JPH06507310A - 脆弱ｘ症候群に関与するｘ染色体領域の核酸フラグメント、脆弱ｘを伴う精神遅滞の診断方法およびヌクレオチドプローブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 脆弱Ｘ症候群に関与するＸ染色体領域の核酸フラグメント、脆弱Ｘを伴う精神遅 滞の診断方法およびヌクレオチドプローブ 脆弱Ｘ　（ｆｒａｇｉｌｅ　Ｘ　）を伴う精神遅滞症候群は、およそ１５００人 に１人の割合で男子がかかるＸ染色体に関連づけられた病気である。約７５０人 に１人の女性媒介者が、３０％の割合で軽度さらには中度の精神薄弱を出現させ る危険性をはらんでいる。脆弱Ｘを伴う精神遅滞症候群は、遺伝的な精神遅滞の 原因として最も頻度の高いものである。

この病気の診断は、細胞遺伝学的に検出可能な脆弱部位が有糸分裂の５〜５０％ にしか存在していないことから特殊な培養条件および５０〜１００の有糸分裂の 分析を必要とする、繊細な細胞遺伝学的分析によって下される。媒介者である女 性の診断は、これらの女性のうちのわずか５０〜６０％のみが、有糸分裂の一般 に低い割合で脆弱部位を発現するにすぎないことから、さらに一層難しいもので ある。

細胞遺伝学的試験は、その難しさのため、限られた数の研究所においてしか信頼 性の高い形で実践されていない；その上、病気の診断は、往々にして同一家族内 にその病気にかかった子供がもう１人生まれた後にしか行われない；ところで、 このような診断を早期に下すことは、ハイリスクファミリーにおけるその男児の ５０％に病気を伝達する媒介者である女性の追跡および出生前診断を可能にする 調査の実施にとって最も重要なことである。この病気の頻度が高いこと、そして 早期の遺伝学的重要性は、この病気の新生児期における系統立った追跡を正当化 している。

本発明は、まさに病気の迅速な診断を可能にし、多数の患者に適用できる、ＤＮ Ａの直接的研究に基づく調査および診断用の新たな手段を提供することを自損し ている。

脆弱Ｘを伴う精神遅滞症候群は、領域Ｘｑ２７．３の中に、葉酸の欠如またはデ オキシヌクレオチド合成の阻害剤によりインビトロで誘発される脆弱部位が存在 することによって特徴づけられる。領域Ｘｑ２７−ｑ２８の遺伝子地図により、 病気の遺伝子座が脆弱部位のレベルまたはそのそばに局在していることを確認す ることができた（Ｏｂｅｒｌｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　（１９８６伍）　；　５ｕｔｈｅｒｓ　ｅｔ　ａ ｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８９年）；　Ｒｏｕｓｓｅａｕ　ｅｔ　ａｌ、 。

Ｊ、　Ｈｕｍ、　Ｇｅｎｅｔ、（１９９１年）】。

また、この病気の遺伝的伝達は、Ｘ染色体に関連づけられるその他の病気に比べ て尋常でないものである。表現型は正常である男性がその娘たちに突然変異を伝 達し、これらの娘たちはこの病気の症状を稀にしか出現させないのに対し、これ らの女性の息子たちおよび娘たちは病気出現率が極めて高い、ということが確認 されている（Ｓｈｅｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｈｕｍ、　Ｇｅｎｅｔ、　（１ ９８５年）〕。この現象を説明すべく、いくつかの仮定が提案された。

本発明は、同様に、罹病していない人において、脆弱Ｘ部位レベルでの異常、特 に突然変異を検出するための手段をも提供している。

これらの非罹病者は、キャリヤまたは媒介者と呼ばれる。

先行技術において提案された遺伝マーカーは、細胞遺伝学研究により病気が既に 診断された家族における突然変異の伝達を追跡することにしか役立たない。つま りこれは、関連性研究による間接的な診断であるニ一般に、病気の遺伝子座の両 側で複数のマーカーを使用することが必要であり、これらのマーカーは、可変的 な割合の家族でしか情報を提供するものではない。

国際特許出願明細書Ｗ０９０１０５１９４号は、脆弱Ｘ部位からは離れているも のの、その制限長型性（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ） により遺伝子型マーカーが利用可能となるようなＩＡＩと呼ばれる新しい遺伝子 座について記載している。遺伝子座ＩＡＩを検出することができるプローブは、 Ｘ染色体の領域Ｘｑ２７．−ＤＸＳ５２のレベルでの選択的ハイブリダイゼーシ ョンにより、Ｘ染色体に関連づけられたい（つかの病気、特に脆弱Ｘ症候群の診 断を可能にする。

脆弱Ｘ遺伝子座近くのその他のプローブも、同様に、特に発明者らによって記載 されてきた。かくして、Ｆ、　Ｒｏｕｓｓｅａｕ　ｅｔ　ａｌ、　（Ａｍ。

Ｊ、　Ｈｕｍ、　Ｇｅｎｅｔ、（１９９１年）　４８　：１０ｇ−１１６］は、 脆弱Ｘ遺伝子座近くの７つの領域の検出を報告している（ＦＲＡＸＡ）。ＤＸＳ ３６９およびＤＸＳ２９６の間に含まれているこれらの領域のうちの２つは、今 日までに知られているＦＲＡＸＡに最も近い遺伝マーカーを含んでおり、これら の領域のうちの１つは冬型性を検出する２つのプローブを含んでいる。５ｔｓ７ ７（ＤＸ４６３）および２−３４（ＤＸＳ４７７）という呼称のこれらのプロー ブは、両方とも多型性ＴａｑＩ制限フラグメントを検出する；冬型性を同様に検 出し、Ｄｏ３３と呼ばれるもう１つのプローブ（ＤＸＳ４６５：ヘテロ接合度４ ２％）は、ハンター症候群（ＩＤＳ）の遺伝子座に対応する染色体の分割点に近 いＤＸＳ２９６と同じ領域内に位置決定されている；こわらのプローブの利用は 、前述の領域、すなわち、Ｃｅｎ−ＤＸＳ３６９−ＤＸＳ４７６−　（ＤＸＳ４ ６３．ＤＸＳ４７７）−（ＤＸＳ２９６．ＤＸＳ４６５）−ＩＤＳ−ＤＸＳ３０ ４−ｔｅｌの物理的配置および脆弱Ｘ遺伝子座との関係におけるその位置を決定 することを可能にした。

前述のプローブ、より特定的にはプローブＤｏ３３　（ＤＸＳ４６５）を用いた 脆弱Ｘ遺伝子座のパルスフィールド電気泳動による分析から、発明者らは、脆弱 Ｘおよび精神遅滞をもつ患者が、プローブＤｏ３３近くの制限部位、特に酵素ｌ 且旦ＨＩＩ、足且旦■、ｌ１ＩＩＩのための部位の消化の全面的または部分的な 阻害によって、正常な被験者または脆弱Ｘ突然変異を有するが病気の臨床的発現 のない被験者と区別される、ということを認識するに至った。

発明者は、プローブ５ｔ６７７とＤｏ３３の間に規定され、ヒトＸ染色体の領域 Ｘｑ２７−ｑ２８の中に位置する約２２５ｋｂのＤＮＡセグメントを、酵母の人 工染色体（ＹＡＣ）の形でクローニングした。このセグメントに由来するプロー ブが、脆弱Ｘ症候群に関与する遺伝子およびＤＮＡのメチル化、突然変異の分析 のために調製された。

