JPH06507308A - トランス−スプライシングリボザイムを用いる細胞除去 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 トランスースプラインングリボザイムを用いる細胞除去発明の分野 本発明は、新規なトランスースブマイシングリボザイムおよびこれらリボザイム を用いる細胞除去法に関する。

触媒活性を有するＲＮＡ分子をリボザイムまたはＲＮＡ酵素と称する［Ｃｅｃｈ 、　Ｔ。

Ｒ，、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５９：　５４３−５６８　（１９９ ０）］。テトラヒメナ・サーモフイラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ　ｔｈｅｒｓｏ ｐｈｉｌａ）の前駆体ｒＲＮＡはそれ自身の切除を触媒し得るイントロン（リボ ザイム）を含有する。このリポザイムは一部の構造的に関連したグループＩイン トロンのうちの１つである。

修飾されたテトラヒメナ・サーモフィラのイントロンのスプライシング活性は、 グアノ７ン補助因子および二価の陽イオンＭｇ”またはＭ　ｎ　”　”のどちら かの存在を必要とし、２つの連続したトランスエステル化反応を経て起こる（図 １）。第一に、遊離のグアノシンがリボザイムに結合し、その３′水酸基が５゛ スプライス位のリン原子を攻撃するように配置される。グアノシンがイントロン 配列に共有結合し、５°エクソンが遊離する。第二に、３°スプライス部位に位 置するホスホジエステル結合が新たに遊離した５°エクソンの３°水酸基から攻 撃を受け、連結されたエクソン配列が生成する。切り出されたイントロンは続い て、３°水酸基および内部配列が関与する一連のトランスエステル化反応を受け 、短縮された環状形が形成される。

これらの連続した反応は化学的に類似しており、単一の活性部位で起こるように 見られる。自己−スプライシング反応は別のＲＮＡ構造の形成を特徴とするが、 これは、異なるＲＮＡ鎖のそれぞれが保存性の高いイントロンの回りに同様の立 体配座を形成することになるためである。スプライシングには、「内部ガイド配 列」またはＩＧＳと称する相補的な配列を横切るイントロン−エクソン連結点の 整列が必要である。

５°スプライス部位での最初の切断には、ＩＧＳおよびスプライス部位に隣接す る配列の間に塩基対合したヘリックス（Ｐｌ）の形成か必要である。このへｌル 。

クス内のＵ・Ｇ「ゆらぎ」塩基対の存在が、リボザイムの触媒反応において壊さ れるであろうホスホジエステル結合を規定する。この結合の切断後に、Ｐｌへワ ックスの一部が置換され、新しいヘリックスＰＬＯがＩＧＳと３゛スプライス位 に隣接する配列の間の相補性のために形成される。不変のグアノシン残基は、そ れが置換しているＰ１配列の部分と同様、３′スプライス部位のホスホジエステ ルの前にある。従って、エクソンの連結は最初の切断反応の逆に起こるが、そこ では新しいエクソン配列がイントロンの配列に代わって置換される。さらにエク ソンの連結に続いて起こるイントロンの環化反応には、ＩＧＳを横切る５′配列 の塩基対合、およびイントロンの末端グアニン残基の３′水酸基により媒介され る攻撃が関係する［Ｂｅｅｎ、　Ｍ、　Ｄ、ら、「グループＩ　ＩＶＳ　ＲＮＡ の環化部位の選択は内部鋳型様配列の複数の整列を必要とするＪ　、　Ｃｅ１ｌ 　５０：　９５１　（１９８７）］。

＋＋、触媒活性 グループＩイントロンの構造および触媒の性質をさらに詳しく規定するために、 エクソン配列がテトラヒメナ・サーモフイラのイントロンの「コア」から除去さ れた。Ｃｅｃｈ、Ｔ、Ｒ，ら（Ｗ○　８８１０４３００）は、テトラヒメナのイ ントロンリボザイムにより保持されている少なくとも３つの触媒活性　（１）Ｒ ＮＡの３′末端ホスフエートを配列−特異的な方法で除去し得る脱リン酸化活性 、（２）オリゴリボヌクレオチドのポリリボヌクレオチドへの変換を触媒し得る ＲＮＡポリメラーゼ活性（ヌクレオチジルトランスフエラーゼ）、および（３） 配列−特異的エンドリボヌクレアーゼ活性について記載している。

単離されたりボザイム活性は基質ＲＮＡとトランスで相互作用することができ、 そしてこれら相互作用の特徴が調べられている。例えば、イントロンの末端切除 された形態を５゛スプライス連結に対応する配列とインキュベートすると、その 部位はスプライシングの第一段階とよく似たグアノノン−依存性切断を受ける。

基質およびエンドリボヌクレオライティック・イントロンＲＮＡが塩基対合して Ｐ１ヘリックスを形成し、切断か４番目〜６番目の位置にあるＵ二〇塩基対の後 で起こる。系統発生論的な比較および突然変異の分析により、５°スプライス部 位の保存性ウランル残基にす（隣接している配列の性質は、Ｐ１ヘリックスの塩 基対合が維持されているときには、触媒作用にとって重要ではないことが示され ている［Ｄｏｕｄｎａ、　Ｊ、　Ａ、ら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、ＵＳＡ　８６：　７４０２−７４０６　（１９８９）n。

３′スプライス部位の選択のための配列の必要条件は主としてイントロンそれ自 体の構造内にあるようであり、これにはへワックスＰ９．０およびそれに続（３ ′イントロン境界を示すグアノシン残基が含まれる。しかし、３゛エクソン内の 側面に位置する配列は、突然変異の分析により示される様にＰＩＯへワックスの 形成および効率的なスプライシングのために必要である［５ｕｃｈ、　Ｅ、　Ｒ ，ら、　Ｍｏ１．ＣｅＬｌ。

Ｂｉｏｌ、　１０：　２９８０−２９６５　（１９９０）］。さらにオリゴヌク レオチドが、末端切除された形態のイントロンおよび「外部の」ガイド配列およ び５°グア／シン残基により伸長されたオリコヌクレオチドを用いてトランスで 連結されている。３°工クソン配列に対応する基質オリゴヌクレオチドは、連結 前に、外部鋳型上のＰＩＯ様へＩルックスの形成により単独で整列された［Ｄｏ ｕｄｎａ、　Ｊ、　Ａ、ら、　Ｎａｔｕｒｅ　３３９：　５１９−５２２　（１ ９８９）ｉ。

所望のＲＮＡと特異的にハイブリクイズしうる別個の「ノ翫イブリダイゼーショ ン」領域をリボザイム中に工作することにより、リボザイムの切断活性が該特定 のＲＮＡを標的とするようにされている。例えば、Ｇ　ｅｒｌａｃｈ、　Ｗ、　 Ｌ　、ら（ＥＰ３２１．２０１）は標的ＲＮＡに相補的な配列を有するリホザイ ムを構築した。この相補配列の長さを長くすることにより、標的に対するこの配 列の親和性が上昇した。しかし、このリボザイムのハイブリクイズする領域およ び切断領域は、互いに絶対必要な部分であった。相補領域を介して標的ＲＮＡに ハイブリダイズすると、このリボザイムの触媒領域が標的を切断した。リボザイ ムがインビボでの標的ＲＮＡの不活性化または切断に、例えば外来宿主ＲＮＡの 生成を特徴とするヒト疾病の治療なとに有用であろうことが示唆された。しかし 、リボザイムー指向性のトランス−スプライ７ング（トランス−切断とは対照的 に）は記載されておらずまた示唆されていない。

天然に存在する様々なりボザイムのエンドリボヌクレアーゼ活性（切断活性）が 徹底的に研究されている。これらのりポザイムの構造および配列の分析により、 切断部位の回りのある種のヌクレオチドは保存性が高いが側面に位置する配列は さほど保存性が高くないことが示された。この情報により天然に見られない新規 なエンドリボヌクレアーゼ活性の設計が導かれた。例えば、Ｃｅｃｈおよび他の 者は改変された基質配列特異性を有する新規なりボザイムを構築した［Ｃｅｃｈ 、　Ｔ、　Ｒ，ら。

１０８ｇ１０４３００；　Ｋｏｉｚｕｍｉ、−ら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、２２８ ：　２２８−２３０　（１９８ｇ）；　Ｋｏｉｚｕ＋＊ｉ、l、ら。

ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、２３９：　２８５−２８８　（１９８ｇ）；　Ｈａｓｅｌ ｏｆｆ、　Ｊ、ら、Ｎａｔｕｒｅ　３３４：　５８５−５９P　（１９８ ７）：およびＨｅｕｓ、　Ｈ，Ａ、ら、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１ ８：　１１０３−１１０８　（１９９０）］。自自己−切断植物ライロイおよび サテライトＲＮＡの初期の研究［Ｂｕｚａｙａｎ、　Ｊ、　Ｍら、　Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　ＵＳＡ８３：　８８５９−８８６２　 （１９８６）］から、他のＲＮＡ分子をトランスで非常に配列特異的に切断し得 るリボザイムの設計のための指針が開発された［Ｈａｓｅｌｏｆｆ、Ｊら、　Ｎ ａ５ｔｕｒｅ　３３４：　５８５−５９１　（１９８８）］。しかし、これらの 構築物は効率的な標的化トランスースプライシング反応を触媒することができな かった。

異なるＲＮＡ上に含まれるエクソンの結合、即ち、トランス−スプライシングは 、天然において５ｎＲＮＰ−介在性および自己−触媒性グループＩおよびグルー プＩＩイントロンの両方に対して発生する。トリパノゾーマ類およびＣａｅｎｏ ｒｈａｂｄｉｔｉｓ　ｅｌｅｇａｎｓのｍＲＮＡにおいて、共通の５′リーダー 配列が異なる遺伝子から転写されてａ＋ＲＮＡの３′部分にスプライスされる［ ＾ｇａｂｉａｎ、Ｎ、、　Ｃｅ１ｌ　６１：　１１５７−１１６０　（１９９０ ）；　Ｈｉｒｓｈ、Ｄ、ら、　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、Ｒｅｐ、１４：　１１５　（ １９９０）］。これらの小さな「スプライスされたリーダーｊ　ＲＮＡ（ｓｌＲ ＮＡ）は、哺乳動物の５ｎＲＮＰ−スプライシング抽出物においてＵｌｓｎＲＮ Ａの代わりに機能的に置換することができる配列に融合された５°エクソンから なる。

さらに、グループＩおよびグループ１１の自己−スプライシンゲイントロンの両 方は、人工的な系においてトランスでエクソン連結することができる［Ｂｅｅｎ 、　ＶＤら、　Ｃｅ１ｌ　４７：　２０７−２１６　（１９８６）；　Ｇａ１ｌ ｏｖａｙ−３ａｌｖｏ、Ｊ、Ｌ、ら、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、２１P：　５ ３７−５４９　（１９９０）；　Ｊａｃｑｕｉｅｒ、Ａら、　５ｃｉｅｎｃｅ　 ２３４：　１０９９−１１９４　（１９８６）；およびＪａ窒窒■ ｌ　１、　Ｋ、　Ａ、ら、　Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　８：　２３６１− ２３６６　（１９８８）］。］トランスースプライシンはインビボにおいて葉緑 体のスプリット遺伝子中のグループ１１イントロンに対して起こり［Ｋｏｈｃｈ 　ｉ、　■、ら、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１６：　１００２５−１０ ０３６　（１９８ｇ）］、大腸菌の人工的スプリット遺伝子中のグループＩイン トロンに対して示されている［Ｇａ１ｌ。

ｗａｙ−３ａｌｖｏ、　Ｊ、　Ｌ、ら、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　２１１：　 ５３７−５４９　（１９９０）］。後者の場合には、グループＩイントロンを含 有するバタテリオファージＴ４チミジル酸シンターゼ遺伝子（ｔｄ）がイントロ ンへリノクスＰ６ａを結合しているループにおいて分割される。

ｔｄ遺伝子セグメントの転写がインビトロでトランス−スプライシングを受け、 機能障害性の大腸菌宿主細胞を救うことが示された。既知の塩基対合（Ｐ３、Ｐ ６、およびＰ６ａ）およびイントロンセグメント間の可能な３次相互作用が、遺 伝子の半分の正しい組立ておよびプロセシングを可能にした。

インビトロで、テトラヒメナのりボザイムは一本鎖のモデルのオリゴリボヌクレ オチド基質のトランス−スプライシングを触媒することができる。４つの成分が 必要である　リボザイム、３°−末鎖ＲＮＡ、５°エクソンおよびＧＴＰ０内部 ガイド配列で開始してＵ　４０８で終了するテトラヒメナのりボザイムの短縮さ れた形態（Ｌ−２１５ｃａｒ　ｒ　ＶＳ　ＲＮＡ）がそのような反応において用 いられたＣＦＩａｎｅｇａｎ、　Ｊ、　Ｂ、ら、Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｃｈｅｍ 、（Ｓｕｐｐ、）　１２　ｐａｒｔ　Ｄ：　２Ｂ　（１９８ｇ）］。５′スvラ イ ス部位のＧＴＰによる攻撃によって５°エクソンが遊離し、それが次いでリポザ イムにより３′スプライス部位のトランスエステル化反応において３°エクソン に連結された。

特定のＲＮＡを標的化および破壊するためのアンチセンスＲＮＡの使用に代わる ものとして、ワホザイムのインビボでの使用が提案されている［Ｃｅｒ　１ａｃ ｈ、　Ｌ　Ｌ。

ら、ＥＰ３２１，２０１；　Ｃｏｔｔｅｎ、Ｍ、、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃ ｈｎｏｌ、８：　１７４−１７８　（１９９０）；　Ｃｏｔ狽■氏AＭ。

特表十６−５０７３０８　（４） ら、ＥＭＢＯＪ、８：　３８６１−３８６６　（１９８９）：　５ａｒｖｅｒ、 Ｎ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４７：　１２２２−１２２５　i１９ ９０）］。例えば、ＨＩ＼ｒ　１感染中に発現されるＲＮＡに向けられた触媒性 エンドヌクレオライティック活性を有するリボザイムの発現が、ヒト免疫不全ウ ィルス１型（ＨＩＶ−１）感染に対する可能性ある治療として示唆された［５ａ ｒｖｅｒ、　Ｎ、ら。

５ｃｉｅｎｃｅ　２４７：　１２２２−１２２５　（１９９０）；　Ｃｏｏｐｅ ｒ、）１．、　ＣＤＣＡＩＤＳ　Ｗｅｅｋｌｙ、＾ｐｒｉｌ@３．１９８９゜ ２頁：　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　Ｆｉｌｅ　２６５中のＤｉａｌｏｇ’ｓ　Ｆｅｄｅ ｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ中のＲｏｓｓｉ、　Ｊ、　Ｊ、　A＾ｂｓ ｔｒａｃｔ　ｏｆ　Ｇｒａｎｔ　Ｎｏ、ＩＲ０１ＡＩ２９３２９］。しかし、そ のような試みも依然として成功していない。

ヒト免疫不全ウィルス１型（ＨＴＶ−１）感染の治療における治療薬としてリボ ザイムを使用することの可能性を調査するために計画された研究において、ハン マーヘッド・モチーフのりボザイム［Ｈｕｔｃｈｉｎｓ、　Ｃ，Ｊ、ら＋　Ｎｕ ｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１４：　３６２７　（１９８６）；　Ｋｅｅｓｅ 、Ｐ、ら、　［ウィロイドおよびウィロイド様病原体Ｊ　、　Ｊ、Ｓ、Ｓｅｍａ ｎｃｉｋ編、　ＣＲＣＰｒｅｓｓ、　Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ、　ＰＬ、　１９８ ７．　ｐｐ、　１−４７］がＨＩｖ−１ｇａｇ転写物を標的とするようにされた 。ヒト細胞培養物中のｇａｇ標的標的化リポニイム現により、ＨＩＶ−１ｇａｇ ＲＮＡおよび抗原ｐ２４レベルの減少（しかし完全な消失ではない）がもたらさ れた［５ａｒｖｅｒ、　Ｎら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４７：　１２２２−１２２ ５　（１９９０月。即ち、逃避するあらゆる病原体ＲＮＡが宿主に対して問題を 残すので、５ａｒｖｅｒのりボザイムの医学的な有効性はその低効率により限定 された。

インビボでのりボザイムの応用についての別の問題は、核抽出物中のりボザイム の阻害機能のために基質に対して高い比率のりボザイムが必要とされるが、その ような比率を達成することは困難であることである。Ｃｏｔｔｏｎらは基質に対 するワボザイムの高い比率を、カエル卵母細胞中の強力なｔＲＮＡプロモーター （ポリメラーゼＩＩ＋プロモーター）に機能的に結合されたりボザイムー産生遺 伝子を温存する発現カセｙｈを、リポザイムのための切断配列を温存する基質Ｒ ＮＡと共にマイクロインジェクションすることにより達成した［Ｃｏｔｔｏｎ、 　Ｍ、ら、　ＥＭＢＯＪ、　８：３８６１−３８６６　（１９８９）］。しかし 、マイクロインジェクションは多細胞生物における適当な供給方法ではない。

大腸菌β−ガラクト／ダーセをコードするｍＲＮＡに対して設計されたりホザイ ムのインビボでの活性が報告されている［Ｃｈｕａｔ、　Ｊ、−Ｃ，ら、　Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、ｃｏｍｍｕｎ、１６２：　１０２５−１ ０２９　（１９８９）コ。しかしこの活性は、リホザイムおよび標的が細菌細胞 中に同じ分子上でトランスフェクションされた場合にのみ観察された。

β−ガラクト／ダーゼ遺伝子の標的部分を有する細菌のＦエビソームから転写さ れたｍＲＮＡを標的とした場合にはりホザイム活性は効果がなかった。

このように、リボザイム活性の現在の技術的な応用は、標的ＲＮＡの活性を壊す ためにリホザイムの切断活性を利用することを計画するものに限られている。

残念ながらそのような応用には、有効性を確保するために全ての標的ＲＮＡ分子 の完全な破壊および／または比較的高いリホザイム　基質の比率が必要とされる ことが多く、これを達成するのは困難であった。もっとも重要なことには、修飾 された当分野のりホザイムは有効な指向性のトランス−スプライシングをするこ とができない。

従って、非常に有効なりホザイムおよびリボザイム発現系の開発に対する必要性 が存在する。特に、宿主ＲＮＡ中への新しいＲＮＡ配列のトランス−スプライシ ングにより、存在するＲＮＡ配列を破壊するかまたは存在するＲＮＡの暗号配列 を変化させるための有効な方法は当分野において開示されていない。

発明の要旨 新規なりポザイムの設計のための潜在性を認識し、そしてインビボにおける高等 真核生物の遺伝子の性質を変化させる有効性の高い方法に対する必要性を認識し た上で、本発明者らはりボザイムを利用してインビボで天然ＲＮＡの遺伝情報を 変化させる研究を行なった。これらの試みにより、極めて有効なトランスースプ ラインングリボザイム、およびその工作のための指針が開発された。

本発明に従い、第一にＲＮＡまたはＤＮＡ分子が提供されるが、該分子はインビ トロまたはインビボで非常に正確な方法で任意の選択された標的ＲＮＡ配列中に 新しい３′工クソン配列を有効にスプライシングすることができるトランスース ブマイシングリポザイムをコードしており、そして該分子は任意の選択された標 的ＲＮＡまたは３°工クンン配列を適応させる能力において、および該リボザイ ムの特異性を増強する相補配列の付加において新規である。

本発明に従い、さらにリボザイムをコードしているＲＮＡまたはＤＮＡ分子が提 供されるが、該リボザイムのための配列は、該リボザイムを標的ＲＮＡにハイブ リダイズするように標的化するに十分な第一のＲＮＡ配列、および標的ＲＮＡ中 に転移させることができ、標的化ＲＮＡ配列にとって外来のＲＮＡ配列をコード している第二のＲＮＡ配列を提供する融合ＲＮＡである。

本発明に従い、さらにリボザイムをコードしているＲＮＡまたはＤＮＡ分子が提 供されるが、該リポザイムのための配列は上記のような融合ＲＮＡであって、該 融合ＲＮＡによって提供される第一のＲＮＡ配列が該ＲＮＡ分子をＧＡＬ４ＲＮ Ａにハイブリダイズするように標的化するための配列であり、そして該融合ＲＮ Ａの第二のＲＮＡ配列がジフテリア毒素のＡ鎖（Ｄ　Ｔ　Ａ）の暗号配列を提供 する融合ＲＮＡである。

本発明に従い、さらに立体配座が破壊された本発明のりボザイム、即ちブローリ ボザイムをコードしているＲＮＡまたはＤＮＡ分子が提供されるが、該ブローリ ボザイムは基質−活性化されるもの、即ち該ブローリボザイムは標的ＲＮＡとの 特異的な相互作用により再活性化されるまで無視されるか、または自己−切断も しくはトランスースプラインング活性を有さないものである。

本発明に従い、さらにリボザイムまたはブローリボザイム発現カセ、トを含有す るＲＮＡまたはＤＮＡ分子が提供されるが、該カセットは宿主において安定に維 持されるか、または宿主のゲノム中に挿入することができ、モして該カセ、）は 、本発明のりボザイムまたはブローリポザイムの配列に機能的に結合された該宿 主において機能し得るプロモーター配列を提供するものである。

本発明に従い、さらにリボザイムまたはブローリボザイム発現カセットを含有す るＲＮＡまたはＤＮＡ分子が提供されるが、該カセットは宿主ゲノム中に安定に 挿入することができ、そして該カセットは、本発明のりボザイムまたはブローリ ボザイムの配列に機能的に結合されたＧＡＬ４応答性プロモーター配列を提供す るものである。

本発明に従い、さらにインビトロでのトランス−スプライシングのための方法が 提供されるが、該方法は以下の段階からなる：（１）インビトロで本発明のりポ ザイムまたはブローリボザイムおよび該リボザイムのための適当な基質を供給し 、（２）さらに該リボザイムまたはブローリボザイムの所望の触媒活性を促進さ せるインビトロの反応条件を提供し：そして（３）該条件下で該リボザイムまた はブローリボザイムを該基質と反応させる。

本発明に従い、さらにインビボでのトランス−スプライシングのための方法が提 供されるが、該方法は以下の段階からなる：（１）本発明のＲＮＡまたはＤＮＡ 分子を宿主細胞に供給し、（２）該宿主細胞において該分子によりコードされる リボザイムまたはブローリボザイムを発現させ、（３）該宿主細胞において該リ ボザイムまたはブローリボザイムの基質を発現させ、そして（４）該宿主細胞中 で該リボザイムまたはブローリポザイムを該基質と反応させる。

