JPH06507014A - Ｂ群連鎖球菌検出用免疫検定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 Ｂ群連鎖球菌検出用免疫検定 産業上の利用分野 本発明は、試験液や身体からの分泌液などの流体中のＢ群連鎖球菌（ストレプト コッカス・アガラクチアエ（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃｔｉａ ｅ））多糖抗原の検出に関する。また、本発明は、ヒト、及び、他の動物（牛な ど）を含む哺乳類におけるＢ群連鎖球菌の検出ないし診断にも関する。

発明の背景 免疫検定法は、免疫反応に関与し得る物質の検出法としてよく知られている。

例えば試験液中の、このような物質の検出は、標識剤と共に溶液をインキュベー トし、標識剤が溶液中に存在する物質と結合するかどうかを確認することで行な うことができる。標識剤は物質と結合するものであれば何でもよく、それは検定 トレーサーで標識される。検定トレーサーは、検定の原理により、放射性同位元 素である場合もあれば、化学的／生物学的標識成分の場合もある。

免疫検定法にはいろいろな方式、例えば、シングルユースデバイス（ＳＵＤ　： ｓｉｎｇｌｅ　ｕｓｅ　ｄｅｖｉｃｅ）のようなＥＬＩＳＡ　（酵素結合イムノ ソルベント検定法：ｅｎｚｙｍｅ−１ｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ 　ａｓｓａｙ）　、ラテックス凝集方式、放射線免疫検定法などがある。ＥＬＩ ＳＡは、物質（例えば抗原や抗体）の存在を酵素活性に関連させる。この種の検 定では、物質は、酵素標識をつけた標識剤（例えば、米国特許第３，７９１，９ ３２号、第４，７５７，１３４号、第４，８３３，０７１号明細書を参照された い）を用いて検出される。またＥＬＩＳＡでは検出を行う前に、対象の物質を捕 捉するために免疫吸着剤を用いることもある。

ＳＵＤは、典型的には、検定中の抗原が結合する捕捉（ｃａｐｔｕｒｅ）抗原を 担持する膜から成る。そして、酵素などの、基質に接触するとその後に発色する 適切な標識を担持する２番目の標識抗体を用いて”サンドインチ”が作られる。

ラテックス凝集方式では、抗原物質が、ミルク様の外観を有するラテックスの形 態のポリスチレンビーズに吸着される。続いて、抗体を加えると、コートされた ラテックス粒子が凝集し、媒体の外観に目にみえる変化が生じる。

放射免疫検定法は、酵素の代わりに例えばヨウ素１２５などの放射性同位元素が 使われる点を除いてＥＬＩＳＡと同じである。ガンマ・カウンターを用いて検出 できる。

Ｂ群連鎖球菌（ＣＢＳ）に感染すると、ヒトや動物では健康に重大な危険が生じ る。ＣＢＳ感染は、例えば、乳牛の乳腺炎の原因になる。しかし特に懸念される のは、出産時のＣＢＳ感染の発生である。出産前の母親がこのバクテリアの保菌 者であると、出産後感染の危険があるだけでなく、子供が産道を通るときに子供 に感染させる場合もある。新生児のこのような感染の予防は、子宮頚部または腟 におけるＣＢＳの存在の識別のための出産前検査を行い、必要な場合は抗体治療 を行うことにより可能である（１）。このような場合には、分娩前に抗生物質に よる治療を行う必要があるために、−夜培養法よりも、迅速免疫診断検査が好ま しい。

Ｂ群連鎖球菌は、５つの個々のＣＢＳ抗原型に共通する群特異的多糖抗原（「Ｃ 」物質）の存在により、他の連鎖球菌と区別できる（２．３．４）。この共通Ｃ ＢＳ多糖抗原には、Ｌ−ラムノース、Ｄ−ガラクトース、２−アセトアミド−２ −デオキシ−Ｄ−グルコース及びＤ−グルシトールが含まれる（５．６）。ＣＢ Ｓ多糖抗原の全体構造は、以前に、下記に示す構造工、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶを 有する４つの異なるオリゴ糖の単位から成ることが示されている（５．６）。

オリゴ糖の単位工、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶは、一種のホスホジエステル結合（Ｄ −グ工 妊娠中の女性をスクリーニングする最適な時期は、陣痛が始まる時であるとルシ トールの０６とＤ−ガラクトピラノースの０６の間）により連結され、複雑で非 常に分枝の多いマルチアンテナリー構造であることが示されている。ＧＢＳ多糖 抗原の全体構造を下記に示す（６）。

ＧＢＳの免疫診断検定は、ＣＢＳ多糖抗原をターゲットとしている（７）。

構造研究により、ＣＢＳ多糖抗原には３８個のモノラムノースエピトープと４個 のトリラムノースエピトープがあることが知られている。また、末端の式Ｕ−Ｌ −Ｒｈａｐ−１−［式中、Ｒｈａｐはラムノースである。］の基を包含するモノ ラムノース基が、ＧＢＳ多糖抗原のイムノドミナントなエピトープであることも 知られている（８）。しかし、このモノラムノース基は、多糖類と、連鎖球菌Ｂ 群、連鎖球菌Ｇ、肺炎球菌ＸＸＩＩＩの抗血清にみられる交差反応性の多くの原 因となっている（９）。

ある種の市販の、ＥＬ　Ｉ　ＳＡまたはラデノクス凝集タイプのＧＢＳ多糖抗原 の試験は、感度に欠け（１０，１１）、また非ＧＢＳ細菌抗原と交差反応を示す 場合があること　（１２）が多くの研究により判明している。妊娠中の女性の場 合、このような交差反応で誤りの結果が示されると、まだ生まれていない子供に 不必要な抗生物質治療を受けさせることになる。ＧＢＳの感度に欠けると、治療 を行わないというより重大な状況が生じる可能性があり、そうなると新生児のＣ ＢＳ疾患が増加する危険が生じる。

報告されている。それ故に、特に出産直前の妊娠中の女性のためには、ＣＢＳの 存在を診断する感度と特異性（交差反応性を有さない）が優れた、がなり迅速な 診断試験が必要とされるのである。本発明は、ＣＢＳに対し、非常に感度と特異 性に優れた迅速診断試験を提供することを目的とする。

発明の要旨 本発明者らは、モノラムノース基のエピトープと比べて、ＣＢＳについて選択性 の優れたエピトープを決定するため、エピトープを組織的に研究した。本発明者 らは、また、ＣＢＳに対するより優れた感度を示す測定法を見つけるために、い ろいろな検定方式も研究した。

本発明者らは、驚いたことに、例えばツーサイト（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ）　Ｅ　Ｌ 　Ｉ　Ｓ　Ａ方式のように、モノラムノース基のエピトープが、トリラムノース 基のエピトープと一緒に用いる場合に、ＣＢＳの免疫診断に有効に使用できるこ とを見い出した。この組合せで、捕捉抗原に結合する捕捉エピトープとして用い られる場合、トリラムノース基のエピトープは、ＣＢＳに対する高い特異性に寄 与し、酵素標識抗体のターゲットとして使用されるモノラムノース基のエピトー プは感度を与え、捕捉抗体への結合に関し、酵素標識抗原と捕捉エピトープの間 の拮抗を防ぐ。

また、トリラムノース基のエピトープ全、シングルサイト（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｉ ｔｅ）　Ｅ　ＬＩＳＡ方式において捕捉抗体のターゲットとして用いると、最大 量の捕捉抗体（５００ｎｇ／ウェルの範囲）をコートするという標準的方法に従 った場合、ＣＢＳ多糖抗原に対する感度が、ｌｎｇ以下の多糖抗原という重要な 範囲で、ゼロ近くまで低下することも判明した。本発明者らは、トリラムノース 捕捉抗体のコーティング密度を５００ｎｇ／ウェルから約１６０ｎｇ／ウェルに まで減少させると、ＧＢＳ多糖抗原に対する感度がわずかに低下してはいるが、 シングルサイトＥＬＩＳＡが機能することを見い出した。

本発明の要旨は、抗原標ｍ（ｍａｒｋｅｒ）剤、不溶性担体、不溶性担体の表面 に固走化された抗原捕捉（ｃａｐｔｕｒｅ）剤がら成る免疫吸着剤組合せ物（ｉ ｍｍｕｎｏａｄｓｏｒｂｅｎｔｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を提供することである 。抗原捕捉剤は、担体にＣＢＳ多糖抗原を固定させる、ＣＢＳ多糖抗原のトリラ ムノースエピトープと特異的に結合する親和性を有する。トリラムノースエピト ープは、式ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ　（１→２）ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ　（１−２）　ａ− Ｌ−Ｒｈａｐ−１−［式中、Ｒｈａｐはラムノースである。］の基から成る。抗 原標識剤は、その抗原が担体に結合した場合に、ＣＢＳ多糖抗原に結合する親和 性を有する。

本発明の別の要旨は、抗原標識剤、不溶性担体、不溶性担体の表面に固定化され た抗原捕捉剤から成る、ＣＢＳ多糖抗原検出用の免疫吸着剤組合せ物を提供する ことである。抗原捕捉剤は、ＣＢＳ多糖を担体に固定させる、ＣＢＳ多糖抗原の モノラムノースエピトープに特異的に結合する親和性を有する。モノラムノース エピトープは、式ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ−１−［式中、Ｒｈａｐはラムノースである 。］の基から成る。抗原標識剤は、その抗原が担体に結合した場合に、ＣＢＳ多 糖抗原と特異的に結合する親和性を有する。

本発明のさらに別の要旨は、Ｂ群連鎖球菌多糖抗原を検出するための免疫検定法 を提供することである。この方法は下記（ｉ＞及び（ｉｉ）のステップから成る 。

（ｉ）ＣＢＳ多糖抗原を含む疑いのある試験液に、上記のようなＣＢＳのモノラ ムノースまたはトリラムノースのエピトープと結合する親和性を有し、不溶性に 固定化された抗原捕捉剤を接触させる。

（ｉｉ）ＣＢＳ多糖抗原が抗原捕捉剤と結合した場合にＣＢＳ多糖抗原と結合す る親和性を有する抗原標識剤を導入して、担体に結合したＣＢＳの存在を検出す る。

本発明のさらにまた別の要旨は、別々の容器に適切に下記（ａ）〜（ｅ）　を含 む、ＣＢＳ多糖抗原検出用の試験キットを提供することである。

（ａ）不溶性担体の表面に固定化された、上記のようなＣＢＳのモノラムノース またはトリラムノースのエピトープと結合する親和性を有する抗原捕捉剤。

（ｂ）有機酸から成る、ＣＢＳ多糖抗原をＢ群連鎖球菌から亜硝酸水溶液抽出す るための第１抽出剤。

（ｃ）無機亜硝酸塩から成る、ＣＢＳ多糖抗原をＢ群連鎖球菌から亜硝酸水溶液 抽出するための第２抽出剤。（但し、第１抽出剤と第２抽出剤は、水性媒体中で 混合した場合に互いに反応して亜硝酸を生成し得るものである。）（ｄ）過剰の 亜硝酸を中和するための中和剤。

（ｅ）ＣＢＳ多糖抗原が担体と結合した場合に、抗原のモノまたはトリラムノー スエピトープと特異的に結合する親和性を有する抗原標識剤。

また、本発明の要旨は、ＣＢＳ多糖抗原に対する抗体産生を賦活する免疫原複合 体を提供することである。複合体は、薬学的に許容可能な担体と結合した炭水化 物から成り、その炭水化物は、ＣＢＳ多糖抗原のラムノースエピトープに対する 抗体産生を賦活する免疫反応性を有する。ラムノースエピトープは、（ａ）式ａ −Ｌ−Ｒｈａｐ　（１−２）　ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ　（１−２）　ａ−Ｌ−Ｒｈａ ｐ−１−のトリラムノース基、（ｂ）式ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ−１−のモノラムノー ス基、または、（Ｃ）上記（ａ）及び（ｂ）に各々記載のトリラムノース及びモ ノラムノースの基の混合物［各式中、Ｒｈ　ａｐはラムノースである。コから選 択される。

また、本発明の別の要旨は、不溶性担体と当該不溶性担体の表面に固定化された 抗原捕捉剤からなる免疫吸着剤を提供することである。抗原捕捉剤は、（ａ）式 ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ　（１→２）　ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ　（１→２）　ａ−Ｌ−Ｒｈ ａｐ−１−のトリラムノース基、及び（ｂ）式ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ−１−のモノラ ムノース基［各式中、Ｒｈａｐはラムノースである。］から選択されるラムノー ス部分から成る。

さらに、本発明の要旨は、不溶性担体、及び、当該担体の表面に単位面積当り１ ６０ｎｇ以下のコーティング密度でコートされた、Ｂ群連鎖球菌に対するトリラ ムノースモノクローナル抗体から成る免疫吸着剤を提供することである。

さらにまた、本発明の要旨は、ＣＢＳ多糖抗原に対する、ヒツジポリクローナル 抗体から単離した抗体を提供することである。

図面の簡単な説明 添付の図を参照して本発明を説明する。

図１は、表４に示す構造１〜２２を有する種々のオリゴ糖を用いて、ポリクロー ナル抗ウサギＢ群多糖特異性血清（０９０Ｒ）へのＢ群多糖の結合についての定 量的沈降阻害を示す。

図２は、そのまま（ｎａｔｉｖｅ）のタイプＩａ（白丸）及びタイプＩＩＩ　（ 黒丸）のＢ群多糖と、それぞれのナリンギナーゼ（Ｎａｒｉｎｇｉｎａｓｅ）処 理物（白道三角形と魚道三角形）の、ポリクローナル抗ウサギＢ群多糖特異的血 清（０９０Ｒ）での定量的沈降曲線を示す。

図３は、１−２−結合−σ−Ｌ−）リラムノピラノシドーアフイニテイカラムを 使用した、ポリクローナル抗ウサギＢ群多糖特異性血清の分画を示し、末端α− Ｌ−ラムノピラノシド特異性抗体は緩衝液Ａで溶出され、トリラムノシト特異性 抗体は緩衝液りで溶出される。

図４は、そのままのＢ群多糖とトリラムノシドアフイニテイ精製ポリクローナル 抗つサギＢ群多糖特異性血清（０９０Ｒ）の結合の、１．２．３．４及び１５　 （表４）によるＥＬＩＳＡ阻害を示す。

図５は、そのままのＢ群多糖とネズミモノクローナルＢ群多糖特異性抗体（０９ ０Ｒ，）の結合の、１．２．３．４及び１５（表４）によるＥＬＩＳＡ阻害を示 す。

図６は、アフィニティ精製したとノジ抗体とＢ群特異的多糖の結合の阻害を示す 。

［Ｎ７Ａ及び図７Ｂは、捕捉抗体としてトリラムノース特異性モノクローナル抗 体を用いたＢ群特異的多糖抗原の検出用のシングルサイ）ＥＬＩＳＡ及びツーサ イトＥＬ　Ｉ　ＳＡを示す。

図８Ａ及び図８Ｂは、捕捉抗体としてモノラムノース特異性を有するヒツジのポ リクローナル抗体を用いたＢ群特異的多糖抗原検出用のシングルサイトＥＬＩＳ Ａ及びツーサイトＥＬＩＳＡを示す。

図９は、捕捉抗体として、トリラムノース特異性を有するモノクローナル抗体（ 白丸）またはモノラムノース特異性を有するポリクローナル抗体（黒丸）を用い たＣＢＳ細胞に対するＥＬＩＳＡの感度を示す。いずれの場合も、標識抗体とし てベルキシダーゼ標識モノラムノース特異性ヒツジポリクローナルを用いている 。

図１０は、トリラムノース特異性モノクローナル抗体をシングルサイトＥＬＩＳ Ａの捕捉抗体として用いたＥＬＩＳＡの感度（白丸、図７Ａの１６０ｎｇの抗体 コーティング密度で得たデータ）と、モノラムノースエピトープポリクローナル 抗体を標識抗体として用いたツーサイトＥＬＩＳＡでの感度（黒丸、図７Ｂの２ ００ｎｇの抗体コーティング密度で得たデータ）を示す。

発明の詳細な説明 本発明において、下記の表現は、下記のように理解されたい。

（ｉ）「免疫吸着剤」は、免疫反応に関係する物質を吸着することができる物質 （例えば、場合により、抗体または抗原）を意味する。

（ｉｉ）　ｒ免疫検定剤」は、免疫反応に関係する物質の存在の試験にかかわる ことができる物質のすべて（例えば、場合により、抗体または抗原）を意味する 。

（山）「免疫原複合体」は、動物（例えば、哺乳類や鳥類）に注入された場合に 、それに対する抗体の産生ないし増強を賦活ないし誘導する物質を意味する。

（ｉｖ）　ｒ抗原捕捉剤」は、抗原に結合できる物質（例えば抗体）を意味する 。

（Ｖ）「抗体捕捉剤」は、抗体に結合できる物質（例えば抗原）を意味する。

（ｖｉ）　ｒ結合する親和性」は、一般に、要素が、−緒に結合するというよう に、別の要素と相互作用することが可能であることを意味する。

（ｖｉｉ）　ｒ特異的に結合する親和性」は、一般に、要素が、排他的または少 なくとも優先的な形態、即ち、本発明の目的に十分な形態で別の要素と相互作用 が可能であることを意味する。

（ｖｉｉｉ）　ｒ抗原捕捉剤が、Ｂ群連鎖球菌多糖抗原のトリラムノースエピト ープと特異的に結合する親和性を有する」は、抗原捕捉剤が、この捕捉剤とＢ群 連鎖球菌多糖抗原のその他の成分（例えばモノラムノースエピトープ）の間の相 互作用が非常に低い、または、無視でさる（すなわち、トリラムノースエピトー プとの相互作用が、Ｂ群連鎖球菌多糖抗原またはＢ群連鎖球菌感染の検出及び／ または診断の目的に十分に特異的である）というように、トリラムノースエピト ープと排他的または少なくとも優先的形態で相互作用が可能なことを意味する。

（ｉｘ）　ｒ抗原標識剤は、Ｂ群連鎖球菌多糖抗原のモノラムノースエピトープ に特異的に結合する親和性を有する」は、抗原標識剤が、この標識剤とＢ群連鎖 球菌の多糖抗原のその他の成分（例えばトリラムノースエピトープ）との相互作 用が非常に低い、または、無視できる（すなわち、モノラムノースエピトープと の相互作用が、Ｂ群連鎖球菌多糖抗原またはＢ群連鎖球菌感染の検出及び／また は診断の目的に十分に特異的である）というように、排他的あるいは少なくとも 優先的形態で相互作用可能なことを意味する。

（Ｘ）［シングルサイ）ＥＬＩＳＡＪは、捕捉抗体と標識（プローブ）抗体がタ ーゲットとするエピトープの部位が、構造的に同じである（例えば、トリラムノ ースエピトープが捕捉抗体と標識抗体のターゲットとされる）ようなＥＬＩＳＡ 方式検定を意味する。

（ｘｉ）　ｒノーサイ）ＥＬＩＳＡＪは、捕捉抗体と標識（プローブ）抗体がタ ーゲットとするエピトープの部位が、構造的に異なる（例えば、トリラムノース エピトープが捕捉抗体のターゲットとされ、モノラムノースエピトープがマーカ ー抗体のターゲットとされる）ようなＥＬＩＳＡ方式検定を意味する。

検定する物質（抗原）を含む試験液は、いかなる源由来のものでもよい。従って 、源はヒトであっても、例えば哺乳類や鳥類など他の動物であってもよい。

例えば、乳、尿、あるいは羊水などの流体（既知の方法で濃縮することが必要な ことがある）を試験することが望ましい場合もある。あるいは、胃スワブ（５ｗ ａｂ）、尿生殖器スワブ、胎盤スワブ、細菌の培養物またはコロニーの試験が望 ましい場合もある。試験液は、特に、スワブから得た腟及び／または子宮頚部の 分泌物から採取することができる。

ＣＢＳ多糖抗原には、Ｂ群連鎖球菌から周囲の流体環境に自然に放出されるもの もあるが、検出目的に十分な量の抗原が存在することにはならないことがある。

それ故、抽出手順が、そのままの細菌からＣＢＳ多糖抗原を試料流体中に移行さ せるために必要なことがある。

一般に、抽出手順には、細菌の細胞壁へのＣＢＳ多糖抗原の付着を破壊できる適 切な抽出剤を用いてＣＢＳ細菌を処理することがある。温度や抽出剤などの抽出 条件は、ＣＢＳ多糖抗原に悪影響がないように選択される。ＣＢＳ多糖抗原の抽 出は、例えば、単一化合物から成る、または、相互作用により抽出を引き起こす ２以上の化合物から成る適切な抽出剤を含む水性媒体中で行うことができる。適 切な抽出法としては、例えば、酵素法（２２）や亜硝酸法がある。

亜硝酸法では、混合した場合に（例えば、液状媒体中で）反応が生じ亜硝酸を生 成し得る少なくとも２つの反応剤を組み合わせて、亜硝酸が、通常、インシトゥ （ｉｎ　５ｉｔｕ）で生成される。試薬の１つは有機酸から、またもう１つは無 機亜硝酸塩から選ぶことができる。ＣＢＳ多糖抗原の亜硝酸抽出に適切である限 り、有機酸と無機亜硝酸塩をどのように組み合わせても用いることができる。有 機酸は、例えば、酢酸、コハク酸、クエン酸などが使用できる。無機亜硝酸塩と しては、例えば、アルカリ金属の亜硝酸塩（亜硝酸ナトリウムまたは亜硝酸カリ ウムなど）を用いることができる。

そのままの細菌からＣＢＳ多糖抗原を常温常圧下で抽出するための既知のミクロ 亜硝酸抽出法の例は、スリフキン（Ｓｌｆｆｋｉｎ）、　Ｍら（２３）が述べて いる。ミクロタイターウェル法を用いて、この種の抽出では最大抽出に達するま でに約２０必要することが判明している。実際には、検出の目的では５分から１ ０分で十分である。

抽出手順は、一般に、次の（１）〜（７）のステップから成る。

（１）ＣＢＳ細菌を含む疑いのある細菌試料を、ＣＢＳ多糖抗原を抽出できる適 切な抽出剤と共にインキュベートし、分析液を作成する。

（２）必要な場合は、適切なインキュベーション時間の経過後、分析試料に中和 剤を混合し、過剰な抽出剤を中和する。

（３）得られた分析液に、本明細書に記載したような抗原免疫吸着剤を接触させ る。

（４）分析液を抗原免疫吸着剤と共にインキュベートする。

（５）抗原免疫吸着剤により捕捉されたＣＢＳ多糖抗原を、所望の標識をつけた 抗原標識剤と共にインキュベートする。

（６）このようにして得られた捕捉「サントイ・ノチ」を、適切な洗浄剤、すな わち、「サンドインチ」の構造や結合した標識剤の活性１こ悪影響を与えなし） 水溶液で洗浄する。

（７）上記のステップ（５）で結合多糖抗原に捕捉された標識剤の性質に基づき 、ＣＢＳ多糖抗原／細菌の存在を決定し、必要な場合１こｌよその量をＩＩ定す る。

抗原捕捉剤は、例えば、抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）または、 レクチンのようなその他の同効物質から成る。同様（こ、抗原標識剤Ｉよ、例え ば、抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）また（よＧＢＳ多糖抗原シこ 結合するために必要な親和性を有する同効物質から成る。あるｕｌｌよ、抗原捕 捉剤と抗原標識剤は、例えば所望の親和性なり）し必要な親和性を有する断片で あるＦａｂ断片のような抗体の適切な断片から成ってもより）。これらの斉ｊ番 よ、また、シングルドメイン抗体（ｄＡＢｓ：ｓｉｎｇｌｅｄｏｍａｉｎａｎｔ ｉｂｏｄｙ）　（１３）力ゝら成ってもよい。