これらのプローブは、特に白血球のＤＮＡを用いての、制限部位Ｂｓ５ＨＩＩ、 旦３ＪＬ　Ｉ　、ΣａｃＩＩ、そして一般的には、部位がメチル化シトシンを含 む場合に、対応する酵素によるその消化が阻害されるような制限部位の消化率に ついての研究を可能にした；これらの部位は、ＣｐＧ　（をもつ）部位と呼称さ れ、これは、例えば、比！Ａｎ　（ＣＣＧＧ）または比丘ａ　Ｉ　（ＧＣ（ｉＣ ）といったＣｐＧジヌクレオチドを含む部位、あるいは旦ａ　ｎ　Ｉ　（ＧＧＰ ｙＰｕＣＣ）またはＣＧＧ　（ＡもしくはＴ）　ＣＣまたはＧＧ　（Ａもしくは Ｔ）　ＣＧＧという配列の中のへ二互ＩＩ　［ＧＧ（ＡまたはＴ）ＣＧ３などの 、ＣｐＧジヌクレオチドを部分的におおうことができる部位である；発明者は、 病気の臨床的発現と、動原体の方向にプローブＤｏ３３から１００ｋｂのところ の発明者によりクローニングされたＤＮＡセグメント上に規定された位置１２５ ｋｂのまわりの約２０ｋｂの領域におけるＣｐＧ部位の消化率の阻害との間の驚 くべき相関関係を明らかにした。

これらのプローブは、同様に、ＤＮＡの伸長による上述のＸ染色体の領域の核酸 の突然変異の結果として得られる、病気の臨床的発現を伴わない脆弱Ｘ遺伝子座 の検出にも適している。

実際、伸長は、被験者が単に異常のキャリヤであるか、あるいはまた脆弱Ｘ異常 に関連づけられた精神遅滞の臨床的徴候を示しているかによって、多少の差があ り得る。本発明のプローブは、有利にも、約１００ｂｐ（塩基対）から約５００ ｂｐの核酸の伸長に対応する前突然変異（ｐｒｅｍｕｔａｔｉｏｎｓ）の検出、 および少なくとも約５００ｂｐであり３．０ＯＯｂｐ以上におよび得る核酸の伸 長に対応する完全突然変異の検６を可能にする。前突然変異が、一般に、臨床的 発現を伴わない異常のキャリヤである被験者に対応するのに対して、５００ｂｐ 以上のサイズの伸長による突然変異は、通常臨床的徴候の存在と関連づけられる 。

以下では、突然変異という用語は、上述の２つの状況を表すために使用され、臨 床的徴候に関連づけられたまたは関連づけられていない突然変異の間の区別は、 必要に応じて行われるものとする。

精神遅滞の臨床的発現を伴わない脆弱Ｘ領域の突然変異の研究の枠内において有 用なプローブは、例えば、ＣｐＧ部位に隣接すると言われるプローブである。

Ｆｉｇ、　（図）１は、動原体の方向にｋａプローブＤｏ３３から約１００ｋｂ のところにある位置１２５ｋｂのまわりのＸ染色体の領域の概略的表示である。

スケール上には、プローブ５ｔ６７７．２−３４およびＤ０３３の局在を表した 。スケールと対応させて、上述のＤＮＡセグメントに対応するクローンＹＡＣ１ ４１Ｈ５および２０９Ｇ４を表し、制限部位旦且１■、ｌ且亙■などの局在は、 クローン１４１Ｈ５のライン上に表した。クローン１４１Ｈ５のライン上の表示 ＣｐＧは、脆弱Ｘを伴う精神遅滞を患う患者において、メチル化が異常である領 域に対応している。

ＣｐＧ部位の消化率のこの阻害現象は、ＣｐＧ部位に近いかまたはこれらの部位 を含むプローブである、図１に規定された位置１２５ｋｂのまわりの２０ｋｂの 領域からのプローブを使用することによって、サザンプロット法によって検出さ れ得る。

発明者は、同様に、同じ方法によって、脆弱Ｘ突然変異キャリヤの被験者に特徴 的な異常である、メチル化現象と必ずしも関連していないＤＮＡフラグメントの 移動の異常を明らかにした。

これらの異常は、前記領域の特異的プローブとのハイブリダイゼーションの後、 酵素旦旦旦Ｒ１またはＨｉｎｄＩ［［によって消化されたＤＮＡにおいて特に検 出された。

脆弱Ｘ症候群の原因であり、子孫に伝達される可能性のある性細胞突然変異は５ プローブ５ｔ６７７とＤｏ３３の間に規定されたＸ染色体の領域内にあり、この 領域内のＣｐＧ部位のメチル化は、病気の臨床的発現に関連づけられる結果であ る、これらの突然変異の必然的でない結果である。必ずしも臨床的発現を伴って いないキャリヤ（媒介）被験者における脆弱Ｘ部位に相関される核酸フラグメン トの移動の異常は、特に脆弱Ｘ部位のまわりのゲノムＤＮＡフラグメントの伸長 の結果として生じる。この伸長は、例えば、付加的配列の挿入の結果であり得る 。この伸長は、ある種の場合においては、例えば図２に表されている旦且１■部 位の近（のフラグメント９Ｂ１２．５のレベルでの、脆弱Ｘ部位の付近に含まれ た短い配列の増幅（反復）の結果生じる可能性もある。

したがって、本発明は、位置１２５ｋｂのまわり１０〜２０ｋｂの領域内にあり 、ＣｐＧ部位に隣接するかまたはそれを含む、Ｘ染色体の領域Ｘｑ２７−ｑ２８ に由来する全ての核酸フラグメントを目的とする。

一般的に言って、本発明は、プローブ５ｔ６７７とＤｏ３３の間に規定された約 ２２５ｋｂのＤＮＡセグメント内に含まれる全ての核酸フラグメントに関する。

好ましくは、このような核酸フラグメントは少なくとも１５ｂｐまたはヌクレオ チドを含む。

本発明の核酸配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、さらにはｍＲＮＡの配列である。

本発明の核酸配列は、個別の配列であり、したがってその自然環境内にはない。

本発明の核酸配列に対応するｃＤＮＡは、本発明の核酸フラグメントを用いて、 利用可能なヒトｃＤＮＡバンクのスクリーニングによる従来の技術にしたがって 得ることができる。このスクリーニングによって、本発明の核酸フラグメントと 選択的にハイブリダイズするｃＤＮＡフラグメントを検出することが可能となる のである。

Ｘ染色体のこの領域は脆弱Ｘ症候群に関与し、この領域の特異的プローブは、病 気の臨床的発現に関連するメチル化の異常の存在を検出するため、または脆弱Ｘ 症候群の原因である突然変異およびその伝達の存在を検出するため、さらには脆 弱Ｘ症候群に関与する遺伝子（群）の発現を位置決定し、同定し、分析するため 、有利に利用される。これらのプローブは、一般に、脆弱Ｘ症候群に関連づけら れる突然変異の直接的または間接的結果であるＤＮＡの異常を検出するために利 用することができる。

したがって、本発明は、プローブ５ｔ６７７とＤｏ３３の間に規定されたＤＮＡ セグメント内に含まれた核酸フラグメント、より特定的には位置１２５ｋｂのま わり約２０ｋｂの領域内でＣｐＧ部位に隣接するかまたはそれを含む核酸フラグ メントと選択的にハイブリダイズすることができる全てのヌクレオチドプローブ に関する。

本発明のプローブは、適当な緊縮性（ストリンジエンシー）条件下で上述の核酸 フラグメントとハイブリダイズするが、同じハイブリダイゼーション条件下では ヒトゲノムのその他の領域とハイブリダイズしない。

