JPH06506973A - 平滑筋細胞増殖のインヒビターとしての硫酸化多糖類 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 平滑筋細胞増殖インヒビターとしての硫酸化多糖類技術分野 本発明は、治療および診断組成物としての炭水化物調製物の使用に関する。特に 、本発明は、６個以上の糖単位を有する多糖類、そして過度の平滑筋細胞増殖を 特徴とする疾患および状態を治療するのに有用であるそのような多糖類を含有す る組成物に関する。

略語 合成的に生成されたオリゴマーおよびヘパリンから誘導されたオリゴマーの表記 において、次の略語が使用される＝　Ｄ−グルクロン酸＝ＧｌｃＡ；Ｌ−イズロ ン酸＝ＩｄｏＡ；Ｄ−グルコサミン＝Ｇ１ｃＮＨ２；　Ｎ−アセチル−Ｄ−グル コサミン＝Ｇ１ｃＮＡｃ；　Ｄ−グルコサミンＮ−硫酸＝　Ｇ］ｃＮＳ　；　２ ．５−アンヒドロマンノース＝Ｍａｎ（２，５）；２，５−アンヒドロマンニト ール＝　ＭａｎＨ（２，５）　；　Ｄ−キシロース＝ＸＹＩ　；グリコサミノグ リカン＝ＧＡＧ０〇一連結された硫酸残基の位置は、「Ｓ」および硫酸残基が糖 残基上の酸素に連結される硫酸化の位置の番号によって示される。これらの命名 においてはまた、αおよびβのアノマ一連結は、ヘパリンに通常見い出される連 結であり、表示されたＤまたはＬの配置が通常見られ関係する。硫酸基の位置は 、略語が適用される糖の略語の下に示され、それゆえ、例えば、 は、糖残基の２位および６位でそれぞれ結合した硫酸基を有するＬ−イズロン酸 およびＤ−グルコサミンＮ−硫酸を示す。

背景技術 血管壁における平滑筋細胞増殖は、血管の損傷に応答して起こり、そして特定の 病気状態に関連して起こる（Ａｕｓｔｉｎ、Ｇ。

Ｅ、ら、Ｊ　Ａｍ　Ｃｏ１１　Ｃａｒｄｉｏ！　（１９８５）旦：３６９−３７ ５）ｏ　これらの細胞増殖は、過剰なタンパク質または他のマトリックス分子の 生成による負の効果を有し得る。その過剰なタンパク質または他のマトリックス 分子は、それら細胞自身と共にあり、例えば、アテローム性硬化症、腎性高血圧 症、肺高血圧症、脈管炎、および術後血管性網膜症のような病変を形成する。こ れらの結果は、血液凝固を特徴とする外傷に対する急性の応答と区別される。

グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）は、ヘキソサミン残基とアルドウロン酸残基が 交互に並ぶコポリマーであり、それらは硫酸化された形態で見い出され、プロテ オグリカンとして合成される。それらは、総称してムコ多糖と呼ばれ、ヘパリン 中のムコ多糖は、さらに正確には、グリコサミノグリカンナンと呼ばれる。

下記で議論される組成物を説明するために、ヘパリンおよびヘパラン硫酸が、ヘ キソサミン／アルドウロン酸の繰り返し単位の性質によって分類されるＧＡＧフ ァミリーのメンバーであることが注目され得る。例えば、コンドロイチン硫酸に おいて、アルドウロン酸は主としてＤ−グルクロン酸であり、そしてへ牛ソサミ ンは、より一般的にはＮ−アセチルガラクトサミンとして知られＧａ１ＮＡｃと 略称されるＮ−アセチル化２−７ミノー２−デオキシ−Ｄ−ガラクトースである 。

デルマタン硫酸（コンドロイチン硫酸Ｂ）において、アルドウロン酸は、大抵は Ｌ−イズロン酸であり、ヘキソサミンはＧａ１ＮＡｃである。ケラタン硫酸にお いて、アルドウロン酸はＤ−ガラクトースで置き換えられ、そしてヘキソサミン は、大抵は、より一般的にはＮ〜ルアセチルグルコサミンして知られＧｌｃＮＡ ｃと略称されるＮ−アセチル化２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコースであ る。

本明細書中で関係ある組成物、ヘパラン硫酸およびヘノくリンにおいて、ヘキソ サミンは、大抵はＮ−アセチル化またはＮ−硫酸化グルコサミン（ＧｌｃＮ）で あり、そしてアルドウロン酸は、ヘパリンでは大抵Ｌ−イズロン酸であり、ヘノ くラン硫酸では大抵Ｄ−グルクロン酸である。ヘパラン硫酸は、一般に、へ７＜ リンより高い比率でグルクロン酸を含有すると考えられてｔ）る。

組織から単離されたヘパラン硫酸またはへｌくリンの調製物における不均質性の 問題は、明確な区別を困難にする。その理由は、これらのオリゴ糖が下記に説明 するように生合成経路が関連しているからである。通常のヘパリン（抗凝固剤と して使用される）は、５−２５　ｋＤａの分子量を宵し、通常の手法によって種 々の鎖の長さの混合物として抽出される。これらの手法は、自己融解、およびウ シ、またはブタの肺、膓または肝臓のような適切な組織の抽ａ、ならびに他のＧ ＡＧおよび非多糖類成分の除去を包含する。

抽出物中の鎖の分子量は、組織で合成されるヘパリンプロテオグリカンの多糖鎖 中にあることが知られている６Ｏ−１００ｋｄの鎖よりかなり低い。ＧＡＧ部分 は、配列Ｄ−Ｇ１ｃＡ−Ｄ−Ｇａｌ−Ｄ−Ｇａｌ−Ｄ−Ｘｒｌ−タンパク質の四 糖類連結領域を介して、セリン残基でペプチドマトリックスに結合して合成され 、そしてその四糖類連結領域は、次いで、ＧｌｃＮＡｃおよびＧｌｃＡを交互に 付加してＤ−Ｇ１ｃＡ残基で延長される。

多糖類の側鎖は一連の酵素群で修飾され、それらの酵素は、連続的に、ドアセチ ルグルコサミンを脱アセチル化し、アセチル基を硫酸基で置き換え、Ｄ−グルク ロン酸残基の０５位でヒドロキシル基をエピマー化しくＬ−イズロン酸に変換す る）、その結果生じたし一イズロン酸の０−２位およびグルコサミン残基のＯ− ６位を硫酸化する。鎖のいくつかは、ヘパランまたはヘパリンの位置のいずれか において、グルコサミン残基の０−３位でさらに硫酸化される。この後者の硫酸 化は、抗トロンビンＩＩ［結合およびそれによる抗凝固活性に必要な活性配列を 生じる。他の化学的に可能な硫酸化部位は、Ｄ−グルクロン酸のＯ−２位にある 。

それらの明らかな化学的類似性により、単離された「ヘパリン」は、別に、ヘパ ラン硫酸として分類され得る相当量を含有し得る。

ヘパリン／ヘパラン硫酸鎖の脱ポリマー化およびサイズによる生成物の分離に関 する広範な技術群がある。Ｇｕｏ、　Ｙ、ら。

Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｓ　（１９８８）　１６８：５４−６２ノ報告が特ニ関 係Ｌｒおり、還元末端部の２，５−アンヒドロマンノースが還元されて対応スる ２、５−アンヒドロマンニトールになった後の構造決定の結果を開示している。