抗原捕捉剤は、抗原捕捉剤がさらされる試験媒体に関して不溶性となるよう、吸 着または共有結合により担体に固定化される。担体は、有機成分また番よ無機成 分のものでよい。例えば、担体はアミロース、デキストラン、天然セルロースま たは変性セルロース、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、アガ ロース、及び、ケイ酸（ガラスなど）などから選ぶことができる。抗原捕捉剤は 、例えば、試験容器（即ち、試験管、ミクロタイタープレート、ガラスのキュベ ツト、または上記に類似した他の物体）の内壁、または、固体物体（即ち、ガラ ス棒やその他いろいろな形状の物体）に固定化される。使用される容器は、面積 と体積の比が大きいものが好ましい。捕捉抗体は直接担体に固定化される場合も あるし、または、グルタルアルデヒド、プロティンＡもしくはプロティンＢなど の中間物質の残基を介して固定化される場合もある。

抗体、抗原、酵素、リガンドなどの活性物質を担体に固定化する（即ち、不溶化 する）ための既知の方法のいずれも使用できる（１４）。捕捉抗体は、例えば、 抗体を含む緩衝液（例えば、０．１ＭのＮａＨＣＯ２と５〜１２．ｃ＋ｇ／ｍＩ の捕獲抗体から成る、ｐＨが９．６の緩衝液０．２−０．２５ｍ１）を、適切な 温度で適切な時間（例えば４℃で１６時間）、担体の機能表面に接触させること により、ポリスチレンのミクロタイタープレート、ウェルまたはチューブから成 る担体の表面に固定化することができる。捕捉抗体の固定化後、担体の活性表面 を適切な洗浄剤で洗浄し、結合していない抗体を取り除くことができる。洗浄処 理には、抗体が可溶性の中性の洗浄用緩衝液を用いることもできる。これには例 えば、０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含むｐＨが７．４の０゜０２Ｍ塩化トリス 緩衝液（以下、ＴＢＳと呼ぶ）、０゜０５％のツウィーン（Ｔｗｅｅｎ）　−２ ０を含むＴＢＳ　（以下、ＴＢＳＴと呼ぶ）、あるいはツウィーンー２０を０． ０５％含むｐＨ７，４の０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝食塩水という場合もあ る。ノウイーン−２０はポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートの商標で 、アトラスケミカル社（Ａｔｌａｓ　Ｃｈｅｍｉｃａ＋）から市販されている。

このようにして得た免疫吸着剤は、例えば室温から３７℃の範囲の温度で乾燥に 十分な時間、例えば典型的には３７℃で１時間乾燥し、その後使用するまで約４ ℃で保管することができる。

抗原標識剤は、不溶性担体に結合したＣＢＳ多糖抗原に結合するために必要な親 和性を有していなくてはならない。標識剤は、結合ＣＢＳ多糖抗原に存在し得る 結合可能な結合部位の内のいくつにも結合する親和性を有していてもよい。結合 部位の結合可能性は、抗原標識剤と所望の結合部位の性質により決まる。

前にも述べたように、ＣＢＳ多糖抗原には３８のモノラムノースエピトープと４ つのトリラムノースエピトープがある。それ故に、抗原標識剤は、モノラムノー スエピトープに特異的に結合する親和性を有していることが好ましい。

こうすると、検定する物質の１個の分子に対して標識を有する物質の多数の分子 が結合することで、増幅ができる。

好ましくは、抗原標識剤は、ヒツジの抗血清から得たポリクローナル抗体（例え ば、ＢＣＨ−４０２と表示されるＣＢＳ多糖とツジ抗血清くカナダ国ケベック州 うバルのＩＡＦバイオケムインターナショナル社））から成り、ＣＢＳ多糖抗原 のモノラムノース抗体に結合する親和性を有する。

抗原標識剤は、検出を行なうための適切な標識またはトレーサー成分を有する。

免疫検定に適切に用いられる標識またはトレーサー、例えば、酵素、放射性同位 元素または蛍光標識を、標識抗体に結合できる。使用される標識により、もちろ ん、検出法の性質は決まるものである。

標識酵素は、ホースラディツシュペルオキシダーゼ、例えば、過酸化水素オキシ ドレダクターゼ（ＥＣ１，１１，１，７）のこともある。ホースラディツシュペ ルオキシダーゼは既知の還元アミノ化法を用いて抗体などの物質に結合させるこ とができる（１４．１５）。例えば、本発明者らは、ＮａＢＨ４をより弱い還元 剤であるＮａＣＮＢＨ３に代え、抗体に対するペルオキシダーゼの初期反応比を ２：１とした、ティファーセン（Ｔｉｊｅｓｅｎ）アミノ化法を使うとより有利 であることを見い出した。より弱い還元剤の使用により、Ｎ　ａ　Ｂ　Ｈ４を用 いて得た複合体に比べ、約１．２倍はど感度の優れた抗体−酵素の複合体が得ら れることが判明している。さらに、上記の反応比を用いると、ＮａＣＮＢＨ３を 還元剤として用いた場合の抗体に対する酵素の最終比は、ＮａＢＨ４を還元剤と して用いた場合の比が１．６であるのに対して、２．２となる。

このような方法で得られる酵素抗体複合体は、従来の方法により複合体を透析処 理することにより精製して、存在し得る反応しなかったペルオキシダーゼ及び抗 体を除去することができる。あるいは、残った反応物はアフィニティゲル法で除 去することができる。例えば、抗体−酵素複合体は、ホースラディツシュ・ペル オキシダーゼとその複合体を結合するが、遊離ＩｇＧ抗体とは結合しないコンカ ナバリンＡレクチンアフィニティゲルを含むカラムで処理される。

そして、結合した複合体は適切な溶離剤を用いるとカラムがら溶出し、得られた 溶出物は、複合体とは結合するが、ペルオキシダーゼ自体には結合しないα−Ｌ −ラムノースー１−アフィニティゲルを含むカラムで処理される。すると複合体 はラムノース溶離剤によりカラムから溶出される。得られた溶出物には、その後 透析を行ない、遊離ラムノースを取り除く。

以下、ＥＬＩＳＡ方式について本発明の組合せ物と試験キットを説明する。

しかし、本発明はいかなる検定方式にも適用でき、ＥＬＩＳＡ方式に限定されな いことを理解されたい。従って、本発明は、例えば、ラテックス凝集方式や放射 線免疫検定方式にも適用できる。

組合せ物または試験キットは、例えば、容器の表面に固定化された抗原捕捉剤を 含む容器から成る試験装置を包含することもできる。組合せ物または試験キット は、また、腟または子宮頚部から試験試料を採取するために使用し、上記のよう な容器に挿入できる試料採取綿棒も包含することができる。

さらに、組合せ物または試験キットは、抗原標識剤の標識の性質により、標識抗 原に会合したＣＢＳ多糖抗原検出用の検出基質も包含することができる。

検出基質は、標識剤に使用される標識の性質により、１つ以上の成分がら成るこ とがあり、例えば第１検出基質成分のＨ２Ｏ２及び第２検出基質成分の３，３° 。

５．５°−テトラメチルベンジジンから成ることがある。組合せ物または試験キ ットは、この他に、抗原標識剤とのインキュベーション後に、非結合抗原標識剤 を取り除くために、免疫吸着剤を洗浄する洗浄剤も包含することができる。

本発明では、検出基質の成分は、各々の容器内で別々の溶液とすることができ、 あるいは１つの容器内で事前に混合した溶液とすることができる。別々にする場 合は、使用前に混合するか、または、試験容器に別々に入れる。

本発明は、また、親和性を有する抗体画分を（ポリクローナル抗体から）分離、 回収、精製し、抗原捕捉／標識剤として有用にするためのアフイニテイゲルとし て使用することができる免疫吸着剤を提供する。この免疫吸着剤は、不溶性担体 と不溶性担体の表面に固定化された抗体捕捉剤から成る。抗体捕捉剤は、　（ａ ）式ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ　（１→２）ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ　（１→２）ａ−Ｌ−Ｒｈ ａｐ−１−のトリラムノース基、及び（ｂ）式ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ−１−のモノラ ムノース基［各式中、Ｒｈａｐはラムノースである。］力１ら選択されるラムノ ース部分から成る。トリラムノース免疫吸着剤（即ち、抗体捕捉剤がトリラムノ ース基から成るもの）は、溶液を処理し、トリラムノースエピトープと相互作用 する抗体を吸着する（即ち、分離するか、捕捉する）ためし二層用できる。同様 に、モノラムノース免疫吸着剤（即ち、抗体捕捉剤がモノラムノース基から成る もの）は、溶液を処理し、モノラムノースエピトープと相互作用する抗体を吸着 するため使用できる。

抗体捕捉剤のラムノース部分がモノラムノース基から成るモノラムノース抗体免 疫吸着剤は、Ｌ−ラムノース（例えば、米国ウィスコンシン州のアルド１）゛ノ ヒ・ケミカル社製）をセファロースＣＬ−４８（カナダ国ケベ・ツク州ドーヴア ルのファーマシア・ファイン・ケミカル社製ら入手できるゲルの商標名）＆こ既 知の手順を用いて結合することで得ることができる（２０．２１）。

あるいは、モノラムノース抗体免疫吸着剤は、モノラムノースが本明細側こ記載 の不溶性担体に結合されることを除いて、上記のモノラムノース免疫原複合体を 得る方法と同じ方法により、合成した（４）誘導体である５−メトオキシカルボ ニルベンチルーα−Ｌ−ラムノピラノシドを出発物質として得ることができる。

抗体捕捉剤のラムノース部分がトリラムノース基から成るトリラムノース抗体免 疫吸着剤は、同様の方法で得ることができる。

本発明は、また、ＣＢＳ多糖抗原の、式ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ−１−のモノラムノー ス［式中、Ｒｈａｐはラムノースである。］のモモノラムノースエピトーに結合 する特異的親和性を有する抗体の調製方法を提供する。この方法は、ラムノース 免疫吸着剤に、適切なポリクローナル抗体を含む免疫血清を接触させ、（溶出に より）成分に結合した抗体画分を溶出物として回収し、このようにして得られた 溶出物にトリラムノース免疫吸着剤を接触させ、このように処理された所望の抗 体を含む溶出物を回収することから成る。

上記の方法は修正して、ＣＢＳ多糖抗原の上記のモノラムノースエピトープに結 合する特異的親和性を有する抗体と、上記のＣＢＳ多糖抗原のトリラムノースエ ピトープに結合する特異的親和性を有する抗体の調製にも用いることができる。

修正方法は、適切なポリクローナル抗体を含む免疫血清をトリラムノース免疫吸 着剤に接触させ、（溶出により）所望の抗体を含む各々の抗体画分を、成分に結 合した物質から回収することから成る。

また、本発明は、適切な動物（例えば哺乳類または鳥類）に注入することにより 、ＣＢＳ多糖抗原に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の産生 を賦活する免疫原複合体を提供する。免疫原複合体は、医薬的に許容可能な担体 、例えば、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミンまたは破傷風トキソイドな どのポリマーないしタンパク質に結合した炭水化物から成る。炭水化物は、ＣＢ Ｓ多糖抗原の、（ａ）式ａ　Ｌ　Ｒｈａｐ　（１＝２）　ａ　Ｌ　Ｒ１１ａｐ　 （１−２）ａ　−Ｌ−Ｒｈａｐ−１−のトリラムノース基、　（ｂ）式ａ−Ｌ− Ｒｈａｐ−１−のモノラムノース基、または、（ｃ）上記（ａ）及び（ｂ）に各 々記載のトリラムノース及びモノラムノースの基の混合物［各式中、Ｒｈａｐは ラムノースである。］から選択されるラムノースエピトープに対する抗体産生を 賦活する免疫反応性を有する。

炭水化物は、例えば上記のラムノース部分（ａ）、（ｂ）及び／または（Ｃ）か ら成ることがある。さらに、免疫原複合体は、医薬的に許容可能な担体に結合し たＣＢＳ多糖抗原から成ることがある。

一般に、炭水化物を医薬的に許容可能な担体に結合させるためには、従来の方法 を用いることができる。従って、免疫原複合体は、炭水化物、例えば本明細書に 記載のラムノース部分から成る物質を、結合を行なうために必要な物質及び／ま たは担体の活性化を含む方法を用いて、医薬的に許容可能な担体に結合すること で調製することができる。例えば、ラムノース部分は、開始物質としてＣＢＳ多 糖抗原自体を用いて担体に結合できる。あるいは、適切なオリゴ糖の単位、部分 、誘導体を使用することもできる。ラムノース部分から成るオリゴ糖は、ＣＢＳ 多糖抗原から得ることができ、また、既知の手順にしたがって合成することもで きる（６．７）。

開始物質としての炭水化物物質は、例えば下記のような一般的形態をとることが できる。

［式中、Ｒは、Ｈまたは有機部分もしくは反応性部分である。］Ｒが水素の場合 、例えば、適切なスペーサー基を介してラムノース基を医薬的に許容可能な担体 に結合するのが望ましいことがある。担体（例えばタンパク質）への結合のため の活性化は、ヒドラジンまたはナトリウムメタベリオデートを用いて達成できる 。Ｒはさらに−（ＣＨ２）５−ＣＯＯＭｅ、Ｄ−グルシトール、または、下記式 の基の場合もある。

モノラムノース基を含むモノラムノース免疫原複合体は、合成誘導体である５− メトキシカルボニルペンチルーα−Ｌ−ラムノシト（７）を開始物質として得る ことができる。この誘導体は、ヒドラジン水化物で活性化され、タンノ（り質担 体に結合されて、モノラムノース複合体を得ることができる。トリラムノース免 疫原複合体、すなわち、トリラムノース基を含む免疫原複合休養よ、相当する５ −メトキシカルボニルペンチル−ａ−Ｌ−トリラムノシト誘導体を開始物質とし て、同様の方法で得ることができる。

上記のような免疫原複合体は、おそらく、ラムノース基を不溶性担体１こ結合す る場合の中間物として使用することもできる。このようにして得られた抗体免疫 吸着剤は、例えばＥＬＩＳＡタイプの測定におり）で、血清診断剤として用いる ことができる。複合体は、上記に述べたように、従来の固定化法を用し１て表面 に結合させることができる。

上記のような免疫血清は、例えば、上記に述べたような免疫原複合休養こ以前に さらされたことがある適切な動物（例えば哺乳類や鳥類）の血液力）ら作り出せ る。例えば、医薬的に許容可能な担体、例えば破傷風トキソイドをこ結合された ＣＢＳ多糖抗原から成る免疫原複合体は、リン酸緩衝液食塩水中の複合体溶液と フロイント完全アジュバントを混合して得た乳濁液を、適切なマウスの腹腔内に 毎月連続して注入すると、抗体の産生を誘発すること力τできる。ＣＢＳ多糖抗 原に対する抗体の力価が検出可能になったときに、ノ１イブ１ノドーマ細胞を通 常の方法で得ることができる（１６）。

本発明の好ましい態様では、抗原捕捉剤と抗原標識剤を、ツーサイトサンドイッ チ・タイプの免疫検定となるように設定することができる。この検定では、抗体 は、ＣＢＳ多糖抗原の異なるエピトープに対して個々に親和性を有する。

好ましくは、抗原捕捉剤はトリラムノースエピトープと結合する親和性を有し、 抗原標識剤はモノラムノースエピトープと結合する親和性を有する。このツーサ イト抗体の設定では、トリラムノースエピトープを捕捉部位として用いるため特 異性が増加し、抗原標識剤のターゲットとしてより多数のモノラムノースエピト ープを使用する結果、感度も増加する。

本発明で有用なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞系を用いる従来の方 法を用いて得ることができる。このため、ＣＢＳ多糖抗原に結合する所望の親和 性を有するモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞系を用いることが できる。例えば、コーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）とミルスティン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ）の方法（１７）をモノクローナル抗体の生成に用いることができる。スターリ （ＳｔａＬｈｌｉ）ら（１８）の方法を、同じ抗原の異なるエピトープに対する モノクローナル抗体の識別に用いることができる。

抗原捕捉剤がモノクローナル抗体から成る場合は、抗体はＢ群連鎖球菌多糖抗原 のトリラムノースエピトープに結合するための必要な親和性を有している必要が ある。上記の性質を有するならば、モノクローナル抗体はいかなるアイソタイプ でもよい。

モノクローナル抗体ＧＢＳ　１／１８　：　６／ＤＩは、ＣＢＳ多糖抗原のトリ ラムノースエピトープを認識するモノクローナル抗体の一例であり、好ましくは 、捕捉抗体として使用される。抗体はＩ　ｇＧ３アイソタイプで、ＣＢＳの血清 型Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、ＩＩ、ＩＩＩと相互作用することが判明している。この抗 体は、カナダ国ケベノク州うバルのＩＡＦバイオケムインターナショナル社によ りＢＣＨ−４０６とも表示されている。

上記のＩ　ｇＧ３モノクローナル抗体は、既知の方法を用いて腹水（マウスまた はその他の動物）から得ることができる（１６）。得られたＩ　ｇＧ３モノクロ ーナル抗体は、アイ（Ｅｙ）、　Ｐ、１．らの方法を用いて、プロティンＡアフ ィニティクロマトグラフイーにより腹水から精製することができる（１９）。こ のため、例えば、腹水は、既知の方法で、ＩｇＧ３抗体を分泌する（カナダのケ ベック州うバルのＩＡＦバイオケムインターナショナル社により）　ＢＣＨ−１ ３６と表示されるハイブリドーマ細胞系を用いて得ることができる。このハイブ リドーマで得た腹水の試料は、プロティンＡセファロース−４Ｂカラムを用いた プロティンＡアフィニティクロマトグラフイーで精製できる。本発明では、この 種のカラムからの溶出は、４．５のｐＨで可能であり、１ｍｇの腹水当り２．１ ｍｇのＩｇＧの収率であることが判明している。

あるいは、抗原捕捉剤または抗原標識剤として有用な抗体は、まず動物の体内に 有効な量の賦活剤を注入し、ＣＢＳ多糖抗原に対する所望の抗体産生を起こさせ 、その後に動物の抗血清から所望の抗体を回収することによって得ることができ る。動物は、例えば、ウサギ、ウマ、ヤギ、モルモット、マウス、ウシ、ヒツジ 、ニワトリなどから選ぶことができる。賦活剤は、本明細書に記載するような免 疫原複合体から成ってもよい。所望の抗体は、これも本明細書に記載の抗体免疫 吸着剤を用いることもある、従来の方法を用いて抗血清から精製することができ る。

本発明者らが行った結合阻害の研究から、ＢＣＨ−４０６モノクローナル抗体は 、トリラムノースエピトープ［σ−Ｌ−ラムノース−（１→２）ラムノース（ｌ →２）ラムノース−１］に対して非常に高い特異性を有することが示された。ジ ラムノース［ラムノース（１−２）ラムノース−１−コ　との相互作用は、ｌ／ ２０１．か有効でないことが判明し、また遊離ラムノースとの相互作用は無視で きることが判明した。

本発明者らはまた、アフイニテイ精製したヒツジのポリクローナル抗体の特異性 の研究から、別々の２つのラムノース含有エピトープが同等に相互作用できるこ とを見い出した。この２つのラムノースは、ラムノース（１−３）ガラクトース とラムノース（１−３）グルシトール構造で、併せて抗原の１モル当り３０モル の数である。これは、シングルサイトＥＬＩＳＡにトリラムノースエピトープの みを用いた場合に得られるものより、１０倍以上の数の標識抗体付着部位が得ら れる可能性があることを意味する。実際、図７Ａと図７Ｂに示すように（後で論 じる）、ｏ、３７ｎｇの抗原濃度において、シングルサイトＥＬＩＳＡの場合と 比較し、ツーサイトＥＬＩＳＡでは４．２倍以上のシグナルが観察された。

ＣＢＳ多糖抗原を含むと考えられる試験液、例えば血清や分析物は、多糖抗原を 免疫吸着剤に結合するを助けるインキュベーション条件下で、抗原免疫吸着剤に 接触させ、インキュベートすることができる。その後、既知の方法（１４）にし たがい、適切な抗原標識剤（例えば末端ａＬ−ラムノースを特異的に示すポリク ローナル抗体−酵素複合体）をこのように結合された多糖抗原に接触させ、これ ら２つを一緒にインキュベートして、標識剤を「サンドイッチ」状に免疫吸着剤 に結合した多糖抗原に結合させ、検出を行なう。このように、結合した多糖抗原 は所望の感度を与えるのに十分な量の抗原標識剤にさらされる。

インキュベーション後、適切な洗浄緩衝液で洗浄して余分な標識剤を取り除く。

ＣＢＳ多糖抗原の存在は、結合したＣＢＳ多糖抗原に結合した酵素を適切な検出 基質にさらすことにより測定できる。抗原の存在の有無は、色の変化の有無で分 かる。存在する細菌の量は、試験での発色と比較するための検量色表（カラーチ ャート）によって、または分光光度計と抗原の標準曲線によって測定できる。

本発明では、ＥＬＩＳＡタイプの測定は、例えば、下記（ａ）〜（ｋ）の手順に よって行なうことができる。（ａ）細菌試料（例えば疑わしい細菌を含む試料採 取綿棒）を、容器の内側表面に適切な抗原捕捉剤を固定化した試験容器に入れ、 （ｂ）亜硝酸ナトリウムの水溶液と酢酸の水溶液を加え、　（Ｃ）得られた抽出 混合物と共に、室温で約５分から２０分、時々撹拌しながら、綿棒をインキュベ ートし、　（ｄ）例えば、０．２％ツウィーンー２０を含むｐＨ７゜４の０．２ Ｍ塩化トリス溶液などの中和剤を加え、（ｅ）所望の酵素レベルを有する所望の 抗原標識剤を加え、　（ｆ）このようにして得た混合物を適当な時間（例えば１ ０〜１５分）室温にて容器内で、時々撹拌しながらインキュベートし、　（ｇ） 綿棒（ある場合）と試験容器に残っている溶液を取り除き、試験容器の内側表面 をＴＢＳＴで洗浄し、洗浄溶液を捨て、（ｈ）酵素検出基質を洗浄した容器に加 え、（ｉ）酵素検出基質混合物を試験容器の内側表面に接触させて、室温で適切 な時間（例えば１０〜１５分）、必要であれば時々撹拌しながら、インキュベー トし、（ｊ）得られた試験容器内の混合物に、ＣＢＳ多糖抗原／細菌の存在を示 す色の変化があるかを目視で検査し、及び／または（ｋ）　（既知の方法で分光 光度計を用いて）吸光度検査を行ない色の変化を記録し、必要な場合には、酵素 ／基質活性を停止させるのに十分な量の無機酸（たとえばＨ２Ｓ０４）を、０． ５Ｎの最終酸濃度を得るに十分な量（１〜３Ｎの硫酸を５０〜１００μｍ）にな るよう、混合物に加えて検査を行なう。必要により、綿棒は上記のステップ（ｄ ）の前、ステップ（ａ）の前、または（ｆ）の前で取り除くことができる。しか し、ステップ（ｆ）の後で取り除くのが好ましい。流体中に十分な量の抗原があ る場合、例えば乳を培養してウシを試験する場合などは、抽出ステップは一般に は必要ではない。

前記したように、最大量の捕捉抗体をコートするという標準的な方法で、トリラ ムノースエピトープを用いたシングルサイトＥＬＩＳＡを行うと、感度はｌｎｇ 未清の抗原という重要な範囲でゼロ近くまで低下した。いかなる理論に拘束され るものではないが、これについて有り得る説明としては、各ＧＢＳにある限定数 （４個）のトリラムノースエピトープが、完全に捕捉抗体に結合し、そのため標 識のついた第２抗体が付着することができなくなる、というものである。捕捉抗 体の密度を５００　ｎ　ｇ／ウェルからｌ　６０　ｎ　ｇ／ウェルに減少させる と、感度が少し低下するが、ＥＬＩＳＡは機能することが判明した。これはおそ らく、ウェルの壁にある抗体の結合部位の間隔を、全てのトリラムノースエピト ープが結合しないようにあけることである。最適密度が１６０ｎｇ／ウェルより むしろ２００ｎｇ／ウェルであるツーサイトＥＬＩＳＡでのコーティング密度の 効果から（図７Ｂを参照）、このように減少させたコーティングによりシグナル が約２０％低下すると推定される。このため、幾分かの感度の損失と、捕捉抗体 のコーティングを正確に制御する必要から、トリラムノースエピトープはシング ルサイトＥＬＩＳＡにおいて使用するのにあまり適していない。