このようなハイブリダイゼーションは、次のような段階を含んでいるニ ー　４０％のホルムアミド、０．９ＭのＮａＣｌ２；　２００ｕｇ／ｍｌのサケ 精子ＤＮＡ；５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６，５，４％の硫酸デキストラ ン、０．０８％（重量／体積）のフィコールおよびポリビニルピロリドンといっ た組成をもつ予備（ブレ）ハイブリダイゼーション溶液を用いて、４２℃の温度 で２時間、上述のプローブとハイブリダイズする可能性のあるテストすべきＤＮ Ａが上に固定されたニトロセルロースフィルターまたはナイロン膜といった支持 体を、予備ハイブリダイゼーション処理する段階； −有利な形で標識された本発明に基づ（少なくとも１つのヌクレオチドプローブ をさらに含む、予備ハイブリダイゼーション溶液と同じ溶液の中での、４２℃の 温度で１８時間のハイブリダイゼーション段階、 −連続した４回の洗浄段階、 −プローブの標識に適合させたあらゆる方法によって、場合により形成されるハ イブリッドを検出する段階。

上述のハイブリダイゼーション条件は、好ましい条件を構成するが、制限的な意 味は全（なく、本発明のプローブの対形成特性および上述のヌクレオチド配列に 影響を及ぼすことなく修正可能である。

本発明のプローブは、有利にも、従来利用されてきたあらゆる標識によって標識 される。これらのプローブは、ｓａｐ、３ＳＳ、１、ｓ　工、　３Ｈ１＋４Ｃと いった放射性トレーサーを用いて標識することができ、放射能標識づけは、当業 者にとって既知の何らかの方法にしたがって実施できる。

プローブは、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼの存在下で ｓｉｐによってアルファで標識された、ジデオキシヌクレオチドまたは単数もし くは複数のデオキシヌクレオチドもしくはりボヌクレオチドの付加によって３′ 標識されてもよいし、あるいは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下でガンマ位置で標 識された遊離ジデオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドの放射性リン 酸塩基のトランスファーにより５′標識されてもよい。さらに、「ニックトラン スレージ目ン」または「ランダムブライミング」または「ポリメラーゼ連鎖反応 」により、ＤＮＡポリメラーゼを用いることによってプローブを標識することも 可能である。

ハイブリダイゼーションの検出方法は、利用された放射性標識によって異なり、 オートラジオグラフへ液体シンチレーション、ガンマ計数、または放射性標識に よって出される放射線の輻射を検出することができるその健全ての技術に基づい ていてよい。

抗原のような免疫学的特性、リガンドのようなある種の試薬に対する特異的親和 力（アフィニティ）、蛍光または発光といった物理的特性、酵素または酵素基質 といった酵素反応の完了を可能にする特性を呈する基を、プローブに結びつける ことによって、非放射性標識を利用することも同様に可能である。非放射性標識 は、同様に、フォトビオチニル化またはスルホン化といったＤＮＡの化学的修飾 によって直接行うこともできる。

本発明のプローブは、脆弱Ｘ症候群の原因である突然変異、これらの突然変異の 存在の結果としての、またはこの症候群に関連づけられる、ＣｐＧ部位のメチル 化異常またはその他のＤＮＡ異常を、インビトロで検出するために利用される。

突然変異の検出は、家族内伝達を追跡調査することを目的としており、特に、媒 介者である女性または突然変異伝達者である正常な男性といった、病気を伝達す る可能性のある非罹病者の診断を可能にする。

メチル化異常の検出は、出生前または出生時点での診断の枠内で、臨床的に発現 されたか、臨床的に発現される可能性のある病気の診断を可能にする。

一般的に、脆弱Ｘ症候群の原因である突然変異ならびにＣｐＧ部位のメチル化異 常またはこの症候群に関連するＤＮＡの異常の検出方法は、突然変異またはメチ ル化異常またはその他すべてのＤＮＡの異常を含むか否かによってプローブによ り検出されるフラグメントが異なるように、少な（とも１つの適切な制限酵素お よび本発明に基づく少なくとも１つのプローブを利用することから成る。

このような方法は、以下の段階を含む「サザンプロットｊ法と呼ばれる方法にし たがって実施できる［Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｆｒ１ｔｓｈ　ａｎｄＭａｎｉａｔ ｉｓ　；　ｒ分子クローニング：実験室マニュアルＪ　（１９８９年）。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　 ］　ニー　一定の制限酵素によって認識されたその部位レベルでのＤＮＡの切断 に由来する制限フラグメントの獲得を可能にする条件下で、この少な（とも１つ の制限酵素により、白血球または絨毛膜絨毛またはその地金てのゲノムＤＮＡ供 給源などから抽出されたゲノムＤＮＡを処理する段階；−電気泳動によるフラグ メントの分離ニー−ハイブリダイゼーション複合体の形成を可能にする条件下で 、前述のフラグメントと特異的にハイブリダイズすることができる本発明に従っ た核酸プローブを接触させる段階；−ハイブリダイゼーション複合体の検出段階 ；−ハイブリダイゼーション複合体に組み込まれた制限フラグメントのサイズの 測定段階。

精神遅滞を患う患者における脆弱Ｘ症候群のインビトロ診断のためのメチル化異 常の研究は、有利に標識された、本発明に基づく少なくとも１つのプローブを用 いて、メチル化に対する感受性をもつ部位を有する制限酵素を少なくとも１つ利 用した前述の方法にしたがって、有利にも実施される。

上述の方法は、Ｂｓ５ＨＩＩ、旦旦ＩＩ、戊兄互■、ｌ且旦工などのメチル化に 対する感受性をもつ制限部位を有する唯一の酵素を用いて；あるいはメチル化に 対する感受性をもつ制限部位を有するものとメチル化に対し感受性をもたない制 限部位を有するものとの計２つの酵素を用いて、実施することができる。得られ たフラグメントとのハイブリダイゼーションのために利用される本発明のプロー ブは、有利には、メチル化に対し感受性をもつ部位を有する酵素のための部位に 隣接しているかあるいはそれを含んでいる。

サザンプロット法は、脆弱Ｘ症候群に関連づけられる突然変異または臨床的徴候 がない媒介者体内に存在する突然変異を検出するためにも使用される。これらの 突然変異は、例えば、ＤＮＡ配列の欠失または挿入、あるいはこれらの突然変異 の結果である配座（コンフォメーション）または複製の異常といったその他のＤ ＮＡの異常である。

精神遅滞を患うまたは患っていない患者における、脆弱Ｘ症候群、より一般的に は脆弱Ｘ部位の突然変異のインビトロ診断のためのこれらの突然変異の検圧は、 １旦ｏＲＩまたはＨｆｎｄＩＩＩといった、メチル化に対する感受性を必ずしも もたない適切なあらゆる制限酵素による消化にゲノムＤＮＡを付すことによって 、サザンプロット方法にしたがって実施される。制限フラグメントは、有利な形 で標識された本発明のプローブとのハイブリダイゼーションにより明らかにされ 、これらのフラグメントの電気泳動的に異常な移動は、病気の臨床的発現、また は病気の臨床的発現自体の不在下での突然変異自体の存在と相関される。

フラグメントのこの異常な移動は、ヌクレオチド配列の挿入突然変異により伸長 されたフラグメントの存在に相当する。

本発明は、同様に、前述の方法の利用のためのキットにも関する。

本発明の核酸フラグメントの中でも、２０〜３０ヌクレオチドのものが、位置１ ２５のまわり２０ｋｂの領域の核酸フラグメントの遺伝的増幅方法におけるプラ イマーとして、有利にも利用可能である。この増幅は、特にＤＮＡの伸長による この領域のレベルでの突然変異の存在を明らかにすること、または／およびＣｐ Ｇ部位を含むフラグメントを検出することを目的とすることができる。この増幅 方法は、増幅すべきフラグメントに隣接する本発明の２０〜３０ヌクレオチドの 核酸フラグメントを含むものの中から適切に選ばれた２つのオリゴヌクレオチド を、例えば白血球から抽出されたゲノムＤＮＡ上に、ハイブリダイゼーションに よって特異的に固定すること、次にＤＮＡポリメラーゼを用いた酵素的伸長（エ クステンション）プロセスとそれに続（変性プロセスを実施すること、そして行 われたサイクル数との関係において指数的割合で増幅すべきフラグメントの量を 増大するのに充分な回数だけ、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）サイクルの名で 知られているハイブリダイゼーション−伸長−変性サイクルを反復することから 成る。