本発明に従い、さらに標的ＲＮＡの活性を不活性化するための方法が提供される が、該方法は、（１）該標的ＲＮＡに対して触媒的に活性な本発明のりボザイム またはブローリボザイムを提供し、（２）該標的ＲＮＡを供給し、モして（３） 該リポザイムまたはブローリポザイムが該標的ＲＮＡに対してその触媒活性を発 現する条件を提供することからなる。

本発明に従い、さらに所望の遺伝子配列をインビボで宿主細胞に供給するための 方法が提供されるが、該方法は、（１）所望の宿主細胞中の標的ＲＮＡに対して 触媒的に活性な本発明のりボザイムまたはブローリボザイムを該所望の宿主細胞 に供給し、（２）該所望の遺伝子配列をフードしている該リポザイムまたはブロ ーリボザイムを供給し、そして（３）該リボザイムまたはブローリボザイムが該 所望の遺伝子配列を標的ＲＮＡの配列中にトランス−スプライスし得る条件を提 供することからなる。

本発明に従い、さらに多細胞性の植物および動物における細胞除去のための方法 が提供されるが、該方法は、任意の宿主細胞、特に受精した胚宿主細胞中に、該 宿主細胞に毒性である遺伝子配列をコードしている本発明のりボザイムまたはブ ローリボザイムであって、該宿主細胞中の所望の標的とトランス−スプライスし うる本発明のりボザイムまたはブローリボザイムを供給することからなる。

本発明に従い、さらに農業経済学的に重要な植物種において雄性または雌性不稔 を工学処理するための方法が提供されるが、該方法は、本発明のりボザイムまた はブローリボザイムを用いて生殖能力のために必要な任意の細胞を除去すること からなる。

本発明に従い、さらに植物の病原体に対して植物を免疫する方法が提供されるが 、該方法は、該病原体に感染した任意の宿主細胞を除去しうる本発明の植物病原 体−特異的な融合リボザイムまたはブローリボザイムを発現しうるトランスジェ ニック植物を構築することからなる。

本発明に従い、さらに所望の病原体に対して耐性である形質転換された病原体− 耐性の微生物が提供されるが、該微生物は、該病原体により発現される核酸分子 を標的とする触媒活性をもたらす本発明のりボザイムまたはブローリボザイムで 形質転換されている。

本発明に従い、さらに本発明のりボザイムまたはブローリボザイムにより供給さ れる所望のりボザイムまたはブローリボザイム活性を所望の宿主に供給しうるウ ィルス病原体が提供される。

図面の説明 図１はグループ■イントロンのりボザイムのスプライシング機序の概略図である 。

図２は（Ａ）テトラヒメナ・サーモフィラのｒＲＮＡイントロン；（Ｂ）Ｉ的ｍ ＲＮＡおよび本発明のトランスースプライシングリボザイムまたはブローリボザ イムの構造を示す概略図である。

図３（Ａ）はＣＡＴ−ＬａｃＺ　α−ペプチドのトランスースブマイシングリボ ザイムの設計の概略図であり：（Ｂ）はＣＡＴ−ＬａｃＺリボザイムの完全なり ＮＡ暗号配列である。

図４はキュウリモザイク病ウィルス（ＣＭＶ）ＲＮＡ４　）ランスースブマイシ ングリボザイムの配列を表す。Ａ　ウィルスＲＮＡ標的配列；Ｂ：オリコヌクレ オチド標的配列；Ｃ：ＣＭＶ　ＲＮＡ４−ジフテリア毒素Ａ鎖トランスースブマ イシングリポザイム。

図５はキュウリモザイク病つィルス３／４配列の比較である。

図６（Ａ）はＧａ１４−ジフテリア毒素Ａ（ＤＴＡ）トランスースブマイシング リボザイムの設計の概略図であり；（Ｂ）はインロイシン置換を伴うＧａ１４− ＤＴＡリボザイムの完全な暗号配列である。

図７はＧａ１４タンパク質の発現のためのＰ要素介在「エンハンサーー捕捉」法 の概略図である。

図８は野生型ＤＴＡおよびＤＴＡの３′工クソン突然変異体の部分配列を示すも のである。

図９はｐＧａＴＢおよびｐＧａＴＮの地図である。

図１０はｐＵＡＳＴの地図である。

図１１はＧａ１４−ＤＴＡトランスースプライシングリボザイムを発現するドロ ソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）胚の表皮調製物である。

図１２は「ブローリボザイム」設計のための原理を表す。矢印はりボザイムの切 断部位を示し、「アンチセンス」領域は黒で示し、触媒ドメインは放射状の陰で 示し、そして３゛「エクソン」配列は明るい陰で示す。標的１ＲＮＡが存在しな い場合、トランスースブマイシングリボザイムは一時的に塩基対合し、異種の配 列（それら自身を含む）と反応することがある。さらに、「３′エクソン」連結 点での切断が起こるであろう。不活性な「ブローリボザイム」を構築し、リポザ イムの触媒中心に誤った折り畳みを引き起こす余分の自己相補的配列を含むよう にする。活性なりボザイムは、意図した標的ｖＡＲＮＡとの塩基対合およびその 結果としての干渉２次構造の置換の後にのみ形成される。

図１３はＣＡＴ−ＬａｃＺ）ランスースブマイシングリボザイムの配列およびそ の予想２次構造を示す。リホザイム「コア」配列には陰をつけている（Ｃｅｃｈ 、　Ｇｅｎｅ　７３・２５９−２７１　（１９８８）に従った）。ヘリックスＰ ８は、未修飾のりボザイムおよびブローリボザイムｌおよび２について、各々１ ３および１８ヌクレオチドの「アンチセンス」領域に相補的な配列（強調されて いる）と共に示されている。

図１４は、（１）「アンチセンス」、ヘリックスＰ８を有するリボザイムドメイ ンおよび３°「エクソン」配列と共に概略的に示された活性なＣＡＴ−ＬａｃＺ リボザイム：（２０ａ）修飾されたヘリックスＰ８および「アンチセンス」領域 における配列間の塩基対合と共に示された不活性なＣＡＴ−ＬａｃＺブローリボ ザイム２：および（ｂ）ＣＡＴ　ｍＲＮＡとの塩基対合、ヘリックスＰ８−ｒア ンチセンス」対合の置換およびヘリックスＰ８の再形成の後の活性なブローリボ ザイムを示す。

図１５はＣＡＴ−ＬａｃＺブローリボザイム転写体の安定性を示す。ＣＡＴ−Ｌ ａｃＺリボザイムおよびブローリボザイム配列を含むプラスミドをＥｃｏＲＩで 切断し、Ｔ７またはＳＦ３　ＲＮＡポリメラーゼおよび［３２−Ｐ］ＵＴＰを用 いて転写させた。放射ラベルされた転写体を７Ｍ尿素および２５％ホルムアミド 中の５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分画し、オートラジオグラフィ ーを行った。このリボザイム転写体を、主として「３′エクソン」連結点のとこ ろで徹底的に加水分解した。ブローリボザイム形態は著しく反応性が低かった。

図１６はＣＡＴ−ＬａｃＺブローリボザイムのエンドリボヌクレアーゼ活性を示 す。ＣＡＴ−ＬａｃＺリボザイムおよびブローリボザイム配列を含有するプラス ミドを５ｃａｌで切断し、Ｔ７またはＳＦ３　ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写 させた。転写体を、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼを用いてＰｕｖｌｌ切断プラスミ ドから転写させた放射ラベル化ＣＡＴ　ＲＮＡと共に、４０ｍＭトリス−ＨＣＩ （ｐＨ７，５）、５　ｍＭ　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　ｔ、２ｍＭスペルミジン、ｌｏｍＭ Ｎａｃｌ、２ｍＭ　ＧＴＰ中、３７℃、４５°Ｃおよび５０°Ｃで３０分間イン キュベートした。生成物を７Ｍ尿素および２５％ホルムアミド中の５％ポリアク リルアミドゲル電気泳動により分画し、オートラジオグラフィーを行った。１７ ３ｎｔ（ヌクレオチド）ＣＡＴ　ＲＮＡのＲＮＡ媒介切断により、７６ｎｔおよ び９７ｎｔの５°および３°フラグメントが各々生成する。

図１７はブローリボザイムの設計に使用される「野生型」および修飾型ヘリ。

クスＰ８を、図式的に示した可能な塩基対合と共に示すものである。対応するブ ローリボサイムの「アンチセンス」部分に相補的な塩基を太文字で示す。相補的 な塩基の数は各ヘリックスの隣に掲げている。これらへリノクスは、インビトロ 転写中の「３°エクソン」の加水分解の程度により測定される、対応するプｏ　 −リボザイム転写体の安定性により順序づけられている。

図１８はＧＡＬ４−ＤＴＡブローリポザイムの安定性を示す。リボザイムおよび ブローリポザイムの配列を含むプラスミドをＸｈｏｌで直線化し、Ｔ７　ＲＮＡ ポリメラーゼを使用して転写させた。転写体を４０１１ＩＭトリスーＨＣＩ（ｐ Ｈ７，５）、６　ｍＭ　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　ｔ、２ｍＭスペルミジン、１０ｍＭＮａ Ｃ１、ｌ　ｍＭ　Ｇ　Ｔ　Ｐ中、５０℃で６０分間インキュベートし、７Ｍ尿素 および２５％ホルムアミド中の５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分画 し、そしてオートラジオグラフィーを行った。リボザイム転写体はこれらの条件 下で著しく加水分解されるが、一方、ブローリボザイム１は加水分解が少なく、 ブローリボザイム２は安定である。

以下の説明においては、組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）技術において用いられる多く の用語を広く使用する。本明細書および請求の範囲（用語び範囲を含む）の明確 で矛盾がない理解を与えるために、以下に定義を行う。

リボザイム　触媒活性を本質的に有するＲＮＡ分子。

トランス−スプライス　第一のポリヌクレオチドの核酸配列が第二のポリヌクレ オチドの配列中に該ポリヌクレオチド間の３゛→５°ホスホンエステル結合を保 持するように共直線的に結合または挿入される遺伝子操作の形態である。「指向 性の」トランスースプラインングまたは「基質特異的な」トランス−スプライシ ングは、トランスースプライシング反応のための基質として特定のＲＮＡ種（即 ち、転移される配列をスプライスするための特定のＲＮＡ種）を必要とするトラ ンスースプラインング反応を意味する。指向性のトランス−スプライシングは、 リボザイムまたはブローリボザイムが関連の一組のＲＮＡ中に存在する標的配列 に対して指向性であるように設計されるならば１を越えるＲＮＡ種を標的として よい。

標的ＲＮＡ　本発明のりボザイムまたはブローリボザイムの触媒活性のための基 質であるＲＮＡ分子。

発現カセット　本発明のりボザイムまたはブローリボザイムの発現に必要な配列 を提供する遺伝子配列。

家主Ｓ　配列をゲノムに「安定に」挿入するとは、該ゲノムのコピー中に該配列 が継承される結果になるように挿入することを意図している。

機能的な結合　「機能的な結合」とは、配列（または配列群）の機能を改変しう る方法で配列を他の配列（または配列群）に結合させるような結合をいう。例え ば、リホザイムまたはブローリボザイムのコード化配列をプロモーターに機能的 に結合させることにより、リボザイムまたはブローリボザイムのコード化配列の 発現は該プロモーターの影響下または支配下に置かれる。２つの核酸配列（例え ば、リボザイムまたはブローリホザイムのコード化配列および該コード化配列の ５゛末端のブロモ−クー領域の配列）は、プロモーター機能の導入の結果として リボザイムまたはブローリボザイムのコード化配列の転写が得られるならば、そ して２つの配列の間の結合の性質が（１）フレームシフト突然変異の導入を生じ ず、（２）リボザイムの発現を指令する発現調節配列の能力に干渉しないならば 、機能的に結合されているという。従って、プロモーター領域は、該プロモータ ーが核酸配列の合成を与えることができるならば、該核酸配列に機能的に結合さ れているで本発明のトランス−スプライ７ングリボザイム、ブローリボザイムお よび方法は、任意のＲＮＡ配列、特に成熟（イントロンを含まない）ｍＲＮＡ中 への指向性のトランス−スプライシングが可能なりボザイムを初めて提供するも のである。

本明細書中に記載されるトランスースブマイシングリポザイムは、標的に対して 広範囲な相補性を有し、当技術分野で開示されているテトラヒメナ・サーモフィ ラ由来のエンドリボヌクレアーゼ活性とは大きく異なる。本発明のりホザイムの 追加的な相補性により標的に対する親和性および特異性の上昇がもたらされるが 、その相補性は触媒活性の絶対必要な部分ではない。さらに、変性剤の非存在下 および高濃度のＭｇ＋＋のときに切断が効率良くそして正確に起こる。

本明細書中で開示されるトランスースブマイシングリホザイムの設計のための指 針は伝統的なものであり、良く特徴付けられたグループＩ自己−スプライシンゲ イントロンの性質に基づいており、任意の指向性のトランス−スプライ７ングリ ボザイムの設計のための一般的方式の提供を意味している。従って、本明細書中 で提示される指針はテトラヒメナ・サーモフィラのブレーｍＲＮＡのグループ■ イントロンに限られず、当業者なら他のグループＩイントロンと共に該指針およ び当分野での知識を使用して本発明のりボザイムを設計することができる。

天然のテトラヒメナ・サーモフィラ　リボザイム（イントロン配列）は、以下に 示すテトラヒメナ・サーモフィラの染色体外ｒＤＮＡの配列中の塩基５３から塩 基４６５に位置している ＴＧＡＣｔｌ；ＣＡＡＴＴ　ＣＡＡＣＣＡＡＧＣＧ　ＣＧＧＧＴＡＡＡＣＧ　Ｇ ＣＧＧＧＡＧＴ入＾　ＣＴＡＴＧＡＣＴＣＴＣＴＡＡＡＴＡＧＣＡ　ＡＴＡＴＴ ＴＡＣＣＴ　ＴＴＧＧＡＧＧＧＡＡ　ＡＡＧＴＴＡＴＣＡＧ　ＧＣＡＴＧＣＡＣ ＣＴＣＣＴＡＧＣＴＡＧＴ　ＣＴＴＴＡＡＡＣＣＡ　ＡＴＡＧＡＴＴＧＣＡ　Ｔ ＣＧＧＴＴＴＡＡＡ　ＡＧＧＣＡＡＧＡＣＣＧＴＣＡＡＡＴＴＧＣＧＧＧＡＡＡ ＧＧＧＧ　ＴＣＡＡＣＡＧＣＣＧ　ＴＴＣＡＧＴＡＣＣＡ　ＡＧＴＣＴＣＡ（、 ＣＧＧＡＡＡＣＴＴＴＧＡ　ＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧ　ＣＡＡＡＧＧＧＴＡＴ　Ｇ ＧＴＡＡＴＡＡＧＣＴＧＡＣＧＧＡＣＡＴＧＧＴＣＣＴＡＡＣＣＡＣＧＣＡＧＣ ＣＡＡ　ＧＴＣＣＴＡＡＧＴＣＡＡＣＡＧＡＴＣＴＴ　ＣＴＧＴＴＧＡＴＡＴＧ ＧＡＴＧＣＡＧＴＴ　ＣＡＣＡＧＡＣＴＡＡ　ＡＴＧＴＣＧＧＴＣＧ　ＧＧＧＡ ＡＧＡＴＧＴ　ＡＴＴＣＴＴＣＴＣ人ＴＡＡＧＡＴＡＴＡＧ　ＴＣＧＧＡＣＣＴ ＣＴ　ＣＣＴＴＡＡＴＧＧＧ　ＡＧＧＴＡＧＣＧＧＡ　ＴＧＡＡＴＧＧＡＴＧＣ ＡＡＣＡＣＴＧＧＡ　ＧＣＣＧＣＴＧＧＧＡ　ＡＣＴＡＡＴＴＴＧＴ　ＡＴＧＣ ＧＡＡＡＧＴ　ＡＴＡＴＴＧＡＴＴＡＧＴＴＴＴ（、ＧＡＧＴ　ＡＣＴＣＧＴＡ ＡＧＧ　ＴＡＧＣＣＡＡＡＴＧ　ＣＣＴＣＧＴＣＡＴＣＴＡＡＴＴＡＧＴＧＡＣ ＧＣＧＣＡＴＧＡＡ　ＴＧＧＡＴＴＡ　（配列番号１）ＳＫａｎ、　Ｎ、　Ｃ， ら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１０：　２８０９−２８２２　（１９８２ ）］。

本明細書中に記載されているように、本発明の指向性トランスースブマイシング リボザイムはこのイントロンの触媒性コアを用いて工学処理する。このイントロ ン、およびその触媒性コアは当技術分野で既知の方法により単離することができ る。イントロンの触媒性コア、即ち末端切除されたイントロンは５ｃａ１部位で 末端切除されていること、即ちイントロンの最後の５ヌクレオチドが除去されて いることにおいてのみ完全長のイントロンと異なっている。末端切除されたイン トロンＲＮＡは当技術分野で既知の方法により製造することができ、また、例え ばＵＳ　ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＥＣｌｅｖｅｌａｎｄ、　ＯＨ（の製品＃　７ ２０００（ＲＮＡｚｙｍｅＴ″Ｔｅｔ１．０Ｋｉｔ）等の商業的供給源からキッ トの形で市販品として購入することができる。このＵ　Ｓ　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉ ｃａｌキットによりリポザイムおよび該リボザイムの使用のためのプロトコール が提供される。転写されたＴｅｔ、１　ｃＤＮＡを以下に記述するようにポリメ ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）突然変異誘発のための基質として用いて合成トランス −スプライシング酵素を製造することができる。

本発明のりボザイムの基質特異性、すなわち基質として特異的なＲＮＡを「標的 」にするためのりポザイムの能力は、標的（基質）ＲＮＡに特異的な相補配列を リホザイムの５゛末端に融合させることにより得られる。

本発明のりボザイムの指向性トランスースプライシングの特異性、すなわち所望 の興味ある外来配列を標的ＲＮＡの配列にトランス−スプライスする際の特異性 は、新しい３′エクソンをリボザイムの３′末端に供給することにより得られる 。

設計の詳細についてはさらに以下に記載する。

（以下、余白） グループＩイントロンの構造的および触媒的な性質を変化させるため、イントロ ンの触媒性コア、即ちリボザイムのみが残るようにエクソン配列がそのようなイ ントロンの側面配列に取って代わる。得られた修飾されたりボザイムは基質ＲＮ Ａとトランスで相互作用することができる。イントロンの末端切除された形態（ 即ち、触媒性「コア」、即ちＳｃａ［部位で末端切除され、イントロンの最後の ５ヌクレオチドを除去したもの）を天然リボザイムの５°スプライス連結点に対 応する配列とインキュベートすると、その部位はスプライシングにおける第一段 階とよく似たグア／シン−依存性の切断を受ける。

本発明のりボザイムの工学には、以下の４つの指針の考慮が必要である。

第一に、スプライス部位を標的ＲＮＡ内に選択しなければならない。最終のトラ ンス−スプライシング複合体において、Ｐに末鎖の５′部分のみが標的ＲＮＡに より供される。１個の保存性残基であるウラシルのみが意図したスプライス部位 のす＜５゛側に必要とされる。これは標的ＲＮＡにおいて唯一必要な配列である 。標的ＲＮＡに必要とされるイネイト（ｉｎａｔｅ）な構造は存在しない。成熟 ｌｌＲＮＡを標的としてよく、トランスースプライシング反応は核中よりも細胞 質中で行われる（プレーｍＲＮＡに対して）。これにより細胞核中の高濃度のり ボザイムに対する必要性が回避される。

第二に、特定の標的配列を選択したなら、標的およびリボザイムＲＮＡの間に適 当なヘリックスＰ１を形成させるために、補完配列変化をリボザイムの５′部分 に加えなければならない。ヘリ、クスＰｉが意図した５′スプライス部位にＵ、 Ｇ塩基対を含み、このヘリックスのベースから４番目、５番目（好ましい）また は６番目に位置していることが非常に望ましい［本明細書の一部を構成するＤｏ ｕｄｎａ、　Ｊ、　Ａ、　、ら、「配列ではなくＲＮＡ構造が、グループＩイン トロンの５°スプライス一部位特異性を決定するＪ　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６：７４０２−７４０６　（１９８９）］。

天然のテトラヒメナ・サーモライライントロンについては、Ｐｌは意図した５° スプライス部位を過ぎてさらに３塩基対まで伸びているが、好ましい態様におい て、これは本発明のトランスースプライシングリボザイムにおいて維持される。

トランス−スプライシングが有効なものとなるためには、基質およびエンドリボ ヌクレオライティック　イントロンＲＮＡは塩基対を形成し、その結果としてゆ らぎＵ：Ｇ塩基対を有するヘリックスＰ１を形成しなければならない。

標的ＲＮＡの切断は、Ｕ：Ｇ塩基対のすぐ３′側（その塩基対の後）のホスホジ エステル結合のところで起こる。系統発生論的な比較および突然変異の分析によ り、５°スプライス部位の保存性ウラシル残基のすぐ隣の配列の性質は、へり、 クスＰ１の塩基対合が維持されているならば、触媒反応には重要ではないことが 示されている。

第三に、３°スプライス部位の側面に位置するエクソン配列を選択しなければな らず、必要ならリボザイムの５′部分に調節を行なって安定なヘリックスＰ１０ を形成させる。必要ならヘリックスＰＩＯを除外してもよいが、その存在はスプ ライシングを増強し、本発明のりポザイムの好ましい態様では、ヘリックスＰ１ ０が保持される［Ｓｕｈ、　Ｅ、　Ｒ，ら、　「テトラヒメナの自己−スプライ シングｒＲＮＡイントロンにおいて３゛エクソンおよび内部ガイド配列の間の塩 基対合が３°スプライス部位の特異性を上昇させるＪ　、　Ｍｏ１．Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ、　１０：　２９６０−２９６５　（１９９０）］。

ヘヘリックス１とヘリックスＰＩＯはテトラヒメナ・サーモフィラのイントロン ＩＧＳに沿って重なり合っており、５′および３°スプライス部位の両方の後ろ の２番目および３番目の残基は、ＩＧＳにおける同じ残基に対して相補的である （図２）。これに従うことにある種の利点が存在するかもしれないが、一方、多 くの天然のグループＩイントロンはこの制約を共有していないので、３′工クソ ン配列の選択は主として実験上の考察により決定してよい。そのような考察は、 スプライス部位の選択における広い融通性を反映する。例えば、ある点で２つの 配列を結合させることが所望であるときには、そのような点の配列は突然変異さ せることができないか、さもなくばトランス−スプライシング現象により変化さ せることができない。重なり合っている配列が他の方法では所望のスプライス部 位を適応させないときには、ＰｌまたはＰＩＯのどちらかをさらに短くすること ができる。