ヘパリンまたはヘパラン硫酸またはその分解生成物が平滑筋の増殖に関係するこ とが、ある期間認められる。ヘパリンおよびヘパラン硫酸は、本明細書中の上記 の損傷に関連した血管性平滑筋細胞増殖を遅くし得るが、または阻止し得る（Ｃ １ｏｖｅｓ、　ＡＪ、ら、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９７７）　２６曙６２５−６２ ６）。平滑筋細胞増殖に対するヘパラン硫酸およびヘパリンの効果はまた、紅己 ｏ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｏ　１　ｃａｎ、　Ａｃａｄｅｍｆｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１ ９ｇ？）　ｐｐ、　３０１−３４３中にＭａｒｃｕｍ、　Ｊ、Ａ、らによって記 載されている。ヘパリンによる血管性平滑筋細胞の成長阻害は、さらにＣａ５ｔ ｅｌｌｏｔ、　Ｊ、Ｊ、。

Ｊｒ、ら、　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｌｌ（１９８２）　２５７：１１２５６−１ １２６０に記載され、そして胎児組織の血管性平滑筋細胞の成長に対するヘパリ ンの効果は、Ｂｅｎ１ｔｚ、　Ｗ、Ｅ、ら、Ｌ工旦し一ヱｂ」上ｏ１　（１９８ ６）　１２ユニ１−７に記載されている。血管周囲細胞および平滑筋細胞増殖の 両方のインヒビターとしてのヘパリンの効果は、Ｏｒｌｉｄｇｅ、　Ａ、ら２Ｌ 二ｏｖａｓｃ旺肛」！１旺肋（１９８６）　３１：４１−５３に示され、そして これらの著者はさらに、コンドロイチン硫酸およびデルマタン硫酸がこの効果を 有しないことを示した。平滑筋細胞増殖に対するヘパリンおよびヘパラン硫酸の 効果に関する総説は、Ｂｅｎ１ｔｚ、　Ｗ、Ｅ、による、「肺循環：正常と異常 Ｊ　Ｆｉｓｈｍａｎ、　Ａ、Ｐ、編、ペンシルバニア大学プレス（１９８４＞中 にある。

どんなメカニズムでこれらのグリコサミノグリカンが作用するのか、またはどの 程度それらが上皮細胞成長因子および線維芽細胞成長因子のような他の成長因子 と相互作用するのか明らかではない。少なくとも５個の糖のオリゴ糠中のグルコ サミン上の３−０位の硫酸基が、このプロセスで重要であること、そして〇−硫 酸化およびＮ−硫酸化の両方が重要であるということが提案されている（Ｃａｓ ｔｅｌｌｏｔ、　Ｊ、Ｊ、ら、　Ｊ　Ｃｅ１ｌ　Ｐ■ム虹（１９ｇ４）　１２０ ：３１５−３２０：　Ｃａ５ｔｅｌｌｏｔ、Ｊ、Ｊ、ら、　Ｊ　Ｃｅ上ＬＬｏ１ 　（１９８６）工：１９７９−１９８４）。ヘパリンの部分的亜硝酸消化から得 られた大端類−十糖類は、酸性線維芽細胞成長因子に結合し、線維芽細胞中でそ のマイトジェン活性を促進するが、いくつかの条件下では上皮細胞の増殖を阻害 する（Ｂａｒｚｕ、　Ｔ、ら、　Ｊ　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈ　５ｉｏｌ　（１９８９） 　１４０：５３Ｂ−５４８）。有効な大端類が陳述され、下記の構造： 工ｄｏＡ−ＧｌｃＮＳ−工ｄｏＡ−ＧｌｃＮＳ−工ｄｏＡ−Ｍａｎ（２，５）２ Ｓ　６Ｓ　２Ｓ　６５　２Ｓ　Ｌ５Ｓを有した。

２−０−硫酸化グルクロン酸の存在が抗増殖活性には必要ではないことを示した 報告がある（ｆｒｉｇｈｔ、　Ｊｒ、、　Ｔ、Ｃ，ら、　Ｊ　Ｂｉｏｌ」旦（１ ９８９）　２６４：１５３４〜１５４２）。この論文で、亜硝酸開裂およびゲル 濾過により：Ｉｌ製された、限定された長さの、サイズ分離された断片が、い（ っかのアッセイで電荷に従ってさらに分離された。サイズに従ってのみ分離され た部分消化されたヘパリンが、平滑筋細胞および上皮細胞の成長の刺激に関して 試験された。その結果は同一ではなかったが、類似の結果が両方の場合に見い出 された。試験されたタイプの四糖類は、非常に低い抗増殖活性を有することが示 された：大端類、へ糖類、および十糖類は、重量／容量の濃度基準でほぼ同じレ ベルで活性であることが示された。ヘパリンの抗トロンビンＩＩＩへの結合に必 要なヘパリンの特有配列を示す合成ペンタペプチドもまた試験された；このペン タペプチドは平滑筋に対する増殖阻害には活性であったが、上皮細胞の増殖阻害 には活性でなかった。次に、サイズ分離された断片を化学的に処理し、「〇−過 硫酸化」を行った。そしてこの処理は阻害活性を増大させた；実際、四糖類断片 調製物の過硫酸化は、増殖阻害で活性な四糖類断片を生じた。グルコサミンのア ミ７基の脱硫酸化および再アセチル化を包含する逆ブａセスは、抗増殖活性の減 少を生じる。しかし、これらの断片は、次の過硫酸化によって、より活性にされ 得た。

総員電荷を減少させるためのカルボ牛シル基の還元はまた、ヘパワン断片の活性 を減少させ得た。〇−過硫酸化は、部分的にこの活性を回復する。抗増殖活性を 欠いているＮ−脱硫酸化、Ｎ−アセチル化断片を用いたこれらの結果は、同様に 処理されたヘパリンが、細胞分裂を妨げる能力を保持しているという以前の結果 とは区別される。なぜなら、抗増殖活性のサイズ依存性−より大きい断片がより 小さい断片より一般に強力であるであるという理由からである。

サイズ分離された断片がさらに、電荷に従って分画されたとき、最も高く荷電さ れた両分が最も強い活性を示すことが見い出された。さらに、抗トロンビンＩＩ Ｉ結合部位として同定された合成五糖類は、平滑筋細胞で増殖を阻害し得るが、 このペンタペプチドに相当する配列を壊すであろう、ヘパリンの任意の処理（例 えば、過ヨウ素酸塩処理）は、抗増殖活性を壊さない、ということが示された。

オリゴ糖を合成する方法は、１９９０年７月１４Ｅｒに発行された米国特許第４ ．９４３．６３０号に開示されており、それはそのような方法を開示するために 参考のために本明細書に援用される。

本発明者らは今回、平滑筋細胞に関して増大した抗増殖活性が、高度に硫酸化さ れ、そして６または８個の糖単位を含有するヘパリンまたはヘパリン硫酸ＧＡＧ のオリゴ糖部分に関連していることを見い出し、そのオリゴ糖が平滑筋細胞に関 して増大した抗増殖活性を有する、６またはそれ以上の糖残基を含有する多糖類 を作る合成メカニズムを提供した。

ｌ豆立皿玉 本発明は、平滑筋細胞に関して優れた特異的な抗増殖活性を有する低分子量のグ リコサミノグリカン（ＧＡＧ）組成物を提供する。低分子量ＧＡＧにおけるこの 活性の存在は、合成によって、または天然の原料からの組成物の単離によって調 製され得る有効な薬学的組成物に対する機会を提供する。

従って、１つの面では、本発明は、抗増殖活性を有する硫酸化多糖類を調製する プロセスに関する。本発明の多糖類は、本明細書中に開示されるような一連の化 学反応を用いて合成的に生成され得るか、またはへノくリンを消化し、本明細書 中に開示されるようなサイズおよび電荷に基づく分離手法を行うことにより生成 し得る。

本発明の多糖類化合物を合成的に生成するために、イズロン酸シントンを合成す ることがまず必要である。次１こ、グルコサミンシントンが生成される。イズロ ン酸シントンおよびグルコサミンシントンは、五糖類シントンを生成するためζ こ反応する。五糖類単位は、４個、６個、８個またはそれらの任意の倍数の単糖 類単位を含有するオリゴ糖を形成するために反応し得、および／または任意の奇 数個の糖単位を含有するオリゴ糖を提供するためにイズロン酸またはグルコサミ ンノ反応シントンのいずれかと反応し得る。