上述の増幅方法は、前記突然変異の存在の結果であるＤＮＡの異常の検出に利用 され得る。

脆弱Ｘ症候群のインビトロ診断、特に精神遅滞のある患者または媒介者における それは、メチル化に対して感受性をもたないかまたは反対にメチル化に対する感 受性をもつ酵素の中から選ばれた少なくとも１つの制限酵素によって消化された ＤＮＡについてと、消化されていないＤＮＡについて、平行して行われる遺伝的 増幅によって、有利に実施される。診断を目的とする分析は、消化されていない ＤＮＡの増幅生成物を、選択された単数または複数の制限酵素により消化された ＤＮＡの増幅生成物と比較することによって行われる。この増幅生成物の分析は 、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル上での電気泳動の後に臭化エチジウ ムにより誘発された蛍光の視覚化によって、あるいは増幅されたフラグメントの 中に取り込まれたヌクレオチドまたはブライマーオリゴヌクレオチドのビオチン ーアビジン系などによる非放射性のまたは放射性の標識の検出によって、実施で きる。増幅サイクル数は、増幅の直線性、ひいては利用される単数または複数の 酵素の部位の消化率の量的見積りを保つような形で制限される。有利なことに、 １つのフラグメントは選択された酵素の部位を含まないことから、制限酵素の作 用の対照としておよび増幅の有効性の対照として、特にこのような選択された酵 素の部位を同様に含む同時に増幅されたゲノムのその他のフラグメントの内部標 識が利用される。

特に、伸長の結果生じる、突然変異に特徴的なフラグメントの量的測定、ならび に調査対象部位におけるゲノムＤＮＡのメチル化の量的測定は、前述の増幅方法 を適合させることによって、特に、Ｓｔｅｉｇｅｒｗａｌｄ　ｅｔ　ａｌ、　［ Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（１９８０年）　１８：１４３５−１４ ３９］により記述された「連結反応を媒介としたＰＣＲＪと呼ばれる方法である いわゆる「リンカ−」オリゴヌクレオチドとＤＮＡリガーゼを、本発明に従った オリゴヌクレオチドに加えて用いることによって、行うことができる。

特に、核酸の伸長による、脆弱Ｘ症候群を発生させる可能性のある突然変異を構 成する欠失またはその地金ての再配置は、位置１２５ｋｂのまわりの領域の複数 のフラグメントを増幅させ、これらのフラグメントのい（つかの消滅または変更 を検出するため、唯一の反応において混合できるオリゴヌクレオチド対を用いて 、いわゆる多重ＤＮＡ増幅方法によって、同様に検出され得る。−回限りの突然 変異の検出は、５ｓｃｐ　（一本紙配座多型性）またはＤＧＧＥ（変性勾配ゲル 電気泳動）方法、さらにはヘテロ二本鎖検出方法による分析を伴うＤＮＡセグメ ントの増幅によって、有利に実施される。

本発明は、同様に　前述の方法の利用のためのキットにも関する。このようなキ ットには、以下のものが含まれるニー　突然変異、特にＤＮＡの伸長および／ま たは本発明に従ったメチル化に対して感受性をもつ部位を含む核酸フラグメント の伸長による突然変異の結果生じた異常を呈する核酸フラグメントの増幅のため の、標識されたまたはされていないオリゴヌクレオチド； −対照核酸セグメントの増幅のための、標識されたまたはされていないオリゴヌ クレオチド； −いわゆる「リンカ−」オリゴヌクレオチド；−増幅に適した緩衝液、ヌクレオ チドおよび酵素。

本発明の実施のために特に有利な一群のプローブには、実験の部分にその詳細が 記載されているプローブが含まれる。これらのプローブは、図２に示されている プローブＤｏ３３と５ｔ６７７の間にあるＤＮＡとの関係において位置決定され たフラグメント９Ｂ１２．３（ここでは５ｔＢ１２．３と呼称される）、９Ｂ１ ２．５（ＳｔＢ１２．５）、９Ｂ１２．４．９Ｂ１２．２および９Ｂ１２．１を 含んでいる。その他のプローブは、約ｔ、５ｏｏｂｐのフラグメント５ｔＡ２２ 　（ＡｖａＩＩ−Ａｖａ旧、約３．８００ｂｐの５ｔＸ２１、およびｓ　ｔ　Ｘ 　２１　Ｅ　（ＥＬＬＩ部位の動原体）である。

有利なことに、プローブ９Ｂ１２．３は、核酸フラグメントの脆弱Ｘ部位のレベ ルでの異常、より特定的にはＤＮＡの伸長による突然変異を、制限酵素１旦ｏＲ Ｉでの消化段階後に検出するために利用できる。

制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩを利用することによっても類似の結果が得られる。

正常なフラグメントまたは突然変異を有するフラグメントを示す、プローブ９Ｂ １２．３によって検出された１旦ｏＲＩによる消化の結果生じる制限フラグメン トについて得られた結果の概略図が、図７に示されている。

プローブ９Ｂ１２．３　（Ｓｔ８１２．３）および９Ｂ１２．５（ｓｔＢ１２． ５）のヌクレオチド配列は、その相補的配列と共に図８に表わされている。

また、メチル化に対する感受性をもつ酵素（例えば旦！且工）およびメチル化に 対する感受性がない酵素（例えば旦立旦ＲＩ）による二重の消化を予め受けさせ たＤＮＡフラグメントの検出のために前述のプローブを利用することによって、 脆弱Ｘ部位レベルでの突然変異の存在およびメチル化状態を明らかにすることが できる。

本発明のプローブは、同様に、脆弱Ｘ症候群の臨床的発現に関与する単数または 複数の遺伝子がある領域へのアクセスをも可能にする。

実際、位置１２５ｋｂに近い領域内のＢｓ互ＨＩＩ、１旦ＩＩ、ΣａｃＩＩとい ったＣｐＧ部位の同定は、この領域（ＣｐＧ島）により発現が制御されている隣 接する遺伝子の存在を示す。これらの遺伝子に対応するプローブは、対応するメ ツセンジャーＲＮＡの検出、または治療目的での対応するタンパク質の発現ベク ターの構築、または同様に診断に使用できる特異的抗体の生産のために有効であ る。

当業者は、核酸フラグメントのうち、位置１２５ｋｂのまわりに存在するＣｐＧ 部位のメチル化を理由として間接的にまたは突然変異により直接的に不活性化さ れることができ、位置１２５ｋｂの両側でプローブ５ｔ６７７とＤｏ３３の間の 領域内に存在する遺伝子に対応する核酸フラグメントを、同定、ひいては選定す ることを可能にする手段を利用することができる。

この点において、本発明に基づくフラグメントは、ヒトの細胞内、例えば白血球 などに存在するｍＲＮＡと選択的にハイブリダイズすること、および図２Ａに表 わされている遺伝子地図上で位置１２５ｋｂでＣｐＧ島に隣接するか含まれてい る５′末端をもつ遺伝子に対応することを特徴とする。

本発明特有のもう１つのフラグメントは、Ｘ染色体の領域Ｘｑ２７−ｑ２８のプ ローブＤｏ３３から約１００ｋｂのところの位置１２５ｋｂとプローブＤ０３３ の間に規定されたＤＮＡ内に含まれていること、および、例えば白血球といった ヒト細胞内に存在するｍＲＮＡと選択的にハイブリダイズすることを特徴とする 。

