JPH06507420A - 粘膜の病原体に対するワクチンとその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

粘膜の病原体に対するワクチンとその製法問題点 百日咳は普通小児に多い重い呼吸器疾患で、１９３０年代までは小児の疾病率、 死亡率の主原因の一つであった。その後百日咳菌（Ｂｏｒ−ｄｅｔｅｌｌａ　ｐ ｅｒｔｕｓｓｉｓ　、病原菌）を加熱滅菌した全細胞調製品の非経口予防接種が 普及し、社会的、経済的状況が好転したため、先進国に於いては百日咳の発生率 が著しく減少した。しかしこの２０年の間にこの病気の発生率か急激に増加して おり、これは百日咳ワクチンに原因すると思われる副作用の可能性を心配した親 達かワクチンの接種を控えるようになったためである。この副作用はその程度が 穏やかな局所的反応からしつこい号泣を経て永久脳症にまで及んでおり、国によ っては法的責任を恐れた医者が予防接種の勧めを躊躇している。その上ワクチン の効果がメーカーによって著しい相違があり、全てのワクチン調製品が有効であ るわけではない。 近年百日咳の研究の主な課題の一つは、反応原性を少なくし免疫原性を高めたは っきり規定された無細胞ワクチンの開発にあるか、百日咳の非常に複雑な病原性 と感染後の免疫学的防御機構に関する知識が十分でないためその開発は遅れてい る。百日咳菌は病原性に付随する幾つかの因子を有するが、その内のどれが人体 の防御抗原であるか、又との因子かワクチンの反応原性と関連しているかに就い て結論が得られていない。精製した抗原、即ち解毒した百日咳毒素と繊維状血球 凝集素とをベースにしたワクチンがスウェーデンでの実地試験である程度の効果 を示したか、このワクチンか防御作用に関連の可能性のある他の抗原により汚染 されていたことは明らかである。従って、反応原性のない効果の高いワクチンは 未だ利用できず、これに代わる方法の開発が必要である。本発明者等は、経口又 は鼻腔内投与後に空気の経路で免疫応答を刺激するために、百日咳菌抗原を含む リポソームが使用できるがどうかを研究した。 序説 先進国に於ける百日咳の発生率は、百日咳菌を加熱滅菌した全細胞調製品の非経 口予防接種の普及により著しく減少したが、この予防接種に関連のある副作用の 可能性が広く知れ渡ってこの接種を受ける人が減少し［４８１、ワクチンの製造 に関連してその効果にばらつきがあり［ｌ９１、又百日咳の発生率の９５％を占 める低開発国では予防接種の体制ができていない［３４］ため、百日咳は依然と して世界的の問題である。 ワクチンの効果に再現性を欠く理由の一つに、感染に対する防壁の第一線として 必要な粘膜の免疫システムを刺激するのに百日咳菌抗原の非経口投与では充分で ない点が考えられる。疫学的検討結果によれば、現在のワクチンは感染よりもむ しろ病気を防御するようてある［１１１。抗原の経口又は鼻腔内投与の方が防御 効果が大きいだけでなく非経口投与に関連した副反応の多くを避けることができ るようである。しかし、経口投与された抗原は短時間の免疫反応を誘導するだけ てあることが多く、この反応を促進するためにアジュバントを必要とする。 リン脂質二重層小胞（リポソーム）は非常に多種の生物学的活性物質を特定の組 織に運搬するシステムとして使用されており、最近では幾つかの細菌抗原及びウ ィルス抗原に対する免疫応答を高めるための免疫学的アジュバントとして用いら れるようになった［１７］。 ここでは、肺の中の百日咳菌表面抗原に対する免疫学的応答を高めるための運搬 システムとしてのリポソームの可能性に就いて報告する。 換言すれば、百日咳菌はヒトの呼吸器管に感染する百日咳の病原学的要因である 。この病気には特に小児が罹りやすく、神経の病気から死を招くこともある［６ ２１゜保健上での百日咳の疾病率及び死亡率の影響は報告の不足から普通低く見 られがちであるか、百日咳による或いは百日咳に関連した発病数は年間六千万件 、死亡者は年間五十万Å以上と推定される［３４１゜予防接種が強制されていな い国での百日咳の感染率は非常に高く、１７〜１９才の人の血清の９５％迄か百 日咳に対する抗体を含んでいる１１５１゜先進国では加熱滅菌した全細胞ワクチ ンの接種が普及しているため百日咳の発生率は非常に減少した［１２］。このワ クチンによる恩恵は、稀ではあるが重症の副作用の危険に比べて極めて大きいこ とは明らかであるが、安全性と免疫原性に就いての一般的懸念の結果予防接種の 割合か減少した［２２．３３］。更に幾つかの国例えばアメリカ合衆国では、免 疫感作率が高いにもかかわらず年間３０．０００〜１２５、０００の百日咳の発 病かある［５５まために全細胞ワクチンの効果か疑問視されている。従って、は っきり規定された毒性のない、免疫原性の高い新世代のワクチンが強（要望され ている。はっきり規定された無細胞ワクチン中に封入するために百日咳菌の幾つ かの毒性因子か考慮されており、解毒した百日咳毒素（ＰＴ）と繊維状血球凝集 素（ＦＨＡ）とがその第一の候補である［２９．４０］。非経口経路により投与 された従来のサブユニットワクチンは先ず体液の免疫性を誘導するか、粘膜の抗 体応答は低い。しがし、百日咳菌は呼吸器管の粘膜を通して感染し、自然の感染 の後に特異性免疫グロブリン（Ｉｇ）Ａが誘導される［５７１゜そのような抗体 は宿主をコロニー形成と病気の両方に対してよく防御するようである。従って、 空気の経路で粘膜の免疫を刺激する手段を開発し、感染と病気の両方に対するこ の手段の防御効果を評価することは検討の価値があると思われる。 リポソームは薬剤、抗原、ホルモン、遺伝子物質の運搬システムとして効果的に 用いられている［１７１゜又リポソームに封入した抗原による次のような免疫が 有望な成果を収めた。即ち寄生虫［４，２４，２５゜４５、４９］、ウィルス［ １０，３８］、細菌［８，１８，４３，４６，５２，６１］の抗原に対して経口 ［１８，４３，４５，６１１及び非経口［４，８，１０，２４，２５，４６，４ ９，５２］経路が使用された。リポソームに封入した抗原を使用し、保護免疫［ ４，８゜１８、２４．２５．４５．４９．５２］、或いは少なくとも細胞の仲介 ［８１及び体液の応答［１０，４６１の結果が得られた幾つかの研究に於いて、 このようなリポソームのアジュバントとしての能力が実証された。リポソームの アジュバント活性は、小胞の大きさと構造、脂質の構成、表面の電荷、抗原の局 在、免疫される動物の種、免疫の経路、ラメラの分布と数のような幾つかの因子 によって決まるようである。経口投与の抗原をリポソームに組み合わせると、抗 原の吸収を高めて細胞プロセッシングを行わせ、Ｔ細胞へのプレゼンテーション と局部のリンパ節への受入れを容易にする。この過程が体液性、分泌性、及び細 胞仲介の免疫応答の誘発を改善する［１．２．１７．５８］。 本報告には、マウスを経口的に免疫にした後で、特異性の全身性又は分泌性免疫 応答を誘発するための、ＦＨＡ及びＰＴを封入したりボソームの能力に就いて記 載した。 一つの実施例によれば、本発明は粘膜の病原体に対するワクチンに関するもので あり、ワクチンがリポソームの運搬システムから成り或いは反応成分として該運 搬システムを含み、該運搬システムが脂質小胞から成り又はこれを含むようなワ クチンに於いて、前記脂質小胞がその外膜に組み込まれた少なくとも１種の粘膜 の病原体抗原を含むことを特徴とするワクチンに関する。 本発明の前記ワクチンは、粘膜の病原体がボルデテラ属、特にＢ型、百日咳菌、 赤痢菌又は連鎖球菌の一種の株であることを特徴とすることができる。 本発明の前記ワクチンは又、前記抗原が百日咳菌の外膜タンパク質（ＯＭＰ）の 一つの調製品であることを特徴とすることができる。 本発明の前記ワクチンは又、前記抗原が百日咳菌の一つのリボ多糖（ＬＰＳ）で あることを特徴とすることができる。 本発明の前記ワクチンは又、前記抗原が百日咳菌の繊維状血球凝集素及び／又は 百日咳毒素であることを特徴とすることができる。 本発明の前記ワクチンは又、百日咳菌の外膜タンパク質（ＯＩＪＰ）の一つの調 製品と同じく百日咳菌の一つのリボ多糖（ＬＰＳ）との両方を抗原として含むこ とを特徴とすることができる。 本発明の前記ワクチンは又、脂質小胞による前記ワクチンが大豆をベースとした 小さい多重膜リン脂質小胞であることを特徴とすることができる。 もう一つの実施例によれば、本発明は本発明によるワクチンの調製方法に関し、 溶剤希釈微粒子担体技術により一種又は数種の抗原を脂質小胞に組み込むことを 特徴とする。 百日咳菌のリボ多糖（ＬＰＳ）と外膜タンパク質（ＯＭＰ）との調製品を大豆か らのリン脂質から成る多重膜リポソーム（Ｌｙｐｈａｓｏｍｅ”、　ファウシテ ィン・ファマシューティカルス（Ｆｏｕｎｔａｉｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ ａＩｓ）　、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）に組み込んだ。この被覆リポソームをマウスに経 口又は鼻腔内接種で投与した所、肺洗浄液に抗原特異性の抗体応答が認められた 。免疫応答を誘発するのにＯＭＰ−被覆リポソームの方がＯＭＰｊｌ製品単独よ りも明らかに有効であった。最初の免疫処理後３０日目に追加免疫（ブースター ）を行ったマウスの場合が応答が最高であった。最高の応答は追加免役後２０日 目に得られたが、特異性抗体は二次免疫後７５日目にも尚検出できた。 これらの結果は、このリポソーム抗原運搬システムが百日咳菌の感染を有効に防 御するために必要と思われる分泌性抗体応答を刺激する能力を備え、且つ各種の 百日咳菌からのタンパク質候補及び／又はＬＰＳ抗原の運搬にも適用できる筈で あることを示している。 リポソームはこれまで生体内の抗体応答を誘発するために用いられてきたか、鼻 腔内免疫感作又は経口投与後の肺の抗体応答に就いての報告は見当たらないが、 このような検討はかなり重要である。 現在の全ての百日咳ワクチンが非経口的に投与されており、この方法がコロニー 形成とその後の感染を防御する第一線として必要な粘膜の免疫システムを刺激す るには不充分であると思われるからである。事実、現在のワクチンが感染を防ぐ よりもむしろ病気を防ぐことを示唆する疫学的証拠もある。抗原の経口又は鼻腔 内投与は防御効果を向上するだけでなく、非経口ワクチン接種に関連した副反応 、例えばタンパク質抗原の調製品を汚染する少量の遊離ＬＰＳによる内毒素ショ ックを避けることができる。本発明者等が示すように、ＬＰＳを封入したリポソ ームでは恐ら＜　ＬＰＳの脂質Ａの部分の宿主細胞膜への挿入が妨げられるため に内毒素ショックは起こらない。 このような運搬システムは動物の宿主に粘膜経路、即ち主として肺又は腸管から 侵入する、その他の細菌病原体に対するワクチンにも適用できると思われる。 百日咳菌のリポソームに組み込んだ繊維状血球凝集素（ＰＨＡ）と解毒した百日 咳毒素（ＰＴ）とをワクチンとしてマウスに経口的に投与した所、ＦＨＡ−及び ＰＴ−特異性免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｇが血清中に、又１ｇＧと［ｇＡとの両方 が肺洗浄液中に検出された。封入抗原により免疫にされたマウスの抗体力価は、 封入されていないＰＨＡ及びＰＴによる免疫のマウスの力値よりも明らかに高く 、リポソーム担体のアジュバント活性を示している。この結果は、ＦＨＡ及びＰ Ｔ　（又恐らく他の百日咳抗原）に対する免疫反応をヒトの中に誘発するこの研 究が有用であり、又百日咳菌の感染と病気の両方を防御するための大規模の免疫 に利用される可能性のあることを示している。 次に本発明を図面及び実験部ＡとＢとにより詳細に説明する。 