JPH06507494A

JPH06507494A - 細菌性アレルゲンにより惹起される疾患の検出及び治療方法

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Publication number: JPH06507494A
Application number: JP4511878A
Authority: JP
Inventors: カレノフ，エマニユエル
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1991-04-26
Filing date: 1992-04-21
Publication date: 1994-08-25
Also published as: WO1992019970A1; AU667040B2; CA2109088A1; EP0582672A1; EP0582672A4; AU2003692A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】細菌性アレルゲンにより惹起される疾患の検出及び治療方法発明の分野本発明はアレルゲンの分野、特に細菌性アレルゲンの同定、並びに疾患の診断及び治療におけるそれらの使用に係多数の特発性再発性疾患の病因は未知である。

かかる疾患の幾つかは、微生物による感染に関係すると考えられている。しかしながら、微生物と疾患の因果関係は確証されていないことが多い。慢性胃炎と消化性潰瘍の双生疾患もこの範喀に含まれる。

慢性胃炎と消化性潰瘍は極めて重要な疾患である。全体の５〜１０％の人が一生のうちに慢性胃炎または胃十二指腸潰瘍を発症する。潰瘍は罹患率の主な原因となっている。

米国における症候性消化性潰瘍の年間罹患率は成人１，０００人当たり約１８％（即ち４，５００．０００人）である。

毎年、新たに約３５０，０００の患者が消化性潰瘍と診断されている。

上記疾患の診断は一般に胃十二指腸内視鏡検査によって行われるが、これは、健康な組織を傷付ける上にコストのかかる方法である。治療は、経口投薬、食事制限、及び外科手術を含む。決定的なことはめったになく、かかる慢性状態は回復と再発を繰り返すことが多い。

が慢性胃炎の病巣に物理的に関係していると報告して以来、かかる微生物と慢性疾患の因果関係を明らかにしようと、多大な研究がなされている。Ｈ，ｐｙｌｏｒｉによって誘導される局所的ｐＨ変化、毒素放出（Ｈｕｐｅｒｔｓ　ｅｔ　ａｌ、、（１９８８）、Ｅｕｒ　Ｊ、Ｃ１１ｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ　７：５７６］、及び有害酵素（ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅ　ｅｎｚｙｍｅｓ）関する初期の推測や、種々の細菌株間の相違（Ｅａｔｏｎｅｔ　ａｌ、、（１９８９）、Ｉｎｆｅｃｔ　Ｉｍｍｕ関する確固たる結論は得られていない。更に、有意の数の臨床上健康な患者が該微生物を保有するという認識によって、因果関係の合理的説明の探究は更に複雑化されている。

関連技術Ｃｅ５ｋａ　ｅｔ　ａｌ、、（１９７２）、Ｒａｄｉ。

ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ　ｏｆ　Ａｌｌｅｒｇｅｎｓ　［Ｊ、Ａｌｌｅｒｇｙ　ａｎｄ　Ｃ１１ｎ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、土１：１］は、特定のアレルゲンに対するＩｇＥを検出するためのテスト（Ｒａｄｉｏａｌｌｅｒｇｏｓｏｒｂｅｎｔ、ＲＡＳＴ）法を開示している。

Ｎａ１ｅｂｕｆｆ　ｅｔ　ａｌ、、（１９７９）、Ｔｈｅ　５ｔｕｄｙ　ｏｆ　ＩｇＥ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　Ａｌｌｅｒｇｉｃ　Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ　ｉｎ　ａｎ　Ｏｔｏｌａｒｙｇｏｌｏｇｙ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　（Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ　Ｈｅａｄ　ＮｅｃｋＬａｍｂｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ、、（１９７８）、Ｄｉｆｆｕｓｅ　Ｖａｒｉｏｌｉｆｏｒｍ　Ｇａｓｔｒｉｔｉｓ（Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　上ユニ１５９）は、慢性胃炎の病巣がＩｇＥ陽性形質細胞を含むことを示す実験を報告しており、彼らはそれを、この疾患のアレルギー源を示すものであると解釈している。

Ａｎｄｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、（１９８３）、Ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｆｏｒ　Ａｎａｐｈｙｌａｃｔｉｃ　Ｒｅａｃｔｔｏｎｓ　ｉｎ　Ｐｅｐｔｉｃ　Ｕｌｃｅｒ　ａｎｄ　Ｖａｒｉｏｌｉｆｏｒｍ　Ｇａ５ｔｒｉｔｉｓ　（Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　Ａｌｌｅｒｇｙ　５↓：３２５）では、健常者と比較したときの種々のタイプの胃炎／潰瘍を患う患者におけるＩｇＥ含有細胞の平均数及びクラス分布が調査されており、彼らはその結果を、粘膜アナフィラキシ−が胃炎の原因であり得るという理論を確証するものと解釈している。

Ｃａ１ｅｎｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ、、（１９８３）、Ｂａｃｔｅｒｉａ−３ｐｅｃｉｆｉｃ　ＩｇＥ　ｉｎ　Ｐａｔｔｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　Ｎａ５ａｌ　Ｐｏ１ｙｐｏｓｉｓ（Ａｒｃｈ　Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ　１０９：３７２）は、慢性鼻腔ポリボーシスを示す患者における、細菌抗原に特異的なＩｇＥを検出するための改良ＲＡＳＴ法の使用を記載している。

Ｗａｒｒｅｎ　（１９８３）、Ｕｎｉｄｅｎｔ　ｉ　ｆ　１ｅｄＣｕｒｖｅｄ　Ｂａｃｉｌｌｉ　ｏｎ　ＧａｓｔｒｉｃＥｐｉｔｈｅｌｉｕｍ　ｉｎ　Ａｃｔｉｖｅ　Ｃｈｒ。

ｎｉｃ　Ｇａ５ｔｒｉｔｉｓ　（Ｌａｎｃｅｔ、１２７３）は、僅かに湾曲した形及びＳ字形のバチルス属（ｂａｃｉｌｌｉ）が１３５の胃炎生検標本に認められたと報告している。バチルス属は炎症と関係付けられることが最も多く、急性及び慢性の胃炎にほとんど常に存在する。

Ｐｅｔｅｒｓｏｎ　（１９９１）、Ｈｅ１ｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ　ａｎｄ　Ｐｅｐｔｉｃ　ＵｌｃｅｒＤｉ　５ｅａｓｅ　［Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＪｏＭｅｄ。

３７４　：１０４３）は、Ｈ，ｐｙｌｏｒｉ（以前はＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｐｉｌｏｒｉと称されていたもの）と胃炎／潰瘍の関係についての調査文献である。

発明の説明Ｌ↓のタンパク質アレルゲンの特定のサブフラクシジンに対するＩｇＥの存在との間に、高い正の相関があることが見い出された。かかる結果は、上記細菌に対する有害免疫反応が、病理学的反応、特に特異的ＩｇＥによって媒介される過敏症反応の存在の原因であることを示すものである。

改良ＲＡＳＴ法においては、精製タンパク質アレルゲンを固体支持体に結合した。Ｈｏｐｙｌｏｒｉのタンパク質アレルゲンと反応させる前に、試験すべき血清を処理してＩｇＡ及びＩｇＧを除去した。この“スクラビング（ＳＣｒｕｂｂｉｎｇ）”ステップは、アレルゲン特異的ＩｇＥの検出に不可欠であった。

