JPH06507018A - 経時細胞中の顕微鏡的細胞をスクリーニングする方法および装置 - Google Patents

経時細胞中の顕微鏡的細胞をスクリーニングする方法および装置

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JPH06507018A JP4510966A JP51096692A JPH06507018A JP H06507018 A JPH06507018 A JP H06507018A JP 4510966 A JP4510966 A JP 4510966A JP 51096692 A JP51096692 A JP 51096692A JP H06507018 A JPH06507018 A JP H06507018A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 経時細胞中の顕微鏡的細胞をスクリーニングする方法および装置 技術分野 本発明は一般に、経時試料中の細胞をスクリーニングする方法および装置に関す る。さらに特に、本発明は、特異的なモノクローナル抗体か結合したミクロスフ イアを用いて１つの□細胞集団を除去し、多数の部の白血球集団差異を得ること により経時細胞を分析することを目的とする。
本発明は一般に、研究、診断、医学または工業的目的で、選択された特性を示す 集団の計数のために生物細胞または形成体をスクリーニングする自動アナライザ およびこれを用いる方法に関する。さらに特に、本発明を実施する自動アナライ ザおよび方法により、細胞および形成体の多数の部の分類、細胞および形成体の 機能的表現型、白血病性、リンパ腫および固体腫瘍細胞の分類を、とりわけ電子 的および光学的手法と選択的生体分子の特異性との独特な組み合わせ、例えば抗 体を、細胞および形成体のこのようなスクリーニングおよび選択的計数に用いて 実施することができる。
背景技術 ヒト末梢性血液の従来の完全血液細胞（ＣＢＣ）分析の自動化された血液細胞カ ウンタによる自動化は、アメリカ合衆国フロリダ州バイアレア所在のクールター ・エレクトロニクス・インコーホレーテッド（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｅｌｅｃｔｒｏ 旧ｃｓ　Ｉｎｃ、）製のクールター・カウンタ（ＣＯＵＬＴＥＲＣ０ＵＮＴＥＲ ）　（登録商標）モデルＡにより好首尾に達成された。この器機の電子的粒子検 出システム原理は、Ｗａｌｌａｃｅ　Ｈ，Ｃｏｕｌｔｅｒの米国特許第２６５６ ５０８号明細書（１９５３年ＩＯ月２０日刊行）に開示されている。厄介であり 費用がかかる光学的検出手段またはレーザーの使用を、このクールター電子的検 出原理に基づいて作動する粒子分析器械類のみにより回避することかできる。
このクールター検出原理は、より高性能である器械類、例えばクールター・カウ ンタ（登録商標）モデルＳタイプの器機に開発および拡張され、この器機により 、ＣＢＣパラメータ、絶対的細胞計数、血小板計数および形態、赤血球（ＲＢ　 Ｃ）形態、正常および異常な血液標本の解釈が特定のコンピュータプログラムに より可能となった。
クールター電子粒子検出原理は、直流（ＤＣ）アパーチャ電力供給を用いるアパ ーチャ検出回路を備える。このような粒子センサは構造が単純であり、アメリカ 合衆国の臨床実験においておよび世界の他の国を通じてクールター・カウンタ（ 登録商標）自動アナライザのほぼ全体的な受容により証明されたように極めて耐 久性かあり信頼できる。この基本的なアパーチャ検出回路の改良はＷａｌｌａｃ ｅ　Ｃｏ１１ｔｅｒおよびＷａｌｔｅｒ　Ｈｏｇｇの米国特許第３５０２９７４ 号明細書（１９７０年刊行）に開示されている。標準の直流アパーチャ電力供給 に加えて、分類目的の付加的なパラメータの検出を可能にする高周波数アパーチ ャ電流が用いられた。高周波数アパーチャ電流は、血液細胞の内部導電率および この容積の関数である信号を発生した。直流アパーチャ回路により同時に発生し た信号は、主に細胞の容積を示す従来のＤＣ振幅信号である。無線周波振幅を直 流パルス振幅により高速ディバイダ回路を用いて除して細胞の容積および内部導 電率の関数である商を得、これは好都合に「不透明度」と呼ばれる。この原理は さらにＷａｌｌａｃｅ　Ｃｏ１１ｔｅｒおよびＷａｉｔｅｒ　Ｈｏｇｇにより１ ９７０年に刊行された米国特許第３５０２９７３号明細書に記載されている。こ のパラメータは細胞分類システムにおいて適用性を有する。単一のまたは一対の いずれかの別個のアパーチャをこの目的に用いることかてきる。
異なる集団の分類は、生じた信号対のデータを対照することにより達成される； 一方は粒子の容積の測定値であり、他方は細胞の内部抵抗率または不透明度の測 定値である。このデータを与える好都合の形態は、散布プロット（ｓｃａｔｔｅ ｒｐｌｏｔ）または散布図と呼はれる２次元プロットによる。このようなプロッ トは、ｒＦｌｏｗ　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　ａｎｄ　Ｓｏｒｔｉｎｇ、　３７１頁 ；　Ｍｅｌａｍｅｄ　ＭｅｌａｎｅｙおよびＭｅｄｅｌｓｏｈ口編、１９７９年 、アメリカ合衆国ニューヨーク州ニューヨーク所在のＪｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆５ ｏｎｓＪに十分に記載されている。
図５Ａは、正常な血液の試料のデータプロットの一例である。
各点は、個別の細胞を示す。基準線上の高さは、細胞の相対的容積を示す。点の 垂直基準線の右側までの距離は、相対不透明度を示す。通常の白血球（ＷＢＣ） のプロット（赤血球を除去した）は、これらの大きさおよび内部組成の本来的な 差異の結果である３つの個別の集団を示す３つの点のクラスターを示す。
所要に応じて、適切な回路構成を用いて、これらの集団を計数して各々の数を得 る。細胞をこれらの固有の差異に基づいて分類する。
クールター電子粒子検出原理の最初の適用は、赤血球カウントを実施することで あり、次に他の赤血球パラメータのより精巧な決定であった。赤血球を全体の末 梢性血液から除去することにより、白血球集団の分析を、赤血球の除去が請求め て測定した残りの白血球集団の性質を顕著に損傷しない限り実施することかでき る。有用であり広範囲に用いることができるが、後の白血球測定のすへての観点 において完全には満足できない赤血球溶解試薬がこのために開発された。
種々の角度においてＤＣ容積単独または光散乱を用いた白血球のフロー分析の以 前の方法は、好中球、好塩基球および好酸球集団を含むリンパ球、単球および顆 粒球に対応する白血球の３つのクラスターを示した。おおよそであるか有用な好 酸球濃度の評価を、若干の試料において実施することができる。第５の主要な集 団はこの方法では比較的過小である。好酸球もまた、特別の螢光手法を用いて別 個のクラスターとして観察された。
これらの螢光手法は、フローサイトメトリー機器、例えばクールター・コーポレ ーションから入手できるＥＰＩＣ３（登録商標）フローサイトメータにおいて用 いられる。このような器機は、ンースフローにより結合した円柱状流において、 細胞が一列に配列し、レーザービームを介して個別に通過するように移動する細 胞の原理を用いた。次に、細胞からの光散乱および／または螢光信号を細胞集団 の分類に用いた。細胞を吸収または螢光色素で染色することにより、付加的な細 胞集団の分類が可能になる。自動多次元パラメータ（ｍｕｌｔｉｐａｒａｍｅｔ ｅｒ）分析に用いる器械類および螢光色素の開発は、さらにＲ，Ｃ，Ｌｅｉｆ等 によりＣｌ１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２３巻、１４９２〜９８頁（ １９７７）中に記載されている。これらの開発により、白血球の同時集団分類の 数が４つ、すなわちリンパ球、単球、好酸球および［顆粒球Ｊ　（好中球および 好塩基球）に拡張された。
より近年の血液学的分析機器は、光散乱手法および細胞のぺルオキシダーゼ酵素 染色（吸収色素）を用いて、５つの部の白血球差異を生した。さらに、特異的な 反応性生体分子、例えばモノクローナル抗体と組み合わされた色素により、機能 的下位区分を含むことができる白血球分類の数が増加した。
同様のものを用いる改良された簡単で自動の器機と方法を親出願の米国出願番号 ５８７６４６．１９９０年９月２０日出願、ｒＡＵＴＯＭＡＴＥＤ　ＡＮＡＬＹ ＺＥＲＡＮＤ　ＭＥＴＨＯＤ　ＦＯＲ５ＣＲＥＥＮＩＮＧ　ＣＥＬＬＳ　ＯＲＦ ＯＭＥＤ　ＢＯＤ［ＥＳ　ＦＯＲＥＮＵＭＥＲＡＴＩＯＮ　ＯＦ　ＰＯＰＵＬＡ Ｔ［ＯＮＳ　ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧＳＥＬＥＣＴＥＤ　ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳ Ｔ［Ｃ３Ｊに開示しており、これは、米国出願番号０２５３４５．１９８７年３ 月１３日出願、同様の発明の名称のものの継続出願である。この出願はエレクト ロニ・ツクセンシング　アパーチャ原理の出願、即ち、細胞の限定された集団又 は形成体を固定および／または計数するための選択された生体分子の特異性およ び顕微鏡的粒子技術、と結合する。
自動アナライザーを特別な溶菌試薬および／または顕微鏡的ミクロスフイアに結 合する抗体又は組成を変化させる支持体と共に使用できる。
第２の出願、米国出願番号２８５８５６．１９８８年１２月１６日出願、発明の 名称ｒＭＥＴＨＯＤ　ＡＮＤ　ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ　ＦＯＲ５ＣＲＥＥＮＩＮＧ ＣＥＬＬＳ　ＯＲＦＯＲＭＥＤ　ＢＯＤＩＥＳ　ＷＩＴＨＰＯＰＵＬＡＴ［ＯＮ Ｓ　ＥＸＰＲＥＳＳ［ＮＧ　５ＥＬＥＣＴＥＤ　ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣ ＳＪは全血試料又はその部分から目的のサブセットのスクリーニングを開示する 。