消化によってオリゴ糖化合物を得るために、へ／（リンカダ天然原料から得られ 、そして多量の大端類およびへ糖類を含有するオリゴ糖混合物の形成を有利にす る条件下で亜硝酸による消化を受ける。消化に続いて、混合物はサイズ↓こ従っ て分離され、そして大端類およびへ糖類に対応するそれらの画分は一緒にされ、 回収される。次に、回収された部分（よ、より高度に荷電された画分を得るため に、電荷に従って分離される。これらの画分は、高度に硫酸化されているオリゴ 糖を含有し得る。ＧｌｃＮの０−３位（抗凝固活性に関連しているンで硫酸化さ れた多糖類は、本発明には包含されない。

本発明はまた、本発明のオリゴ糖単独、または賦形剤、例えば、薬効のない薬学 的に受容可能な物質との組合せ、のいずれかを包含する薬学的組成物に関する。

そのような組成物は、平滑筋細胞増殖をｍｓするために患者に投与され得る。

本発明の第一の目的は、６個以上の単糖類単位を含有する合成的に生成されたオ リゴ糖を提供することであり、そのオリゴ糖は、ＧｌｃＮのＯ−３位以外の特定 の位置で高度に硫酸化され、そして平滑筋細胞増殖に影響する。

本発明の別の重要な目的は、天然のヘパリンまたはヘパラン硫酸から大端類およ びへ糖類単位を得る方法を提供することであり、その大端類およびへ糖類単位は 平滑筋細胞増殖の調節に有効であり、そしてその方法は抗凝固活性度をあまり加 工しない。

本発明の有利点は、オリゴ糖単位が、平滑筋細胞増殖の調節を補助するために投 与され得る薬学的組成物中に製剤化され得ることである。

本発明の特徴は、オリゴ糖単位が、（０−３位以外の）特定の位置で硫酸化され る単糖類残基を含有し、その特定の位置がオリゴ糖の平滑筋細胞増殖を調節する 能力に影響することである。

本発明の、これらおよび他の目的、有利点および特徴は、下記に、より十分に記 載される構造、合成および使用法の詳細を読み、本明細書で同じ記号が、すべて 同じ分子部分を言及する、を本明細書の一部を形成する付随の図および一般構造 式を参照すれば、当業者には明らかになり得る。

区ｉ旦１皇ユ翌里 図ＩＡおよびＩＢは、亜硝酸の量を変化させることを用いて生成された反応混合 物のゲル濾過クロマトグラフィーからの溶出プロフィールを示す。

図２は、種々のサイズの画分の成長阻害活性を示す。

図３Ａおよび３Ｂはそれぞれの、ＤＥＡＥ−トヨパールクロマトグラフィーから の大端類およびへ糖類サブユニットの溶出プロフィールを示す。

図４Ａおよび４Ｂは、図３Ａおよび３Ｂの溶出プロフィールにおける、集められ た種々の画分の成長阻害活性を示す。

図５Ａは、図３Ａに示されるＳ−６画分に対する逆相イオン対ＦＩＰＬＣからの 溶出プロフィールを示す。

図５Ｂは、大端類の総画分に匹敵するプロフィールを示す。

図６Ａ１６Ｂおよび６Ｃは、本発明の５７個のへ糖類に対する可能な硫酸化位置 を示すチャートである。

ましい　の−　なｇ「 本発明のオリゴ糖、および記載されるような製造および製剤のプロセスの前に、 本発明が記載される特定のオリゴ糖、製剤またはプロセスのような化合物、組成 物および方法に限定されるものではなく、もちろん、多様であることが理解され るべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施態様のみを記載する目 的のためにあり、そして限定されていることを意図しないということもまた理解 されるべきである。

なぜなら、本発明の範囲が添付の請求の範囲によってのみ限定され得るからであ る。

本明細書および添付の請求の範囲において使用されるように、単数形ｒａＪ、ｒ ａｎＪおよび「ｔｈｅＪは、内容が明瞭に別であることを指示しなければ、複数 の指示語を包含することを注記する。それゆえ、例えば、「オリゴ糖」という言 及はオリゴ糖の混合物を包含し、そして「へ糖類」という言及は本明細書に記載 されるタイプのへ糖類の混合物を包含し、そして「プロセス工程」または「プロ セス」への言及は本明細書に記載されるタイプの種々の工程およびプロセスへの 言及を包含し、それらは当業者には公知であり、または当業者が本開示などを読 めば明らかである。

定義 「ヘパリン／ヘパラン硫酸」または「ヘパリン」は、抗凝固剤としてヘパリンの 調製に一般に行われている方法で組織から得られた調製物を意味するか、さもな ければ合成され、そして組織から得られた調製物に相当するものを意味する。

本明細書に参考のために援用される、１９８９年７月７日発行のＣ０ｎｒａｄ、 　Ｈ，Ｅ、、　Ｈｅ　ａｒｉｎ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｐａｌ　５ａｃｃｈ ａｒｉｄｅｓ、　Ｖｏｌ。

５６、　ｐ、１８．Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　Ｎ、Ｙ、、　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　 Ｓｃ、を参照のこと。この調製物は、ヘパラン硫酸の特徴としてのＤ−グルクロ ン酸（ＧｌｃＡ）残基およびへ／ｆゾリン特徴としてイズロン酸（ＩｄｏＡ）残 基を含有し得る。しカル、ＧｌｃＡおよび１ｄｏＡζまともζこ両者（こお０て 存在し、それらは異なった相対的量（こおｌ、Ｍで存在する。ヘパラン硫酸とし ての（ＩｄｏＡ）／ＧｌｃＡ比の増加（ま、よりへ７くリン様になる。上記の背 景技術の節の記載したよう（こ、Ｄ−グルクロン酸のし一イズロン酸への変換は 、ヘノくラン型中間体番ごお（するＧ１ｃＡ残基の５位の炭素でのエピマー化の 結果である。そのようなエピマー化および変換に包含されるこの一連の工程ｉｔ 、当該技術において理解される。十分な変換力（行われなし１程度まで、ヘパラ ン硫酸の特徴が調製物中で残存して（Ｘる。ヘノ（リン調製物中のポリマー鎖の 正確な性質（よ一般にＩｌｌ定されておらず、そして調製物から調製物で変化す るので、用語「ヘパリン／ヘパラン硫酸」または「ヘノイ１ノン」番よ、遭遇さ れる混合物の範囲を力／（−することを意図１２て−する。おそらく、ヘパラン 硫酸をヘパリンと区別する主要な特徴番よ、後者カタ抗凝固活性を有することで ある。

「ヘパリン／ヘパラン硫酸」調製物ζよ、所望であれ（ｆヒトの組織を包含する 種々のホ乳類組織力）ら得られ得る。一般に、ブタまたはウシの原料が使用され 、血管形成された組織力（好ましい。ヘパリン／へ、＜ラン硫酸出発物質の好ま し−）原料↓よ、ブタの腸粘膜であり、この組織原料から調製された「ヘパリン 」とラベルされた調製物が市販されている。一般に、ヘパリン／ヘパラン硫酸出 発物質は、そして組織を自己融解させ、組織をアルカリで抽出し、続いてタンパ ク質を凝固させ、そして次に、酸性化により上清液からヘパリンタンパク質複合 体を沈降させることにより、選択された組織原料から調製される。複合体は、エ タノール、またはアセトン、またはそれらの混合液のような極性の非水溶媒で再 沈澱させることによって回収され、そして脂肪は、エタノールのような有機溶媒 を用いた抽出により、そしてタンパク質は、トリプシンのようなタンパク質分解 酵素での処理により、除去される。ヘパリン出発物質の調製に適切な手法が、例 えば、Ｃｈａｒｌｅｓ、　Ａ、Ｐ、ら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ　（１９３６）　 ３０：１９２７−１９３３に見い出され、そしてこの基本的手法の改変法がまた 、例えばＣｏｙｎｅ、　Ｅ、による、江ｅｍｉｓｔｒ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏ　ｏ ｆ　Ｈｅ　ａｒｉｎ、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、　Ｎｏｒｔ ｈ　Ｈｏ１ｌａｎｄ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｌｕｎｂｌａｄ、　Ｒ，Ｌ、ら編 （１９１１１＞中に開示された手法などが公知である。