健康な組織を比較的傷めずに該疾患を検出し得る。また、精製タンパク質アレルゲンを使用し、免疫療法によって該疾患を治療することもできる。

従って、本発明の１つの態様は、細菌性アレルゲンに免疫学的に結合するＩｇＥを測定する方法であって、ＩｇＥを含むと推定される血清を、固体支持体に結合させた細菌抽出物と反応させ、次いで洗浄し、標識抗１ｇＥと反応させ、固体支持体に結合した標識抗１ｇＥを検出することからなり、固体支持体に結合させた細菌抽出物と反応させる前に、血清からＩｇＡ及びＩｇＧを除去し得る組成物と血清を反応させるよう改良されており、前記組成物の使用量が、ＩｇＨの細菌性アレルゲンへの結合を妨害するＩｇＡ及びＩｇＧを除去するのに十分である方法である。

本発明の別の態様は、細菌から精製タンパク質アレルゲンを調製する方法であって、（ａ）タンパク質アレルゲンを含む細菌をアセトンで処理して脂質成分を除去し、（ｂ）アセトン処理した細菌を、緩衝液、塩、金属キレート化剤、プロテアーゼ阻害物質及びベンズアミジンを含む溶液中で破壊し、（ｃ）タンパク質含有フラクションを複合糖質及び核酸から分離し、（ｄ）分子量が約１．０００以上のタンパク質を含む組成物を回収し、（ｅ）（ｄ）の組成物のタンパク質をイオン交換クロマトグラフィーによって単離することからなる方法である。

本発明の更に別の態様は、細菌感染に対するアレルギー反応から生じた疾患に対して個体を治療する免疫療法であって、該個体に、実質的に細菌由来のタンパク質アレルゲンからなる組成物を導入することからなり、前記導入の条件が、アレルギー反応の症状を緩和するのに十分である方法ｐｙｌｏｒｉに対してアレルギー反応を示すか判定する方法であって、（ａ）Ｈ，ｐｙｌｏｒｉアレルゲンに対するＩｇＥを含むと推定される個体由来の血清を与え、（ｂ）実質的にＨ，ｐｙｌｏｒｉタンパク質アレルゲンからなる組成物を与え、（Ｃ）（ａ）の血清を（ｂ）の組成物と、ＩｇＥとそれに対するアレルゲンとの間で免疫学的結合が起こる条件下で反応させ、（ｄ）もしあれば（ａ）の血清中のＩｇＥと（ｂ）の組成物中のタンパク質アレルゲンとの間で形成されたＩｇＥ−アレルゲン結合体を検出することからなる方法である。

本発明の更に別の態様は、実質的にＨ，ｐｙｌｏｒｉのタンパク質アレルゲンからなる組成物である。

本発明の更に別の態様は、固体支持体に結合されたＨ８ｐｙｌｏｒｉのタンパク質アレルゲンである。

本発明の更に別の態様は、Ｈ，ｐｙｌｏｒｉ誘発胃炎に能な１つ以上のエピトープを含むポリペプチドを含む組成物を導入することからなり、前記ポリペプチドが、該個体におけるＨ、ｐｙｌｏｒｉに対するアレルギー反応を緩和するのに十分な量であり、前記組成物が更に適当な賦形剤を含む方法である。

本発明の更に別の態様は、適当な容器内に封入された、Ｈ，ｐｙｌｏｒｉエピトープを用いて免疫学的に同定可能なエピトープを少なくとも１つは含むポリペプチドと、前記ポリペプチドと、もしあれば生物試料中のＩｇＥとの間で形成された免疫学的結合体を検出する方法とを含む診断のエピトープの構造類似体を含む組成物であり、前記構造類似体がＩｇＥバラトープに結合する組成物である。

本発明の更に別の態様は、Ｈ，ｐｙｌｏｒｉのポリペプチドアレルゲンに対する精製ポリクローナル抗体を含む組成物である。

本発明の更に別の態様は、Ｈ，ｐｙｌｏｒｉのポリペプチドアレルゲンに対するモノクローナル抗体を含む組成物ｇＥの検出における、プロティンＡを用いて血清をスクラビングすることの効果を示すグラフである。

図２Ａは、健康個体（対照）におけるＨ、ｐｙｌｏｒｉタンパク質アレルゲンのサブフラクションに対するＩｇＥの血清１ｇＥレベルを示すグラフである。

図２Ｂは、胃炎患者におけるＨ、ｐｙｌｏｒｉタンパク質アレルゲンのサブフラクションに対するＩｇＥの血清■ｇＥレベルを示すグラフである。

図３は、ＨＰＬＣＤＥＡＥカラムから単離した全ての使用し、対照及び胃炎患者由来の血清の正味全１ｇＥ免疫学的反応性をプロットしたグラフである。

図４は、ＨＰＬＣＤＥＡＥカラムのフランクジョン５９．６４．６６．６８．７２及び７４のタンパク質を用い、対照及び胃炎患者由来の血清の正味全ＩｇＥ免疫学的反応性をプロットしたグラフである。

発明の実施態様本発明は、慢性胃炎または胃十二指腸潰瘍を患う個体は）ｉ、ｐｙｌｏｒｉのタンパク質アレルゲンに特異的な血清ＩｇＥを有しており、このことは、この微生物に対する過敏症がかかる疾患の病因にあることを示唆するという知見から出発している。

生息し、宿主にも胃酸に対する宿主の防護にもそれほど有害とならずに、保護粘液層から栄養補給している。慢性胃炎において認められる炎症プロセスによって、個体は一般アレルギー傾向を有するようになり、更にはアレルゲンとしてＨ，ｐｙｌｏｒｉアレルゲン性タンパク質を与えるのに必要なＭＨＣＩＩ抗原フレームワークを有するようになる。さかずき細胞による保護粘液の分泌の量的及び／または質的低下が恐らく起こり、下層の粘膜を脆弱にする。更に、アレルギー反応に応答して局所的なヒスタミン産生が増加し易く、胃の静脈叢中に吸収され、胃酸産生を増加させる。これら２つの現象が重なって、初期前病変の痛みが増加し、Ｈ，ｐｙｌｏｒｉに対する一定のアレルギー反応に伴ない、病巣拡大及び慢性化がもたらされる。

上記新規知見に基づき、個体におけるＨ、ｐ）’ｆｏｒｔ誘発アレルギー反応を検出するイムノアッセイを設計することができる。１つの態様においては、かがるイムノアッセイは精製タンパク質アレルゲンを使用し、これは１ｎｖｉｔｒｏで実施し得るし且つ健康な組織を比較的傷付は土の少なくとも１種の精製タンパク質アレルゲンを含む組成物及び／またはＨ，ｐｙｌｏｒｉのタンパク質アレルゲンのアレルゴイド（ａｌｌｅｒｇｏｉｄ）を用いた免疫療法が可能となる。

本発明の実施においては、特に記載のない限り、慣用のタンパク質精製方法、微生物学、分子生物学、免疫学など、当分野の技術内にあるものが使用される。

本明細書における“アレルゲン（ａ　１１　ｅ　ｒｇｅｎ）”なる用語は、ＩｇＥ抗体によるアレルギー感作を生じる抗原を指す。

“アレルゴイド（ａｌｌｅｒｇｏｔｄ）”なる用語は、ＩｇＥクラスでなくてＩｇＧ抗体を生じ、それによってアレルギー症状を低下させる、化学的に変性されたアレルゲンを指す。

本明細書における“個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）”なる用語は、を椎動物、特に哺乳動物種のメンバーを指し、限定的ではないが、家畜、競技動物、ヒトを含む霊長目動物を含む。

本明細書における“アレルギー（ａｌｌｅｒｇｙ）”なる用語は、通常は過敏症を与える免疫反応の変性状態を指す。

本明細書における“〜を用いて／〜とじて免疫学的に同定可能な”なる表現は、指示されたポリペプチド中にも存在するエピトープ及びポリペプチドの存在を指す。免疫学的同定は、抗体の結合及び／または結合の競合によって判定することができ、かかる方法は当業者には周知であり、後で説明する。

