔ　Ｎｅｃｋ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

時間（分） 毒液の型 国際調査報告 国際調査報告 フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、Ａ、Ｔ、　ＡＵ、ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、Ｌ、Ｕ、ＭＧ、ＭＮ 、ＭＷ、ＮＬ、ＮＯ，ＰＬ、ＲＯ、ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ、ＵＳ

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．異なる毒液に対して産生された少なくとも二種の抗血清の混合物を含む抗毒 抗体。
2. ２．各成分抗血清がモノスペシフィック抗毒抗体である、請求の範囲第１項に記 載の抗毒抗体。
3. ３．各抗血清が、完全血清のＩｇＧの部分分解によって得られたＦ（ａｂ′）２ またはＦ（ａｂ）フラグメントを含む、請求の範囲第１項または第２項に記載の 抗毒抗体。
4. ４．各抗血清がヒツジの抗血清である、先行する請求の範囲のいずれかの項に記 載の抗毒抗体。
5. ５．各抗血清が、その毒液に対して各抗血清が作製される当該特定の毒をもつ動 物によって咬まれた人の特定地域における頻度およびその毒性に相関した割合で 含まれる、先行する請求の範囲のいずれかの項に記載の抗毒抗体。
6. ６．各成分抗血清が、その毒液に対して各抗血清が作製される毒をもつ動物の特 定の種または亜種によって咬まれた人の特定地域における相対頻度に正比例して 含まれる、請求の範囲第５項に記載の抗毒抗体。
7. ７．各抗血清が蛇毒に対して作製される、先行する請求の範囲のいずれかの項に 記載の抗毒抗体。
8. ８．各抗血清がガラガラヘビの毒液に対して産生される、請求の範囲第７項に記 載の抗毒抗体。
9. ９．少なくとも二種の異なる抗血清を混合することを含む、請求の範囲第１項か ら第８項のいずれかの項に記載の抗毒抗体の調製方法。
10. １０．請求の範囲第１項から第８項のいずれかの項に記載の抗毒抗体の有効量を 、医薬的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物 。
11. １１．毒液の影響を受けている患者に、請求の範囲第１項から第８項のいずれか の項に記載の抗毒抗体を有効量で投与することを含む、毒液を中和する方法。
12. １２．（ａ）請求の範囲第１項から第８項のいずれかの項に記載の抗毒抗体と、 （ｂ）当該抗毒抗体を体内に注射するための手段とを含む、ヒトまたは動物体に 抗毒抗体を投与するためのキット。