３°スプライス部位の選択のための配列の必要条件は、ヘリックスＰ９．Ｏおよ び隣接３゛グア／シン残基（３°イントロン境界を示す）を含むイントロン（リ ボザイム）それ自体の構造内に主に存在しているようである。Ｐ９．Ｏはイント ロン配列内に全体として含まれ、隣接３′スプライス部位の明確化を助ける。ト ランスースプライシングの設計のためにＰ９．０へリノクスおよびイントロン内 の機能的ＲＮＡ要素の残りが改変されることはない。Ｐ９．Ｏへリノクスの構造 上の特徴は知られている［Ｍｉｃｈｅｌ、　Ｆら、　「テトラヒメナ　リポザイ ムのグアノシン結合部位Ｊ　Ｎａｔｕｒｅ　３４２：　３９１−３９５　（１９ ８９）］。しかし、突然変異分析により示される様に、３′エクソン内の側面配 列がＰ１０ヘリックスの形成および効率的なスプライシングのために必要である 。

第四に、相補性配列の領域が、標的ＲＮＡに対する親和性および特異性を増強す るためにトランス−スプライ／ングリポザイムの５′末端に設置される。本明細 書中に示す様に、約４０の任意の長さの残基を使用した。所望の効果に有害でな いことを条件として他の長さを使用してもよい。

例えば、テトラヒメナ・サーモフイラの自己−スプライシンゲイントロン（以下 の略図に示す）： ］Ｐｌｏ ［上の略図中（および本出願の他のりボザイムの略図中）「１」および「２」は 第一および第二のスプライス部位を各々示している］から出発して、次の操作を 行なう： （１）選択した標的ＲＮＡ内のウラノル残基に隣接したｒ５’Ｊ：部位を選択す る。相補性に関与している配列はＰ１ヘワ！クス形成に関与している配列に直ち に隣接していることはなく、例えばＰＩＯ形成にも関与している５個のヌクレオ チドによって隔てられている。

（２）選択したＲＮＡに対して相補的な配列を自己−スブマイシンググループＩ イントロンの５′部分に融合させる。リボザイムと標的ＲＮＡの間の塩基対合に より、ヘリックスＰ１を形成させる： （３）選択した「３゛エクソン」配列を、保存性へリノクスＰＩＯを維持してい るリポザイムの３′部分に融合させる；そして（４）標的ＲＮＡに対する親和性 を増強するために、所望ならば延長された相補性配列の切片をリボザイムの５′ 部分に融合させて３０〜４０の塩基対を形成させる。

得られたトランスースプライシングリボザイムとその標的ＲＮＡとの整列はすぐ 下に示すように略図化することができる。標的ＲＮＡ配列は一番上のラインに表 す。リボザイム配列がその下に整列しており、連続配列が下の２つのラインのま わりを覆い、ここにリポザイムの５′および３′末端でのヌクレオチドのハイブ リダイゼーションおよびＰｌおよびＰＩＯが見られる。

”　０　＝ｎｎｎｎｎＧｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎ−ｎｎｎ１　１１１１１ １　５’ リボザイムコア・・・・・ψ・ＧＮＮＮＮＩＩＮＮ・・・・・・３”Ｉ　ＰＩＯ 本発明に従い、実質的にあらゆるＲＮＡ配列をあらゆるＲＮＡ標的にトランス− スプライスするトランスースプライノングリボザイムを設計することができる。

この標的がイントロン配列を含んでいること、あるいはこのリボザイムが標的配 列中のイントロンであることを必要としない。例えば、このような設計のための 方法は、以下の操作を含んでいるであろう、（１）所望の標的ＲＮＡの同定：（ ２）所望の標的ＲＮＡまたはその一部のクローニングおよび／または配列決定： （３）標的ＲＮＡ中にトランス−スプライスするための所望の暗号配列の選択： （４）本明細書中の指針を用いる該標的にハイブリダイズしうる本発明のりボザ イムの構築。

および（５）本発明のりボザイムがこの標的を所望の特異的トランスースプライ ンング反応の基質として利用することの確認、および（６）所望の宿主細胞中へ のりボザイムの挿入。

標的ＲＮＡの選択はトランス−スプライソング反応の所望の目的を反映するであ ろう。この反応の目的が特定のＲＮＡを不活性化することであるときには、該Ｒ ＮＡは、該ＲＮＡがフードしている全ての機能的なペプチドドメインを破壊する 位置で、そして所望ではない遺伝子配列の発現が継続する結果を与えない位置で トランス−スプライスされなければならない。このようなＲＮＡをフードしてい る遺伝子の１を越えるアレルが存在するときには、全ての発現される形態に共通 の部位で標的ＲＮＡを不活性化するようにリボザイムを設計するのが望ましいで あろう。別法によれば、標的ＲＮＡの特定のアレル形を不活性化するようにそれ ぞれが設計された１を越えるリボザイムを細胞に供給してもよい。

標的ＲＮＡの不活性化だけが所望であり、新規な所望のＲＮＡ配列の発現が所望 でないときには、このリボザイムによって付与される外来ＲＮＡは宿主細胞によ って翻訳されうる配列を提供する必要はなく、翻訳停止コドンを含有する配列を 末端切除化イントロンとして、例えば５ｅａ１部位のところで末端切除されたイ ントロンリボザイムとして用いることができる。

トランス−スプライソング反応の目的がある宿主細胞に対して遺伝的特徴を与え ることである場合には、標的ＲＮＡの選択はこの遺伝的特徴の所望の発現パター ンを反映するであろう。この遺伝的特徴が宿主によって継続的に発現されること が所望である場合には、標的ＲＮＡも継続的に発現されるべきである。この遺伝 的特徴が所望の増殖、ホルモンまたは環境条件のもとてのみ選択的に発現される ことが所望である場合には、この標的ＲＮＡもそのような条件のもとて選択的に 発現されるはずである。

リボザイムそれ自体が宿主によって翻訳されないが故に、リボザイムの基質が他 の方法では宿主中に存在しない場合には、リホザイムそれ自体の発現を所望の増 殖、ホルモンまたは環境条件に選択的に制限する必要はない。即ち、トランスー スプラインング現象が起こるまで本発明のりボザイムによって付与されるＲＮＡ がコードしている配列は宿主中で翻訳されず、該現象は宿主中のりボザイム基質 の発現によって制御されるであろう。

所望なら、リボザイムの発現を工作して、調節化標的の発現を誘導する同一因子 に応答してリボザイムの発現が起こるようにすることができるし、また、リボザ イムの発現を工作して、リボザイムと標的の両方が細胞中で選択的に誘導される がしかし別の因子（これら因子の組合せは望ましい現象ではない）によって誘導 される条件に、トランス−スプライ７ング現象の発生を制限するように別レベル の調節を付与することができる。このような調節は、リボザイム自体が同時発現 されない条件のもとて宿主細胞がリボザイムの標的を発現するのを可能にするで あろう。

標的ＲＮＡにハイブリダイズするりポザイムドメインの配列は、標的ＲＮＡの配 列によって決定する。標的ＲＮＡの配列は、該ＲＮＡをコードしている配列をク ローニングした後に、または該標的によってフードされているペプチドの配列決 定を行ない、該ペプチドをコートしているＲＮＡ配列を推定した後に決定する。

当分野で既知のクローニング法を、標的ＲＮＡをコードしている配列のクローニ ングに用いることができる。

標的ＲＮＡ中にトランス−スプライスされる所望の配列（以下においては、「ト ランス−スプライスされる配列」と呼ぶ）の選択は、トランス−スプライシング の目的を反映するであろう。新規な遺伝子配列が発現する結果にはならないトラ ンス−スプライ／フグ現象が所望である場合には、トランス−スプライスされる 配列は翻訳可能なタンパク質配列をコードしている必要はない。新規な遺伝子配 列、特に新規なペプチドまたはタンパク質配列が発現する結果になるトランスー スプラインング現象が所望である場合には、トランス−スプライスされる配列は 翻訳停止コドンおよび宿主細胞中でのＲＮＡの正しい翻訳プロセシングに必要な 他の情報をさらに提供するであろう。特定のタンパク質産物がトランス−スプラ イシング現象の結果として所望である場合には、得られる融合体においてアミノ 酸の読み枠が維持されることが必要であろう。

本発明のりポサイムの特異性の同定および確認は、所望の標的配列の存在下での み所望のトランスースプライシング反応を触媒する推定のりホザイムの能力を試 験することによって行なう。存在している唯一のＲＮ　Ａ配列が、リホザイムが 反応性ではない（または、反応性が小さい）非標的配列であるときには、トラン スースプラインング反応は起こらないはずである。このような特徴付けは、正し い（または、正しくない）リポザイム活性かより容易にモニターされうるように マーカーの助けを借りて行なうことができる。はとんどの場合、インビトロでリ ポザイムをその意図している標的に対して試験し、次いでそのインビボでの作用 を調へるためにリボザイムで宿主細胞を形質転換することで十分である。

宿主のＲＮ　Ａを排除することが所望である場合には、この排除はできるだけ完 全なものであるべきである。宿主細胞に新規な遺伝子配列を提供することが所望 である場合には、本発明のトランス−スプライシング反応は完全である必要はな い。このような遺伝子配列から翻訳されるペプチドの生物学的活性に依存して、 十分なトランス−スプライ／フグか起こって所望の目的に対して宿主に十分なｍ ＲＮＡおよびそれにコートされているポリペプチドが提供される限り、トランス −スプライシング現象か実際のところ全く非効率的であってよいことは本発明の 利点である。

宿主細胞における本発明のりボザイムの転写は、この宿主細胞にリボザイム遺伝 子を導入した後に起こる。宿主細胞によるリボザイムの安定な保持が所望でない 場合には、このリボザイムを化学的または酵素的に合成し、マイクロインジェク ション、リポソーム媒介のトランスフェクション、電気穿孔またはリン酸カルシ ウム沈澱などの機械的方法によって宿主細胞に供してよい。また、リボザイムを フードしている遺伝子の安定な保持が所望である場合には、このような保持を、 このリポザイムの少なくとも１個のＤＮＡコピーを宿主染色体中に安定に挿入す ることによって、または宿主細胞によって安定に保持されるプラスミド上にこの リポザイムのＤＮＡコピーを供することによって達成することができる。

本発明のりボザイムは、宿主細胞においてリボザイムの転写を制御する転写調節 要素を提供する発現カセットの一部として宿主染色体中に挿入されるのが好まし い。この要素は、プロモーター要素、エンハンサ−またはＵＡＳ要素、および転 写終止シグナルが含まれるが、必ずしもこれらに限定はされない。リポザイムが 翻訳されないのでポリアデニル化は必要ではない。しがし、このポリアデニル化 シグナルは、トランス−スプライスされる要素をコードしている配列と結合して 提供されることがある。

暗号配列が宿主染色体中に安定に挿入されたりボザイムの発現を、リボザイム暗 号化配列に機能的に連結されたプロモーター配列によって制御する。リポザイム の発現を指令するプロモーターは宿主細胞中で機能的な任意のプロモーターであ ってよいが、原核細胞においては原核性プロモーターが望ましく、真核細胞にお いては真核性プロモーターが望ましい。プロモーターは、宿主細胞において転写 の活性化および／またはプロモーターの抑制を指令する独立したモジュールから なる。このモジュールを、宿主においてリボザイムの適切な発現を付与するよう に、リボザイムのプロモーターにおいて混合および調和させてもよい。真核性プ ロモーターは真核細胞において機能的な任意のプロモーターであってよく、特に 、ＲＮＡポリメラーゼ１．１１またはＩ１１特異性のいずれかであってよい。多 種多様の真核宿主細胞におけるリボザイムの発現が所望である場合には、はとん どの真核宿主細胞において機能するプロモーター、例えば、ｒＲＮＡもしくはｔ ＲＮＡプロモーター、または広く発現されているｍＲＮＡのためのプロモーター 、例えば、アクチン遺伝子もしくはグルコース分解遺伝子のためのプロモーター を選択すべきである。ある種の細胞種または細胞種のみにおけるリボザイムの発 現が所望である場合には、該細胞種または組織種においてのみ機能的な細胞特異 的（または、組織特異的）なプロモーター要素を選択すべきである。

トランス−スプライシング反応は、それがインビトロまたはインビボで行われる ことを問わず化学的に同一である。しかし、インビボでは、補助因子が既に宿主 細胞中に存在しているのが普通であるので、標的およびリボザイムの存在がトラ ンス−スプライシングの結果を得るのに十分であろう。

本発明のトランスースブマイシングリボザイムおよび方法は、標的細胞の遺伝修 飾および／または細胞死に有用な遺伝子活性を産生させるのに有用である。例え ば、本発明のトランス−スプライシング反応は、所望の細胞に毒性を有するタン パク質を導入するのに有用である。細胞の感受性は、標的ＲＮＡおよびリボザイ ムの発現を指令する調節コントロールの選択によって決まるであろう。例えば、 毒性タンパク質をコードしているＲＮＡ配列を転置するりボザイムを工作して、 リボザイムの発現が機能的に結合されたプロモーターの性質に依存するようにす る。非常に好ましい態様においては、ジフテリア毒素ペプチドＡが宿主中の所望 の標的中に転置されるリボザイムの該部分によってコードされている。リボザイ ムとジフテリア毒素ペプチド毒素の条件付きの発現によって宿主細胞が死ぬ結果 になる。他の有用なペプチド毒素には、リンノ、外毒素Ａ１およびヘルペスのチ ミジンキナーゼが含まれる［Ｅｖａｎｓ、Ｇ、Ａ、、　Ｇｅｎｅｓ　＆　Ｄｅｖ 、　３：　２５９−２６３　（１９８９）］。さらに、種々の溶解酵素が細胞代 謝を破壊する可能性を有している。例えば、菌類のりポヌクレアーゼを用いて植 物の雄性不稔を引き起こすことができるＣＭａｒｉａｎｉ。

Ｃ０ら、　Ｎａｔｕｒｅ　３４７：　７３７−７４１　（１９９０）］。特定の 組織が標的ＲＮＡの制限された発現によって破壊されることがある。さらに、ウ ィルスＲＮＡを標的として用いる場合には、新規な形態のウィルス耐性または治 療法を工作することができる。

組織特異的な遺伝子発現の制御のためおよび／または異所性除去のためのバイナ リ−系を、本発明のりボザイムを用いて設計することができる。例えば、Ｐ要素 エンハンサーー捕捉ベクターを用いて組織および空間特異的なパターンで酵母の 転写活性化因子ＧＡＬ４を発現するドロソライラ系統を用いることができる。

ＧＡＬ４の代わりに任意の転写活性化因子を用いることができ、本発明はＧＡＬ ４に限定されるものではない。ＤＴＡ配列をトランス−スプライスしうる融合リ ボザイムをコードしている遺伝子をＧＡＬ４−ＵＡＳプロモーターの支配下に置 くことができ、遺伝的に安定な方法でドロソライラ中に挿入することができる。

このようなりポザイムはＧＡＬ４の存在しないドロソライラ中では発現しないで あろう。従って、このリボザイム構築物を遺伝的に担持するドロソライラ宿主と 組織特異的な方法でＧＡＬ４を発現するドロソライラ宿主を交配することによっ て子孫ハツトが得られる結果になり、ＧＡＬ４発現が誘導されたときにＧＡＬ４ 発現パターンと同様の細胞死パターンが示される。

さらに、リボザイムをＧＡＬ４　ｍＲＮＡにトランス−スプライスするように標 的化することによって、このリポザイムのスプライシング活性がＧＡＬ４の発現 を不活性化し、リボザイムの発現を自己調節することができる。

ブローリボザイム 上記のトランスースブマイシングリボザイムは、次の３つの融合した配列要素か らなる：即ち、標的ＲＮＡに相補性である５′「アンチセンス」領域、占己スプ マイシンググループＩイントロンに基づく触媒領域、および３°「エクソン」配 列からなる。この５′領域は選択した標的ＲＮＡと塩基対合することができ、こ れをグループＩイントロンの触媒配列の近くに持ってくることができる。グルー プＩイントロンの構造は、３′「エクソン」配列と標的ＲＮＡの正確なスプライ シングを触媒するに適した化学的環境を提供する。しかし、適切な標的ＲＮＡが 存在しないと、リボザイム配列は３゛「エクソン」連結点の切断をなお触媒し［ 同様の加水分解がグループＩの自己スプライソングイントロンに対して認められ る：　Ｚａｕｇら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３１：　４７０−４７５　（１９８６ ）］、リボザイムと異種ＲＮＡ配列（それら自身を含むことがある）の一時的な 塩基対合を経て異常なスプライシング現象を触媒することができるであろう。こ のような副反応および異常なスプライシング現象は望ましくなく、そして存寄で あろう。例えば、インビボにおける条件付きの毒素放出に対してトランスースプ ラインングを用いようとする場合、異常なトランス−スプライシングが前活性の 予想外の発現の結果を与えることがある。

３°「エクソン」連結点での自発的な切断はトランス−スプライシングの有効性 を低下させるであろう。

これら問題の回避を助けるため、例えばヘリックスＰ８が破壊された「ブローリ ボザイム」型のトランス−スプライシングＲＮＡを構築した。誤って折り畳まれ るリポザイムの触媒中心を引き起こす余分の自己相補性配列を含むようにブロー リボザイムを構築した。このブローリボザイムは意図している標的ＲＮＡの非存 在下では不活性である（活性型はこのリボザイムと標的ＲＮＡが塩基対合し、そ の結果、このリボザイム内の障害２次構造が置換された後にのみ生成する）。ブ ローリボザイムは標的ＲＮＡの非存在下では触媒的に不活性な種であって、イン ビトロおよびインビボにおいて望ましくない自己切断、自己スプライシングおよ び異常なトランス−スプライソング反応が排除されることが意図されている（図 １２）。

ここに記載したブローリボザイムは立体配座的に破壊されており、従って不活性 型のトランスースプラインング活性である。即ち、このブローリボザイムはごく わずかの自己切断活性しか持っていない。これらは標的ＲＮＡとの特異的な相互 作用によってのみ再活性化され、従って、意図されていない標的ＲＮＡに対する トランス−スプライシングを触媒する可能性の小さい基質−活性化型のりボザイ ムである。トランスースプライソングリボザイムは、インビボにおいて新規な遺 伝子活性を供給するのに用いることが意図されており、望ましくない副反応また は異常なスプライシングの程度のあらゆる減少か望ましく、また必要であろう。

トランスースブマイシングプローリボザイムのために本明細書ではヘリックスＰ ８の破壊を例に挙げたが、触媒活性に必要な他のへワックスも使用することがで きるであろう。

意図した基質ＲＮＡとの塩基対合だけが活性リボザイムの生成を可能するような 方法で触媒的に重要な構造の立体配座を破壊するこの同一のアプローチを、他の リボザイムの設計に適用することができよう。例えば、「ハンマーへノド」型エ ンドリボヌクレアーゼのループ配列［Ｈａｓｅｌｏｆｆら、　Ｎａｔｕｒｅ　３ ３４：　５８５−５９１’（１９８８）］を延長し、リボザイムの「アンチセン ス」アームの１つに相補性にすることができるであろう（上記のへワックスＰ８ の修飾と同様にして）。エンドリボヌクレアーゼ活性は、選択した標的ＲＮ　Ａ との塩基対合、破壊性２次構造の置換、および触媒のために必要なステム−ルー プ構造の再形成の後にのみ示されるであろう。

これにより、リボザイムのその標的の特異性が効率的に増加するであろう。

さらに、ブローリホザイムの活性化は基質それ自体との塩基対合に基つく必要は ない。その代わりに、選択した第３のＲＮＡまたは５ｓＤＮＡあるいはタンパク 質でさえも活性のために必要とされることがある。別の塩基対合またはＲＮＡ− タンパク質の相互作用が活性なりボザイム複合体の形成に必要となろう。このよ うな別の成分の利用可能性がリボザイム活性を決定し、これらを用いてリボザイ ムの選択性を変えることができよう。

本発明のりボザイムまたはブローリボザイムは、原核性もしくは真核性のあらゆ る宿主細胞に、特に植物もしくは哺乳動物宿主細胞、とりわけヒト細胞に、この ような宿主に適切な当分野で既知の方法を用いて、培養物もしくはインビボのい ずれかにおいて導入することができる。また、本発明のりボザイムをウィルスを 破壊するように工作することもできる。ある態様においては、本発明のりボザイ ムまたはブローリボザイムを、ウィルスの攻撃前に宿主細胞に遺伝的に安定な様 式で供する。このような宿主細胞における適当なウィルスによる感染または潜在 性ウィルスの発現（この宿主細胞においてリポザイムまたはブローリボザイムの 標的ＲＮＡが現れる結果になる）は、リボザイムの触媒活性およびウィルスＲＮ Ａ標的の破壊および／またはトランス−スプライシングによる毒素の産生を刺激 し、ウィルス感染した細胞が死ぬ結果を与えるであろう。別の態様においては、 リボザイムまたはブローリポザイムを工作してウィルスそれ自体にパッケージす ることができる。このような態様は、研究目的のためのウィルスの設計において 特に有用であろう（この態様では、特定のウィルスＲＮＡの機能を破壊し、従つ て該ＲＮＡの非存在下でのウィルス機能の研究を可能にするように、リボザイム またはブローリボザイムを設計してよい）。また、リボザイムを担持するウィル スを担体として用いて、宿主細胞を所望のりポザイムまたはブローリボザイム活 性でトランスフェクトすることもできる。

本発明のりボザイムまたはブローリボザイムを用いて農学的に重要な種において 雄性または雌性不稔を工作することができる。例えば、タバコにおける雄性不稔 を、ＴＡ２９またはＴ　Ａ　１３　ｍＲＮ　Ａ　［ｔｏｂａｃｃｏ　ａｎｔｈｅ ｒ−特異的遺伝子：　５ｅｕｒｉｎｃｋ、　Ｊ、ら、　１ｕｃ１．＾ａｉｄｓ　 Ｒｅｓ、１８：　３４０３　（１９９０）］を襟的として、これら標的中にＤＴ Ａ３°エクソンをトランス−スプライスする本発明のりボザイムまたはブローリ ボザイムを用いることによって工作することができる。

本発明のりボザイムまたはブローリボザイムを用いる組織の選択的な破壊または 修飾によって収穫植物の形態を操作することができる。例えば、標的中にＤＴＡ 　３’エクソンをトランス−スプライスする本発明のりボザイムまたはブローリ ボザイムを用いて種子貯蔵タンパク質ｍＲＮＡを標的とすることによって種なし 果物を作成することができる。