この点で、本発明は、それが導入される可能性のある宿主細胞内での転写および ／または翻訳を可能にするあらゆる配列に関連する本発明の核酸フラグメントを 含むあらゆる組換え型ＤＮＡに関する。したがって、本発明は、同様に本発明の 核酸フラグメントのうちの１つを含むクローニングおよび発現用ベクターにも関 する。

組換え型ＤＮＡの導入は、宿主細胞内で複製されることができ、またそこで対応 するＲＮＡの転写および組換え型ＤＮＡ内に含まれた核酸フラグメントによりコ ードされるタンパク質の発現を可能にすることができるベクター、特にプラスミ ドタイプのベクターを用いて、有利に実施される。

上述の宿主細胞は、原核細胞、特にＥ、　ｃａｌｆ　（大腸菌）細胞であっても よいし、あるいは、より有利には、グリコジル化された成熟タンパク質を得るこ とができるようにする真核細胞（酵母、ＣＨＯ細胞、またはバキュロウィルスの 感染を受けた昆虫の細胞）であってもよい、これらのタンパク質は、脆弱Ｘ症候 群の診断および治療的利用分野において有効である特異的抗体の調製のために有 利に利用できる。

上述の特徴以外にも、本発明には、以下の説明中に現われ、本発明の利用例を参 考にし、図中に表わされているその他の特徴もある。ただし、これらの例は、本 発明の範囲に対する何らかの制限を構成し得るものではないということに留意さ れたい。

■、プローブ５ｔ６７７およびＤｏ３３の−プローブ５ｔ６７７およびＤ０３３ に対応するＤＮＡセグメントは、以下のオリゴヌクレオチドを利用して遺伝的増 幅によりヒトＤＮＡから得ることができるニ ー　５ｔ６７７については、 ５’ＡＣ丁ＣＣＴＴＣＡＣＡＡＡＴＣ丁ＴＣＣＧ３’および ５’　ＡＴＣＡＴＧＣＡＡＧＡＣＡＧＴＴＣＴＣＴＧＣ３’−Ｄｏ３３について は、 ５’　ＧＴＧＡＡＧＣＡＡＴＴＴＧＡＧＴＴＧＧＴＧＧＧＡＧ３’および −５’ＣＣＣＡＡＧＴＴＴＡＧＣＴＴＣＣＧＴＡＧＡＡＧＣＣ３′標準培地（環 境）における増幅条件は以下のとおりであるニー　ハイブリダイゼーション：６ ０℃で１分−伸長ニア２℃で８分 −変性：９４℃で１分 ■、　日のプローブの・ 本発明のプローブは、プローブ５ｔ６７７とＤ０３３の間に規定された約２２５ ｋｂの領域内に含まれているＤＮＡセグメントの消化に由来し、酵母人工染色体 （ＹＡＣ）の形でクローニングされ図１に表わされたヒトＸ染色体の領域Ｘｑ２ ７〜ｑ２８内に位置決定された本発明の核酸フラグメントのサブクローニングに よって得られた。

特に、このサブクローニングは、位置１２５ｋｂのまわり２０ｋｂの領域内にあ り、したがってＣｐＧ部位に隣接するかまたはこれを含む核酸フラグメントに特 異的に対応するフラグメントの特異的プローブを得ることを目的としている。

−例を挙げると、このようなプローブは、クローン１４１Ｈ５のＥＬＬＩ、ＬＩ ＬＬＩでの二重消化より調製されたフラグメントのサブクローニングにより得ら れる。得られたプローブ９Ｂ１２は、図１の地図上で位置１２５ｋｂに部位ＬＬ ＩＩを含む約７ｋｂのｌ１１ニー乱且ユＩフラグメントに相当する。

図２は、プローブ９Ｂ１２ならびにそのサブフラグメント９Ｂ１２．１．９Ｂ１ ２．２．９Ｂ１２．３．９Ｂ１２．４および９Ｂ１２．５の、図１とは逆に方向 づけされた地図の概略図である。この図には、以下の７本のラインが含まれてい る。

−ライン（１）は、プローブＤｏ３３から約１００〜１２５ｋｂのところにおい てプローブ５ｔ６７７とＤｏ３３の間で図１のクローニングされたセグメントの 地図上に規定されている位置１２５ｋｂが０として記載されている、ｋｂ単位の スケールである。

−ライン（２）は、プローブ９Ｂ１２＃よびそのサブフラグメント９Ｂ１２．１ ．９Ｂ１２．２．９Ｂ１２．３．９Ｂ１２．４Ｊよび９Ｂ１２．５を、スケール と符合させた状態で表している。

−ライン（３）は、ＢａｎＩ部位（ＧＧＰｙＰｕＣＣ）　、特にＲＦＬＰと記さ れた各型性ＢａｎＩ部位およびＭｅと記されたメチル化感受性且且二工部位の、 スケールと符合させた位置決定を表している。

−　ライン（４）は、Ｋ工旦工部位（ＧＡＡＮＮＮＮＴＴＣ）の、スケールと符 合させた位置決定を表している。

−ライン（５）は、且且ユ■部位（ＡＧＡＴＣＴ）の、ライン（１）のスケール と符合させた位置決定を表している。

−ライン（６）は、旦旦旦ＲＩ部位（ＧＡＡＴＴＣ）の、ライン（１）のスケー ルと符合させた位置決定を表している。

−ライン（７）は、Ｈｉｎｄｆ［１部位（ＡＡＧＣＴ）の、ライン（１）のスケ ールと符合させた位置決定を表している。

ｌ且二■、入エニエおよび旦立旦ＲＩ部位の地図は、脆弱Ｘ突然変異保有者にお ける変化したフラグメントに対応する。

■５サザンプロッドに′ったメチル　の　による　Ｘ１挫渥ＩΩ皿逝 精神遅滞を患う患者の白血球から抽出したゲノムＤＮＡを、酵素ΔΔａＩＩ、Ｂ ａｎＩ＊７’：はＸ工ｎＩにより切断する。得られたＤＮＡフラグメントを、Ｔ ＡＥ緩衝液中０．９％のアガロースゲル上での電気泳動により分析し、次にナイ ロン膜上に移す。

ＤＮＡフラグメントが上に固定された膜を、４０％のホルムアミド、０．９Ｍ（ ７）ＮａＣＡ、２００　ｕ　ｇ／ｍ１（７）サケ精子ＤＮＡ、５０ｍＭのリン酸 ナトリウム、ｐＨ６，５，４％の硫酸デキストラン、０．８％（重量／体積）の フィコールおよびポリビニルとロリドンといった組成をもつ溶液を用いて、４２ ℃で２時間、予備ハイブリダイゼーション処理に付す；次に予備ハイブリダイゼ ーション溶液を、この予備ハイブリダイゼーション溶液と同じものに比活性が２ ・１０”ｄｐｍ／　ｕｇ　テ［ａ−”Ｐｌ　ｄｃＴＰテ標識されたプローブ９Ｂ １２゜３をさらに含んでいるハイブリダイゼーション溶液と交換する；４２℃で １８時間インキュベートし、６５℃でｏ、５ｘｓｓｃ溶液を用いて連続的に洗浄 した後、−８０℃でオートラジオグラフィを行う。

正常な被験者において検圧されたΔΔａｌＩ、Ｂａｎ１または入二旦エフラグメ ントの全部または一部は、脆弱Ｘ症候群を発現する被験者においては、より大き いフラグメントによって置換されている。特に酵素ムエ旦工を用いた場合、互い にがなり近づいている複数のバンドの出現は、この症候群の表現型を発現してい る被験者にきわめて特徴的なものである。