第３の出願、米国出願番号３３９１５６．１９８９年４月１４日出願、発明の名 称ｒＭＥＴＨＯＤ　ＡＮＤ　ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ　ＦＯＲ５ＣＲＥＥＮ［ＮＧ　 ＣＥＬＬＳＯＲＦＯＲＭＥＤ　ＢＯＤＩＥＳ　ＷＩＴ）Ｉ　ＰＯＰｔＪＬＡＴＩ ＯＮＳ　ＥＸＰＲＥＳＳ［ＮＧ　５ＥＬＥＣＴＥＤＣＨＡＲＡＣＴＥＲ［ＳＴ［ Ｃ３ＵＴ［ＬＩＺ［ＮＧ　ＡＴ　ＬＥＡＳＴ　ＯＮＥ　５ＥＮＳｔＮＧ　ＰＡＲ ＡＭＩＥＴＥＲＪは多く又は５つに分けた白血球差、リンノく球すブセ・ソト及 び全血試料から又は赤血球および／または集団および／またはそのサブセットの 脱離により除去された白血球の集団を有する試料から１つ又はそれ以上の先約又 は電気的パラメーターを用いて実施された重複決定を開示する。
第４の出願、米国出願番号０７１５２５２３Ｌ　１９９０年５月１７日出願、発 明の名称ｒＭＥＴＨＯＤ　ＡＮＤ　ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ　ＦＯＲ５ＣＲＥＥＮ［ ＮＧＯＢＳＣＵＲＥＤ　ＯＲＰＡＲＴＩＡＬＬＹ　０ＢＳＣＵＲＥＤ　ＣＥＬＬ Ｓ　Ｊは、特異的なモノクローナル抗体を有するミクロスフイアを用いることに より不明瞭な細胞の解析を開示しており、互いの領域に散布図上の１つの細胞集 団領域から不明瞭な細胞の検出した特徴を移動する。
上記４つの参照出願の各々は参照として本明細書中に含まれる。
改良された血液学的分析器機およびこれを用いる方法は、米国特許通番第０２５ ４４２号、１９８７年３月１３日出願および継続出願である米国特許通番第１２ ９９５４号、１９８７年１２月でおり、これをここに参照として包含する。この いわゆる［ＶＣ３Ｊ血液学的器機は光散乱および電子検出手法を用いて白血球（ Ｌ）ＷＢＣ集団の多数の部の区別を得る。しかし、この血液学的器機はＬサブセ ットの区別を実施せず、これはこのようなサブセットかＬ集団中で不明瞭になる ためである。
微視的粒子の細胞集団の各細胞への選択的結合により少なくとも１つの集団の初 期の位置の原因であるパラメータの変性か可能になる。添加が測定された容量お よび／または不透明度に影響を与える、選択された標的集団の各々の細胞への複 数の微視的粒子の添加の結果、集団を表す散布図の点の位置がシフトする。
既知の特異性を有する抗体を、微視的粒子の覆いに用いる。
この覆いは粒子に、抗体が特異的である抗原を表現するある細胞に選択的に結合 する能力を与える。これらの覆われた又はタグ化された細胞は、新たな存在物と 同様に挙動する粒子と細胞との組み合わせである。これらの不透明度、容積また は不透明度と容積との両方のパラメータを、得られた信号における細胞と粒子と の両方への影響の合計を表すと考えることかできる。
成分の特性か異なる場合には、新たな存在物は最終的な影響に従って散布図上の 新たな位置に移動する。新たな位置は、細胞単独の以前の位置と対照的に、この ような新たな存在物または新たな存在物の群の分類を可能にする。細胞に結合し た粒子か磁性である場合には、当然現在の実際に従って、新たな存在物を磁石を 用いることにより捕集することかできる。急速に混合した場合には、研究下での 細胞の特性に悪影響を与えることなく集団の完全な捕集を含む予期されない結果 が生じる。
３つの別個の細胞の集団のみを、以上に述へたＤＣ容積および不透明度パラメー タの固有のおよび独特の特性を用いることにより血液試料から容易に固定および 計数することかできる。
付加的な工程、例えば改良された溶解システムを実施してより多くの集団の検出 および計数を可能にしなければならない。当然、これらの付加的な集団は、リン パ球、単球および顆粒球と呼はれる３つの基本的なもののサブ集団を表す。上記 に述へた応用に従う工程は、これらの基本的な３つの集団の副次集団をいかにし て得るかを例示する。
このような単純なアパーチャ検出手法を２種類以上の生物学的粒子と組み合わせ て用いて、所与の集団を示す点クラスターの独特てあり新たな場所を生しさせる ことができる。点プロットまたは散乱図における集団のこの選択的な動きは再現 可能であり、基本的な３つの集団と別個の集団を分類するのに用いることができ る。
ＤＣ容積および不透明度検出手法の最初のおよび固有の組み合わせを、微視的粒 子を選択された別個の細胞に結合させることにより変性させることができる。選 択性は、生体分子、とりわけ粒子表面上の覆いとして用いられる抗体の本質また は特異性により粒子に与えられる。表面に粒子を全く有しない細胞のみの集団は 、他の集団または副次集団と同一の点プロ・ソト位置および従って互いに識別不 能な位置を占める請求めて同定され、計数され、研究される特定の集団の細胞へ の選択的吸着を有する粒子の付加はこの方法を用いて可能である。十分な質量の 選択的粒子の関連する別個の集団への選択的付加の結果、この集団の点プロット 位置の、各細胞の質量、容積および不透明度の新たな独特の組み合わせの結果と してのシフトが発生する。
「反応体」の言葉は幾つかの上記出願中で用いられて、溶菌剤およびモノクロー ナル抗体を定義するけれとも、反応体は、細胞の表面にある１つ又はそれ以上の 特異的な分子を検出しこれと反応する種々の試薬を含み得る。幾つかの例を以下 に示す：区座庄　特異の分子 抗体　抗原 薬物　薬物リセブタ ホルモン　ホルモンリセブタ 成長因子　成長因子リセブタ 反応体は細胞上の特異の分子に結合する。これらの反応体は、化学反応の一部を 形成することは確かである；しかじ、反応体は必ずしも化学的に変化するとは限 らない。
本発明の最も価値のある特徴の１つは、これか、単純であり耐久性のあるクール ター検出操作を用いることである。これは安定であり、複雑な光学的システムの 複雑さおよび費用を必要としない。ＲＦ発振器および検出器の付加として必要で ある回路構成は経済的であり、コンパクトであり、信頼できる。単一のアパーチ ャが、必要であるもののすへてであるが、第２のまたはさらに第３のアパーチャ の付加により、さらに大きい試料のスルーブツト速度を経済的に達成することか できる。
発明の開示 本発明は、経時全血試料またはこの一部の細胞のスクリーニングを実施して、多 数の部の白血球集団差異を得る方法および装置を提供する。白血球集団とリンパ 球集団との合計を第１に電気的に計数し、次に経時好中球集団を含む好中球集団 を同一のまたは第２の試料部から除去する。次に、経時好酸球を含む単球、好塩 基球、リンパ球および好酸球の残りの白血球集団を電気的に計数し、２つの計数 を比較して５つの部の白血球差異参照して説明する。ここで： 図１−１３は親出願の通番第５８７６４６号明細書に開示された例を説明する： 図１は、親出願の１つの細胞集団アナライザの例のブロック図式図である： 図２は、親出願の第２のアナライザの例のブロック図式図である： 図３は、ａｔおよび図２に対応する親出願の１つの特定のアナライザの例である ； 図４は、親出願の他のアナライザの例のブロック図式図である： 図５Ａおよび５Ｂは、図２および３に関して例示したものと類似した原型のアナ ライザシステムを用いた１つのセットの結果の散布図である： 図６は、親出願の他のアナライザの例のブロック図式図である； 図７は、親出願の尚他のアナライザの例のブロック図式図である； 図８Ａおよび８Ｂ、９Ａおよび９Ｂ、ＩＯＡおよびＩＯＢ並びにＩＩＡおよびＩ ＩＢは、図６および７に関して例示したものと類似した原型のアナライザシステ ムを用いた１つのセットの結果の散布図である； 図１２は、親出願の尚他のアナライザの例のブロック図式図である： 図１３は、図１２に関して例示したものと類似した原型のアナライザシステムを 用いた１つのセットの結果の散布図である；図１４および１５は本発明において 開示されている例を示す；図１４Ａ−Ｃは２４時時間待試料の散布図である：図 １５Ａ−Ｃは、３６時時間待試料の散布図である。
本発明を実施する態様 図１−１３は、親出願の通番第５８７６４６号明細書の例を示す。
図１において、親出願の通番第５８７６４６号明細書の第１の例の細胞集団分析 方法および装置を一般的に参照符号１０で示す。アナライザＩＯは、例えば全血 試料中にまたはこれからの少なくとも第１のセットの生存可能な生物細胞（図示 せず）を含む生物学的試料１２を含む。生物学的試料１２の細胞は、定量的およ び／または定性的測定または分析における生物学的反応に含まれる。試料１２は 、細胞が加えられる緩衝液を含むことかできる。
試料１２をライン１４を介して、ライン１８を介した少なくとも１種の反応体１ ６と混合する。次に、赤血球（ＲＢＣ）を混合物から機能的に示されたＲＢＣ除 去ステーション２０により除去する。ＲＢＣは多くの方法でステーション２０に より混合物から除去することができる。ＲＢＣを溶解剤により反応体１６中で溶 解することができる。これに用いることかできる１種の選択的溶解剤およびクエ ンチ剤は通番第１３０９１１号、１９８７年１２月１０日出願、題名ｒＭＥＴ） ＩＯＤ　ＡＮＤ　ＲＥＡＧＥＮＴ　ＳＹＳＴＥＭ　ＦＯＲＩＳＯＬＡＴ［ＯＮ、 ＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮ　ＡＮＤｌｏＲＡＮＡＬＹＳＩＳ　ＯＦ　ＬＥＵ ＫＯＣＹＴＥＳＦＲＯＭ　ＷＨＯＬＥ　ＢＬＯＯＤ　ＳＡＭＰＬＥＳＪ　（これ は通番第０２５３０３号、１９８７年３月１３日出願、題名同一のＣＴＰである ）に開示されており、これをここに参照として包含する。反応体１６は、ＲＢＣ 特異性抗体がミクロスフイア（図示せず）に結合した複数の磁性ミクロスフイア であるかまたはこれを含むことができる。この例において、用いられる特定の赤 血球特異性抗体は米国特許第４７５２５６３号明細書、題名ｒＭＯＮＯｃＬＯＮ ＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＹＦＯＲＲＥＣＯＶＥＲＹ　ＯＦ　ＬＥＵＫＯＣＹＴＥＳ 　ＩＮ　Ｆ（ＵＭＡＮ　ＰＥＲＩＰＨＥＲＡＬ　ＢＬＯＯＤ　ＡＮＤＭＥＴＨＯ Ｄ　ＯＦ　ＲＥＣＯＶＥＲＹ　ＥＭＰＬＯＹＩＮＧ　５ＡＩＤ　ＭＯＮＯＣＬＯ ＮＡＬ　ＡＮＴ［ＢＯＤＹＪに開示されており、これをここに参照として包含す る。また反応体１６は、試料緩衝液に加えてまたはこの代わりに緩衝液を含むこ とができる。さらに反応体１６は選択的ＲＢＣ溶解剤およびＲＢＣ特異性ミクロ スフイアの組み合わせとすることができる。