ウィルス特異的なりボザイムまたはブローリボザイムを発現させて感染細胞を死 滅させることによってトランスジエニ、り植物を感染から保護することができる 。これは「過敏反応」の人工的な形態であろう。例えば、標的中にＤＴＡ　３゜ エクソンをトランス−スプライスする本発明のりボザイムまたはブローリボザイ ムを用いてキュウリモザイクウィルスのコートタンパク質＋ｎＲＮＡを標的とす ることができる。

トランス−スプライ／ングリポザイムまたはブローリホザイムの導入によって、 微生物の集団を特定の病原に対して耐性にすることができる。例えば、チーズを 作る細菌をファージ感染に対して耐性にすることができるが、これは本発明のり ボザイムまたはブローリホザイムによって提供される３゛エクソンがコードして いる溶解酵素または細菌毒素遺伝子を用いてファージＲＮＡを標的とすることに よる（例えば、ファージ感染の後に未成熟溶菌を引き起こすことによってファー ジの複製を妨げるであろう）。

トランス−スプライシングにより毒性活性を放出するようにウィルス病原体を構 築することもできる。このようにして、特定の細胞種の除去のために、例えば癌 またはウィルス療法のために標的化することができる。例えば、ＨＩＶ園ＲＮＡ を、ウィルスまたはリポソーム放出のために、ＤＴＡ　３°エクソンを担持する 本発明のりボザイムまたはブローリポザイムの標的とすることができる。

以下に挙げる実施例はもっばら説明のためのものであって、本発明の範囲を限定 するものではない。

特徴付け ■１本発明のりボザイムのＰＣＲ増幅およびクローニング上で説明した指針に従 って、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）ｍＲＮＡのアミノ末端暗号配列 の部分をクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）＋ＲＮＡ 中の部位にスプライスするトランス−スプライシング融合リボザイムを設計した （図３）。テトラヒメナ・サーモライラ　リボザイムコアおよび３°エクソンと 境界を接する新規配列の接合断片はオリゴヌクレオチドとして合成した。

次いで、無傷のりボザイム配列を、リボザイムおよびβ−ガラクトシダーゼＤＮ Ａ鋳型とともにプライマーとして合成アダプターオリゴヌクレオチドを用いて、 連続ポリメラーゼ連鎖反応によって組立てた（使用可能な他の方法も存在するが 、本方法が最も好都合である）。

β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）のα−ペプチド暗号配列をクロラムフェニコ ールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の５°暗号配列中の部位にスプライ スすることができるリボザイムを構築するために、以下の３つのオリゴヌクレオ チドを合成した。

オリゴヌクレオチド１ ５“−ＧＧＣＣＡ　ＡＧＣＴＴ　ＣＴＴＴＡ　ＣＧＡＴＧ　ＣＣＡＴＴ　ＧＧＧ ＡＴ　ＡＴＡＴＣＡＡＣＧＧＴＧＧＴＡ　ＴＡＡＡＣＣＣＧＴＧ　ＧＴＴＴＴ　 ＴＡＡＡＡ　ＧＴＴＡＴ　ＣＡＧＧＣＡＴＧＣＡ　ＣＣ−３°（配列番号２）オ リゴヌクレオチド２ ５−ＧＡＴＴＡ　ＧＴＴＴＴ　ＧＧＡＧＴ　ＡＣＴＣＧ　ＴＡＣＧＧ　ＡＴＴＣ Ａ　ＣＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡＡ−３’　（配列番号３）オリゴヌクレ オチド３ ５−ＧＧＣＣＧ　ＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡ　ＡＴＴＴＣＣＡＴＴＣＡＧＧＣＴ　Ｇ ＣＧＣＡ　人ＣＴＧＴＴＧＧ−３’　（配列番号４） オリゴヌクレオチド２および３（それぞれ２００ｐモル）をＰｖｕｌｌ切断した ｐＧＥＭ４　ＤＮＡ［ＬａｃＺ　α−ペプチド配列を含有する］（０１！ｇ）と 混合し、以下の成分： ５０ｍＭ　ＫＣＩ、 １０ｍＭ　トリス−ＨＣＩ（ｐＨ８，３）、１　５ｍＭ　ＭｇＣ１！、 ０．４　巾Ｍ　ｄＮＴＰ。

０．１％　ゼラチン、および ５Ｕ　Ｔａｑｌ　ＤＮＡポリメラーゼ を含む１００μｍ容量中でＰＣＲ増幅に付し、３ｏサイクルのインキュベートを 行なった（９４°Ｃて１分間、５０’Ｃで２分間、７２°Ｃで２分間）。

プラスミドｐＧＥＭ４は、Ｐｒｏｍｅｇａ　ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎＣＭａｄｉ ｓｏｎ　Ｗｌ、　ＵＳＡｉから市販品として入手可能である。

２１０塩基対の増幅生成物を低ゲル化温度アガロース電気泳動によって精製し、 第２ラウンドのＰＣＲ増幅におけるプライマーとして用いた。

第２ラウンドのＰＣＲ増幅に続いて、２１０塩基対の増幅生成物（２，０！ｇ） 、オリゴヌクレオチド１　（２００ｐモル）およびテトラヒメナ・サーモライラ ＩＶＳを含有する４５０塩基対のフラグメント（０，１！ｇ）を混合し、上に示 した条件を用いてＰＣＲ増幅を行なった。得られた６６０塩基対の生成物を制限 エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌｌｌで消化し、プラスミドベク ターｐＧＥＭ４中にクローンした。ＣＡＴ−ＬａｃＺ　α−ペプチド　リボザイ ムＤＮＡ配列の全配列を、配列番号５および図３Ｂとして示す。

クローンした配列を含有するクローニングベクターを、当分野で既知の方法［Ｍ ａｎｉａｔｉｓ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ　Ｇｕｉｄｅ、第２版、　１９８９．　Ｃｏ１ｄ　rｐｒｉｎｇ ｌ（ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版］を用いて、細菌宿主Ｘ　Ｌ　１／ 　Ｂ　ｌｕｅｌｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊ。

１１ａ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ］中に導入し、増殖させた。しかし、このベク ターを安定に維持することができるあらゆる細菌宿主、例えばＪＭ１０９を用い ることができる。

当分野で広く知られている方法［Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ ｌｏｎｉｎｇ、＾ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＧｕｉｄｅ、第２版、　１９８９．　Ｃ ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版］を用いて、 さらに分析を行なうためにプラスミドを宿主細胞から抽出することができる。

ＩＩ　クローンしたりボザイムと標的ＲＮＡのインビトロ転写常法を用いて、ク ローンした配列を細菌宿主から精製し、リボザイム配列を切断しない制限エンド ヌクレアーゼ（例えば、ＥｃｏＲＩ）を用いてプラスミドを直線化し、そして以 下の成分５ ５μｇ　直線化したプラスミドＤＮＡ。

４０ｍＭ　トリス−ＨＣ（ｐＨ７，５）、６ｍＭ　ＭｇＣＬ、 ２ｍＭ　スペルミジン、 １０ｍＭ　ＮａＣ１， １０ｍＭ　ＤＴＴ。

１！Ｍ　ＮＴＰ（標識化ＲＮ　Ａ転写体が所望であるときには、２０μＣｉ［α −”Ｐ］ＵＴＰを含有する）、 ＩＱＱＵ　ＲＮａｓｉｎ、および ５０Ｕ　Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ を含む１００μｌ容量中でＴ７　ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写させ、この反 応液を３７℃で２時間インキュベートした。

ＲＮＡ転写体を、使用前に５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製し た（Ｔ　Ｂ　Ｅ、７Ｍ尿素ゲル）。活性なテトラヒメナ・サーモライラ■ｖＳ配 列を含有するＲＮＡは、転写中に３°イントロン一エキソン連結点において一部 の自発的な切断を受ける。後に行なうトランス−スプライシング検定中の分析を 明瞭にするため、電気泳動による精製によってフラグメントを除去する。

Ｉｌｌ、インビトロのトランス−スプライシング反応の条件標的および／または トランスースプライシングリボザイムを次の条件下でインキュベートする： ０１〜０．５μｇ　ＲＮＡ成分（量は実験の種類に依存する；通常は標的の５倍 過剰のりボザイム）、 ３０μｌＭ　トリス−ＨＣＩ（ＰＨ７，５）、１００ｍＭ　ＮａＣ１゜ ２ｍＭ　ＧＴＰ。

５ｍＭ　ＭｇＣ１＊、 ５μｍ容置中、４２°Ｃで６０分間。

反応液を９５μｌの０．１ｍＭ　Ｎａ、ＥＤＴＡ、２００ｆｆｉＭ　ＮａＣ１で 希釈し、エタノール沈澱させる。次いで、このＲＮＡをＴＢＥ緩衝液、７Ｍ尿素 および２５％ホルムアミドを含有する５％ポリアクリルアミドゲルで分析し、オ ートラジオグリボザイムと標的の塩基対合の後のトランス−スプライシングの第 １の工程は、標的ＲＮＡの意図された５°スプライス部位におけるグアノシン媒 介の切断である。アニーリングおよびトランス−スプライシングは、緩衝液、例 えば３０ｍＭトリス−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、１００ｍＭ　ＮａＣ１，５ｍＭ　 ＭｇＣＩｔ、２ｍＭ　ＧＴＰ中において４２℃で行なうことができる。３′スプ ライス部位はこの反応に必要ではないので、末端切除したトランスースブマイシ ングリボザイムは特異性の高いエンドリボヌクレアーゼとして働くはずである。

この活性を試験するために、上記のＣＡＴ−ＬａｃＺ　α−ペプチド　トランス ースプライシングリボザイムの短縮されたインビトロ転写体く配列番号５および 図３）を、ＣＡＴ　ｍＲＮＡ配列とともにインキュベートした。このＣＡＴ−Ｌ ａｃＺリボザイムカセノトはＨｉｎｄｌｌｌ−ＥｃｏＲ■フラグメント上にある 。５ｃａｌ切断部位は３°スプライス部位の上流の５塩基の位置に示される。こ のリホザイムは、標的ＲＮＡを予測した単一部位のところで特異的に切断して予 測した大きさのフラグメントを生成した。

■、トランスースプライシング反応 ５”スプライス部位において３′工クソン配列の連結を触媒するＣＡＴ−Ｌａｃ Ｚα−ベブチドリボザイムの能力を確かめるために、種々の形態を放射標識した ＣＡＴ　ＲＮＡとインキュベートした。リボザイム転写体は、リボザイムコアの 末端からエクソン配列までの範囲のいくつかの位置の１つにおいて３゛切除され たＤＮＡ鋳型から合成した。標識したＣＡＴとのインキュベートにより予測した スプライス化産物の生成が導かれたが、これらは３°工クソン配列の長さに依存 して長さが異なっていた。

さらに、一定比率のＣＡＴ−ＬａｃＺ　α−ペプチドリボザイム分子は、無傷の テトラヒメナ・サーモライライントロンと同様、インビトロの転写中に３°スプ ライス部位において自発的な切断を受けた。３°スプライス部位に隣接するグア ノシン残基のところで終わるこれらの切断された形態もＣＡＴ　ＲＮＡとともに インキュベートした。この場合には、このリボザイムそれ自体がＣＡＴ　ＲＮＡ の３′部分に連結されて、大きさが約５５０ヌクレオチド産物が得られた。この 反応は無傷イントロンの自己環化に類似しており、同一の連結産物が他のトラン ス−スプライシング反応において見い出される。

Ｖｌ、）ランス−スプライシングの精度ＣＡＴ−ＬａｃＺ　α−ペプチド　トラ ンス−スプライシング反応からの生成物を逆転写し、予測スプライス部位の両側 の配列に相補性である２つのオリゴヌクレオチドを用いてポリメラーゼ連鎖反応 により増幅した。増幅した配列をクローニングし、配列決定した。個々の組換え 体は、スプライスされた生成物の予測配列からの変化を示さなかった。無傷イン トロンを用いた研究において見い出されるように、スプライシングは極めて正確 のようである。

即ち、上記の研究は、本発明の指針に従って設計したトランスースブマイシング リボザイムがインビトロで正確かつ効率的にトランス−スプライスしうろことを 示すものである。

（以下、余白） 実施例２　植物ウィルス耐性を与えるトランスースプライシングリボザイムの設 計 キュウリモザイクウィルス（ＣＭＶ）は、多数の既知の変種を有する汎流行ウィ ルスである。９つの配列変種が、ＲＮＡ３およびサブゲノム１ｌＲＮＡ４中にコ ードされているそれらのコートタンパク質シストロンの最初の領域に示されてい る〔配列番号７〜２５；図４（Ａ）および図５１゜このコートタンパク質のＡＵ Ｇ開始コドンから下流であって配列中に保存されている２つの部位を選択した。

１ｌｅ−突然変異体型のＤＴＡをＣＭＶコートタンパク質ｍＲＮＡ中にトランス −スプライスすることができるリボザイムの構築のためのオリゴヌクレオチドを 図４Ｂに示し、以下に説明する。

図４０およびＤに示したトランスースプライシングリボザイムを図４Ｂに示した ＣＭＶウィルス配列に対して標的化すると、このリポザイムは感染細胞において ＣＭＶ　ＲＮＡ分子の切断だけでなくジフテリア毒素Ａ鎖の発現の結果を与える であろう。図４に示したトランスースプライシングカセットを当分野で既知の方 法を用いて任意のＣＭＶ感受性の植物種中に導入することができ、トランスジェ ニック子孫をＣＭＶ！＠染によってチャレンジすることができる。このリボザイ ムの設計は次のように行なう。即ち、リボザイムそれ自体は翻訳されないので、 ウィルス感染がＲＮＡ　トランス−スプライシングにより毒素の産生を開始する ために必要であるようにする。毒素の発現に起因する感染細胞の局所的な死は、 植物内のウィルスの複製と伝播を制限し、人工的な過敏反応を与えることができ るでムの構築および特徴付は 本発明および実施例１記載の方法に従って、Ｇａ１４−ジフテリア毒素Ａ鎖トラ ンスースプマイシングリボザイムである融合リボザイムを設計した（図６）。

このリボザイムの配列は配列番号６に示されている。このＧＡＬ４−ＤＴＡリボ ザイムカセノトは５ａｉｌ−ＸｈｏＬフラグメントである。５ａｉｌ部位は３゛ スブライス部位の５塩基上流の位置に示される。このリボザイムは、ジフテリア 毒素Ａ鎖の暗号配列をＧＡＬ４ｍＲＮＡの５′領域中の部位にスプライスするこ とができる。このトランス−スプライシング活性は、インビトロ（上記）および インビボ（下記）の両方において活性である。このＧＡＬ４−ＤＴＡリボザイム ならびに毒性産物をコードしている配列をトランス−スプライスする任意のトラ ンスースプラインングリボザイムの設計に成功するための重要な基準は、トラン スースプライシングの効率的かつ正確な触媒作用だけでなく、毒性産物（例えば 、ＤＴＡ）の発現がトランスースプライシングのないときに起こらないことであ る。

リボザイムの触媒性部分は上記した設計に徒って構築し、５°および３″スプラ イス位をそれぞれＧＡＬ４およびＤＴＡの５“暗号領域内に選択した。３°工ク ソン配列は、最初のＡＵＧコドンおよび数個の基部アミノ酸の除去を除いて、真 核生物中での発現に既に使用したＤＴＡ遺伝子の配列に対応している。また、元 のＣ，ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ型のＤＴＡはこの５“領域において異なっており 、翻訳開始にＣＵＧコドンを利用している。さらに、元のＤＴＡ配列は、欠失し たシグナルペプチドリーダー配列を含有している。

これらのりボザイム分子は３°スプライス部位において自発的な切断を受けるこ とができる。ＤＴＡの極度の毒性が付与されるものとすると、あらゆる遊離した ３″工クソン配列が毒性の翻訳産物を生成しないことが重要である。この３゛エ クソンは１３位にフレーム内メチオニンを含宵しており、これが恐らくは末端切 除されているが毒性であるポリペプチドを生成することができるであろう。この 可能性を排除するために、野生型配列（Ｒｚ−ＤＴＡ、、、）を、この位置のメ チオニンからイソロイ／パＲｚ−Ｄ　Ｔ　Ａ　ｒ　１　、）またはロイシン（Ｒ ｚ−ＤＴＡ＋−ｕ）に、２つの独立したりホザイムの構築において変化させた（ 図６）。

本明細書中に記載した指針に従って設計したりボザイムのインビボ活性ならびに 宿主細胞に新規な遺伝子活性を供給する該リポザイムの能力を、記載したＧａ１ ４−ジフテリア毒素Ａ鎖トランスースブマイシングリボザイム（実施例３および 図６）を用いて宿主細胞に極めて毒性の高いジフテリア毒素Ａ産物を供給するこ とにより証明した。この系においては、ドロソライラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　 ；ショウジヨウバエ）が選択された宿主であり、このドロソライラ宿主内におい て組織特異的な方法で本発明のりボザイムの発現を制御するのを目的とした。

ジフテリア毒素は、Ｂファージに対して溶原性であるフリネバクテリウム・ジフ テリアエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ＋ｍ　ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）によ って分泌される。この毒素は単一のポリペプチドとして産生され、これがタンパ ク質加水分解を受けてＡおよびＢ鎖を生成する。この人鎖（ＤＴＡ）は、真核生 物の翻訳伸長因子ＥＦ−２に特異的である強力なＡＤＰリボシラーゼ活性を含ん でいる。数分子のこの酵素の存在でさえ、種々の真核細胞において翻訳の停止お よび最終的な死を引き起こすに十分である。Ｂ鎖は、マンノース残基に結合する ことによって細胞表面受容体にこの毒素を付着させることにより細胞内供給を可 能にし、エンドサイト−７ス（飲細胞）され、小胞融合によって細胞質に入る。

Ｂ鎖が存在しないと、Ａ鎖は細胞外供給されたときに毒性が非常に低い。この性 質およびその極めて強い毒性は、これを異所性除去実験に使用することを示唆し た。例えば、ＤＴＡをフードしている配列をトランスジェニックマウス中で発現 させた（オプシンプロモーターを用いて発生中の目において発現させた）。得ら れたマウスは盲目であり、奇形した目を有している［Ｂｒｅｉｔｍａｎ、　ｌ１ １．　Ｌ、　、　５ｃｉｅｎｃｅ２３８：　１５８３−１５６５　（１９８７） ］。他の研究においては、マウス膵臓の除去が行われ［Ｐａ１ｍ１ｔｅｒ、　Ｒ ，Ｄ、ら、　Ｃｅ１ｌ　５０：　４３５−４４３　（１９８７）］、そしてＹｅ ｒｔ、　Ｓ、　Ｅ、ら［八ｍ、　Ｒｅｖ、@Ｒｅ５ｐｉｒ、 Ｄｉｓ、　１４１　（Ｎｏ、２、バート２）：　Ａ３９５　（１９９０）］は、 ヒト表面活性物質プロティンＣ遺伝子（ＩＩ型肺胞細胞において発現される）の プロモーターおよび５′境界配列ならびにＤＴＡ遺伝子からなるキメラ遺伝子の 使用による肺胞細胞の除去を記載している。

しかし、この種のアプローチを用いて、さらに重度または致死性の表現型を有す ることもある形質転換生物を維持または増殖させることはできない。さらに、一 部の種（例えば、ドロソライラ）の無傷ＤＴＡ配列による形質転換はこれまで報 告されていない。このような形質転換中のＤＴＡ遺伝子の漏発現により直ちに死 か導かれる。

Ｉｔ　ドロソライラ系 ドロソライラ（ショウジヨウバエ）において遺伝子を発現させる一般法を開発し た。第一に、この系は、異なる組織または細胞種に異所性の遺伝子発現を指令す ることかできる個々の株の迅速な生成を可能にする。エンハンサー検出法を利用 してＣｏ’　Ｋａｎｅ、　Ｃ，ＪおよびＧｅｈｒｉｎｇ、Ｗ、Ｊ、、　Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔｌ＾ｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　ｕｓ＾：　９１２３−X１２７　（１ ９８７）；　Ｂｅ１ｌｅｎら、Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　 ３：　１２ｇｇ−１３００（１９８９）：　Ｂｉｅｒら、Ｇ■獅■■ ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　３：　１２７３−１２８７　（１９８９）３ 、胚、幼虫および成虫において多種多様のパターンで転写活性化因子タンパク質 を発現させる。第二に、この方法は別系統において活性化因子をその標的遺伝子 から隔てることにより、個々の親系統か生存性であることを確保する（ある系統 においては活性化因子タンパク質が存在しているが活性化するための標的遺伝子 を有しておらず、第二の系統においては標的遺伝子がサイレントである）。これ ら２つの系統を交配させると、標的遺伝子は交配子孫においてのみ作動し、優性 表現型（致死性を含む）を好都合に研究することが可能になる。

所望の遺伝子だけを異所発現させるためには、ノ＼工中に内生の標的を持たない 転写活性化因子か必要である。酵母由来の活性化因子であるＧａ１４はノ＼工に おいて転写を活性化することができるが、それはＧａＬ４結合部位を有するプロ モーターからたけであるＪＦｉｓｃｈｅｒら、　Ｎａｔｕｒｅ　３３２：　８５ ３−８６５　（１９８８）コ。遺伝子発現を標的とするため、２つの方法てＧａ １４を特定細胞に制限する；特徴付けられたノλエプロモーターによってＧａ１ ４を転写させるか、またはエンノーンサーのないＧａ１４遺伝子をドロソライラ のゲノム中にランダムに組込んでそれを様々な配置のケ／ムエンハンサーの支配 下に置いた。Ｇａ１４によるトランス活性化を検定するため、Ｇａ１４を発現す るハエを、１ａｃＺ遺伝子（その転写はＧａ１４結合部位によって作動する）を 持つハエと交配させる［Ｆｉｓｃｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　３３２：　８５３− ８６５　（１９８８）コ。Ｇａ１４が初めに発現される細胞においてのみβ−ガ ラクトシダーゼが発現される。１ａｃＺの組織および細胞特異的なトランス活性 化は、Ｇａ１４が発現され、種々のパターンがもたらされる菌株において示され た。

この系を用いて、現在では次のことが可能である：ｌ）任意の暗号配列の上流に Ｇａ１４結合部位を設置すること：２）Ｇａ１４が発現されている細胞内におい てのみ該遺伝子を活性化すること、および３）発生におけるこの異常な発現の効 果を観察すること。異所性の発現か致死性である場合には、この方法は２つの親 系統（一方はＧａ１４を発現し、他方はそのプロモーター中にＧａ１４結合部位 を保持するサイレント遺伝子を担持する）が安定に増殖することを可能にする。