臨床的および／または細胞遺伝学的発現に関連づけられる異常と、臨床的および ／または細胞遺伝学的発現を伴わない脆弱Ｘ突然変異キャリヤにおいて存在する 異常との間のこの区別は、以下のサザンプロット法によるこれらの異常の検出例 において、明らかにされる。

および　または　“・　に　づ番られるａ−酵素Ｂ　ａ　ｎ　Ｉ　（ＧＧＰｙＰ ｕＣＣ部位）による消化図３は、１旦ｎＩにより消化され、プローブ９Ｂ１２． ３によって検出された、正常な男性（１および５）、脆弱Ｘをもつ男性（３）、 媒介者である女性（４）および正常な女性の、白血球および絨毛膜絨毛のＤＮＡ の、０．９％のアガロースゲル上でのオートラジオグラフィ画像の概略図である 。

図４は、且且旦工により消化され、プローブ９Ｂ１２．３によって検出された、 正常な男性（２）、脆弱Ｘをもつ男性（３）、脆弱Ｘをもつ胎児の、絨毛膜絨毛 のＤＮＡの、０．９％のアガロースゲル上でのオートラジオグラフィ画像の概略 図である。

プローブ９Ｂ１２．３は、酵素乱且旦工による消化後の正常な男性のゲノムＤＮ Ａの中に、２．９ｋｂの唯一のフラグメント（対立遺伝子１）、または２．３ｋ ｂおよび０．６ｋｂの２つのフラグメント（対立遺伝子２）を検出する。２つの 対立遺伝子の存在は、図２上にＲＦＬＰと記された各型性ｌ且ｎ１部位の存在に よるものである。対立遺伝子１を保有し、脆弱Ｘを伴う精神遅滞を患う男性患者 においては、２．９ｋｂのフラグメントは、多少の差こそあれ完全に３．５ｋｂ のフラグメントによって置換されている。対立遺伝子２を保有する患者において は、０．６ｋｂのフラグメントは、多少の差こそあれ完全に１．２ｋｂのフラグ メントによって置換されている。脆弱Ｘを伴う精神遅滞の男性におけるこれらの 特異的な差は、図２上にＭｅと記されているＢａｎＩ部位のメチル化によるもの である。この部位は、シトシンのメチル化による阻害と相容性のあるＴＣＧＧＴ ＧＣＣＧＡという配列の中に含まれる。

異常は、白血球のＤＮＡに検出されたばかりではなく、脆弱Ｘ突然変異を保有す る胎児の絨毛膜絨毛のＤＮＡにも検出された。したがって、これは男性における 出生後または出生前の診断で利用可能である。

これに対して３．５ｋｂおよび１．２ｋｂのフラグメントは、正常な女性におい て検出され得る（不活性Ｘ染色体上の且且二工部位のメチル化）。しかしながら 、その強度は、脆弱Ｘ症候群の臨床的または細胞遺伝学的発現を伴う媒介者であ る女性において、さらに強いと思われる。

ｂ−その他の酵素及工旦１　（ＧＡＡ、ＮＮＮＮＴＴＣ部位）での消化図５は、 ＸｍユＩにより消化され、プローブ９Ｂ１２．３により検出された、正常な男性 （１および１０）、脆弱Ｘに関連した精神遅滞を伴う男性（３，４，６，９）、 媒介者である女性（５，７，８）および正常な女性（２）の、白血球のＤＮＡの ０．９％アガロースゲル上でのオートラジオグラフィ画像の概略図である。

プローブ９Ｂ１２．３は、男性と女性ならびに病気を臨床的または細胞遺伝学的 に発現していない脆弱Ｘ突然変異キャリヤにおいて、９ｋｂのフラグメントを検 出する。脆弱Ｘを伴う精神遅滞を患う男性においては、９ｋｂのフラグメントは 、その全部または一部が］、Ｏｋｂ以上の見かけのサイズのフラグメントによっ て置換されている。このようなフラグメントの出現は、同様に、臨床的および／ または細胞遺伝学的発現を伴う媒介者である女性に特徴的なことである。

■、ぢ−・および　または　゛　五“　半わない　ｌと突然亥　キャリヤにおい て　する　の栓 口６は、旦立旦ＲＩにより消化され、プローブ９Ｂ１２．３により検出された、 臨床的または細胞遺伝学的徴候を全て発現していない脆弱突然変異のキャリヤで ある女性（１〜８．１０および１１）と正常な女性（９，１２，１３）の、白血 球のＤＮＡの０．９％アガロースゲル上でのオートラジオグラフィ画像の概略図 である。

プローブ９Ｂ１２．３は、正常な男性または正常な女性において、約６ｋｂの旦 旦ｏＲＩフラグメントを検出する。一方、脆弱Ｘ突然変異の媒介者である女性に おいては、人によって可変的なサイズ（６〜７　ｋｂ）のさらに大きい付加的フ ラグメントが存在する。この異常は、臨床的および／または細胞遺伝学的発現を 伴わない媒介者である女性において現われ、したがって媒介者女性の診断のため に利用できる。罹患した男性においては、正常なフラグメントは、さらに大きい 見かけのサイズの１つのフラグメントまたは一連のフラグメントによって置換さ れる。非常に類似した結果が、酵素ＨｉｎｄＩＩｌの場合にも得られる。

図９は、旦立旦ＲＩでのＤＮＡ消化とプローブ５ｔ８１２．３を用いた脆弱Ｘ領 域レベルの突然変異の検出のもう１つの表示である。

図９：ＥｃｏＲＩによるゲノムＤＮＡの消化産物における脆弱Ｘ突然変異の検出 。白血球のＤＮＡを、１旦ｏＲＩによって完全に消化した。矢印は、正常なフラ グメントのサイズ（５，２ｋｂ）および突然変異を受けたいくつかのフラグメン トを示す。左側の△は、突然変異を受けたフラグメントのサイズの増大を表す。

被験者およびその家族内の関係を表す記号は、上に示されている。正方形および 丸形は、それぞれ男性と女性を表す。２つに割られていない空白の記号は、見か け上正常でしかも細胞遺伝学的にテストされなかった被験者を表す。２つに割ら れている記号については、右部分は脆弱Ｘ部位の配列を表し、左部分は精神遅滞 の程度を表す。２つに割られた白い記号は、いかなる脆性Ｘ症候群も伴わない正 常な被験者に一致し、斜線入りの記号は、わずかな精神遅滞と４％未満の細胞中 に脆弱Ｘ発現を有する被験者に対応し、黒い記号は、精神遅滞と４％以上の細胞 中に脆弱Ｘ発現を有する被験者に対応する。三角形の中に含まれている言己号は 、胎児から得られた試料に対応する０点線記号は、旦立旦Ｒ１による消化が行わ れ、その他の被験者の家族関係を明確化するための情報をもたらさない被験者を 示している。

レーン２２の試料は、旦立旦ＲＩによる消化産物において７．５ｋｂに弱いかげ を有していた。このかげは、右に示されている同じ試料の１ＬＪＬｎによる消化 の産物において、３ｋｂに１本のバンドとじてさらによく見える；これは、１２ ｋｂの長さの正常な旦ＪＬｊＬＩＩフラグメントのすぐ上に位置決定されている 。

■、メチル　むフラグメントの゛　・　に　る　Ｘ゛・の袷 精神遅滞を患う患者の白血球から抽畠されたゲノムＤＮＡを、Δヱ互■、且旦旦 工またはＸｍｎ　Ｉといったメチル化に対する感受性をもつ部位を有する酵素に よる消化に付し、増幅は、メチル化に対し感受性のある制限酵素により消化され たゲノムＤＮＡおよび消化を受けていないＤＮＡについて、平行して実施する。