本明細書における“エピトープ”なる用語は、ポリペプチドの抗原決定基を指す。エピトープは、該エピトープに固有のコンホーメーションをなす３つのアミノ酸を含み得る。一般に１つのエピトープは５つ以上のかかるアミノ酸からなり、より一般的には８〜１０個以上のかかるアミノ酸からなる。アミノ酸のコンホーメーションを決定する方法は当分野において周知であり、例えばＸ線結晶分析及び２次元核磁気共鳴を挙げることができる。

ポリペプチドは、抗体と“免疫学的に反応性”であるとき、即ち、該ポリペプチド内に含まれる特定のエピトープの抗体認識によって抗体に結合するとき、“免疫反応性”である。免疫学的反応性は、抗体の結合、特に抗体結合速度によって、及び／または該抗体に対するエピトープを含む既知のポリペプチドを競合物質として使用する結合の競合によって判定することができる。ポリペプチドが成る抗体と免疫学的に反応性であるか判定する方法は当分野において周知である。“ 免疫反応性”ポリペプチドは“免疫原性”でもある。本明細書において“免疫原性ポリペプチド”なる用語は、単独であろうと担体に結合されていようと、またアジュバントの存在下であろうと不在下であろうと、細胞性及び／または体液性免疫応答を誘発するポリペプチドを指す。

本明細書における“抗体”なる用語は、少な（とも１つの抗体結合部位を含むポリペプチドまたはポリペプチド群を指す。“抗体結合部位”または“結合ドメイン”は、抗体分子の可変域の折り畳みによって、抗原のエピトープの特性と相補的な内部表面形状及び電荷分布を有し、それによって抗原との免疫学的反応が可能な３次元結合空間を作出することから形成される。抗体結合部位は、抗原結合に寄与する超可変ループを形成するＨ鎖環（ＶＨ）及びＬ端域（Ｖ　Ｌ）からも形成され得る。“バラトープは、最も単純な形態の抗原決定基であるエピトープに対する抗原結合部位である。“抗体”なる用語は例えば、を椎動物抗体、ハイブリッド抗体、キメラ抗体、変性抗体、−価抗体、Ｆａｂタンパク質、及び単一ドメイン抗体を含む。

“ポリペプチド”なる用語はアミノ酸のポリマーを指し、特定長の生成物を指すのではない。従って、ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質がポリペプチドの定義に含まれる。またこの用語は、ポリペプチドの発現後修飾、例えばグリコジル化、アセチル化、リン酸化などは指さず、これらは除外される。上記定義に含まれるものとしては、例えば、天然または非天然の、（例えば非天然アミノ酸などを含む）アミノ酸の１つ以上の類縁体を含むポリペプチド、置換結合を有するポリペプチド、当分野において周知の他の修飾を挙げることができる。“ポリペプチド”なる用語は、分子を製造する方法を意味することはなく、天然分子、及び化学合成または組換え合成によって製造された分子を含む。

本明細書における“生物学的試料”なる用語は、個体から単離された組織または体液の使用を指し、例えば、限定的ではないが、血漿、血清、を髄液、リンパ液、皮膚、呼吸器、腸及び尿生殖路の外側切片、涙、唾液、乳汁、血液細胞、腫瘍、臓器、更にはｉｎ　ｖｉｔｒｏ細胞培養成分試料を挙げることができる。

本明細書における“結合（ｃｏｕｐ　Ｉ　ｅｄ）”なる用語は、共有結合または強力な非共有相互作用（例えば疎水性相互作用、水素結合など）による結び付きを指す。共有結合は、例えば、エステル、エーテル、ホスホエステル、アミド、ペプチド、イミド、炭素−硫黄結合、炭素−リン結合などであり得る。

“支持体（ｓｕｐｐｏｒｔ）”なる用語は、所望のポリペプチドを結合させる任意の固体または半固体表面を指す。

適当な支持体としては、ガラス、プラスチック、金属、ポリマーゲルなどを挙げることができ、また、ビーズ、ウェル、浸漬棒、膜などの形態をとり得る。

本明細書における“標識”なる用語は、検出可能な（好ましくは定量化可能な）シグナルを与えるために使用されるもので、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに結合し得る任意の原子または基（ｍｏ　ｉ　ｅ　ｔ　ｙ）を指す。

本明細書における“治療”なる用語は、予防法及び／または療法を指す。

“免疫原性”なる用語は、免疫系の１つ以上の機能が高揚し、゛免疫原性物質に対抗するように生体の免疫系を刺激するために使用される物質を指す。

本発明の１つの実施態様においては、Ｈｌｐｙｌｏｒｉに対する個体のアレルギー感度は、Ｈ，Ｉ）Ｖｌｏｒｉアレルゲンに特異的なＩｇＥを検出することにより決定される。

当分野においては周知のアレルゲン特異的１ｇＥを検出する任意の方法を使用することができる。

例えば１つの方法においては、アレルゲン（この用語はアレルゲンポリペプチドを含む）のエピトープを用いて免疫学的に同定可能なエピトープを含む１つ以上のポリペプチドを固体支持体に結合させる。被検材料由来のアレルゲンに特異的なＩｇＥを含むと推定される生物学的試料を、アレルゲン−支持体結合体と反応させ、結合体のアレルゲンと免疫学的に反応したＩｇＥを検出する。この種のアッセイの例はラスト（ＲＡＳＴ）法である。

一般に、ＲＡＳＴ法においては、アレルゲン抽出物をセルロース粒子または円板濾紙に結合させる。ＩｇＥ抗体を含む患者の血清または標準血清をアレルゲン結合イムノソルベントと反応させる。十分に洗浄した後、標識抗ＩｇＥをイムノソルベントと反応させる。更に洗浄した後、分離したソルベント上の標識を測定すると、これが、アレルゲンに対する特異的血清ＩｇＥ抗体の量の測定値である。

好ましい態様においては、ＲＡＳＴ法は、ＩｇＥのアレルゲンへの結合を妨害し得るＩｇＧ及び／またはＩｇＡ抗体を除去することにより、その感度を増大するよう改良される。

Ｈ，ｐｙｌｏｒｉアレルゲンに特異的な血清１ｇＥを測定する場合にはこれは特に重要である。ＩｇＧ及び／またはＩｇＡを除去し得る反応物質は当分野において周知であり、例えばプロティンＧ１抗ヒトＩｇＧ及び抗ヒトＩｇＡ並びにプロティンＡを挙げることができる。便宜的にはこれらの反応物質を、例えばセファロースを含む固体支持体上に固定することができる。使用する反応物質の量は、妨害となるＩｇＧ及びＩｇＡは除去するが、検出すべきＩｇＥは除去しないのに十分な量とする。所望の量は、当業者には周知の方法によって決定される。

血清をプロティンＡと一緒にインキュベートすることにより妨害となるＩｇＧ及び／またはＩｇＡ抗体を除去する方法を後述の実施例に記述する。一般に、使用するプロティンＡの量は、ブロッキング抗体が同じ特異性を有するＩｇＥと競合することを防ぐのに十分な量とする。

改良ＲＡＳＴ法は、精製タンパク質アレルゲンの使用をも含み得る。タンパク質を精製する方法は当分野において周知であり、例えば分別抽出、塩析、イオン交換樹脂上でのクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、遠心分離などを挙げることができる。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　ｆｏｒ　ａ　ｖａｒｉｅｔｙ　ｏｆ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ参照。Ｈ，ｐｙｌｏｒｉのタンパク質アレルゲンを炭水化物、脂質及び核酸から分離する精製方法の例を実施例に与える。ＤＥＡＥにおけるＨＰＬＣクロマトグラフィーによりタンパク質アレルゲンを更に単離することにより、慢性胃炎及び／または胃十二指腸潰瘍の個体から得たＩｇＥに結合するＨ、ｐｙｌｏｒｉ由来のタンパク質アレルゲンのサブフラクションが同定された。かかるアレルガンに特異的なＩｇＥは、正常対照個体においては実質的に不在であった。上記フラクション由来のアレルゲンはイムノアッセイに特に有用である。