ＲＢＣがほとんど混合物から除去された後に、混合物の一部を白血球（ＷＢＣ） アナライザ２２にライン２４を介して供給する。ＷＢＣアナライザ２２は少なく とも混合物中のＷＢＣの数を計数する。ＷＢＣアナライザ２２はまたＷＢＣの１ 種以上の容積または不透明パラメータを測定することができる。アナライザ２２ からの結果をコンパレータ２６にライン２８を介して供給する。
ＲＢＣが除去された混合物の第２の部分をＷＢＣサブセット減数ステーション３ ０にライン３２を介して供給する。ＷＢＣを混合物から多くの方法で減じること ができる。ＷＢＣサブセットの１つに特異的なモノクローナル抗体が結合したミ クロスフイアを混合物に加えることができる。非磁性または磁性ミクロスフイア をＷＢＣに結合させて細胞の結果的な不透明度または容積パラメータを変化また はシフトさせることができる。また磁性ミクロスフイアを、次に混合物から磁場 により除去することかできるＷＢＣに結合させることかできる。
次に、変化した１種以上のパラメータを除去したかまたはこれを有するＷＢＣサ ブセット集団を含む混合物をＷＢＣサブセットアナライザ３４にライン３６を介 して供給する。アナライザ３４はアナライザ２２と同一であることができる。次 に、アナライザ３４の結果をコンパレータ２６にライン３８を介して供給する。
次にコンパレータ２６はアナライザ２２からのＷＢＣ結果をアナライザ３４から の変性した結果と比較して選択された白血球集団の少なくとも１つの特性、例え ば特定の範囲内の細胞の数を決定する。
図２において、親出願を実施する細胞集団分析方法および装置の第２の例を一般 的に参照符号４ｏで示す。アナライザ４゜は、再び例えば全血試料中にまたはこ れからの少なくとも第１のセットの生存可能な生物細胞（図示せず）を含む。生 物学的試料４２の細胞は、定量的および／または定性的測定または分析における 生物学的反応に含まれる。再び、試料４２は、細胞が加えられる緩衝液を含むこ とができる。
試料４２をライン４４を介して、ライン４８を介した少なくとも１種の反応体４ ６と混合する。アナライザ４ｏにおいて、ＲＢＣを混合物から除去し、同時に少 なくとも１つのＷＢＣサブセットの少なくとも１つの特性を機能的に示したＲＢ Ｃ除去およびＷＢＣシフティングステーション５０により変化またはシフトさせ る。上記のように、ＲＢＣを混合物からステーションにより多くの方法で除去す ることができ、これは前にステーション２０に関して計数した。同時に、同一の 混合割合で、ＷＢＣを、一般に非磁性ミクロスフイアに結合させて、細胞の結果 的な不透明度および／または容積パラメータを変化またはシフトさせる。
次に、ＲＢＣを除去した混合物およびシフトしたＷＢＣサブセット集団をアナラ イザ５２にライン５４を介して供給する。
アナライザ５２はアナライザ２２とほぼ同一であることができる。このようにし て、アナライザ４０は、選択されたＷＢＣ集団またはＷＢＣサブセットの少なく とも１つの特性の迅速であり直接の分析を提供する。
親出願を実施し、第１および第２のアナライザ１０および４０の分析方法を達成 することができる分析機器の１つの特定例を、図３において一般的に参照符号５ ６で示す。
装ｆｆ１５６は、１つの特定の列挙のみを示しており、これは親の出願の原理に よりほとんど無数に詳細を変化させることができる。さらに、装置５Ｇは一般的 な機能的詳細を示しており特定の好適例か多数の既知方法で構造的な要求を満た される場合がある。
装置ｔ５６は興味ある生物試料、例えば装置５６への試料１２または４２を排出 するのに有用なアスピレータポンプ機構５８を含む。アスピレータ５８はライン ６０を介してサンプリング弁６２に結合させ、これを試料プローブ６３に結合す ることができる。希釈液ポンプ６４は希釈液または緩衝液を含む場合がありまた ライン６６を介して弁６２に結合される。弁６２およびポンプ５８は適当な場合 ポンプ６４を介して希釈液と共に生物試料Ｉ２または４２を吸引除去することか できる。
次いで反応体混合物または生物試料それ自体を、排出ライン６８を介して混合装 置７０に供給する。混合機７０は試料または反応体か供給される混合チャンバ７ ２を含む。次いでＲＢＣをライン７４を介しチャンバ７２に供給される溶解剤ポ ンプ７３からの溶解剤により溶解する。この際アナライザＩＯおよび４０の操作 は異なるので別々に記載する。
アナライザＩＯの場合に、ＲＢＣかポンプ７３からの溶解剤により溶解した際、 次いて反応か完了する際冷却剤または固定液をライン７６を介してステーション ７５から添加する。この反応は７８で機能的に示すようにチャンバ７２て溶解剤 と試料とを混合することにより促進することができる。
適当な混合装置７０の詳細、ここで用いることかできるものは１９９０年５月１ 日出願の出願番号５１７．３０９号に開示し、これは１９８７年３月１３日出願 の出願番号０２５．３３７号の続きであり、ｒＭＥＴＨＯＤ　ＡＮＤ　ＡＰＰＡ ＲＡＴＵＳ　ＦＯＲＲＡＰＩＤ　Ｍ［Ｘ［ＮＧ　ＯＦ　ＳＭＡＬＬ　ＶＯＬＬＩ ＭＥＳＦＯＲＥＮＨＡＮＣ［ＮＧ　ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ　ＲＥＡＣＴＩＯＮＳ 　Ｊ　と題し、これをここに参考のために記載する。混合機７０を用いることに より反応は速さにおいて細胞の興味ある特性を有意に損傷することなく著しく高 められ、例えば反応温度を上げることにより発生させることかできる。さらに、 反応は一般に有意に１分未満で完了し、一般に１５秒以下の程度である。これは 自動大容量分析装置５６の迅速分析を可能にする。
次いて溶解剤（ステーション２０からのような）によりＲＢＣを除去した冷却反 応体をライン８０を介して保持チャンバ８２に供給し、この場合これか混合物の 第２部分を保持する。混合物の第１部分をチャンバ８２からライン８４を介して ＷＢＣ分析器８６（すなわち分析器２２）に供給する。分析器８６はウオーレス 　エイチ２クールターにより米国特許第２．６５６．５０８号に記載する計数お よびサイジング技術により多くの物理的種類であり得譲り受け人、クールター　 エレクトロニクス社の多数の市販血液細胞カウンタて体系化されている。
アナライザ８６は、一般に、フローセンサまたは感知チャンノく８８を含む。チ ャンバ８８はそのため孔９２を有するトランスデユーサ９０を含む。このチャン バ８８はそこで流体と接触する第１電極９６を有する第１部分を含む。
チャンバ部分９４および電極９６は孔９２によりそこに第２電極１００を有する 第２チャンバ部分９８と通じる。電極９６および１００を反応リード１０２およ び１０４を介してＲＦ／ＤＣ電源および感知回路＋０６に結合する。回路１０６ は両方のＤＣ１または低周波数電流もしくは信号、および電極９６と１００との 間の高周波数信号を結合させる。
低周波数信号は孔９２を通る細胞により発生する信号パルスの増幅を感知するの に用いられる。高周波数信号は孔９２を通る同一の細胞の電気的不透明度を得る のに用いられる。
細胞の電気的不透明度の測定はつオーレス　エイチ、クールターおよびウォルタ ー　アール、ホックにより米国特許第３，５０２、９７４号ならびにこの特許以 後の、譲り受け人、クールターエレクトロニクス社の種々の特許ならびに刊行物 に開示されている。ここで用いることかできる１つの特定の回路はｒＰＡＲＴＩ ｃＬＥＡＮＡＬＹＺＥＲＦＯＲＭＥＡＳＵＲｒＮＧ　ＴＨＥ　ＲＥＳＩＳＴＡＮ ＣＥ　ＡＮＤ　ＲＥＡＣＴＡＮＣＥ　０ＦＡＰＲＴ［ＣＬＥＪ　と題する米国特 許第４．７９１．３５５号に開示している。
感知した細胞からの回路１０６により発生する信号はＤＣ信号リード１０８およ びＲＦ信号リード　１１０を介してコンパレータ　１１２（コンパレータ２６と 同様に）に結合する。コンパレータ　１１２は第１部分、すなわち、控除したＷ ＢＣサブセットを含まないものから、記載されるべき第２部分からの結果と比較 するために、発生する信号を保持することができる。
アナライザ８Ｇはセンサ８８中で、良く知られた方法で、細胞に焦点を当てるた めにシースフローを含む場合かある。シースフローは流体システム１１４により 提供し、既知方法において１組のライン１１６および１１８によりセンサ８８に 結合することができる。試料反応混合物は導入チューブ１２０を介してセンサ８ ８に供給されセンサ８８から出口チューブ１２２を介して廃棄物容器１２４に供 給される場合がある。
混合物の第１部分をアナライザ８６で分析した一方、第２部分をチャンバ８２に 保持し、混合機７２を洗浄ライン１２６を介して洗浄もしくはフラッシングし廃 棄物ライン１２８を介して排出する。
チトンバ７２を洗浄した後、第２部分をライン１３０を介しチャンバ７２に戻す 。ステーション３０のように、次にＷＢＣサブセットをライン１３４、弁１３６ およびチャンバライン１３８を介してステーション１３２からＷＢＣミクロスフ イアを添加することにより控除する。
ＷＢＣミクロスフイアを混合機構７８により第２部分と混合する。