次いで、交配子孫において表現型を研究することができる。

ＩＩ＋、ベクター これらの研究において出発材料として使用されるベクターには次のものが含まれ る・ １）ｐＧＡＴＢおよびｐＧ　Ａ　Ｔ　Ｎ　（図９）これらのベクターは、プロモ ーターのないＧａ１４遺伝子の上流にプロモーターおよびエンハンサ−をクロー ニングするために用いる。

唯一のＮｏｔｌまたはＢａｍＨ１部位のいずれかをＧａ１４暗号領域の上流に挿 入したベクターを構築した。プロモーターをＧａ１４暗号配列に連結した後に、 遺伝子をｐＨ３ＲＥＭベクター骨格［ＫｎｉｐｐｌｅおよびＭａｒｓｅｌｌａ− Ｈｅｒｒｉｃｋ、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

１６・７７４８　（１９８！１）］から切り出すことができ、Ｐ要素ベクター中 に移動させることができる。Ｒｈ２プロモーターをこのベクター中にクローニン グし［ＭｉｓＩＩｌｅｒら。

Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１２（１：　１７３−１８０　（ＸＱＲ＆）コ、Ｇａ１４が 単眼においてのみ発現されるノ＼工を創製した。

２）が達上旦 これはエンハンサ−検出において使用するためのＧａ１４ベクターである。

エンハンサ−のないＧａ１４遺伝子をベクターｐ　１ｍ　Ｂ　［Ｗ　ｉ　ＬＳＯ Ｉ’ｌら、　Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　３：　１３０１− １３１３　（１９８９）］中にサブクローニングしてｐＧａｗＢを創製した。

初めに、ｐｌｗＢをＨｉｎｄｌｌｌで消化して、ｌａｃ　Ｚ遺伝子とＰ−トラン スポザーゼ遺伝子のＮ−末端を除去した。これらを、Ｐ−）ランスボザーゼ遺伝 子のＴＡＴＡボ。

クスの後ろで、全Ｇａ１４暗号領域によって置換した。

３）ｐＵＡＳＴ（図１０） このプラスミドは、Ｇａｌ　ＵＡＳの下流に暗号配列をクローニングするために 使用した。

Ｇａ１４　ＵＡＳ（上流活性化配列）の後ろに遺伝子をサブクローニングするこ とができるベクターを、Ｐ要素ベクターｐＣａＳ　ｐｅＲ３［Ｃ，Ｔｈｕｍｍｅ ｌ、　Ｕｔａｈ大学Ｍｅｄｉａａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ、　５ａｌｔ　Ｌａｋｅ　Ｃ １ｔｙ、　Ｕｔａｈ、私信］において構築した。５つのＧａ１４結合部位を挿入 し、これらにｈｓｐ７０　ＴＡＴＡボ、クスおよび転写開始、ポリリンカー、お よび５Ｖ４Ｑイントロンおよびポリアデニル化部位を続けた。遺伝子またはｃＤ ＮＡを挿入することができる唯一の部位には、ＥｃｏＲＩ、Ｂｇｌｌｌ、　Ｎｏ ｔＩ、Ｘｈｏｌ、ＫｐｎｌおよびＸｂａｌが含まれる。

■ｖ　Ｌロソフィラ株 これの研究において利用したドロソライラ株を特徴付けるために用いた本明細書 中に記載した遺伝子技術は当分野で周知である［［叶ｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌ ａｎｏｇａｓｔｅｒの遺伝子変異Ｊ　＋　Ｄ、ＬｔｎｄｓｌｅｙおよびＥ、　Ｉ ’１．　Ｇｒｅｌ１編］。

高レベルの構成的に活性なトランスポザーゼを発現する第三染色体上の欠損性Ｐ 要素であるΔ２−３を担持する「ジャンプスターター」株を用いて、Ｐ要素トラ ンスポゾンを移動させる［Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１１８ ：　４５１−４７０　（１９８８）］。挿入系統を創製およびマツピングするた めに現在用いられている３種の保存物は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　５ｔｏｃｋ　 Ｃｅｎｔｅｒ　［Ｉｎｄｉａｎａ大学Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｒ　Ｂｉｏｌｏ ｇｙ、　Ｊｏｒｄａｎ@Ｈａｌｌ Ａ　５０３．　Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ、Ｉｎｄｉａｎａ　４７４０５］に寄託 されている。

１　：　ｙ　ｗ；　＋／＋；　ｓｂ　Ｐ［ｒｙ”、　Δ２−３］／ＴＭ６．　Ｕ 　ｂ　ｘ２　：　Ｗ；　＋／＋；　７Ｍ３．Ｓｂ／ＣｘＤ　（寄託番号３６６５ ）３　：　ｗ：　ＣｙＯ／Ｓｃｏ＋　＋／＋　（寄託番号３６６６）ここで３つ の染色体の遺伝的特徴はセミコロンで分けられている。即ち、例えば株１におい ては、第一の染色体（Ｘ染色体）は黄色および白色に対してホモ接合性であり（ ｒｙｗＪ）、第二の染色体は野生型であり（ｒ＋／＋Ｊ）、そして第三の染色体 はスタブル（ｓｔｕｂｂｌｅ）遺伝子（ｒＳ　ｂＪ　’）、およびＰ要素トラン スポゾンロージ−（ｒｏｓｙ）遺伝子（ｒｒｙ”Ｊ）およびΔ２−３を担持して いるが、第二の第三染色体はバランサー逆位（ｒ／ＴＭ６．　Ｕ　ｂ　ｘＪ　） を担持している。

構築物を次の保存物から導いた胚に注入する：♀♀ｙ　ｖ／ｙ　ｗ　；Δ２−３ ．Ｓｂ／ＴＭ６．Ｕｂｘ　Ｘ　♂♂ｙｖ／Ｙ；Δ２−３．　Ｓｂ／７Ｍ６．　Ｕ ｂｘＦＯ：単一系統を樹立 ♀　ｙ　ｖ／ｙ　璽；Δ２−３．　Ｓｂ／７Ｍ６．　Ｕｂｘ　Ｘ　／　ｙ　ｗ／ Ｙ　：　”／”または ♂ｙｖ／Ｙ；Δ２−３．Ｓｂ／ＴＭ６．Ｕｂｘ　Ｘ　♀ｙ　ｖ／ｙ　＊　；　＋ ／＋Ｆｌ：［ｗ±］およびｓｂ士　孫を選択および保存物を樹立♀　ｙ　ｖ／ｙ 　ｖ；　＋／ＴＭ６．Ｕｂｘ　Ｘ　／　ｙ　ｗ／Ｙ：　＋／＋または ♂　ｙ　ｗ／Ｙ　；　＋／ＴＭ６．Ｕｂｘ　Ｘ　♀　ｙ　ｗ／ｙ　Ｗ　：　十／ ＋［Ｗ°］および［Ｂ］子孫を選択し、保存物を樹立する。

２、Δ２−３−染色体からのジャンプ ♀♀ｙ　Ｗ／Ｙ　＊　Ｘ　♂♂ｙ　ｗ／Ｙ　；　Ｐ［Ｇａ１４．　ｖ”］、Δ２ −３．　Ｓｂ／＋［Ｗ゛］および［Ｓ　ｂ”］子孫を選択し、保存物を樹立する 。

Ｃ染色体の分離 挿入の分離を分析するために、次の２つの保存物を用いる・Ｗ　：　１−７＋　 ；　７Ｍ３．　Ｓｂ／ＣｘＤおよびｗ　；　ＣｙＯ／Ｓｃｏ　；　４／＋。

方法 細胞または組織特異的な様式でＧａ１４を発現する多数の菌株を創製するために 、別バージョンのＧａ１４遺伝子を担持するエンハンサ−検出ベクターを構築し た。

完全長タンパク質または末端切除タンパク質のいずれかをコードしている２つの 遺伝子を、ロージー（ｒｙ”）および白色（ｗ”）Ｐ要素ベクター［ｐｌＡｒＢ およびｐｌｗＢの改変バージミンＨ１ｌｉｌｓｏｎら、　Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　 Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　３：　１３０１−１３１３　（１９８９）］中にクロ ーンした。スクリーンとしてｒｙ”またはＷｏを用いて、これらのベクターをΔ ２−３遺伝子の導入によって移動させた［Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、　Ｇｅｎｅｔ ｉｃｓ　１１８：　４６１−４７０　（１９８８）］。Ｇａ１４の発現パターン を可視化するために、Ｇａ１４挿入系統を、Ｇａ１４ＵＡＳの支配下に１ａｃＺ 遺伝子を担持する菌株と交配する［Ｆｉｓｃｈｅｒら、　Ｎａｔｕｒｅ　３３２ ：　８５３−８６５　（１９８＋１）］。これらの交配によって導かれる胚、幼 虫および成虫を、基質としてＸ−ガルを用いる酵素検定またはβ−ガラクトシダ ーゼに対するモノクローナル抗体を用いる染色のいずれかによって、β−ガラク トシダーゼの発現についてスクリーンした。Ｕ　Ａ　Ｓ−１ａｃＺ構築物がコー ドしているβ−ガラクトシダーゼは細胞質中に局在化される。

約５００のＧａ１４−挿入株をスクリーンし、特定の組織（例えば、表皮の縞、 中胚葉、中枢神経系および末梢神経系など）において遺伝子を活性化するのに用 いることができる多数の株を同定した。多数の系統が、唾液腺ならびに他の組織 においてβ−ガラクトシダーゼを発現する。エンハンサ−のないＧａ１４）ラン スボゾンを構築する際に、位置依存性の唾液腺エンハンサ−が偶発的に生成した 可能性がある。

ｖｌ、試料スクリーン 特定パターンにおける遺伝子（遺伝子Ｘ）を活性化するために、Ｇａ１４挿入系 統を選択し、ＧＡＬ　ＵＡＳの後ろにクローンされた遺伝子Ｘを担持する菌株と 交Ｇａ１４／ＵＡＳ系は、遺伝子活性化を制御するための２部分系である。この 方法は融通性があり、組織特異的であることができ、そして恐らくは本明細書中 に記載したようにＵＡＳ−ＤＴＡ構築物を除いて基礎レベルの発現を示さないと 考えられる。これを用いることにより、特徴のわかった遺伝子を異所発現させ、 他の方法では生物に対して致死性である改変された遺伝子を発現させ、そして他 の種に由来する遺伝子を発現させてドロソライラの発生に及ぼす作用を調べるこ とができる。この方法は優性な機能増加−突然変異の生成を可能にするので、可 視性または致死性表現型のエンハンサ−またはサプレッサーのスクリーンおよび エビスタシス試験を実施することができる。また、このＧａ１４系は、細胞およ び組織特異的な除去の結果を研究するための毒性産物の発現を可能にする。

Ｖｌｌ＋、本発明のＤＴＡリボザイムとＧａ１４を発現するドロソライラの使用 ＤＴＡタンパク質をコードしている配列を担持する融合リボザイムの発現を、ｐ ｕ　Ａ　Ｓ　Ｔ中のＧａ１４　ＵＡＳ（上流活性化因子配列）の支配下に置いた （図１０）。

上記のように、改変型Ｐ要素エンハンサーー捕捉ベクターを用いて、ドロソライ ラの多数の安定な系統を作成した（それぞれが、発生中のハエにおいて特定の空 間約および時間的パターンで酵母の転写活性化因子ＧＡＬ４を発現する）。この ＧＡＬ４上流活性化因子配列（Ｕ　Ａ　Ｓ　）の支配下にある任意の遺伝子を、 ＧＡＬ４を発現する系統と遺伝交配させることによって、特定のドロンプィラ組 織において形質転換および単独で維持し、次いで誘導することができる（図７） 。しかし、ＤＴＡの漏発現によるＵＡＳ−ＤＴＡ形質転換体を調製する際の困難 性の故に、さらに改変することなくＤＴＡそれ自体を発現させるためにＧａ１４ 系を利用することはできなかった。

トランスースブマイシングリボザイム（図６）を介してＤＴＡを条件付きで発現 させる手段としてこの２要素系を用いると上記の問題が克服されることがわかっ た。ＧＡＬ４を発現する細胞において、ＧＡＬ４タンパク質はりボザイム転写に 必要な活性を与え、ＧＡＬ４　ｍＲＮＡはＤＴＡ産生に必要なトランス−スプラ イシングのための標的を与える。

当分野で既知の方法を用いて、上記のようにＵＡＳプロモーターの支配下に設置 されたりボザイム配列を、ドロソライラの胚に注入することができる。Ｒｚ−Ｄ ＴＡ、、、構築物を注入された胚は生存することができないが、Ｒｚ−ＤＴＡｉ ＋＊およびＲｚ−ＤＴＡｉ＊ｕを注入された胚からは正常な形質転換されたハエ が得られた。

この結果は、内部ＡＵＧコドンが注入後の毒性産物の翻訳のための開始コドンと して実際に作用していることを示唆した。このフドンは、ＤＴＡ配列中の計画さ れたＮ　Ａ　Ｄ　＋　結合部位に隣接しており、ンコードモナス・アエルギノサ （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の別のＥＦ−２特異的 ＡＤＰ−リボンラーゼである遠縁の外毒素Ａ中に保存されている配列に隣接して いる。

ＧＡＬ４　ＵＡＳの支配下にＲＺ−ＤＴＡＩＩ＠およびＲＺ　−Ｄ　Ｔ　Ａ　ｔ 　ｅ　ｕ配列を含有しているトランスジェニックハエを、特定の発現パターンで ＧＡＬ４を産生ずるハエと交配した。例えば、特徴のわかった系統の１つである ＩＪ３系統において、ＧＡＬ４遺伝子をヘアリ−（ｈａｉｒｙ）遺伝子の近くに 挿入し、その発現パターンを反映させた。０のへアリ−遺伝子産物は胚形成中に 均等分割された腹部体部の表皮縞において産生される。ＧＡＬ４がヘアリー遺伝 子産物と同じパターンで発現されるＩＪＳ中に、ＵＡＳ誘導されるＬａｃＺ遺伝 子を導入すると、β−ガラクトシターゼか均等分割された編向に局在化されて見 い出された。Ｒｚ−Ｄ　Ｔ　Ａ　ｌ−８遺伝子を含有するハエをこのＧＡＬ４を 発現する系統と交配させると、正常な子孫が得られた。しかし、Ｒｚ−Ｄ　Ｔ　 Ａ　ｔ　Ｉｓを含有するハエをＧＡＬ４を発現する系統と交配させると、子孫の 成長が胚形成中に抑制された。比較的暗い色のバンドが胚の表皮上に明らかであ り、そこに存在する細胞の死と一致していた。表皮調製物を検査すると、均等分 割された小歯状突起バンドが破壊されるかまたは失われていたく特に、４．６お よび８番目の縞のバンド）（図１１）。他の特異的な細胞死パターンが、Ｒｚ− ＤＴＡｔｔ＊含有ハエを別のＧＡＬ４発現遺伝子と交配させたと実施例５　ブロ ーリボザイムの設計 ブローリボザイムの設計のための試験として、先に説明したＣＡＴ−ＬａｃＺ　 トランスースブマイシングリボザイムに修飾を加えた（図２）。系統発生学によ る比較および突然変異分析［概説については、Ｃｅｃｈ、　Ａｎｎ　Ｒｅｖ、Ｂ ｉｏｃｈｅｔ　５９：　５４３−５６８　（１９９０）を参照］により、グルー プＩ自己スプライシングイントロンのコア領域の保存性が高（、これが活性にと って重要であることが示された（図８）。トランスースプライシングブローリボ ザイムの構築のために、この領域にすぐ隣接するヘリックスＰ８を破壊した。最 初の実験において、１３または１８ヌクレオチドの新規な配列をヘリックスＰ８ のループおよび５°鎖に導入して、ブローリポザイム１および２をそれぞれ得た 。この余分のヌクレオチドはりボザイムの５゛「アンチセンス」部分に相補性で あり、一方、これと境界を接する配列は、（１）　Ｐ　８基部の実際の配列、お よび（２）　Ｐ　８内で可能な塩基対合の長さ、を保存するように調節した（図 １３）。ヘリックスＰ８中に挿入した配列とブローリポザイムの５′「アンチセ ンス」領域の間の自己−相補性の程度は、この新しいヘリックスがヘリックスＰ ８より優先して形成期転写体において形成されることが期待されるようにする。

また、この別へリノクスの形成により、リボザイムの触媒性コア内の境界２次、 および恐ら（は３次相互作用を破壊することが期待されるであろう。即ち、この プローリポザイムの誤った折り畳みはそれを触媒として不活性にするであろう（ 図１４）。しかし、意図した標的ＲＮＡとブローリボザイムの塩基対合は、Ｐ８ −ｒアンチセンス」塩基対合を置換し、この「アンチセンス」配列を隔離し、モ してＰ８ヘリックスと活性な触媒性ドメインの再形成を可能にするであろう。

ｐ８−ｒアンチセンス」ヘリ、クスの置換は、さらに大きな量の塩基対を与える ことになり、触媒性ドメインの適切な折り畳みを可能にし、従ってエネルギー的 に有利なはずである。

ＣＡＴ−ＬａｃＺ　ブローリポザイム ２種類のＣＡＴ−ＬａｃＺ　ブローリボザイムに対応するクローン化配列を上記 のＰＣＲ−突然変異誘発を用いて構築し、インビトロ転写によってＲＮＡを産生 させた。ＣＡＴ−ＬａｃＺ　トランスースプライシングリボザイムは、イントロ ン配列によって触媒される加水分解の結果として、転写中に３゛スプライス連結 において切断を受けることが観察された。同様の加水分解が、未修飾のテトラヒ メナ・サーモライライントロンのインビトロ転写において観察される。対照的に 、別種のＣＡＴ−ＬａｃＺ　ブローリボザイムの転写体はさらに安定であり、同 じ条件下で明瞭な切断をわずかしか有していない（図１５）。このことはブロー リボザイムが不活性であることを示すものであり、これは触媒性配列が誤って折 り畳まれているときに期待されるものである。末端切除された形態のブローリボ ザイムを、ＣＡＴ　ＲＮＡに指向性の特異的エンドリボヌクレアーゼ活性（二つ いて試験した。

ＣＡＴ〜ＬａｃＺブローリホザイムＲＮＡは、３′スプライス連結点およびＬａ ｃＺ配列を除去するように、５ｃａＩ部位のところで末端切除された鋳型から転 写された。

３°スプライス部位を除去した後に、リホザイムおよびブローリボザイムＲＮＡ の両方か安定である。末端切除したブローリポザイムとＣＡＴ　ＲＮＡのインキ ュベートにより、標的ＲＮＡの特異的な切断が導かれ、予想された大きさのフラ グメントが得られた（図１６）。特異的な切断活性は３７．４５および５０度で 観察された。

また、ブローリホザイム型のＧＡＬ４−ＤＴＡＩ−ランスースブマイシングリボ ザイムも構築した（図１７）。２０ヌクレオチドの領域（「アンチセンス」領域 に相補性）をヘリックスＰ８のループおよび５′鎖中に挿入した。この２種類の プローリボザイムは、修飾されたヘリックスＰ８において可能な塩基対合の程度 が異なっており、ＧＡＬ４−ＤＴＡ　ブローリホザイム１はループ中により長い ステムとより少ない（３）接近性塩基を有している。ＧＡＬ４−ＤＴＡブローリ ホザイム２のへリノクスＰ８はＣＡＴ−ＬａｃＺ　ブローリボザイム２のものに さらに密接に類似しており、「アンチセンス」領域に相補性の配列を含むさらに 大きいループ（１４塩基）を有している。ＧＡＬ４−ＤＴＡ　ブローリポザイム の転写体は、未修飾リボザイムの転写体よりもさらに安定である。特に、ブロー リボザイム２は、リボザイム型の実質的に完全な自己切断の結果を与える条件で のインキュベート（５０°Ｃで３０分間、１０　ｍＭ　ＭｇＣ１，，２ｍＭＧＴ ＰＨ図１８を参照）の後に大部分か無傷である。

以上に本発明の詳細な説明したが、本発明の思想もしくは範囲または本発明のい ずれかの態様に障ることなく、本発明を広くかつ等価な条件またはパラメーター などの範囲内で実施しうろことは当業者の理解するところであろう。

（以下、余白） 配列表 （１）　一般的情報 （］）特許出願人：　ハセロフ、ジェームズ（ｉｉ）　発明の名称：　トランス ースプライシングリホザイムを用いる細胞除去１ｉ）　配列の数　５６ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）名宛人・スターン、ケスシー。コールドシュタイン・アンド・フォックス （Ｂ）　通り　スィート３００、エヌ・ダブリュー、コ不チカノト・アベニュー （Ｅ）　国：アメリカ合衆国 （Ｆ）ＺＩＰ・２００３６ （ｖ）　コンピー−ター解読書式。

（Ａ）　媒体型、フロッピーディスク （Ｂ）　コンピューター：ＩＢＭＰＣ適合（Ｃ）　オペレーティング・システム ：　ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）　ソフトウェア：　Ｐａｔｅｎｔｌｎ　 Ｒｅ１ｅａｓｅ　＃　１．　Ｏ、バージョン＃１．２５（ｖｉ）本出願のデータ ・ （Ａ）　出願番号：　ＰＣＴ （Ｂ）　出願臼・本　日 （Ｃ）　分類：未　定 （ｖｉｉ）　優先権主張出願のデータ。