便宜的には、Ｈ，ｐｙｌｏｒｉアレルゲンのエピトープを用いて免疫学的に同定可能な１つ以上のエピトープを含むポリペプチドを診断キットに内包することができる。診断キットは、適当な容器に入ったポリペプチドと、該ポリペプチドともしあるならば生物学的試料中のＩｇＥとで形成される免疫学的結合体を検出する手段とを含む。場合によっては、ポリペプチドを固体支持体上に固定することもできる。更にキットは、特定の診断プロトコルに必要な他の適当な内包試薬、例えば標準試薬、緩衝液と、キット成分を使用して試験を実施するための手順書とをも含み得る。

本発明の別の実施態様においては、ＨｏＩ）ｙｌｏｒｉ誘発胃疾患の傾向を有するかまたはそれを患っていると推定される個体を、該微生物に対するアレルギ一応答を低下する物質で治療する。治療は例えば、精製タンパク質アレルゲンを含む組成物を用いて、または、Ｈ９ｐｙｌｏｒｉタンパク質アレルゲン上のエピトープと免疫学的交差反応性質アレルゲンを用いて免疫学的に同定可能な組換えポリペプチドまたは抗イデイオタイプ抗体を用いて行ない得る。

その調製方法を実施例１に記載するＤＥＡＥフラクション５９．６４．６６．６８．７２及び７４に含まれる１種以上のアレルゲンは特に適当となり得る。

治療は更に、例えばＨ，ｐｙｌｏｒｉタンパク質アレルゲンのアレルゴイドを用いて行なうこともできる。抗原からアレルゴイドを調製する方法は当分野において周知である。典型的には、抗原の温和なホルマリンまたはグルタルアルデヒド処理は、抗原性（ＩｇＧ“ブロッキング抗体形成）に影響することなくアレルゲン性（Ｉ’ｇＥ形成）を低下する。

治療は、例えば対応のＩｇＥパラトープに結合する、タンパク質アレルゲンのエピトープの少なくとも１つの構造類似体を含む組成物を用いて行なうこともできる。構造類似体は、エピトープの免疫学的結合を模倣する態様でバラトープに結合し得る適当な電荷分布及び疎水性／親水性をとり得る有機分子である。

過敏性減退の形態の免疫療法によるアレルギー反応の緩和を目的とする場合、被治療個体は、１種以上の関連アレルゲンを含む組成物の注射を継続的に受ける。

治療は、いなかる局所性または全身性反応をも避けるに十分に低い用量から開始し、過度の局所性または全身性反応なしに患者が耐え得る最高用量に達するまで用量を増やしながら、週１〜２回の頻度で注射により投与する。次いで、より少ない頻度で、通常は個体の応答に従って２〜６週間ごとにメンテナンス投与を継続する。しかしながら、実際の用量及び治療レジンは治療される個体に従い、治療を行なう担当者によって決定される。

本発明の別の実施態様においては、（アレルゲンを含む）免疫反応性ポリペプチドまたはエピトープの構造類似体をワクチンに調製する。ワクチンは、１種以上の免疫原性ポリペプチドから調製することができる。組換えるならば、かかるポリペプチドを種々の宿主細胞（例えば細菌、酵母、昆虫または哺乳動物細胞）中で発現させてもよいし、或いは細菌調製物から単離してもよい。

有効成分として免疫原性ポリペプチドまたはエピトープの構造類似体を含むワクチンの調製は当業者には周知である。典型的にはかかるワクチンは溶液または懸濁液の注射液として調製されるが、注射前に液体中に溶液化または懸濁液化するのに適した固体形態で調製することもできる。

調製物は乳化することもできるし、タンパク質をリボソーム中に封入することもできる。免疫原性有効成分は、医薬的に容認可能であり且つ該有効成分と相容性である賦形剤と混合することが多い。適当な賦形剤としては、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、及びこれらの組合せを挙げることができる。更に、所望であればワクチンは、例えば湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤といった微量補助物質及び／またはワクチンの効力を増強するアジュバントを含むことができる。有効となり得るアジュバントの例としては、限定的ではないが、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−し−トレオニルーＤ−イソグルタミン（ｔ　ｈ　ｒ−ＭＤＰ）　、Ｎ−アセチル−ノルムラミルーＬ−アラニルーＤ−イソグルタミン（ＣＧＰ　１１６３７．ｎｏｒ−ＭＤＰと称されるもの）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニルーし一アラニンー２−（１°、２′−ジパルミトイル−５ｎ−グリセロ− ３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ　１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと称されるもの）、及びＲＩＢＩ　（これは、細菌から抽出される３種の成分、モノホスホリルリビドＡ１トレハロースジミコレート及び細胞壁スケルトン（ＭＰＬ十ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ　８０エマルジヨン中に含む）を挙げることができる。アジュバントの有効性は、種々のアジュバントを含むワクチンにおいて上記ポリペプチドを投与することによって生じる、Ｈ，ｐｙｌ。

Ｌ↓免疫反応性配列を含む免疫原性ポリペプチドに対する抗体の量を測定することにより決定し得る。

ワクチンは、例えば皮下または筋肉内注射によって非経口的に投与するのが都合が良い。他の投与形態に適した別の製剤としては、座薬及び場合によっては経口製剤を挙げることができる。座薬においては、例えばポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドといった慣用の結合剤及び担体を含めることができる。このような座薬は、０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の有効成分を含む混合物から成形することができる。経口製剤は、例えば医薬用のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの慣用賦形剤を含有する。かかる組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、火剤、カプセル、持効性製剤または粉末の形態をとり、１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％の有効成分を含む。

タンパク質は、中性または塩形態のワクチンに調製することができる。医薬的に容認可能な塩としては（ペプチドの遊離アミノ基で形成される）酸付加塩を挙げることができ、これは、例えば塩酸もしくはリン酸といった無機酸、または酢酸、オキサル酸、酒石酸、マレイン酸などの有機酸を用いて形成される。遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは第二鉄の水酸化物のような無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することもできる。

ワクチンは、投与製剤と適合する方法で、また予防上及び／または治療上有効な量で投与される。投与すべき量は、通常は投与１回当たり約５μｇ〜約２５０μ ｇの抗原が投与されるが、治療すべき被験体、被験体の免疫系の抗体合成能力、及び所望の保護の程度に従う。投与が必要な有効成分の正確な量は実施者の判断に委ねることができ、各被験体に特有となり得る。

ワクチンは、単回投与または好ましくは複数回投与において与えることができる。複数回投与においては、初回免疫感作で１〜１０回投与して免疫し、次いで免疫応答を維持及び／または増強するのに必要な別の投与量及び時間間隔、例えば１〜４ケ月おきに別の投与量で投与し、必要であれば、数ケ月後にまた再投与することができる。投与レジンは、少なくとも一部分は個体の要求によって決定され、実施者の判断に委ねられる。

本発明の別の態様においては、Ｈ，ｐｙｌｏｒｉアレルゲンのエピトープを用いて免疫学的に同定可能な１つ以上のエピトープを含むポリペプチドを免疫剤として使用し、当業者には周知の方法を用いてＨ，ｐｙｌｏｒｉエピトープに対する抗体を生産する。生産された抗体は精製ポリクローナル抗体、−重鎖抗体、モノクローナル抗体、抗体フラグメントなどであり得る。これらの抗体は、例えば、問題のポリペプチドをアフィニティークロマトグラフィーすることにより精製するために使用することができる。特にｏｒｉアレルゲンのエピトープを用いて免疫学的に同定可能なエピトープを含むポリペプチドを精製することができる。