一方、ヒツジのポリクローナル抗体が結合するモノラムノースエピトープは、抗 体のコーティング密度にかかわらず、シングルサイトＥＬＩＳＡで機能する。こ れは多分、抗原分子当りのこのエピトープの数がより多いため（３８モル１モル ）である。しかし、このエピトープは、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅ ｒｏｇｅｎｏｓａ）との交差反応という欠点がある。

トリラムノースエピトープを介しての複数部位付着（ｍｕｌｔｉｓｉｔｅ　ａｔ ｔａｃｈｍｅｎｔ）は、このようにツーサイ）ＥＬＩＳＡにとっては著しい利点 である。抗原が工ｇＧ及びＩｇＭ抗体に多価結合することによって得られる、機 能的親和性の増加は、それぞれ１０３倍及び１０６倍のオーダーであると示され ている（２８）。

さらに、全ての４つのトリラムノースエピトープによることもあり得るＣＢＳ多 糖抗原の多価の捕捉は、この抗原の捕捉について固相の機能的親和性を有意に増 加させると期待できる。

図１には、表４に示すオリゴ糖を用いて、ウサギのポリクローナル抗血清とＢ群 多糖の沈降を阻害する実験から得られた阻害曲線が示されている。これらは、Ｂ 群多糖（５，６）の断片であるか、あるいはこれらの構造的同族体であり、合成 法（７）またはＢ群多糖の分解（５，６）で得られた。ポリクローナルのウサギ ＧＢＳ抗血清に関連する２つの別個の特異性が、これらの実験で識別できる。ま ず第１は末端１−２−結合α−Ｌ−）リラムノビラノシドに関連する主たる特異 性であり、第２は末端α−Ｌ−ラムノピラノシドに関連する。

これは次のように推測できる。

オリゴ糖ｌ、２及び３はすべて同じように優れた結合の阻害剤で、全てに１＝２ −結合α−Ｌ−トリラムノビラノシドエピトープが含まれる。オリゴ糖１及び２ には、Ｂ群多糖を構成するオリゴ糖断片が余分に含まれるという事実（６）にも かかわらず、これらの三糖のアグリコンは、それらの阻害特性にとって比較的重 要ではない。

オリゴ糖ｌ及び３から末端α−Ｌ−ラムノピラノシル残基を取り除き、それぞれ オリゴ糖５及び４にすると、阻害特性はがなり低下する。従って、トリラムノピ ラノシドエピトープの末端ａＬ−ラムノピラノシル残基と末端から２番目のα− Ｌ−ラムノピラノシル残基の間にある末端１−２−結合は、結合にとって！要で ある。これはまた、上記の末端１−２−結合が１−３−結合または１−４−結合 に代わったオリゴ糖１２．１３及び１４を用いて行った実験でも確認されている 。オリゴ糖３として表されているトリラムノースエピトープ全体の末端α−Ｌ− （１−２）−結合をα−Ｌ−（１−４）−結合に変えただけのオリゴ糖１２では 、α−り一トリラムノビラノシドエピトープに対する抗体について非阻害的とな った。

末端α−Ｌ−ラムノビラノシドエピトープに基づく抗体群は、この構造上の特徴 を含むオリゴ糖１２．１３．１４及び１５を用いた阻害実験（図１を参照）で最 も良く識別される。これらの実験に用いた他のオリゴ糖もまたこの構造の特徴を 有するが、しかしこれらオリゴ糖には余分のエピトープ構造が含まれているため に、阻害特性はより複雑である。α−Ｌ−ラムノピラノシドエピトーブの単純な 単量体的性質は、メチルα−Ｌ−ラムノピラノシド１５がオリゴ糖１２．１３及 び１４と同効の阻害剤であるという事実でも示されている。

図１では、また、ウサギの抗血清中の第３のエピトープに関連する抗体の存在が 、オリゴ糖６と８の阻害性質によって示されている。オリゴ糖１２．１３．１４ 及び１５と同様に、オリゴ糖８にもまた末端α−Ｌ−ラムノピラノシル残基が含 まれているが、オリゴ糖８は前述のオリゴ糖類より優れた阻害剤である。

このため、３番目のエピトープ特異性は、オリゴ糖８の末端α−Ｌ−ラムノピラ ノシル残基と別の隣接するグリコース成分の両方が関連していると考えられる。

末端α−Ｌ−ラムノピラノースもまた第３のエピトープにとって重要であるとい う事実は、これをオリゴ糖８から除去すると、得られたオリゴ糖８は完全に阻害 機能がなくなるという事実からも確認できる。第３のエピトープは、また、Ｂ群 多糖の実際の成分であるオリゴ糖６に存在する。

図２はウサギのポリクローナル抗血清の血清学におけるα−Ｌ−）リラムノビラ ノシドエビトープの優位性を示す。これは、２つの源からのそのままのＢ群多糖 、及び、ナリンギナーゼ（α−Ｌ−）リラムノシダーゼ）で処理した生成物（即 ち、Ｂ群多糖（１０ｍｇ）をペニシリウム種（ＥＣ３，２，１，４０、ミネソタ 州セントルイスのシグマ社）のｌＯ単位のナリンギナーゼで処理して得られた生 成物）の比較によっても確認された。ナリンギナーゼはＢ群多糖の。−Ｌ−トリ ラムノピラノシドエピトープから、末端（１−２）−結合α−Ｌ−トリラムノピ ラノシドを特異的に除去することが知られている（６）。Ｉａ群とＩＩＩ群から 得たＢ群多糖は、全く同じ沈降曲線を描き、これはまた各々のナリンギナーゼ処 理生成物でも同じである。沈降曲線から、。−Ｌ−）リラムノビラノシドエピト ープに特異性を有する抗体は、沈降した抗体全体のほぼ２／３（６６％）と推測 できる。Ｂ群多糖に特異性を有する他の抗体はすべて、α−り一トリラムノビラ ノシドへの特異性を有するものも含め、ナリンギナーゼで処理したＢ群多糖で沈 降する。

図３は、上記のウサギの抗血清の、ａ　Ｌ）リラムノビラノシドとα−Ｌ−トリ ラムノビラノシドエピトープに基づくエピトープ特異性のものへの分画を示す。

これは、α−Ｌ−トリラムノピラノシドエピトープが固体支持体にうまく結合し たアフイニテイ力ラムを用いて行った。（ＩＬ−ラムノピラノシドに特異的な抗 体は、０．２Ｍのα−Ｌ−ラムノースを含む緩衝液を用いてカラムから溶出した 。異なるアルカリ性を有するグリシンを含む緩衝液でカラムからさらに溶出を行 なうと、最終的にはｐＨ１１，５で、トリラムノピラノシドに特異性を有する抗 体が溶出された。２つの異なる特異性を有する抗体を含む両分は、α−Ｌ−ラム ノピラノシド複合体と（ＩＬ−トリラムノピラノシド複合体をコーティング抗原 として用いたＥＬＩＳＡで画分をモニターすることで識別した。

図４は、アフイニテイ精製したα−Ｌ−）リラムノビラノシドに特異性を有する 抗体を用いたＥＬＩＳＡ阻害実験を示す。Ｂ群多糖はＥＬＩＳＡプレートのウェ ルに結合しないため、Ｂ群多糖−ＢＳＡ複合体をコーティング抗原として用いた 。末端ａ−Ｌ　）リラムノビラノシドエピトープ（オリゴ糖１，２及び３）を含 むオリゴ糖は全て、結合に対し同効の阻害剤であった。α−Ｌ−ジラムノビラノ シド（オリゴ糖４）はより効果の少ない阻害剤であるが、結合を阻害することは できる。メチルα−Ｌ−ラムノピラノシドの低い阻害特性で証明されているよう に、α−Ｌ−ラムノピラノシドに特異性を有する抗体が先にこの画分から除去さ れているため、オリゴ糖４がこの抗体の両分をなお阻害するという事実から、こ の抗体の特異性はｃｒＬ）リラムノビラノシドエビトープ全体に対するものであ ることが示された。

図５は、Ｂ群多糖特異的モノクローナル抗体（１６）　、及び、コーティング抗 原としてＢ群多糖−ＢＳＡ複合体を用いたＥＬＩＳＡ阻害実験から得た結合曲線 を示す。本質的には、上記のアフイニテイ精製したウサギのポリクローナル抗血 清でも同じ結果が得られた。同じく、末端ａＬ−トリラムノピラノシドエピトー プを含む全てのオリゴ糖（１，２及び３）は優れた阻害剤であり、α−Ｌ−ジラ ムノピラノシド（オリゴ糖４）は、それほど優れた阻害剤でないとしても、阻害 剤としての機能を有していた。メチルａＬ−ラムノピラノシド（３１）はこの系 では非常に効果のない阻害剤である。

トリラムノシト及びモノラムノシトのエピトープ以外と関連する特異性を有する 抗体もまた、ウサギのポリクローナル抗血清中で識別できた。四糖ａＬ−Ｒｈ　 ａｐ−（１−３）α−Ｄ−Ｇａ　ｌ　ｐ（１−３）β−Ｄ　−Ｇ　ｌ　ｃ　ｐＮ Ａｃ（１−４）ａ　Ｌ　Ｒｈａｐを含むオリゴ糖は、末端モノラムノシドエピト ープだけより、上記の抗体へのＢ群多糖の結合を阻害する優れた阻害剤であった 。四糖はオリゴ糖工及びＩＩの構造的特徴を有しており、それ故にＢ群多糖内部 に工及びＩＩがあるにもかかわらず、四糖は免疫機構に関わることができるので ある。

図６は、精製したヒツジのポリクローナル抗体の特異性に関連するものである。

これは、表４に示す群特異性多糖の断片を用いたＥＬＩＳＡの阻害研究で評価さ れた。抗体結合の阻害剤を試験するために、ＰＢＳＴ中の抗体（１００μｍ）と 抑制剤（１００μｍ）を、低結合タイプのミクロタイタープレート（米国マクリ ーンのフローラボラトリー（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、リンプロ ／タイターチック（Ｌｉｎｂｒｏ／Ｔｉｔｅｒｔｅｋ）　Ｅ　Ｉ　Ａ）のウェル で、室温で１時間予備混合した。この阻害剤／抗体溶液の１００μｍの容量を、 ＣＢＳ多糖−ＢＳＡ複合体コートミクロタイターウェルに移し、１時間インキュ ベートした。ペルオキシダーゼで標識したウサギの抗ヒツジと酵素基質を上記に 述べたように加えた。

ラムノース＝（１−３）−グルシトール（オリゴ糖１，７及び１０）またはラム ノース−（１−３）−ガラクトース（オリゴ糖８）のいずれかを含む断片は、固 相群特異性多糖−ＢＳＡ複合体に対するＰＡｂ結合の阻害剤としては、同じよう に有効であった。ラムノース−（１−３）−グルシトールとラムノース−（１− ３）−ガラクトースの両方を含むオリゴ糖５は、これらの配列の一方だけを含む 断片より阻害剤として有力であった。遊離ラムノースとラムノースのメチルグリ コシドはどちらも、非常に弱い阻害剤であり、１０−５〜１０−４Ｍの濃度のオ リゴ糖１．６．７．８及び１０と同じ阻害を得るためには１×１叶ＩＭの濃度を 必要とすることが判明した。単糖による抑制は、性質は弱いが、特異的のようで ある。なぜなら、他の単糖（グルコース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）及 び二Ｎ（ラクトース、メリビオーズ及びスクロース）は１×１０−ＩＭの濃度で は阻害できなかったからである。オリゴ糖（３及び４）は両方とも非常に弱い阻 害剤で、トリラムノシル基及びジラムノシル基はラムノース単糖ぐらいしか有効 でないことを示した。興味深いことに、試験を行った構造の中で最も弱かったが 、ガラクトースもまた阻害することが分かった。ガラクトースは、Ｒｈａ　（１ −３）Ｇａ　ｌ　（１−３）ＧｌｃＮＡｃ枝の２番目の糖として、ポリクローナ ル抗体のＢ群多糖抗原への結合に有意な役割を果たしているのかもしれない。グ ルシトール、ラムノース−（１−３）−グルシトールを含む三糖は非常に有効な 阻害剤であったにもかかわらず、グルシトールは、同様な濃度範囲で試験した場 合には阻害剤として機能しなかった。

図７Ａ及び図７Ｂは、トリラムノシル基及びラムノシル基を含むエピトープ用い たシングルサイトＥＬＩＳＡ及びツーサイトＥＬＩＳＡの感度に関するものであ る。トリラムノシトに特異性を有するモノクローナル抗体が、捕捉抗体として使 用された。図７Ａでは、トリラムノシトに特異性を有するペルオキシダーゼ標識 したモノクローナル抗体が第２の抗体として使用された。図７Ｂでは、アフィニ ティ精製され、ペルオキシダーゼ標識したヒツジのポリクローナル抗体が、第２ の抗体として使われている。各ミクロタイターウェルをコートするために使用さ れた抗体の量はＸ軸に示されている。また、ウェルに加えられたＢ群特異性を有 する抗体の量は、Ｏｎｇ　（白丸）、ｏ、３７ｎｇ　（黒丸）、１．１１ｎｇ（ 白道三角形）、３．３３ｎｇ　（魚道三角形）、１０ｎｇ（自回角形）、１１０ ０ｎ　（具四角形）である。

ミクロタイターウェルにコートされたモノクローナル抗体の密度の関数としての 感度は、ＣＢＳ多糖濃度が低いときは（０，３７ｎ　ｇ／試験）、２面性を有す ることが判明した。最大シグナルは、ウェルのＭａｂ当り１６０ｎｇで生じたが 、より高いコーティング密度では、シグナルはほとんどゼロまで低下した。前記 したように、この現象について最も有力な説明は、抗体分子が多くの点で捕捉さ れ（すなわち、４つのトリラムノピラノシルエピトープすべてが捕捉抗体層に結 合している）、ペルオキシダーゼの標識がついたＭａｂが付着できる抗原部位が 残されていなかった、ということである。図７Ａに示されているデータのこの解 釈の確証となる観察は、２００　ｎ　ｇ／ウェル以上のＭａｂのコーティング密 度で生じる阻害は、抗原濃度が高い場合は見られないこと、即ち、０．３７ｎｇ の曲線と１１００ｎの曲線との比較である。抗原が大量に余っている状態では、 抗原の別の分子の抗原からのトリラムノシルエピトープが、捕捉層の抗体結合部 位を占めると予測される。こうなると、ベルオキシダーゼの標識がついた第２の 抗体が結合するために、各捕捉された抗原の４つのトリラムノシト結合部位のう ちの３つが残ることになる。トリラムノシルエピトープを用いたシングルサイト ＥＬＩＳＡは、捕捉抗体の密度がほぼ１６０ｎｇ／ウェル以下に保たれていると 、可能なことが明白である。

図７Ｂは、モノクローナル抗体が捕捉抗体として、ポリクローナル抗体が標識さ れた第２の抗体として用いられているツーサイトＥＬＩＳＡについて示す。

図７Ａに示すシングルサイトＥＬＩＳＡと対照的に、捕捉層コーティング密度に 対する影響が示されていないことが分かる。その代わりに、０．３７ｎｇの抗原 レベルにおいて、プラスチックが飽和状態になり生じるシグナルがプラトー状態 になるまで、通常の線形関係がコーティング密度とシグナルの間にみられる。こ のデータでは、第２の標識抗体の付着において捕捉抗体の干渉がないことが示さ れているが、これは特異性が異なるためである。

図８Ａ及び８Ｂは、抗原の捕捉のためにポリクローナルモノラムノース含有エピ トープを用いて行った同様の１対の実験の結果を示す。シングルサイトＥＬＩＳ Ａ（図８Ａ）、ツーサイトＥＬＩＳＡ（図８Ｂ）のいずれでも、第２のペルオキ シダーゼの標識がされた抗体の付着に捕捉層が干渉したという証拠はない。ポリ クローナルには結合部位として３０カ所、つまり１５のＲｈａ（１−３）Ｇａｌ と１５のＲｈａ（１−３）グルシトールがあり得るため、捕捉抗体のコーティン グ密度にかかわらず、ペルオキシダーゼの標識がされた第２の抗体には付着部位 が十分あるように思われる。

Ｂ群多糖を検出するために、ミクロタイタープレートを２００μｍのモノクロー ナルまたはポリクローナル抗体の５Ｉｉｇ／ｍｌ溶液でコートした。ＰＢＳＴの ２００μＩ中の抗原を３０分間ウェルに入れ、次いで、ＰＢＳＴで５回洗浄した 。ＰＢＳＴで１万分の１に希釈したペルオキシダーゼで標識がされた第２の抗体 を各ウェルに加え、３０分後にウェルをＰＢＳＴで再度５回洗浄した。

酵素基質を追加し、吸光度を読み取った。

図９は、図７Ｂ及び図８Ｂに示した２つのＥＬＩ　ＳＡの相対感度を示す。血清 型ＩＩＩのＢ群連鎖球菌細胞を上記に説明したように抽出し、トリラムノースに 特異性を有するモノクローナル抗体（白丸）またはモノラムノシルエピトープに 特異性を有するポリクローナル抗体（黒丸）でコートしたミクロタイターウェル に移した。捕捉のためのトリラムノシルエピトープと、第２の抗体のペルオキシ ダーゼ標識モノラムノース特異ヒツジポリクローナルの付着部位としてモノラム ノース含有エピトープを用いたツーサイトＥＬＩＳＡは、モノラムノース含有エ ピドースを捕捉及び標識第２抗体の両方のために用いたシングルサイトＥＬＩ　 ＳＡと類似する感度を有することが分かった。どちらのＥＬＩＳＡの場合でも、 新生児の分娩時の感染と相関する３Ｘ１０４ｃｆｕ（１）を検出するために必要 な感度を有していた。

図１０は、捕捉抗体としてトリラムノース特異的モノクローナルを用いた２つの ＥＬＩＳＡの感度を示す。モノラムノース特異的抗体をプローブ（ツーサイトＥ ＬＩＳＡ、黒丸）として用いた場合には、トリラムノシト特異的抗体を使用した 場合（シングルサイトＥＬＩＳＡ、白丸）より感度が４〜５倍に増加したことが 示された。

実際の細菌に対するツーサイトＥＬＩＳＡの感度は、サンプル当り３Ｘ１０４ｃ ｆｕを超えるＣＢＳは、新生児の分娩時の感染の発生と相関関係にあることを報 告している研究の観点からすると興味深い。図９に示すように、ツーサイトＥＬ Ｉ　ＳＡでは実際に、この数の細菌の検出が可能で、従って、予防的抗生物質治 療が必要な女性を判断する場合に役立つ感度を備えている。

プローブエピトープとしてモノラムノース構造を、また捕捉エピトープとしてト リラムノースまたはモノラムノースを用いるシングルサイトＥＬＩＳＡ及びツー サイトＥＬＩ　ＳＡの特異性調査を、腟のフローラの代表細菌についてのライブ ラリー（２７）を用いて行った。この結果を表５に示す。２．４Ｘ１０７ｃｆｕ ／試験の濃度、即ち、膣スワブに回収される細菌の数（２７）を超えるものが、 試験された。シングルサイ）ＥＬＩＳＡは緑膿菌と主に交差反応することが判明 した。緑膿菌は、腟のフローラの部分では通常は見つからないヒトの病原菌であ る。この生物は、ノーサイトＥＬＩＳＡではほとんど検出できなかった。このこ とは、非常に高い特異性を示している。どちらのＥＬＩＳＡでも重大な交差反応 性は見られなかった。

以下の実施例で説明する実験では、表５に示す連鎖球菌細菌の培養物の代表例と その他の細菌の培養物をインステイテユソトアーマンドフラソビール（Ｉｎｓｔ ｉｔｕｔ　Ａｒｍａｎｄ−Ｆｒａｐｐｉｅｒ、カナダ国ケベック州モントリオー ル）の品質管理研究所から入手した。

さらに、ＣＢＳ　（特にステロタイプ１８−ＷＨＯ番号１２３−８３５）の従来 の培養法を用いた。また細菌数も従来の方法により測定した（２４）。既知の数 の、表５に示す連鎖球菌細菌とその他の細菌を含む溶液を調製した。

実施例 本発明を、以下の非制限的な実施例により説明する。

実施例１ （抗原）免疫吸着剤を作成するための、ポリスチレン容器担体上への抗原捕捉剤 の固定化 ポリスチレンウェルとチューブを以下に示すように処理した。活性化させる担体 の表面を処理液でコーティングし、４℃で１６時間インキュベートした。この処 理液を捨て、被処理表面をＰ　Ｂ　Ｓ　Ｔ（１ｍｌ）で３回、ＴＢＳ（１ｍｌ） で１回洗浄し、さらにＴ　Ｂ　Ｓ　（５ｍｌ）で２回洗浄して、未結合の抗体を 除去した。こうして得られた免疫吸着剤を（３７℃で１時間）乾燥させ、４℃に おいてデシケータ中で保存した。

前述の固定化法には、下記のものを使用した。

（ａ）ポリスチレン担体（および付随処理液）ヌンク（Ｎｕｎｃ）（Ｎｕｎｃ　 １ｎｔｅｒ　Ｍｅｄ、デンマーク）の高結合性マイクロタイタープレート（ウェ ル洗浄処理液は、５ｐｇ／ｍｌの抗体捕獲抗体を含有する０、２ｍｌの炭酸水素 ナトリウム緩衝液（０，１Ｍ　ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９，６）から成る。）ヌンク イムノチューブ（処理溶液は、沖ｇ／ｍ＋の抗体捕獲抗体を含有する０、２５ｍ １）炭酸水素ナトリウム緩衝液（０，１Ｍ　ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９，６）から成 る。）（ｂ）　（Ｂ群連鎖球菌多糖類抗体のトリラムノースエピトープと直接反 応する）抗体捕獲抗体 既知の方法（１６）に従い、ＩｇＧ３モノクローナル抗体ＢＣＨ−４０６（ＩＡ ＦＢｉｏＣｈｅｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｃ、カナダ国ケベック州 うバル）を調製し、プロティンＡ−セファロース４Ｂカラム（アイ（Ｅｙ）らの 方法（１９））を用いて腹水から精製した。

実施例２ トリラムノース（抗体）免疫吸着剤の調製ニトリラムノース基を含む抗体捕獲剤 ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ（１−”２）α−Ｌ−Ｒｈａｐ（１−２）ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ− Ｄ−グルシトールは、合成（４）、及び、Ｂ群多糖類をフッ化水素酸水溶液によ る分解の両方により得た（３）。

室温で１．５ｍｌのＯ，ＩＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液中にａ　Ｌ　Ｒｈ ａｐ（１＝２）α−Ｌ　Ｒｈａｐ（］−２）ｃ＋−Ｌ　Ｒｈａｐ　Ｄ−グルシト ール（５０ｍｇ）を溶解し、制御過ヨウ素酸酸化法（１６）法に従って、アルデ ヒドを選択的に末端グルシトール残基に導入することによって、ａ　−Ｌ−Ｒｈ ａｐ（１→２）α−Ｌ−Ｒｈａｐ（１−”２）σ−Ｌ−Ｒｈａｐ−Ｄ−グルシト ールを活性化させた。１０分間の酸化反応後、０．５ｍｌのエチレングリコール を添加し、反応を停止させ、この溶液を４℃で２０分間放置した。この溶液を回 転式エバポレータ中（＜４０℃）で濃縮した。この濃縮物をセファデックス６１ Ｇカラム（Ｐａｒｍａｃｉａ）にかけ、水で溶出させ、低分子化合物から分離し た。この溶出物をＷａｔｅｒｓ　Ｒ４０３型示差式屈折計でモニターし、酸化オ リゴ糖に相当する溶出物画分を凍結乾燥した。

酸化されたトリラムノシト（４５ｍｇ＞を水（３ｍｌ）に溶解し、酢酸アンモニ ウム（５００ｍｇ）およびナトリウムシアノボロヒドリド（５０ｍｇ）と反応さ せた。この反応混合液を、０．１Ｍの水酸化ナトリウムでｐＨ９に調整し、この 溶液を３７℃で４８時間インキュベートした。アミノ基を含有する生成トリラム ノシトを、アルデヒドを含むトリラムノシト誘導体について前述した方法に従っ て精製した。精製したアミノ官能性トリラムノシトを対象として、ＴＮＢＳの変 法による分析（３０）を行うと、アミン基の取り込みが９０％を超えることが示 された。