立腹ヱユ互亘 本発明の合成オリゴ糖は、少なくとも６個の糖残基単位を含有し、次の一般構造 式を有する： （以下余白） ヱ （糖の３位のヒドロキシル基は、より明瞭にするために省略されている）、そし てｃｏｏＨで置換された炭素付近の＊印は、分子に任意の可能な立体化学があり 得るという立体化学が決っていないことを示す、；ここで、可変基のＡ、Ｂ、Ｃ およびＤの各々は、独立して水素または５Ｏ３Ｒである、ただし可変基の少なく とも２つは５（ｈＲであり、そして各Ｒは独立してＨ′″、Ｎａ−５または他の 適切な陽イオンであるｉそしてここで、Ｒ＋およびＲ２は、各々独立して、水素 または、次の構造を有する、１つ以上の繰り返し単位である： ここで、構造式１　（ａ）の単位が一端で連結されるとき水素が存在せず、そし て連結されない末端の水素は存在し、さらにここで、可変基ＥおよびＦの各々は 、独立して水素または５Ｏ３Ｒである。

本発明のいくつかの好ましい実施態様は、構造式■の化合物を包含し、ここでＡ 、８％　ＣおよびＤの各々は、−３０３−であり、そしてＲ１またはＲ２のいず れかは構造式１　（ａ）の単位である。別の好ましい実施態様は、構造式Ｉの化 合物を包含し、ここでＡ、ＢＳＣおよびＤの各々は、−５０３〜であり、そして Ｒ１およびＲ２の両方が構造式Ｉ　（ａ）の単位であり、そしてここで、単位１ 　（ａ）の各ＥおよびＦは−５０３−である。

ヘパリンおよび　たはヘパラン　か゛　される好ましくは、出発物質として用い られるヘパリン／ヘパラン硫酸調製物は、最初に、エタノールまたはアセトンの ようなヘパリンが溶解しない溶媒で抽出することにより精製される。次いで、精 製された出発物質は脱ポリマー化される。

一般に、脱ポリマー化には、亜硝酸、ヘバリナーゼ、または過ヨウ素酸塩のよう な種々の試薬が用いられ得る。本発明の抗増殖性組成物は、大域類およびへ糖類 の断片の形成を最大にするような条件下で、亜硝酸による部分消化が行われる場 合に得られ得る。

輿望的な手法においては、亜硝酸は、５０■Ｍ濃度の亜硝酸ナトリウム溶液を酸 性化することによりその場で調製される。

そしてその試薬は、ヘパリンを処理するために、ｐＨ約１．０〜約２．０、好ま しくは約１．５で、６０〜１８０ｍｇ／■ｌ濃度で用いられる。

この反応は、室温で行われ、そして消化の所望の段階で適切な試薬を添加するこ とにより中和され得る。活性成分、すなわち、（１）主に大域類およびへ糖類で ある成分；（２）著しく硫酸化されている成分；（３）平滑筋細胞に関して実質 的な抗増殖活性を有する成分；および（４）わずかな抗凝固活性を有するか、ま たは抗凝固活性を有さない成分、を生成するならば、他の脱ポリマー化法も使用 され得る。

次に、単離された断片は、平滑筋細胞の増殖を阻害する能力に対して試験され得 る。（市販のヘパリンに対して、）平滑筋細胞の増殖を阻害することに関して高 い活性を育する断片および血液凝固を阻害する能力に関して低い活性を有する断 片が好ましい。

脱ポリマー化により断片の混合物が生じ、それは次いでサイズに基づいて分離さ れる。ゲル浸透法、密度勾配遠心分離法を包含する種々のサイズによる分離技法 が利用され得る；約１００〜３５００ダルトンの分画範囲を有するセファデック スゲル系またはポリアクリルアミドゲル系を用いたゲル濾過クロマトグラフィー が特に好ましい。特に好ましいゲル浸透樹脂はバイオゲル（Ｂｊｏｇｅｌ）　Ｐ ＩＯであり、そしてこの方法を用いた分離に基づいて、三糖類、四糖類、六ｍ類 、へ糖類および高分子量のオリゴ糖である断片が効果的に分離される。

主に大域類およびへ糖類の単位を含有する画分は、平滑筋細胞の増殖を阻害する ことにおいて増大した活性を示す。この特性の証明は、標準的アッセイ、例えば 、Ｃａ５ｔｅｌｌｏｔ、　Ｊ、Ｊ、Ｊｒ、ら、　Ｊ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉａｌ　（１ ９８６）　１０２：１９７９−１９８４に記載されているア１セイを用いて得れ れ得る。他のアブセイ法、例えば、Ｂｅｎ１ｔｚ、　Ｗ、Ｅ、ら、Ｊ　Ｃｅ１ｌ 　Ｐｈ　５ｉｏｌ　（１９８６）　１２７＋１−７の方法もまた用いられ得る。

このようにして得られる大端類断片は次式の通りであり：ここで、可変基Ａ、Ｂ ％　ＣおよびＤは、独立してＨまたは５Ｏ３Ｒであり、そして各Ｒは、独立して Ｈまたは陽イオンであり、ただし、可変基Ａ、、Ｂ、ＣまたはＤの少なくとも２ つは−Ｓｏ、Ｒである。糖の３位のヒドロキシル基は、より明瞭にするため省略 され、そしてＣ０ＯＨの隣接の幸印は立体化学が決まっていないことを示すこと が指摘される。

式（ＩＩ）の化合物において、還元末端の糖は脱アミノ化されて表示の２．５− アンヒドロマンノースを形成する。この化合物がさらに還元される場合、表示の ＣＨＯは−ＣＨ２０■となる；しかし、この還元は、本質的には脱ポリマー化反 応において起こらない。この還元体は、本発明の化合物であり、以下の式（ｌｌ ａ）に示される。

（以下余白） 一３Ｏ３Ｒにおいて、Ｒで表される陽イオンは、無機陽イオン（例えば、ナトリ ウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、またはアンモニウムイオン） または有機陽イオン（例えば、四級アミンから得られる陽イオン）のいずれがで あり得る；これらの塩は蘭単な中和によって形成される。

上式（Ｉ　＋）に基づいて、−５Ｏ３Ｒ部分が２個またはそれ以上存在する場合 、その位置に関して、１１個の異なる可能な立体配置があると考えられ得る。こ れらの立体配置が次の表に図式的に示される。ここで、ｒＸＪは表示のＡ、Ｂ、 ＣまたはＤの位置に一５Ｏ３Ｒが存在することを示す。

１−工 Ａ　Ｂ　ＣＤ　−５Ｏ３ １−Ｘ　Ｘ　Ｘ　Ｘ ２、　Ｘ　Ｘ　Ｘ ３、ＸＸＸ ４、ＸｘＸ ５、　Ｘ　Ｘ　Ｘ １ニー　ｘｘ 各ｒＲＪが任意の陽イオンである場合、上記１１個の可能な構造はかなり多数の 化合物、すなわち、酸型および塩型を表す。

式（１）で示される１１個の可能な立体配置および上記表の基本構造が以下に示 される。構造１１（１）−１［１１）ｔこ関して、糖の３位のヒドロキシル基が より明瞭（こするためζこ省略されたことが指摘される。