更に、Ｈ，ｐｙｌｏｒｉエピトープに対する抗体は、抗イデイオタイプ抗体の製造に使用することができる。かかる抗イデイオタイプ抗体は、アレルゲンのエピトープを模倣する領域を含む。抗イデイオタイプは当分野において周知の方法を使用して合成することができ、通常は、免疫剤としてＨ，ｐｙｌｏｒｉエピトープに対する抗体を使用する。

抗イデイオタイプ抗体は、Ｈ，ｐｙｌｏｒｉアレルゲンに感受性の個体の免疫療法や、抗イデイオタイプ抗体と免疫学的交差反応するエピトープを含むＨ９ｐｙｌｏｒｉ抗原に対する抗体の精製及び／または検出に有用となり得る。

上述のごとく製造される免疫原性ポリペプチドを使用し、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む抗体を生産することができる。ポリクローナル抗体が所望であれば、選択した哺乳動物（例えばマウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）を、Ｈ，ｐｙｌｏｒｉエピトープを担う免疫原性ポリペプチドを用いて免疫する。免疫動物由来の血清を回収し、公知の方法に従って処理する。Ｈ，ｐｙｌｏｒｉエピトープに対するポリクローナル抗体を含む血清が他の抗原に対する抗体を含む場合は、イムノアフィニティークロマトグラフィーによってポリクローナル抗体を精製することができる。ポリクローナル抗血清を生産及び処理する方法は当分野において周知であり、例えばＭａｙｅｒ　ａｎｄ　Ｗａｌｋｅｒ　（１９８７）　ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＣＡＬ　ＭＥＴＨＯＤＳ　ＩＮ　ＣＥＬＬ　ＡＮＤ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ　（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ）を参照されたい。或いは、予めＨ，ｐｙｌｏｒｉに感染させた個体からポリクローナル抗体を単離し、上述の方法によって精製することができる。

Ｈ，ｐｙｌｏｒｉエピトープに対するモノクローナル抗体は、当業者には容易に生産される。ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を生産する一般方法が良く知られている。不死化抗体産生細胞系は、細胞融合によって作製することもできるし、癌ＤＮＡ　（ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ　ＤＮＡ）による８９２３球の直接形質転換またはエプスタイン−バールウィルスによるトランスフェクションといった他の方法によって作製することもできる。例えば、Ｍ、５ｃｈｒｅｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、（１９８０）ＨＹＢＲＩＤＯＭＡ　ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ　ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳＡＮＤ　ＰＲＡＣＴＩＣＥ、５ＥＣＯＮＤ　ＥＤＩＴＩＯＮ　（Ｓｐ　ｒ　ｉｎｇｅ　ｒ−Ｖｅ　ｒ　１　ａｇ、　Ｎ、Ｙ、）　；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、（１９８１）ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＹ　ＡＮＤ　Ｔ−ＣＥＬＬＨＹＢＲＩＤＯＭＡＳ；Ｋｅｎｎｅｔ　ｅｔ　ａｌ、。

（１９８０）ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＹ。

更に米国特許第４，３４１．７６１号；第４．３９９，１２１号；４．４２７．７８３号；第４，４４４．８８７号；第４゜４６６．９１７号；第４．４７２．５００号：４，４９１，６３２号；及び４，４９３，８９０号参照。Ｈ１ｐｙｌｏｒｆエピトープに対して産生された一部のモノクローナル抗体は、種々の特性、例えばイソタイプ、エピトープ親和性などについてスクリーニングすることができるＨ、ｐｙｌｏｒｉエピトープに対する抗体はモノクローナル及びポリクローナルのいずれも特に診断に有用であり、中和性のものは受動免疫療法に有用である。モノクローナル抗体は特に、抗イデイオタイプ抗体を生産するために使用することができる。

抗イデイオタイプ抗体は、防護が所望される感染物質の抗原の“内部像（ｉ　ｎ　ｔ　ｅ　ｒｎａ　１　ｉｍａｇｅ）”を担う免疫グロブリンである。例えばＮ１５ｏｎｏｆｆ、Ａ、。

ｅｔ　ａｌ、、（１９８１）、Ｃｌ１ｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ、２１：３９７−４０６；及びＤｒｅｅｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、（１９８５）、Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓｅａｓｅ　１５１ニア６１参照。抗イデイオタイプ抗体を生産する方法は当分野において周知でｄｅｈａａｇ　ｅｔ　ａｌ、、（１９８５）、Ｊ、１ｍｍ実施例以下、説明の目的で本発明の実施例を与えるが、これらの実施例は本発明の範囲を制限するものではない。本発明の開示に照らし、請求の範囲内で種々の実施態様が当業者には明らかであろう。

実施例ＩＨ，ｐｙｌｏｒｉタンパク質アレルゲンの単離及び該アレ４；ＡＴＣＣ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）を実質的にＳｍ１ｂｅｒｔの方法（Ｓｍｉｂｅｒｔ、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１９７８　３２：６７）によって培養した。特に、ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅからａｓｐｅｃｔｉｃａｌｌｙに取り出し、１ｍｌの無菌Ｄｉｆｃｏ　Ｂｒｕｃｅｌｌａブロス中に懸濁させ、接種ループ（ｔｎｏｃｕｌａｔ　ｔｎｇ　１ｏｏｐ）によって３つの別個のＢｒｕｃｅｌｌａ寒天プレート（嫌気系、Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ、ＣＡ）に移した。プレートを、８５％Ｎ７．１０％ＣＯ６及び５％０２のマイクロ好気雰囲気において３５℃で５日間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを取り出して調査すると、小さな灰白色のコロニーが認められた。グラム染色の顕微鏡調査は、大きなＵ字形及びループ状のグラム陰性ロッド（５μ）を示した。こ± を新たなりｒｕｃｅｌｌａプレートに移入し、プレートを３５℃で３〜５日間マイクロ好気下にインキュベートした。３日後、Ｈ，ｐｙｌｏｒｉコロニーの増殖はより盛んであった。かかるコロニーを、ブロスシード培養（ｂｒ。

ｔｈ　５ｅｅｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ）のための接種材料（ｉｎｏｃｕｌｕｍ）として使用した。

数個の１０ｍ１ねじ蓋付き試験管に、５％ウマ血清（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）を含む無菌Ｂｒｕｃｅｌｌａブロス５ｍ１と、プレートからスワブによって回収したコロニーとを移した。全ての試験管をマイクロ好気雰囲気下に３５℃で３〜５日間インキュベートした。この期間後に試験管内に重度の濁りが認められたならば、グラム染色スライドを顕微鏡調査することにより培養液の純度を調査した。

ブロスシード培養液を、５％ウマ血清を含む無菌Ｄｉｆｃｏ　Ｂｒｕｃｅｌｌａブロス１リットルのための接種材料として使用した。接種培養液を、３リツトルフラスコ内でマイクロ好気雰囲気下で３５℃で３〜５日間インキュベートすることにより増殖させた。中程度の濁りが認められたら、上述のごとく培養液の純度をチェックした。１リツトルの培養液から通常的２．０ｇの未洗浄細胞が得られた。