アミノ官能性トリラムノシト（３５ｍｇ）を、０．１Ｍ炭化水素ナトリウム緩衝 液（５ｍｌ）に溶解し、この溶液を、５ｍ１（湿潤ゲル）のアフィゲル（Ａｆｆ ｉｇｅｌ）　１０（Ｎ−ヒドロキシスフシイミド型）（Ｂｉｏ−ｒａｄ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｉｅｓ、リッチモンド、ＣＡ）と共に４℃で１６時間振とうした。

得られたゲルを水及びＰＢＳで洗浄し、０．０３５アジ化ナトリウム含有ＰＢＳ 中に懸濁して４℃で保存した。取り込まれたトリラムノシトの量（５ｍｇトリラ ムノシト／ｍｌ湿潤ゲル）は、ハプテン結合ゲルの水洗浄液から回収した未反応 オリゴ多糖の量から計算した。

実施例３ モノラムノース（抗体）免疫吸着剤の調製：モノラムノース基を含む抗体捕獲剤 Ｌ−ラムノース（Ａｌｄｒｉｃｈ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｏｍｐａｎｙ　Ｉｎｃ 、ライスコンシン、ＵＳＡ）は、フオルンステド（Ｆｏｒｎｓｔｅｄ）及びボラ ース（Ｐｏｒａｔｈ）の方法（２０）を利用し、蒸留水で注意深く洗浄した、１ ００ｍ１のセファロースＣＬ−４Ｂカラムを、ｐＨ１１の０．５Ｍカルボン酸緩 衝液及び１０ｍ１のジビニルスルホンブリッジ（ＤＶＳ、　Ａｌｄｒｉｃｈ　ｃ ｈｅｍｉｃａｌｃｏｍｐａｎｙ、　ＵＳＡ）と共にインキュベートすることによ って、セファロースＣＬ−４Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅ ｍｉｃａｌｓ、　Ｄｏｒｖａｌ、　Ｑｕｅｂｅｃ、　Ｃａｎａｄａから入手でき るゲルの商標）にカップリングさせた。この混合液を、撹拌しながら室温で７０ 分間放置し、続いてガラスフィルターに移して蒸留水で注意深く洗浄した。

活性化させたこのゲル（ｌｏｏｍｌ）に、ｐＨ１０の０．５Ｍカルボン酸緩衝液 中の、２０％（Ｗ／Ｖルーラムノース溶液］００ｍ１を添加して、室温において 一晩力・ノブリング反応を進行させた。この生成物をガラスフィルター上でさら に蒸留水で洗浄し、ｐＨ８，５の０．５Ｍ炭酸水素緩衝液に懸濁した。２ｍｌの ２−メルカプトエタノールを、懸濁液１００ｍ１に対してそれぞれ添加した。２ 時間後にふたたび生成物を回収し、蒸留水で注意ｌ朶く洗浄した。

実施例４ 免疫原複合体の調製： Ｂ群連鎖球菌多糖類抗体−タンパク質複合体既存の方法（５）に従って、Ｂ群連 鎖球菌（菌株ＡＴＣＣ１２４００すなわち菌株０９０タイプＩａ、菌株ＡＴＣＣ １２３８６すなわち０９０ＲのＢ群）を増殖させ、既存の方法（５）に従って培 養上清からＢ群連鎖球菌多糖抗原を得た。１０９ｃｆｕにおけるＧＢＳの希釈液 は、コロニーカウント法によって調製した。

このＢ群連鎖球菌多糖抗原（１２０ｍｇ）を、塩基を用いて部分的に解重合した 後（５０℃で５ｍｌの水酸化ナトリウムと３０分反応）、この溶液をレキシン（ Ｒｅｘｉｎ）　＋０１（Ｈ＋）イオン交換樹脂で中和し、透析し凍結乾燥した。

このときの残渣をｐＨ８，８の０．２Ｍ硫酸アンモニウム液（２ｍｌ）に溶解し 、ｌＯ単位のアルカリフォスファターゼ（Ｅ、Ｃ，３，１，３，１）（Ｍｉｌｌ ｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ、、　Ｆｒｅｅｈｏｌｄ、　ＮＪ）を用いて室温で１６時 間処理した。冷フェノールで抽出を行い過剰の酵素を除去して、残った水溶液を 透析し凍結乾燥した。末端部アルデヒド基を、部分的に解重合させたＢ群抗原に おける末端Ｄ−グルシトール残基へ導入する方法は、制御過ヨウ素酸酸化法（２ ９）に従った。前述のＢ群連鎖球菌多糖抗原（１００ｍｇ）を水（１０ｍｌ）に 溶解し、室温において等容量の００２Ｍメタ過ヨウ素酸ナトリウムで８分間処理 した。このとき、エチレングリコール（２０ｍｌ）を添加して過剰の過ヨウ素酸 を分解し、この溶液を４℃で２０分間放置してから凍結乾燥した。過ヨウ素酸へ さらしても、Ｂ群連鎖球菌多糖抗原の抗原性に対しては有害な影響が及ばなかっ たことは、０ｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ免疫拡散実験において、酸化多糖が、Ｂ群連 鎖球菌多糖抗原特異性のウサギ抗血清に対して沈降能力を維持していたことによ り判定した。

酸化されたＢ群連鎖球菌多糖抗原（５０ｍｇ）を、ｐＨ８，２の０．１Ｍ炭化水 素ナトリウム緩衝液１ｍｌに溶解し、前述の方法（２９）に従って、ｌｏｍｇの Ｂ　Ｓ　Ａ　（Ｓｔ、ＬｏｕｉｓのＳｉｇｍａ社から入手したウシ血清アルブミ ン）または（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ　Ａｒｍａｎｄ　Ｆｒａｐｐｉｅｒ。

Ｌａｖａｌ、Ｑｕｅｂｅｃから入手した破傷風トキソイド製剤から得られる）単 量体■を同緩衝液１ｍｌ中に添加して溶解した。この溶液にシアノボロ水素化ナ トリウム（ｓｏｄｉｕｍ　ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）　（１５ｍｇ） を添加し、マグネチツクスターラーを用いて室温で４日間撹拌を続けた。この複 合体を、Ｂｌｏ−Ｇｅ１　Ａ−５ｍ（２００−４００メツシユ）カラム（１，６ Ｘ　９０ｃｍ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎ ｄ、ＣＡ）を用しゝ、溶離剤として水を使用してゲル濾過法により精製した。カ ラムから溶出した両分を、Ｗａｔｅｒｓ　Ｒ４０３型示差式屈折計と、２８０ｎ ｍにおけるＵ、Ｖ、分光計によってモニターした。このカラムを使用して、複合 体から過剰の多糖類抗原を分離し、複合体と汀またはＢＳＡの溶出プロフィール を比較すると、全体が複合体状態であることが示された。Ｂ群連鎖球菌多糖−タ ンパク質複合体を含有する両分を個々にプールし、透析および凍結乾燥を行った 。この複合体におけるタンパク含量をローリ−（Ｌｏｗｒｙ）法（３１）に従っ て測定し、炭水化物の含量をＢ群連鎖球菌多糖抗原を標準物質として、Ｄｕｂｏ ｉｓ法（３２）に従って測定した。■のタンパク／多糖比は１２．４となり、Ｂ ＳＡでは１３．０となった。複合体の純度は、ゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｏｓ ｅ　１２　ＨＲＩＯ／３０．　Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用しまたＦＰＬＣ（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ）　）こよって確認した。　膣フローラ（ｖａｇｉｎａｌ　ｆｌ ｏｒａｌ（２７）の代表種（表５参照）を含有する一連の細菌については、Ｉｎ ５ｔｉｔｕｔｅ　Ａｒｍａｎｄ　Ｆｒａｐｐｉｅｒ、　Ｌａｖｅｌ、　Ｃａｎａ ｄａｋこよって調製した００．１５Ｍの塩化ナトリウム中における１０９ｃｆｕ ／ｍｌの希釈液は、ＭａｃＦａｒｌａｎｄ光学密度法により調製した。この細菌 に最終濃度２％のホルマリンを添加して殺菌し、使用時まで一８０℃で保存した 。ＣＢＳの抗原型は以下のとおりであった。

５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃ＋ｉａｅ　Ｉａ（ＡＴＣＣ１２４０ ０）、　Ｉｂ　（ＡＴＣＣ１２４０１）、　ＩＩ（ＡＴＣＣP２９７３）。

ＩＩＩ（ＡＴＣＣ＋２４０３） 実施例５ 免疫原複合体の調製： モノラムノースーＢＳＡ複合体及びトリラムノース−ＢＳＡ複合体５−メトキシ ペンチルでＤ−グルシトール誘導体を置き換え、相当するｌ−〇−Ｄ−グルシド ールーα−Ｌ−ラムノピラノシド及び１−０−Ｄ−グルシド−ルーａ　Ｌ）リラ ムノピラノシド誘導体を合成する過程において使用することを除いては、前述の 方法（７）に従って、５−メトキシカルボニルペンチルーα−Ｌ−ラムノピラノ シド及び５−メトキシカルボニルペンチル２−０［２０（ａ　Ｌ−ラムノピラノ シル）−α−Ｌ−ラムノピラノシル］−α−Ｌ−ラムノピラノシドを調製した。

前述のオリゴ糖メチルエステノ喧１００ｍｇ）およびヒドラジン水化物（５００ ｐｌ）の無水エタノール（２，５ｍ１）中の溶液を０℃に２０時間維持した。こ の溶液を減圧下濃縮し、水溶液からの凍結乾燥によって、ヒドラジンの痕跡量を 最終的に除去した。無定形の残渣を、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（４ｍｌ） 中で一５０℃まで冷却し、ジクロロメタン（１００ｍｌ）中の四酸化二窒素（Ｎ ２０４）（４，６ｇ）を添加した。温度を一１０℃から一２０℃に１５分間維持 し、反応混合液を０℃でＢ　Ｓ　Ａ　（３００ｍｇ）の水性緩衝液（２０ｍｌ） （ｐＨ９）へ直接添加した。この溶液を０℃に１２時間維持し、透析及び凍結乾 燥を行った。

複合体の炭水化物含量は、システィン−硫酸法（２７）によって測定した。両夜 合体におけるＢＳＡ分子一つ当り約４０ハプテンが取り込まれていることが示さ れた。

実施例６ 抗原標識剤の調製： モノラムノースエピトープに対するポリクローナル抗体誘導体、即ち、セイヨウ ワサビ由来ペルオキシダーゼと結合させた抗体（Ａ）抗体誘導体の調製 ポリクローナル抗血清は、サフォーク（Ｓｕｆｆｏｘ）ヒツジを、２部のフロイ ントコンプリートアジュバント（Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、０ｒ ａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、ＵＳＡ）と、　０．５ｍｇのＣＢＳ多糖−破傷風トキソ イド複合体を含有する１部のＰ　Ｂ　Ｓ　（０，０５ＭのＮａ２ＨＰＯ４／　Ｎ ａＨ２ＰＯ４，ｐＨ７，４，０，１５Ｍ　ＮａＣＩ）とのエマルジョンを用いて 経皮的に免疫して得た。この複合体はホルマリンで殺菌したＢ群連鎖球菌よりも 抗原性が高いことが判明した。注射後７４日に大量に採血し、この全血から抗血 清７５０ｍ１を（通常の方法で）分離し、この抗血清を使用時まで一７６℃で保 存した。

Ｂ群連鎖球菌多糖抗体のモノラムノースエピトープと相互作用をする抗体画分を 、以下に述べる一連の操作に従って、上記のヒツジ抗血清から単離した。

ステップ１ 免疫血清２５０ｍ１を２×緩衝液Ａで２倍に希釈し、３．５ｃｃのＲｈａ３カラ ムを通した（５ｍｌ／ｈｒ、　４℃）。トリラムノース（抗体）免疫吸着剤（本 明細書に記載したもの）を含有するＲｈａ３カラムは、０．０５ＭのＮａＨ２Ｐ Ｏ４／ＮａＨＰＯ４，０，３Ｍの塩化ナトリウムおよび０．０１％アジ化ナトリ ウムから成るｐＨ７，４の緩衝液（緩衝液Ａ）を使い、あらかじめ平衡化した。

ステップ２ ステップ１においてＲｈａ３カラムを通した流体画分を一緒にして、（１２ｍｌ ／ｈｒ４℃で）Ｒｈａｌカラムのベッドを通した。このＲｈａｌカラムは、あら がじめ緩衝液Ａで平衡化した１５ｃｃのモノラムノース（抗体）免疫吸着剤（本 明細書に記載したもの）のベッドを含有していた。緩衝液Ａ中０．１Ｍのα−Ｌ −ラムノースによるベッドの溶出により、溶出の第１〜９ベツド容積の間に（モ ノラムノース結合性の）画分が生じた。５５６ｍｇのタンパクを含有する、この （モノラムノース結合性の）画分（１１９ｍｌ）は、緩衝液２Ｌに対し７回にわ たり透析を行い、α−Ｌ−ラムノースの痕跡量を全部除去した。

ステップ３ ステップ２で得られた（モノラムノース結合性の）透析画分をステップｌで述べ たＲｈａ３の別のカラムに通した。Ｒｈａ３カラムを通した両分を回収したとこ ろ、アプライしたタンパクのうち４０１ｍｇすなわち８１％が両分に含まれるこ とが判明した。

前述のようなアフィニティー精製法によって（通常の方法で）得られた抗体誘導 体を、セファクリルＳ　−３００カラムを用いたゲル濾過で評価した。セファク リルＳ　−３００スーパーフアイン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｃａｎａｄａ）Ｉｎ ｃ、　、Ｄｏｒｖａｌ、Ｃａｎａｄａ）のカラム（１，６Ｘ　１００ｃｍ）を、 ＨＢＳ緩衝液（０，３Ｍの塩化ナトリウムおよび０．０１％アジ化ナトリウムを 含有する０、０５ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７，４）で平衡化した。このカラ ムを、市販の、分子量が１，３釦ダルトンから６７０，０００ダルトンの範囲の ゲル濾過標準物質混合物（ＢｉｏＲａｄ　１ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍｉｓｓ ｉｓａｕｇａ、Ｃａｎａｄａ）を用いて校正した０ＨＢＳに溶解した精製抗体１ ３．８ｍｇを、５ｍｌ／ｈｒの流速において４℃でゲルに通し、溶出したタンパ ク質の位置を２８０ｎｍにおける吸光度から読みとった。アプライしたタンパク 質の９３％を含有する単一の所要主要ピークが、標準ＩｇＧと同一の溶出体積で 回収された。アプライしたタンパクの２％を含有する分子量約５０００の小さい ピークが発生した。これらの結果から、この精製方法においては、ＩｇＧと同一 のタイプの抗体が高い純度で得られることが示された。（ポリクローナル）抗体 誘導体の特異性を測定したところ、マイクロタイタープレートに結合した［ラム ノース（１−２）ラムノース（１−２）ラムノース］の牛血清アルブミン複合体 には、結合できないことが判明した。しかし、［Ｌ−ラムノース−１−］　また はＢ群連鎖球菌多糖抗原ユニットを含有する複合体では、強い反応性が詔められ た。よって、得られた抗体は、Ｂ群連鎖球菌多糖抗原上に認められる末端モノラ ムノース基と反応している。

（Ｂ）抗体標識剤の調製 セイヨウワサビ由来ペルオキシダーゼ（すなわち過酸化水素酸化還元酵素、ＥＣ １，１１土万を、還元的アミノ化法（１５）を使用して、得られた抗体誘導体（ 画分）と結合させた。但し、ＮａＢＨ４の代わりにＮａＣＮＢＨ３を使用した。

また、セイヨウワサビ由来ペルオキシダーゼと抗体の初期反応比をも２：１とし て反応させた。

このあと、単純透析を行い、ＮａＣＮＢＨ３などの残留反応物をすべて除去した 。

実施例７ トリラムノースエピトープ特異性抗体及びモノラムノースエピトープ特異性抗体 の調製 トリラムノースエピトープ特異性抗体及びモノラムノースエピトープ特異性抗体 は、前述したトリラムノース（抗原）免疫吸着剤等を使い、適切なウサギ高血清 をアフィニティークロマトグラフィー処理することにより、以下のように得た（ 分離及び精製した）。

（ａ）ウサギ抗血清の調製 ニューシーラント白色ウサギを、マクカーティ（ＭｃＣａｒｔｙ）及びランスフ ィールド（Ｌａｎｃｅｆｉｅｌｄ）らの方法（３３）に従ってホルマリン殺菌し た生物全体（菌株０９０Ｒ／ＡＴＣＣ１２３１１１６）で免疫した。Ｇ　Ｂ　Ｓ 　１／１８　：　６／Ｄ＋と表示される、ＣＢＳ多糖（１６）に対するマウスＩ ｇＧモノクローナル抗体が腹水中に生成し、プロティンＡアフィニティークロマ トグラフィーにて精製した。腹水は、プリスタン感作Ｂａ１ｂ／ｃマウスにハイ プリドーマ細胞を注入することにより生成させた。

（ｂ）トリラムノシトエピトープに対するポリクローナル抗体のアフィニティー 精製 トリラムノシト結合ゲル（３，５ｍＬ）を含有するカラム（直径１ｃｍ）を、Ｐ ＢＳで平衡化した。ＰＢＳで１．ｌに希釈したウサギ抗血清を５ｍｌ／ｈの流速 でカラムに流した。続いて、カラムを一連の緩衝液（Ａ：Ｂ、ｃ及びＤ）を使い 、５〜ｌＯ倍のベッド容量の各緩衝液で溶出した。溶出プロフィールは表３に示 し、タンパク質についてはＵＶ分光計にて２８０ｎｍで測定した。末端部のし一 ラムノースに特異的な抗体については、ＰＢＳ中に０．２Ｍのし一ラムノースを 溶解させた緩衝液Ａで溶出した。未確認タンパクについては、ｐＨ］０．５の０ ，１Ｍグリシンを含有する緩衝液Ｂで溶出した。緩衝液Ｃ（ｐＨ］、１．ｏ、０ ．１Ｍのグリシンを含有）を用いてさらに溶出したところ、少量の未確認タンパ クを得た。トリラムノースに特異的な最終抗体は、緩衝液Ｄ（ｐＨ１１，５，０ ，１Ｍのグリシンを含有）を使用して得た。緩衝液Ａ及び緩衝液りを用いて得ら れた二つの抗体画分の特異性は、ラムノシト−ＢＳＡ複合体及びトリラムノシト −ＢＳＡ複合体を用いてＥＬＩＳＡ法（後述）により確証した。同棲合体の調製 については前述のとおりである。緩衝液Ａによって溶出した抗体画分は、同棲合 体と反応し、緩衝液りによって溶出した抗体画分は、トリラムノシト−ＢＳＡ複 合体とのみ反応した。ほかの画分は、いずれの複合体とも反応しなかった。

（Ｃ）モノラムノース含有エピトープに対するポリクローナル抗体のアフィニテ ィー精製 ＣＢＳ多糖類−破傷風トキソイド複合体で免疫してから３力月後に採取したヒツ ジ血清は、Ｂ群連鎖球菌多糖−ＢＳＡ、）リアムノシルーＢＳＡ及びモノラムノ シル−ＢＳＡのユニットに対する抗体について高い力価を示した。表１に、モノ ラムノシル含有エピトープに対するポリクローナル抗体の血清からの分離につい てまとめて示す。

表Ｉ　ＧＢＳ多糖に対するポリクローナル抗体の精製ｎｄ測測定れなかった まず、α−Ｌ−（１−２）〜トリラムノシトユニットを含有するアフィニティー ゲルに血清を通すことにより、σ−Ｌ−トリラムノシトに結合する抗体を除去し た。これは、緩衝液Ａ（０，０５ＮのＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４，ｐＨ７ ，４，０，３０Ｍ塩化ナトリウム及び０．０１％アジ化ナトリウム）で、アフィ ニティーゲルの３．５ｍｌのカラムを平衡化し、等容量の２×緩衝液Ａを用いて 希釈した免疫血清２５０ｍ１を、４℃において流速５ｍｌ／ｈｒでゲルに通した 。この過程により、抗ラムノシル結合抗体のうち９３％以上を除去した。同時に 、ゲルに抗ラムノース結合活性が約６３％保持された。このことは、多糖抗原（ ６）における枝分かれしていない（末端の）及び／または枝分がれしている（内 部の）トリラムノースユニットの（末端部の）ラムノースが、血清中に存在する 抗モノラムノース結合活性の大半を占めることを示している。抗モノラムノース 結合活性の残部（約３７％）を含有するフロースルー画分を、モノラムノースユ ニットを含むアフィニティーゲルに通し、Ｏ，ＩＭのし一ラムノースで溶出する と、５５６ｍｇのタンパクを含有するりンバク質画分が放出された。続いて、透 析を行ない、ラムノースを除去し、溶出したタンパク質両分を、α−Ｌ−（１− ２）−）リラムノシドアフィニテイ力ラムに再び通し、少量残っている抗トリラ ムノピラノシド結合活性の残留分（元の約５％）を除去した。２度目のトリラム ノシトカラムのフロースルー画分を合わせ、５０％グリセロールに調整して一２ ０℃で保存した。トリラムノシル−ＢＳＡ及びラムノシル−ＢＳＡでコーティン グしたマイクロタイタープレートを使い、ＥＬＩＳＡ法によってアフィニティー カラムからの抗体収率を測定した。最終精製画分は、オリジナルの抗モノラムノ ース結合活性に対して２８．５％の活性を示すＰＡｂを４０］ｍｇ含んでいた。

精製抗体を校正済みのゲル濾過カラムを通すことにより、溶出したタンパク質の ほとんど全体（９７，９％）がＩｇＧから成ることが示された。

実施例８ 試料綿棒（ｓｐｅｃｅｍｅｎ　ｓｗａｂ）から採取したＢ群連鎖球菌（多糖抗原 ｌ細菌）の測定用ＥＬＩＳＡタイプ検定 試験法は、以下に示したステップから構成された。

１、細菌溶液５０□１をレーヨン綿棒（Ｓｔｒａｐｌｅｘ）上にアプライし、試 料綿棒を抗体でコーティングした免疫検定チューブまたはマイクロタイタープレ ートウェルへ入れる。マイクロタイターウェル（Ｉｍｍｕｎｏ　４．　Ｄｙｎａ ｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、。

Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、　ＵＳＡ）を、Ｏ，ＩＯＭ　Ｎａ２ＨＣＯ３／Ｎａ２ＨＣ Ｏ３緩衝液、ｐＨ９，６に溶解した抗体で、４℃において一晩コーティングし、 ０．０５％Ｖ／ＶのＴｗｅｅｎ−２０（Ｐ　Ｂ　Ｓ　Ｔ）を含有するＰＢＳで３ ７℃において１時間ブロックし、ＰＢＳＴで３回洗浄してからＰＢＳで３回洗浄 して、３７℃で１時間乾燥させる。

２．２Ｍの硝酸ナトリウムを１００μｍ添加する。

３．０．１Ｍの酢酸を１００μｌ添加する。

４、綿棒を適宜回転させながら５分間置く。

５．０２％のＴｗｅｅｎ　−２０を含有するｐＨ７，４の００２Ｍ塩化トリスを ５０μｌ添加する。

６．１００μｍのペルオキシダーゼ複合体溶液（ｐＨ７，４の０．０２Ｍ　トリ ス塩酸、０．１５Ｍ塩化ナトリウムから成り（すなわちＴＢＳ）、１％正常ヒツ ジ血清、及び、標識剤としてペルオキシダーゼ標識ポリクローナル抗体誘導体１ 　ｐ　ｇ／ｍＬ（前述のとおり）を含む）を添加する。