図面の簡単な説明 図１ 小胞の５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（ＳＯＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）。試料 を１１％の分離ゲルで分析した。１　：　ＯＭＰ−被覆小胞、２：百日咳菌のＯ ＭＰ調製品、３二百日咳菌の全細胞、４：分子量標識。 図２ 小胞の電子顕微鏡検査。被覆なしの小胞（Ａ）とＯＭＰ−被覆小胞（Ｃ）とを酢 酸ウラニル４％で負に染色した。矢印が多重膜を示す。Ｂ（被覆なしの小胞）と Ｄ（ＯＭＰ−被覆小胞）は一方向金属シャドウィング後の小胞である。ＯＭＰ− 被覆小胞を始めに抗−〇ＭＰ抗体、次にタンパク質Ａ・全複合体でインキュベー トした（Ｅ：染色していない小胞、Ｆ：金属シャドウィング後）、金の粒子（矢 印で表示）はＯＭＰ小胞の外面にあるＯＭＰ材料を示す。対照試験としてＯＭＰ −被覆小胞を始めにプレ免疫の免疫グロブリン、次にタンパク質Ａ・全複合体（ Ｇ）、又はタンパク質Ａ・金複合体単独（Ｈ）でインキュベートした。ＯＭＰ− 被覆小胞の標識は検出されなかった。黒棒は０．２ｍをあらゎす。 図３ ＯＭＰ−被覆小胞及び組み込まなかったＯＭＰ調製品とを鼻腔内予防接種した後 のマウスの肺洗浄液の抗体力値（抗−ＯＭＰ）。黒棒は標準偏差を示す。 図４ ＯＭＰ−被覆小胞を鼻腔内予防接種した後のマウスの肺洗浄液の抗体力値（抗− ＯＭＰ）に及ぼすワクチンの用量の影響。 図５ ＯＭＰ−被覆小胞を鼻腔内投与により免疫にしたマウスの投与後の抗体応答の存 続期間。マウスにワクチンを投与し図示の日に殺して肺の洗浄液からの抗−ＯＭ Ｐカ値を測定した。黒捧は標準偏差を示す。 図６ 肺洗浄液と血清のウェスタンプロット分析。百日咳菌のＯＭＰを分離ゲル１１％ を用いた５ＯＳ−ＰＡＧＥにより分離しプロットした。ストリップｌと２はＯＭ Ｐ−被覆小胞で免疫にしたマウスからプールした肺洗浄液でインキュベート、ス トリップ３と４とは被覆なしのＯＭＰで免疫にしたマウスからプールした肺洗浄 液でインキュベート、ストリップ５はＯＭＰ−被覆小胞で免疫にしたマウスから プールした血清でインキュベート、ストリップ６は被覆なしの小胞で免疫にした マウスからプールした血清でインキュベートした。ストリップｌと３とは第２の 抗体としてペルオキシダーゼを抱合した抗マウスＩｇＡでインキュベートし、ス トリップ２．４．５．６は抗マウス［ｇＧでインキベートした。矢印は主要３２ 　ｋｄタンパク質を示す。 図７ ＬＰＳ−被覆小胞の銀染色。ｌ二百日咳菌から抽出したＬＰＳ、２：被覆なしの 小胞、３：ＬＰＳ−被覆小胞。 図８ リポソームへのＦＨＡとＰＴとの組込み。レーンｌ：分子質量標準、レーン２． 封入していないリポソーム、レーン３：遊離のＦＨＡ　、レーン４：リポソーム に封入したＦＨＡ　、レーン５：遊離のＰＴ、レーン６・　リポソームに封入し たＰＴ、　ＦＨＡとＰＴのサブユニットは矢印で示してあり、標準の分子質量と 同様にキロダルトンである。 図９ リポソームの電子顕微鏡検査。負に染色した被覆なしのリポソーム（Ａ）。ＢＨ Ａ−被覆リポソームの負に染色後（Ｂ）、一方向金属シャドウィング後（Ｃ）、 ポリクロナール抗−ＦＨＡ抗体とタンパク質Ａ・全複合体とによるインキュベー ト後の金属シャドウィングなしくＤ）と育り（Ｅ）、プレ免疫血清とタンパク質 Ａ・全複合体とによるインキュベート後（Ｆ）。Ｇ：金粒子。黒棒は０．２μｍ を示す。 図ｌ０ ＰＴ−被覆リポソームの電子顕微鏡検査。ＰＴ−被覆リポソームの酢酸ウラニル ４％（ｐＨ４，５）で負に染色後（Ａ）、ポリクロナール抗−ＦＨＡ抗体とタン パク質Ａ・全複合体とによるインキュベートと金属シャドウィング後（Ｂ）、対 照試験としてプレ免疫の血清、次にタンパク質Ａ・全複合体によるインキュベー トと金属シャドウィング後（Ｃ）、ポリクロナール抗−ＰＴ抗体とタンパク質Ａ ・全複合体とによりインキュベートしたポスト包理標識（Ｄ）。Ｇ：金粒子。黒 捧は０．１μｍを示す。 図１１ 遊離のＦＨＡ及びリポソーム被覆（Ｌ、　Ｃ，）Ｆｌ（Ａを経口投与したマウス の血清中（Ａ）及び肺洗浄液中（Ｂ）の抗−ＦＨＡ特異性抗体のレベル。標準偏 差を垂直の線で表示。 図１２ 遊離のＰＴ及びリポソーム被覆（Ｌ、　Ｃ，）ＰＴを経口投与したマウスの血清 中（Ａ）及び肺洗浄液中（Ｂ）の抗−ＰＴ特異性抗体のレベル。標準偏差を垂直 の線で表示。 実験の部Ａ、ワクチンの調製とその成分材料と方法 株と培養 百日咳Ｄ３００４２１　（血清型１．２．３）［３］をポルデー・ジャングベー ス（Ｄｉｒｃｏ）の上で１％（容量／容量）及び１５％（容量／容量）の繊維素 を除去したウマの血液で培養した。大量の生産にはモディファイド・ホーニブル ツク（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｈｏｒｎｉｂｒｏｏｋ）培地［６６１を使用した。 リボ多糖の調製 百日咳菌の４８時間培養の２ｒを遠心により採取し、リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ： 　ＮａＣ１８ｇ／ｊ？　、にＣ１Ｏ，２ｇ／β、　Ｋ）Ｉｔ　Ｐｏａ　Ｏ，２ｇ ／ｌ。 ＮａＪＰＯ４・２Ｈｔ０２．９　ｇ／Ｌ　ｐＨ７，４）で１回洗浄した。細胞を 蒸留水で７５ｍｆになるように再懸濁し６５°Ｃで３０分インキュベートした。 これに等容の９０％（重量／容量）フェノールを加え、攪拌しなから６５°Ｃで ４５分インキュベートした。この懸濁液を氷上で冷却し、＋０．０００Ｘｇで１ ０分遠心した。上部の水の層を除き、ｔｏ、　０００　Ｘ　ｇで１０分遠心して デブリを除去した。水冷アセトン２容を加えて１晩インキユベートしてリボ多糖 （ＬＰＳ）を沈澱した。この沈澱を４°Ｃで１０．０００Ｘｇで１０分遠心して 収集し、７０％のアセトンで洗浄した。乾燥したベレットを蒸留水２０ｍ　ｌに 再懸濁し、１００．０００　Ｘｇで２時間超遠心し、ペレットを蒸留水で２回以 上洗浄してから凍結乾燥した。 外膜タンパク質の調製 百日咳菌の４８時間培養の２ｉ！を遠心により採取し、ＰＢＳで１回洗浄した。 細胞をＰＢＳ　５０　ｍｌに再懸濁し加熱滅菌した（５６°Ｃ１３０分）。 フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＦＳ）を加えて最終濃度を０．１ｍ Ｍとし、細胞を音波処理（氷の上で１分間の１０個のパルス、パルスの間に１分 の冷却）して破壊し、破壊しなかった細胞を５．０００×ｇて１０分遠心して除 去し、エンベロープを１００．０００　Ｘ　ｇで１時間の遠心により収集した。 次にこのエンベロープを２％のトリトンＸ−１００２０ｍｌ　、　ＭｇＣ１ｚ　 ７．５　ｍＭ、　ＨＥＰＥＳ　（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−エ タンスルホン酸）　（ｐＨ７，４）　５０　ｍＭに再懸濁し、氷の上に１時間放 置後、１００．ＯＯＯＸｇで１時間遠心してから同し緩衝液で１回洗浄し、得ら れたＯＭＰ調製品を蒸留水で２回洗浄した。タンパク質の濃度の測定にはＬｏｗ ｒｙ法の改良法［３１］を使用した。 小胞の調製 ＬｙｐｈａｚｏｍｅＴＭは小さい多重膜リン脂質小胞の特許形態であるが、これ を百日咳菌ＬＰＳ及びＯＭＰ調製品を含むようにして、ファウシテイン・フ了− マシューティカルス・インク、　（Ｆｏｕｎｔａｉｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ ｃａｌｓ　Ｉｎｃ、）の開発した溶剤希釈微粒子担体技術［５３１を用いて、ア メリカン・レシチン・カンパニー、二ニー・ヨーク（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｌｅｃ ｉｔｈｉｎ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）の精製した大豆ホスファチ ドから調製した。精製した脂質混合物の組成はホスファチジルコリン、ホスファ チジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、及び中性脂質で、その比率は約８ ・ｌ：ｏ、７・０．３であった。 マウスの免疫感作 ４〜５週齢の雌のＢａ１ｂ／ｃマウスを５グループに分けて免疫にした。 鼻腔内免疫の場合はマウスをエーテルで麻酔し、ＰＢＳで希釈したワクチン５０ μｌを外側の鼻孔に置いて吸入するようにした。経口投与ではワクチンをＰＢＳ で適当に希釈し、免疫の直前に胃の酸性を中和するために等容の重炭酸カルシウ ムの３％ＰＢＳ溶液（ｐｔ（８，０）を添加した。６〜８時間水を遠ざけたマウ スにこの５０μｌを徐々に与えた。特に断らない限り、１日目と４日目にマウス の免疫感作を、又３００日目追加免疫を実施した。ｌ用量は、ＯＭＰ−被覆では タンパク質４μＩｇ、　ＬＰＳ−被覆小胞と被覆なしの小胞では１５Ｍｇの乾燥 重量とした。追加免疫１０日後に、特に断らない限り頚椎脱臼によりマウスを殺 して腕の動脈から放血した。気管にシリンジで挿管し、ＰＭＦＳ　０゜１　ｍＭ を含む氷冷ＰＢＳ　Ｏ，７ｍｊ７を肺に満たしてから抜き取り、これを４回繰り 返して肺洗浄液を得た。各々のマウスからその約０．５ｍｉ！を採り、４°Ｃに 於いて１０．０００　Ｘｌｉで１０分遠心してデブリを除去し、−２０°Ｃて保 存した。 ＯＭＰに対する抗血清 ＯＭＰ調製品を不完全フロインドアジュバントと１：ｌの割合て最終の容積がｌ 　ｍｊ！になるように乳化し、これを１匹の３月齢のチンチララビット（こ、１ 日目（２００μｇ）、３００日目１００μｇ）及び４００日目１００μｇ）を皮 下及び筋肉内に注射した。５００日目ラビットを殺して、免疫グロブリンを得ら れた血清からタンパク質Ａ・セファロースＣＬ４Ｂクロマトグラフィーにより精 製した。 ５ＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンプロット分析タンパク質とＬＰＳとをドデシル硫 酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＯ３−ＰＡＧＥ）により既 述のように分離した［３０］。タンパク質はクーマシーブルーで、ＬＰＳは銀で 染色した［５９１゜ウェスタンプロット法を既述のように実施した［５１゜簡単 に言えば、タンパク質を半乾燥転移細胞を用い、トリス２５　ｍＭ、グリシン１ ９２ｍＭ、メタノール２０％、ｐＨ８，３を転写緩衝液として、又ウシ血清アル ブミンの５％ＰＢＳ溶液をブロッキング剤として使用して、ニトロセルロースに 転写した。ＰＢＳで１＝４に希釈した肺洗浄液又はＰＢＳで１：１０に希釈した 血清サンプルをブロックした膜に加えて３７℃で１時間インキュベートした。Ｐ ＢＳで３回洗浄後パーオキシダーゼ抱合ヤギ抗マウスＩｇＡ　（サザン・バイオ テクノロジー・アソシエイツ・インク（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇｙ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ　Ｉｎｃ、）　）又は抗マウスＩｇＧ（ジャク ソン・イムノリサーチ・ラボラドリース（Ｊａｃｋｓｏ口１ｍｍｕｎ。 ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を加えて３７°Ｃで１時間イ ンキュベートし、膜をＰＢＳて３回洗浄し、４−クロロ−１−ナフトールを基質 として使用して発色させた。 