（以下余白） 本発明の代表的な化合物（ここで、Ｒは上記で定義されたとおりである）は、次 のように記述される。これらの表現では次の略語が用いられる：Ｌ−イズロン酸 ＝ｌｄｏＡ；Ｄ−グルコサミン＝　Ｇ］ｃＮＨ２；　Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコ サミン＝　ＧｌｃＮＡｃ　：　Ｄ−グルコサミ７Ｎ−硫酸＝ＧｌｃＮＳ；　２． ５−アンヒドロマンノース＝Ｍａｎ（２゜５）；２，５−アンヒドロマンニトー ル＝　ＭａｎＨ（２，５＞。〇一連結硫酸残基の場所は、「Ｓ」および硫酸化（ ＳＯ３Ｒ残基が酸素に連結されている）の位置の番号によって示される。以下に 明示のように、αおよびβのアノマ一連結は、上記の式ｌに示される連結の通り であり、上記の表示のＤまたはＬの立体配置が関係する。硫酸基の場所は、適用 される糖の略語の下に示される。

ヘパリンの消化およびそれに続く上記手法によって得られる大域類およびへ糖類 の断片は、次式の通りであり：ここで、ｎは１または２であり、可変基Ａ、Ｂ、 ＣおよびＤは独立してＨまたは５ｏ３Ｒであり、ここで各Ｒは独立してＨまたは 陽イオンであり、ただし、ここで上記Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの少なくとも２つは５ ｏ３Ｒである。上記式ＩおよびＩＩにおけＺように、糖の３位のヒドロキシル基 は、より明瞭にするため省略され、そしてカルボキシル基の位置の隣の＊印は、 その毛体化学が決まっていないことを示す。

式（Ｉｌｌ＞の化合物において、還元末端の糖は、脱アミ／化されて表示の２． ５−アンヒドロマンノースを形成する。この糖がさらに還元されるとき、表示の ＣＩ（Ｏは−Ｃｌ（２０ｗｌになる；しかじ、還元は本質的には脱ポリマー化反 応においては起こらない。

還元された化合物は本発明の一部であり、式（［［Ｉａ）として以下に示される 。ここで、各可変基は上記式ＩＩＩにおいてのように定義される。

（以下余白） 入　Ｉ［Ｉ（ａ） Ｒで表された陽イオンは、無機陽イオン（例えば、ナトリウムイオン、カリウム イオン、カルシウムイオンまたはアンモニウムイオン）または有機陽イオン（例 えば、四級アミンから得られる陽イオン）のいずれかであり得、そしてこれらの 塩は簡単な中和によって形成される。上記のように、３位のヒドロキシル基は、 構造中には示されないが、存在することはわかっている。そしてカルボキシル基 の位置の隣すの本印は、これらの位置の立体化学が決まっていないことを示す。

上記式（ＩＩ＋＞に基づいて、−３Ｏ３Ｒ部分が２個またはそれ以上存在する場 合、その位置に関して、５７個の異なる可能な立体配置があると考えられ得る。

これらの立体配置が図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃに図式的に示される。ごこて、ｒＸ Ｊは、−３Ｏ３Ｒが表示のＡ、Ｂ、　Ａ’、Ｂ′、ＣまたはＤの位置に存在する ことを示し、ここで、Ａ′およびＢ′　は、デヒドロマンノースまたはデヒドロ マンニトール残基に近接する括弧に入った三糖類単位におけるＡおよびＢの実施 態様を表す。

各ｒＲＪがＨまたは陽イオンであり得るということにおいて、５７個の可能な構 造はかなり多数の化合物、すなわち酸型および塩型を表す。

この５７個の立体配置の基本構造式は、本明細書中には示されていない。しかし 、これらの式は式＋１（１）−ＩＩ（１１）を参照することによって、式ＩＩ＋ および図６Ａ、６Ｂおよび６ｃから推定され得る。

本発明の好ましい化合物は、大域類である。しかし、好ましいへ糖類としては、 平滑筋細胞に対する抗増殖活性を有するへ糖類を包含し、式 を育する。ここで、中間の−ＧＩｃＮＳ−１ｄｏＡ−Ｇ１ｅＮＳ−１ｄｏＡ−Ｇ ｌｃＮＳ−１ｄｏＡ−基における６個の糖のうちの少なくとも２個は、硫酸基を 含有し；あるいはその生理学的に受容可能な塩を含有する。

これらのうち特に好ましいものは、へ糖類であり、ここで、少なくとも２個のＩ ｄｏＡ−Ｇ１ｅＮＹ単位は、１ｄｏＡ−ＧｌｃＮＳ−１ｄｏＡ−ＧｌｃＮＳ２Ｓ 　６Ｓ　２Ｓ　６Ｓ である。

従って、本発明の好ましいへ糖類は、次のへ糖類、それらの薬学的に受容可能な 塩、ならびに、２個またはそれ以上のそのようなへ糖類およびそれらの塩の混合 物のいずれもが包含される。

工ｄｏＡ−ＧｌｃＮＳ−工ｄｏＡ−ＧｌｃＮＳ−工ｄｏＡ−ＧｌｃＮＳ−１ｄｏ Ａ−Ｍａｎ　（２，５）　；２Ｓ６Ｓ２Ｓ６ｓ２ｓ６ｓ２ｓ６ｓ 工ｄｏＡ−ＧｌｃＮＳ−工ｄｏＡ−ＧｌｃＮＳ−１ｄｏＡ−ＧｌｃＮＳ−工ｄｏ Ａ−Ｍａｎ（２，５）　；正ｏＡ−ＧｌｃＮＳ−工ｄｏＡ−ＧｌｃＮＳ（ｄｏＡ −ＧｌｃＮＳ−ＩｄｏＡ−Ｍａｎ　（２、５）　；工ｄｏＡ−ＧｌｃＮＳ−工ｄ ｏＡ−ＧｌｃＮＳ−ｒｄｏＡ−ＧｌｃＮＳ−工ｄｏＡ−Ｍａｎ　（２、５）　； 正ｏＡ−ＧｌｃＮＳ（ｄｏＡ−ＧｌｃＮＳ−工ｄｏＡ−ＧｌｃＮＳイｄｏＡ−Ｍ ａｎ　（２，５）　；ＩｄｏＡ−ＧｌｃＮＳ−工ｄｏＡ−ＧＩＣＮｓ−工ｄｏＡ −ＧｌｃＮＳ−工ｄｏＡ−Ｍａｎ（２，５）；　’ｂ’Ｊ：メ工ｄｏＡ−Ｇｌｃ ＮＳ−１ｄｏＡ−ＧｌｃＮＳ−工ｄＯＡ−ＧＩＣＮＳ−工ｄｏＡ−Ｍａｎ　（２ 、５）　。

！囲ｇｃロ二座 本発明のオリゴ糖組成物は、過剰なかつ破壊的な平滑筋細胞の増殖を特徴とする 状態または病気の治療のための治療上の適用に有用である。これらの状態は、手 術患者の場合のように被験体が外傷にさらされているところで、しばしば起こる 。創傷または手術によって引き起こされる外傷は、血管の損傷および平滑筋細胞 の二次的増殖を引き起こす。この二次的増殖は、血管のレゼノーシス（ｒｅｓｅ ｎｏｓ　ｉｓ）を引き起こす。この望ましくない結果は、血管移植片手術、心臓 移植、バルーンまたはレーザーによる血管形成、動脈外傷性損傷、崩性動脈の術 後修復、動脈カテーテルの長期間留置、侵郭的な動脈診断法、腎臓移植、肺移植 または肝臓移植、冠動脈／シイｚｆス手術、頚動脈バイパス手術、大腿膝窩動脈 バイノくス手術、および頭蓋内勤脈バイパス手術の後に生じ得る。