（Ａ）　出願番号：ＵＳＯ７／６４２３３０（Ｂ）　出願臼：１９９１年１月１ ７日（ｖｉｉ）　弁理士／代理人情報。

（Ａ）氏名　コールドンニタイン、ンヨーノ・ニー（Ｂ）　登録番号・２９，０ ２１ （Ｃ）　参照／整理番号：０６０９．３４９６６０４（ｉｘ）　ｉｉ話連絡先情 報： （Ａ）１１話番号：（２０２）８３３−７５３３（Ｂ）　ファックス番号：（２ ０２）８３３−８７１６（２）　配列番号ｌの情報 （１）　配列の特徴 （Ａ）　長さ：５１７塩基対 （Ｂ）　型・核酸 （Ｃ）　鎖の数：両形態 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）　配列の種類：　ＤＮＡ （ｘｉ）　配列・配列番号Ｉ ＴＧＡＣＧＣＡＡＴＴ　ＣＡＡＣＣＡＡＧＣＧ　ＣＧＧＧＴＡＡＡＣＧ　ＧＣＧ ＧＧＡＧＴＡＡ　ＣＴＡＴＧＡＣＴＣＴ　５０ＣＴＡＡＡＴＡＧＣＡ　ＡＴＡＴ ＴＴＡＣＣＴ　ＴＴＧＧＡＧＧＧＡＡ　ＡＡＧＴＴＡＴＣＡＧ　ＧＣＡＴＧＣＡ ＣＣＴ　１００ＣＣＴＡＧＣＴＡＧＴ　ＣＴＴＴＡＡＡＣＣＡ　ＡＴＡＧＡＴＴ ＧＣＡ　ＴＣＧＧＴＴＴＡＡＡ　ＡＧＧＣＡＡＧＡＣＣ１５０ＧＴＣＡＡＡＴＴ ＧＣＧＧＧＡＡＡＧＧＧＧ　ＴＣＡＡＣＡＧＣＣＧ　ＴＴＣＡＧＴＡＣＣＡ　Ａ ＧＴＣＴＣＡＧＧＧ　２００ＧＡＡＡＣＴＴＴＧＡ　ＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧ　Ｃ ＡＡＡＧＧＧＴＡＴ　ＧＧＴＡＡＴＡＡＧＣＴＧＡＣＧＧＡＣＡＴ　２５０ＧＧ ＴＣＣＴＡＡＣＣＡＣＧＣＡＧＣＣＡＡ　ＧＴＣＣＴＡＡＧＴＣＡＡＣＡＧＡＴ ＣＴＴ　ＣＴＧＴＴＧＡＴＡＴ　３００ＧＧＡＴＧＣＡＧＴＴ　ＣＡＣＡＧＡＣ ＴＡＡ　ＡＴＧＴＣＧＧＴＣＧ　ＧＧＧＡＡＧＡＴＧＴ　ＡＴＴＣＴＴＣＴＣＡ 　３５０ＴＡＡＧＡＴＡＴＡＧ　ＴＣＧＧＡＣＣＴＣＴ　ＣＣＴＴＡＡＴＧＧＧ 　ＡＧＧＴＡＧＣＧＧＡ　ＴＧＡＡＴＧＧＡＴＧ　４００ＣＡＡＣＡＣＴＧＧＡ 　ＧＣＣＧＣＴＧＧＧＡ　ＡＣＴＡＡＴＴＴＧＴ　ＡＴＧＣＧＡＡＡＧＴ　ＡＴ ＡＴＴＧＡＴＴＡ　４５０ＧＴＴＴＴＧＧＡＧＴ　ＡＣＴＣＧＴＡＡＧＧ　ＴＡ ＧＣＣＡＡＡＴＧ　ＣＣＴＣＧＴＣＡＴＣＴＡＡＴＴＡＧＴＧＡ　５００ＣＧＣ ＧＣＡＴＧＡＡ　ＴＧＧＡＴＴＡ　５１７（２）　配列番号２の情報 （１）　配列の特徴。

（Ａ）　長さ・８２塩基 （Ｂ）　型　核酸 （Ｃ）　鎖の数・両形態 （Ｄ）　トポロジー　直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：ＤＮＡ （ｘｉ）　配列：配列番号２・ ＧＧＣＣＡＡＧＣＴＴ　ＣＴＴＴＡＣＧＡＴＧ　ＣＣＡＴＴＧＧＧＡＴ　ＡＴＡ ＴＣＡＡＣＣＧ　ＴＧＱＴＡＴＡＡＡＣ５０ＣＣＧＴＧＧＴＴＴＴ　ＴＡＡＡＡ ＧＴＴＡＴ　ＣＡＧＧＣＡＴＧＣＡ　ＣＣ８２（２）　配列番号３の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ：４７塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数二両形聾 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：　ＤＮＡ （ｘｉ）　配列：配列番号３ ＧＡＴＴＡＧＴＴＴＴ　ＧＧＡＧＴＡＣＴＣＧ　ＴＡＣＧＧＡＴＴＣＡ　ＣＧＧ ＣＣＧＴＣＧＴ　ＴＴＴＡＣＡＡ　４７（２）　配列番号４の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ：４３塩基 （Ｂ）　型・核酸 （Ｃ）　鎖の数８両形態 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：　ＤＮＡ （ｘｉ）　配列　配列番号４： ＧＧＣＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＡＴＴＴＣＣＡＴＴＣＡＧＧＣＴ　ＧＣＧＣＡ ＡＣＴＧＴ　ＴＧＧ　４３（２）　配列番号５の情報 （ｉ）　配列の特徴 （Ａ）　長さ二６２３塩基 （Ｂ）　型・核酸 （Ｃ）　鎖の数：両形態 （Ｄ）　トポロジー６直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：　ＤＮＡ （ｘｉ）　配列：配列番号５： ＧＧＧＡＧＡＣＣＧＧ　ＡＡＧＣＴＴＣＴＴＴ　ＡＣＧＡＴＧＣＣＡＴ　ＴＧＧ ＧＡＴＡＴＡＴ　ＣＡＡＣＧＧＴＧＧＴ　５０ＡＴＡＡＡＧＣＣＧＴ　ＧＧＴＴ ＴＴＴＡＡＡ　ＡＧＴＴＡＴＣＡＧＧ　ＣＡＴＧＣＡＣＣＴＧ　ＧＴＡＧＣＴＡ ＧＴＣ１００ＴＴＴＡＡＡＣＣＡＡ　ＴＡＧＡＴＴＧＣＡＴ　ＣＧＧＴＴＴＡＡ ＡＡ　ＧＧＣＡＡＧＡＣＣＧ　ＴＣＡＡＡＴｒＧＣＧ　１５０ＧＧＡＡＡＧＧＧ ＧＴ　ＣＡＡＣＡＧＣＣＧＴ　ＴＣＡＧＴＡＣＣＡＡ　ＧＴＣＴＣＡＧＧＧＧ　 ＡＡＡＣＴＴＴＧＡＧ　２００ＡＴＧＧＣＣＴＴＧＣＡＡＡＧＧＧＴＡＴＧ　Ｇ ＴＡＡＴＡＡＧＣＴ　ＧＡＣＧＧＡＣＡＴＧ　ＧＴＣＣＴＡＡＣＣＡ　２５０Ｃ ＧＣＡＧＣＣＡＡＧ　ＴＣＣＴＡＡＧＴＣＡ　ＡＣＡＧＡＴＣＴＴＣＴＧＴＴＧ ＡＴＡＴＧ　ＧＡＴＧＣＡＧＴＴＣ３００ＡＣＡＧＡＣＴＡＡＡ　ＴＧＴＣＧＧ ＴＣＧＧ　ＧＧＡＡＧＡＴＧＴＡ　ＴＴＣＴＴＣＴＣＡＴ　ＡＡＧＡＴＡＴＡＧ Ｔ　３５０ＣＧＧＡＣＣＴＣＴＣＣＴＴＡＡＴＧＧＧＡ　ＧＣＴＡＧＣＧＧＡＴ 　Ｇ＾＾ＧＴＧＡＴＧＣＡＡＣＡＣＴＧＧＡＧ　４００ＣＣＧＣＴＧＧＧＡＡ　 ＣＴＡＡＴＴＴＧＴＡ　ＴＧＣＧＡＡＡＧＴＡ　ＴＡＴＴＧＡＴＴＡＧ　ＴＴＴ ＴＧＧＡＧＴ＾　４５０ＣＴＣＧＴＡＣＧＧＡ　ＴＴＣＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧ ｎＴＴＡＣＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡ　ＣＴＧＧＧＡＡＡＡＣ５００ＣＣＴＧＧＣＧ ＴＴＡ　ＣＣＣＡＡＣＴＴ＾＾　ＴＣＧＣＣＴＴＧＣＡ　ＧＣＡＣＡＴＣＣＣＣ ＣＴＴＴＣＧＣＣＡＧ　５５０ＣＴＧＧＣＧＴ＾人Ｔ　ＡＧＣＧＡ＾ＧＡＧＧ　 ＣＣＣＧＣＡＣＣＧＡ　ＴＣＧＣＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣＡＧＴＴＧＣ６００ＧＣ ＡＧＣＣＴＧ入人　ＴＧＧＡＡＡＴＴＧＴ　ＡへＧ　６２３（２）　配列番号６ の情報 （１）　配列の特徴。

（Ａ）　長さ：　１０３８塩基対 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数９両形態 （Ｄ）　トボロノー：直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：ＤＮＡ （ｘｌ）　配列：配列番号６： ＧＴＣＧＡＣＣＴＴＴ　ＴＴ＾＾ＧＴＣＧＧＣＡＡＡＴＡＴＣＧＣＡ　ＴＧＴＴ ＴＧＴＴＣＧ　ＡＴＡＧＡＣＡＴＣＧ　ＡＧＴＧＧＣＴＴＣ`　６０ ＾ＡＡＧＴＴＡＴＣＡ　ＧＧＣＡＴＧＣＡＣＣＴＧＧＴＡＧＣＴＡＧ　ＴＣＴＴ ＴＡＡＡＣＣＡＡＴＡＧＡＴＴＧＣＡＴＣＧＧＴＴＴＡＡ　P２０ ＡＡＧＧＣ入＾ＧＡＣＣＧＴＣＡＡＡＴＴＧ　ＣＧＧＧＡＡＡＧＧＧ　ＧＴＣ八 ＾へＡＧＣＣＧＴＴＣＡＧＴＡＣＣＡＡＧＴＣＴＣＡＧＧ　P８０ ＧＧＡＡＡＣＴＴＴＧ　ＡＧＡＴＧＧＣＣＴＴ　ＧＣＡＡＡＧＧＧＴＡ　ＴＧＧ ＴＡＡＴＡＡＧ　ＣＴＧＡＣＧＧＡＣＡ　ＴＧＧＴＣＣＴＡ`Ｃ２４０ ＣＡＣＧＣＡＧＣＣＡ　ＡＧＴＣＣＴＡＡＧＴ　ＣＡＡＣＡＧＡＴＣＴ　ＴＣＴ ＧＴＴＧＡＴＡ　ＴＧＧＡＴＧＣＡＧＴ　ＴＣＡＣＡＧＡＣsＡ　３００ ＡＡＴＧＴＣＧＧＴＣＧＧＧＧＡＡＧＡＴＧ　ＴＡＴＴＣＴＴＣＴＣＡＴＡＡＧ ＡＴＡＴＡ　ＧＴＣＧＧＡＣＣＴＣＴＣＣＴＴＡＡＴＧＧ　R６０ ＧＡＧＣＴＡＧＣＧＧ　ＡＴＧＡＡＧＴＧＡＴ　ＧＣＡＡＣＡＣＴＧＧ　ＡＧＣ ＣＧＣＴＧＧＧ　ＡＡＣＴＡＡＴＴＴＧ　ＴＡＴＧＣＧＡＡ`Ｇ　４２０ ＴＡＴＡＴＴＧＡＴＴ　ＡＧＴＴＴＴＧＧＡＧ　ＴＡＣＴＣＧＴＣＴＣＧＡＴＧ ＡＴＧＴＴＧ　ＴＴＧＡＴＴＣＴＴＣＴＡＡＡＴＣＴＴＴＴ@４８０ ＧＴＧＡＴＴＧＡ＾＾　ＡＣＴＴＴＴＣＴＴＣＧＴＡＣＣＡＣＧＧＧ　ＡＣＴＡ ＡＡＣＣＴＧ　ＧＴＴＡＴＧＴＡＧＡ　ＴＴＣＣＡＴＴＣＡ`　５４０ ＡＡＡＧＧＴＡＴＡＣＡＡＡＡＧＣＣＡＡＡ　ＡＴＣＴＧＧＴＡＣＡ　ＣＡＡＧ ＧＡＡＡＴＴ　ＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡ　ＴＴＧＧＡＡＡＧＧf　６００ ＴＴＴＴＡＴＡＧＴＡ　ＣＣＧＡＣＡＡＴＡＡ　ＡＴＡＣＧＡＣＧＣＴ　ＧＣＧ ＧＧＡＴＡＣＴ　ＣＴＧＴＡＧＡＴＡＡ　ＴＧＡＡ＾＾ＣＣbＧ　６６０ ＣＴＣＴＣＴＧＧＡＡ　ＡＡＧＣＴＧＧＡＧＧ　ＣＧＴＧＧＴＣＡＡＡ　ＧＴＧ ＡＣＧＴＡＴＣＣＡＧＧＡＣＴＧＡＣＧＡＡＧＧＴＴＣＴＣV２０ ＧＣＡＣＴＡＡＡＡＧ　ＴＧＧＡＴＡＡＴＧＣＣＧＡＡＡＣＴＡＴＴ　＾＾ＧＡ ＡＡＧＡＧＴ　ＴＡＧＧＴＴＴＡＡＧ　ＴＣＴＣＡＣＴＧＡ`　７８０ ＣＣＧＴＴＧＡＴＧＧ　ＡＧＣＡＡＧＴＣＧＧ　ＡＡＣＧＧＡＡＧＡＧ　ＴＴｒ ＡＴＣＡＡＡＡ　ＧＧＴＴＣＧＧＴＧＡ　ＴＧＧＴＧＣＴＴbＧ　８４０ ＣＧＴＧＴＡＧＴＧＣＴＣＡＧＣＣＴＴＣＣＣＴＴＣＧＣＴＧＡＧ　ＧＧＧＡＧ ＴＴＣＴＡ　ＧＣＧＴＴＧＡＡＴＡ　ＴＡＴＴＡＡＴＡＡＣX００ ＴＧＧＧＡＡＣＡＧＧ　ＣＧＡＡＡＧＣＧＴＴ　ＡＡＧＣＧＴＡＧＡＡ　ＣＴＴ ＧＡＧＡＴＴＡ　ＡＴＴＴＴＧＡＡＡＣＣＣＧＴＧＧＡＡＡ`　９６０ ＣＧＴＧＧＣＣＡＡＧ　ＡＴＧＣＧＡＴＧＴＡ　ＴＧＡＧＴＡＴＡＴＧ　ＧＣＴ ＣＡＡＧＣＣＴ　ＧＴＩＩ：ＣＡＧＧＡＡＡ　ＴＣＧＴＧＴbＡＧＧ　１０２０ ＣＧＡＴＣＴＴＴＧＴ　ＧＡＣＴＣＧＡＧ　１０３８（２）　配列番号７の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ：１３４塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数４両形態 （Ｄ）　トポロジー　直鎖状 （１１）　配列の種類・ＤＮＡ （ｘｉ）　配列・配列番号７ ＧＴＴＴＡＧＴＴＧＴ　ＴＣＡＣＣＴＧＡＧＴ　ＣＧＴＧＴＧＴＴＴＴ　ＧＴＡ ＴＴＴＴＧＣＧ　ＴＣＴＴＡＧＴＧＴＧ　５０ＣＣＴＡＴＧＧＡＣＡ　ＡＡＴＣ ＴＧＧＡＴＣＴＣＣＣＡＡＴＧＣＴ　ＡＧＴＡＧＡＡＣＣＴ　ＣＣＣＧＧＣＧＴ ＣＧ　１００ＴＣＧＣＣＣＧＣＧＴ　ＡＧＡＧＧＴＴＣＴＣＧＧＴＣＣＧＣＴＴ ＣＴＧＧＴ　１３４（２）　配列番号８の情報 （ｉ）　配列の特徴 （Ａ）　長さ　１３４塩基 （Ｂ）　型　核酸 （Ｃ）　鎖の数１両形態 （Ｄ）　トポロジー　直鎖状 （１１）　配列の種類：ＤＮＡ （ｘｉ）　配列　配列番号８ ＧＴＴＴＡＧＴＴＧＴ　ＴＣＡＣＣＴＧＡＧＴ　ＣＧＴＧＴＴＴＴＣＴ　ＴＴＧ ＴＴＴＴＧＣＧ　ＴＣＴＣＡＧＴＧＴＧ　５０ＣＣＴＡＴＧＧＡＣＡ　ＡＡＴＣ ＴＧＧＡＴＣＴＣＣＣＡＡＴＧＣＴ　ＡＧＴＡＧＡＡＣＣＴ　ＣＣＣＧＧＣＧＴ ＣＧ　１００ＴＣＧＣＣＣＧＣＧＴ、へＧＡＧＧＴＴＣＴＣＧＧＴＣＣＧＣＴＴ ＣＴＧＧＴ１３４（２）　配列番号９の情報 （ｉ）　配列の特徴。

（Ａ）　長さ　１５２塩基 （Ｂ）　型　核酸 （Ｃン　鎖の数　両形態 （Ｄ）　トポロジー、直鎖状 （１１）　配列の種類：　ＤＮＡ （Ｘｉ）　配列：配列番号９： ＧＴＴＡＴＴＧＴＣＴ　ＡＣＴＧＡＣＴＡＴＡ　ＴＡＧＡＧＡＧＴＧＴ　ＴＴＧ ＴＧＣＴＧＴＧ　ＴＴＴＴＣＴＣＴＴＴ　５０ＴＧＴＧＴＣＧＴＡＧ　ＡＡＴＴ ＧＡＧＴＣＧ　ＡＧＴＣＡＴＧＧＡＣＡＡＡＴＣＴＧＡＡＴ　ＣＡＡＣＣＡＧＴ ＧＣ１００ＴＧＧＴＣＧＴＡＡＣＣＧＴＣＧＡＣＧＴＣＧＴＣＣＧＣＧＴＣＧ　 ＴＧＧＴＴＣＣＣＧＣＴＣＣＧＣＣＣＣＣＴ　１５０ＣＣ１５２ （２）　配列番号１０の情報 （１）　配列の特徴・ （Ａ）　長さ：１５２塩基 （Ｂ）　型　核酸 （Ｃ）　鎖の数・両形態 （Ｄ）　トポロン−三直鎖状 （１１）　配列の種類：　ＤＮＡ （ｘｌ）　配列・配列番号１０ ＧＴＴＡＴＴＧＴＣＴ　ＡＣＴＧＡＣＴＡＴＡ　ＴＡＧＡＧＡＧＴＧＴ　ＧＴＧ ＴＧＣＴＧＴＧ　ＴＴＴＴＣＴＣＴＴＴ　５０ＴＧＴＧＴＣＧＴＡＧ　ＡＡＴＴ ＧＡＧＴＣＧ　ＡＧＴＣＡＴＧＧＡＴ　ＡＡＡＴＣＴＧＡＡＴ　ＣＡＡＣＣＡＧ ＴＧＣ１００ＴＧＧＴＣＧＴＡＡＣＣ［ｌ、ＴＣＧＡＣＧＴＣＧＴＣＣＧＣＧＴ ＣＧ　ＴＧＧＴＴＣＣＣＧＣＴＣＣＧＣＣＴＣＣＴ　１．５０ＣＣ１５２ （２）　配列番号１１の情報 （１）　配列の特徴 （Ａ）　長さ＝１３１塩基 （Ｂ）　型・核酸 （Ｃ）　鎖の数：両形態 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：　ＤＮＡ （ｘｉ）　配列・配列番号１１・ ＡＧＡＧＡＧＴＧＴＧ　ＴＧＴＧＣＴＧＴＧＴ　ＴＴＴＣＴＣＴＴＴｒ　ＧＴＧ ＴＣＧＴＡＧＡ　ＡＴＴＧＡＧＴＣＧＡ　５０ＧＴＣＡＴＧＧＡＣＡ　ＡＡＴＣ ＴＧＡＡＴＣＡＡＣＣＡＧＴＧＣＴ　ＧＧＴＣＧＴＡＡＣＣＧＴＣＧＡＣＧＴＣ Ｇ　１００ＴＣＣＧＣＧＴＣＧＴ　ＧＧｎＣＣＣＧＣＴ　ＣＣＧＣＣＣＣＣＴＣ Ｃ１３１（２）　配列番号１２の情報 （１）　配列の特徴・ （Ａ）　長さ：１５４塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数二両形態 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：　ＤＮＡ （ｘｌ）　配列：配列番号１２゜ ＧＴＴＡＴＴＧＴＣＴ　ＡＣＴＧＡＴＴＧＴＡ　ＴＡＡＡＧＡＧＴＧＴ　ＧＴＧ ＴＧＴＧＣＴＧ　ＴＧＴＴＴＴＣＴＣＴ　５０ＴＴＴＡＣＧＴＣＧＴ　ＡＧＡＡ ＴＴＧＡＧＴ　ＣＧＡＧＴＣＡＴＧＧ　ＡＣＡＡＡＴＣＴＧＡ　ＡＴＣＡＡＣＣ ＡＧＴ　１００ＧＣＴＧＧＴＣＧＣＡ　ＡＣＣＧＴＣＧＡＣＧ　ＴＣＧＴＣＣＧ ＣＧＴ　ＣＧＴＧＧＴＴＣＣＣＧＣＴＣＣＧＣＣＣＣ１５０ＣＴＣＣ１５４ （２）　配列番号１３の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ：１５４塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数、両形態 （Ｄ）　トポロジー　直鎖状 （１１）　配列の種類：　ＤＮＡ （ｘｉ）　配列・配列番号１３： ＧＴＴＡＴＴＧＴＣＴ　ＡＣＴＧＡＣＴＡＴＡ　ＴＡＧＡＧＡＧＴＧＴ　ＧＴＧ ＴＧＴＧＣＴＧ　ＴＧＴＴＴＴＣＴＣＴ　５０ＴＴＴＧＴＧＴＣＧＴ　ＡＧＡＡ ＴＴＧＡＧＴ　ＣＧＡＧＴＣＡＴＧＧ　ＡＣＡＡＡＴＣＴＧＡ　ＡＴＣＡＡＣＣ ＡＧＴ　１００ＧＣＴＧＧＴＣＧＴＡ　ＡＣＣＧＴＣＧＡＣＧ　ＴＣＧｍＧＣＧ Ｔ　ＣＧＴＧＧＴＴＣＣＣＧＣＴＣＣＧＣＣＴＣ１５０ＣＴＣＣ１５４ （２）　配列番号１４の情報 （ｉ）　配列の特徴・ （Ａ）　長さ＝１３０塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数：両形態 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：　ＤＮＡ （Ｘｉ）　配列・配列番号１４・ ＧＡＧＴＧＴＧＴＡＴ　ＧＴＧＣＴＧＴＧＴＴ　ＴＴＣＴＣＴＴＴＴＧ　ＴＧＴ ＣＧＴＡＧＡＡ　ＴＴＧＡＧＴＣＧＡＧ　５０ＴＣＡＴＧＧＡＣＡＡ　ＡＴＣＴ ＧＡＡＴＣＡ　ＡＣＣＡＧＴＧＣＴＧ　ＧＴＣＧＴＡＡＣＣＧ　ＴＣＧＡＣＧＴ ＣＧＴ　１００ＣＣＧＣＧＴＣＧＴＧ　ＧＴＴＣＣＣＧＣＴＣＣＧＣＣＣＣＣＴ ＣＣ１３０（２）　配列番号１５の情報 （ｉ）　配列の特徴・ （Ａ）　長さ　１５２塩基 （Ｂ）　型、核酸 （Ｃ）　鎖の数−両形態 （Ｄ）　トポロジー、直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：ＤＮＡ （ｘｉ）　配列・配列番号１５ ＧＴＴＡＴＴＧＴＣＴ　ＡＣＴＧＡＣＴＡＴＡ　ＴＡＧＡＧＡＧＴＧＴ　ＧＴＧ ＴＧＣＴＧＴＧ　ＴＴＴＴＣＴＣＴＴＴ　５０ＴＧＴＧＴＣＧＴＡＧ　ＡＡＴＴ ＧＡＧＴＣＧ　ＡＧＴＣＡＴＧＧＡＣＡＡＡＴＣＴＧＡＡＴ　ＣＡＡＣＣＡＧＴ ＧＣ１００ＴＧＧＴＣＧＴＡＡＣＣＡＴＣＧＡＣＧＴＣＧＴＣＣＧＣＧＴＣＧ　 ＴＧＧＴＴＣＣＣＧＣＴＣＣＧＣＣＣＣＣＴ　１５０ＣＣ１５２ （２）　配列番号１６の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ＝７８塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数９両形態 （Ｄ）　トポロジー　直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類・ＤＮＡ （Ｘｉ）　配列　配列番号１６゜ ＧＧＡＧＧＧＧＧＣＧ　ＧＡＧＣＧＧＧＡＡＣＣＡＣＧＡＣＧＣＧＧ　ＡＣＧＡ ＣＧＴＣＧＡ　ＣＧＧＴＴＡＣＧＡＣ５０ＣＡＧＣＣＣＴＧＧＴ　ＡＧＡＴＴＣ ＡＧＡＴ　ＴＴＧＴＣＣＡＴ　７８（２）　配列番号１７の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ：４９塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数・両形態 （Ｄ）　トポロジー、直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：　ＤＮＡ （Ｘｉ）　配列：配列番号１７゜ ＴＴＴＧＣＧＴＣＴＴ　ＡＧＴＧＴＧＣＣＴＡ　ＴＧＧＡＣＡＡＡＴＣＴＧＧＡ ＴＣＴＣＣＣＡＡＴＧＣＴＡＧＴ　４９（２）　配列番号１８の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ：４９塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数二両形態 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：　ＤＮＡ （Ｘｌ）　配列：配列番号１８： ＴＴＴＧＣＧＴＣＴＣＡＧＴＧＴＧＣＣＴＡ　ＴＧＧＡＣＡＡＡＴＣＴＧＧＡＴ ＣＴＣＣＣＡＡＴＧＣＴ入ＧＴ　４９（２）　配列番号１９の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ：５６塩基 （Ｂ）　型、核酸 （Ｃ）　鎖の数：両形態 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：ＤＮＡ （ｘｉ）　配列：配列番号１９： ｍＧＴＧＴＣＧＴ　ＡＧＡＡＴＴＧＡＧＴ　ＣＧＡＧＴＣＡＴＧＧ　ＡＣＡＡＡ ＴＣＴＧＡ　ＡＴＣＡＡＣＣＡＧＴ　５０ＧＣＴＧＧＴ　５６ （２）　配列番号２０の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ・５６塩基 （Ｂ）　型・核酸 （Ｃ）　鎖の数：両形態 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：ＤＮＡ （ｘｉ）　配列：配列番号２０： ｍＧＴＧＴＣＧＴ　ＡＧＡＡＴＴＧＡＧＴ　ＣＧＡＧＴＣＡＴＧＧ　ＡＴＡＡＡ ＴＣＴＧＡ　ＡＴＣＡＡＣＣＡＧＴ　５０ＧＣＴＧＧＴ　５６ （２）　配列番号２１の情報 （ｉ）　配列の特徴・ （Ａ）　長さ　５６塩基 （Ｂ）　型、核酸 （Ｃ）　鎖の数：両形態 （Ｄ）　トポロジー　直鎖状 （１１）　配列の種類：核酸 （ｘｌ）　配列、配列番号２１゜ ＴＴＴＧＴＧＴＣＧＴ　ＡＧＡＡＴＴＧＡＧＴ　ＣＧＡＧＴＣＡＴＧＧ　ＡＣＡ ＡＡＴＣＴＧＡ　ＡＴＣＡＡＣＣＡＧＴ　５０ＧＣＴＧＧＴ　５６ （２）　配列番号２２の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ・５６塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数１両形態 （Ｄ）　トポロジー、直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：ＤＮＡ （ｘｉ）　配列：配列番号２２ ＴＴＴＡＣＧＴＣＧＴ　ＡＧＡＡＴＴＧＡＧＴ　ＣＧＡＧＴＣＡＴＧＧ　ＡＣＡ ＡＡＴＣＴＧＡ　ＡＴＣＡＡＣＣＡＧＴ　５０ＧＣＴＧＧＴ　５６ （２）　配列番号２３の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ：５６塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数ニー水路 （Ｄ）　トポロジー、直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：核酸 （ｘｉ）　配列：配列番号２３゜ ＴＴＴＧＴＧＴＣＧＴ　ＡＧＡＡＴＴＧＡＧＴ　ＣＧＡＧＴＣＡＴＧＧ　ＡＣＡ ＡＡＴＣＴＧＡ　ＡＴＣＡＡＣＣＡＧＴ　５０ＧＣＴＧＧＴ　５６ （２）　配列番号２４の情報 （ｉ）　配列の特徴。