ＥＬＩＳＡ法 マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ　Ｍａｘｉｓｏｒｐ）を４°Ｃで１晩ＯＭ Ｐの０、　Ｉ　Ｍ　ＮａＨＣＯｘ溶液ｐＨ９，６（ウェル当たり５０μ！中５μ ｇ）又はＬＰＳの５０ｍＭ）リス塩酸ｐＨ９，６，２０ｍＭ　ＭｇＣ１を溶液（ ウェル当たり５０μｌ中１　ｍｇ）で被覆した後、プレートを洗浄し、コウシ胎 児血清（ＦＣＳ）のＰＢＳ溶液（ウェル当たり１００μりで３７℃で１時間ブロ ックした。洗浄後、ＦＣＳのｌＯ％ＰＢＳ溶液で種々の濃度に希釈した血清又は 肺洗浄液をプレートに加えて（ウェル当たり５０μｉ’）３７℃で１時間インキ ュベートした。プレートを洗浄し、ＦＣＳのｌＯ％ＰＢＳ溶液でＩ　：　１００ ０の割合に希釈したパーオキシダーゼ抱合ヤギ抗マウス１ｇＡ又は抗マウス［ｇ Ｇをウェル当たり５０μｌずつ加えて、プレートを前回のようにインキュベート し、洗浄後基質（クエン酸０．２５Ｍ。 ＮａＪＰＯ，０，２５Ｍ、　ＨｔＯｔ　Ｏ，００１５％、０−フェニルジアミン ジハイドロクロライド０．３　ｍｇ／ｍ！りを各ウェル当たり５０μｌずつ加え て発色させた。室温で３０分放置後、５０μ！の０．２５　Ｍ　Ｈ！ＳＯ４を加 えて反応を停止し、Ａ４．。をバイオラッド・モデル・３５５０・マイクロプレ ート・リーダー（Ｂｉｏｒａｄ　ｍｏｄｅｌ　３５５０　ｍ１ｃｒｏｐｌａｔｅ 　ｒｅａｄｅｒ）を用いて測定した。結果は５匹のマウスのサンプルから得られ た値の平均値であり、ＥＬ［ＳＡユニットは非免疫マウスから得られたバックグ ラウンド値を差し引いた後でＡ　ａ　ｓ。に相当する希釈ファクターを掛けた値 である。対照マウスからの希釈していない肺洗浄液と血清サンプル（１：５０に 希釈）は実質的にゼロの読みを与えた。 電子顕微鏡 被覆なし及びＯＭＰ−被覆の小胞を酢酸ウラニルの４％水溶液（ｐＨ４，５）を 用いてヴアレンタイン（Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ）等の方法［６０１により負に染色 した。金属シャドウィングには２個の小胞サンプルをニッケル製グリッドを覆っ た新たに調整したホルムバール（ポリビニルホルマール）の膜の上に吸収させ、 蒸留水で洗浄、風乾後白金で一方向（角度２０°）にシャドウィングした。 免疫電子顕微鏡法 被覆なし及びＯＭＰ−被覆の小胞をニッケル製グリッドを覆った新たに調整した コロジオンの膜の上に吸収させて、蒸留水で注意して洗浄した。室温で風乾後精 製した抗体（［ｇＧ　１００μｇ／タンパク質ｍｌ＞で室温で３０分処理した。 プラスチック瓶からＰＢＳ　（リン酸カリウム０．１　Ｍ、　ＮａＣ１Ｏ，１５ Ｍ、　ｐＨ６，９）を穏やかにスプレーして結合していない抗体を除き、タンパ ク質Ａ・全複合体（金粒子径１０　ｎｍ、　０．０３のＡ。。）を滴下してグリ ッドを室温で１０分インキュベートして、結合した抗体が電子顕微鏡で見えるよ うにした。次にグリッドを始めは０．０１％のＴｗｅｅｎ　２０を含むＰＢＳ、 次に蒸留水で洗浄した。風乾後グリッドを白金で一方向（角度２０°）シャドウ ィングした。対照実験では、精製したプレ免疫の免疫グロブリン又はタンパク質 Ａ・全複合体だけでサンプルを処理した。サンプルをＺｅｉｓｓの電子顕微鏡Ｃ ＥＭ　９０２又は１０Ｂを用い、８０　ｋＶの加速電圧で、検定した拡大率によ り調へた。 実験の部への結果 ＯＭＰ−被覆小胞の分析 ＯＭＰ−被覆小胞とＯＭＰ調製品を５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（図１）で分析して実質 的に同一のタンパク質を含んでいることを見出した。これは木組込み技術が特異 性タンパク質を優先的に選択しないことを示している。 被覆なしの小胞調製品ではタンパク質は検出されなかった（結果は記載せず）。 被覆なし及びＯＭＰ−被覆の小胞の電子顕微鏡検査の結果両方の小胞は多重膜で その大きさは０．２〜２μｍの間であった（図２Ａ−Ｄ）。しかし、ＯＭＰ−被 覆の小胞は被覆なしの小胞と比べてその形態学的外観を異にし、ＯＭＰの組込み によりＯＭＰ小胞は水庖を示した（図２Ｄ）。このような小胞を抗−〇ＭＰ抗原 でインキュベートした所、小胞外面のＯＭＰ物質の位置を示す標識が小胞に明瞭 に示された（図２Ｅ、　２Ｆ）。対照試験では標識は認められなかった（図２Ｇ 、　２Ｈ）。 ＯＭＰ−被覆小胞による免疫感作 被覆小胞のアジュバント活性を調べるため、異なるグループのマウスに、ＯＭＰ −被覆小胞と小胞を被覆するのに使用したＯＭＰ調製品とをタンパク質の濃度を 同じにして鼻腔内にワクチン投与した所、ＯＭＰ−被覆小胞で免疫にしたマウス の肺洗浄液中の［ｇＡ及び［ｇＧの力価がＯＭＰ調製品で免疫にしたマウスに比 べて約４倍であった（図３）。 又ＯＭＰ−被覆小胞で免疫にしたマウスの血清中のＩｇＧの力価はＯＭＰ調製品 で免疫にしたマウスの約２倍であった。被覆なしの小胞で免疫にしたマウスはＯ ＭＰに対して免疫応答を示さなかった（結果は記載せず）。共通の粘膜免疫シス テムの存在は充分確証されているか、鼻腔内及び経口経路による免疫感作の効果 を比較するのは興味があった。鼻腔内及び経口経路により免疫にしたマウスの肺 洗浄液の力価は同様であった（表１）。１次応答は４日目の第２の免疫感作から １０日後に検出されたが、追加免疫後の著しい力価の増加は３００日目現れた。 １次応答のピークが何時起こったかは測定されなかったか、４００日目追加免疫 をせずに段したマウスの力価の方が１０日後の力価よりも高かったので、そのピ ークが１０日後に起こったことは明らかである。血清中のＩｇＧ力価は肺の応答 の場合と同様であった（結果は記載せず）。 肺の中で最大の応答を誘発するのに必要な用量は６〜１２μｇ（２回の１次免疫 感作と１回の追加免疫の合計用量）（図４）である。１２０μｇのタンパク質で 免疫にしたマウスの応答は弱く、高濃度では阻害効果が生ずることを示している 。しかし、１．２５μｇという低い用量でも肺洗浄液中に尚特異性抗体を認める ことができた。免疫応答の持続を調べるために３００日目追加免疫後、種々の間 隔を置いてマウスを犠牲にした（図５）。［ｇＡと［ｇＧとの最大の応答は共に 追加免疫２０日後に起こったが、７５日後にも尚特異性免疫グロブリンを肺の中 に認めることができた。 免疫応答のウェスタンプロット分析 経口及び鼻腔内経路により免疫にしたマウスからの肺洗浄液及び血清のサンプル を一緒にプールして、ウェスタンプロット法で分析した（図６）。ＯＭＰ−被覆 小胞で免疫にしたマウスからの肺洗浄液は幾つかのＯＭＰバンドと反応したが、 信号は抗マウス［ｇＧに対する方が抗［ｇＡに対するよりも明らかに強かった。 これは両方の検出システムの結合活性又は感度の差によるものか、或いは気管の 低い箇所で［ｇＧ応答がＩｇＡ応答よりも顕著であったためと思われる。ネトラ ッド（Ｎｅｄｒｕｄ）等［３６１は、不活性化したセンダイウィルスで経口及び 鼻腔内経路により免疫にした後で、気管の低い箇所ではＩｇＧが優勢な応答で、 気管の高い箇所ではＩｇＡが優勢な応答であったと報告した。本報の対照試験で は被覆なしの小胞で免疫にしたマウスから得られた肺洗浄液にはＯＭＰバンドに 対する信号は認められなかった（図６、レーン３と４）。ＯＭＰ−被覆小胞で免 疫にしたマウスからプールした血清もいくつかのＯＭＰバンドと反応した（図６ 、レーン５）。血清と肺洗浄液のいずれも主要３２　ｋｄ　ＯＭＰと反応したが 、血清の応答は低分子量の方のバンドを優先し、一方分泌物の応答は高分子量の 方のバンドを優先した。被覆なしの小胞で免疫にしたマウスからの血清は写真に は認めることができなかった（図６、レーン６）が、主要３２　ｋｄ　ＯＭＰと 非常に僅かの反応を示した。 ＬＰＳ−被覆小胞による免疫感作 百日咳菌から分離したＬＰＳ及びＬＰＳで被覆した小胞を５ＤＳ−ＰＡＧＥ及び 銀染色により分析した。いずれも同様の泳動パターンを示しく図７）、ベブラー （Ｐｅｐｐｌｅｒ）　［４２］が記載したａｂ表現型であった。即ち、野生型の 百日咳菌は二つの別個の粗ＬＰＳを有し、これが５ＤＳ−ＰＡＧＥ後にａ及びｂ と呼ばれた２個のバンドとして現れた。しＰＳで被覆した小胞により経口及び鼻 腔内経路で免疫にしたマウスからの肺洗浄液には特異性１ｇＡは認められなかっ たが（表２）、特異性１ｇＧ応答は検出された。しかし、ＬＰＳに対する特異性 １ｇＡは、マウスをＯＭＰ−被覆小胞で免疫にした場合に検出された。ＯＭＰ− 被覆小胞の銀の染色は、この小胞がＬＰＳ−被覆小胞に比べてＬＰＳを約１／１ ０　ｔ、か含んでいないにもかかわらすＬＰＳの存在を示唆しており（結果は記 載せず）、これはＯＭＰ−被覆小胞に存在するタンパク質かＬＰＳ抗原の適切な プレゼンテーションのために必要であることを示している。又［ｇＧ応答はＯＭ Ｐ−被覆小胞により免疫にしたマウスの方がＬＰＳ−被覆小胞により免疫にした マウスよりも高かった。鼻腔内経路による免疫の方が経口免疫よりも免疫応答を 誘発するのに作動であるようである。ＬＰＳに対する特異性１ｇＧが血清中に検 出され、マウスの免疫にＯＭＰ小胞を使用しても又ＬＰＳ小胞を使用してもその 力価は同様であった。 実験の部への考察 ＯＭＰ又はＬＰＳで被覆した小胞はこれらの抗原に対する分泌性及び全身性免疫 応答を誘発するのに有効であることが判った。しかし、ＬＰＳに対する分泌性１ ｇＡ応答はＯＭＰ−被覆小胞による免疫感作の後でのみ検出され、ＬＰＳ−被覆 小胞では検出されなかった。これはＯＭＰ調製品中のタンパク質抗原がＩｇＡ応 答の刺激に於いてアジュバント効果を有するためと思われ、恐らくタンパク質抗 原が、Ｂ細胞イソタイプの直接１ｇＭからＩｇＡへの切換えを仲介するヘルパー Ｔ細胞のプレゼンテーションに必要である［５４］。ＯＭＰ小胞で免疫にしたマ ウスはＯＭＰｌｉ製品で免疫にしたマウスに比べて約４倍の分泌性抗体力価を示 した。このリポソームのアジュバント活性の一般的理由は不明であるが、被覆し た小胞がＯＭＰ調製品よりもリンパ系組織の中で長く存続することは可能である 。ある粘膜組織中の免疫応答がとこか他の箇所の分泌性応答を誘導しようとする 共通の粘膜免疫システムが存在することは現在一般に受け入れられている［３２ １゜しかし、腸管付属リンパ組織（ＧＡＬＴ）及び気管支付属リンパ組織（ＢＡ ＬＴ）の中で働くシステムの調節機構が相違しているという幾つかの証拠がある ［２８１゜本研究ではマウスを経口的に又は鼻腔内で免疫にしてもＯＭＰに対す る力価は同様であったが、ＬＰＳに対する力価は鼻腔内で免疫にした方が高いよ うであった。ＯＭＰ−被覆小胞で鼻腔内で免疫にしたマウスの最高の応答は３０ ０日目追加応答後２００日目生じた。しかし分泌性抗体は免疫感作後７５日経過 しても同誌められた。この点は、抗百日咳＋ｇＡがヒトの自然感染から３力月後 でも鼻咽頭腔の分泌中に認められたが、非経口による予防接種の場合にはこれが 認められないと言うグツドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）等［１６１の観察と関連して 特に興味かある。更に百日咳の自然感染の方が非経口による予防接種与よりも免 疫か有効で長く持続することは一般に認められている。 本研究では予防接種後の体液性応答のみを調査したが、他の研究に於いて、抗原 被覆リポソームが細胞仲介免疫（ＣＭＩ）を誘発し得ることが示された［２４１ ゜百日咳菌に対するＣＭ［の防御作用は現在の所不明ではあるが、ヒトの感染後 の種々の抗原に対するＣＭＩ応答が報告されている［７．１４］。 百日咳の病原性は複雑で、どの抗原を無細胞ワクチンに含ませるべきかは未だ明 らかでない。百日咳毒素と繊維状血球凝集素とをベースにした非経口ワクチンが スウェーデンの実地試験である程度の防御作用を示した［４１］が、このワクチ ンが防御作用に関連の可能性のある他の抗原により汚染されていたことは明らか である［５１］、抗−ＬＰＳ抗体の防御作用に於ける役割は明らかでない。