外傷の結果として起こる平滑筋細胞の二次的増殖という出来事に加えて、ある種 の病気は望ましくない血管の増殖に関連しているが、それはこれらの場合も、い くらかの内部の未知の損傷が、二次的な結果を引き起こすことが推測されるから である。これらの病気の状態は、グ・ノドノくスチャー症候群、急性糸球体腎炎 、新生児肺高血圧、喘息、うつ血性心不全、成人肺高血圧、および腎血管性高血 圧を包含する。

これらの病気および状態にもかかわらず、適切な量の本発明組成物の投与は、治 療に有用である。投与は多糖類組成物にとって適切な典型的な経路によるもので あり、一般的に注射によるような全身投与を包含する。特に好ましい投与は、長 期間にわたる持続的な注射が容易に持続され得るような、静脈注射である。典型 的な投与量の範囲は、５〜３０日間、好ましくは７〜１４日間にわたって、一定 の基準で０．１〜ｔａｎｇ／ｋｇ／時間の範囲である。特に好ましい投与量は、 約０．３ｍｇ／ｋｇ／時間、または７０　ｋｇの成人に対して、２１ｍｇ／時開 またはＳ４０ｒａｇ／日である。

投与の他の方式は、あまり好ましくないが、より便利であり得る。静脈注射に比 べて、より低用量での皮下注射またはわずかに高用量での経口投与、または経膜 （ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）的投与または経皮投与、または局所的な損傷に 対する他の局所投与もまた、有効であり得る。支持マトリックスのような、おそ らく血管移植片物質内に含まれる連続性放出デバイスを介する局所投与は、外傷 の位置が影響されやすいところでは特に有用である。

前記の投与方式に対して適切な製剤は、当該分野において公知であり、そして製 剤の適切な概要は、Ｒｅ＋＊ｉｎ　ｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ 　５ｃ１ｅｎｃｅ、　Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｒ＋ｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　 Ｅａｓｔｏｎ、　ＦＡの最新版に見い出される。

本発明の組成物はまた、放射性標識、蛍光標識、発色基または酵素のような典型 的な方法を用いて標識され得、そして生物学的試料中の抗増殖成分の量に対する 競合的７ノセイにおいて用いられ得る。生物学的試料中の分析物の競合的アッセ イのための適切なプロトフールは、当該分野においてよ（知られており、そして 一般的に、標識された競合物質との混合において、代表的には免疫グロブリンま たはその断片のような分析物と反応する特異的な結合相手との混合において、試 料の処理を包含する。本発明に従って調製される抗体は、この目的に有用である 。分析物と競合物質の抗体への結合は、結合した複合体を除去することおよび複 合体または標識の上清のいずれかを分析することによって測定され得る。分離は 、固体支持体に対する特異的結合相手の予備接合によってより容易に行われ得る 。そのような技法は、当該分野においてよく知られており、そしてそのような競 合的アッセイに利用可能なプロトコールは、数が多すぎて、かつよく知られすぎ て本明細書中では詳細に述べることはできない。

本発明の抗体は、試料における標識された組成物と分析物の抗増殖因子との間の 競合を包含する上記タイプのイムノア２セイだけでなく、この因子に対する直接 的イムノアッセイにおいてもまた有用である。直接的なア・ｌセイを包含する他 のプロトコールもまた、多（の種類があり、よく知られている。典型的には、抗 体に結合する分析物は、標識を有するさらなる反応相手により、または他の検出 法により検出される。

それゆえ、代表的なサンドイッチアッセイにおいて、例えば、本発明抗体の分析 物への結合は、これらの同じ抗体の標識調製物とのさらなる反応によって、また は種の違いによりこの調製物と免疫反応する標識抗体によって検出され得る。

本発明の抗体はまた、薬学的組成物中に製剤化され得、かつ被験体における平滑 筋細胞の成長を刺激するために使用され得、そして被験体に対してこの結果は望 ましい。

Ｋ立五 本発明の化合物および組成物をいかに調製するかを当業者に対して完全に開示し 、説明するために以下の実施例を述べるが、これらは発明者が発明に対する認識 を制限することを意図するものではない。使用される数字（たとえば、量、温度 等）Ｑ正確さには注意を払ったが、いくらかの実験誤差および偏差は存在する。

特に断わりのない限り、部は重量部、温度は摂氏、そして圧力は常圧付近である 。

支立匠よ 六　および八　ヘパリン　の− １６０ｍｌの水に溶解したヘパリン２０　ｇに、脱アミノ化混合物中の最終ＨＯ ＮＯ濃度が５０　ＪＩＭとなるように固形のＮａＮＯ２６９０ｍｇを加えた。混 合物をマグネティックスクーラーで撹拌しながら、約７０　＋ａｌの６Ｍ　ＭＣ Ｉを滴下して加えた。ｐＨが１．５までゆっくりと下がり、６Ｍ　ＨＣＩまたは ２Ｍ　Ｎａ２ＣＯ３のいずれかを滴下して加えることにより１．５に維持した。

最初に、この酸の添加により、反応混合物は黄色に変色したが、その反応が終る と（Ｎ２の放出が止まるまで約６分間）、溶液は透明になった。反応が完了した ときに、２Ｍ　Ｎａ２ＣＯｓを加えて最終ｐＨを８．５にまでした。時折現れる 微細な白色沈澱を遠心分離して除去し、上清液をデカンテーシヨンにより除き、 減圧下で脱気し、次いで直接バイオゲル＜ＢｉｏＧｅｌ）ＰＩＯカラム上にかけ た。

バイオゲル（ＢｉｏＧｅｌ）クロマトグラフィーを行うために、それぞれ直径約 ５ｃｍおよび長さ約１２８　ａｍの２本のカラムを直列につなぎ、それに計５リ ットルの／％’イオゲルＰＩＯを充填した。

カラムを準備し、０．５Ｍ　ＮＨ４ＨＣＯ３を毎分０．７ｍｌの流速で流した。

脱アミノ化混合物は可能な限り最小容量（１６０ｍ１未満）でカラムにかけた。

１８　ｍｌの画分を集め、そしてカル／＜ゾール法によ大域類、へ糖類、十糖類 、および高分子オリゴ糖の混合物を含有するピーク群が得られた。

爽亘五主 ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ培地である「完全培地」て２−４時間付 着させた。この完全培地を０．１％ウシ胎児面清を添加したＤＭＥＭで置き換え 、さらに２４〜７２時間イン牛コベートして細胞成長を停止させた。次に、低血 清培地を試験試料を含有する完全培地で置き換えた。

一定の間隔で試料を与えたレプリケートプレートを用いて、：６４Ｈに記載の乳 酸脱水素酵素（ＬＤＩＩ）活性を７・ノセイするこう低い濃度のへ糖類画分に見 られる。これに匹敵する阻害（家、約６０μｇ／＊ｌの大域類画分により示され る。

支亘匹主 大域　およびへ糖　の　イオン 実施例１によって得られた大域類およびへ糖類の画分を、０．　ＬＭ　ＮＨ４Ｈ ＣＯ３中で充填されたＤＥＡＥ−トヨバールの１ｘ７ｃ１１のカラムを用いて、 陰イオン交換クロマトグラフィーにかけ、そり、７．０１　Ｍからり、ＯＭ（７ ）ＩＩ線濃度勾配ノＮＨ４Ｈ（：０３（総容量＝６００ｍｌ）を用いて展開させ た。各オリゴ糖混合物の約２０　ｍｇをカラム上にかけた。

図３Ａおよび図３Ｂに、大域類およびへ糖類に対するそれぞれ結果を示す。溶出 液を図３Ａおよび３Ｂに示されるように等量の６つの画分に分け、実施例２の方 法に従って平滑筋増殖の阻害能力に対してアッセイした。このアッセイの結果を 図４Ａおよび４Ｂに示す。