７、綿棒を適宜回転させながら１０分間置く。

８、綿棒を廃棄し、免疫検定チューブまたはマイクロタイターウェルを、０．０ ５％ＴＷＥＥＮ　−２０を含有する（６Ｘ）ＴＢＳで洗浄する。

９、テトラメチルベンジジンｌ過酸化水素から成る基質を、ボス（Ｂｏｓ）らの 方法（２６）に従って添加する。

１０、１０分後に、チューブｌウェル上の青色の発色を肉眼で観察する。または 、１５分後にＢｉｏ−Ｔｅｋ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｉｎｃ、、Ｖｅｒｍｏ ｎｔ社製の分光光度計を使って、６５０ｎｍでマイクロタイターウェルを測定し た。感度をあげるためにはＩＮ硫酸１００１１１を添加して、４５０ｎｍでマイ クロタイターウェルを測定する。免疫検定チューブを使う場合は、３Ｎ硫酸を５ ０□１添加して、酸の添加後に、基質溶液を、コーティングしていないマイクロ タイターのプレートに移して測定する。

抗原に対する抗体の結合性を測定するために、２μｇ／ｍｌの多糖−ＢＳＡ複合 体を１００μｌでコーティングした。ＰＢＳＴで希釈した抗体く１００μｌ）を 各ウェルにピペッティングし、３０分後にウェルを５回、ＰＢＳＴで洗浄した。

Ｆｃ特異性のウサギ抗ヒツジＩ　ｇ　Ｇ　（１００μＩ）（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉ ｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ、、Ｗｅｓｔ　 Ｇｒｏｖｅ、ＵＳＡ）を添加し、３０分後に再びＰＢＳＴでウェルを５回洗浄し た。各ウェルに、ペルオキシダーゼに対するＨ２Ｏ２／テトラメチルベンジジン 基質（２６）を添加して、１５分後に６５０ｎｍでの吸光度を読みとった。

実施例９ Ｂ群連鎖球菌多糖抗原の測定における、亜硝酸による抽出の及ぼす影響実施例８ に示したＥＬＩＳＡ法に続いて、Ｂ群連鎖球菌細菌をＩ　Ｘ　１０６ｃｆｕ含む 細菌の試験試料を使って試験を行った。ただし、ステップ１から５までは、コー ティングしていないマイクロタイタープレートを使い、ステップ４における抽出 時間については、表２に示したようにさまざまな時間をとった。表２で示した抽 出時間の終了時に、抽出物を、前述のようにＩｇＧ３モノクローナル抗体／ＢＣ Ｈ−４０６でコーティングしたマイクロタイターウェルに移した。試験の結果の アウトラインを次の表２に示す。

表２　亜硝酸によるＢ群連鎖球菌の、抽出時間に及ぼす影響抽出時間　吸光度　 吸光度　抽出率 ６５０ｎｍ　ゼロ　１の　を　し　いた　％　０１　ｍｘｔｏ　０．１０１　０ ．０００　０ ２．５　０．２１１　０．１１０　４６．８Ｓ　Ｏ，３２１０，２２０７３，６ ＋０　０ｉ１７　０．２４６　１１２１２０　０．３９３　０．２９２　９７． ６１Ｌ−一一上且り一−１上９−−−−−−−−−１１上−実施例１Ｏ Ｂ群連鎖球菌を対象とした実施例８のＥＬＩＳＡ法では、Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅ、 ＦおよびＧ群連鎖球菌細菌由来の市販の抽出物（Ｄｉｆｃｏ　Ｃｏ、Ｌａｂｏｒ ａｃｏｒｉｅｓ、ＤｅｔｒｏｉｔＭｉｃｈｉｇａｎ　Ｕ、Ｓ、Ａ）を使用した。

これらの抽出物は、連鎖球菌にお番する各タイプの多糖類を含む。マイクロタイ ターウェル方式に従って試験を行ったところ、Ｂ群連鎖球菌からの抽出物は、１ １５０．１／１００．１／２００．１／４００．１／８００．１／１６００およ び１／３２００の各希釈範囲において、１．００（６５０ｎｍ）を超える吸光度 変化を示した。このほかの群においては、抽出物が陽性を示すことはなかった。

実施例１１ 実施例８におけるＥＬＩＳＡ法を、既知数のホルマリン殺菌Ｂ群連鎖球菌、８群 血清型１０（ＧＢ５１ｇ）と、正常ヒト糞便中細菌Ｅ、ｌｅｎｔｕｍを使用して 評価した。

各試験において、Ｏ，１５ＭのＮａＣｌ３０μｍ中の細菌を、微生物学用綿棒（ Ｓｔａｒｐｌｅｘ　Ｐｌａｉｎ　５．０９　ｆｒｏｍ　５ｃｉｅｎｔ山ｃ、　Ｍ ｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、　０ｎｔａｒｉｏ、　Ｃａｎａｄ＝jへ各検定法 実施直前にアプライした。前述のごとく活性化した免疫検定チューブ（Ｎｕｎｃ ）において、検定を行った。比較の目的で、Ｂｉｎａｘ　Ｋｉｔも使用した。結 果は表３に示す。

表３　Ｂ群連鎖球菌およびＥ、ｌｅｎＬｕｍの検出細菌ＣＦＵ　Ｘｌ０Ｉ　ＥＬ 　Ｉ　ＳＡ　Ｂ１ｎ１ｘ室吸光度（１５０ｎｍｌ　吸光度（４５ｈｍ）ＧＢＳ　 ｌ　Ｏ，６３４０，４２８０，ｉ８４　０．０３４３　０．６＋５　０．４０９ 　０．１６７　０．０１７１０　２．１１２　２．２３６　０．１５Ｇ　Ｏ，０ ００３０＞３．０００　＞３．０００　０．５６０　０．４１０Ｅ、ｌｅｎｔｕ ｍ　２００Ｇ　０．２５０　０．０４４　０．０２１　０．０６１４０００　０ ．２＋８　０．０４２　０．１５０　０．ＯＯＱ”’Ｅｑｕａｔｅ　５ｔｒｅｐ 　Ｂ”キット（Ｂｉｎｄｅｘ、　５ｏｕｔｈ　Ｐｏｒｔｌａｎｄ、Ｍａｒｉｎｅ 、Ｕ、Ｓ、Ａ）を使い、キットに書かれた検定法のアウトラインに従って試験を 行った。

ネット、吸光度の全体値からブランクの値を引いたもの。

綿棒（膣由来）一つあたりのＥ、ｌｅｎｔｕｍの予測値は、約２Ｘ　ｌ０７ＣＦ Ｕである。すなわち、自然の状態において、膣フローラ（３４）に関して報告さ れている数に基づいている。前述の表３に示したように、免疫検定チューブを使 用した場合には、Ｅ、Ｉｅｎｔｕｍは、この範囲では、かろうじて検出可能なシ グナルを生じた。

実施例１２ 沈降反応阻害試験は、ウサギ抗血清をＰＢＳで１０倍に希釈した液１００μｌに 増加する種々の濃度の阻害剤を混合し、３７℃で１時間放置して行なった。抗原 過剰域において沈降する抗体の最大量より少し少量の沈降に十分な、Ｂ群多糖（ ０，５μｇ）を、最終容量が２００μｌとなるように添加した。カバット（Ｋａ ｂａｔ）及びメイヤー（Ｍａｙｅｒ）らの方法（３５）に従って、定量的な沈降 分析を行った。ＰＢＳで１０倍に希釈したウサギ抗Ｂ群多糖特異的血清を、多糖 を増加する種々の濃度で最終容量が２００μｌとなるように混合した（ＰＢＳで 調製）。チューブを３７℃で１時間放置し、４℃で４日放置したものを遠心分離 して、冷ＰＢＳで２回洗浄し、再び遠心分離して、ペレット中のタンパク質の量 をローリ−らの方法（３１）により測定した。

ポリクローナルウサギ抗Ｂ群連鎖球菌多糖血清と、相同性Ｂ群多糖の定量的沈降 反応により、１ｍｌ当’）　１．２ｍｇの多糖特異性の抗体が含まれていること が判明した。

当業者であれば、本発明の要旨をはずれることなく、抗原捕獲剤、抗原標識剤、 標識、炭水化物、（不溶性）担体（容器型を含む）、抗原固定化の量、抽出条件 、容器型担体の面積１体積比などのさまざまなパラメータを変更できることは明 らかであろう。

表４ オリゴ糖阻害剤の構造 （１）ａａ　−Ｌ−Ｒｈａｐ　ｌ−２ａ　−Ｌ−Ｒｈａｐ　ｌ−２ａ　−Ｌ−Ｒ ｈａｐ　ｌ−１°Ｄ−グルシトール３°−１ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ （２）　ａ　−Ｌ−Ｒｈａｐ　ｌ−２ａ　−Ｌ−Ｒｈａｐ　ｌ−２ａ　−Ｌ−Ｒ ｈａｐ　ｌ−１’Ｄ−グルシトール（３）　α−Ｌ−Ｒｈａｐ　ｌ−２α−Ｌ− Ｒｈａｐ　ｌ−２α−Ｌ−Ｒｈａｐ　ＯＭｅ（４）　ａ　−Ｌ−Ｒｈａｐ　ｌ− ２ａ　−Ｌ−Ｒｈａｐ　ＯＭｅ（５）　ａ　−Ｌ−Ｒｈａｐ　！−２ａ　−Ｌ− Ｒｈａｐ　ｌ−１’Ｄ−グルシトール３°−１ａ　−Ｌ−Ｒｈａｐ表４（続き） α−Ｄ−Ｇａｌｐ （８）　ａ　−Ｌ−Ｒｈａｐ　ｌ−３ａ　−Ｄ−Ｇａｌｐ　１−３β−Ｄ−ＧＩ ｃｐＮＡｃ　α−Ｌ−Ｒｈａｐ　ＯＭｅ（９）　ａ　−Ｄ−Ｇａｌｐ　１−３β −Ｄ−ＧｌｃｐＮＡｃ　１−４　ａ　−Ｌ−Ｒｈａｐ　ＯＭｅ（１０）　Ｄ−グ ルシトール　３’−１ａ　−Ｌ−Ｒｈａｐ（１１）β−Ｄ−ＧＩｃｐＮＡｃ　１ −４β−Ｌ−Ｒｈａｐ　ＯＭｅ（１２）　ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ　ｌ−４α−Ｌ−Ｒ ｈａｐ　ｌ−２α−Ｌ−Ｒｈａｐ　ＯＭｅ（１３）　α−Ｌ−Ｒｈａｐ　ｌ−３ α−Ｌ−Ｒｈａｐ　ＯＭｅ（１４）　ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ　ｌ−４ａ−Ｌ−Ｒｈａ ｐ　ＯＭｅ（１５）　ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ　ＯＭｅ （１６）　Ｌ−ラムノース （１７）　Ｄ−ガラクトース （１ｇ）Ｄ−グルシトール （１９）　Ｄ−グルコース （２０）　Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（２１）　ａ　−Ｄ−Ｇａｌｐ　１ −４　Ｄ−Ｇｌｕ（２２）　ａ　−Ｄ−Ｇａｌｐ　１−６　Ｄ−Ｇｌｕａ以前に 、オリゴ糖ＩＩＩと表示されている。

ｂ以前に、オリゴ糖ＩＩと表示されている。

表５　シングルサイトＥＬＩＳＡ法とツーサイトＥＬＩ　ＳＡ法の比較細菌　ソ ース　シングルサイト　ツーサイトＵｓ　６５０　ｎｍ ５ｔ＋ｅｐ＋ｏｕｃｕｉ　Ｂ　１２４０３’　＞２．０００　＞１．５００Ｓｌ ＋ｅｐｌｏｕｃｃｕｓ＾　１９６１５＋　、０Ｇ２　．００１Ｓｔｒｅｐｔｏｃ ｏｃｃｕｓ　ｅｑｕｉ　ＥＴＡ３　．０１１　．００１Ｓｌ＋ｅｐ＋ｏｃｏＣＣ ｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　６３０５　．０００　．００１１Ｋｌｅｂｓｉｅ ｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｔ１３８０　．０１７　、ＧＯＯＧｘ＋ｄｎｕｅｌ ｌａ　ｖｘｇｉｎｅｌｌａ　１４１０８　．０Ｇ５　．００３ＳｔａｐＪｌｏｃ ｏｃｕ＋　ｅｐｉｄｅｎｎｉ＋　１２２２８　．０１５　．０００Ｌａｃｌｏｂ ｘｃｉｌｌｕ＋　Ｉｅ＋ｍｅｎｆｕｍ　ＬＳＰＱ２　、Ｏｎ　、００ＩＣｉｎｄ ｉｄ２ａｌｂｉｃａ＋＋＋　１０２３１　．０００　．００１Ｅｕｂｚｃ＋ｅ＋ ｉｕｍ　ｌｅｎｌｕｍ　２５５５９　．０１？　、００８Ｐｅｐｌｏｉｔ＋ｅｏ ｌｏｕｃｕ＋　ａｎａｅ＋ｏｂｕ＋　ＬＳＰＱ　、ＯＮ　、００ＯＮｅｉ＋ｅ＋ ｉｘ　Ｈｎｏ＋＋ｈｏｅａｅ　１９４２１　．０Ｇ０　．００２Ｐ＋ｅｕｄｏｍ ｏｎｘｓ　２ｅｒａｇｉｎｏｓａ　２Ｎ５３　、Ｈｏ　、０４６Ｅｕｈｕｉｃｈ ｉ２ｃｏｌｉ　Ｋ−１２Ｃ−６０ＯＬＳＰ　、０５９　．０１ｇ＋、ＡＴＣＣＡ ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　Ｒｏｃ ｋｖｉｌｌｅ２、ＬＳＰＱ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　ｄｅ　５ａｎｔｅ　Ｐ ｕｂｌｉｑｕｅ　ｄｕ　Ｑｕｅｂｅｃ、　Ｓｔｅ、Ａｎｎｅ　ｄｅ　ＢｅPｌｅ ｖｕｅ。

ａｎａｄａ ３、ＥＴＡ　Ｅｃｏｌｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　Ａｇｒｉｃｏｌｅ、Ｓｔ、Ｈｙ ａｃｉｎｔｈｅ、Ｑｕｅｖｅｃ、ＣａｎａｄａＣＢＳ細菌はすべて、あらかじめ 低結合性タイタープレート（Ｌｉｎｂｒｏ／ＴｉｔｅｒｔｅｋＥＴＡ）のウェル 中で、亜硝酸抽出法により抽出された。２００μｌの０．１５Ｍ塩化ナトリウム 中の細菌、２５μｍの５．６Ｎ亜硝酸ナトリウム及び２５μＩの１．４Ｎ酢酸を 混ぜ、１５分間置き、ｐＨ１０，０の１．４Ｎ　）リス塩酸２５μｌで中和した 。この抽出液のうち２００□１の分液を、抗体でコーティングしたプレートに移 してＥＬＩＳＡ法を開始し、Ｂ群連鎖球菌を検出した。各抽出液（１００μｌ） の等価（２，４Ｘ　１０７ｃｆｕ）の分液を、モノラムノース特異性ポリクロー ナル抗体（シングルサイトＥＬＩＳＡ）Ｉμｌまたはトリラムノシト特異性モノ クローナル抗体（ツーサイトＥＬＩＳＡ）でコーティングしたプレートに移した 。ペルオキシダーゼ標識第二抗体を、両方の場合におけるモノラムノースエピト ープ特異性ポリクローナル抗体とした。

参考文献 １、　Ｍｏｒａｌｅｓ、　Ｗ、Ｊ、　ａｎｄ　Ｌｉｍ、　Ｄ、　（１９８７）　 Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｒｏｕｐ　Ｂ　ｓｔｒｅｐｔ盾モ盾モモ≠■ ｍａｔｅｒｎａｌ　ａｎｄ　ｎｅｏｎａｔａｌ　１ｎｆｅｃｔｉｏｎｓ　ｉｎ　 ｐｒｅｔｅｒｍ　ｐｒｅｇｎａｎｃｉｅｓ　ｗｉｔｈ　ｐｒ■高≠狽浮窒■@ｒ ｕｐｔｕｒｅ ｏｆ　ｍｅｍｂｒａｎｅｓ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ａ　ｒａｐｉｄ　１ｄｅｎｔｉｆ ｉｃａｔｉｏｎ　ｔｅｓｔ、　Ａｍ、　Ｊ、　０ｂｓｔｅｔA　Ｇｙｎｅｃｏｌ 、　１５７゜ １３−１６゜ ２、　Ｌａｎｃｅｆｉｅｌｄ、　Ｒ，Ｃ，１９３３，Ａ　ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａ ｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　≠獅п@ｏｔｈｅｒ ｇｒｏｕｐｓ　ｏｆ　ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ　５ｔｒｅｐｒｏｃｏｃｃｉ、Ｊ、Ｅ ｘｐ、Ｍｅｄ、５７：　５７１−５９５゜３、　Ｌａｎｃｅｆｉｅｌｄ、　Ｒ， Ｃ，１９３４，Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｏ ｆ　５ｐｅｃｉｆｉｃ@ｔｙｐｅｓ　ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ　ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ　（ｇｒｏｕｐ 　Ｂ）、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　５９：　４４１−４T８０゜ ４、　Ｌａｎｃｅｆｉｅｌｄ、　Ｒ，Ｃ，１９３ｇ、　Ｔｗｏ　ｓｅｒｏｌｏｇ ｉｃａｌ　ｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ｇｒｏｕｐ　Ｂ　ｈｅｍｏｌ凾嘯奄■ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ　ｗｉｔｈ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｂｕｔ　ｎｏｔ　１ｄ ｅｎｔｉｃａｌ、　ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　５ｕｂｓ狽≠獅モ■刀A　Ｊ 、　Ｅｘｐ。

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（１９８８）　Ｍｕｌｔｉａｎｔｅｎｎａｒｙ　ｇｒｏｕｐ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ 　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｏｆ　ｇｒｏｕｐ　Ｂ　Tｔｒｅｐｔｏｃｏ ｃｃｕｓ。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２７．５３４１−５３５１゜７、　Ｐｏｚｓｇａ ｙ、　Ｖ、　ａｎｄ　Ｊｅｎｎｉｎｇｓ、　Ｈ，Ｊ、、　１９８８　”５ｙｎｔ ｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｏｌｉｇｏｓａｃｃ■≠窒奄р■■ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　Ｃｏｍｍｏｎ　Ｐｏ１ｙｓａｃｃ ｈａｒｉｄｅ　Ａｒｕｉｇｅｎ　ｏｆ　Ｇｒｏｕｐ　ＢＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ ｉ”　ＬＯｒｇ、　Ｃｈｅｍ、　５３：　４０４２−４０５２゜８、Ｃｕｒｔｉ ｓ、Ｓ、Ｎ、ａｎｄ　Ｋｒａｕｓｅ、Ｒ，Ｍ、（１９６４）Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ 　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅ氏@ｇｒｏｕｐ Ｂ　ａｎｄ　Ｇ　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　 １２０．６２９−６３７゜９、　Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇｅｒ、　Ｍ、、　Ｄａｖ ｉｅ、　Ｊ、Ｍ、　ａｎｄ　Ｋｒａｕｓｅ、　Ｒ，Ｍ、　（１９６７）　Ｃｒｏ ｓｓｒ■≠モ狽奄盾獅刀@ｏｆ ｔｈｅ　ｇｒｏｕｐ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ｏ ｆ　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ　ｇｒｏｕｐｓ　Ｂ　ａｎп@Ｇ　ｉｎ ａｎｔｉ−ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ　５ｅｒａ　ｗｉｔｈ　５ｐｅｃｉａｌ　 ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｒｏ　ｔｙｐｅ　ＸＸＩＩＩ　ａｎｄ@ｉｔｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ １０．　Ｙａｗｎ、　Ｂ、Ｐ、、　Ｙａｗｎ、　Ｒ，Ａ、　ａｎｄ　Ｈｅｎｎ４ ｎｇ　Ｔ、　（１９９０）　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｉｎ　窒浮窒＝j ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　ａ　ｒａｐｉｄ　ｇｒｏｕｐ　Ｂ　５ｔｒｅｐｔｏｃ ｏｃｃｕｓ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｔｅｓｔ、　Ｆａｍｉｌ凵@Ｐｒａｃｔｉｃ ｅ　２２゜ １２２−１２４゜ １１、　Ｈｏｐｐｅ、　Ｊ、Ｅ、、　Ｌｉｎｄｅｎａｕ、　Ｃ，ａｎｄ　Ｈｏｆ ｌｅｒ、　Ｗ、　（１９８９）　Ｒａｐｉｄ　ｄｅｔｅｃｔ奄盾氏@ｏｆ　ｇｒ ｏｕｐ Ｂ　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ　ｉｎ　ｖａｇｉｎａｌ　ｓｗａｂｓ　ｏｆ　ｐ ａｒｔｕｒｉｅｎｔｓ　ｂｙ　１ａｔｅｘ　ｐａｒｔｉｃｌ■@ａｇｇｌｕｔｉ ｎａｔｉｏｎ。

Ｚｂｌ、　Ｂａｋｔ、　Ｈｙｇ、　Ａ　２７０．３７９−３８４゜１２、　Ｃｏ ５ｔａ−Ｃｒｕｚ、　Ｏ，、５ｅｓｓｏ、　Ａ、Ｍ、、　５ｈｒｉｋｒｉｓｈｎ ａ、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｆｒａｎｋ、　Ｅ、　（P９９０） Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｍｕｌｔｏｃｉｄａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ、　Ｎｅ ｗ　Ｊｅｒｓｅｙ　Ｍｅｄ、　８７．１２７−１２９゜１３、　Ｗａｒｄ、　Ｅ 、Ｓ、　Ｇｕｓｓｏｗ、　Ｄ、、　Ｇｒｉｆｆｊｔｈｓ、　Ａ、Ｄ、、　Ｊｏｎ ｅｓ、　Ｐ、Ｔ、　ａｎｄ　Ｗｉｎ狽■秩A　Ｇ。

（１９８９）　”Ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ａ　ｒｅｐｅ ｔｏｉｒｅ　ｏｆ　ｓｉｎｇｌｅ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕ撃奄氏@ｖａｒｉａ ｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ　５ｅｃｒｅｔｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｌａ　Ｃｏ １１″Ｎａｔｕｒｅ　３４１．５４４−５４６゜１４、Ｔｉｊｓｓｅｎ、Ｐ、（ １９８５）”Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄ　Ｌｈｅｏｒｙ　ｏｆ　ｅｎｚｙｍｅ　 ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ　Pｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｇｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ 　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ”　ｇｅｎｅｒａｌ@ｅｄｉｔｏｒｓ Ｂｕｒｄｏｎ、　Ｒ，Ｈ，ａｎｄ　Ｖａｎ　Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ、　Ｐ、Ｈ ，、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

１５、Ｗｉｌｓｏｎ、Ｍ、Ｂ、ａｎｄＮａｋａｎｅ、Ｐ、Ｘ、（＋９７８）Ｉｎ ：夏ｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｎｄｒｅｌａｔｅｄ　ｔｅｃｈｎｉ ｑｕｅｓ　（Ｗ）　Ｋｎａｐｐ、　Ｈ，Ｒｏｌｕｎｂａｒ　ａｎｄ　Ｇ、　Ｗｉ ｃｋ、　ｅｄｓ、）　ｐ、　Q１５ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒ山−Ｈｏｌｌａｎｄ　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ。