（Ａ）　長さ：５６塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数、一本鎖 （Ｄ）　トポロジー　直鎖状 （１１）　配列の種類：核酸 （ｘｌ）　配列　配列番号２４ ＴＴＴＧＴＧＴＣＧＴ　ＡＧＡＡＴＴＧＡＧＴ　ＣＧＡＧＴＣＡＴＧＧ　ＡＣＡ ＡＡＴＣＴＧＡ　ＡＴＣＡＡＣＣＡＧＴ　５０ＧＣＴＧＧＴ　５６ （２）　配列番号２５の情報 （ｉ）　配列の特徴・ （Ａ）　長さ：５６塩基 （Ｂ）　型・核酸 （Ｃ）　鎖の数二両形聾 （Ｄ）　トポロジー　直鎖状 （１１）　配列の種類　ＤＮＡ （Ｘｌ）　配列・配列番号２５・ ＴＴＴＧＴＧＴＣＧＴ　ＡＧＡＡＴＴＧＡＧＴ　ＣＧＡＧＴＣＡＴＧＧ　ＡＣＡ ＡＡＴＣＴＧＡ　ＡＴＣＡＡＣＣＡＧＴ　５０ＧＣＴＧＧＴ　５６ （２）　配列番号２６の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ゛５９塩基 （Ｂ）　型、核酸 （Ｃ）　鎖の数ニー水路 （Ｄ）　トポロジー・直鎖状 （ｉ　ｉ）　配列の種類：核酸 （ｘｌ）　配列・配列番号２６゜ ＡＡＴＴｎＧＴＧＴ　ＣＧＴＡＧＡＡＴＴＧ　ＡＧＴＣＧＡＧＴＣＡ　ＴＧＧＡ ＣＡＡＡ、ＴＣＴＧＡＡＴＣＡＡＣＣ５０ＡＧＴＧＣＴＧＣＡ　５９ （２）　配列番号２７の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ：５１塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数、一本鎖 （Ｄ）　トポロジー、直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：核酸 （ｘｉ）　配列：配列番号２７： ＧＣＡＣＴＧＧＴＴＧ　ＡＴＴＣＡＧＡＴＴＴ　ＧＴＣＣＡＴＧＡＣＴ　ＣＧＡ ＣＴＣＡＡＴＴ　ＣＴＡＣＧＡＣＡＣＡ　５０Ａ　５１ （２）　配列番号２８の情報 （１）　配列の特徴： （Ａ）　長さ＝５９塩基 （Ｂ）　型、核酸 （Ｃ）　鎖の数ニー水路 （Ｄ）　トポロジー・直鎖状 （１１）　配列の種類・核酸 （ｘｉ）　配列：配列番号２８： ＡＡＴＴＴＴＧＴＧＴ　ＣＧＴＡＧＡＡＴＴＧ　ＡＧＴＣＧＡＧＴＣＡ　ＴＧＧ ＡＣＡＡＡＴＣＴＧＡＡＴＣＡＡＣＣ５０ＡＧＴＧＣＴＧＣＡ　５９ （２）　配列番号２９の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ＝２３塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）　トポロジー　直鎖状 （１１）　配列の種類：核酸 （ｘｌ）　配列：配列番号２９： ＡＧＣＡＴＴＧＧＴＡ　ＴＣＡＴＣＡＧＧＴＴ　ＴＧＴ　２３（２）　配列番号 ３０の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ＝２１塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （１１）　配列の種類８核酸 （ｘｉ）　配列：配列番号３０゜ ＧＴＴＧＡＴＧＡＴＧ　ＴＴＧＴＴＧＡＴＴＣＴ　２１（２）　配列番号３１の 情報 （１）　配列の特徴 （Ａ）　長さ：１０アミノ酸 （Ｂ）　型二アミノ酸 （Ｃ）　鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）　トポロジー　直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：ペプチド （ｘｉ）　配列　配列番号３１ ＭＥＴ　ＡＳＰ　ＬＹＳ　ＰＩＩＩＥ　ＡＳＰ　ＡＳＰ　ＶＡＬ　ＭＡＬ　ＡＳ Ｐ　ＳＥＲ（２）　配列番号３２の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ：３０塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）　トポロジー、直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：核酸 （ｘｉ）　配列：配列番号３２： ＡＴＧＧＡＣＡＡＡＴ　ＴＴＧＡＴＧＡＴＧＴ　ＴＧＴｒＧＡＴＴＣＴ　３０（ ２）　配列番号３３の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ：５９塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数、−重鎖 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：核酸 （ｘｌ）　配列：配列番号３３： ＡＡＴＴｒＴＧＴＧＴ　ＣＧＴＡＧＡＡＴＴＧ　ＡＧＴＣＧＡＧＴＣＡ　ＴＧＧ ＡＣＡＡＡＴＣＴＧＡＡＴＣＡＡＣＣ５０ＡＧＴＧＣＴＧＣＡ　５９ （２）　配列番号３４の情報 （１）　配列の特徴： （Ａ）　長さ二１７塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）　トボロノー、直鎖状 （１１）　配列の種類、核酸 （ｘｉ）　配列　配列番号３４ ＡＧＣＣＡＴＣＣＴＴ　ＧＧＴＴＣＡＧ　１７（２）　配列番号３５の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ：１５塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：核酸 （ｘｉ）　配列：配列番号３５： ＧＴＡＡＧＧＧＴＧＧ　ＡＴＧＴＴ　１５（２）　配列番号３６の情報 （１）　配列の特徴・ （Ａ）　長さ　１０アミノ酸 （Ｂ）　型・アミノ酸 （Ｄ）　トポロジー　直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類・ペプチド （Ｘｌ）　配列：配列番号３６ ＭＥＴ　ＡＳＰ　ＬＹＳ　ＳＥＲＧＬＵ　ＬＥＵ　ＡＲＧ　ＶＡＬ　ＡＳＰ　Ｍ ＡＬ５１Ｏ （２）　配列番号３７の情報 （ｉ）　配列の特徴・ （Ａ）　長さ：３０塩基 （Ｂ）　型、核酸 （Ｃ）　鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：核酸 （ｘｉ）　配列、配列番号３７゜ ＡＴＧＧＡＣＡＡＡＴ　ＣＴＧＡＡＴＴＡＡＧ　ＧＧＴＧＧＡＴＧＴＴ　３０（ ２）　配列番号３８の情報 （ｉ）　配列の特徴・ （Ａ）　長さ、７０塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類、核酸 （ｘｉ）　配列：配列番号３８・ ＴＣＴＣＧＡＴＧＡＴ　ＧＴＴＧＴＴＧＡＴＴ　ＣＴＴＣＴＡＡＡＴＣＴＴＴＴ ＧＴＧＡＴＧ　ＧＡＡＡＡＣＴＴＴＴ　５０ＣＴＴＣＧＴＡＣＣＡ　ＣＧＧＧＡ ＣＴＡＡＡ　７０（２）　配列番号３９の情報 （ｉ）　配列の特徴二 （Ａ）　長さ、１１アミノ酸 （Ｂ）　型二アミノ酸 （Ｄ）　トポロジー、直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：ペプチド （ｘｉ）　配列：配列番号３９： ＭＥＴ　ＧＬｔｌ　ＡＳＮ　ＰＩＥ　ＳＥＲＳＥＲＴＹＲ）ＩＩｓ　ＧＬＹ　Ｔ ＨＲＬＹＳ５１Ｏ （２）　配列番号４０の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さニア０塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数ニー水路 （Ｄ）　トポロジー・直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：核酸 （ｘｉ）　配列：配列番号４０： ＴＣＴＣＧＡＴＧＡＴ　ＧｎＧＴＴＧＡＴＴ　ＣＴＴＣＴＡＡＡＴＣＴＴＴＴＧ ＴＧＡＴＴ　ＧＡＡＡＡＣＴＴＴＴ　５０ＣＴＴＣＧＴＡＣＣＡ　ＣＧＧＧＡＣ ＴＡＡ＾　７０（２）　配列番号４１の情報 （ｉ）　配列の特徴・ （Ａ）　長さ＝７０塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数、−重鎖 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類・核酸 （ｘｉ）　配列、配列番号４１・ ＴＣＴＣＧＡＴＧＡＴ　ＧＴＴＧＴＴＧＡＴＴ　ＣＴＴＣＴＡＡＡＴＣＴＴＴＴ ＧＴＧＴＴＧ　ＧＡＡＡＡＣＴＴＴｒ　５０ＣＴＴＣＧＴＡＣＣＡ　ＣＧＧＧＡ ＣＴ＾＾Ａ　７０（２）　配列番号４２の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さニア８塩基 （Ｂ）　型・核酸 （Ｃ）　鎖の数ニー水路 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：核酸 （ｘｉ）　配列：配列番号４２： ＾ＴＧＡＡＧＣＴＴＣＴＣＧＡＴＧＡＴＧＴ　ＴＧＴＴＧＡＴＴＣＴ　ＴＣＴＡ ＡＡＴＣＴＴ　ＴＴＧＴＧＡＴＧＧＡ　５０Ａ＾＾ＣＴＴＴＴＣＴ　ＴＣＧＴＡ ＣＣＡＣＧ　ＧＧＡＣＴＡＡ＾　７８（２）　配列番号４３の情報 （１）　配列の特徴・ （Ａ）　長さ：２６アミノ酸 （Ｂ）　型、アミノ酸 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：ペプチド （ｘｉ）　配列：配列番号４３゜ ＭＥＴ　ＬＹＳ　ＬＥＵ　ＬＥＵ　ＡＳＰ　ＡＳＰ　ＶＡＬ　ＶＡＬ　ＡＳＰ　 ＳＥＲＳＥＲＬＹＳ　ＳＥＲＰＩＥ　ＶＡＬｌ　５　１０　１５ ＭＥＴ　ＧＬＵ　ＡＳＮ　ＰＩＥ　ＳＥＲＳＥＲＴＹＲＨＩＳ　ＧＬＹ　ＴＨＲ ＬＹＳ（２）　配列番号４４の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ＝４１塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数ニー水路 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類、核酸 （ｘｌ）　配列：配列番号４４： ＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡ　ＡＡＡＴＣＡＣＴＧＧ　ＡＴＡＴＡＣＣＡＣＣＧＴＴＧ ＡＴＡＴＡＴ　Ｃ４１（２）　配列番号４５の情報 （ｉ）　配列の特徴、 （Ａ）　長さ＝１７アミノ酸 （Ｂ）　型二アミノ酸 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）　配列の種類：ペプチド （ｘｉ）　配列・配列番号４５゜ ＭＥＴ　ＧＬＵ　ＬＹＳ　ＬＹＳ　ＩＬＥ　ＴＨＲＡＳＰ　ＳＥＲＬＥＵ　ＡＬ Ａ　ＭＡＬ　ＶＡＬ　ＬＥＤ　ＧＬＮ　ＡＲＧｌ　５　１０　１５ ＡＲＧ　ＡＳＰ （２）　配列番号４６の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ＝５１塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数ニー水路 （Ｄ）　トポロジー　直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類、核酸 （ｘｉ）　配列：配列番号４６゜ ＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡ　ＡＡＡＴＴＡＣＧＧＡ　ＴＴＣＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧ ＴＴＴＴＡＣＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡ　５０（２）　配列番号４７の情報 （ｉ）　配列の特徴。

（Ａ）　長さ＝４０塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数ニー水路 （Ｄ）　トポロジー・直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：核酸 （ｘｉ）　配列：配列番号４７： ＡＴＧＡＡＧＣＴＡＣＴＧＴＣＴｒＣＴＡＴ　ＣＧＡＡＣＡＡＧＣＡ　ＴＧＣＧ ＡＴＡＴＴＴ　４０（２）　配列番号４８の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ：２０アミノ酸 （Ｂ）　型二アミノ酸 （Ｄ）　トポロジー・直鎖状 （１１）　配列の種類、ベブチド （ｘｉ）　配列：配列番号４８： ＭＥＴ　ＬＹＳ　ＬＥＵ　ＬＥＵ　ＡＳＰ　ＡＳＰ　ＶＡＬ　ＶＡＬ　ＡＳＰ　 ＳＥＲＳＥＲＬＹＳ　ＳＥＲＰＲＥ　ＶＡＬｌ　５　１０　１５ ＮＥＴ　ＧＬＩ］　ＡＳＭ　ＰＨＥ　ＳＥＲ（２）　配列番号４９の情報 （ｉ）　配列の特徴・ （Ａ）　長さ二６ｏ塩基 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類、核酸 （ｘｉ）　配列：配列番号４９： ＾ＴＧＡＡＧＣＴＴＣＴＣＧＡＴＧＡＴＧＴ　ＴＧＴＴＧＡＴＴＣＴ　ＴＣＴＡ ＡＡＴＣＴＴ　ＴＴＧＴＧＡＴＧＧＡ　５０ＡＡＡＣＴＴＴＴＣＴ　６０ （２）　配列番号５０の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さニア２塩基対 （Ｂ）　型。核酸 （Ｃ）　鎖の数二両形態 （Ｄ）　トポロジー、直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：　ＤＮＡ （ｘｉ）　配列　配列番号５０： ＡＵＧＧＡＧＡＡＡＡ　ＡＡＡＵＣＡＣＵＧＧ　ＡＵＡＵＡＣＣＡＣＣＧＵＵＧ ＡＵＡＵＡＵ　ＣＣＣＡＡＵＧＧＣＡ　ＩＪＣＧＩＩＡＡ、`ＧＡＡ　６０ ＣＡＵＵＵＵＧＡＧＧ　Ｃ入　７２ （２）　配列番号５１の情報 （ｉ）　配列の特徴・ （Ａ）　長さ：４７９塩基対 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数二両形憶 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：　ＤＮＡ （ｘｉ）　配列：配列番号５１： ＡＡＧＣＵＵＣＵＵＵ　ＡＣＧＡＵＧＣＣＡＵ　ＵＧＧＧＡＵＡＵＡＵ　ＣＡＡ ＣＧＧＵＧＧＵ　ＡＵＡＡＡＧＣＣＧＵ　ＧＧＵＵＵＵＵＡ`Ａ　６０ ＡＧＵＵＡＵＣＡＧＧ　ＣＡＵＧＣＡＣＣＵＧ　ＧＵＡＧＣＵＡＧＵＣＵＵＵＡ ＡＡＣＣＡＡ　ＵＡＧＡＵＵＧＣＡＵ　ＣＧＧＵＵＵＡＡＡ`　１２０ ＧＧＣＡＡＧＡＣＣＧ　ＵＣＡＡＡＵＵＧＣＧ　ＧＧＡＡＡＧＧＧＧＵ　ＣＡＡ ＣＡＧＣＣＧＵ　ＵＣＡＧＵＡＣＣＡＡ　ＧＵＣＵＣＡＧＧfＧ　１８０ ＡＡＡＣＵＵＵＧＡＧ　ＡＵＧＧＣＣＵＵＧＣＡＡＡＧＧＧＵＡＵＧ　ＧＵＡＡ ＵＡＡＧＣＵ　ＧＡＣＧＧＡＣＡＵＧ　ＧＵＣＣＵＡＡＣＣ`　２４０ ＣＧＣＡＧＣＣＡＡＧ　ＵＣＣＵＡＡＧＵＣＡ　ＡＣＡＧＡＵＣＵＵＣＵＧＵＩ ＪＧＡ［ＩＡＵＧ　ＧＡＵＧＣＡＧＬＩＡＣＡＧＡＣＵＡＡ`ＵＧ　３００ ＵＣＧＧＵＣＧＧＧＧ＾＾ＧＡＵＧＵＡＵＵ　ＣＵＵＣＵＣＡＵＡＡ　ＣＡＵＡ ＵＡＧＵＣＧ　ＧＡＣＣＵＣＵＣＣＵ　ＵＡＡＵＧＧＧＡＧb３６０ ＵＡＧＣＧＧＡＵＧＡ　ＡＧＵＧＡＵＧＣＡＡ　ＣＡＣＵＧＧＡＧＣＣＧＣＵＧ ＧＧＡＡＣＵ　ＡＡＵＵＵＧＵＡＵＧ　ＣＧＡＡＡＧＵＡＵ`　４２０ ＵＵＧＡＵＵＡＧＵＵ　ＵＵＧＧＡＧＵＡＣＵ　ＣＧＵＡＣＧＧＡＵＵ　ＣＡＣ ＵＧＧＣＣＧＵ　ＣＣＵＧＵＵＡＣＡＡ　ＣＧＵＣＧＵＧＡb４７９ （２）　配列番号５２の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ：４７９塩基対 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数二両形態 （Ｄ）　トポロジー：直鎖状 （１１）　配列の種類：ＤＮＡ （ｘｉ）　配列・配列番号５２゜ ＡＡＧＣＵＵＣＵＵＵ　ＡＣＧＡＩｊＧＣＣＡＵ　ＵＧＧＧＡＵＡＵＡＵ　ＣＡ ＡＣＧＧＵＧＧＵ　ＡＵＡＡＡＧＣＣＧＵ　ＧＧＵＵｔｌＵtＡＡＡ　６０ ＾ＧＵＵＡＵＣＡＧＧ　ＣＡＵＧＣＡＣＣＵＧ　ＧＵＡＧＣＵＡＧＵＣＵＵＵＡ ＡＡＣＣＡＡ　ＵＡＧＡＵＵＧＣＡＵ　ＣＧＧＵＵＵＡＡＡ`　１２０ ＧＧＣＡＡＧＡＣＣＧ　ＵＣＡＡＡＵＵＧＣＧ　ＧＧＡＡＡＧＧＧＧＵ　ＣＡＡ ＣＡＧＣＣＧＵ　ＵＣＡＧＵＡＣＣＡＡ　ＧＵＣＵＣＡＧＧfＧ　１８０ ＡＡＡＣＵＵＵＧＡＧ　ＡＵＧＧＣＣＵＵＧＣＡＡＡＧＧＧｔｌＡＵＧ　ＧＵＡ ＡＵＡＡＧＣＵ　ＧＡＣＧＧＡＣＡＵＧ　ＧＵＣＣＵＡＡＣbＡ　２４０ ＣＧＣＡＧＣＣＡＡＧ　ＵＣＣＵＡＡＧＵＣＡ　ＡＣＡＧＡＵＣＵＵＣ［；ＧＵ ＵＧＡＵＡＵＧ　ＧＡＵＧＣＡＧＵＡＣＡＧＡＣＵＡＡＡＵf　３００ ＵＣＧＧＵＣＧＧＧＧ　ＡＡＧＡｔｌＧＵＡＵＵ　ＣＵＵＣＵＣＡＵＡＡ　ＣＡ ＵＡＵＡＧＵＣＧ　ＧＡＣＣＵＣＵＣＣＵ　ＵＡＡＵＧＧＧ`ＧＣ３６０ ＵＡＧＣＧＧＡＵＧＡ　ＡＧＵＧＡＵＧＣＡＡ　ＣＡＣＵＧＧＡＧＣＣＧＣＵＧ ＧＧＡＡＣＵ＾＾ＵＵＵＧＵＡＵＧ　ＣＧＡＡＡＧＵＡＵＡ@４２０ じＵＧＡＵＵ、〜ＧＵＵ　ＵＵＧＧＡＧＵＡＣＵ　ＣＧＵＡＣＧＧＡＵＵ　ＣＡ ＣＵＧＧＣＣＧＵ　ＣＣＵＧＵＵＡＣＡＡ　ＣＧＵＣＧＵＧ`Ｃ４７９ （２）　配列番号５３の情報 （１）　配列の特徴。