結合ＷＢＣミクロスフイアを含む反応混合物をライン８０．チャンバ８２および ライン８４を介してアナライザ８６（すなわち、アナライザ３４）に供給し、そ こで第２部分を第１部分のように分析し次いて結果をコンパレータ１１２（すな わち、コンパレータ２６）で比較する。少な（とも１つのＷＢＣサブセット細胞 パラメータを第２部分、例えば細胞不透明度でＷＢＣサブセット結合ミクロスフ イアにより変化させ、次いて分析することかできる変化した結果を提供する。
磁性ＷＢＣミクロスフイアを用いることにより、その後これに結合したＷＢＣサ ブセットを磁界または磁石１４０による混合工程の間および／またはその後に磁 界により除去することができる。
磁界は電磁手段またはチャンバ７２に関して物理的に移動できる磁石１４０によ り提供され磁気的に結合したＷＢＣサブセットを捕獲することかできる。次に結 合ＷＢＣサブセットを有しない第２部分をライン８０、チャンバ８２およびライ ン８４を介して以前記載した方法（アナライザ３４のような）でアナライザ８６ に供給して分析結果を得る。
次いて装置５６を準備して次の分析のための次の試料を採取する。プローブ６３ はプローブ洗浄機構１４２により洗浄することができラインおよびチャンバフ２ および８２を通常の方法でフラッシングすることができる。次の試料混合物のそ れぞれの分析結果を迅速な自動形式で得る。次の試料混合物の分析の間の期間は １分以下の程度で可能である。
分析装置５６の操作で、アナライザ４０のように、ＲＢＣ溶解剤／反応体４Ｇお よび試料４２を含む反応混合物をステーション１３２からの非磁性ＷＢＣミクロ スフイアと共にチャンバフ２て混合し、これをＷＢＣサブセットの１つと結合す る。冷却剤７４を反応混合物に添加し次いてライン８０、チャンバ８２およびラ イン８４を介して分析のためのＷＢＣアナライザ８６（すなわち、アナライザ５ ２のようなしの）に供給する。
溶解剤の利用に変えて、それぞれのアナライザｌＯおよび４０で、試料１２また は４２を任意の溶解剤を用いずに弁６２を介して混合機７０に供給することかで きる。この場合、ＲＢＣはＲＢＣミクロスフイアステーション１４４からのＲＢ Ｃ特異的抗体を結合したミクロスフイアを用いて磁気的に除去することかてきさ らにライン１４６を介して弁１３Ｇにさらにその後ライン１３８を介してチャン バ７０に供給する。溶解剤を用いない場合、結合ＲＢＣを上述した磁気的に結合 したＷＢＣとほとんと同一の方法で混合した後磁石１４０により磁気的に除去す る。
さらに、第２の場合に反応の速度を速めるために、ＲＢＣ溶解剤およびＲＢＣ磁 性ビーズをともに含む反応混合物を用いることかできる。反応混合物を況合し、 溶解物を冷却し結合ＲＢＣを磁気的に除去し次にＷＢＣを以前記載したように分 析する。
図４に関して、親出願を具体化する細胞集団の分析方法および装置の他の好適例 を一般的に参照番号１４８により示す。アナライザ１４８は、全血試料の中また はこれからのようなさらに少なくとも第１のセットの生存能力のある生物細胞を 含む生物試料１５０を含む。また試料１５０は細胞を添加する緩衝液を含む場合 かある。
試料＋５０はライン１５６を介した少なくとも１つの反応体＋５４とライン１５ ２を介して結合する。次いてＲＢＣは上述のように機能的に示されるＲＢＣ除去 ステーション１５８により除去される。
ＲＢＣを除去した反応混合物をライン１６０を介してＷＢＣアナライザ１６２に 供給する。アナライザ１６２からの結果をライン１６６を介してコンパレータ　 １６４に供給し、単球（Ｍ）、リンパ球（１，）および顆粒球（Ｇ）に対する結 果についての３部分のＷＢＣ示差を提供する。
次いて混合物をライン１７０を介して機能的に示される好中球（Ｎ）除去ステー ション１６８に供給した。Ｎは上述したように、１つのパラメータ、例えは不透 明性をシフトしあるいは変化させることにより、または磁気的に除去することに よりともに混合物から除去することかできる。この例では、用いられる特定のＮ 特異性抗体を米国特許第４．９３１．３９５号のｒＭＱＮＯｃＬＯＮＡＬ　ＡＮ ＴＩＢＯＤＹ　５ＰＥＣ［Ｆ［ＣＴｏ　ＮＥＵＴＲＯＰＨ［ＬＳＪに開示されて いる。
次いてＮを除去またはシフトさせた混合物をライン１７４を介して他のＷＢＣア ナライザ１７２に供給する。アナライザ１７２の結果をライン１７６を介してコ ンパレータ　１６４に供給する。また、アナライザ１７２の結果を用いてＭ、お よびＬに対する結果についての４部分のＷＢＣ示差を得るか、次にさらにＮがシ フトされあるいは除去されるので、好酸球（Ｅ）および好塩基球（Ｂ）に関する 結果か冴られる。次にアナライザ＋６２および１７２からの２つの分析結果をコ ンパレータ１６４により比較し５部分のＷＢＣ示差を形成することかできる。特 に、Ｇの数からＢおよびＥの数を控除することにより除去したＮの数か得られる 。
図５Ａおよび５Ｂに関して、全血試料からアナライザ１４８に類似する原型分析 法を用いて得られる２つのセットの散布図結果を示す。生物試料１５０は１４０ １ｉｌの緩衝溶液と混合したＲＢＣ特異抗体を結合した４０μｌの磁性ミクロス フイアと混合し反応体１５４を形成する２０μｍの全血試料であった。反応混合 物を１５秒間混合しステーション＋５８中で１０秒間磁界に放置しＲＢＣを除去 した混合物を４５．６のＬ（１）、５．６のＭ（２）および４８．７の６（３） の計数が得られるｌＮ５Ａの散布図に示すようにアナライザ１６２により分析し た。
次いて混合物をＮ特異的抗体の結合したｌｏμｌの磁性ミクロスフイアとステー ション１６８で混合する。混合物を３０秒間かき混せ次いで磁界に１０秒間放置 する。次いてＮを除去した混合物を８１．０（７）Ｌ（１）、０．６　（７）Ｍ （２）、１１．０（７）Ｅ（３）および１．８　（７）Ｂ（４）（７）計数か得 られる図５Ｂの散布図を生じるアナライザ１７６に供給した。次にコンパレータ 　１６４は４５．６のし、５．６のＭ、４１．６のＮ、６．０のＥおよび１．２ の８の計数の５部分のＷＢＣ示差を提供する。
この結果は４４．０のＬ　、３．４　（７）Ｍ　、４５．０（７）Ｎ　、６．１ 　（７）Ｅおよび０．４のＢの計数を生しるスライド上の試料においてライＩ・ 染色（Ｗｒｉｇｈｔ　５ｔａｉｎ）を用いた標準的な顕微鏡による５部分のＷＢ Ｃ示差に対応する。
図６は親出願を具体化する細胞集団分析法および装置のさらなる好適例を示し、 参照番号１７８により一般的に示される。アナライザ１７８はまた少なくとも第 １のセットの生存可能な生物細胞を含む生物試料１８０を含みさらに緩衝液を含 む場合がある。
試料１８０をライン１８６を介する反応体１８４とライン１８２を介して混合す る。機能的に示すように、混合物の第１部分をライン１８８を介して機能的に示 したＲＢＣおよびＮ除去ステーション１９０に供給する。ＲＢＣおよびＮを前述 したように除去しあるいはソフ）・させ第１部分をライン１９２を介してＷＢＣ アナライザ１９４に供給する。
これによりライン＋９６を介してコンパレータ１９８に供給されるアナライザ１ ９４からの結果を提供する。結果には上述したＭ、Ｌ、ＥおよびＢを含む４部分 の示差か含まれる。
同時に、試料１８０および反応体１８４の混合物の第２部分をライン２００を介 して機能的に示されるＲＢＣ除去ステーション２０２に供給する。ＲＢＣを除去 した混合物をライン２０４を介して他のＷＢＣアナライサ２０６に供給する。ア ナライザ２０６の結果をライン２０８を介してコンパレータ１９８に供給する。
アナライザ２０６の結果は直接的に上述したＭ、ＬおよびＧが含まれる３部分の ＷＢＣ示差を含む。次いてアナライザ１９４および２０６の結果をコンパＩ／− 夕１９８により比較して５部分のＷＢＣ示差を提供する。
アナライザ１７８の方法および装置を組み入れた特定の分析装置の好適例は一般 的に図７中の参照番号２１０により示される。
さらに、１つの特定ハードウェアのみを列挙するか、分析装置５６に似て、分析 装置２１０か多数の配置を実現することができる。
装置２１０はライン２＋６を介してサンプリング弁２１４に結合するアスピレー タパーノング機構２１２を含む。弁２１４には試料プローブ２１８を含み興味あ る生物試料、例えば試料１８０を吸引除去することかできる。希釈剤分配ポンプ ２２０をライン２２２を介して弁２１４に結合して試料、所望の場合、例えば全 血試料のための希釈剤を提供する。次いて混合物の第１部分をライン２２４およ びライン２２６を介して第１混合装ａ２２８に結合する。同時に、混合物の第２ 部分をライン２２４およびライン２３０を介して第２混合装置２３２に供給する 。
混合機２２８（ステーション１９０に匹敵する）は混合機２３２（ステーション ２０２に匹敵する）とほとんと同一であり最初に説明する。混合機２２８は第１ 混合物部分を供給される混合チャンバ２３４を含む。混合機２２８は上述した種 々のオプションのすべてを含み所望の場合にＩ？ＢＣ溶解剤のための溶解剤投入 ライン２３６を含む場合かある。
溶解剤を用いる際、機能的に２３８で示すような混合後、次いで冷却剤を冷却剤 ライン２４０を介して添加する。同時に、ＮはＮ特異抗体か結合した適当な磁性 または非磁性ミクロスフイアをライン２４４を介してチャンバ２３４に供給する ミクロスフイアの供給源２４２から添加することにより除去される。磁性ミクロ スフイアをＮまたはＲＢＳのために用いる場合、次いでマグネット２４６または 磁界を用いて磁気的に結合した細胞を除去する。
混合しく必要なら）冷却した混合物を次に弁２５０まてライン２４８を介しさら にライン２５２を介してＷＢＣアナライザ２５４（すなわちアナライザ１９４） に供給する。アナライザ２５４はアナライザ８６と同一でありかかる詳細につい てはさらに説明しない。
また、アナライザ２５４は混合物および細胞か通過する孔２５８を有する感知チ ャンバ２５６を含む。ノースフロー流体系２６０をチャンバ２５６に結合するこ とかできる。細胞により発生する信号はＲＦ／ＤＣ電源により前述したように、 出力をコンパレータ２６４に供給する感知回路２６２により検出される。