タンパク質アレルゲンを単離するため、１リツトルの培養液から得た生きた微生物を、３．００Ｏｒｐｍ、４℃で１５分間遠心することによりペレット化した。

これらを弱毒化（ａｔｔｅｎｕａｔｅ）Ｌ／、懸濁によってまとめて脱脂し、水冷アセトン中で１５分間撹拌した。弱毒化細菌を同様に遠心して再度ペレット化した。ペレットを、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７，３，１５０ｍＭ　ＮａＣ１゜５ｍＭ　ＥＤＴＡ、５ｍＭ　ＥＧＴＡ、１００μｇ／ｍｌＰＭＳＦ及び１００μｇ　／　ｍ　ｌ　ベンズアミジンを含む冷たい緩衝液２０ｍ１中に再懸濁させた。１０ｍ１または１５０〜２１０μの酸洗浄したガラスピーズ（Ｓ　ｉ　ｇｍａ。

Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ，ＵＳＡ）を加え、懸濁液を、標準チップを有する４００ワツトＢｒａｎｓｏｎ　５ｏｎｉｆｉｅｒＩＩ超音波細胞破砕装置を使用し、７番にセットして超音波処理した。懸濁液を１５分間超音波処理する間、メタノール水浴中で冷却した。次いで、得られた混合液を上述のごとく遠心し、上清を保存した。

密度勾配遠心分離上清を、Ｂｅｃｋｍａｎ　ＳＷ　４０Ｔｉｏ−ター（Ｂｅｃｋｒｎａｎ、Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）において１００．０００ｇ、４℃で１時間遠心した。得られた上清に０．４５６　ｇ／ｍ　ｌのＲｂＣ１（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓ、。

ＵＳＡ）を加えた。溶液を、Ｂｅｃｋｍａｎ　７０Ｔｉローター中、（最初の２４時間は６５，０００ｒｐｍで、次の２４時間は４８．００Ｏｒｐｍで）４℃で４８時間遠心した。各密度勾配管の上演内容物を、容管の底部から始まる等量の１０個のフラクションに回収した。密度勾配形式前の上清中に含まれる残留複合糖質及び核酸の大部分からなる容管のペレットは捨てた。

イオン交換クロマトグラフィー各密度勾配フラクションを、カットオフ平均分子量１゜０００の透析チューブを使用し、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，０，４℃で透析した。分光光度計によって波長２８０ｎｍにおいて、フラクション当たりのタンパク質含有量を概算した。検出されたタンパク質の９０％がフラクション２〜６に認められ、これらのフラクションをプールした。次いで、プールしたフラクションをＢｌｏ−８ｉｌ　ＤＥＡＥ分析アニオン交換ＨＰＬＣカラム（ＢｉｏＲａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）に添加し、濃度勾配の末端が１００パーセント緩衝液Ｂとなる３０分間の直線濃度勾配を実施した。平衡化緩衝液（緩衝液Ａ）緩衝液（緩衝液Ｂ）は、１．０ＭＮａＣ１を含む２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７，０であった。溶出フラクションを回収し、各々のタンパク質を前述のごとく定量化した。

高分子及びカチオン性分子を含む素通り（ボイド）フラクションを、Ｂｌｏ−５ｉｌ　ＳＰカチオン交換カラム（ＢｉｏＲａｄ）に添加し、ＤＥＡＥに関して正確な濃度勾配条件下にカラム操作した。得られた溶出フラクションのタンパク質を定量化した。

Ｈ，ｐｙｌｏｒｉタンパク質の円板濾紙への共有結合実質的にＣｅ５ｋａの方法（Ｃｅｓｋａ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、Ａｌｌｅｒｇｙ　ａｎｄ　Ｃ１１ｎ、Ｉｍｍｕｎ、４９　：　１　（１９７２）］によって、ＣｎＢｒ活性化円盤状濾紙を作製した。詳しく述べると、５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ　５８９　赤色リボン濾紙からパンチを用いて円板濾紙（直径６ｍｍ）を裁断した。円板を水で３０分間膨潤させた。

ＣＮＢｒ溶液（５％水溶液）を加え、撹拌装置を用いて１９℃の水浴中で３分間混合した。

ＮａＯＨ（ＬＭ）を滴下して加え、ｐＨを１０．０〜１０゜５の範囲内に維持した。懸濁液を即座に、約１０倍過剰量の冷たいＮ　ａ　ＨＣＯｓ溶液（５ｍＭ、４℃）中に注ぎ込んだ。十分に混合した後、溶液をデカントした。ＮａＨＣＯ３溶液を用いて洗浄を１１回繰り返した。次いで、円板濾紙を各々５００ｍ１の２５％、５０％及び７５％の段階的増加濃度のアセトンで２回ずつ洗浄し、更に５００ｍ１のアセトン（試薬グレード、４℃）で４回洗浄した。次いでそれらを、乾燥するためにフード換気下の濾紙上に３時間置き、ビニール袋内の乾燥割入りパウチで包装し、使用するまで一２０℃で保管した。

イオン交換実験の間に回収された各溶出試料から十分な量を取り、５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９，６で希釈し、タンパク質３００μｇを含む溶液３ｍｌを得た。各々に３０個のＣＮＢ　ｒ活性化円板濾紙を加え、種々のタンパク質をそれぞれの円板濾紙に共有結合させるため、混合物を静かに撹拌しながら４℃ で４８時間放置した。タンパク質が付着した円板濾紙を洗浄し、Ｃｅ５ｋａ　（前出）によって記載されているようにエタノールアミンを用いてブＨ，ｐ）’ｆｏｒｔアレルゲンに特異的なＩｇＥを検出するための改良ＲＡＳＴ法Ｈ，ｐｙｌｏｒｉアレルゲンに特異的なＩｇＥを改良ＲＡＳＴ法を使用してアッセイした。該方法の一部は実質的に、Ｎａ１ｅｂｕｆｆら（Ｎａｌｅｂｕｆｆ　ｅｔ　ａｌ。

、Ｏｔｏｌａｒｙｇｏｌ　Ｈｅａｄ　Ｎｅｃｋ　Ｓｕｒｇ８９　：　２７１　（１９８１））によって記載されている通りである。詳しく述べると、１００μｌの血清アリコートを適当なアレルゲン円板と一緒に一部インキユベートし、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５０ｍＭリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）、ｐＨ７，３を用いて３回洗浄した。次いで、Ｄｅ−２抗原決定基に特異的な■１！５標識抗ＩｇＥと一緒にもう一部インキユベートした。洗浄した後、アレルゲン円板を新しい試験管に入れ、時間調整によつて予め選択した時間だけγ計数管内に置き、カウントした。時間調整は、２５単位のＷＨＯ標準標準化１奢ＥＲＩ　ＳＴ抗ＩｇＥ円板に対して、ＩｇＥが２５．０００カウント結合するのに要する時間だけ試験することからなった。この時間を、全ての後続試験のカウントに使用した。

個々の患者におけるバックグラウンドを、各々プロティンＡをスクラビングした血清（後記参照）を４つのブランク円板に対して試験し、個体のバックグラウンドを表わす中央値を計算することにより決定した。このバックグラウンドレベルの２倍以上の値を陽性と見なした。各患者の個体バックグラウンドレベルを決定することは、（細菌性アレルゲンに特異的なものだけでなく）全血清ＩｇＥに直接対応する変動性を考慮することになるので、アッセイの精度を高めることになる。

図１に示したように、Ｈ，ｐｙ　ｌｏ　ｒ　ｉ　Ｉ　ｇＥを検出するためには、Ｈ，ｐｙｌｏｒｉタンパク質アレルゲンを含む円板と一緒にインキュベートする前に、血清試料をスクラビングしてほとんどのＩｇＧ及びＩｇＡ抗体を除去することが不可欠である。

スクラビングは、組換えプロティンＡ／セファロース（Ｚｙｍｅｄ、Ｓ、Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ。

ｔＪｓＡ）と−緒にインキュベートすることによって行なった。より詳しく述べると、プロティンＡ／セファロース１ｍ１当たり２ｍｌの血清を撹拌しながら１時間インキュベートした。次いで懸濁液を１５００ｒｐｍで１５分間遠心し、血清上清を回収した。