図４Ａに示されるように、平滑筋増殖の阻害能力は電荷と相関関係にあるようで あり、最も電荷の高い画分はかなり効果が高い。いずれのカラムでも早く溶出し た画分は、実質的な抗増殖活性を有しないようである。しかし、陰イオン交換体 に対して高い親和性を膏する画分は非常に高い効果を有する。例えば、大域類混 合物の場合、このアッセイでは、電荷の最も高い４つの画分のいずれもおよそ７ ５μｇ／ｍ　ｌの濃度で、市販のヘパリンを用いて得られる最大阻害値の６０％ と同等の平滑筋増殖の阻害を与える；へ糖類の陰イオン交換分離の電荷の最も高 い４つの画分は、１５−３０μｇ／＋１で約６０−８０％阻害し得る。

０、３Ｍ　ＮＨ４ＨＣＯ３中で充填された５ｃｍＸ　２７ｃｍのカラムを用いて 、より大きな規模で、ＤＥＡＥ−トヨバールクロマトグラフイーヲ行った。３ｇ までのオリゴ糖混合物をこのカラムにかけ、そしてコ”　ｈ　ラム’；ｃ　２　 ｌ）　７１−　ル容量ノ０．３　Ｍ、、０．５　Ｍ、　、０６　Ｍ、　０．９　 Ｍ。

および１，２ＭのＮＨ４ＨＣＯ３で順次流した。０．９Ｍ　Ｎ［１４ＨＣＯ３中 に現れる画分は、より小さなカラムから得た最も高度に硫酸化されたプールと同 等であり、最初のオリゴ糖混合物に対して約ｌｓｏ　ｍｇ／ｇの収率で回収され る。

Ｋ五匠エ イオン・ＨＰＬＣ 未分離の大域類および実施例３でＤＥＡＥ−）ヨパールカラムから得られた最も 高い電荷特性を有する大域類画分を、Ｇｕｏ、　Ｙ、ら、　Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃ ｈｅｍ　（１９８８）　１５８：５４−６２に記載のように、逆相イオン対ＨＰ ＬＣにかけた。これらの手法の溶出パターンを図５Ａおよび５Ｂに示す。

図５Ａは、ＤＥＡＥ−１−ヨバールの最も電荷の高い断片の溶出プロフィールを 示している。図５Ｂは、全量の大域類画分を用いた結果を示している。これらの プロフィールの比較が示すように、電荷で分離された画分は非常に単純化された 混合物である。この単純化された混合物の個々の成分は、抗増殖活性を有するこ とが予想される。

より電荷の高い断片は、一般に、（あまり電荷の高（ない断片および／または市 販ヘパリンと比較して）、（１）より強い平滑筋細胞の増殖阻害能、および（２ ）より低い抗凝固剤としての作用能を示す。さらに、分画／分離のプロセシング を行い得、それは（１）および（２）の要因を改善し、そしてまたそれと同時に 、３位が硫酸化されたオリゴ糖を含有する画分を除去するのを助ける。グルコサ ミンが抗凝固活性を宵するためには、３位で硫酸化されていなければならないこ とが指摘される。

本発明の好ましいオリゴ糖断片は（１）および（２）の特徴を有し、（３）高い 電荷を有し、（４）市販ヘパリンの断片と比べて３位で硫酸化された糖を非常に 少ｌ′含宵する（または全く含有しない）。そのような好ましいオリゴ糖を得る ために、それらをヘパリンの消化から得るよりもむしろ合成によりそれらを生産 した方が好ましい。

足立匠旦 ましいオリゴ糖のム 上記のように、特に好ましい本発明のオリゴ糖は、多くの異なった特徴がある。

例えば、平滑筋細胞の増殖阻害能がより高いこと、また抗凝固剤としての作用能 がより低いこと、硫酸化の程度が高いこと、および３位が硫酸化されていないこ とである。ヘバリ／を消化し、次いて上記の方法に従って得られた断片を分離す ることにより、そのような特に好ましいオリゴ糖を得ることはできるが、化学的 合成方法論を用いてそのような特に好ましい断片を得ることが好ましい。化学的 合成方法論は、すべてが同一の構造であり、それゆえ同一の特徴を有する高純度 の反応生成物を得ることを可能にする。

次の図は、特に好ましいオリゴ糖の合成を示す流れ図である。

下記の構造の合成スキームの終りのところで、そのような合成を行う方法を説明 する記述が付されている。

（以下余白） ！Ｉ−ｔ１ふり一一丁・ｊつ゛卓＾虻ｄＥ（”Ａ！Ｓｒつン１つ児！４１バくス ヤやｎツ２．２．４ ルコサミン誘導体とカップリングすることにより合成し得る。

この適合成は、新規で、かつ特に有利なプロ、キング基の戦略を包含し、それは 、硫酸化オリゴ糖の以前の合成とは対象的に、同じ保護化誘導体からの異なった 硫酸化パターンを用いたオリゴ糖の調製を可能にする。

アシル型（ベンゾイル）保護基と２−メトキシベンジル基の組合せは、任意の順 序で、特異的脱保護および続いての硫酸化を可能にし、それは以下の位！：ａ） 保護化誘導体においてベンゾイル基でマスクされた位置；ｂ〉保護化誘導体にお いてａ−メトキシベンジル基でマスクされた位置；およびＣ）保護化誘導体にお いてベンゾイル基およびニーメトキシベンジル基の両方でマスクされた位置に硫 酸基を有する構造に通じる。

さらに２−メトキシベンジル基の使用によるさらなる利点は、この基の選択的除 去が必要でないならば、永久的ベンジル基と同じ工程において触媒による水素添 加により除去し得、それにより必要な合成工程を減らせるということである。

イズロン酸供与体の合成のため、３−０−ベンジル−し−イドース（本明細書に 参考のために援用される、ｖａｎ　Ｂｏｅｃｋｅｌ、　Ｃ，Ａ。

Ａ、う、Ｃａ皿立庄二且肛（１９８５）±２９３）をピリジン中でトリチルクロ ライドでトリチル化し、そしてその生成物は、単離されることなく、ベンゾイル クロライドを反応混合物に加えることにより直接ベンゾイル化した。トリチル基 を酸加水分解により除去し、そして−級ヒドロ牛／ル基をクロム酸で酸化し、続 いて得られたカルボキシル基はジアゾメタンでエステル化シた。グリコリルブロ マイドへの変換は、チタンニウム（ＩＶ）ブロマイドによって行われた。

グルコサミンシントンの合成のため、２−アジド−２−デオキシ−Ｄ−グルコー スパーアセテート（本明細書に参考のために援用される、Ｐａｕｌｓｅｎ、　Ｈ ，ら、　Ｃｈｅｍ　Ｂｅｒ　（１９７８）凪ユニ２３３４）をヒドラジンアセテ ートを用いて選択的脱アセチル化（本明細書に参考のため援用される、Ｅｘｃｏ ｆｆｉｅｒ、　Ｇら、　Ｃａｒｂｏｈ　ｄｒ　Ｒｅｓ　（１９７８）　３９＋３ ６８）により３工程でチオグリコシドに変換した。次いで、得られたヘミアセク ールをクロライドに変換し、そして続いてチオグリコシド化した。Ｚｅｍｐ　１ ｅｎ−説アセチル化によりアセチル基を除去し、そしてアセタール交換反応によ り、４゜６−０−１−メト牛ジベンジリデンアセクールを調製した。３−ＯＨ基 をベンゾイル化し、そして４．６−０−アセタール環をＮａＣＮＢＨ３−トリフ ルオロ酢酸（本明細書に参考のために援用される、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ、　Ｒ， ら、　Ｊ　Ｃｈｅｍ　Ｓｏｃ　（１９８４）　１：２３７１＞により還元的に開 環した。

還元末端のグルコサミンシントンを、ニーメトキシベンジリデン化、ベンジル化 、および還元的開環により、メチル２−ペンジルオキシ力ルポニルアミノ−２− デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシド（本明細書に参考のために援用される、Ｈ ｅｙｎｓ、　Ｋ、ら。