同時に、第２混合物部分を混合チャンバ２６６に供給する。第２部分て、ＲＢＣ を単に除去しくすなわぢ、ステーション２０２）さらにＲＢＣをライン２６８を 介してチャンバ２６６に供給するＲＢＣ溶解剤により除去することかできる。溶 解剤を試料と混合し次いて冷却剤ライン２７０を介して冷却剤を添加する。ある いはまたＲＢＣをライン２７４ヲ介してチャンバ２６６に供給するミクロスフイ ア供給源２７２からのＲＢＣ特異抗体を結合した磁性ミクロスフイアにより除去 することかできる。ミクロスフイアを、２７６で機能的に混合し、次いて磁気的 に結合したＲＢＣミクロスフイアを磁石２７８により除去する。
ＲＢＣを除去した混合物を次いてライン２８０を介して弁２５０に供給しライン ２５２を介してアナライザ２５４に供給して上述の結果を得る。混合１２２８お よび２３２は適当なそれぞれの洗浄ライン２８２および２８４ならびに廃棄物ラ イン２８６および２８８さらにプローブ洗浄２９０を含み次の試料または分析の ための試料を吸引除去する前に装置２１０を洗浄する。
図８Ａおよび８Ｂはアナライザ１７８に類似する分析方法を用いる全血試料から 得られた散布図の結果を示す。この例では、２０μｍの全血か試料＋８０を形成 し、ＲＢＣ特異抗体を結合した４０μｌの磁性ミクロスフ−イアを１４０μＩの 緩衝溶液と混合して反応体１８４を形成する。混合物の１部を２０秒間ステーシ ョン２０２て混合し次に磁界に１０秒間放置する。次いてＲＢＣを除去した混合 物を２９．４のしく１）、８．１のＭ（２）、６２．４のＧ（３）の計数を提供 する図８Ａの散布図を生しるアナライザ２０６で分析する。
同時に、同一混合物の他の部分をＮ特異抗体を結合した１０μｍの磁性ミクロス フイアと混合してステーション１９０中てＲＢＣおよびＮを除去する。混合物を ３００秒間混し、次に磁界に１０秒間放置する。次にＮおよびＲＢＣを除去した 混合物を７３．５のしく１）、２１．７のＭ（２）、３．４のＥ（３）および１ ．４の８（４）の計数を提供する図８Ｂの散布図を生しるアナライザ１９４によ り分析する。２つの計数をコンパレータ　１９８て比較し、２９．４のＬ、８． ０のＭ、６０．８のＮ、Ｉ、２のＥおよび０．６の８の５部分のＷＢＣ示差計数 か得られる。さらに顕微鏡による比較ては２９．４のＬ、５．０のＭ、６５．０ のＮ、１．０のＥおよび１．０未満のＢか得られた。
図９Ａおよび９Ｂは図８Ａおよび８Ｂと類似した５部分のＷＢＣ示差の例の散布 図の結果を示す。２０μｌの全血試料を図８Ａおよび８Ｂに関して記載した同一 の工程で分析し３５．４のしく１）、１４．６のＭ（２）および５０．０のＧ（ ３）の計数を与える図９Ａの散布図か得られた。図９Ｂの散布図は６６．４のＬ （１）、２５．０のＭ（２）、６．６のＥ（３）および２．０の６（４）の計数 を提供する。３５．４のＬ、１４．６のＭ、４５．５のＮ、３．５のしおよび１ ．１のＢの計数て得られる５部分のＷＢＣ示差結果を３６のり、１１のＭ、４９ のＮ、３のＥおよび１のＢの顕微鏡の計数と比較した。
図１０ＡおよびＩＯＢは図８Ａ、８Ｂおよび９Ａ、９Ｂのものとさらに類似する ５部分のＷＢＣ示差の散布図の結果を示すか、この例では、溶解剤を用いた。こ の例では、２０μｍの全血を８０μｌの緩衝液および上述したような２４０μｌ の選択的ＲＢＣ溶解剤と混合した。
混合物を６秒間混合し次いて冷却剤を添加する。時間間隔は重要であり、その理 由は約１０秒より長く溶解物を冷却しないで放置するとＷＢＣの重要な特性に影 響を及ぼし始めるからである。
ＲＢＣを除去した混合物を分析して２５．７のＬ（１）、９．６のＭ（２）およ び６５．０のＧ（３）の計数を生しる図１０Ａの散布図を提供する。
全血の第２の２０μｌの試料を含む混合物の第２部分を１２０μｌの緩衝液およ びＮ特異抗体を結合した１０μｌの磁性ミクロスフイアと混合し３０秒間かき混 ぜ次いで１０秒間磁界に放置した。
次に選択的ＲＢＣ溶解剤をＮ除去混合物に添加しその後冷却する前に６秒間混合 する。得られる散布図１０Ｂは７４．６のＬ（１）、２１．６のＭ（２）、２． ９のＥ（３）および０．８のＢ（４）の割合計数を生じる。得られる５部分のＷ ＢＣ示差は２５．６のＬ、９．６のＭ、６３．５のＮ、１．０６のＥおよび０． ３のＢの割合計数を生じる。さらに顕微鏡による比較は２９．４のり、５．０の 闇、６５．０のＮ、１．０のＥおよび１未満のＢの計数を生じる。
図１０ＡおよびＩＯＢに類似する５部分のＷＢＣ示差の散布図の結果の他の例を 図１１Ａおよび１１Ｂに示す。全血の試料は図１０ＡおよびＩＯＨに関して説明 する同一の工程で同時に分析した２つの試料を有した。図１１Ａの散布図は３１ ．９のＬ（１）、１７．６のＭ（２）および５０．４のＧ（３）の計数を提供す る。図１１Ｂの散布図は６７．１のしく１）、２４．１のＭ（２）、７．６のＥ （３）および１．２のＢ（４）の計数を提供する。
得られる５部分のＷＢＣ示差は３６のり、１１のＭ、４９のＮ、３のＥおよびｌ のＢの顕微鏡による計数と比較するような３１．９のし、１１．４のＭ、４６． ０のＮ、３．６のＥおよび０．７のＢの計数を生じる。
親出願を具体化する細胞集団の分析方法および装置のなお残るさらなる好適例は 図１２で参照番号２９２により一般的に示される。アナライザ２９２は生物試料 ２９４を含み、さらに第１のセットの生存可能な生物細胞および所望なら緩衝液 を含む。
試料２９４をライン２９６を介してライン３００を介した少なくとも１つの反応 体２９８と混合する。アナライザ２９２で、ＲＢＣを除去しさらにＮを続いてま たは同時に機能的に示すステーション３０２てシフトさせる。ＲＢＣ除去機能は ３０４て示されＮの移動またはシフト部分を３０６で示し同時にあるいは続けて 行うことがてきる。ＲＢＣは磁気的にあるいは溶解剤を用いまたは前述した２つ の組み合わせを用いて除去することかできる。ＮはＮ特異抗体を結合したミクロ スフイアを混合物に添加することにより除去あるいはシフトされる。
ＲＢＣが除去されＮか移動あるいはシフトすると、その後得られる混合物はライ ン３０８を介してアナライザ３１０に供給される。
この場合、ＮはＭ、Ｌ、Ｅ、ＢおよびＮの５部分のＷＢＣ示差が直接得られるＥ およびＢのパターンから十分にシフトさせる。
アナライザ２９２の機能は装置５６および２１０のいずれでもまたはそれらをわ ずかに変化させたもので行うことができる。
アナライザ２９２に対応した直接的な５つの部のＷＢＣの差の１例の点点図結果 を図１３に示す。この例では、生物試料２９４は２０マイクロリツトルの全血試 料であり、反応体２９８はｌＯマイクロリットルのミクロフェアに結合したＮ特 異的抗体を伴った非磁性ミクロスフイアであり、１００マイクロリツトルの緩衝 液と合わせて、３０秒間サブステーション３０６中で混合した。その後ＲＢＣ優 先的溶解剤のｌＯマイクロリットルをその混合物中に加え、６秒間サブステーシ ョン３０４中で混合し、その後クエンチ剤を添加した。その後、ＲＢＣ除去及び Ｎシフト混合物をアナライザ３１０て分析し、図１３の点点図に結果を示す。こ の図は３５Ｌ、５Ｍ、５６Ｍ、４ＥＳＢなしの顕微鏡測定と比較した、２９．６ Ｌ、　１３．６Ｍ、５２．２Ｎ、　３．４　Ｅ、　１．０６Ｂの直接係数値を示 す。この特別な例では、全血試料をクールターエレクトロニクスインコーポレイ テッドの一般的な細胞計数機器で分析した。結果は２９　Ｌ、　１１．１Ｍ及び ５９．９Ｇ（Ｎ、Ｅ及びＢ）である。
図１４及び図１５を参照して、本発明の詳細な説明する。
本発明のＷＢＣ集団分析方法及び装置の具体例は図３．４及び６にて説明したア ナライザ５６．１４８及び１７８と略同じである。アナライザは生物試料を含み 、これは少なくとも白血球集団を含有した生育可能な生物細胞の第１セツト（図 示せず）を含有している。
出願人は、親出願の差に基づく多数の部の手順は典型的な診療操作で有効に正確 に操作されており、ここては、血液試料は１２時間又はそれ以内のオーダーであ ることを見い出した。しかしながら、血液試料か１８〜２４時間又はそれ以上の 範囲内である場合は、経時試料は点点図上に細胞データ点か違う位置に出る。例 えばＤＣ及び不透明度の電子検出ノくラメータを用Ｌｚる普通の血液試料点点図 は図９Ａ、ＩＯＡ及びＩＩＡのようなパターンを示す。Ｎは、図９８．ＩＯＢ及 びＩＩＢにて示すし、Ｎ１、Ｅ及びＢのパターンを示す血液試料から除去される 。親出願のＮ除去の手順により差に基づく所望の５つの部のＷＢＣ力く示される 。
しかしながら、図１４Ａ及び＋５Ａで示したような経時血液試料では、点点図は もはやり、Ｇ及びＭの明確な同定ができない。
約２６時間経った血液試料を示す図１４Ａ及び、約３６時間経った血液試料を示 す図１５Ａの経時試料では親出願の手順（よ結果か出ないか誤った結果となる。
図１４及び図１５と図９Ａ、ＩＯＡ及びＩＩＡを比較することにより判るか、１ つか複数の新しい集団であるから、これらの経時試料は容易には同定できない、 ＜５−ンとなる。
先ず、１４Ａを参照し、出願人は親出願の電子検出）くラメータを先ず使用して 、点点図３５０を得た。このノくターン３５０は通常の（非経時の）血液試料と 同してはない。とし）うのは、例えは図９Ａ、図１０Ａ又は図１１Ａを図１４Ａ と比較するとわ力Ａるが、経時試料の点点図には新しい細胞グルブ３５４が現わ れるからである。親出願と同様に、出願人はＮを除去し、点点図、図１４Ｃに示 す３５６を得た。細胞グルーピング３５４中の幾つかの細胞は他のＮと共に除去 された経時Ｎてあった。しかしながら、このことは、幾つかの非同定の細胞はま た残されており、細胞グルービング３５８を形成するので、適当な５つの部の差 にとって許容できない。点点図３５６は別々にり、Ｍ、Ｅ及びＢグルーピングを 含むか、未計数のグルーピング３５８か残っている。この技術は親出願に一致し て得られた５つの部の白血球の差を許容しないので、出願人はその後、ｖＣ３型 器機の光分散技術を用い、これは図１４Ｂて示された別のパターン３５２を得た 。点点図３５２は再び新しい明確てない集団３５４のために普通のｖＣ８技術を 用いて分析できなかった。