図１の結果は、書類上では胃炎及びＨ，ｐｙｌｏｒｉコロニー形成を有する１人の患者由来の同じ血清の２つのアリコートを取り、一方のアリコートにスクラビング処理を実施することにより得たものである。同量の血清から得たスクラビング試料と非スクラビング試料とに、前述のごとく、Ｈ，ｐ　ｙ　１　ｏ　ｒ−ｉタンパク質アレルゲンを含む円板を使用するＲＡＳＴ法の残りの作業を実施した。図中のスクラビング試料（白四角）及び非スクラビング試料（黒丸）において検出された自涜ＩｇＥレベルを比較する。グラフから判るように、スクラビング試料は、フラクション番号６６にピークをもってＤＥＡＥカラムから溶出したルユｙｌｏｒｉタンパク質アレルゲンへのＩｇＥの結合を可能にしている。非スクラビング試料においては結合は検出されたなかった。アッセイを繰り返しても同様の結果が得ら患者血清のＨ，ｐｙｌｏｒｉ特異的１ｇ特異的１視Ｅ検査によって疾患陽性が認められた継続的な胃炎／Ｇｌ潰瘍患者１０人と、内視鏡検査によって病巣が認められなかった患者２人と、見掛は上無症候の対照患者１２人とを、実施例２に記載のごとく、スクラビングを含む改良ＲＡＳＴ法を使用して試験した。

１０人余丁の疾患陽性患者は、血清中に測定可能量のＬｐｙｌｏｒｉ特異的ＩｇＥを有していた。２人の内視鏡検査正常患者はＩｇＥ陰性であり、１２人の無症候対照患者のうち６人は、ＨＰ　Ｉ、Ｃ溶出タンパク質の一部に対しＩｇＥ陽性を示した。図２に示したように、各１ｇＥ陽性患者は、種々のＨＰ　Ｌ　Ｃ分画されたタンパク質に別様に反応していると思われる。

“無症候”及び“胃炎”患者のうちの陽性患者に対し、個々のクロマトグラフィーフラクションに対するＩｇＥ陽性反応性の罹患率を調査した。疾患患者グループが“無症候”患者よりも明らかに反応した幾つかのＨ，ｐｙｌｏｒｉタンパク質フラクションがあった。このより明らかな反応性は、ＤＥＡＥフラクション５９．６４．６６．６８．７２及び７４に認められた。

図３は、ＨＰＬＣＤＥＡＥカラムから単離した入手可能な全てのＨ，ｐｙｌｏｒｉタンパク質フラクションを使用し、対照及び胃炎患者由来の血清の正味全ＩｇＥ免疫学的反応性をプロットした図である。図４は、フラクション５９．６２．６５．７０．６４．６８．７１．７３及び７４中のタンパク質を有する対照及び胃炎患者由来の血清の正味全１ｇＥ免疫学的反応性をプロットした図である。

産業上の利点（限定的ではないが、精製アレルゲン、組換えまたは合ｐＶｌｏｒｉタンパク質のエピトープを用いて免疫学的に同定可能な１つ以上のエピトープを含むポリペプチドは、Ｈ，ｐｙｌｏｒｉ誘発胃炎の診断に有用であり、またかかる疾患の治療にも有用となり得る。かかるポリペプチドは、Ｈ，ｐｙｌｏｒｉのエピトープに対する精製ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の生産に有用である。

更にこれらの抗体は、Ｈ，ｐｙｌｏｒｉタンパク質のエピトープを用いて免疫学的に同定可能な１つ以上のエピトープを含むポリペプチドの精製に有用である。

モノクローナル抗体は特に抗イデイオタイプ抗体の生産に有用であり、抗イｏｒｉ誘発疾患のためのワクチンの製造にも有用となり得る。

る方法、特に改良ＲＡＳＴ法は、Ｈ，ｐｙｌｏｒｉ誘発胃疾患の診断に有用である。

試験管番号図２ＡＤＥＡＥ　試験管番号図２ＢＤＥＡＥ　試験管番号図３１ｄｉｒｌ：璽のπｌ　ｒ劫蜆立）燻由貴ｒ絡鯰辻惰１Ｑ１欠小い改良ＲＡＳＴ法は、精製タンパク質アレルゲンの使用をも含み得る。タンパク質を精製する方法は当分野において周知であり、例えば分別抽出、塩析、イオン交換樹脂上でのクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、遠心分離などを挙げることができる。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　ｆｏｒ　ａ　ｖａｒｉｅｔｙ　ｏｆ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ参照。Ｈ，ｐｙｌｏｒｉのタンパク質アレルゲンを炭水化物、脂質及び核酸から分離する精製方法の例を実施例に与える。ＤＥＡＥにおけるＨＰＬＣクロマトグラフィーによりタンパク質アレルゲンを更に単離することにより、慢性胃炎及び／または胃十二指腸潰瘍の個体のＩｇＥに結合するＨ、ｐｙｌｏｒｉ由来のタンパク質アレルゲンのサブフラクションが同定された。

かかるアレルゲンに特異的なＩｇＥは、正常対照個体においては実質的に不在であった。上記フラクション由来のアレルゲンはイムノアッセイに特に有用である。

イオン交換クロマトグラフィー各密度勾配フラクションを、カットオフ平均分子量１゜０００の透析チューブを使用し、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，０，４℃で透析した。分光光度計によって波長２８０ｎｍにおいて、フラクション当たりのタンパク質含有量を概算した。検出されたタンパク質の９０％がフラクション２〜６に認められ、これらのフラクションをプールした。次いで、プールしたフラクションをＢｌｏ−５ｉｌ　ＤＥＡＥ分析アニオン交換ＨＰＬＣカラム（ＢｉｏＲａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）に添加し、濃度勾配の末端が１００％緩衝液Ｂとなる３０分間の直線濃度勾配を実施した。平衡化緩衝液（緩衝液Ａ）は２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７，０であった。塩含有緩衝液（緩衝液Ｂ）は、１．０Ｍ　ＮａＣ１を含む２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７，０であった。溶出フラクションを回収し、各々のタンパク質を前述のごとく定量化した。高分子及びカチオン性分子を含む素通り（ボイド）フラクションを、Ｂｌｏ−５ｉｌ　ＳＰカチオン交換カラム（ＢｉｏＲａｄ）に添加し、ＤＥＡＥに関して正確な濃度勾配条件下にカラム操作した。得られた溶出フラクションのタンパク質を定量化した。

Ｊ、Ａｌｌｅｒｇｙ　ａｎｄ　Ｃ１１ｎ、Ｉｍｍｕｎ、４紙を作製した。

図２に示したように、各１ｇＥ陽性患者は、種々のＨＰＬＣ分画されたタンパク質に別様に反応していると思われる。

“無症候”及び“胃炎”患者のうちの陽性患者に対し、個々のクロマトグラフィーフラクションに対するＩｇＥ陽性反応性の罹患率を調査した。疾患患者グループが“無症候”患者よりも明らかに反応した幾つかのＨ，ｐｙｌｏｒ±タンパク質フラクションがあった。このより明らかな反応性は、ＤＥＡＥフラクション５９．６４．６６．６８．７２及び７４に認められた。

図３は、ＨＰＬＣＤＥＡＥカラムから単離した入手可能な全てのＨ−ｐｙｌｏｒｉタンパク質フラクションを使用し、対照及び胃炎患者由来の血清の正味全１ｇＥ免疫学的反応性をプロットした図である。図４は、フラクション５９．６４．６６．６８．７２及び７４中のタンパク質を有する対照及び胃炎患者由来の血清の正味全ＩｇＥ免疫学的反応性をプロットした図である。