（Ａ）　長さ：４８０塩基対 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数　両形態 （Ｄ）　トポロジー・直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：　ＲＮＡ （ｘｉ）　配列：配列番号５３： ＡＡＧＣＵＵＣＵＵＵ　ＡＣＧＡＵＧＣＣＡＵ　ＵＧＧＧＡＵＡＵＡＵ　ＣＡＡ ＣＧＧＵＧＧＵ　ＡＵＡＡＡＧＣＣＧＵ　ＧＧＵＵＵＵＵＡ`Ａ　６０ ＡＧＵＵＡＵＣＡＧＧ　ＣＡＵＧＣＡＣＣＵＧ　ＧＵＡＧＣＵＡＧＵＣＵＵＵＡ ＡＡＣＣＡＡ　ＵＡＧＡＵＵＧＣＡＵ　ＣＧＧＵＵＵＡＡＡ`　１２０ ＧＧＣＡＡＧＡＣＣＧ　ＵＣＡＡＡＵＵＧＣＧ　ＧＧＡＡＡＧＧＧＧ［ｌ　ＣＡ ＡＣＡＧＣＣＧＵ　ＵＣＡＧＵＡＣＣＡＡ　ＧＵＣＵＣＡＧfＧＧ　１８０ ＡＡＡＣＵＵＵＧＡＧ　Ａｔ１ＧＧＣＣＵＵＧＣＡＡＡＧＧＧＵＡＵＧ　ＧＵＡ ＡＵＡＡＧＣＵ　ＧＡＣＧＧＡＣＡＵＧ　ＧＵＣＣＵＡＡＣbＡ　２４０ ＣＧＣＡＧＣＣＡＡＧ　ＵＣＣＵＡＡＧＵＣＡ　ＡＣＡＧＡＵＣＵＵＣＵＧＵＵ ＧＡＵＡＵＧ　ＧＡＵＧＣＡＧＵＡＣＡＧＡＣＬＩＡＡＡＵf　３００ ＵＣＧＧＵＣＧＧＧＡ　ＣＣＧＵＵＧＡＵＡＵ　ＡＵＧＧＵＵＣＡＵＡ　ＡＣＡ ＵＡＵＡＧＵＣＧＧＡＣＣＵＣＵＣＣＵＵＡＡＵＧＧＧＡＧ@３６０ ＣＵＡＧＣＧＧＡＵＧ　ＡＡＧＵＧＡＵＧＣＡ　ＡＣＡＣＵＧＧＡＧＣＣＧＣＵ ＧＧＧＡＡＣＵＡＡＵＵＵＧＵＡＵ　ＧＣＧＡＡＡＧＵＡＵ@４２０ ＡＵＵＧＡＵＵＡＧＵ　ＵＵＵＧＧＡＧＵＡＣＵＣＧＵＡＣＧＧＡＵ　ＬＩＣＡ ＣＵＧＧＣＣＧ　ＵＣＣＵＧＵＵＡＣＡ　ＡＣＧＵＣＧＵＧ`Ｃ４８０ （２）　配列番号５４の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ　４８７塩基対 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数：両形態 （Ｄ）　トポロジー・直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ （ｘｉ）　配列：配列番号５４： ＡＡＧＣＩＪＵＣＵＵＵ　ＡＣＧＡＵＧＣＣＡＵ　ＵＧＧＧＡＵＡＵＡＵ　ＣＡ ＡＣＧＧＵＧＧＵ　ＡＵＡＡＡＧＣＣＧＵ　ＧＧＵＵＵＵＵ`ＡＡ　６０ ＾ＧＵＩＩＡＵＣＡＧＧ　ＣＡＵＧＣＡＣＣＵＧ　ＧＵＡＧＣＵＡＧＵＣＵＵＵ ＡＡＡＣＣＡＡ　ＵＡＧＡＵＵＧＣＡＵ　ＣＧＧＵＵＵＡＡ`Ａ　１２０ ＧＧＣＡＡＧＡＣＣＧ　ＵＣＡＡＡＵＵＧＣＧ　ＧＧＡＡＡＧＧＧＧＵ　ＣＡＡ ＣＡＧＣＣＧＵ　ｔｌｃＡＧＵＡｃｃＡＡ　ＧＵＣＵＣＡＧfＧＧ　１８０ ＣＧＣＡＧＣＣＡＡＧ　ＵＣＣＬＩＡＡＧＵＣＡ　ＡＣＡＧＡＵＣＩＪＵＣＵＧ ＵＵＧＡＵＡＵＧ　ＧＡＵＧＣＡＧＵＡＣＡＧＡＣＵＡＡＡtＧ　３００ ＵＣＧＧＩｊＣＧＧＧＡ　ＣＣＧＵＵＧＡＵＡｔｌ　ＡＩＪＣＣＣＡＡＡＣＧ　 ＧＵＵＣＡＵＡＡＣＡ　ＵＡｔｌＡＧＵＣＧＧＡ　ＣＣＵＣtＣＣＩＪｔｌＡ　 ３６０ ＵＣＧＵＧＡＣ４８７ （２）　配列番号５５の情報 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ：１０４４塩基対 （Ｂ）　型、核酸 （Ｃ）　鎖の数二両形態 （Ｄ）　トボロノー：直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：ＤＮＡ （ｘｉ）　配列、配列番号５５： ＧＧＡＡＡＣＴＴＴＧ　ＡＧＡＴＧＧＣＣＴＴ　ＧＣＡＡＡＧＧＧＴＡ　ＴＧＧ ＴＡＡＴＡＡＧ　ＣＴＧＡＣＧＧＡＣＡ　ＴＧＧＴＣＣＴＡ`Ｃ２４０ ＣＡＣＧＣＡＧＣＣＡ　ＡＧＴＣＣＴＡＡＧＴ　Ｃ＾＾ＣＡＧＡＴＣＴ　ＴＣＴ ＧＴＴＧＡＴＡ　ＴＧＧＡＴＧＣＡＧＴ　ＴＣＡＣＡＧＡＣsＡ　３００ ＡＡＴＧＴＣＧＧＴＣＧＧＧＧＡＡＣＡＡＣＡＴＧＣＧＡＴＡＴＴ　ＧＴｒＣＴ ＣＡＴＡＡ　ＧＡＴＡＴＡＧＴＣＧ　ＧＡＣＣＴＣＴＣＣＴ@３６０ ＴＡＡＴＧＧＧＡＧＣＴＡＧＣＧＧＡＴＧＡ　ＡＧＴＧＡＴＧＣＡＡ　ＣＡＣＴ ＧＧＡＧＣＣＧＣＴＧＧＧＡＡＣＴ　ＡＡＴＴＴＧＴＡＴＧ@４２０ ＧＧＡＡＡＡＣＧＴＧ　ＧＣＣＡＡＧＡＴＧＣＧＡＴＧＴＡＴＧＡＧ　ＴＡＴＡ ＴＧＧＣＴＣＡＡＧＣＣＴＧＴＧＣＡＧＧＡＡＡＴＣＧＴ　P０２０ ＧＴＣＡＧＧＣＧＡＴ　ＣＴＴＴＧＴＧＡＣＴ　ＣＧＡＧ　１０４４（２）　配 列番号５６の情報 （１）　配列の特徴： （Ａ）　長さ：　１０４７塩基対 （Ｂ）　型・核酸 （Ｃ）　鎖の数・両形態 （Ｄ）　トポロジー・直鎖状 （ｉｉ）　配列の種類：　ＤＮＡ （ｘｉ）　配列、配列番号５６・ ＧＴＣ［１ｉＡＣＣＴＴＴ　ＴＴＡＡＧＴＣＧＧＣＡＡＡＴＡＴＣＧＣＡ　ＴＧ ＴＴＴＧＴＴＣＧ　ＡＴＡＧＡＣＡＴＣＧ　ＡＧＴＧＧＣＴsＣＡ　６０ ＡＡＡＧＴＴＡＴＣＡ　ＧＧＣＡＴＧＣＡＣＣＴＧＧＴＡＧＣＴＡＧ　ＴＣＴＴ ＴＡＡＡＣＣＡＡＴＡＧＡＴＴＧＣＡＴＣＧＧＴＴＴＡＡ　P２０ ＡＡＧＧＣＡＡＧＡＣｅＧＴｃＡＡＡＴＴＧ　ＣＧＧＧＡＡＡＧＧＧ　ＧＴＣＡ ＡＣＡＧＣＣＧＴＴＣＡＧＴＡＣＣＡＡＧＴＣＴＣＡＧＧ　P８０ ＧＧＡＡＡＣＴＴＴＧ　ＡＧＡＴＧＧＣＣＴＴ　ＧＣＡＡＡＧＧＧＴＡ　ＴＧＧ ＴＡＡＴＡＡＧ　ＣＴＧＡＣＧＧＡＣＡ　ＴＧＧＴＣＣＴＡ`Ｃ２４０ ＣＣＴｒＡＡＴＧＧＧ　ＡＧＣＴＡＧＣＧＧＡ　ＴＧＡＡＧＴＧＡＴＧ　ＣＡＡ ＣＡＣＴＧＧＡ　ＧＣＣＧＣＴＧＧＧＡ　ＡＣＴＡＡＴＴＴfＴ　４２０ ＡＴＧＣＧＡＡＡＧＴ　ＡＴＡＴＴＧＡＴＴＡ　ＧＴＴＴＴＧＧＡＧＴ　ＡＣＴ ＣＧＴＣＴＣＧ　ＡＴＧＡＴＧＴＴＧＴ　ＴＧＡＴＴＣＴＴbＴ　４８０ ＡＡＡＴＣＴＴＴＴＧ　ＴＧＡＴＴＧＡＡＡＡ　ＣＴＴＴＴＣＴＴＣＧ　ＴＡＣ ＣＡＣＧＧＧＡ　ＣＴＡＡＡＣＣＴＧＧ　ＴＴＡＴＧＴＡＧ`Ｔ　５４０ ＴＣＣＡＴＴＣＡＡＡ　ＡＡＧＧＴＡＴＡＣＡ　ＡＡＡＧＣＣＡＡ＾＾ＴＣＴＧ ＧＴＡＣＡＣＡＡＧＧＡＡＡＴＴＡ　ＴＧＡＣＧＡＴＧＡＴ@８００ Ｔ部＾ＡＡＧＧＧＴ　ＴＴＴＡＴＡＧＴＡＣＣＧＡＣＡＡＴＡＡＡ　ＴＡＣＧＡ ＣＧＣＴＧ　ＣＧＧＧＡＴＡＣＴＣＴＧＴＡＧＡＴＡＡＴ　U６０ ＧＡＡＡＡＣＣＣＧＣＴＣＴＣＴＧＧＡＡＡ　ＡＧＣＴＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＴ ＣＡＡＡＧ　ＴＧＡＣＧＴＡＴＣＣＡＧＧＡＣＴＧＡＣＧ　V２０ 、ＡＡＧＧＴＴＣＴＣＧ　ＣＡＣＴ＾＾＾＾ＧＴ　ＧＧＡＴＡＡＴＧＣＣＧＡＡ ＡＣＴＡＴＴＡ　ＡＧＡＡＡＧＡＧＴＴ　ＡＧＧＴＴＴＡＡfＴ　７８０ ＣＧＴＧＧＡＡＡＡＣＧＴＧＧＣＣＡＡＧＡ　ＴＧＣＧＡＴＧＴＡＴ　ＧＡＧＴ ＡＴＡＴＧＧ　ＣＴＣＡＡＧＣＣＴＧ　ＴＧＣＡＧＧＡＡＡs　１０２０ ＣＧＴＧＴＣＡＧＧＣＧＡＴＣｍＧＴＧ　ＡＣＴＣＧＡＧ　１０４７１．５′ス プライス部位のグアノシン介在の切断３．エクソンセグメントの連結 Ｃ）　―　− ＦＩＧ、　１３Ａ 皮＝「アンチセンス」に相補性 ＦＩＧ、　１３８ Ｒ２プローＲ２−１プローＲ２−２ ３°エクソン−−−１８０市 ＦＩＧ、　１５ Ｎ＝　リポザオム「アンチセンス」に相補性ＧＡＬ４−ＤＴ−Ａ ＦＩＧ、１８ 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　ｆａｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　７１０１ ９／１０　９３５９−４Ｂ ／／Ｃ０７Ｋ　７１０６　Ｚ　８３１８−４ＨＣＯ７Ｋ　９９：００ ８４１２−４Ｂ （７２）発明者　ハセロフ、ジェームズアメリカ合衆国マサチューセッツ０２１ ３９、ケンブリッジ、メイプル・アベニュー２６番（７２）発明者　ブランド、 アンドレアアメリカ合衆国マサチューセッツ０２１３９、ケンブリッジ、メイプ ル・アベニュー２６番Ｉ Ｃ１２Ｎ　５１００　Ｂ （７２）発明者　ペリモン、ノーバートアメリカ合衆国マサチューセッツ０２１ ４６、プルツクリン、リージェント・サークル７６番 （７２）発明者　グツドマン、ハワード・エムアメリカ合衆国マサチューセッツ ０２１５９、ニュートン、ザ・レッジズ・ロード１０番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．トランス−スプライシングリボザイムをコードしているポリヌクレオチド分 子であって、該リボザイムの配列が融合ＲＮＡであり、その融合ＲＮＡの配列が 、 （１）リボザイムを標的ＲＮＡにハイプリダイズするように標的化するに十分な 第１のＲＮＡ配列、および （２）該リボザイムのトランス−スプライシング活性の結果として標的ＲＮＡ中 に共直線的に転移させることができる第２のＲＮＡ配列、を含有し、該ポリヌク レオチド分子の発現が転写活性化因子タンパク質の発現に機能的に結合しており 、該第１のＲＮＡ配列が該転写活性化因子タンパク質をコードしているＲＮＡに ハイブリダイズする配列であるポリヌクレオチド分子。 ２．転写活性化因子がＧＡＬ４である請求項１に記載のポリヌクレオチド分子。 ３．第２のＲＮＡ配列が宿主細胞に毒性であるペプチドをコードしている配列を 含有する請求項１に記載のポリヌクレオチド分子。 ４．ペプチドがＤＴＡペプチドである請求項３に記載のポリヌクレオチド分子。 ５．ＤＴＡペプチドが突然変異ペプチド配列である請求項４に記載のポリヌクレ オチド分子。 ６．突然変異ペプチド配列が配列番号４０によってコードされているアミノ酸を 含有する請求項５に記載のポリヌクレオチド分子。 ７．突然変異ペプチド配列が配列番号４１によってコードされているアミノ酸を 含有する請求項５に記載のポリヌクレオチド分子。 ８．第１のＲＮＡ配列がＧＡＬ４ＲＮＡにハイプリダイズする配列であり、第２ のＲＮＡ配列がＤＴＡペプチドをコードしている配列である請求項１に記載のポ リヌクレオチド分子。 ９．分子がＲＮＡである請求項１〜８のいずれかに記載のポリヌクレオチド分子 。 １０．分子がＤＮＡである請求項１〜８のいずれかに記載のポリヌクレオチド分 子。 １１．宿主ゲノム中に安定に挿入することができるリボザイム発現カセットであ って、請求項１〜９のいずれかに記載のポリヌクレオチドの暗号配列に機能的に 結合した該宿主中で機能することができるプロモーター配列を含有するリボザイ ム発現カセットを含有するポリヌクレオチド分子。 １２．請求項１１のポリヌクレオチド分子を含有する宿主細胞。 １３．宿主細胞がウイルス細胞である請求項１２に記載の宿主細胞。 １４．宿主細胞が原核細胞である請求項１２に記載の宿主細胞。 １５．宿主細胞が真核細胞である請求項１２に記載の宿主細胞。 １６．真核細胞が植物細胞である請求項１５に記載の宿主細胞。 １７．真核細胞が動物細胞である請求項１５に記載の宿主細胞。 １８．動物がドロソフィラである請求項１７に記載の宿主細胞。 １９．動物が哺乳動物である請求項１７に記載の宿主細胞。 ２０．動物がヒトである請求項１９に記載の宿主細胞。 ２１．インビトロのトランス−スプライシングのための方法であって、以下の工 程からなる方法： （１）第２のポリヌクレオチドとハイプリダイズしうる配列を含有する請求項９ に記載のポリヌクレオチド分子をトランス−スプライシング反応混合物に供し； （２）該第２のポリヌクレオチドを該反応混合物に供し；そして（４）該条件の もとで該第２のポリヌクレオチドのトランス−スプライシングを触媒させる。 ２２．インビボのトランス−スプライシングのための方法であって、以下の工程 からなる方法： （１）請求項９に記載のポリヌクレオチドを宿主細胞に供し；（２）該分子によ ってコードされているリボザイムを該宿主細胞中で発現させ；（３）該リボザイ ムの基質を該宿主細胞中で発現させ；そして（４）該宿主細胞中で該基質と該リ ボザイムのトランス−スプライシングを触媒させる。 ２３．標的ＲＮＡの活性を不活性化するための方法であって、以下の工程からな る方法： （１）リボザイムが標的ＲＮＡに対して該標的ＲＮＡの機能の不活性化の結果を 与える触媒活性を保持するものである請求項９に記載のポリヌクレオチドをトラ ンスースプライシング反応混合物に供し；（２）該標的ＲＮＡを該混合物に供し ；そして（３）該ポリヌクレオチドに該触媒活性を発現させる条件を供する。 ２４．インビボで宿主細胞に所望の遺伝子配列を供するための方法であって、以 下の工程からなる方法： （１）宿主細胞中の標的ＲＮＡに対して触媒活性を保持するポリヌクレオチドで あって、リボザイムが所望の遺伝子配列をトランス−スプライスすることができ るものである請求項９に記載のポリヌクレオチドを該宿主細胞に供し；（２）該 宿主細胞において該標的ＲＮＡを供し；そして（３）該リボザイムが該所望の遺 伝子配列を該標的ＲＮＡの配列中にトランス−スプライスしうる条件を供する。 ２５．多細胞植物および動物における細胞除去のための方法であって、リボザイ ムが該宿主細胞に毒性であるペプチド配列をコードしており、そして該配列を該 宿主細胞中の標的にトランス−スプライスすることができるものである請求項９ に記載のポリヌクレオチドを受精胚宿主細胞に供することからなる方法。 ２６．植物において雄性または雌性不稔を工作するための方法であって、リボザ イムが、タンパク質として発現したときに該植物の受精能力に必要なＲＮＡであ って該タンパク質を発現する細胞の除去の結果を与えるＲＮＡを標的とするもの である請求項９に記載のポリヌクレオチドを該種の生殖細胞に供することからな る方法。 ２７．植物病原体に対して植物を免疫するための方法であって、該植物病原体に 対して免疫を与えうるトランス−スプライシング配列をコードしているポリヌク レオチドであって該病原体による該植物由来の細胞の感染が該細胞の除去の結果 を与える請求項９に記載のポリヌクレオチドで植物細胞を形質転換することから なる方法。 ２８．リボザイムがブローリボザイムである請求項１〜７のいずれかに記載のポ リヌクレオチド分子。 ２９．リボザイムがブローリボザイムである請求項８のいずれかに記載のポリヌ クレオチド分子。 ３０．リボザイムがブローリボザイムである請求項９のいずれかに記載のポリヌ クレオチド分子。 ３１．リボザイムがブローリボザイムである請求項１０のいずれかに記載のポリ ヌクレオチド分子。 ３２．リボザイムがブローリボザイムである請求項１１に記載のポリヌクレオチ ド分子。 ３３．リボザイムがブローリボザイムである請求項１２に記載の宿主細胞。 ３４．リボザイムがブローリボザイムである請求項２１に記載の方法。 ３５．リボザイムがブローリボザイムである請求項２２に記載の方法。 ３６．リボザイムがブローリボザイムである請求項２３に記載の方法。 ３７．リボザイムがブローリボザイムである請求項２４に記載の方法。 ３８．リボザイムがブローリボザイムである請求項２５に記載の方法。 ３９．リボザイムがブローリボザイムである請求項２６に記載の方法。 ４０．リボザイムがブローリボザイムである請求項２７に記載の方法。