ラビ ット抗−ＬＰＳ抗体は、これを病原細菌と混合すると、マウスを感染がら保護し なかった［４７］が、ヒトの場合抗−ＬＰＳ抗体はコロニー形成を妨げるのに寄 与することが指摘された［６８１゜分泌性応答を誘発するために本研究で使用し たＯＭＰ−被覆リポソームは疑いもなく未精製のワクチンである。しかし、これ らの抗原に対する抗体刺激を高めるリポソーム運搬システムは、繊維状血球凝集 素、百日咳毒素、或いはマウスモデルで防御作用のあることが判った毒素［６７ ］と関連のある６９　ｋｄ　ＯＭＰのような精製した表面抗原を組み込むのに使 用できた。これらのリポソームを調製するために使用した大豆脂質源は比較的安 価で、ワクチンの大量生産に有利である。 一方百日咳菌の完全な防御には幾つかの抗原に対する免疫応答が必要になると思 われ、将来のワクチンがはっきり規定された精製した成分のみから成るべきであ ると言うのは恐らく誤った独断であろう。経口投与により、粗ワクチンの非経口 投与に関連した、特にＬＰＳに関連した有毒な副作用の多くを避けることができ よう。百日咳毒素に関連した副作用も低減することが期待される。しかし、リポ ソームに組み込む前に調製品をトキソイド化するか、又は最近発表された、免疫 学的には活性であるが生物学的には不活性の百日咳毒素を発現する百日咳菌変異 体［３７１を使用するのが望ましい。全細胞ワクチンを経口投与した１５．００ ０人の幼児の調査結果では、効力は非経口投与の場合と変わらなかったが、経口 投与の場合副反応が実質的に起こらなかった［９１　ことは注目に値する。しか し、経口免疫感捏による免疫の持続期間についてはそれ以上調査されなかった。 結論として、この研究は、百日咳菌表面抗原に対する分泌性抗体の刺激を高める のにリポソーム運搬システムが有用であることを示した。しかし、これがマウス をコロニー形成から保護するのか、又個々の百日咳菌表面抗原用の運搬システム として使用できるかどうか確かめるために更に研究する必要がある。 実験の部Ｂ：治療学的検討 材料と方法 抗原封入小胞の調製 ＦＨＡは以前にサトー（Ｓａｔｏ）等［５０］が報告した百日咳菌Ｔｏｈａｍａ 株から精製した。ＰＴはニス・クリズイー（Ｓ、　Ｃｒｙｚｙ）が親切にも送付 されたものをムノズ（Ｍｕｎｏｚ）等

【３５】の方法により解毒した。Ｌｙｐｈ ａｚｏｍｅ”リポソームは、百日咳菌ＦＨＡとＰＴとを含む小さい多重膜脂質小 胞の特許形態であるが、これをファウシティン・ファーマシューティカルス・イ ンク（Ｆｏｕｎｔａｉｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ　Ｉｎｃ、　）の開 発した溶剤希釈微粒子担体技術［５３ｊを用いてアメリカン・レシチン・カンパ ニ　、　二ニーΦＥ−り（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｌｅｃｉｔｈｉｎ　Ｃｏｍｐａｎ ｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）の精製大豆ホスファチドから調製した。精製した脂質 混合物の組成はホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホス ファチジン酸及び中性脂質で、その比率は約８：１：０．７：０．３であった。 マウスの免疫感作 ５〜６週齢の雌のＢａ１ｂ／Ｃマウス（チャールズ・リヴアー、エムエル、イタ リー（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ、　Ｍｌ、　Ｉｔａｌｙ）を５グループに分 けて経口投与により免疫にし、次の定めにより別々に籠に入れた。グループａ・ 　リポソーム封入ＦＨＡ；　グループｂ：　リポソーム封入ＰＴ：　グループＣ ：リポソーム封入ＦＨＡとリポソーム封入ＰＴ；　グループｄ：遊離のＦＨＡ　 ；　グループｅ：遊離のＰＴ；　グループｆ：遊離のＦＨＡとＰＴ；対照グルー プ：被覆なしのリポソームを用いた免疫。ワクチンの投与は、０日目と４日目に タンパク質を１用量（４μｇ）、次に３００日目追加免疫を同じ用量で実施した 。６〜８時間水を遠ざけたマウスにＰＢＳで希釈したワクチン５０μｌと免疫の 直前に胃の酸性を中和するために添加した等容の重炭酸カルシウムの３％リン酸 塩緩衝液（ＰＢＳ：　ＮａＣ１ｓ、ｏ　ｇ／ｊ’、　ＫＣＩ　２．Ｏｇ／Ｉ！、 　ＮａＪＰＯ４２Ｈ＊０２．Ｏｇ／ｌ。 ＫＨ２ＰＯ４２，Ｏｇ／ｌ　、　ｐＨ８，０）溶液とを徐々ニ与えた。追加免疫 後１０日百計マウスを犠牲にしてサンプルを採取した。犠牲にしたマウスの腕の 動脈を切断して放血し、採取した血清を分離して−２０”Ｃで保存した。肺洗浄 液は気管にカニユーレを挿入し、プロテアーゼインヒビターとして２　ｍＭのフ ェニルメタンスルホニルフルオリドを含む氷冷ＰＢＳ　Ｏ，５ａｈｌｌでゆっく り洗浄して集め、各々のマウスからそれぞれ約０．５ｍｌの肺洗浄液を採取し、 ４℃に於いて１０，０００　Ｘｇで５分遠心してデブリを除き一２０″Ｃで保存 した。 免疫学的技術 ＦＨＡに対するモノクロナール抗体Ｐ１２Ｈ３［１３］　とＰＴサブユニットＳ ｌ　（ＰＩ９）、　Ｓ４／Ｓ５ダブレツト（Ｅ２０５）及びＳ２とＳ３　（Ｐ： ２５１）と反応するモノクロナール抗体の反応混液とをウェスタンプロット法の 実験［５１に使用した。遊離及びリポソームに封入したＦＨＡとＰＴとを電気泳 動用緩衝液と１：１の比率で混合し、タンパク質をラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ） ［３０］の方法に従って、３．８５％のアクリルアミド濃縮用ゲルと１０％のア クリルアミド分離用ゲルとを用いて電気泳動した。半乾燥転移細胞（ＢｉｏＲａ ｄ）を用い、２５ｍＭトリス、グリシン１９２ｍＭ、メタノール２０％（ｐ）Ｉ 　８．３）を転写緩衝液とし、０．３％脂肪ミルクのｌＯ％ＰＢＳ溶液（ｐＨ７ ，４）をブロッキング剤として使用し、タンパク質をニトロセルロース膜（Ｂｉ ｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｓ、　Ｓ、ｒ、１．、　Ｍｌ、Ｉｔａｌｙ）に転写した。ブ ロックした膜に、第１の抗体、即ちＰＩ３）１３とＰＩ９．　Ｅ２０５．　Ｅ２ ５１（７）ハイブリドーマ上清をＰＢＳてｌ：２０に希釈した反応混液（ｐＨ７ ，４）との両方を加えて２時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄後、ＰＢ Ｓで１：５００に希釈したウマ・ダイコン・パーオキシダーゼ抱合ヤギ抗マウス 　［ｇＧ　（サザン・バイオテクノロジー・アソシェイッ・インク。 バーミンガム、アラバマ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ａ ｓ５ｏｃｉａｔｅｓ　Ｉｎｃ、。 Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｎ＋、　Ａｌａ、）　）を加えて膜を１時間インキュベート し、膜の洗浄後、４−クロロ−１−ナフトールを基質として使用して発色させた 。 プレ染色の分子量標識はパイオーラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）から購入した。 血清及び肺洗浄液中に存在するＦＨＡ及びＰＴに対するサブクラス特異性抗体を 測定するために、エンザイムリングドイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ） を次のように実施した。Ｎｕｎｃ　Ｍａｘｉｓｏｒｐ　［ｍｍｕｎｏ−ｍｏｄｕ ｌｅの９６ウエルのプレートを０．　Ｉ　Ｍ　ＮａＨＣＯｓで希釈したＦＨＡ又 はＰＴ　（ｐＨ９，６，ウェル当たり５０μｌ中６０ｎｇ、４°ｃで１晩インキ ユベート）で被覆し、ウェルをコウシ胎児血清（Ｆｅ３．　フロラ・ラボラドリ ース・インク、イルヴアイン、ユナイテッド・キングダム（ＰｌｏｗＬａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、、［ｒｖｉｎｅ、　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎｇｄｏｍ） の１０％ＰＢＳ溶液１００μｌで３７℃で２時間ブロッキングした。続いてプレ ートをＰＢＳで３回洗浄し、Ｆｅ２の１０％ＰＢＳ溶液で１＝５０に希釈した血 清サンプル又は１：１０に希釈した肺洗浄液を各ウェルに１００μβずつ加えた 。３７°Ｃで６０分放置後にプレートを再び洗浄し、［ｇＧ、［ｇＭ又はＩｇＡ 重鎖に対するアルカリ性ホスファターゼ抱合ヤギ抗マウス抗体をＦｅ２の１０％ ＰＢＳ溶液で１：５００に希釈して各ウェルに１００μｌずっ加え、３７℃で２ 時間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、基質溶液（ｐ−ニトロフェニ ルホスフェイトジナトリウム塩の１０ｍｇ／ｍ　ｌジェタノールアミン緩衝液溶 液、ｐＨ９，８）を各ウェルに１００μｌずっ加えて発色させた。室温で３０分 後、３．ＯＭ　ＮａＯＨ５０μｌを加えて反応を停止し、ティドーリチック・マ ルチスキャン　ＭＣＣマイクロプレート・リーダー（Ｔｉｔｒｅｔｅｋ　Ｍｕｌ ｔｉｓｋａｎ　ＭＣＣｍ１ｃｒｏｐｌａｔｅ　ｒｅａｄｅｒ）　（Ｆｌ。 Ｗ）によりＡ４゜６を測定した。全てのサンプルを同時に同じ日に処理し、各血 清又は各肺洗浄液のサンプルを別個にアッセイし、ＥＬＩＳＡ測定の空試験には 抗原を含まないリポソームで免疫にしたマウスの血清又は肺洗浄液を用いた。結 果は各免疫グループ毎の平均値で示した。標準偏差は各グループ内の個々のマウ スサンプルの間のばらつきである。 電子顕微鏡検査 被覆なし、ＦＨＡ−被覆及びＰＴ−被覆リポソームを酢酸ウラニルの４％水溶液 （ｐＨ４，５）を用いてヴアレンタイン（Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ）等［６０］の方 法により負に染色した。金属シャドウィングには、３００メツシユのニッケル製 グリッドを覆った新たに調製したコロジオンの上にリポソームを吸収させ、蒸留 水で洗浄、風乾後、白金で１５°の角度に一方向金属シャドウイングを行った。 免疫電子顕微鏡法では、被覆なし又は抗原で被覆したリポソームを３００メツシ ユのニッケル製グリッドを覆った新たに調製したコロジオンの上に吸収させて、 蒸留水で注意して洗浄した。室温で風乾後グリッドをタンパク質１１製抗−ＦＨ Ａ又はＰＴポリクロナール又はモノクロナール抗体（ＩｇＧ　１．２５μｇ／タ ンパク質ｍｆ）で室温で６０分処理した。結合していない抗体をプラスチック瓶 からＰＢＳ（ｐＨ６，９）を穏やかにスプレーして除き、タンパク質Ａ・全複合 体（金粒子径１０　ｎｍ、　０．０１のＡｃｔ。）を滴下してグリッドを室温で １５分インキュベートして、結合した抗体を電子顕微鏡で見えるようにした。次 にグリッドを先ず０．０１％のＴｗｅｅｎ　２０を含むＰＢＳ、次に蒸留水で洗 浄した。風乾後、グリッドを白金で一方向（１５°の角度）に金属シャドウィン グするか、或いは金属シャドウィングなしで調べた。対照試験には、精製したプ レ免疫の血清又はタンパク質Ａ・全複合体だけてサンプルを処理した。標識のボ スト包理には、連続温度低下法に従ってＬｏｗｉｅｒｙｌ　Ｋ４Ｍ樹脂を用い標 識プロトコルを記載通りに適用して百日咳毒素リポソームを包理した［６４］。 サンプルをＺｅｉｓｓの電子顕微鏡ＥＭ　ＩＯＢを用い、８０　ｋＶの加速電圧 で、検定した拡大率により調べた。 