メチル化に対する感受性をもつ酵素のための部位を含む増幅すべきゲノムＤＮＡ のフラグメントと隣接する２０〜３０ヌクレオチドの２つのオリゴヌクレオチド を、消化を受けたＤＮＡおよび消化を受けていないＤＮＡとハイブリダイズさせ る。次に、ＤＮＡポリメラーゼを用いた酵素による伸長プロセスと、その後に続 （変性プロセスを実施する；このハイブリダイゼーション−伸長−変性サイクル は、行なわれたサイクル数との関係において指数的な割合でＣｐＧ部位を含むフ ラグメントの量を増大させるのに充分な回数だけ反復する。

増幅サイクル数は、増幅の直線性、ひいてはメチル化に対する感受性をもつ酵素 部位の消化率の量的見積りを保つような形で、制限される。有利なことに、特に 男性においてメチル化されていないメチル化感受性酵素部位を含む同時に増幅さ れたゲノムのその他のフラグメントまたはこのような部位を含まないフラグメン トの内部標識が使用される。

増幅産物の分析は、アガロースゲルまたはポリアクリルアミド上での電気泳動の 後、臭化エチジウムにより誘発された蛍光の視覚化によって行われる。メチル化 感受性部位がメチル化された場合、２つの一反応において増幅されたフラグメン トが存在し、メチル化感受性部位がメチル化されない場合、消化を受けていない ＤＮＡを用いた反応のみに増幅されたフラグメントが存在する。

■、　Ｘｏ〜の　炊・・　の　ｔ　びにＥｃｏＲＩおよびＥａ　Ｉによる２　ｇ （たＤＮＡのメチル　の′脆弱Ｘ症候群を呈する家族を、旦旦旦ＲＩとＥＬＬＩ を用いたＤＮＡの二重消化により分析した。この方法は、突然変異の存在および メチル化の状態を同時に明らかにすることができた（ＣｐＧの豊富な制限部位が メチル化されている場合、旦ｕＩはＤＮＡを切断することができない）。結果を 図１０に示す、この二重消化のためには、５ｔＢ１２．３は、正常な全ての人の ＤＮＡと、活性Ｘ染色体に対応する２、８ｋｂの旦ｃｏＲＩ一旦ＡＪＬＩフラグ メントでハイブリダイズした（図１０、レーン２．４．５および１４）；女性に おいては、メチル化された不活性Ｘ染色体に対応する５、２ｋｂの補足的旦ｃｏ ＲＩフラグメントともハイブリダイズした（レーン１．７．１８および２７）、 脆弱Ｘ突然変異を示す男性には２．８ｋｂのフラグメントはなかったのに対して 、突然変異を保有する女性は正常なフラグメント（２，８ｋｂおよび５．２ｋｂ ）と同時に突然変異を受けたフラグメントも有していた。前突然変異は、男性に おいて２．９ｋｂから約３．３ｋｂの旦ｃｏＲＩ一旦旦ＩＩフラグメントの形で 検出され（レーン３）、女性の活性Ｘ染色体上で検出された（レーン８．２４． ２６およびそれに類似するもの）のに対して、５．３ｋｂ〜５．７ｋｂの旦ｃｏ ＲＩフラグメントは不活性Ｘ染色体上の前突然変異に対応していた。完全突然変 異に対応するフラグメントはＥＬＬＩによって消化されず、したがって５．７ｋ ｂより上に単純または不均一なバンドとして現われる（レーン１０．１２．１５ およびそれに類似のもの）、モザイク（前突然変異に対応し、可変的な割合で存 在する補足的バンド）のケースは、完全突然変異（メチル化されたもの）および メチル化されていない前突然変異（レーン２ｏおよび２１）の混合物の形で現わ れた。このことは、脆弱Ｘ症候群をもつ男性においてすでに認識された不完全な メチル化のケースの大部分について確認されている。い（人かの人は、６００〜 １，０ＯＯｂｐの間のサイズの増大を伴って、むしろ均質な、部分的にメチル化 されていないバンドを示していた。この図式は、「メチル化モザイク」として記 述された。

図１１、旦旦旦Ｒ１と１旦ＩＩによって消化されたＤＮＡについてのメチル化図 式および脆弱Ｘ突然変異の検出を表している：白血球のＤＮＡは、酵素旦旦ｏＲ Ｉおよび旦ＡＪ、Ｉで完全に同時に消化された。サイズは、突然変異を受けたフ ラグメントのい（つかについて、および活性および不活性のＸ染色体上の正常な フラグメントについて（それぞれ２．８および５．２ｋｂ）　、左側に表されて いる。△は、突然変異を受けたフラグメントのサイズの増大に対応する。ハイブ リダイゼーション図式は、右側に示されている。線「／」は、死亡した家族の一 員を表す、その他の記号については、図９を参照されたい、レーン６および１６ についての結果はわずかである。対照プローブに対するこれらの試料のハイブリ ダイゼーションは、これらのレーンが他と同じＤＮＡを含んでおり、移動の人為 的変更を呈していないことを示した。

ト　−ぼやけたバンド（患者または病気を伝達する可能性のある人において） ＊　−異常サイズ 、＊ｈ　や３，５ｋｂ −麹−嘴−２，９ｋｂ 、　−ｅ−３，５ｋｂ 、　禰−２，９ｋｂ ＦＩＧＵＲＥ　４ ＦＩＧＵＲＥ　５ ＦＩＧＵＲＥ６ す 罷 ＜　ｔｉ！ｔ！！　観 Ｆ工ＧＵＲＥ　８ ｙＩＧＵＲＥ　８　（ＩＩ　ｍ　＋ ｎの１五８（続き） ｋ 円 絋 挑 国際調査報告 −一−−＾−−ｍｗ−ｐｃｉｌＦＲ９２１００１４５国際調査報告 フロントページの続き （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ３，ＦＩ、　ＨＵ、ＪＰ。

ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　Ｎｏ、　ＰＬ、　ＲＯ，ＲＵ 、ＳＤ、　ＵＳ （７２）発明者　オベール、イザベル フランス国　６７４５０　ランペルティム　リュ・ドウ　ラ　スーフル　５ （７２）発明者　ヴアンサン、アンヌ フランス国　６９１６０　タラサン・う・ドミ・リュン　シュマン・ド・う・ポ ム トビー （７２）発明者　ハイツ、ドミニク フランス国、６７０００　サベルヌ、リュ・ドウ・う・ガレンヌ　４６ （７２）発明者　ハイデステファン フランス国　６７４５０　ランペルティム　リュ・ドウ・う・スーフル　５