出願人は時間が経つと点点図パターンの変化を引きおこす１又は複数の細胞を決 定することを試みた。グルービング３５８の細胞を決定するために、出願人はパ ターン３５６を分析した。
幾つかの経時Ｎはパターン３５４にあることかわかったので、出願人はパターン ３５８が経時Ｅにより引きおこされた場合は決定することを決心した。出願人は まずパターン３５８の細胞計数値をＥの数に添加し、これをこの試料に対する普 通（非経時）のに５つの部の差（既に得ている）と比較した。なるほど、これは 誤った５つの部の差の結果を訂正し、パターン３５８中の残存細胞か経時Ｅであ ることを確認する。
その後出願人は、参考として、１９８７年６月１３日出願のに開示されたＮ及び Ｅ特異的抗体を用いた。Ｎはすてに除去されたことがわかっているので、磁性ミ クロスフイアに再び結合した抗体か少なくともへてのＥを除去することを期待し た。ミクロスフイアはすべてのＥグルーピング及び細胞グルーピング３５８の両 方を除去した。このことは、点点図３５０中の経時細胞は経時Ｅ及び経時Ｎの両 方てありことを再び確認した。グルーピング３５８中の細胞は、もはやＮ特異的 抗体に親和性を示さないか、Ｎ及びＥ特異的抗体には未だ親和性を示す経時Ｎで ある。しかしながら、最終結果はゼロ時間の結果に戻して比較され、且つＥの数 では訂正されるので、このことは残存細胞か経時Ｅであり経時Ｎてはないことを 示唆する。
現われた細胞か経時Ｅ及び経時Ｎの場合は、親出願の技術を以下のように修正し て適用できる。グルーピング３５４のすへてを含むすへてのＷＢＣ集団及びＬ集 団を先ず計数する。図９Ａ、ＩＯＡ及びＩＩＡに示された試料の点点図に似ず、 Ｇ′及びＭ′は点点図３５０におて別々に同定できない。故に、全ＷＢＣ集団は ブロック３６０に示されたように計数され、ブロック３６０中に含まれる。Ｌは 点点図３５０及び３５６の両方に同定可能にあられれ、図１４Ａ中にブロック３ ６２により示されたように別々に計数される。Ｎは、除去され、図１４Ｃとの点 点図３５６中のＥ領域からＮ及びグルーピング３５４から経時Ｎの両方を除去す る。Ｌ、Ｍ、Ｂ及びＥは点点図３５６中で数えることかできる。Ｌはブロック３ ６２中のしと関連している。すへてのＷＢＣ集団はブロック又はグルーピング３ ５８を含む。除去したＮの計数値は２つのすへてのＷＢＣ計数値を比較して得ら れる。Ｌ及びすへてのＷＢＣ計数値は個々のＭ、　Ｂ及びＥ計数値に関連して使 用できる。Ｅ全計数値はＥグルーピング及び経時Ｅ３５８グルーピングを含む。
又、出願人は、試料の経時により生した誤差を発生の時に関して正確に予想でき ないことを明らかにした。しかしながら、誤差は１つの細胞対１つの細胞に基づ いて生じるので、本発明の技術はいっても使用できる。図９Ａ、ＩＯＡ及びＩＯ Ｂに示されたような普通のパターンの場合、グルーピング３５４及び３５８の計 数値はゼロになる。この技術は経時細胞があってもなくても訂正した５つの部の 差を確実にする。
本発明の技術の結果を確認するために、試料をゼロ時間経時にてＶＣ３器機を用 いて試験し、本発明を用いた２４時間経った試料と比較する。結果は表１に示さ れたようによ（似ている患者　患者 ＶＣ３２４時間　ＶＣＳ　２４時間 リンパ球　３４．１３　３６．０　リンパ球　３１．６　２９．８単球　９．６ ７　９．０　単球　１１．７　１２．０好中球　５２．６８　５１．４　好中球 　４８．０７　４９．６好酸球　３．０６　２．９　好酸球　７．４　７．２好 塩基球　０．４６　０．５　好塩基球　１．２　１．５患者　患者 ＶＣ３２４時間　ＶＣＳ　２４時間 リンパ球　１８．７６　１９．０　リンパ球　２７．６３　２７．４単球　８． ６　７．８　単球　６．５　４．９好中球　６９．１８　６９．７　好中球　４ ９．５　５０．１好酸球　２．８１　３．２　好酸球　１５．９　１６．４好塩 基球　０．７　０．２　好塩基球　０．５　１．２患者　患者 ＶＣ３２４時間　ＶＣＳ　２４時間 リンパ球　２Ｇ、６　２７．４　リンパ球　３３．２４　３３．５単球　＋０． ６７　９．８　単球　９．１８　７．７好中球　５９．８　６０．６　好中球　 ４９．７３　５１．３好酸球　２．８６　３．３　好酸球　６．７６　６．６好 塩基球　０．１９　０．７　好塩基球　１．０９　＋、０患者　患者 ＶＣ３２４時間　ＶＣＳ　２４時間 リンパ球　２８．２　２７．４　リンパ球　４０．６２　４０．１単球　９．３ 　８．９　単球　６．７７　３．６好中球　５７．８０　５９．１　好中球　５ ０．７６　５３．０好酸球　３．９　３．９　好酸球　１．０４　２．６好塩基 球　０．６　０．８　好塩基球　０．８１　０．９患者　患者 ＶＣＳ　２４時間　ＶＣＳ　２４時間 リンパ球　３５．２１　３３．３　リンパ球　３８．４１　３６．２単球　８． ９１　８．９　単球　１３．０９　１５．７好中球　４７．６５　４８．９　好 中球　３９．４９　３８．５好酸球　７．８６　８．９　好酸球　７．０３　５ ．８好塩基球　０．３８　０．８　好塩基球　１．４　１．７患者　患者 ＶＣＳ　２４時間　ＶＣＳ　２４時間 リンパ球　２４．２０　２３．６　リンパ球　３２．６９　３４．６単球　９． ２７　７．４　単球　１０．３７　７．１好中球　６２．２３　６４．２　好中 球　５０．３２　５１．６好酸球　３．３３　３，６　好酸球　５．８２　６． １好塩基球　０．９８　１．３　好塩基球　０．７９　０．６患者　患者 ＶＣＳ　２４時間　ＶＣＳ　２４時間 リンパ球　３４．３５　３７．８　リンパ球　３３．６２　３４．０単球　９． ３７　７．４　単球　７．４４　７．２好中球　５４．７３　５２．６　好中球 　５６．３３　５４．８好酸球　０．９５　＋、３　好酸球　１．８７　２．８ 好塩基球　０．５８　０．９　好塩基球　０．７５　１．１患者　患者 ＶＣＳ　２４時間　ＶＣＳ　２４時間 リンパ球　３０．４１　２９．３　リンパ球　４０．５３　３８．７単球　６． ６５　４．５　単球　＋２．３５　１０．７好中球　５８．８６　５９．７　好 中球　４５．５７　４６．７好酸球　３．３９　４．８　好酸球　１．１９　３ ．０好塩基球　０．８０　１．６　好塩基球　０．３１　０．３表Ｉの２４時間 試料結果はすべて電子的ＲＦ及びＤＣ検出パラメータを用いて得られた。本発明 はＶＣ８器機におけるような光分散を用いても使用できることを確実にするため に、２４時間経った試料の１セツトを表■に示す如く得た。
表■ 患者 ＶＣＳ　２４時間 リンパ球　１５．６１　１５．５ 単球　８．２　６．９ 好中球　７２．２　７４．５ 好酸球　４．１９　３．１ 好塩基球　−一一一一一 本発明の技術は図１５Ａ−Ｃに示したような３６時間経った試料にも適用できる 。電子検出により作った別の点点図３６４を図１５Ａに示し、ＶＣ３点点図３６ ６を図１５Ｂに示す。再び、全白血球集団をブロック又はグルーピング３６８で 示されたように計数し、又、Ｌはブロック又はグルーピング３７０で示されたよ うに計数する。点点図３７２を示した経時Ｎを含むＮを除去し、グルーピング３ ７４中にり、Ｍ、Ｅ、Ｂ及び経時Ｅか含まれる。
３６時間経った試料からの結果は表■のｖＣ３経時ゼロデータと比較できる。
表■ 患者　患者 ＶＣ３３６時間　ＶＣＳ　３６時間 リンパ球　４６．６　４４．４　リンパ球　３１．７１　３２．８単球　１１． １　１０．２　単球　１１．３　１０．４好中球　３７．１　３９．６　好中球 　５０．７　４９．９好酸球　５．２　５．０　好酸球　５．０　６．６好塩基 球　０．０４　０．８　好塩基球　１．２　０．３患者　患者 ＶＣＳ　３６時間　ＶＣＳ　３６時間 リンパ球　３０．１　２８．６　リンパ球　２９．９　２Ｂ、１単球　９．６　 、　７．５　単球　１３．６　１４．８好中球　５５．３　５８．８　好中球　 ４９．２　４９．１好酸球　４．２　４．５　好酸球　５．５　５．１好塩基球 　０．７　０．６　好塩基球　１．７　２．９患者　患者 ＶＣ３３６時間　ＶＣＳ　３６時間 リンパ球　３９．５　３６．４　リンパ球　２９．９　２５．３単球　９．９　 ６．２　単球　７．７　６．２好中球　４５．２　５１．６　好中球　５７．３ 　６１．８好酸球　３．７　５．２　好酸球　４．９　５．８好塩基球　１．７ 　０．６　好塩基球　０．２　０．９患者　患者 ｖＣ３３６時間　ＶＣＳ　３６時間 リンパ球　４１．３　４１．３　リンパ球　３０．１　２７．９単球　６．８　 ７．９　単球　８．４　６．６好中球　４４．３　４３．０　好中球　５４．５ 　５６．９好酸球　６．４　６．６　好酸球　６．５　８．２好塩基球　１．２ 　１．２　好塩基球　０．５０．４患者　患者 ＶＣ３３６時間　ＶＣＳ　３６時間 リンパ球　３６．６　３２．９　リンパ球　３１．２　３０．０単球　７．１　 ５．７　単球　６．７５．６好中球　５２．１　５５．０　好中球　５７．６　 ５７．１好酸球　３．５　５．２　好酸球　３．９　６．３好塩基球　１．４　 １．２　好塩基球　０．５　０．１患者　患者 ＶＣ３３６時間　ＶＣＳ　３６時間 リンパ球　３８，６　３５．２　リンパ球　３５．７　３１．５単球　８．４　 ７．３　単球　１３．７　１３．５好中球　４９．５　５２．５　好中球　４４ ．１　４６．３好酸球　３．２　４．４　好酸球　５．４　５．７好塩基球　０ ．３　０．６　好塩基球　１．０　２．０患者　患者 ＶＣＳ　３６時間　ＶＣＳ　３６時間 リンパ球　３４．５　３１．６　リンパ球　３７．０　３３．２単球　７．６　 ６．３　単球　７．５　６．１好中球　５６．４　５９．６　好中球　５０．１ 　５４．１好酸球　１．１　２．