実験の部Ｂの結果 ＦＨＡとＰＴとを含むリポソームの大きさの測定ＦＨＡとＰＴで被覆したリポソ ームの大きさはコールタ−・カウンター・モデル（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｃｏｕｎｔ ｅｒ　ｍｏｄｅｌ）　Ｎ４Ｍ　ＰＴを用いて分析した。 空試験及びＦｌ（Ａ又はＰＴで被覆したリポソームの平均直径は、それぞれ２２ ７　ｎｍ（９５％が２１１〜２４３　ｒ＋ｍの範囲）、２３６　ｎｍ　（９５％ が２１９〜２５３　ｎｍの範囲）及び２４４　ｎｍ　（９５％か２２６〜２６２ 　ｎｍの範囲）であった。 このデータから、リポソームにＦＨＡ又はＰＴを封入してもその平均直径にはあ まり影響しないことが判る。 ＦＨＡとＰＴとを含むリポソームのウェスタンプロット分析小胞中のＦＨＡとＰ Ｔとの存在を、ウェスタンプロット分析（図８）により、Ｐ１２Ｈ３モノクロナ ール抗体（レーン２．３．４）とＰＴサブユニット５１−４に対するハイブリド ーマ上清の反応混液（レーン２゜５．６）とを使用して確認した。遊離のＰＨＡ とＦＨＡ−被覆リポソームとの間のＦＨＡ含有量の差異は認められなかった（レ ーン３．４）が、遊離ＰＴとリポソームに組み込んだＰＴとの間にははっきりし た差異が見られた（レーン５．６）。これはＳｌ／Ｓ４とＳ２／Ｓ３とのそれぞ れに特異性のモノクロナール抗体の結合親和力に相違があるのが、リボソームへ のＳｌと５４１５サブユニツトの組込みが優先するのかのいずれかであると思わ れる。空試験の被覆なしのリポソームの中にはタンパク質は検出されなかった（ レーン２）。 ＦＨＡとＰＴとを含むリポソームの免疫電子顕微鏡分析被覆なし、ＦＨＡ−被覆 及びＰＴ−被覆のリポソームの電子顕微鏡検査から、これらのリポソームは大き さの異なる多重膜小胞であることが判明した（図９．Ａ、　Ｂ、　Ｃ，図３．Ａ ）。しかし、ＦＨＡ−被覆及びＰＴ−被覆のリポソームは被覆なしのリポソーム に比べてその形態学的外観を異にする（図９Ａと８７図９Ａと図１ＯＡとの比較 ）。これは恐ら＜　ＦＨＡ、　ＰＴのリポソームへの組込みによるものである。 ＦＨＡ−被覆リポソームを先ず抗−Ｆｌ（Ａポリクロナール又はモノクロナール 抗体、次にタンパク質Ａ・全複合体によりインキュベートした所、ＦＨＡ−リポ ソームの表面に強い標識化パターンを生じた（図９ＤとＥ）。モノクロナールの 方が標識化は軽度であった（データは記載せず）。 ＰＴ−被覆リポソームのポリクロナール抗ＰＴ抗体によるインキュベーションで の標識化パターンはＦＨＡ−被覆リポソームの場合より遥かに弱かった（図９． Ｄと図１０．８との比較）。標識強度がバックグラウンド標識より僅かしか強く なかったこともあったので、ポスト包理標識化によりＰＴかリポソーム膜の上で 検出できることを示そうと試みた。従来の方法ではリポソームの外側に付着した 抗原反応部位だけが検出でき、リポソーム膜の内側に存在する部位は検出できな かった。図１０．　Ｄは膜の周囲の標識を示すリポソームの図であり、ＰＴが外 側の膜に組み込まれたことを示している。照合試験（図９．Ｆと図１０．　Ｃ） ではごく僅かの金粒子しか検出されなかった。 予防接種したマウス中の百日咳菌ＦＨＡとＰＴとに対して特異な抗体応答 遊離のＦＨＡとＰＴ、及びＰＴとＦＨＡ抗原封入リポソーム原型ワクチンの両方 が特異性血清及び粘膜抗体応答を誘発した（図１０．１１）。 ＦＨＡ又はＰＴを全体で１２μｇの用量を等量ずつ３回に分けて経口投与して免 疫にしたマウスには、全身性（主としてＩｇＧ）と肺分泌性（主としてＩｇＧと ＩｇＡ　）の抗体応答が得られた（図１０ＡとＢ）。ＦＨＡを封入したリポソー ムで免疫にしたマウスには遊離のタンパク質を経口投与して免疫にしたマウスに 比べて約３倍の抗体力価が存在していることから、リポソームをベースにしたシ ステムのアジュバント活性がＦＨＡの場合に確認された（図１０）。遊離及びリ ポソームに封入したＰＨＡとＰＴとを同時にワクチンとして投与した場合抗ＰＨ Ａ抗体応答は阻害されなかった。肺洗浄液中に検出されたＦＨＡに特異のＩｇＭ の力価は僅かであった（データは記載せず）。 ＰＴによる免疫によっても同様な結果か得られた（図１１ＡとＢ）。 ＦＨＡの場合と同様に、両方のタンパク質（ＦＨＡとＰＴ）による同時免疫感作 は良い抗ＰＴ抗体応答を与えた。 実験の部Ｂの考察 百日咳に対する現在の非経口ワクチンは、感染を防ぐよりも臨床での百日咳の防 御に有効である。しかし、新たな安全なワクチンを考える場合、免疫感作の方策 を再考し、呼吸気管が百日咳感染の入口であることと、粘膜レベルでの有効な応 答を刺激するワクチンには感染を防止する可能性があることとを考慮に入れるの が適切であると思われる。分泌性１ｇＡと特異性１ｇＧ　（血清から毛細管を通 しての滲出により得られ、呼吸器官下部の主な１ｇ）が初期段階の細菌の付着と コロニー形成とを妨げ、それによって病気の根絶を容易にすることができるよっ てある。 経口及び非経口の経路で投与された抗原のプロセシングには、抗原の特異性と１ ｇクラスの特性に関して相違があり［２，６，２７，５８］　、［ｇＡ応答がワ クチン経口投与の典型である。バイエル板を被覆する特殊型Ｍ細胞は抗原性物質 を上皮細胞の下のリンパ球まで通過させ、そこでプロセシングされた抗原がＩｇ Ａ前駆Ｂ細胞に供与される。このＢ細胞はリンパ管システムを経由して種々の粘 膜まで移動し、そこでＩｇＡ分泌プラズマ細胞を産生ずる。Ｔリンパ球はバイエ ル板のにその帰着パターン（ｈｏｍｉ口ｇ　ｐａｔｔｅｒｎ）を得ることができ よう［５８１゜幾つかの抗原の場合に、粘膜及び全身性の免疫応答か経口投与に よって得られ［２３，２６，５６，６１］　、非経口経路で投与された抗原によ り誘発された免疫応答よりも有効で効力の持続期間が長い。経口投与の百日咳菌 全細胞ワクチンの効果は非経口投与ワクチンと同等である［９］。本発明者等は 最近、サルモネラｓｐｐ、の組換え体ａｒｏＡムタンにより経口的に免疫感作し た後で、ＦＨＡ及びＰＴのＳｔサブユツトに対して特異性肺粘膜応答のあること を示した［２１．６３］。現在の研究は、百日咳菌に対する全身性及び粘膜の免 疫応答が遊離のＦＨＡとＰＴによる経口免疫感作の後に得られることを示すこと によって、前記の観測結果を広げようとしている。ＦＨＡとＰＴとのリポソーム 運搬システムへの封入により、アジュバント効果が得られ、抗体応答を大いに改 善する。抗原の経口投与後の抗原特異性Ｔサプレッサー細胞による耐性と全身性 抑圧、及び特異性分泌性＋ｇＡの既存のレベルによる吸収の問題が報告されてい るが［６，５８］、これらの現象は本発明者等の実験では見られなかった。 Ｆｌ（Ａ−被覆リポソームとＰＴ−被覆リポソームとの両方で免疫にしたマウス の抗体レベルは単一の抗原で免疫にした場合と同じであったことは強調に値する 。従って本発明者等は、最近重要な保護抗原であることが示された百日咳菌の６ ９　ｋＤａ外膜タンパク質を含む多重抗原を運搬するのに本研究が使用し得ると の結論である［３９］。組換え体ＦＨＡを発現する大腸菌株［２ｏ１、ＰＴを過 剰生産するボルデテラ５ｐｐ１株［６４，６９］　、及びＰＴの遺伝的解毒の方 法［４４，６９］が現在利用することができ、リポソームのベースとなるサブユ ニットワクチン用の無毒の全遺伝的成分を高収率で生産することが容易になろう 。事実１次及び２次の免疫応答がリポソームと関連したジフテリア毒素により高 められた［１１ので、幼児のワクチン体制での従来のＤＴＰワクチンを置き換え ることのできる多価ワクチンの出現が予想される。 百日咳菌の感染の防御を仲介する機構はまだ明らかでない。非経口免疫感作とそ の後の体液及び細胞の応答とは常に関連しているとは限らない［４４］。更に、 百日咳の病気を防御するために細胞が仲介する免疫応答が生体内で重要であると 信じられている［７．１４］。リポソームは細胞仲介の免疫性を誘導することが 知られているので、本研究に使用した運搬システムが、文献にある抗体応答に加 えてＦＨＡ及びＰＴに対する細胞仲介応答を誘導するかどうかの確認も興味があ る。 ここで報告した結果は出発点に過ぎない。脂質Ａ、水酸化アルミニウムなどのよ うなアジュバント活性を有することが既知の他の物質の組込みは分泌性＋ｇＡプ ライミングに追加の効果又は相乗的効果を与えるものと思われる（４３，４６］ 。ビタミンＡの投与により経口ワクチン投与後の免疫応答か改善されよう［２１ ゜免疫か得られる期間の長さ、最適の予防接種計画及び刺激後の防御などを含む その他の問題も研究しなければならない。 サブユニットワクチンが侵入部位から離れた箇所の免疫応答を誘発するための運 搬システムとして、リポソームの使用は極めて有望である。経口経路により百日 咳ワクチンに関連して局所的に最も起こり易い副作用を軽減又は除去し、アジュ バント活性が細胞仲介及び体液の免疫応答を高めることができよう。リポソーム は化学的に安定で、生産が容易で、生物により分解される。段階■及び■での試 験にリポソームを使用したがその毒性は報告されていない［１，１７］。更にリ ポソームの生産に使用する安価な原料が生産原価の低減に寄与する。ワクチンの 経口投与はいずれの場合にも非経口予防接種に比へて経費を大幅に削減でき、特 に健康保健対策に金のがかる地方の新開地に於ける予防接種プログラムのキーポ イントである。 ＬＩ　（ＴｈｌＰ−被覆ワクチンの経口及び鼻腔内投与により免疫にしたマウス の肺洗浄液中の百日咳菌ＯＭＰに対する抗体の力価投与経路　１０日後２ １ｇＡ　ＩｇＧ 経口０．１０＋０．０６ｅ０．１１＋０．０５鼻腔内　０．１１＋０．０３　０ ．３５＋０．１７４０日後１ 追加免疫なし１　追加免疫あり ［ｇＡ　ＩｇＧ　ＩｇＡ　ＩｇＧ 経口　ｎｄ’　ｎｄ’　４．６±２．０　６．５±１．１鼻腔内　０．４０＋０ ．１８　０．４８＋０．３５　５．１＋１．５　６．６＋１．５ａ：最初の免疫 後の日数、ｂ＝最初の免疫後３０日日月追加免疫、Ｃ：標準偏差、ｄ：口ｄ＝測 測定ず 炙２　ＬＰＳ−被覆小胞及びＯＭＰ−被覆小胞の経口及び鼻腔内投与後のマウス 肺洗浄液中の百日咳菌ＬＰＳに対する抗体の力価経口　鼻腔内 ＩｇＡ　ＩｇＧ　［ｇＡ　ＩｇＧ ＬＰＳ−小胞　０．０　＋０．０５’　０．３７＋０．１２　０．０　＋０．０ ５　０．４６ｆＯ，２１０ＭＰ−小胞　０．６６＋０．５１　１．１　＋０．３ ４　１．６±０．２３　１．６±０．１４ａ：標準偏差 文献 ［１１アリソン・エイ・シー（Ａｌｌｉｓｏｎ　Ａ、Ｃ，）及びジー・グレゴリ アゾイス（Ｇ、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ）、１９７４、免疫学的アジュバントと してのリポソーム、Ｎａｔｕｒｅ　２５２．２５２゜［２１ビエネンストック・ ジエー（Ｂｉｅｎｅｎｓｔｏｃｋ　Ｊ、）及びエイ・ディー・ビフス（Ａ、Ｄ、 Ｂｅｆｕｓ）、１９８０、Ｍｕｃｏｓａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　４１：２ ４９−２７０゜［３１ブラウンシー・アール・エム（Ｂｒｏｗｎｌｊｅ　Ｒ，Ｍ 、）、ジエイ・ジー・コート（Ｊ、　Ｇ、　Ｃｏｏｔｅ）及びアール・バートン （Ｒ，Ｐａｒｔｏｎ）、１９８５、百日咳菌の表現型変化の間のアデニル酸シク ラーゼ活性、Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１３１．２７−３８゜［ ４１ブロウ・アール（Ｂｕｌｏｗ　Ｒ，）及びジエイ・シー・ブースロイド（Ｊ 、　Ｃ，Ｂｏｏｔｈｒｏｙｄ）、　１９９１．リポソーム中のｐｓｏ抗原の免疫 感作による致命的トキソプラズマ症病原体感染に対するマウスの防御、Ｊ、　１ ｍｍｕｎｏ１．