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｘ染色体の領域Ｘｑ２７−ｑ２８に由来する核酸フラグメントであって、プ ローブＳｔ６７７とＤｏ３３の間に規定された約２２５ｋｂのＤＮＡセグメント 内に含まれていることおよび少なくとも１５ｂｐまたはヌクレオチドを含んでい ることを特徴とする核酸フラグメント。
2. ２．図２Ａの遺伝子地図との関係において規定された位置１２５ｋｂのまわりの ２０ｋｂの領域内に位置づけされ、ＣｐＧをもつ部位に隣接しているかまたはＣ ｐＧをもつ部位を含む（ＥａｇＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＳａｃＩＩ）ことを特徴とす る、請求の範囲第１項に記載の核酸フラグメント。
3. ３．請求の範囲第１項または第２項の核酸フラグメントと選択的にハイブリダイ ズすること、およびＤＮＡまたはＲＮＡであることを特徴とする核酸フラグメン ト。
4. ４．例えば白血球といったヒト細胞内に存在するｍＲＮＡと選択的にハイブリダ イズすること、および図２Ａに示されている遺伝子地図上で１２５ｋｂの位置に おいてＣｐＧ島に隣接するか含まれている５′末端を有する遺伝子に対応するこ とを特徴とする、請求の範囲第１項または第２項に記載の核酸フラグメント。
5. ５．請求の範囲第４項に記載のＤＮＡに対応するｃＤＮＡであることを特徴とす る核酸フラグメント。
6. ６．脆弱Ｘ症候群の原因である突然変異またはこれらの突然変異の存在の結果と してのその他の異常をインビトロで検出するため、あるいは脆弱Ｘ症候群に関与 する単数または複数の遺伝子を位置決定するためのヌクレオチドプローブであっ て、請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項に記載の核酸フラグメントと選択 的にハイブリダイズすることができることを特徴とするヌクレオチドプローブ。
7. ７．請求の範囲第５項に記載のヌクレオチドプローブであって、−約７，０００ ｂｐの９Ｂ１２（ＥａｇＩ−ＢｇｌＩ）、約１，２００ｂｐの９Ｂ１２．３（Ｐ ｓｔＩ−ＰｓｔＩ）、約１，０００ｂｐの（ＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ）、約９００ｂ ｐの９Ｂ１２．５（ＥａｇＩ−ＰｓｔＩ）、約１，８００ｂｐの９Ｂ１２．２（ ＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ）、約１，５００ｂｐのｓｔＡ２２（ＡｖａＩＩ−ＡｖａＩ Ｉ）、約３，８００ｂｐのｓｔＸ２１およびｓｔＸ２１Ｅ（ＥａｇＩ工部位の動 原体）の各フラグメント； −上述のフラグメントのうちの１つと選択的にハイブリダイズするフラグメント 、 の中から選ばれることを特徴とするヌクレオチドプローブ。
8. ８．図８に示されている鎖のヌクレオチド１と１０７８の間に含まれているフラ グメント９Ｂ１２．３または請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に記載の 核酸フラグメントと選択的にハイブリダイズするこのフラグメントの全ての部分 に対応することを特徴とする、請求の範囲第５項または第６項のいずれか１項に 記載のヌクレオチドプローブ。
9. ９．図８に示されている鎖のヌクレオチド１０７９と１９８５の間に含まれてい るフラグメント９Ｂ１２．５または請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に 記載の核酸フラグメントと選択的にハイブリダイズするこのフラグメントの全て の部分に対応することを特徴とする、請求の範囲第５項または第６項に記載のヌ クレオチドプローブ。
10. １０．放射能を用いて標識されているか、あるいは放射能以外の標識、特に酵素 標識、リガンド、発光性または蛍光標識によって標識されていることを特徴とす る、請求の範囲第５項〜第８項のいずれか１項に記載のヌクレオチドプローブ。
11. １１．請求の範囲第６項〜第１０項のいずれか１項に記載のプローブとハイブリ ダイズすることを特徴とする、特にヒト白血球に由来するｍＲＮＡフラグメント 。
12. １２．臨床的徴候を呈していない人の体内に存在するかまたは脆弱Ｘ症候群と関 連のある突然変異あるいはこれらの突然変異の存在の結果としてのＤＮＡのその 他の異常をインビトロで検出する方法であって、 −ＥａｇＩといったメチル化感受性部位またはＥｏｏＲＩもしくはＨｉｎｄＩＩ Ｉといったメチル化非感受性部位をもつ少なくとも１つの制限酵素を用いたゲノ ムＤＮＡ試料の処理；−電気泳動によるフラグメントの分離、および請求の範囲 第５項〜第１０項のいずれか１項に記載の少なくとも１つのプローブとのそのハ イブリダイゼーション；−形成されたハイブリッドの視覚化、および脆弱Ｘ部位 に突然変異をもたない正常な被験者において採取された生物学的試料を用いた同 じ条件下での処理により得られた対照フラグメントの長さよりも長いフラグメン トの検出、といった段階を含むことを特徴とする方法。
13. １３．脆弱Ｘ症候群のインビトロ診断のための請求の範囲第１２項に記載のＤＮ Ａの異常の検出方法であって、−メチル化感受性部位をもつ少なくとも１つの制 限酵素によるゲノムＤＮＡの処理； −電気泳動によるフラグメントの分離、および請求の範囲第５項〜第１０項のい ずれか１項に記載の少なくとも１つのプローブとのそのハイブリダイゼーシヨン ； −形成されたハイブリッドの視覚化、および対照フラグメントについて同一条件 下で得られた結果との比較；といった段階を含むことを特徴とする方法。
14. １４．ゲノムＤＮＡの消化を、ＥａｇＩといったメチル化感受性部位をもつ制限 酵素およびＥｃｏＲＩもしくはＨｉｎｄＩＩＩといったメチル化非感受性部位を もつ制限酵素により実施することを特徴とする、精神遅滞の臨床的発現を伴わな いキャリヤ患者における突然変異の存在または脆弱Ｘ症候群のインビトロ診断の ための、請求の範囲第１３項に記載の方法。
15. １５．脆弱Ｘ部位についての突然変異または場合によってはこれらの突然変異の 結果としてのその他の異常を含む核酸フラグメントの遺伝子増幅方法であって、 請求の範囲第１項または第２項に記載の核酸フラグメントと選択的にハイブリダ イズする２０〜３０ヌクレオチドの核酸フラグメントの中から選ばれた、前記フ ラグメントにブランキングする標識された２つのオリゴヌクレオチドをゲノムＤ ＮＡ上にハイブリダイゼーションによって固定すること、次にＤＮＡポリメラー ゼを用いた酵素による伸長プロセスおよびそれに続く変性プロセスを利用するこ と、および増幅されたフラグメントの視覚化を可能にする条件下で、実行された サイクル数との関係において指数的割合でフラグメントの量を増大させるのに充 分な回数だけハイブリダイゼーション−伸長−変性サイクルを反復すること、か ら成ることを特徴とする方法。
16. １６．一方ではメチル化感受性部位をもつ酵素により消化されたＤＮＡについて 、他方ではこの酵素による消化を受けていないＤＮＡについて、請求の範囲第１ ５項に記載の遺伝子増幅方法を平行して行うこと、次に、プライマーオリゴヌク レオチドの標識のおかげで検出されたかまたは臭化エチジウムで視覚化された状 態で得られたフラグメントを比較することを特徴とする、脆弱Ｘ症候群のインビ トロ診断方法。
17. １７．位置１２５ｋｂのまわりの２０ｋｂの領域、特にＣｐＧ島近くの部位を含 む領域の単数または複数の核酸フラグメントについて、請求の範囲第１５項また は第１６項に記載の遺伝子増幅を行うこと、およびこれらのフラグメントのいく つかの消滅または変化を検出すること、特に、脆弱Ｘ突然変異を有さない正常な 試料を用いて同じ処理条件下で得られたフラグメントのサイズに比べて長いフラ グメントを検出することを特徴とする、脆弱Ｘ症候群に関連のある突然変異の検 出方法。
18. １８．請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項に記載の核酸フラグメントを少 なくとも１つ含む組換え型ＤＮＡであって、場合によっては、それが中に導入さ れる可能性のある選ばれた宿主細胞の中での転写および／または翻訳を可能にす る配列に関連づけられている組換え型ＤＮＡ。
19. １９．請求の範囲第１８項に記載の組換え型ＤＮＡを含むことを特徴とする、ク ローニングおよび発現ベクター。
20. ２０．請求の範囲第１９項に記載の組換え型ベクターによって形質転換されてい ることを特徴とする宿主細胞。
21. ２１．請求の範囲第５項に記載のｃＤＮＡフラグメントの転写および翻訳の結果 として得られたタンパク質であって、−該ｃＤＮＡによる、その転写およびその 翻訳を可能にする条件下での、決められた宿主細胞の形質転換；−場合によって は宿主細胞の溶解後の、発現されたタンパク質の回収、 といった段階によって得られるタンパク質。
22. ２２．請求の範囲第２１項に記載のタンパク質に対する抗体。