２　好酸球　４．８　４．８好塩基球　０．４ 　０．３　好塩基球　０．５　１．８患者　患者 ＶＣ３３６時間　ＶＣＳ　３６時間 リンパ球　３１，８　３０．３　リンパ球　４１．５　３７．５単球　ｉｉ、ａ 　ｓ、ｓ　単球　５．９　４．２好中球　５０．４　５４．２　好中球　４５． ２　４９．５好酸球　５．０　５．７　好酸球　６．９　８．０好塩基球　１． ４　１．０　好塩基球　０．７　０．９患者　患者 ＶＣ３３６時間開Ｃ３３６時間 リンパ球　３９．５　３６．９　リンパ球　４１．４　４０．６単球　８．９　 ６．８　単球　７．６　７．４好中球　４９．８　５２．９　好中球　４７．１ 　４７．４好酸球　１．５　２．８　好酸球　３．４　３．７好塩基球　０．３ 　０．６　好塩基球　０．５　０．７患者　患者 ＶＣＳ　３６時間　ＶＣ３３６時間 リンパ球　２５．９　２５．５　リンパ球　２８．７　２７．７単球　６．４　 ５．５　単球　９．８　８．４好中球　６２．８　６２．２　好中球　５９．２ 　６１．１用いられた磁性ミクロフィアはとんな好適な型でもよく、例えばイン ディアナ、カルメルのパンゲス研究所から販売される、直径０．７ミクロン、１ ０！％Ｗ／Ｖの固形物のポリスチレン磁性ミクロスフイアである。非磁性ミクロ フイアはどんな好適な型でもよく、例えばオレゴン、ボートランドのインターフ エイシャツ（ダイナミクスによりＩＤＣミクロスフイアとして販売される、直径 ２．１７ミクロン、８％Ｗ／Ｖの固形物の、界面活性剤のない硫酸化ポリスチレ ンラテックスミクロスフイアである。これらの特異的ミクロスフイアは例示の目 的に対して使用されるけれとも、他の従来の給源からの他の型及びサイズのミク ロスフイアも使用できる。
一般に、シフティングには、多数のミクロスフイアが各細胞に結合すべきなのて 、細胞の直径より実質的に小さい直径のミクロスフイアを使用するのか好ましい 。典型的に、０．６５〜３．０ミクロンの直径のミクロフイアを用いて、示され た細胞として遊離のミクロスフイアそれ自体を検出し、計数することかないこと を確実にする。一般に、低密度（少しのミクロスフイアと結合する）はより大き いミクロスフイアを必要とし、高密度（多数のミクロスフイアと結合する）はよ り小さいミクロスフイアの使用かできるので、細胞抗原密度は用いられたミクロ スフイアの大きさにも影響する。ミクロスフイアか大きすぎると、装置は細胞と して遊離のミクロスフイアを計数でき、計数値か不正確となり、これにより分析 が不正確になる。更に、非常に大きなミクロフィアは多数の細胞が結合するので 検出の孔をふさいだり、ブロックでき、結果として大きなミクロフィア及び細胞 の塊かできる。磁性ミクロスフイアも検出細胞シフトを生じるのに使用てきるけ れとも、典型的に、非磁性ミクロスフイアは高価でなく、これによりシフティン グの目的に使用される。
磁気的に細胞を除去するためには、磁性ミクロスフイアのみか使用できる。この 適用においては、検出の前に細胞は試料から除去されるのでミクロスフイアの大 きさはあまり問題とはならない。磁場中で速く容易に除去するために、ミクロス フイアが十分な手段である。この場合、０．６５〜４．５ミクロンの直径のミク ロスフイアか良好に作用する。更に、細胞のみか除去されのて、１０ミクロン又 はそれより大きい直径のミクロスフイアを使用できる。多数の細胞を各ミクロス フイアに結合できるか、計数しないので、器機の操作の妨げにならない。
ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、１４Ａ Ｏ，３００００，４００００，５００００，６００００，７０００ＲＦ／ＤＣ ＦＩＧ、　１４Ｂ

Claims (48)

    【特許請求の範囲】
  1. １．少なくとも全白血球集団及びリンパ球集団を電子的に計数し； 前記白血球集団から経時好中球集団の寄与を含む好中球集団を除去し； 少なくとも前記残存白血球集団の単球、リンパ球、好酸球、経時好酸球及び好塩 基球を電子的に計数し；前記２計数値を比較して前記白血球集団の好中球及び経 時好球の計数値を得、これにより、５つの部の白血球の少なくとも１つの差を得 る： ことを特徴とする 少なくとも白血球集団を有する全血試料の少なくとも１部分から多数の部の白血 球集団の１つの差を得る方法。
  2. ２．前記全血試料が赤血球集団を含み、且つ前記白血球集団の関連ある性質及び ／又は量に悪影響を及ぼすことなく前記試料から前記赤血球集団を除去すること を更に特徴とする請求項１記載の方法。
  3. ３．前記赤血球集団の除去がミクロスフィアに結合する赤血球特異的モノクロー ナル抗体を有するミクロスフィアを供給すること及び前記ミクロスフィアと前記 全血試料を混合して前記赤血球集団に結合することを含み、且つ前記全血試料か ら前記結合赤血球を伴った前記ミクロスフィアを除去することを更に特徴とする 請求項２記載の方法。
  4. ４．磁性ミクロスフィア及び磁場を形成し、且つ前記磁場内で前記磁性ミクロス フィアを引き付けている間に前記赤血球を除去することにより前記ミクロスフィ アを除去することを更に特徴とする請求項３記載の方法。
  5. ５．前記ミクロスフィアと前記全血試料を急速に混合して６０秒以内に前記赤血 球集団を前記ミクロスフィアに結合することを更に特徴とする請求項３記載の方 法。
  6. ６．前記赤血球集団を除去することが、ミクロスフィアに結合する赤血球特異的 モノクローナル抗体を有するミクロスフィアを供給すること、前記ミクロスフィ アと前記全血試料を混合して前記赤血球集団に結合すること、前記ミクロスフィ アと共に赤血球溶解剤を供給し、前記赤血球集団の１部分を除去し、前記赤血球 集団を除去するのに必要なミクロスフィアの数を減少すること及び前記全血試料 からミクロスフィアに結合した前記赤血球を伴った前記ミクロスフィアを除去す ることを含むことを更に特徴とする請求項２記載の方法。
  7. ７．磁性ミクロスフィア及び磁場を形成し、且つ前記磁場内で前記磁性ミクロス フィアを引き付けている間に前記赤血球を除去することにより前記ミクロスフィ アを除去することを更に特徴とする請求項６記載の方法。
  8. ８．前記ミクロスフィアを前記全血試料と急速に混合して６０秒以内に前記赤血 球集団と前記ミクロスフィアを結合し、前記溶解作用を与えることを特徴とする 請求項６記載の方法。
  9. ９．前記赤血球集団を除去することが赤血球溶解剤を供給し、実質的に前記赤血 球集団を除去することを含むことを更に特徴とする請求項２記載の方法。
  10. １０．好中球及び経時好中球集団の除去がミクロスフィアに結合する好中球特異 的モノクローナル抗体を有するミクロスフィアを供給すること、及び前記ミクロ スフィアと前記試料を混合して前記好中球集団に結合することを含み、且つ、前 記試料からミクロスフィアに結合した前記好中球集団を伴う前記ミクロスフィア を除去することを更に特徴とする請求項１記載の方法。
  11. １１．磁性ミクロスフィア及び磁場を形成し、前記磁場内で前記磁性ミクロスフ ィアを引き付けている間に前記好中球集団を除去することにより前記ミクロスフ ィアを除去することを更に特徴とする請求項１０記載の方法。
  12. １２．前記ミクロスフィアと前記試料を急速に混合し６０秒以内に前記好中球集 団を前記ミクロスフィアに結合することを更に特徴とする請求項１０記載の方法 。
  13. １３．少なくとも全白血球集団及びリンパ球集団を電子的に計数する手段； 前記白血球集団から経時好中球集団の寄与を含む好中球集団を除去する手段； 少なくとも前記残存白血球集団の単球、リンパ球、好酸球、経時好酸球及び好塩 基球を電子的に計数する手段；前記２計数値を比較して前記白血球集団の好中球 及び経時好球の計数値を得、これにより、５つの部の白血球の少なくとも１つの 差を得る手段： を備えることを特徴とする 少なくとも白血球集団を有する全血試料の少なくとも１部分から多数の部の白血 球集団の１つの差を得る装置。
  14. １４．前記全血試料が赤血球集団を含み、且つ前記白血球集団の関連ある性質及 び／又は量に悪影響を及ぼすことなく前記試料から前記赤血球集団を除去する手 段を備えることを更に特徴とする請求項１３記載の装置。
  15. １５．前記赤血球集団の除去がミクロスフィアに結合する赤血球特異的モノクロ ーナル抗体を有するミクロスフィアを供給すること、且つ前記ミクロスフィアと 前記全血試料を混合して前記赤血球集団に結合する手段を含み、且つ前記全血試 料から前記結合赤血球を伴った前記ミクロスフィアを除去する手段を更に特徴と する請求項１４記載の装置。
  16. １６．磁性ミクロスフィア及び磁場を形成し、且つ前記磁場内で前記磁性ミクロ スフィアを引き付けている間に前記赤血球を除去することにより前記ミクロスフ ィアを除去する手段を備えることを更に特徴とする請求項１５記載の装置。
  17. １７．前記ミクロスフィアと前記全血試料を急速に混合して６０秒以内に前記赤 血球集団を前記ミクロスフィアに結合する手段を備えることを更に特徴とする請 求項１５記載の装置。
  18. １８．前記赤血球集団を除去する手段が、ミクロスフィアに結合する赤血球特異 的モノクローナル抗体を有するミクロスフィアを供給すること、前記ミクロスフ ィアと前記全血試料を混合して前記赤血球集団に結合すること、前記ミクロスフ ィアと共に赤血球溶解剤を供給し、前記赤血球集団の１部分を除去し、前記赤血 球集団を除去するのに必要なミクロスフィアの数を減少する手段及びミクロスフ ィアに結合した前記赤血球を伴った前記ミクロスフィアを除去する手段を備える こと更に特徴とする請求項１４記載の装置。
  19. １９．磁性ミクロスフィア及び磁場を形成し、且つ前記磁場内で前記磁性ミクロ スフィアを引き付けている間に前記赤血球を除去することにより前記ミクロスフ ィアを除去する手段を備えることを更に特徴とする請求項６記載の装置。