１４７：３４９６−３５００゜［５１バーネット・ダヴリュ・エ ヌ（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ　Ｗ、Ｎ、）、１９８１、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリ アクリルアミドゲルからのタンパク質の未修飾ニトロセルロースへの　１ウエス タンプロツト法１電気泳動転写及び抗体と目″Ｉ標識タンパク質Ａとを用いたラ ジオグラフによる検出、Ａｎａｌｙｔ、Ｂｉｏ−ｃｈｅｍ、１２１：１９５−２ ０３゜［６１クゼールキンスキー・シー（Ｃｚｅｒｋｉ口ｓｋｙ　Ｃ，）、ニス ・ジエイ・プリシス（Ｓ、Ｊ、Ｐｒ１ｎｃｅ）、　ｘス−１ム・ミカレク（Ｓ、 　Ｍ、　Ｍｉｃｈａｌｅｋ）。 ニス・ジャクソン（Ｓ、　Ｊａｃｋｓｏ口）、　エム・ダヴリュ・ラッセル（Ｍ 、　Ｗ、　Ｒｕ５ｓｅｌｌ）、ゼット・モルドヴイーヌ（Ｚ、　Ｍｏ１ｄｏｖｅ ａｎｕ）、ジエイ・アール・マツクギ−（Ｊ、　Ｒ，ＭｃＧｈｅｅ）　及びジエ イ・メステｔ−−（Ｊ、Ｍｅｓｔｅｃｋｙ）、　１９８７、末梢血液ａＲｅｒ抗 原摂取でのＩｇＡ抗体産生細胞：ヒトの共通粘膜免疫システムに対する証拠、Ｐ ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ。 ８４・２４４９−２４５３゜ ［７］　Ｆ・マシス）’Ｊス・ティー−ｚム（ＤｅＭａｇｉｓｔｒｉｓＴ、Ｍ、 ）、エム・ロマバＭ、Ｒｏｍａｎｏ）、　ｆ−ス・ヌイ（Ｓ、Ｎｕｔｉ）、　７ −）Ｌｔ　・ラップｔ　ＩＪ（Ｒ，Ｒａｐｐｕｏｌｉ）及びエイ・タグリアブー （Ａ、Ｔａｇｌｉａｂｕｅ）、１９８８、ボルデテラ属に対する切開ヒトＴ細胞 応答、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１６８：１３５１−１３６２゜ ［８１デシデリオ・ジエイ・ケイ（Ｄｅｓｉｄｅｒｉｏ　Ｊ、Ｖ、）　及びニス ・ジー・キャンベル（Ｓ、Ｇ、Ｃａｍｐｂｅｌｌ）、　１９８５、リポソーム会 合。抗原による実験マウスのサルモネラ症に対する免疫、１ｎｆｅｃｔ、［ｍ− ｍｕｎ、　４８：６５８−６６３゜ ［９１フォーク・ダヴリュ（Ｆａｌｋ　Ｗ、）、ケイ・エイチ・ポフラー（Ｋ。 Ｈ，Ｈｏｆ　１ｅｒ）、ケイーロザネリ（Ｋ、　Ｒｏｓａｎｅｌｌｉ）及びアー ル・クルッ（Ｒ。 Ｋｕｒｚ）、　１９８１　、経口百日咳予防接種の現在と将来、Ｆｏｒｔｓｃｈ ｒ、　Ｍｅｄ。 ９９：ｌ３６３−１３６６゜ ［１０ｊ　フランシス・エム・ジエイ（Ｐｒａｎｃｉｓ　Ｍ、　Ｊ、　）、　シ 町エム・フラー（Ｃ，Ｍ、　Ｆｒｙ）、ディー・エル−ｏ−ラング（Ｄ、１．Ｒ ｏｗｌａｎｄｓ）、　ｘフ・ブラウン（Ｆ、　Ｂｒｏｗｎ）、ジエイ・エル・ピ ッチル（Ｊ、Ｌ、Ｂｉｔｔｌｅ）、　７−ル・エイ・ホーフテン（Ｒ，Ａ、　Ｈ ｏｕｇｈｔｅｎ）　及びアール・エイ・ラーナー（Ｒ，Ａ、Ｌｅｒｎｅｒ）、　 １９８５、口蹄疫ウィルスの合成ペプチドによる免疫学的ブライミング、Ｊ、Ｇ ｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、６６：２３４７−２３５４゜［１１］　ファイン・ビ町イー ・エム（Ｆｉｎｅ　Ｐ、Ｅ、Ｍ、）　及びジエイ・エイ・クラーク（Ｊ、　Ａ、 　Ｃ１ａｒｋｓｏｎ）、１９８２、百日咳の再発：ワクチンノ効能の評価に対す る関連性、Ｌａｎｃｅｔ　１．　６６６−６６９゜［１２］　ファイン・ビー・ イー・エム（Ｆｉｎｅ　Ｐ、　Ｅ、　Ｍ、　）及びジエイ・エイ・クラーク（Ｊ 、Ａ、Ｃ１ａｒｋｓｏｎ）、　１９８７、百日咳ワクチンの効能中の反射、Ｒｅ ｖ、［ｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、９：８６６−８８３゜［１３１フランク・ディー・ ダヴリュ（Ｆｒａｎｋ　Ｄ、Ｗ、）　及びシー・ディー・パーカー（Ｃ，Ｄ、Ｐ ａｒｋｅｒ）、　１９８４、百日咳菌に対するモノクロナール抗体の分離とキャ ラクタリゼーション、Ｊ、Ｂｉｏｌ、５ｔａｎｄ、　１２：３５３−３６５゜ ［１４］　キ７　ＩＪ　ング・エイ・ジエイ・エイチ（Ｇｅａｒｉｎｇ　Ａ、Ｊ 、Ｈ，）、シーアール・バード（Ｃ，Ｒ，Ｂｉｒｄ）、ケイ・リードヘッド（Ｋ 、　Ｒｅｅｄｈｅａｄ）　及びエム・トーマス（Ｍ、Ｔｈｏｍａｓ）、　１９８ ９、百日咳菌感染に対するヒトの細胞免疫応答、ＦＢＭＳ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ ｌ、［ｍｍｕｎｏｌ、　４７＋２０５−２１２゜［１５１ギアマンコ・エイ（Ｇ ｉａｍｍａｎｃｏ　Ａ、）、エイ・シャリーニ（Ａ、Ｃｈｉａｒｉｎｉ）、ティ ー・ストロフオリー＝（Ｔ、５ｔｒｏｆｆｏｌｉｎｉ）、ディー・トーｖティア （Ｄ、Ｄｅ　ＩＪａｔｔｉａ）、エム・シャラーノンテ（Ｍ、　Ｃｈｉａｒａｒ ｎｏｎｔｅ）、エム・イー・モジエン（Ｍ、　Ｅ、　Ｍｏ５ｃｈｅｎ）　、アイ ・ムラ（１，Ｍｕｒａ）。 ジー・リボ（Ｇ、Ｒｉｇｏ）、　ニス・タオルニナ（Ｓ、Ｔａｏｒｒｎｉｎａ） 、−Ｔ−イ・サルザナ（Ａ、　５ａｒｚａｎａ）、ジー・マッツｙ　（Ｇ、　Ｍ ａｚｚａ）及びビー・スカルパ（Ｂ、５ｃａｒｐａ）、　１９９１、イタリアに 於ける百日咳の血清疫学、Ｒｅｖ、　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、１３：１２１６− １２２０゜［１６１グ・ソドマン・ワイ・イー（Ｇｏｏｄｍａｎ　Ｙ、巳、）、 エイ・ジエイ・ウォート（Ａ、　Ｊ、　Ｗｏｒｔ）　及びエフ・エル・ジャクラ ン（Ｆ、　Ｌ、　Ｊａｃｋｓｏｎ）（１９８１）、最近の感染の指標としての鼻 咽頭腔分泌中の百日咳免疫グロブリンＡの検出用のエンザイムリンクトイムノソ ルヘントアツセイ。 Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、＋３：２８６−２９２゜［１７１グレゴ リアゾイス・ジー（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ　Ｇ、）、　１９９０、免疫学的ア ジュバント・リポソームに対する役割、［ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ、　 １１：８９−９７゜ ［１８１グレゴリ−・アール・エル（Ｇｒｅｇｏｒｙ　Ｒ，Ｌ、）、−１−ス・ エム・ミカレク（Ｓ、　Ｍ、　Ｍｉｃｈａｌｅｋ）、ジー・リチャードソン（Ｇ 、　Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）、シー・ハーモン（Ｃ，Ｈａｒｍｏｎ）、ティー・ ヒルトン（Ｔ、　Ｈｉｌｔｏｎ）及びジェイ・アール・マツクギ−（Ｊ、Ｒ，Ｍ ｃＧｈｅｅ）、　１９８６、リポソーム中の連鎖球菌５ｏｂ−ｒｉｎｕｓ　ｒｉ ｂｏｓｏｍａｌ調製品の経口投与に対する免疫応答のキャラクタリゼーション、 １ｎｆｅｃｔ、［ｍｍｕｎ、　５４ニア８０−７８６゜［１９］　グリフイス・ イー（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ　Ｅ、）　（１９８８）　、全細胞百日咳ワクチンの 効能、書籍［百日咳に於ける病原性と免疫（Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄ　 Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　ｉｎ　Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）Ｊ　（編者　エイ・シー・ワー ドロウ（Ａ。 Ｃ，Ｗａｒｄ　ｌａｗ）　及びアール・バートン（Ｒ，Ｐａｒｔｏｎ））　３５ ３−３７４頁、出版社Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ　Ｌｔｄ、　Ｇ ｕｉｌｄｆｏｒｄ、　Ｕ、Ｋ。 ［２０１グツマン・シー・エイ（ＧｕｚｍＡｎ　Ｃ，Ａ、　）、エム・ジェイ・ ウォーカー（Ｍ、Ｊ、Ｗａｌｋｅｒ）、　−１−ムーｏ−ド（Ｍ、　Ｒｏｈｄｅ ）及びケイ・エフ・ティミス（Ｋ、Ｎ、Ｔｉｍｍ１ｓ）、　１９９１、大腸菌及 びネズミチフス菌ａｒｏＡ中の百日咳菌繊維状血球凝集素の直接発現、Ｉｎｆｅ ｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、　５９：３７８７−３７９５゜ ［２１１グツマン・シー−エイ（Ｇｕｚｍａｎ　Ｃ，Ａ、）、アール−エム・ブ ラウンジー（Ｒ，Ｍ、　Ｂｒｏｗｎ　ｌ　ｉｅ）、　ジエイ・カデュラガムワ（ Ｊ、　Ｋａｄｕｒｕｇａｍｕｗａ）、エム・ジエイ・ウォーカー（Ｍ、　Ｊ、Ｗ ａｌｋｅｒ）及びケイ・エフ・ティミス（Ｋ、Ｎ、Ｔｉｍｍ１ｓ）、　１９９１ ．ネズミチフス菌ａｒｏＡ及び百日咳菌の繊維状血球凝集素を発現する侵入性大 腸菌株による経口免疫感作後のマウスの肺の中の抗体応答、［ｎｆｅＣｔ、Ｉｍ ｍｕｎ、　５９：４３９１−４３９７゜［２２１ホウラン・シー・ビー（Ｈｏｗ ｓｏｎ　Ｃ，Ｐ、）及びエイチ・ケイ・フィンベルブ（Ｈ，Ｖ、Ｆｉｎｅｂｅｒ ｇ）、　１９９２、百日咳及び風疹ワクチン接種後の副作用：医学学会の報告の 要約、ＪＡＭＡ　２６７・３９２−３９６゜［２３］　Ｅ　ハ：／セン・エイチ （Ｊｏｈａｎｓｅｎ　Ｈ，）、エフ・ホイビー（Ｎ、Ｈｏ１ｂｙ）及びニス−ニ ス・ペブルセン（Ｓ、Ｓ、Ｐｅｄｅｒｓｅｎ）、　１９９１．緑膿菌アルギン酸 塩による実験的免疫がＩｇＡ及び［ｇＧ抗体応答を誘発、ＡＰＭ　［Ｓ、９９： １０６１−１０６８゜ （２４１カール・エル・ビー（ＫａｈＬ　Ｌ、Ｐ、）、アール・レルチャック（ １’ｌ。 Ｌｅｌｃｈｕｋ）、シー・エイ・スコツト（Ｃ，Ａ、５ｃｏｔｔ）及びジエイ・ ビーズレイ（Ｊ、Ｂｅｅｓｌｅｙ）、１９９０、ＢＡＬＢ／Ｃマウスを皮膚リー シ、７＝７症から保護するリーシュマニア主要抗原リポソームのキャラクタリゼ ーンヨン、５８：３２３３−３２４１゜ ［２５］　カール・エル・ビー（Ｋａｈｌ　Ｌ、Ｐ、）、シー−エイ・スコツト （Ｃ。 