１６、　Ｆｅｌｄｍａｎ、　Ｒ，Ｇ、、　Ｌａｗ、　Ｓ、Ｍ、　ａｎｄ　５ａｌ ｉｓｂｕｒｙ、　Ｊ、Ｒ，（１９８６）　Ｄｅｔｅｃｔｉｏ氏@ｏｆ　ｇｒｏｕ ｐ Ｂ　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｉｎ　ｎｅｃｒｏｐｓｙ　 ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ　ｕｓｉｎｇ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　≠獅狽奄ｂ盾р凵@ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｓｔａｉｎｉｎｇ、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　 Ｐａｔｈｏｌ、　３９．２２３−２２６１７、　Ｘｏｈｌｅｒ、　Ｇ、　ａｎｄ 　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｃ，（１９７５）　”Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　ｃｕｌｔ ｕｒｅｓ　ｏｆ　ｆ浮唐■п@ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｏｆ　ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ　５ｐｅ ｃｉｆｉｃｉｔｙ”　Ｎａｔｕｒｅ　２５６．４９５゜ｔｇ、　５ｔａｈｌｉ　 ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄ　６． ３２．２９７−３０４．１９８０゜１９、　Ｅｙ、　Ｐ、Ｉ、　Ｐｒｏｗｃｒ、 　Ｓ、Ｊ、　ａｎｄ　Ｊｅｎｋｉｎ、　Ｃ，Ｒ，（＋９７８）　”ｌ５ｏｌａｔ ｉｏｎ　ｏｆ　垂浮窒■@ＩｇＧ１゜ ＩｇＧ２ａ　ａｎｄ　ＩｇＧ２ｂ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｆｒｏｍ　 ｍｏｕｓｅ　ｓｅｒｕｍ　ｕｓｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａｓｅｐｈａｒｏｓｅ ”　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１５．４２９−４３６２０、　Ｆｏｒｎ ｓｔｅｄｔ、　Ｎ、　ａｎｄ　Ｐｏｒａｔｈ、　Ｊ、　（１９７５）　Ｃｈａｒ ａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　５ｔｕｄｉｅ刀@ｏｎ　ａ　ｎｅｗ Ｉｅｃｔｉｎ　ｆｏｕｎｄ　ｉｎ　５ｅｅｄｓ　ｏｆ　ｖｉｃｉａ　ｅｒｖｊｌ ｊａ、　ＦＥＢＳ　ＬＥＴＴ、　５７．　ＩＢ７−１９１゜２１、　Ｐｏｒａｔ ｈ、　Ｊ、、　Ｌａａｓ、　Ｔ、　ａｎｄ　Ｊａｎｓｏｎ、　Ｊ、Ｃ，（１９７ ５）　Ｊ、　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、　P０３．４９゜ ２２、　Ｌａｍｍ１ｅｒ、　Ｃ，、Ｐｒｅｄｅ、　Ｃ，ａｎｄ　Ｂｉｏｄｅｌ、 　Ｈ，（１９８６）　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ撃盾■凵@２４゜ ９０３−９０４　”Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｍｕｒｏｌｙｔｉｃ　５ｏｌｕｂｉｉ ｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ　−Ｃ窒盾浮吹@−ｓｐｅ ｃｉｆｌｃ ａｎｔｉｇｅｎ″。

２３、５ｌｉｆｋｉｎ　Ｍ、、　Ｆｒｅｅｄｅｌ、　Ｄ、、　ａｎｄ　Ｇｉｌ、 　Ｇ、Ｍ、　（１９８２）　Ｄｉｒｅｃｔ　ｓｅｒｇｒｏｕ垂奄獅■@ｏｆ　ｇ ｒｏｕｐ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ：　ｆｒｏｍ　ｕｒｏｇｅｎｉｔａｌ　ａｎｄ　ｇａ ｓｔｒｉｃ　ｓｗａｂｓ　ｗｉｔｈ　ｎ１ｔｒｏｕｓ　ａｃ奄п@ｅｘｔｒａｃ 口ｏｎ　ａｎｄ ｔｈｅ　ｐｈａｄｅｂａｃｔｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｅｓｔ、Ａｍ、Ｊ 、Ｃｌ１ｎ、Ｐａｔｈｏｌ、７８，８５０−８５２゜２４、Ｊａｗｅｔｚ、　Ｅ 、、　Ｍｅｌｗｉｃｋ、　Ｊ、Ｌ、　ａｎｄ　Ａｄｅｌｂｅｒｇ、　Ｅ、Ａ、　 （１９８７）　”Ａ　ｒｅｖｉｅ浴@ｏｆ　ｍｅｄｉｃａ１ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｌ′１７ｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ、　Ｌａｎｇｅ。

２５、　Ｗｉｌｓｏｎ、　Ｍ、Ｂ、　ａｎｄ　Ｎａｋａｎｅ、　ＰＩＫ、　（１ ９７ｇ）　Ｉｎ：　ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ@ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　（Ｋｎａｐｐ、　Ｗ、、　Ｈｏ１ｕｂ ａｒ、　Ｈ，ａｎｄ　Ｗｆｃｋ、　Ｇ、、　ｅｄｓ、）　ｐA　１２５゜ Ｅｌｓｉｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ、　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ。

２６、　Ｂｏｓ、　Ｅ、Ｓ、、　Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｄｏｅｌｅｎ、　Ａ、Ａ、、 　ｖａｎ　Ｒｏｏｙ、　Ｎ、　ａｎｄ　５ｃｈｕｕｒｅ、　`、Ｈ，Ｗ、Ｍ。

（＋９８１）　３．３’　、５．５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉ ｎｅ　ａｓ　ａｎ　ａｍｅｓ　Ｌｅｓｔ　ｎｅｇａｔｉｖｅ@ｃｈｒｏｍｏｇｅ ｎ　ｆｏｒ ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｉｎ　ｅｎｚｙｍｅ　ｉｍｍ ｕｎｏａｓｓａｙ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　２．P８７−２０４゜ ２７、　Ｂａｒｔｌｅｔｔ、　Ｊ、Ｇ、　ａｎｄ　Ｐｏ１ｋ、　Ｂ、Ｆ、　（＋ ９１＋４）　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｆｌｏｒａ　ｏｆ　ｔｈ■@ｖａｇｉｎａ ｇｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　５ｔｕｄｙ、　Ｒｅｖ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ 、　６．５６７−５７２゜２８、　Ｈｏｒｎｉｃｋ、　Ｃ，Ｌ、　ａｎｄ　Ｋａ ｒｕｓｈ、　Ｆ、　（１９７２）　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　−Ｉ ＩＩ　sｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ ｍｕｌＬｉｖａｌｅｎｃｅ、　ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｒｓＩｒｙ　９．３２５− ３４０゜２９、　Ｊｅｎｎｉｎｇｓ、　Ｈ，Ｊ、　ａｎｄ　Ｃ，Ｌｕｇｏｗｓｋ ｉ、　＋９８１．　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　ｇｒｏ浮垂刀@Ａ 、　Ｂ ａｎｄ　Ｃｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｔｅ ｔａｎｕｓ　ｔｏｘｏｉｄ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ、　Ｊ、@Ｉｍｍｕｎｏ１ １２７：　１０１２４０１８ ３０、　Ｌｅｅ、　Ｙ、Ｃ，１９７８５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｓｏｍｅ　ｃ ｌｕｓｔｅｒ　ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ　５ｕｉｔａｂｌｅ　■盾■ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｔｏ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｒ　５ｏｌｉｄ　ｍａｔｒｉ ｃｅｓ、　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、　Ｒｅｓ、　６７：　５０X−５１４゜ ３１、　Ｌｏｗｒｙ、　Ｏ，Ｈ，Ｎ、Ｊ、、　Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ、　Ａ、Ｌ 、　Ｆａｒｒ　ａｎｄ　Ｒ，Ｊ、　Ｒａｎｄｅｌｌ、　１９T１．　Ｐｒｏｔｅ ｉｎ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　Ｆｏｌｉｎ　ｐｈｅｎｏｌ　ｒｅ ａｇｅｎｔ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　１９３：　Q６５−２７５ ３２、　Ｄｕｂｏｉｓ、　Ｍ、、　Ｋ、Ａ、　Ｇ１１ｌｅｓ、　Ｊ、に、　Ｈａ ｍｉｌｔｏｎ、　Ｐ、Ａ、　Ｒｅｂｅｒｓ　ａｎｄ　Ｆ、　rｍ１ｔｈ、　１９ ８６゜ ＣｓｌｏｒｉＣ５１ｏｒｉ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎ ａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｕｇａｒｓ　ａｎｄ　ｒｅｌａｔｅｄ@５ｕｂｓｔａｎｃ ｅｓ。

Ａｎａｌ、Ｃｈｅｍ、２８：　３５０−３５６３３、ＭｃＣａｒｔｙ、Ｍ、ａｎ ｄ　Ｌａｎｃｅｆｉｅｌｄ、Ｒ，Ｃ，（１９５５）　Ｖａｒｉａｔｉｏｎ　ｉｎ 　ｔｈｅ　ｇｒｏｕｐ−ｓ垂■モ奄■奄■ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｏｆｇｒｏｕｐ　Ａ　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ　Ｊ 、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１０２：　１１−２８゜３４、　Ｂａｒｔｌｅｔｔ　Ｊ、Ｇ 、　０ｎｄｅｒｄｏｎｋ、　Ａ、Ｂ、、　Ｄｒｕｄｅ、　Ｅ、　Ｇｏｌｄｓｔｅ ｉｎ、　Ｃ，Ａｎｄｅｒ汲＝A　Ａ、Ｓ、　ａｎｄ ＭｃＣｏｒｍａｃｋ、　Ｗ、Ｍ、　（＋９７７）　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ　Ｖａｇｉｎａｌ　Ｆｌｏｒａ、　ＪA　Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｄｉｓｅａｓｅｓ　１３６．２７１−２７７３５、　Ｋａｂａｔ　Ｅ、Ａ、　＋ ９６１　Ｋａｂａｔ　ａｎｄ　Ｍａｙｅｒ’ｓ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉ ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓ狽窒凵B ５ｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、　Ｃｈａｓ、　Ｃ，Ｔｈｏｍａｓ、　Ｉｎｃ、 、　Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ、　Ｉｌｌ、　ｐ、　２４１゜−Ｉ　Ｏ＋　２　３ オリゴ糖（ｌｏｇ　ｎＭｌ 図１ 抗原（μ９） 図４ オリゴ糖＜ｌｏｇ　ｎＭ） 図５ Ｏｔｏｏ　２００　３００　４００　５００抗　体（ｎｇ／ウェル） 抗体（ｎ９／ウ−ｒ−Ｊｌ 図７Ｂ 抗　体（ｎ９／ウエル） 図８Ａ 抗　体（ｎ９／ウエル） ０．０　０．５　１．０　＋、５　２．０　２．５　３．ＯＧ日Ｓ　（ｃｆｕ／ 試験　ｘ　ｌ０Ｅ−５）図１０ 補正書の翻訳文の提出書傷許法第１８４条の８）平成５年ｌＯ月２５日 １、国際出願の表示 ＰＣＴ／ＣＡ９２１００１７２ ２、発明の名称 Ｂ群連鎖球菌検出用免疫検定 ３、特許出願人 住　所（居所）　カナダ国、オンタリオ・ＫＩＡ・ＯＲ６、オタワ、モントリオ ール・ロード・１２００ 氏　名（名称）　ナショナル・リサーチ・カランシル・オブ・カナダ（ほか２名 ） ５、補正書の提出年月日 ＳＵＤは、典型的には、検定中の抗原が結合する捕捉（ｃａｐｔｕｒｅ）抗原を 担持する膜から成る。そして、酵素などの、基質に接触するとその後に発色する 適切な標識を担持する２番目の標識抗体を用いて”サンドインチ”が作られる。

ラテックス凝集方式では、抗原物質が、ミルク様の外観を有するラテックスの形 態のポリスチレンビーズに吸着される。続いて、抗体を加えると、コートされた ラテックス粒子が凝集し、媒体の外観に目にみえる変化が生じる。

放射免疫検定法は、酵素の代わりに例えばヨウ素１２５などの放射性同位元素が 使われる点を除いてＥＬＩＳＡと同じである。ガンマ・カウンターを用いて検出 できる。

Ｂ群連鎖球菌（ＣＢＳ）に感染すると、ヒトや動物では健康に重大な危険が生じ る。ＣＢＳ感染は、例えば、乳牛の乳腺炎の原因になる。しがし特に懸念される のは、出産時のＣＢＳ感染の発生である。出産前の母親がこのバクテリアの保菌 者であると、出産後感染の危険があるだけでなく、子供が産道を通るときに子供 に感染させる場合もある。

（ｉｉ）　ｒ免疫検定剤」は、免疫反応に関係する物質の存在の試験にかかわる ことができる物質のすべて（例えば、場合により、抗体または抗原）を意味する 。

（ｉｉｉ）　ｒ免疫原複合体」は、動物（例えば、哺乳類や鳥類）に注入された 場合に、それに対する抗体の産生ないし増強を賦活ないし誘導する物質を意味す る。

（ｉｖ）「抗原捕捉剤」は、抗原に結合できる物質（例えば抗体）を意味する。

（■）「抗体捕捉剤」は、抗体に結合できる物質（例えば抗原）を意味する。

（ｖｉ）　ｒ結合する親和性」は、一般に、要素が、−緒に結合するというよう に、別の要素と相互作用することが可能であることを意味する。

（ｖｉｉ）　ｒ特異的に結合する親和性」は、一般に、要素が、排他的または少 なくとも優先的な形態、即ち、本発明の目的に十分な形態で別の要素と相互作用 が可能であることを意味する。

（ｖｉｉｉ）　ｒ抗原捕捉剤が、Ｂ群連鎖球菌多糖抗原のトリラムノースエピト ープと特異的に結合する親和性を有する」は、抗原捕捉剤が、この捕捉剤とＢ群 連鎖球菌多糖抗原のその他の成分（例えばモノラムノースエピトープ）の間の相 互作用が非常に低い、または、無視できる（すなわち、トリラムノースエピトー プとの相互作用が、Ｂ群連鎖球菌多糖抗原またはＢ群連鎖球菌感染の検出及び／ または診断の目的に十分に特異的である）というように、トリラムノースエピト ープと排他的または少なくとも優先的形態で相互作用が可能なことを意味する。

（ｉｘ）　ｒ抗原標識剤は、Ｂ群連鎖球菌多糖抗原のモノラムノースエピトープ に特異的に結合する親和性を有する」は、抗原標識剤が、この標識剤とＢ群連鎖 球菌の多糖抗原のその他の成分（例えばトリラムノースエピトープ）との相互作 用が非常に低い、または、無視できる（すなわち、モノラムノースエピトープと の相互作用が、Ｂ群連鎖球菌多糖抗原またはＢ群連鎖球菌感染の検出及び／また は診断の目的に十分に特異的である）というように、排他的あるいは少なくとも 優先的形態で相互作用可能なことを意味する。

（Ｘ）［シングルサイトＥＬＩＳＡＪは、捕捉抗体と標識（プローブ）抗体がタ ーゲットとするエピトープの部位が、構造的に同じである（例えば、トリラムノ ースエピトープが捕捉抗体と標識抗体のターゲットとされる）ようなＥＬＩＳＡ 方式検定を意味する。

（ｘｉ）　ｒツーサイトＥＬＩＳＡＪは、捕捉抗体と標識（プローブ）抗体がタ ーゲットとするエピトープの部位が、構造的に異なる（例えば、トリラムノース エピトープが捕捉抗体のターゲットとされ、モノラムノースエピトープがマーカ ー抗体のターゲットとされる）ようなＥＬＩＳＡ方式検定を意味する。

抗原捕捉剤は、抗原捕捉剤がさらされる試験媒体に関して不溶性となるよう、吸 着または共有結合により担体に固定化される。担体は、有機成分または無機成分 のものでよい。例えば、担体はアミロース、デキストラン、天然セルロースまた は変性セルロース、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、アガロ ース、及び、ケイ酸（ガラスなど）などから選ぶことができる。抗原捕捉剤は、 例えば、試験容器（即ち、試験管、ミクロタイタープレート、ガラスのキュベツ ト、または上記に類似した他の物体）の内壁、または、固体物体（即ち、ガラス 棒やその他いろいろな形状の物体）に固定化される。使用される容器は、面積と 体積の比が大きいものが好ましい。捕捉抗体は直接担体に固定化される場合もあ るし、または、グルグルアルデヒド、プロティンＡもしくはプロティンＢなどの 中間物質の残基を介して固定化される場合もある。

抗体、抗原、酵素、リガンドなどの活性物質を担体に固定化する（即ち、不溶化 する）ための既知の方法のいずれも使用できる（１４）。捕捉抗体は、例えば、 抗体を含む緩衝液（例えば、０．１ＭのＮａＨＣＯ３と５−１２μｇ／ｍｌの捕 獲抗体から成る、ｐＨが９．６の緩衝液０．２−０．２５ｍ１）を、適切な温度 で適切な時間（例えば４℃で１６時間）、担体の機能表面に接触させることによ り、ポリスチレンのミクロタイタープレート、ウェルまたはチューブから成る担 体の表面に固定化することができる。

好ましくは、抗原標識剤は、ヒツジの抗血清から得たポリクローナル抗体（例え ば、ＢＣＨ−４０２と表示されるＣＢＳ多糖ヒツジ抗血清（カナダ国ケベック州 うバルのＩＡＦバイオケムインターナショナル社））から成り、ＣＢＳ多糖抗原 のモノラムノース抗体に結合する親和性を有する。

抗原標識剤は、検出を行なうための適切な標識またはトレーサー成分を有する。

免疫検定に適切に用いられる標識またはトレーサー、例えば、酵素、放射性同位 元素または蛍光標識を、標識抗体に結合できる。使用される標識により、もちろ ん、検出法の性質は決まるものである。

標識酵素は、ホースラディツシュペルオキシダーゼ、例えば、過酸化水素オキシ ドレダクターゼ（ＥＣ１，１１，１，７）のこともある。ホースラディツシュペ ルオキシダーゼは既知の還元アミノ化法を用いて抗体などの物質に結合させるこ とができる（１４．１５）。例えば、本発明者らは、ＮａＢＨ４をより弱い還元 剤であるＮａＣＮＢＨ３に代え、抗体に対するペルオキシダーゼの初期反応比を ２：ｌとした、ティファーセン（Ｔｉｊｅｓｅｎ）アミノ化法を使うとより有利 であることを見い出した。より弱い還元剤の使用により、ＮａＢＨ４を用いて得 た複合体に比べ、約１．２倍はど感度の優れた抗体−酵素の複合体が得られるこ とが判明している。さらに、上記の反応比を用いると、ＮａＣＮＢＨ３を還元剤 として用いた場合の抗体に対する酵素の最終比は、ＮａＢＨ４を還元剤として用 いた場合の比が１．６であるのに対して、２．２となる。

さらに、組合せ物または試験キットは、抗原標識剤の標識の性質により、標識抗 原に会合したＣＢＳ多糖抗原検出用の検出基質も包含することができる。

検出基質は、標識剤に使用される標識の性質により、１つ以上の成分から成るこ とがあり、例えば第２検出基質成分の３．３’　、５．５’−テトラメチルベン ジジンと組み合わせた第１検出基質成分のＨ２Ｏ２から成ることがある。組合せ 物または試験キットは、この他に、抗原標識剤とのインキュベーション後に、非 結合抗原標識剤を取り除くために、免疫吸着剤を洗浄する洗浄剤も包含すること ができる。

本発明では、検出基質の成分は、各々の容器内で別々の溶液とすることができ、 あるいは１つの容器内で事前に混合した溶液とすることができる。別々にする場 合は、使用前に混合するか、または、試験容器に別々に入れる。

本発明は、また、親和性を有する抗体画分を（ポリクローナル抗体から）分離、 回収、精製し、抗原捕捉／標識剤として有用にするためのアフイニテイゲルとし て使用することができる免疫吸着剤を提供する。この免疫吸着剤は、不溶性担体 と不溶性担体の表面に固定化された抗体捕捉剤から成る。抗体捕捉剤は、　（ａ ）式ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ　（１−２）ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ　（１−２）ａ−Ｌ−Ｒｈ ａｐ−１−のトリラムノース基、及び（ｂ）式ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ−１−のモノラ ムノース基［各式中、Ｒｈａｐはラムノースである。］から選択されるラムノー ス部分から成る。トリラムノース免疫吸着剤（即ち、抗体捕捉剤がトリラムノー ス基から成るもの）は、溶液を処理し、トリラムノースエピトープと相互作用す る抗体を吸着する（即ち、分離するか、捕捉する）ために使用できる。同様に、 モノラムノース免疫吸着剤（即ち、抗体捕捉剤がモノラムノース基から成るもの ）は、溶液を処理し、モノラムノースエピトープと相互作用する抗体を吸着する ため使用できる。

抗体捕捉剤のラムノース部分がモノラムノース基から成るモノラムノース抗体免 疫吸着剤は、Ｌ−ラムノース（例えば、米国ウィスコンシン州のアルドリツヒ・ ケミカル社製）をセファロースＣＬ−４８（カナダ国ケベック州ドーヴアルのフ ァーマシア・ファイン・ケミカル社製ら入手できるゲルの商標名）に既知の手順 を用いて結合することで得ることができる（２０．２１）。

あるいは、モノラムノース抗体免疫吸着剤は、モノラムノースが本明細書に記載 の不溶性担体に結合されることを除いて、上記のモノラムノース免疫原複合体を 得る方法と同じ方法により、合成した（４）誘導体である５−メトオキシカルボ ニルペンチル−α−Ｌ−ラムノピラノシドを出発物質として得ることができる。

抗体捕捉剤のラムノース部分がトリラムノース基から成るトリラムノース抗体免 疫吸着剤は、同様の方法で得ることができる。

本発明で有用なモノクローナル抗体は、ハイプリドーマ細胞系を用いる従来の方 法を用いて得ることができる。このため、ＣＢＳ多糖抗原に結合する所望の親和 性を有するモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞系を用いることが できる。例えば、コーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）とミルスティン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ）の方法（１７）をモノクローナル抗体の生成に用いることができる。スターリ （Ｓｔａｔｈｌｉ）ら（１８）の方法を、同じ抗原の異なるエピトープに対する モノクローナル抗体の識別に用いることができる。

抗原捕捉剤がモノクローナル抗体から成る場合は、抗体はＢ群連鎖球菌多糖抗原 のトリラムノースエピトープに結合するための必要な親和性を有している必要が ある。上記の性質を有するならば、モノクローナル抗体はいがなるアイソタイプ でもよい。

モノクローナル抗体ＧＢＳ　ｌ／１８　：　６／ＤＩは、ＣＢＳ多糖抗原のトリ ラムノースエピトープを認識するモノクローナル抗体の一例であり、好ましくは 、捕捉抗体として使用される。抗体はＩ　ｇＧ３アイソタイプで、ＣＢＳの血清 型Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、ＩＩ、ＩＩＩと相互作用することが判明している。この抗 体は、カナダ国ケベック州うバルのＩＡＦバイオケムインターナショナル社によ りＢＣＨ−４０６とも表示されている。ＢＣＨ−４０６と表示された細胞系は、 この抗体を産生ずるものであり、１９９３年４月６日に米国、メリーランド州２ ０８５２、ロックヴイル、パークローン・ドライブ１２３０１にあるアメリカン タイプカルチャーコレクションに寄託され、受託番号ＡＴＣＣＨＢ１１３２１を 付与された。

上記のＩ　ｇＧ３モノクローナル抗体は、既知の方法を用いて腹水（マウスまた はその他の動物）から得ることができる（１６）。

（ｉ）酵素検出基質混合物を試験容器の内側表面に接触させて、室温で適切な時 間（例工ｌｆ　１０〜１５分）、必要であれば時々撹拌しながら、インキュベー トし、（」）得られた試験容器内の混合物に、ＣＢＳ多糖抗原／細菌の存在を示 す色の変化があるかを目視で検査し、及び／または（ｋ）　（既知の方法で分光 光度計を用いて）吸光度検査を行ない色の変化を記録し、必要な場合には、酵素 ／基質活性を停止させるのに十分な量の無機酸（たとえばＨ２Ｓ０４）を、０． ５Ｎの最終酸濃度を得るに十分な量（１〜３Ｎの硫酸を５０−１００，１）にな るよう、混合物に加えて検査を行なう。必要により、綿棒は上記のステップ（ｄ ）の前、ステップ（ａ＞の前、または（ｆ）の前で取り除くことができる。しか し、ステップ（ｆ）の後で取り除くのが好ましい。流体中に十分な量の抗原があ る場合、例えば乳を培養してウシを試験する場合などは、抽出ステップは一般に は必要ではない。