Ｃｈｅｍ　Ｂｅｒ　（１９５５）　８８：１８８）由来の類似配列により合成し た。

２−アジド−および２−ベンジルオキ７カルポニルーアミ／−２−デオキシ−Ｄ −グルコース誘導体と、同じイズロ／シルブロマイドとのカップリングを、反応 培地の緩衝液としてコリジンを組み合わせてシルバートリフレートを用いて行い 、モして三糖類を生成した。

両方の三糖類をさらに三糖類ンントンに官能化した。その化合物を脱ベンゾイル 化し、モしてＯ−２″位に単一のベンゾイル基を導入した。その三糖類チオグリ コシド誘導体の場合では、ベンゾイル化の後にＯ−４′位のクロロアセチル化を 行った。

２つの三糖類シントンを、ジメチル（メチルチオ）スルホニウムトリフレート（ 本明細書に参考のために援用される、Ｆｕｇｅｄｉ、　Ｐ、ら、江」」工匡ユｅ ｓ　（１９８６）　１４９：Ｃ９）　（ＤＭＴＳＴ）を用いることによりカップ リングし、必要なα−糖鎖間連結を有する四糖類を与えた。

クロロアセチル基の選択的除去とそれに続く同じ三糖類供与体を用いてのグリコ リル化は、保護化六糖類を与え、そしてその保護化六糖類を前述のようなさまざ まな方法で硫酸化し、次いで脱保護し得る。

上記の開示および／または、オリゴ糖の合成方法を開示するために、本明細書に 参考のために援用される、１９９０年７月２４日発行の米国特許第４．９４３． ６３０号とを組み合わせて参照すれば、当業者には、他の合成方法は明らかとな り得る。

本発明は特定の実施態様に関して記載されているが、本発明の真の精神および範 囲から外れることな（、種々の変更が行われ得、そして同等のものが提供され得 ることが当業者には理解されるべきである。さらに特定の状況、物質、物質の組 成物、プロセス、プロセス工程または工程を、本発明の目的、精神および範囲に 適合させるために、多くの改変が行われ得る。すべてのそのような改変は、本明 細書に添付される請求の範囲の範囲内にあることが意図される。

ＦＩＧ、　ＩＡ 唇各砺イａ４＋ ！りｔｏ　大　Ｃ％４　９ ｄ　ｄ　ロ　ロ　ロ １８融く口４ ＦＩＧ、　４Ａ 清慣　−月／ｍ１ ＦＩＧ、　４Ｂ ＦＩＧ、　６Ａ フロントページの続き （７２）発明者　ラム、ルン　エイチ。

アメリカ合衆国　カリフォルニア　９５０１４カツバーチイノ、エヌ、　プルツ ク　スクエア　２０３１７

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．平滑筋細胞の増殖を阻害し得る化合物であって、該化合物は、次の構造式を 有する： 式Ｉ ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの各々は、独立してＨあるいはＳＯ３Ｒであり、そ して各Ｒは独立してＨあるいは陽イオンである、ただしＡ、Ｂ、ＣあるいはＤの 少なくとも２つは−ＳＯ３Ｒである；ここで、糖のヒドロキシル基は、式Ｉおよ びＩ（ａ）において、より明瞭にするために省略されており、ＣＯＯＨで置換さ れた炭素付近の＊印は、ＩあるいはＩ（ａ）のいずれかにおいて任意の可能な立 体化学を示し；Ｒ１およびＲ２は、各々独立して、水素あるいは、次の構造式を 有する１つ以上の繰り返し単位である： 式Ｉ（ａ） ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、式Ｉ（ａ）の単位が１つの末端で連結されるとき、該末端で水素が存在 せず；そしてＥおよびＦの各々は独立して水素あるいはＳＯ３Ｒである、ここで 、各糖の３位にヒドロキシル基が存在するが、より明瞭にするために省略されて いる。
2. ２．Ａ、Ｂ、ＣあるいはＤの少なくとも３つが−ＳＯ３Ｒである、請求項１に記 載の化合物。
3. ３．Ａ、Ｂ、ＣおよびＤのすべてが−ＳＯ３Ｒである、請求項２に記載の化合物 。
4. ４．Ｒ１およびＲ２が水素であり、各ＲがＨ、Ｎａ、Ｋ、ＣａあるいはＮＨ４で ある、請求項１に記載の化合物。
5. ５．平滑筋細胞の増殖を阻害し得る六糖類および八糖類化合物の混合物であって 、該混合物中の化合物は、次の構造式を有する： 式ＩＩＩ ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、ｎは１あるいは２であり、そしてＡ、Ｂ、ＣおよびＤの各々が、独立し てＨあるいはＳＯ３Ｒであり、ここで、各Ｒは独立してＨあるいは陽イオンであ る、ただし、該Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの少なくとも２つはＳＯ３Ｒである；そして 、ここで、各糖の３位にヒドロキシル基が存在するが、図式からは省略されてい る；そして、ここで、カルボキシル基で置換された炭素上の＊印は、立体化学が 決っていないことを示す。
6. ６．Ａ、Ｂ、ＣあるいはＤの少なくとも３つが−ＳＯ３Ｒである、請求項５に記 載の混合物。
7. ７．Ａ、Ｂ、ＣあるいはＤの少なくとも４つが−ＳＯ３Ｒである、請求項５に記 載の混合物。
8. ８．Ａ、Ｂ、ＣあるいはＤの少なくとも５つが−ＳＯ３Ｒである、請求項５に記 載の混合物。
9. ９．Ａ、Ｂ、ＣおよびＤのすべてが−ＳＯ３Ｒである、請求項５に記載の混合物 。
10. １０．各ＲがＨ、Ｎａ、Ｋ、ＣａあるいはＮＨ４である、請求項５に記載の化合 物。
11. １１．平滑筋細胞の増殖を阻害し得る六糖類および八糖類化合物の混合物であっ て、該混合物中の化合物は、次の構造式を有する： 式ＩＩＩ（ａ） ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、ｎは１あるいは２であり、そしてＡ、Ｂ、ＣおよびＤの各々は、独立し てＨあるいはＳＯ３Ｒであり、ここで、各Ｒは独立してＨあるいは陽イオンであ る、ただし、該Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの少なくとも２つはＳＯ３Ｒである；そして 、ここで、各糖の３位にヒドロキシル基が存在するが、図式からは省略されてい る；そして、ここで、カルボキシル基で置換された炭素上の＊印は、立体化学が 決っていないことを示す。
12. １２．Ａ、Ｂ、ＣあるいはＤの少なくとも３つが−ＳＯ３Ｒである、請求項１１ に記載の混合物。
13. １３．Ａ、Ｂ、ＣあるいはＤの少なくとも４つが−ＳＯ３Ｒである、請求項１１ に記載の混合物。
14. １４．Ａ、Ｂ、ＣあるいはＤの少なくとも５つが−ＳＯ３Ｒである、請求項１１ に記載の混合物。
15. １５．Ａ、Ｂ、ＣおよびＤのすべてが−ＳＯ３Ｒである、請求項１１に記載の混 合物。
16. １６．各ＲがＨ、Ｎａ、Ｋ、ＣａあるいはＮＨ４である、請求項１１に記載の化 合物。
17. １７．望ましくない平滑筋細胞の増殖を特徴とする状態の治療に有用な薬学的組 成物であって、 六糖類および八糖類あるいは薬学的に受容可能なそれらの塩から成る群から選択 されるオリゴ糖断片の形態の薬学的に有効な量のヘパリン消化物誘導体であって 、該断片が、市販のヘパリンに比べて、平滑筋細胞の増殖を阻害する増大した活 性、および抗凝固剤として作用する減少した活性を有する；および 薬学的に受容可能な担体、 を含有する薬学的組成物。