Ａ、　５ｃｏｔｔ）、アール・シルチー１−ツク（Ｒ，Ｌｅｌｃｈｕｋ）、ノー ・グレゴリアゾイス（Ｇ、　Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ）及びエフ・ワイ・リウ（ Ｆ、Ｙ、Ｌｉｅｗ）、　１９８９、リーシュマニア主要抗原／リポソームを使用 したマウスの皮膚り一シュマニア症に対する予防接種、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　 １４２＋　４４４１−４４４９゜［２６］　カンチル・エイ（Ｋａｎｔｅｌｅ　 Ａ、）、　−１−イチ・アヴリロミ（Ｈ，Ａｖｒｉｌｏｍｍｉ）及びアイ・ヨキ ネン（１，Ｊｏｋｉｎｅｎ）、１９８６、チフス菌に対する経口予防接種後の特 異性免疫グロブリンを分泌するヒトの血液細胞、Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、１ ５３：１１２６−１１３１゜［２７］　カンチル・エイ（Ｋａｎｔｅｌｅ　Ａ、 ）、　エイチ・アヴリロミ（Ｈ，Ａｖｒｉｌｏｍｍ　ｉ　）　、ジェイ・エム・ カンチル（Ｊ、Ｍ、Ｋａｎｔｅｌｅ）、エル・リンタラ（Ｌ、　Ｒｉｎｔａｌａ ）及びビー・エイチ・メカラ（Ｐ、　Ｈ，Ｍｅｋｅｌａ）、１９９１、生の、滅 菌した経口、滅菌した非経ロチフス菌Ｔｙ２１ａワクチンに対するヒトの免疫応 答の比較、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ、Ｐａ−ｔｈｏｇｅｎ、　ＩＯ：１１７−１２６ ゜［２８１ケラト・ケイ（Ｋｅｔｔ　Ｋ、）、ビー・ブランドツァエグ（Ｐ、　 Ｂｒａｎｄｔｚａｅｇ）、ジエイ・ランドル（Ｊ、　Ｒａｄｌ）及びノエイ・エ フ・ハーイジマン（Ｊ、Ｆ、Ｈａａｉｊｍａｎ）、　１９８６、ヒトのリンパ系 器官及び種々の分泌組織に於ける［ｇＡ産生細胞の異なるサブクラスの分布、Ｊ 、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３６：３６３１−３６３５゜ ［２９１キムラ・エイ（Ｋｉｍｕｒａ　Ａ、）、ティー・マウントゾウロス（Ｔ 、　Ｍｏｕｎｔｚｏｕｒｏｓ）、ディー・エイ・レルマン（Ｄ、　Ａ、　Ｒｅｌ ｍａｎ）、ニス・ファルコウ（Ｓ、　Ｆａｌｋｏｗ）　及びジエイ・エル・コラ エル（Ｊ、　Ｌ、　Ｃｏｗｅｌｌ）、　１９９０、百日咳繊維状血球凝集素：マ ウスの呼吸感染モデルに於ける保護抗原及びコロニー形成因子としての評価、Ｉ ｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　５８ニア−１６゜［２０］　ラエムリ・ニー・ケ イ（Ｌａｅｍｍｌｉ　Ｕ、に、）　１９７０、バタテリオファージＴ４の頭部の 構築の際の構造タンパク質の切開、Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０−６８５゜ ［３１１ラーソン・イー（Ｌａｒｓｏｎ　Ｅ、）、ビー・ホーレット（Ｂ、　Ｈ ｏｗｌｅｔｔ）及びエイ・ジャゲンドルフ（Ａ、Ｊａｇｅｎｄｏｒｆ）、１９８ ６、タンパク質測定用Ｌｏｗｒｙ法の人工還元剤増強、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、＋５５：２４３−２４８゜［３２１メステラキー・ジエイ（Ｍｅｓｔｅｃｋ ｙ　Ｊ、）、１９８７、共通の粘膜免疫システムと外部分泌中に免疫応答を誘発 するための最近の方策、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、［ｍｍｕｎｏｌ、７：２６５−２７６゜ ［３３１ミラー・ディー・エル（Ｍｉｌｌｅｒ　Ｄ、Ｌ、）、アール・アルダ− スレイト（Ｒ，Ａｌｄｅｒｓｌａｄｅ）及びイー・エム・ロス（Ｅ、ＩＪ、Ｒｏ ｓｓ）、　１９８２、百日咳と百日咳ワクチン：危険と恩恵の討論、Ｅｐｉｄｅ ｍｉｏｌ、Ｒｅｖ、４＋１−２４゜［３４１ミューシー・エイ・ニス（Ｍｕｌｌ ｅｒ　Ａ、Ｓ、）、ジエイ・リーウヴエンブルク（Ｊ、　Ｌｅｅｕｗｅｎｂｕｒ ｇ）及びディーニス・ブラット（Ｄ、　Ｓ、　Ｐｒａｔｔ）。 １９８６、百日咳　疫学と規制、Ｂｕｌｌ、　ＷＨｏ、　６４：３２１−３３１ ゜［３５］　ムノズ・ジエイ・ジエイ（Ｍｕ口ｏｚ　Ｊ、Ｊ、）、エイチ・アラ イ（Ｈ，Ａｒａｉ）　及びアール・エル・コール（Ｒ，Ｌ、Ｃｏ１ｅ）、　１９ ８１、百日咳菌がらの百日咳の房状の血球凝集素のマウス防御、ヒスタミン感作 活性、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、　３２：２４３−２５０゜１３６］　ネトラ ド・ジエイ・ジー（Ｎｅｄｒａｄ　Ｊ、　Ｇ、　）、エックス・ビー・リャン（ Ｘ、　−Ｐ、　ｌｊａｎｇ）及びエム・イー・ラム（Ｍ、　Ｅ、　Ｌａｍｍ）、 　１９８９、マウスのセイダイウィルスによる経口免疫感作、Ｃｕｒｒ、Ｔｏｐ ｉｃ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１４６：１１７−１２２゜ ［３７］　ネンシオニ・エル（Ｎｅｎｃｉｏｎｉ　Ｌ、）、エム・ピザ（Ｍ、　 Ｐｉｚｚａ、）。 エム・ブグノル（Ｍ、　Ｂｕｇｎｏｌｌ）、ティー・ド・マンストリス（Ｔ、Ｄ ｅ　Ｍａｇｉｓｔｒｉｓ）、　エイ・ディ・トマソ（Ａ、Ｄｉ　Ｔｏｍｍａｓｏ ）、　エフ・ジョヴアンニ（Ｆ、　Ｇｉｏｖａｎｎｏｎｉ）、アール・マネッテ ４−　（Ｒ，Ｍａｎｅｔｔｉ）、アイ・マルノリ（［、Ｍａｒｓｉｌｉ）、ジ・ マチウシ（Ｇ、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ）、ディー・ヌッシ（Ｄ、　Ｎｕｃｃｉ）、 アール・オリケイエリ（Ｒ，０１ｉｖｉｅｒｉ）、ビー・ピレリ（Ｐ、　Ｐｉ　 １ｅｒｉ）、アール・プレゼンティ−−１−（Ｒ，Ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｉ）、　 −Ｌル・ケイラ（Ｌ、　Ｖｉ　Ｉ　ｌａ）、　ジェイ・ジー・フリーテンベルブ （Ｊ、　Ｇ、　Ｋｒｅｅｔｅｎｂｅｒｇ）、ニス・シルヴエストリ（Ｓ、５ｉｌ ｖｅｓｔｒｉ）、エイ・タグリアブー（Ａ、　Ｔａｇｌｉａｂｕｅ）及びアール ・ラボウリ（Ｒ，Ｒａｐｏｕｌｉ）、　１９９０．普通は不活性の百日咳毒素変 異体のキャラクタリゼーション二百日咳に対する新しいワクチンの候補、　Ｉｎ ｆｅｃｔ、　［ｍｍｕｎ、　５８：１３０８−１３１５゜［３８１ノイラト・ア ール・エイ（Ｎｅｕｒａｔｈ　Ｒ，Ａ、）、　−ｒ−ス・ビー・ケント（Ｓ、Ｂ 、　Ｋｅｎｔ’）及びエフ・ストリック（Ｎ、５ｔｒｉｃｋ）、　１９８４、肝 炎ＢウィルスのＰｒｅ−３遺伝子コードの免疫支配エピトープの位置と化学的合 成、５ｃｉｅｎｃｅ　２２４：３９２−３９４゜［３９１ノヴオトニー・ビー（ Ｎｏｖｏｔｎｙ　Ｐ、）、　−ｒ−イ・ビー・チュブ（Ａ、　Ｐ。 Ｃｈｕｂｂ）、ケイ・コランレイ（Ｋ、　Ｃｏｗｎｌｅｙ）及びアイ・ジー・チ ャールズ（（、Ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ）、　１９９１　、百日咳菌の６９　ｋＤａ 外膜タンパク質の生物学的、保護的性質：無細胞百日咳ワクチンの新しい製剤、 Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、１６４：１１４−１２２゜［４０１エーランダー ・アール・エム（Ｏｌａｎｄｅｒ　Ｒ，Ｍ、）、エイ・ムオティアラ（Ａ、Ｍｕ ｏｔｉａｌａ）、　１ム・カルヴオネン（Ｍ、　Ｋａｒｖｏｎｅｎ）、ティー・ クロンネン（Ｔ、　Ｋｕｒｏｎｅｎ）及びケイ・ルネベルグーニマン（Ｋ、　Ｒ ｕｎｅｂｅｒｇ−Ｎｙｍａｎ）、　１９９０　、百日咳菌Ｔｎ５変異体、二つの 異なるマウス系統の精製したＰＴとＦＨＡ及びマウスの鼻腔内感染モデルでの受 動免疫に対する血清抗体応答、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ、Ｐａｔｈｏｇｅｎ、　８： ３７−４５゜［４１１オーリン・ビー（Ｏｌｉｎ　Ｐ、）及びジェイ・ストアサ エター（Ｊ、　５ｔｏｒｓａｅｔｅｒ）、　１９８９、無細胞百日咳ワクチンの 効能、Ｊ、　Ａｍｅｒ、　Ｍｅｄ、　Ａｓ５ｏｃ、２６１：５６０−５６２゜ ［４２１ペブシー・エム・ニス（Ｐｅｐｐｌｅｒ　Ｍ、Ｓ、）、　１９８４、百 日咳菌の株の二つの物理的、血清学的に異なるリボ多糖とその表現型変種、Ｉｎ ｆｅｅｔ、　［ｍｍｕｎ、４３：２２４−２３２゜［４３１ピエーセ・エフ・エ フ（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｎ、Ｆ、）及びジェイ・ビー・サツシ・ジュニア（Ｊ、Ｂ、 　５ａｃｃｉ　Ｊｒ、）　１９８４、脂質Ａによるリポソーム会合コレラ毒素の 粘膜免疫原性の増強、Ｒｅｖ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、　６：５６３−５６ ６゜［４４１ボダ・エイ（Ｐｏｄｄａ　Ａ、）、　−Ｌル・ネンシオニ（Ｌ、　 Ｎｅｎｃｉｏｎｉ）、ティ・エム・ド・マンストリス（Ｔ、Ｍ、Ｄｅ　Ｍａｇｉ ｓｔｒｉｓ）、エイ・ディ・トマ゛バＡ、Ｄｉ　Ｔｏｍｍａｓｏ）、ビー・ブッ ス（Ｐ、Ｂｏｓｓｔ＋）、：Ｌス・ヌテ４（Ｓ、Ｎｕｔｉ）、ビー・ピレリ（Ｐ 、Ｐｉｌｅｒｉ）、　Ｌス・ペボロ−：（Ｓ、Ｐｅｐｐｏｌｏｎｉ）。 エム・ブグノリ（Ｍ、　Ｂｕｇｎｏｌｉ）、ビー・ルギエロ（Ｐ、　Ｒｕｇｇｉ ｅｒｏ）、エル・マルシリ（Ｌ、Ｍａｒｓｉｌｉ）、エイ・ディエリコ（Ａ、Ｄ ’Ｅｒｒｉｃｏ）、−１−イ・タグリアブー（Ａ、　Ｔａｇｌｉａｂｕｅ）及び アール・ラブオり（Ｒ，Ｒａｐｐｕｏｌ　ｉ）。 １９９０、遺伝的に不活性化した百日咳毒素変異体ＰＴ−９に／１２９Ｇで免疫 にした成人篤志者に於ける代謝体液及び細胞の応答、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１ ７２８６１−８６８゜ ［４５１シーレム・エイ（Ｒｈａｌｅｍ　Ａ、）、シー・ボアディオ（Ｃ，Ｂｏ ｕｒｄｉｅｕ）、ノー・ルフｔ　（Ｇ、　Ｌｕｆ　ｆａｕ）及びビー・ベリー（ Ｐ、Ｐｅｒｙ）、　１９８８、リポソームニ封入したＮｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙ ｌｕｓ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓの成人抗原によるマウスの予防接種、Ａｎｎ 、［ｎｓｔ、Ｐａ５ｔｅｕｒ／Ｉｍｍｕｎｏ１．　＋３９：１５７−１６６゜［ ４６１リチャーズ・アール・エイ（Ｒｉｃｈａｒｄｓ　Ｒ，Ａ、）、−Ｌム・デ ィー・ハイレ（Ｍ、　Ｄ、　Ｈａｙｒｅ）、ダヴリュ・ティー・ホックメイアー （Ｗ、　Ｔ、　Ｈｏｃｋｍｅｙｅｒ）及びシー・アール・アーケイング（Ｃ，Ｒ ，Ａｌｖｉｎｇ）、　１９８８、ボソーム、脂質Ａ、及び水酸化アルミニウムは 合成マラリャスボロゾイト抗原に対する免疫応答を高める、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍ ｍｕｎ、　５６：６８２−６８６゜［４７］　ロバートラン・エイ（Ｒｏｂｅｒ ｔｓｏｎ　Ａ、）、　：Ｌルーエイ・イー・アンスワース（Ｌ、Ａ、Ｅ、Ａｓｈ ｗｏｒｔｈ）、　−ｒ−イ・バスカーヴイル（Ａ、　Ｂａ５ｋｅｒｖｉｌＩｅ） 及びエル・アイ・アイアンス（Ｌ、１．Ｉｒｏｎｓ）、１９８５、百日咳菌によ るマウスの鼻腔内感染に対する防御、Ｄｅｖｅｌｏｐ、　Ｂｉｏｌ、　５ｔａｎ ｄａｒｄ。 ６］　：１６５−１７２゜ ［４８１ロバートラン・エイ（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ　Ａ、）、エル・アイ・アイ アンス（Ｌ、　１．　Ｉｒｏｎｓ）及びエル・エイ・イー・アンスワース（Ｌ、 　Ａ、　Ｅ、　Ａｓｈｗ。 ｒｔｈ）、　１９８５、百日咳ワクチン：現状と将来の予想、Ｖａｃｃｉｎｅ　 ３：１１−２２゜ ［４９１ラッセル・ディ・ジー（Ｒｕｓｓｅｌ　Ｄ、Ｇ、）及びジエイ・アレキ サンダー（Ｊ、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ）、　＋９８８、リポソーム中ニ再構成シタ ハツキリ規定した膜抗原による皮膚リーシュマニア症に対する有効な免疫感作、 Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４０：　ｌ’７４−１２７９゜［５０］　サト＝’フ イ（ＳａｔｏＹ、）、シエイーｘルーコウェル（Ｊ、Ｌ、Ｃｏｗｅｌｆ）、　エ イチ・サト（Ｈ，５ａｔｏ）、デ４−−ジーーＡ−スチン（Ｄ、　Ｇ、　Ｂｕｒ ｓｔｙｎ）及びシー・アール・マンクラーク（Ｃ，Ｒ，Ｍａｎｃｌａｒｋ）、　 １９８３、百日咳菌からの血液凝集素の分離と精製、Ｉｎｆｅｃｔ、［ｍｍｕｎ 、　６１：３１３−３２０ｃ＋［５１ｊ　シャヒン・アール・ディー（Ｓｈａｈ ｉｎ　Ｒ，Ｄ、）、エム・ジエイ・ブレナン（Ｍ、　Ｊ、　Ｂｒｅｎｎａｎ）、 ゼット−ｘム・す（Ｚ、　Ｍ、　Ｌｉ）、ビ町ディー・メアデ（Ｂ、　Ｄ、　Ｍ ｅａｄｅ）及びシー・アール−マンクラーク（Ｃ，Ｒ，Ｍａｎｃｌａｒｋ）、　 ＋９９０、百日咳菌の６９　ｋｄ外膜タンパク質の保護容量と免疫原性のキャラ クタリゼーション、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１７１：６３−７３゜［５２１スニ ップ・エイチ（８口１ｐｐｅ　）！