前記したように、最大量の捕捉抗体をコートするという標準的な方法で、トリラ ムノースエピトープを用いたシングルサイトＥＬ　ＩＳＡを行うと、感度はｌｎ ｇ未満の抗原という重要な範囲でゼロ近くまで低下した。いかなる理論に拘束さ れるものではないが、これについて有り得る説明としては、各ＧＢＳにある限定 数（４個）のトリラムノースエピトープが、完全に捕捉抗体に結合し、そのため 標識のついた第２抗体が付着することができなくなる、というものである。捕捉 抗体の密度を５００　ｎ　ｇ／ウェルから１６０ｎｇ／ウェルに減少させると、 感度が少し低下するが、ＥＬＩＳＡは機能することが判明した。これはおそらく 、ウェルの壁にある抗体の結合部位の間隔を、全てのトリラムノースエピトープ が結合しないようにあけることである。最適密度が１６０ｎｇ／ウェルよりむし ろ２００ｎｇ／ウェルであるツーサイトＥＬＩＳＡでのコーティング密度の効果 から（図７Ｂを参照）、このように減少させたコーティングによりシグナルが約 ２０％低下すると推定される。このため、幾分がの感度の損失と、捕捉抗体のコ ーティングを正確に制御する必要から、トリラムノースエピトープはシングルサ イトＥＬＩＳＡにおいて使用するのにあまり適していない。

一方、ヒツジのポリクローナル抗体が結合するモノラムノースエピトープは、抗 体のコーティング密度にかかわらず、シングルサイトＥＬＩＳＡで機能する。こ れは多分、抗原分子当りのこのエピトープの数がより多いため（３８モル１モル ）である。しかし、このエピトープは、抗原の濃度が著しく高い場合トリラムノ ースエピトープを介しての複数部位付着（ｍｕｌｔｉｓｉｃｅ　ａｔｔａｃｈｍ ｅｎｔ）は、このようにツーサイトＥＬＩＳＡにとっては著しい利点である。抗 原が工ｇＧ及びＩｇＭ抗体に多価結合することによって得られる、機能的親和性 の増加は、それぞれ１０３倍及び１０６倍のオーダーであると示されている（２ ８）。

さらに、全ての４つのトリラムノースエピトープによることもあり得るＣＢＳ多 糖抗原の多価の捕捉は、この抗原の捕捉について固相の機能的親和性を有意に増 加させると期待できる。

図５は、Ｂ群多糖特異的モノクローナル抗体（１６）　、及び、コーティング抗 原としてＢ群多糖−ＢＳＡ複合体を用いたＥＬＩＳＡ阻害実験から得た結合曲線 を示す。本質的には、上記のアフィニティ精製したウサギのポリクローナル抗血 清でも同じ結果が得られた。同じく、末端α−Ｌ−）リラムノビラノシドエピト ープを含む全てのオリゴ糖（１，２及び３）は優れた阻害剤であり、α−Ｌ−ジ ラムノビラノシド（オリゴ糖４）は、それほど優れた阻害剤でないとしても、阻 害剤としての機能を有していた。メチルα−Ｌ−ラムノピラノシド（３１）はこ の系では非常に効果のない阻害剤である。

トリラムノシト及びモノラムノシトのエピトープ以外と関連する特異性を有する 抗体もまた、ウサギのポリクローナル抗血清中で識別できた。四糖α−Ｌ−Ｒｈ ａｐ−（１−３）＋７−Ｄ−Ｇａ　１ｐ（１−３）β−Ｄ−Ｇ　ｌ　ｃ　ｐＮＡ ｃ（１−４）ａ−Ｌ−Ｒｈ　ａｐを含むオリゴ糖は、末端モノラムノースエピト ープだけより、上記の抗体へのＢ群多糖の結合を阻害する優れた阻害剤であった 。四糖はオリゴ糖工及びＩＩの構造的特徴を有しており、それ故にＢ群多糖内部 に１及びＩＩがあるにもかかわらず、四糖は免疫機構に関わることができるので ある。

図６は、精製したヒツジのポリクローナル抗体の特異性に関連するものである。

これは、表４に示す群特異性多糖の断片を用いたＥＬＩＳＡの阻害研究で評価さ れた。抗体結合の阻害剤を試験するために、ＰＢＳＴ中の抗体（１００μｌ）と 抑制剤（１００μりを、低結合タイプのミクロタイタープレート（米国マクリー ンのフローラボラトリー（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、リンプロ／ タイターチック（Ｌｉｎｂｒｏ／Ｔｉｔｅｒ＋ｅｋ）　Ｅ　Ｉ　Ａ）のウェルで 、室温で１時間予備混合した。この阻害剤／抗体溶液の１００□１の容量を、Ｃ ＢＳ多糖−ＢＳＡ複合体コートミクロタイターウェルに移し、１時間インキュベ ートした。ペルオキシダーゼで標識したウサギの抗ヒツジと酵素基質を上記に述 べたように加えた。

ラムノース−（１−３）−グルシトール（オリゴ糖１．７及び１０）またはラム ノース−（１−３）−ガラクトース（オリゴ糖８）のいずれかを含む断片は、固 相群特異性多糖−ＢＳＡ複合体に対するＰＡｂ結合の阻害剤としては、同じよう に有効であった。ラムノース−（１−３）−グルシトールとラムノース−（１− ３）−ガラクトースの両方を含むオリゴ糖６は、これらの配列の一方だけを含む 断片より阻害剤として有力であった。遊離ラムノースとラムノースのメチルグリ コシドはどちらも、非常に弱い阻害剤であり、１０−５〜１０−４Ｍの濃度のオ リゴ糖１．６．７．８及び１０と同じ阻害を得るためにはＩ　Ｘ　Ｉ　Ｏ−ＩＭ の濃度を必要とすることが判明した。単糖による抑制は、性質は弱いが、特異的 のようである。なぜなら、他の単ｍ＜グルコース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサ ミン）及び三糖（ラクトース、メリビオーズ及びスクロース）は１×ｌＯ−ＬＭ の濃度では阻害できなかったからである。

シングルサイ）ＥＬＩＳＡは緑膿菌と主に（２倍未満であったが）交差反応する ことが判明した。緑膿菌は、腟のフローラの部分では通常は見つからないヒトの 病原菌である。この生物は、ツーサイトＥＬＩＳＡではほとんど検出できなかっ た。このことは、非常に高い特異性を示している。どちらのＥＬＩＳＡでも重大 な交差反応性は見られなかった。

以下の実施例で説明する実験では、表５に示す連鎖球菌細菌の培養物の代表例と その他の細菌の培養物をインスティテユットアーマンドフラッピール（Ｉｎｓｔ ｉｔｕｔ　Ａｒｍａｎｄ−Ｆｒａｐｐｉｅｒ、カナダ国ケベック州モントリオー ル）の品質管理研究所から入手した。

さらに、ＣＢＳ　（特にステロタイプ１８−Ｗ）（０香号１２３−８３５）の従 来の培養法を用いた。また細菌数も従来の方法により測定した（２４）。既知の 数の、表５に示す連鎖球菌細菌とその他の細菌を含む溶液を調製した。

実施例 本発明を、以下の非制限的な実施例により説明する。

実施例１ （抗原）免疫吸着剤を作成するための、ポリスチレン容器担体上への抗原捕捉剤 の固定化 試験の結果のアウトラインを次の表２に示す。

表２　亜硝酸によるＢ群連鎖球菌の、抽出時間に及ぼす影響抽出時間　吸光度　 吸光度　抽出率 ６ＳＯｎｍ　ゼロ　の　を　し　いた　％ｏｌ　１０１０　０．１０１　０．０ ００　０ ２．５　０．２４＋　０．１４０　４６．８Ｓ　Ｏ，３２＋　０．２２０　７３ ．６＋０　０．３４７　０．２４６　８２．’３２０　０．３９３　０．２９２ 　９７．６１０　０．１００　Ｇ、２９９ １００．０−一 実施例１０ Ｂ群連鎖球菌を対象とした実施例８のＥＬＩＳＡ法では、Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄ、Ｅ、 ＦおよびＧ群連鎖球菌細菌由来の市販の抽出物（Ｄｉｆｃｏ　Ｃｏ、Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ、ＤｅｔｒｏｉｔＭｉｃｈｉｇａｎ　Ｕ、Ｓ、Ａ）を使用した。

これらの抽出物は、連鎖球菌における各タイプの多糖類を含む。マイクロタイタ ーウェル方式に従って試験を行ったところ、Ｂ群連鎖球菌からの抽出物は、１１ ５０．　Ｉ／１００．１／２００．１／４００．１１ｇ００．１／１６００およ び１／３２００の各希釈範囲において、１．００（６５０ｎｍ）を超える吸光度 変化を示した。このほかの群においては、抽出物が陽性を示すことはなかった。

ポリクローナルウサギ抗Ｂ群連鎖球菌多糖血清と、相同性Ｂ群多糖の定量的沈降 反応により、１ｍｌ当り１．２ｍｇの多糖特異性の抗体が含まれていることが判 明した。

当業者であれば、本発明の要旨をはずれることなく、抗原捕獲剤、抗原標識剤、 標識、炭水化物、（不溶性）担体（容器型を含む）、抗原固定化の量、抽出条件 、容器型担体の面積１体積比などのさまざまなパラメータを変更できることは明 らかであろう。

補正書の翻訳文の提出書（特許法第１８４条の８）平成５年ＩＯ月２５日 １、国際出願の表示 ＰＣＴ／ＣＡ９２１００１７２ ２、発明の名称 Ｂ群連鎖球菌検出用免疫検定 ３、特許出願人 住　所（居所）　カナダ国、オンタリオφＫＩＡ・ＯＲ６、オタワ、モントリオ ール・ロード・１２００ 氏　名（名称）　ナショナル・リサーチ・カランシル・オブ・カナダ（ほか２名 ） ４、代理人 住　所（居所）　〒１５４　東京都世田谷区上馬−丁目３２番１２号請求の範囲 １．　不溶性担体、前記不溶性担体上に固定化され、Ｂ群連鎖球菌多糖抗原を前 記担体に結合させる抗原捕捉剤、及び、前記抗原捕捉剤により捕捉された前記Ｂ 群連鎖球菌多糖抗原に結合する抗原標識剤から成り、前記抗原捕捉剤及び前記抗 原標識剤の少なくとも一方は、式ａ　Ｌ　Ｒｈａｐ（１→２）ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ 　（１→２）ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ−１［式中、Ｒｈａｐはラムノースである。］の トリラムノースエピトープに特異的に結合する親和性を有する抗体である免疫検 定組合せ物。

２、　前記抗原捕捉剤が、Ｂ群連鎖球菌多糖抗原由来の、式α−Ｌ−Ｒｈａｐ　 （１−＝２）ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ　（１−２）ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ−１［式中、Ｒｈ ａｐはラムノースである。］のトリラムノースエピトープに特異的に結合する親 和性を有する抗体であり、前記抗原標識剤が、Ｂ群連鎖球菌多糖抗原由来の、式 α−Ｌ−Ｒｈａｐ−１のモノラムノースエピトープに特異的に結合する親和性を 有する抗体である請求の範囲第１項に記載の免疫検定組合せ物。

３、　前記抗原捕捉剤がモノクローナル抗体である請求の範囲第２項に記載の免 疫検定組合せ物。

４、　前記抗原捕捉剤が、細胞系ＡＴＣＣＢＢ１１３２１が分泌する、ＧＢＳ　 １／１８　：　６／ＤＩと表示されるＩｇＧ３である請求の範囲第３項に記載の 免疫検定組合せ物。

５、　前記抗原標識剤が、ヒツジポリクローナル抗体である請求の範囲第２項に 記載の免疫検定組合せ物。

６、　前記不溶性担体が、前記抗原捕捉剤を固定化して含む容器がら成る請求の 範囲第２項に記載の免疫検定組合せ物。

７、　前記抗原標識剤が、検出可能なマーカーで標識され、前記マーカーが酵素 または放射性同位元素である請求の範囲第５項に記載の免疫検定組合せ物。

８、　前記抗原捕捉剤が、Ｂ群連鎖球菌多糖抗原由来の、式ａ　Ｌ　Ｒｈａｐ− １［式中、Ｒｈａｐはラムノースである。］のモノラムノースエピトープに特異 的に結合する親和性を有する抗体であり、前記抗原標識剤が、Ｂ群連鎖球菌多糖 抗原由来の、式ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ　（１−２）ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ　（１−２）　 ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ−１［式中、Ｒｈａｐはラムノースである。］のトリラムノー スエピトープに特異的に結合する親和性を有する抗体である請求の範囲第１項に 記載の免疫検定組合せ物。

９、　前記抗原捕捉剤が、ヒツジポリクローナル抗体である請求の範囲第８項に 記載の免疫検定組合せ物。

１０、前記不溶性担体が、前記ポリクローナル抗体を固定化して含む容器から成 る請求の範囲第８項に記載の免疫検定組合せ物。

１１、前記抗原標識剤がモノクローナル抗体である請求の範囲第８項に記載の免 疫検定組合せ物。

１２、前記モノクローナル抗体が、細胞系ＡＴＣＣＢＢ１１３２１が分泌する、 ＧＢＳ　１／１８　：　６／Ｄｉと表示されるものである請求の範囲第１１項に 記載の免疫検定組合せ物。

１３、前記抗原標識剤が、検出可能なマーカーで標識され、前記マーカーが酵素 または放射性同位元素である請求の範囲第８項に記載の免疫検定組合せ物。

１４、前記抗原標識剤が、Ｂ群連鎖球菌多糖抗原由来の、式ａ　Ｌ　Ｒｈａｐ　 （１→２）ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ　（１→２）ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ−１［式中、Ｒｈａ ｐはラムノースである。］のトリラムノースエピトープに特異的に結合する親和 性を有する抗体であり、前記抗原標識剤もまた前記トリラムノースエピトープに 特異的に結合する親和性を有する抗体である請求の範囲第１項に記載の免疫検定 組合せ物。

１５、前記抗原捕捉剤及び前記抗原標識剤がモノクローナル抗体である請求の範 囲第１４項に記載の免疫検定組合せ物。

１６、前記モノクローナル抗体が、細胞系ＡＴＣＣＢＢ１１３２１が分泌する、 ＧＢＳ　１／ｌ　８　：　６／Ｄ１と表示されるものである請求の範囲第１５項 に記載の免疫検定組合せ物。

１７、前記不溶性担体が、前記ポリクローナル抗体を固定化して含む容器から成 る請求の範囲第１６項に記載の免疫検定組合せ物。

１１１１、前記抗体が、前記容器に、前記容器の単位面積当り１６０ｎｇ以下の 濃度でコートされている請求の範囲第１７項に記載の免疫検定組合せ物。

１９、前記抗原標識剤が、検出可能なマーカーで標識され、前記マーカーが酵素 または放射性同位元素である請求の範囲第１４項に記載の免疫検定組合せ物。

２０、　（ｉ）Ｂ群連鎖球菌多糖抗原を含む疑いのある試料の試験溶液に、不溶 性担体に固定化した、式ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ　（１−２）ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ　（１ →２）　ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ−１［式中、Ｒｈａｐはラムノースである。］のトリ ラムノースエピトープに特異的に結合する親和性を有する抗体である抗原捕捉剤 を接触させ、　（＋１）式α−Ｌ−Ｒｈａｐ−１のモノラムノースエピトープに 特異的に結合する親和性を有する抗体である抗原標識剤を導入して、前記抗原捕 捉剤に捕捉されたＢ群連鎖球菌多糖抗原の存在を検出することから成る、試料中 のＢ群連鎖球菌多糖抗原を検出するための免疫検定法。

２１、前記抗原捕捉剤がモノクローナル抗体である請求の範囲第２０項に記載の 方法。

２２、前記モノクローナル抗体が、細胞系ＡＴＣＣＢＢ１１３２１が分泌する、 ＧＢＳ　１／１８　：　６／ＤＩと表示されるＩｇＧ３である請求の範囲第２１ 項に記載の免疫検定。

２３、前記抗原標識剤が、ヒツジモノクローナル抗体である請求の範囲第２０項 に記載の方法。

２４、前記抗原標識剤が、検出可能なマーカーで標識され、前記マーカーが酵素 または放射性同位元素である請求の範囲第２０項に記載の方法。

２５、　（ｉ）Ｂ群連鎖球菌多糖抗原を含む疑いのある試料の試験溶液に、不溶 性担体に固定化した、式α−Ｌ−Ｒｈａｐ−１のモノラムノースエピトープに特 異的に結合する親和性を有する抗体である抗原捕捉剤を接触させ、（ｉｉ＞式ａ −Ｌ　Ｒｈａｐ　（１＝２）ａ　Ｌ−Ｒｈａｐ　（１＝２）ａ　Ｌ　Ｒｈａｐ− １［式中、Ｒｈａｐはラムノースである。］のトリラムノースエピトープに特異 的に結合する親和性を有する抗体である抗原標識剤を導入して、前記抗原捕捉剤 に捕捉されたＢ群連鎖球菌多糖抗原の存在を検出することがら成る、試料中のＢ 群連鎖球菌多糖抗原を検出するための方法。

２６、　前記抗原標識剤がモノクローナル抗体である請求の範囲第２５項に記載 の方法。

２７、前記モノクローナル抗体が、細胞系ＡＴＣＣＢＢ１１３２１が分泌する、 ＧＢＳＩ／１８：６／ＤＩと表示されるＩ　ｇＧ３である請求の範囲第２６項に 記載の方法。

２８、前記抗原捕捉剤が、ヒツジモノクローナル抗体である請求の範囲第２５項 に記載の方法。

２９、前記抗原標識剤が、検出可能なマーカーで標識され、前記マーカーが酵素 または放射性同位元素である請求の範囲第２５項に記載の方法。

３０、　（ｉ）Ｂ群連鎖球菌多糖抗原を含む疑いのある試料の試験溶液に、不溶 性担体に固定化した、式ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ　（１−２）ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ　（１ −２）　ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ−１［式中、Ｒｈａｐはラムノースである。］のトリ ラムノースエピトープに特異的に結合する親和性を有する抗体である抗原捕捉剤 を接触させ、　（１１）同じく、前記トリラムノースエピトープに特異的に結合 する親和性を有する抗体である抗原標識剤を導入して、前記抗原捕捉剤に捕捉さ れたＢ群連鎖球菌多糖抗原の存在を検出することがら成る、試料中のＢ群連鎖球 菌多糖抗原を検出するための方法。

３１、前記抗原捕捉剤及び前記抗原標識剤がモノクローナル抗体である請求の範 囲第３０項に記載の方法。

３２、前記モノクローナル抗体が、細胞系ＡＴＣＣＢＢ１１３２１が分泌する、 ＧＢＳ　１／１８　：　６／ＤＩと表示されるＩｇＧ３である請求の範囲第３１ 項に記載の方法。

３３、前記不溶性担体が容器であり、前記抗体が、前記容器に、前記容器の単位 面積当り１６０ｎｇ以下の濃度でコートされている請求の範囲第３２項に記載の 方法。

３４、前記抗原標識剤が、検出可能なマーカーで標識され、前記マーカーが酵素 または放射性同位元素である請求の範囲第３０項に記載の方法。

３５、試料中に存在するＢ群連鎖球菌からのＢ群連鎖球菌多糖抗原の抽出のため 、試料を亜硝酸水溶液で処理することにより、試験溶液を得る請求の範囲第２０ 項〜第３４項のいずれか一項に記載の方法。

３６、　（ａ）不溶性担体上に固定化され、式ａ　Ｌ−Ｒｈ　ａ　ｐ　（１＝２ ）　ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ　（１→２）ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ−１［式中、Ｒｈａｐはラ ムノースである。］のトリラムノースエピトープに特異的に結合する親和性を有 する抗体である抗原捕捉剤、　（ｂ）有機酸から成る、Ｂ群連鎖球菌からのＢ群 連鎖球菌多糖抗原の亜硝酸水溶液抽出のための第１抽出剤、（ｃ）無機亜硝酸塩 から成る、Ｂ群連鎖球菌からのＢ群連鎖球菌多糖抗原の亜硝酸水溶液抽出のため の第２抽出剤（但し、第１抽出剤と第２抽出剤は、水性溶媒中で混合された場合 に、共に反応して亜硝酸を生成し得るものである）、（ｄ）過剰の亜硝酸を中和 するための中和剤、及び（ｅ）α−Ｌ−Ｒｈａｐ−１のモノラムノースエピトー プに特異的に結合する親和性を有する抗体である抗原標識剤から成る、Ｂ群連鎖 球菌多糖抗原検出用試験キ・ノド。

３７、前記抗原捕捉剤がモノクローナル抗体である請求の範囲第３６項に記載の 試験キット。

３８、前記モノクローナル抗体が、細胞系ＡＴＣＣＢＢ１１３２１が分泌する、 ＧＢＳ　ｌ／１８　：　６／Ｄ１と表示されるＩｇＧ３モノクローナル抗体であ る請求の範囲第３７項に記載の試験キット。

３９、前記抗原標識剤が、ヒツジポリクローナル抗体である請求の範囲第３６項 に記載の試験キット。

４０、前記抗原標識剤が、検出可能なマーカーで標識され、前記マーカーカτ酵 素または放射性同位元素である請求の範囲第３６項に記載の試験キ・ノド。

４１、　（ａ）不溶性担体上に固定化され、ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ−１［式中、Ｒｈ ａｐはラムノースである。］のモノラムノースエピトープに特異的に結合する親 和性を有する抗体である抗原捕捉剤、（ｂ）有機酸から成る、Ｂ群連鎖球菌から のＢ群連鎖球菌多糖抗原の亜硝酸水溶液抽出のための第１抽出剤、（ｃ）無機亜 硝酸塩から成る、Ｂ群連鎖球菌からのＢ群連鎖球菌多糖抗原の亜硝酸水溶液抽出 のための第２抽出剤（但し、第１抽出剤と第２抽出剤は、水性溶媒中で混合され た場合に、共に反応して亜硝酸を生成し得るものである）、（ｄ）過剰の亜硝酸 を中和するための中和剤、及び（ｅ）式σ−Ｌ−Ｒｈａｐ（１→２）ａ−Ｌ−Ｒ ｈａｐ　（１−＝２）ａ　Ｌ−Ｒｈａｐ−１のトリラムノースエピトープに特異 的に結合する親和性を有する抗体である抗原標識剤から成る、Ｂ群連鎖球菌多糖 抗原検出用試験キット。

４２、前記抗原捕捉剤がモノクローナル抗体である請求の範囲第４１項に記載の 試験キット。

４３、前記モノクローナル抗体が、細胞系ＡＴＣＣＢＢｌ１３２１が分泌する、 ＧＢＳ１／ｌ　８　：　６／ＤＩと表示されるＩｇＧ３モノクローナル抗体であ る請求の範囲第４２項に記載の試験キット。

４４、前記抗原標識剤が、ヒツジポリクローナル抗体である請求の範囲第４１項 に記載の試験キット。

４５、前記抗原標識剤が、検出可能なマーカーで標識され、前記マーカーが酵素 または放射性同位元素である請求の範囲第４１項に記載の試験キット。

４６、　（ａ）不溶性担体上に固定化され、式ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ　（１→２）ａ −Ｌ−Ｒｈａｐ　（１−２）ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ−１［式中、Ｒｈａｐはラムノー スである。］のトリラムノースエピトープに特異的に結合する親和性を有する抗 体で浸る抗原捕捉剤、（ｂ）有機酸から成る、Ｂ群連鎖球菌からのＢ群連鎖球菌 多糖抗原の亜硝酸水溶液抽出のための第１抽出剤、（ｃ）無機亜硝酸塩から成る 、Ｂ群連鎖球菌からのＢ群連鎖球菌多糖抗原の亜硝酸水溶液抽出のための第２抽 出剤（但し、第１抽出剤と第２抽出剤は、水性溶媒中で混合された場合に、共に 反応して亜硝酸を生成し得るものである）、（ｄ）過剰の亜硝酸を中和するため の中和剤、及び（ｅ）トリラムノースエピトープに特異的に結合する親和性を有 する抗体である抗原標識剤から成る、Ｂ群連鎖球菌多糖抗原検出用試験キット。

４７、前記抗原捕捉剤がモノクローナル抗体である請求の範囲第４６項に記載の 試験キット。

４８、前記モノクローナル抗体が、細胞系ＡＴＣＣＢＢ１１３２１が分泌する、 ＧＢＳｌ／１８　：　６／Ｄｌと表示されるＩｇＧ３モノクローナル抗体である 請求の範囲第４７項に記載の試験キット。