  20. ２０．前記ミクロスフィアを前記全血試料と急速に混合して６０秒以内に前記赤 血球集団と前記ミクロスフィアを結合し、前記溶解作用を与える手段を備えるこ とを更に特徴とする請求項１８記載の装置。
  21. ２１．前記赤血球集団を除去する前記手段が赤血球溶解剤を供給し、実質的に前 記赤血球集団を除去することを含むことを更に特徴とする請求項１４記載の装置 。
  22. ２２．好中球及び経時好中球集団の除去する前記手段がミクロスフィアに結合す る好中球特異的モノクローナル抗体を有するミクロスフィアを供給すること、及 び前記ミクロスフィアと前記試料を混合して前記好中球集団に結合する手段を含 み、且つ前記試料からミクロスフィアに結合した前記好中球集団を伴う前記ミク ロスフィアを除去する手段を備えることを更に特徴とする請求項１３記載の装置 。
  23. ２３．磁性ミクロ久フィア及び磁場を形成し、前記磁場内で前記磁性ミクロスフ ィアを引き付けている間に前記好中球集団を除去することにより前記ミクロスフ ィアを除去する手段を備えることを更に特徴とする請求項２２記載の装置。
  24. ２４．前記ミクロスフィアと前記試料を急速に混合し６０秒以内に前記好中球集 団を前記ミクロスフィアに結合する手段を更に特徴とする請求項２２記載の装置 。
  25. ２５．少なくとも全白血球集団及びリンパ球集団を電子的に計数し； 前記試料の第２部分からの前記白血球集団から経時好中球集団の寄与を含む好中 球集団を、前記残存白血球集団の関連ある性質及び／又は量に悪影響を及ぼすこ となく除去し；前記第２部分中の少なくとも前記残存白血球集団の単球、リンパ 球、好酸球、経時好酸球及び好塩基球を電子的に計数し； 前記第１及び第２部分からの前記２計数値を比較して前記白血球集団の好中球及 び経時好球の計数値を得、これにより、５つの部の白血球の少なくとも１つの差 を得る：ことを特徴とする 少なくとも白血球集団を有する全血試料の少なくとも１部分から多数の部の白血 球集団の１つの差を得る方法。
  26. ２６．前記全血試料が赤血球集団を含み、且つ前記白血球集団の関連ある性質及 び／又は量に悪影響を及ぼすことなく前記試料から前記赤血球集団を除去して前 記第１部分を計数し、且つ前記第２部分から前記赤血球集団を除去してこれを計 数することを更に特徴とする請求項２５記載の方法。
  27. ２７．前記部分の少なくとも１部分から前記赤血球集団を除去することがミクロ スフィアに結合する赤血球特異的モノクローナル抗体を有するミクロスフィアを 供給すること、且つ前記ミクロスフィアと前記全血試料を混合して前記赤血球集 団に結合することを含み、且つ前記全血試料から前記結合赤血球を伴った前記ミ クロスフィアを除去することを更に特徴とする請求項２６記載の方法。
  28. ２８．磁性ミクロスフィア及び磁場を形成し、且つ前記磁場内で前記磁性ミクロ スフィアを引き付けている間に前記赤血球を除去することにより前記ミクロスフ ィアを除去することを更に特徴とする請求項２７記載の方法。
  29. ２９．前記ミクロスフィアと前記全血試料を急速に混合して６０秒以内に前記赤 血球集団を前記ミクロスフィアに結合することを更に特徴とする請求項２７記載 の方法。
  30. ３０．前記部分の少なくとも１部分から前記赤血球集団を除去することが、ミク ロスフィアに結合する赤血球特異的モノクローナル抗体を有するミクロスフィア を供給すること、前記ミクロスフィアと前記全血試料を混合して前記赤血球集団 に結合し、前記ミクロスフィアと共に赤血球溶解剤を供給し、前記赤血球集団の １部分を除去し、前記赤血球集団を除去するのに必要なミクロスフィアの数を減 少すること且つ全血試料からミクロスフィアに結合した前記赤血球集団を伴った 前記ミクロスフィアを除去することを含むこと更に特徴とする請求項２６記載の 方法。
  31. ３１．磁性ミクロスフィア及び磁場を形成し、且つ前記磁場内で前記磁性ミクロ スフィアを引き付けている間に前記赤血球を除去することにより前記ミクロスフ ィアを除去することを更に特徴とする請求項３０記載の方法。
  32. ３２．前記ミクロスフィアを前記全血試料部分と急速に混合して６０秒以内に前 記赤血球集団と前記ミクロスフィアを結合し、前記溶解作用を与えることを特徴 とする請求項３２記載の方法。
  33. ３３．前記部分の少なくとも１部分から前記赤血球集団を除去することが赤血球 溶解剤を供給し、実質的に前記赤血球集団を除去することを含むことを更に特徴 とする請求項２６記載の方法。
  34. ３４．前記第２部分中の好中球及び経時好中球集団の除去がミクロスフィアに結 合する好中球特異的モノクローナル抗体を有するミクロスフィアを供給すること 、及び前記ミクロスフィアと前記全血試料を混合して前記好中球集団に結合する ことを含み、且つ前記試料からミクロスフィアに結合した前記好中球集団を伴う 前記ミクロスフィアを除去することを更に特徴とする請求項２５記載の方法。
  35. ３５．磁性ミクロスフィア及び磁場を形成し、前記磁場内で前記磁性ミクロスフ ィアを引き付けている間に前記好中球集団を除去することにより前記ミクロスフ ィアを除去することを更に特徴とする請求項３４記載の方法。
  36. ３６．前記ミクロスフィアと前記全血試料を急速に混合し６０秒以内に前記好中 球集団を前記ミクロスフィアに結合することを更に特徴とする請求項３４記載の 方法。
  37. ３７．前記試料の第１部分中の少なくとも全白血球集団及びリンパ球集団を電子 的に計数する手段； 前記試料の第２部分からの前記白血球集団から経時好中球集団の寄与を含む好中 球集団を、前記残存白血球集団の関連ある性質及び／又は量に悪影響を及ぼすこ となく除去する手段； 前記第２部分中の少なくとも前記残存白血球集団の単球、リンパ球、好酸球、経 時好酸球及び好塩基球を電子的に計数する手段； 前記第１及び第２部分からの前記２計数値を比較して前記白血球集団の好中球及 び経時好球の計数値を得、これにより、５つの部の白血球の少なくとも１つの差 を得る手段：を備えることを特徴とする 少なくとも白血球集団を有する前記血試料の少なくとも１部分から多数の部の白 血球集団の１つの差を得る装置。
  38. ３８．前記全血試料が赤血球集団を含み、且つ前記白血球集団の関連ある性質及 び／又は量に悪影響を及ぼすことなく前記試料から前記赤血球集団を除去して前 記第１部分を計数し、且つ前記第２部分から前記赤血球集団を除去してこれを計 数する手段を更に特徴とする請求項３７記載の装置。
  39. ３９．前記部分の少なくとも１部分から前記赤血球集団を除去することがミクロ スフィアに結合する赤血球特異的モノクローナル抗体を有するミクロスフィアを 供給すること、且つ前記ミクロスフィアと前記全血試料を混合して前記赤血球集 団に結合する手段を含み、且つ前記全血試料から前記結合赤血球を伴った前記ミ クロスフィアを除去する手段を更に特徴とする請求項３８記載の装置。
  40. ４０．磁性ミクロスフィア及び磁場を形成し、且つ前記磁場内で前記磁性ミクロ スフィアを引き付けている間に前記赤血球を除去することにより前記ミクロスフ ィアを除去する手段を更に特徴とする請求項３９記載の装置。
  41. ４１．前記ミクロスフィアと前記全血試料を急速に混合して６０秒以内に前記赤 血球集団を前記ミクロスフィアに結合する手段を備えることを更に特徴とする請 求項３９記載の装置。
  42. ４２．前記部分の少なくとも１部分から前記赤血球集団を除去する手段が、ミク ロスフィアに結合する赤血球特異的モノクローナル抗体を有するミクロスフィア を供給すること、前記ミクロスフィアを前記全血試料と混合して前記赤血球集団 に結合し、前記ミクロスフィアと共に赤血球溶解剤を供給し、前記赤血球集団の １部分を除去し、前記赤血球集団を除去するのに必要なミクロスフィアの数を減 少する手段及び前記全血試料からミクロスフィアに結合した前記赤血球を伴った 前記ミクロスフィアを除去する手段を含むことを更に特徴とする請求項３８記載 の装置。
  43. ４３．磁性ミクロスフィア及び磁場を形成し、且つ前記磁場内で前記磁性ミクロ スフィアを引き付けている間に前記赤血球を除去することにより前記ミクロスフ ィアを除去する手段を備えることを更に特徴とする請求項４２記載の装置。
  44. ４４．前記ミクロスフィアを前記全血試料部分と急速に混合して６０秒以内に前 記赤血球集団と前記ミクロスフィアを結合し、前記溶解作用を与えることを特徴 とする請求項４２記載の方法。
  45. ４５．前記部分の少なくとも１部分から前記赤血球集団を除去する手段が赤血球 溶解剤を供給し、実質的に前記赤血球集団を除去することを含むことを更に特徴 とする請求項３８記載の装置。
  46. ４６．前記第２部分中の好中球及び経時好中球集団を除去する手段がミクロスフ ィアに結合する好中球特異的モノクローナル抗体を有するミクロスフィアを供給 すること、及び前記ミクロスフィアと前記全血試料を混合して前記好中球集団に 結合することを含み、且つ前記試料からミクロスフィアに結合した前記好中球集 団を伴う前記ミクロスフィアを除去する手段を備えることを更に特徴とする請求 項３７記載の装置。
  47. ４７．磁性ミクロスフィア及び磁場を形成し、前記磁場内で前記磁性ミクロスフ ィアを引き付けている間に前記好中球集団を除去することにより前記ミクロスフ ィアを除去する手段を備えることを更に特徴とする請求項４６記載の装置。
  48. ４８．前記ミクロスフィアと前記全血試料を急速に混合し６０秒以内に前記好中 球集団を前記ミクロスフィアに結合する手段を備えることを更に特徴とする請求 項４６記載の装置。
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