、）、ジエイ・イー・ジー・ヴアン・ダム（ Ｊ、　Ｅ、　Ｇ、　ｖａｎ　Ｄａｍ）、ｘイ・ジェイ・ヴアン・ホウテ（Ａ、　 Ｊ、　ｖａｎ　Ｈｏｕｔｅ）、ジエイ・エムーｚヌ・ウィシーズ（Ｊ、　Ｍ、　 Ｎ、　Ｗｉ　Ｉ　１ｅｒｓ）、ジエイ・ビー・カマ−リング（Ｊ、　Ｐ、　Ｋａ ｍｅｒｌｉｎｇ）及びジエイ・エフ・ジー・ヴライジエントハート（Ｊ、Ｆ、Ｇ 、ＶＩｉｅｇｅｎｔｈａｒｔ）、　１９８３、肺炎双球菌タイプ３に対する半合 成ワクチンの調製、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、　４２：８４２−８４４゜ ［５３１スペイン特許２０１３５３１．１９９０．溶剤希釈微粒子担体の調製方 法、１９９０年３月３０日。 ［５４］　ストロバ町ダヴリュ（Ｓｔｒｏｂｅｒ　Ｗ、）及びエム・シ町スネラ −（Ｍ、Ｃ，５ｎｅｌｌｅｒ）、１９８８、ＩｇＡ　Ｂ細胞分化に伴う細胞及び 分子のイベント、Ｍｏｎｏ、Ａｌｌｅｒｇｙ　２４．　ＩＢＭ−１９０゜［５５ ］　サラターリール・ダヴリュ（Ｓｕｔｔｅｒ　Ｒ，Ｗ、）及びニス・エル・コ チ（Ｓ、Ｌ、Ｃｏｃｈｉ）、１９９２、アメリカ合衆国に於ける百日咳の入院加 療数と死亡率＋９８５−１９８８．国内報告の完全性の評価、ＪＡＶＡ　２６７ ：３８６−３９１゜ （５６１スヴエナーホルム・エイ・エム（ＳｖｅｎｎｅｒｈｏｌＯＩＡ、Ｍ、） 、ディー−Ｘイ・サック（Ｄ、　Ａ、　５ａｃｋ）　、　ジエイ・ホルムグレン （Ｊ、　Ｈｏｌｍｇｒｅｎ）及びビー・ケイ・バーダン（Ｐ、に、Ｂａｒｄｈａ ｎ）、１９８２、コレラＢザブユニット３０５−３０８による免疫感作後の腸の 抗体応答、Ｌａｎｃｅｔ　３０５−３０８゜［５７］　トーマス・エム・ジー（ Ｔｈｏｍａｓ　Ｍ、Ｇ、）、イー・エル・エイ・７　ッ：／　ユ’７−　ス（Ｅ 、　Ｌ、　Ａ、　Ａｓｈｗｏｒｔｈ）、イー・ミラー（１３，Ｍｉｌｌｅｒ）及 びエイチ・ビー・ラムバー）（Ｈ，Ｐ、Ｌａｍｂｅｒｔ）、　１９８９　、百日 咳感染後及び全細胞ワクチンによる免疫感作後の百日咳毒素、繊維状血球凝集素 及び凝集原２．３に対する血清１ｇＧ　、　（ｇＡ　、　ＩｇＭの応答、Ｊ、　 Ｉｎｆｅｃｔ。 ＤｉＳ、　１６０：８３８−８４５゜ ［５８］　ト７シ・ジュニア・ティー・ビー（Ｔｏｍａｓｉ　Ｊｒ、　Ｔ、Ｂ、 ）、１９８３、粘膜表面での免疫制御機構、Ｒｅｖ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、　 ５（ｓｕｐｐｌ）：５７８４−３７９２゜ ［５９１ツァイ・シー・エム（Ｔｓａｉ　Ｃ，Ｍ、）及びシー・イー・フラッシ ュ（Ｃ，Ｅ、Ｆｒａｓｈ）、１９８２、ポリアミドゲル中の多糖類の内のりボ多 糖を検出するだめの敏感な銀染色、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１１９：　１ １５−１１９゜［６０１ヴ７レンタイン・アール・シー（Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ　 Ｒ，Ｃ，）、ビー・エム・シャピロ（Ｂ、　Ｍ、　５ｈａｐｉｒｏ）及びイー・ アール・スタットマン（Ｅ、　Ｒ。 Ｓｔａｄｔｍａｎ）、１９６８、グルタミン合成酵素Ｘ■の調節、大腸菌からの 酵素の電子顕微鏡調査、Ｂｉｏｃｈｅｍ　７：２１４３−２１５２゜［６１１ワ クスマン・ディ（Ｗａｃｈｓｍａｎｎ　Ｄ、）、　ジエイ・ビー・クライン（Ｊ 、Ｐ、　Ｋｌｅｉｎ）、エム・スコシー・（Ｍ、５ｃｈｏｌｌｅｒ）、ジェイ・ オギア−（Ｊ、０ｇ１ｅｒ）、エフ・アッカーマンズ（Ｆ、　Ａｃｋｅｒｍａｎ ｓ）及びアール・エム・フランク（Ｒ，Ｍ、Ｆｒａｎｋ）、１９８６、リポソー ムと会合した連鎖球菌変異体炭水化物タンパク質抱合体により経口的に免疫にし たラットでの血清及び唾液の抗体応答、Ｉｎｆｅｃｔ、　［ｍｏ＋ｕｎ、　５２ ：４０８−４１３゜ｔ６２］　ウォーカー・イー（Ｗａｌｋｅｒ　Ｅ、）　、百 日咳の臨床的観点、書籍エイ・シー・ワードロウ（Ａ、　Ｃ，Ｗａｒｄｌａｗ） 及びアール・バートン（Ｒ。 Ｐａｒｔｏｎ）（編者）　、　Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ ｉｔｙ　ｉｎ　Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ　（百日咳の病原性と免疫）、出版社Ｊｏｈ ｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ、　Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ　２７３−２８２ 頁。 ［６３１ウォーカー−ｚム・ジエイ（１！ｔａｌｋｅｒ　Ｍ、　Ｊ、　）、’　 ｘム−ｏ−ド（Ｍ。 Ｒｏｈｄｅ）、ケイ・エフ・ティミス（Ｋ、　Ｎ、　Ｔｉｍｍ１ｓ）及びシー・ エイ・グズマン（Ｃ，Ａ、ＧｕｚｍＡｎ）、　１９９２、ネズミチフス菌ａｒｏ Ａ、チフス菌Ｔｙ２１ａ及び組換え体百日咳毒素サブユニットを発現する発病性 大腸菌によるマウスの経口免疫感作後の特異性肺粘膜及び全身性免疫応答、１ｎ ｆｅＣｔ、　Ｉｍｍｕｎ、に寄稿。 ［６４１ウォーカー・エム・ジエイ（Ｗａｌｋｅｒ　Ｍ、Ｊ、）、エム・ロード （Ｍ。 Ｒｏｈｄｅ）、ジェイ・ウェーランド（Ｊ、　Ｗｅｈｌａｎｄ）及びケイ・エフ ・ティミス（Ｋ、Ｎ、Ｔｊｍｍｉｓ）、１９９Ｌ　ｂｖｇ−陰性Ｂｏｒｄｅｔｅ ｌｌａ　ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ中て百日咳毒素を構成的、誘導的に発現 するためのミニトランスポゾンの構築、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　５９ ：４２３８−４２４８゜［６５１ウォーカー・エム・ジエイ（Ｗａｌｋｅｒ　Ｍ 、　Ｊ、　）、ジエイ・ウェーランド（Ｊ、　Ｗｅｈｌａｎｄ）、ケイーｚヌ・ ティミス（Ｋ、Ｎ、　Ｔｉｍｍ１ｓ）、ビー・ラウバッチＣＢ、　Ｒａｕｐａｃ ｈ）及びエム・エイ・シュミットＣＭ、Ａ、　Ｓｃｈｍｉｄｔ）、　１９９１、 百日咳毒素のはっきり規定したエピトープを認識し、チャイニーズハムスター卵 巣に対するその毒素を中和するマウスのモノクロナール抗体のキャラクタリゼー ション、　１ｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、　５９・４２４９−４２５１゜ ［６６１ワードロウ・エイ・シー（Ｗａｒｄｌａｗ　Ａ、　Ｃ，）、　アール− １＜−）ン（Ｒ，Ｐａｒｔｏｎ）及びエム・ジエイ・フッカ−（Ｍ、Ｊ、Ｈｏｏ ｋｅｒ）、　１９７６、百日咳菌の培養変異体中の防御抗原、ヒスタミン感作因 子、及びエンベローブポリペプチドの損失、Ｊ、Ｍｅｃｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ 、　９：８９−１００゜［６７１ウニイス・エイ・エイ（Ｗｅｉｓｓ　Ａ、Ａ、 ）及びイー・エル・ヒユーレット（Ｅ、Ｌ、Ｈｅｗｌｅｔｔ）、１９８６、百日 咳菌の毒性因子、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、４０：６６１−６ ８６゜［６８１ウィンスネス・アール（Ｗｉｎｓｎｅｓ　Ｒ，）、ティ・ロンネ ス（Ｔ、　Ｌｏｎｎｅｓ）、ビー・モグステン（Ｂ、Ｍｏｇｓｔｅｎ）及びビー ・ビー・ベンダル（Ｂ。 Ｐ、Ｂｅｎｄａｌ）、１９８５、白血球増加症促進因子、繊維状血清凝集素リボ 多糖及び百日咳の際に誘発された補体結合抗体に結合するタンノ＜り質に対する 予防接種と病気後の抗体反応、Ｄｅｖｅｌｏｐ、　Ｂｉｏｌ、　５ｔａｎｄａｒ ｄ。 ６１：　３５５−３６５゜ ［６９］　ズイーレイ・ジ−アール（Ｚｅａｌｅｙ　Ｇ、Ｒ，）、ニス・エム・ ルーズモア（Ｓ、　Ｍ、　Ｌｏｏｓｍｏｒｅ）　、アール・ケイ・ヤコブ（Ｒ， Ｋ、　Ｙａｃｏｏｂ）　、ニス・エイ・コツクル（Ｓ、Ａ、Ｃｏｃｋｌｅ）、　 −ｒ−イ・ビー・ノ１−ベルト（Ａ、　Ｂ、　Ｈｅｒｂｅｒｔ）、エル・ディー ・ミラー（Ｌ、Ｄ、Ｍｉｌｌｅｒ）、　エフ・ジエイ・マ・ノカイ（Ｎ、　Ｊ、 λ１ａｃｋａｙ）　及びエム・エイチ・ネイン（Ｍ、Ｈ，Ｎｅ１ｎ）、　１９９ ２、遺伝的に不活性化された百日咳毒素を過剰生産する百日咳菌株の構築、Ａｐ ｐｌ、Ｅｎｖ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５８＋２０８−２１４゜図３ 小胞　調製品 図４ 図５ 追加免疫感作後の日にち フロントページの続き （７２）発明者　ケイーランド、ユルゲンドイツ連邦共和国　デー−３３００ブ ラウンシュヴアイク、マンエローデル・ヴエーク（７２）発明者　ブラウンリー 、ロバート・エムドイツ連邦共和国　デー−３３００ブラウンシュヴアイク、マ ンエローデル・ヴエーク（７２）発明者　ティミス、ケニース ドイツ連邦共和国　デー−３３００ブラウンシュヴアイク、マンェローデル・ヴ エーク（７２）発明者　ホワイト、ディケイッド・シーアメリカ合衆国　テネシ ー　３７９３２−２５６７、ノックスヴイル、スーツ　３００、リサーチ・ドラ イヴ　１０５１５ （７２）発明者　グツマン、カルロス・エイイタリア国　１６１３２　ジエフア 、１０、ケイアレ・ベネデート　ＸＶ （７２）発明者　ウォーカー、マーク・ジェイオーストラリア国　ノース・サウ ス・ウェスト　２５００、ウーロンゴング、ピー・オー・ボックス　１１４４ （７２）発明者　ファウシテイン、マイケル・ダヴリュドイツ連邦共和国　デー −３３００ブラウンシュヴアイク、マンェローデル・ヴエーク

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．ワクチンがリボソーム運搬システムから成り或いは反応成分として該運搬シ ステムを含み、該運搬システムが脂質小胞から成り或いはこれを含むようなワク チンに於いて、前記脂質小胞がその外膜に組み込まれた少なくとも１種の粘膜の 病原体抗原を含むことを特徴とする粘膜の病原体に対するワクチン。
2. ２．前記粘膜の病原体がボルデレラ属の１種、特にＢ型、百日咳菌、赤痢菌又は 連鎖球菌であることを特徴とする請求の範囲第１項記載のワクチン。
3. ３．前記抗原が百日咳菌の外膜タンパク質（ＯＭＰ）の一つの調製品であること を特徴とする請求の範囲第２項記載のワクチン。
4. ４．前記抗原が百日咳菌の一つのリポ多糖（ＬＰＳ）であることを特徴とする請 求の範囲第２項記載のワクチン。
5. ５．前記抗原が百日咳菌の繊維状血球凝集素及び／又は百日咳毒素であることを 特徴とする請求の範囲第２項記載のワクチン。
6. ６．百日咳菌の外膜タンパク質（ＯＭＰ）の一つの調製品と同じく百日咳菌の一 つのリポ多糖（ＬＰＳ）とを抗原として含むことを特徴とする請求の範囲第２項 記載のワクチン。
7. ７．脂質小胞による前記ワクチンが大豆をベースにした小さい多重膜リン脂質小 胞であることを特徴とする請求の範囲第１項記載のワクチン。
8. ８．前記ワクチンが粘膜を免疫にするための経口投与に、特に腸の通路及び／又 は呼吸の通路、好ましくは呼吸の通路を免疫にするために適用されることを特徴 とする前記請求の範囲のいずれか１項記載のワクチン。
9. ９．溶剤希釈微粒子担体技術により一種又は数種の前記抗原を脂質小胞中に組み 込むことを特徴とする前記請求の範囲のいずれか１項記載のワクチンを調製する 方法。