４９、前記不溶性担体が容器であり、前記抗体が、前記容器に、前記容器の単位 面積当り１６０ｎｇ以下の濃度でコートされている請求の範囲第３６項に記載の 試験キット。

５０、前記抗原標識剤が、モノクローナルまたはポリクローナルの抗体である請 求の範囲第３６項に記載の試験キット。

５！、前記抗原標識剤が、検出可能なマーカーで標識され、前記マーカーが酵素 または放射性同位元素である請求の範囲第３６項に記載の試験キット。

５２゜　前記有機酸が、酢酸、コハク酸及びクエン酸から成る群から選択され、 前記無機亜硝酸塩が、亜硝酸ナトリウム及び亜硝酸カリウムから成る群から選択 される請求の範囲第３６項、第４１項または第４６項に記載の試験キット。

５３、患者の膣または子宮頚から試験細菌試料を採取するための試料採取綿棒を 包含し、前記綿棒は、前記容器に挿入可能である請求の範囲第５２項に記載の試 験キット。

５３、前記抗原捕捉剤が、ＧＢＳＩ／１８：６／ＤＩと表示されるトリラムノー スＩｇＧ３モノクローナル抗体から成り、前記抗原標識剤が、Ｂ群連鎖球菌多糖 抗原に対するポリクローナルモノラムノース抗体から単離され、酵素で標識され た抗体から成る請求の範囲第４３項に記載の試験キット。

５４、　（ｆ）抗原物質とのインキュベーション後に、前記不溶性担体を洗浄し て、非結合の抗原標識剤を除去するための洗浄剤、及び、（ｇ）　（ｉ）第１検 出基質成分であるＨ２Ｏ２、及び（ｉｉ）第１検出剤と組み合わせの第２検出基 質成分である３、３°、５．５’　−テトラメチルベンジジンを組み合わせて成 る検出基質を更に含んで成る請求の範囲第５３項に記載の試験キット。

５５、式ａ　Ｌ−Ｒｈａｐ−１−のモノラムノースエピトープの特異的に結合す る親和性を有し、式ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ　（１−２）ａ−Ｌ−Ｒｈａｐ　（１→２ ）σ−Ｌ−Ｒｈａｐ−１−のトリラムノースエピトープに対する親和性を有さな いか、または、実質的に有さない、単離精製された抗体。

ＰＣＴ／ＣＡ　９２１００１７２ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，Ｓ　識別記号　庁内整理番号ＧＯＩＮ　３３１５３ 　Ｖ　８３１０−２Ｊ３３１５７７　Ｂ　９０１５−２Ｊ ／／　Ｃ１２Ｐ　２１１０８　８２１４−４Ｂ（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、Ｂ Ｅ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＳＥ）、０Ａ（Ｂ Ｆ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、Ｔ Ｇ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、 ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、ＮＯ，ＰＬ、ＲＯ、ＲＵ、　ＳＤ、５Ｅ （７１）出願人　プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・バーバード・カレ ッジ アメリカ合衆国、マサチューセッツ・ ０２１３８、ケンブリッジ、フィンジー・ストリート・１７ （７２）発明者　ジエニングズ、ハロルド・ジェイカナダ国、オンタリオ・ＫＩ Ｊ・６Ｇ６、グロスター　ウッドグレン・クレセント・ＦＩ （７２）発明者　マイカン、フランシスカナダ国、オンタリオ・ＫＩＮ・７Ｓ６ 、オタワ、ネルソン・ストリート・４２９（７２）発明者　シャリフォール、ロ バート・ジェイカナダ国、ケベック・Ｈ７Ｖ・ＩＢ７、ラバル、プルバール・ド ウ・プレリー・５３１、ビルディング・ナンバー・１０ （７２）発明者　ラクロア、マーシャルカナダ国、ケベック・Ｈ７Ｖ・ＩＢ７、 ラバル、プルバール・ドウ・プレリー・５３１（７２）発明者　フェルトマン、 ロバートイギリス国、ロンドン・ＮＷ９・８ＴＢ、オールド・チャーチ・レーン 、オールド・ストリート・アンドルーズ・マンションズ・ｌ０Ａ （７２）発明者　カスパー、グロス・エルアメリカ合衆国、マサチューセッツ・ ０２１１５、ボストン、ロングウッド・アベニュー・１８０　チャニング・ラボ ラトリーズ（７２）発明者　ボッガイ、ヴインス アメリカ合衆国、メリーランド・２０８５２、ロックビル、パークローン・テラ ス・ ５１１２、アパートメント・２０１

Claims (70)

【特許請求の範囲】
1. １．不溶性担体、前記不溶性担体の表面に固定化された抗原捕捉剤、及び、抗原 標識剤から成り、前記抗原捕捉剤が、Ｂ群連鎖球菌多糖抗原を前記担体に結合さ せる、Ｂ群連鎖球菌多糖抗原のトリラムノースエピトープに特異的に結合する親 和性を有し、前記トリラムノースエピトープが、式α−Ｌ−Ｒｈａｐ（１→２） α−Ｌ−Ｒｈａｐ（１→２）α−Ｌ−Ｒｈａｐ−１−［式中、Ｒｈａｐはラムノ ースである。］の基から成り、前記抗原標識剤が、前記Ｂ群連鎖球菌多糖抗原が 前記担体に結合した場合にＢ群連鎖球菌多糖抗原に結合する親和性を有する免疫 吸着剤組合せ物。
2. ２．前記抗原捕捉剤が抗体から成る請求の範囲第１項に記載の免疫吸着剤組合せ 物。
3. ３．前記抗原捕捉剤がモノクローナル抗体から成る請求の範囲第２項に記載の免 疫吸着剤組合せ物。
4. ４．前記抗原捕捉剤が、ＧＢＳ１／１８：６／Ｄ１と表示されるトリラムノース ＩｇＧ３モノクローナル抗体から成る請求の範囲第２項に記載の免疫吸着剤組合 せ物。
5. ５．前記抗原標識剤が、前記Ｂ群連鎖球菌抗原が前記担体に結合した場合にＢ群 連鎖球菌多糖抗原のモノラムノースエピトープに特異的に結合する親和性を有し 、前記モノラムノースエピトープは、式α−Ｌ−Ｒｈａｐ−１−［式中、Ｒｈａ ｐはラムノースである。］の基を含む請求の範囲第１項に記載の免疫吸着剤組合 せ物。
6. ６．前記抗原標識剤が抗体から成る請求の範囲第１項に記載の免疫吸着剤組合せ 物。
7. ７．前記抗原標識剤が、Ｂ群連鎖球菌多糖抗原に対するヒツジポリクローナル抗 体から単離された抗体から成る請求の範囲第１項に記載の免疫吸着剤組合せ物。
8. ８．前記抗原標識剤が、Ｂ群連鎖球菌抗原に対するヒツジポリクローナルモノラ ムノース抗体から成り、前記抗原捕捉剤が、Ｂ群連鎖球菌多糖抗原に対するトリ ラムノースモノクローナル抗体から成る請求の範囲第１項に記載の免疫吸着剤組 合せ物。
9. ９．前記抗原標識剤が、Ｂ群連鎖球菌抗原に対するトリラムノースモノクローナ ル抗体から成り、前記トリラムノース抗原捕捉剤が、前記担体上に、担体の単位 面積当り約１６０ｎｇ以下のコート密度でコートされている請求の範囲第１項に 記載の免疫吸着剤組合せ物。
10. １０．不溶性担体、前記不溶性担体の表面に固定化された抗原捕捉剤、及び、抗 原標識剤から成り、前記抗原捕捉剤が、Ｂ群連鎖球菌を前記担体に結合させる、 Ｂ群連鎖球菌多糖抗原のモノラムノースエピトープに特異的に結合する親和性を 有し、前記モノラムノースエピトープが、式α−Ｌ−Ｒｈａｐ−１−［式中、Ｒ ｈａｐはラムノースである。］の基から成り、前記抗原標識剤が、前記Ｂ群連鎖 球菌多糖抗原が前記担体に結合した場合にＢ群連鎖球菌多糖抗原に特異的に結合 する親和性を有する免疫吸着剤組合せ物。
11. １１．前記抗原捕捉剤が、Ｂ群連鎖球菌多糖抗原に対するヒツジポリクローナル 抗体から単離された抗体から成る請求の範囲第１０項に記載の免疫吸着剤組合せ 物。
12. １２．前記ポリクローナル抗体が、ヒツジポリクローナルモノラムノース抗体か ら成る請求の範囲第１１項に記載の免疫吸着剤組合せ物。
13. １３．前記抗原標識剤が、前記Ｂ群連鎖球菌多糖抗原が前記担体に結合した場合 にＢ群連鎖球菌多糖抗原のモノラムノースエピトープに特異的に結合する親和性 を有し、前記モノラムノースエピトープは、式α−Ｌ−Ｒｈａｐ−１−［式中、 Ｒｈａｐはラムノースである。］の基を含む請求の範囲第１０項に記載の免疫吸 着剤組合せ物。
14. １４．前記抗原標識剤が、前記Ｂ群連鎖球菌多糖抗原が前記担体に結合した場合 にＢ群連鎖球菌多糖抗原のトリラムノースエピトープに特異的に結合する親和性 を有し、前記トリラムノースエピトープは、式α−Ｌ−Ｒｈａｐ（１→２）α− Ｌ−Ｒｈａｐ（１→２）σ−Ｌ−Ｒｈａｐ−１−［式中、Ｒｈａｐはラムノース である。］の基を含む請求の範囲第１０項に記載の免疫吸着剤組合せ物。
15. １５．前記抗原標識剤がモノクローナル抗体から成る請求の範囲第１０項に記載 の免疫吸着剤組合せ物。
16. １６．前記抗原標識剤がモノクローナル抗体から成る請求の範囲第１４項に記載 の免疫吸着剤組合せ物。
17. １７．前記抗原標識剤がヒツジポリクローナル抗体から成る請求の範囲第１３項 に記載の免疫吸着剤組合せ物。
18. １８．前記抗原標識剤がヒツジポリクローナル抗体から成る請求の範囲第１４項 に記載の免疫吸着剤組合せ物。
19. １９．前記ポリクローナル抗体がヒツジポリクローナル抗体から成る請求の範囲 第１７項に記載の免疫吸着剤組合せ物。
20. ２０．前記ポリクローナル抗体がヒツジポリクローナル抗体から成る請求の範囲 第１８項に記載の免疫吸着剤組合せ物。
21. ２１．検出を行なうための試験装置を包含し、前記装置は前記抗原捕捉剤を含む 容器であり、前記抗原捕捉剤は前記容器に固定化されている請求の範囲第１項に 記載の免疫吸着剤組合せ物。
22. ２２．検出を行なうための試験装置を包含し、前記装置は前記抗原捕捉剤を含む 容器であり、前記抗原捕捉剤は前記容器に固定化されている請求の範囲第１０項 に記載の免疫吸着剤組合せ物。
23. ２３．前記抗原標識剤が、酵素で標識された抗体から成る請求の範囲第１項に記 載の免疫吸着剤組合せ物。
24. ２４．前記抗原標識剤が、Ｂ群連鎖球菌多糖抗原に対するヒツジポリクローナル 抗体から単離された抗体から成る請求の範囲第２３項に記載の免疫吸着剤組合せ 物。
25. ２５．前記抗原標識剤が、酵素で標識された抗体から成る請求の範囲第２３項に 記載の免疫吸着剤組合せ物。
26. ２６．前記抗原標識剤が、Ｂ群連鎖球菌多糖抗原に対するヒツジポリクローナル 抗体から単離された抗体から成る請求の範囲第２３項に記載の免疫吸着剤組合せ 物。
27. ２７．前記抗原捕捉剤が、ＧＢＳ１／１８：６／Ｄ１と表示されるトリラムノー スＩｇＧ３モノクローナル抗体から成り、前記抗原標識剤が、Ｂ群連鎖球菌多糖 抗原に対するモノラムノースポリクローナル抗体から単離され、且つ、酵素で標 識された抗体から成る請求の範囲第１項に記載の免疫吸着剤組合せ物。
28. ２８．前記抗原捕捉剤が、Ｂ群連鎖球菌多糖抗原に対するモノラムノースポリク ローナル抗体から単離された抗体から成り、前記抗原標識剤が、酵素で標識され た、ＧＢＳ１／１８：６／Ｄ１と表示されるＩｇＧ３モノラムノースモノクロー ナル抗体から成る請求の範囲第１０項に記載の免疫吸着剤組合せ物。
29. ２９．（ｉ）Ｂ群連鎖球菌多糖抗原を含む疑いのある試験溶液に、不溶性担体に 固定化した請求の範囲第１項に記載のような抗原捕捉剤を接触させ、（ｉｉ）請 求の範囲第１項に記載のような抗原標識剤を導入して、担体に結合したＢ群連鎖 球菌多糖抗原の存在を検出することから成るＢ群連鎖球菌多糖抗原検出用免疫検 定法。
30. ３０．試験溶液と抗原捕捉剤をインキュベートすることを更に含む請求の範囲第 ２９項に記載の免疫検定法。
31. ３１．前記抗原捕捉剤がモノクローナルまたはポリクローナル抗体から成る請求 の範囲第２９項に記載の免疫検定法。
32. ３２．前記抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲第３１項に記載の免疫検 定法。
33. ３３．前記抗原捕捉剤が、ＧＢＳ１／１８：６／Ｄ１と表示されるトリラムノー スＩｇＧ３モノクローナル抗体である請求の範囲第３２項に記載の免疫検定法。
34. ３４．前記抗原標識剤が、酵素で標識したモノクローナルまたはポリクローナル 抗体であり、且つ、前記Ｂ群連鎖球菌多糖抗原が前記担体に結合した場合にＢ群 連鎖球菌多糖抗原のモノラムノースエピトープに特異的に結合する親和性を有し 、前記モノラムノースエピトープは、式α−Ｌ−Ｒｈａｐ−１−［式中、Ｒｈａ ｐはラムノースである。］の基を含む請求の範囲第２９項に記載の免疫検定法。
35. ３５．Ｂ群連鎖球菌からのＢ群連鎖球菌多糖抗原の抽出のため、試験細菌を亜硝 酸水溶液抽出処理することにより、試験溶液を得る請求の範囲第２９項に記載の 免疫検定法。
36. ３６．前記抗原捕捉剤が、ＧＢＳ１／１８：６／Ｄ１と表示されるトリラムノー スＩｇＧ３モノクローナル抗体から成り、前記抗原標識剤が、Ｂ群連鎖球菌多糖 抗原に対するヒツジポリクローナル抗体から単離された抗体から成る請求の範囲 第３５項に記載の免疫検定法。
37. ３７．（ｉ）Ｂ群連鎖球菌多糖抗原を含む疑いのある試験溶液に、不溶性担体に 固定化した請求の範囲第１０項に記載のような抗原捕捉剤を接触させ、（ｉｉ） 請求の範囲第１０項に記載のような抗原標識剤を導入して、担体に結合したＢ群 連鎖球菌多糖抗原の存在を検出することから成るＢ群連鎖球菌多糖抗原検出用免 疫検定法。
38. ３８．試験溶液と抗原捕捉剤をインキュベートすることを更に含む請求の範囲第 ３７項に記載の免疫検定法。
39. ３９．前記抗原捕捉剤がモノクローナルまたはポリクローナル抗体から成る請求 の範囲第３７項に記載の免疫検定法。
40. ４０．前記抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲第３９項に記載の免疫検 定法。
41. ４１．前記抗原標識剤が、酵素で標識したモノクローナルまたはポリクローナル 抗体であり、且つ、前記Ｂ群連鎖球菌多糖抗原が前記担体に結合した場合にＢ群 連鎖球菌多糖抗原のトリラムノースエピトープに特異的に結合する親和性を有し 、前記トリラムノースエピトープは、式α−Ｌ−Ｒｈａｐ（１→２）α−Ｌ−Ｒ ｈａｐ（１→２）α−Ｌ−Ｒｈａｐ−１−［式中、Ｒｈａｐはラムノースである 。］の基を含む請求の範囲第３７項に記載の免疫検定法。
42. ４２．Ｂ群連鎖球菌からのＢ群連鎖球菌多糖抗原の抽出のため、試験細菌を亜硝 酸水溶液抽出処理することにより、試験溶液を得る請求の範囲第３７項に記載の 免疫検定法。
43. ４３．（ａ）不溶性担体上に固定化され、ＧＢＳのモノラムノースまたはトリラ ムノースのエピトープに結合する親和性を有する抗原捕捉剤であって、前記モノ ラムノースエピトープは、式α−Ｌ−Ｒｈａｐ−１−の基から成り、前記トリラ ムノースエピトープは、式α−Ｌ−Ｒｈａｐ（１→２）α−Ｌ−Ｒｈａｐ（１→ ２）α−Ｌ−Ｒｈａｐ−１−の基から成る抗原捕捉剤［各式中、Ｒｈａｐはラム ノースである。］、（ｂ）有機酸から成る、Ｂ群連鎖球菌からのＢ群連鎖球菌多 糖抗原の亜硝酸水溶液抽出のための第１抽出剤、（ｃ）無機亜硝酸塩から成る、 Ｂ群連鎖球菌からのＢ群連鎖球菌多糖抗原の亜硝酸水溶液抽出のための第２抽出 剤（但し、第１抽出剤と第２抽出剤は、水性溶媒中で混合された場合に、共に反 応して亜硝酸を生成し得るものである）、（ｄ）過剰の亜硝酸を中和するための 中和剤、及び（ｅ）前記Ｂ群連鎖球菌多糖抗原が前記担体に結合した場合にＢ群 連鎖球菌多糖抗原のモノラムノースまたはトリラムノースのエピトープに特異的 に結合する親和性を有する抗原標識剤から成る、Ｂ群連鎖球菌多糖抗原検出用試 験キット。
44. ４４．前記抗原捕捉剤がモノクローナルまたはポリクローナル抗体から成る請求 の範囲第４３項に記載の試験キット。
45. ４５．前記抗原捕捉剤がモノクローナル抗体から成る請求の範囲第４４項に記載 の試験キット。
46. ４６．前記抗原捕捉剤が、ＧＢＳ１／１８：６／Ｄ１と表示されるＩｇＧ３モノ クローナル抗体である請求の範囲第４４項に記載の試験キット。
47. ４７．前記抗原標識剤が、酵素で標識されたモノクローナルまたはポリクローナ ル抗体から成る請求の範囲第４３項に記載の試験キット。
48. ４８．前記酵素が、過酸化水素酸化還元酵素である請求の範囲第４７項に記載の 試験キット。
49. ４９．前記抗原標識剤が、Ｂ群連鎖球菌多糖抗原に対するポリクローナル抗体か ら単離された抗体から成る請求の範囲第４３項に記載の試験キット。
50. ５０．前記有機酸が、酢酸、コハク酸及びクエン酸から成る群から選択され、前 記無機亜硝酸塩が、亜硝酸ナトリウム及び亜硝酸カリウムから成る群から選択さ れる請求の範囲第４３項に記載の試験キット。
51. ５１．検出を行なうための試験装置を包含し、前記装置は容器から成り、前記容 器は、その表面に固定化された前記抗原捕捉剤を含む請求の範囲第４３項に記載 の試験キット。
52. ５２．患者の膣または子宮頸から試験細菌試料を採取するための試料採取綿棒を 包含し、前記綿棒は、前記容器の挿入可能である請求の範囲第５１項に記載の試 験キット。
53. ５３．前記抗原捕捉剤が、ＧＢＳ１／１８：６／Ｄ１と表示されるトリラムノー スＩｇＧ３モノクローナル抗体から成り、前記抗原標識剤が、Ｂ群連鎖球菌多糖 抗原に対するポリクローナルモノラムノース抗体から単離され、酵素で標識され た抗体から成る請求の範囲第４３項に記載の試験キット。
54. ５４．前記酵素が過酸化水素酸化還元酵素であり、前記有機酸が、酢酸、コハク 酸及びクエン酸から成る群より選択され、前記無機亜硝酸塩が、亜硝酸ナトリウ ム及び亜硝酸カリウムから成る群から選択される請求の範囲第５３項に記載の試 験キット。
55. ５５．抗原標識剤とのインキュベーション後に、担体を洗浄して、非結合の抗原 標識剤を除去するための洗浄剤、並びに、検出基質として、（ｉ）第１検出基質 成分であるＨ２Ｏ２、及び（ｉｉ）第２検出基質成分である３，３′，５，５′ −テトラメチルベンジジンを更に包含する請求の範囲第４３項に記載の試験キッ ト。
56. ５６．ＥＬＩＳＡ方式である請求の範囲第４３項に記載の試験キット。
57. ５７．ラテックス凝集方式である請求の範囲第４３項に記載の試験キット。
58. ５８．放射線免疫検定方式である請求の範囲第４３項に記載の試験キット。
59. ５９．医薬的に許容可能な担体に結合した炭水化物から成り、前記炭水化物は、 Ｂ群連鎖球菌多糖抗原のラムノースエピトープに対する抗体産生を賦活する免疫 反応性を有し、前記ラムノースエピトープは、（ｉ）式α−Ｌ−Ｒｈａｐ（１→ ２）α−Ｌ−Ｒｈａｐ（１→２）α−Ｌ−Ｒｈａｐ−１−のトリラムノース基、 （ｉｉ）式α−Ｌ−Ｒｈａｐ−１−のモノラムノース基、または、（ｉｉｉ）上 記（ｉ）及び（ｉｉ）に各々記載のトリラムノース及びモノラムノースの基の混 合物［各式中、Ｒｈａｐはラムノースである。］から成る、Ｂ群連鎖球菌多糖抗 原に対する抗体産生を賦活する免疫原複合体。
60. ６０．前記炭水化物が、前記医薬的に許容可能な担体に結合したＢ群連鎖球菌多 糖抗原から成る請求の範囲第５９項に記載の免疫原複合体。
61. ６１．前記炭水化物が、ラムノース部分から成り、前記部分は、（ｉ）式α−Ｌ −Ｒｈａｐ（１→２）α−Ｌ−Ｒｈａｐ（１→２）α−Ｌ−Ｒｈａｐ−１−のト リラムノース基、（ｉｉ）式α−Ｌ−Ｒｈａｐ−１−のモノラムノース基、また は、（ｉｉｉ）上記（ｉ）及び（ｉｉ）に各々記載のトリラムノース及びモノラ ムノースの基の混合物［各式中、Ｒｈａｐはラムノースである。］から成る請求 の範囲第５９項に記載の免疫原複合体。
62. ６２．前記担体が、前記医薬的に許容可能なタンパク質担体から成る請求の範囲 第６０項に記載の免疫原複合体。
63. ６３．前記医薬的に許容可能な担体がタンパク質担体から成る請求の範囲第６１ 項に記載の免疫原複合体。
64. ６４．不溶性担体、及び、前記不溶性担体の表面に固定化された抗体捕捉剤から 成り、前記抗体捕捉剤は、（ａ）式α−Ｌ−Ｒｈａｐ（１→２）α−Ｌ−Ｒｈａ ｐ（１→２）α−Ｌ−Ｒｈａｐ−１−のトリラムノース基、及び（ｂ）式α−Ｌ −Ｒｈａｐ−１−のモノラムノース基［各式中、Ｒｈａｐはラムノースである。 ］から選択されるラムノース部分から成る免疫吸着剤。
65. ６５．前記ラムノース部分が、請求の範囲第５８項に記載のようなトリラムノー ス基から成る請求の範囲第６４項に記載の免疫吸着剤。
66. ６６．前記ラムノース部分が、請求の範囲第５８項に記載のようなモノラムノー ス基から成る請求の範囲第６４項に記載の免疫吸着剤。
67. ６７．不溶性担体、及び、前記担体の表面に、表面の単位面積当り約１６０ｎｇ 以下のコーティング密度でコートされた、Ｂ群連鎖球菌抗原に対するトリラムノ ースモノクローナル抗体から成る免疫吸着剤。
68. ６８．前記トリラムノースモノクローナル抗体が、ＧＢＳ１／１８：６／Ｄ１と 表示されるＩｇＧ３アイソタイプである請求の範囲第６７項に記載の免疫吸着剤 。
69. ６９．Ｂ群連鎖球菌多糖抗原に対するヒツジポリクローナル抗体から単離された 抗体。
70. ７０．前記抗体が、Ｂ群連鎖球菌多糖抗原に対するヒツジポリクローナルモノラ ムノース抗体である請求の範囲第６９項に記載の抗体。