請求の範囲１、細菌性アレルゲンに免疫学的に結合するＩｇＥを測定する方法であって、前記１ｇＥを含むと推定される血清を、固体支持体に結合させた前記細菌のアレルゲン抽出物と反応させ、洗浄し、標識抗ＩｇＥと反応させ、前記固体支持体に結合した標識抗ＩｇＥを検出することからなり、前記固体支持体に結合させた細菌性アレルゲン抽出物と反応させる前に、前記血清からＩｇＡ及びＩｇＧを除去し得る組成物と前記血清を反応させるよう改良されており、前記組成物の使用量が、ＩｇＥが細菌性アレルゲンに結合するのを妨害するＩｇＡ及びＩｇＧを除去するのに十分な量で、ある、前記方法。

２、前記細菌のアレルゲン抽出物が精製タンパク質アレルゲンである請求項１に記載の方法。

３、前記組成物がプロティンＡを含む請求項１に記載の方法。

４、前記組成物がプロティンＡを含む請求項２に記載の方法。

５、細菌から精製タンパク質アレルゲンを調製する方法であって、（ａ）タンパク質アレルゲンを含む細菌をアセトンで処理して脂質成分を除去し、（ｂ）前記アセトン処理した細菌を、緩衝液、塩、金属キレート化剤、プロテアーゼ阻害物質及びベンズアミジンを含む溶液中で破壊し、（ｃ）タンパク質含有フラクションを複合糖質及び核酸から分離し、（ｄ）分子量が約１，０００以上であるタンパク質を含む組成物を回収し、（ｅ）イオン交換クロマトグラフィーによって前記（ｄ）の組成物のタンパク質を単離することからなる方法。

６、前記イオン交換クロマトグラフィーを、アニオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ’）カラムにおいて実施する請求項５に記載の方法。

７、前記精製タンパク質アレルゲンが、（ａ）タンパク質アレルゲンを含む細菌をアセトンで処理して脂質成分を除去し、（ｂ）前記アセトン処理した細菌を、緩衝液、塩、金属キレート化剤、プロテアーゼ阻害物質及びベンズアミジンを含む溶液中で破壊し、（ｅ）タンパク質含有フラクションを複合糖質及び核酸から分離し、（ｄ）分子量が約１，０００以上であるタンパク質を含む組成物を回収し、（ｅ）イオン交換クロマトグラフィーによって前記（ｄ）の組成物のタンパク質を単離することからなる、細菌から精製タンパク質アレルゲンを調製する方法によって製造される請求項２に記載の方法。

８、前記精製タンパク質アレルゲンが、（ａ）タンパク質アレルゲンを含む細菌をアセトンで処理して脂質成分を除去し、（ｂ）前記アセトン処理した細菌を、緩衝液、塩、金属キレート化剤、プロテアーゼ阻害物質及びベンズアミジンを含む溶液中で破壊し、（ｃ）タンパク質含有フラクションを複合糖質及び核酸から分離し、（ｄ）分子量が約１，０００以上であるタンパク質を含む組成物を回収し、（ｅ）アニオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラム上でのイオン交換クロマトグラフィーによって前記（ｄ）の組成物のタンパク質を単離することからなる、細菌から精製タンパク質アレルゲンを調製する方法によって製造される請求項２に記載の方法。

９、請求項５に記載の方法によって調製されたタンパク質アレルゲンを含む組成物。

１０、請求項６に記載の方法によって調製されたタンパク質アレルゲンを含む組成物。

１１、細菌感染に対するアレルギー反応から生じた疾患に対し個体を治療する免疫療法であって、前記個体に、実質−的に前記細菌由来のタンパク賀アレルゲンからなる組成物を導入することからなり、前記導入の条件が前記アレルギー反応の症状を緩和するのに十分である、前記方法。

１２、個体がＨｅ１ｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉに対してアレルギー反応を示すか判定する方法であって、（ａ）　Ｈ，ｐｙ　Ｉ　ｏ　ｒ　ｉアレルゲンに対するＩｇＥを含むと推定される個体由来の血清を与え、（ｂ）実質的にＨ，ｐｙｌｏｒｉタンパク質アレルゲンからなる組成物を与え、（Ｃ）前記（ａ）の血清を前記（ｂ）の組成物と、ＩｇＥとそれに対するアレルゲンとの間で免疫学的結合が可能な条件下で反応させ、（ｄ）もしあれば前記（ａ）の血清中のＩｇＥと前記（ｂ）の組成物中のタンパク質アレルゲンとの間で形成されるＩｇＥ−アレルゲン結合体を検出し、（ｅ）それによって、個体がＨｅ１ｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉに対するアレルギ一応答を有するか判定することからなる方法。

１３、前記与えられた血清が、ＩｇＥ−アレルゲン結合体の形成を妨害するＩｇＧ及びＩｇＡを除去するのに十分な量の、該血清からＩｇＡ及びＩｇＧを除去し得る組成物と反応させである請求項１２に記載の方法。

１４、前記組成物がプロティンＡを含む請求項１３に記載の方法。

１５、実質的にＨ，ｐｙｌｏｒｉのタンパク質アレルゲンからなる組成物。

１６、固体支持体に結合されたＨ、ｐｙｌｏｒｉのタンパク質アレルゲン。

１７、前記Ｈ，ｐｙｌｏｒｉのタンパク質アレルゲンが、（ａ）タンパク質アレルゲンを含む細菌をアセトンで処理して脂質成分を除去し、（ｂ）前記アセトン処理した細菌を、緩衝液、塩、金属キレート化剤、プロテアーゼ阻害物質及びベンズアミジンを含む溶液中で破壊し、（Ｃ）タンパク質含有フラクションを複合糖質及び核酸から分離し、（ｄ）分子量が約１．０００以上であるタンパク質を含む組成物を回収し、（ｅ）イオン交換クロマトグラフィーによって前記（ｄ）の組成物のタンパク質を単離することからなる、細菌から精製タンパク質アレルゲンを調製する方法に従って製造される請求項１５に記載の組成物。

１８、前記Ｈ，ｐｙｌｏｒｉの精製タンパク質アレルゲンが、（ａ）タンパク質アレルゲンを含む細菌をアセトンで処理して脂質成分を除去し、（ｂ）前記アセトン処理した細菌を、緩衝液、塩、金属キレート化剤、プロテアーゼ阻害物質及びベンズアミジンを含む溶液中で破壊し、（Ｃ）タンパク質含有フラクションを複合糖質及び核酸から分離し、（ｄ）分子量が約１．０００以上であるタンパク質を含む組成物を回収し、（ｅ）アニオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラム上でのイオン交換クロマトグラフィーによって前記（ｄ）の組成物のタンパク質を単離することからなる、細菌から精製タンパク質アレルゲンを調製１９、Ｈ，ｐＶｌｏｒｉ誘発胃炎に対し個体を治療する方法であづて、前記個体に、Ｈ，ｐｙｌｏｒｉの免疫原性エピトープを用いて免疫学的に同定可能な１つ以上のエピトープを含むポリペプチドを含む組成物を導入することがらなり、前記ポリペプチドが、前記個体においてＨ，ｐ７１あり、前記組成物が更に適当な賦形剤を含んでいる、前記レルゲンを含んでいる請求項１９に記載の方法。

２１、前記組成物が、Ｈ，ｐｙｔｏｒｉタンパク質アレルゲンのアレルゴイドを含んでいる請求項２０に記載の方法。

２２゜適当な容器内に封入された、Ｈ，ｐｙｌｏｒｉエピトープを用いて免疫学的に同定可能な少なくとも１つのエピトープを含むポリペプチドと、前記ポリペプチドと、もしあれば生物学的試料中のＩｇＥとで形成される免疫学的結合体を検出する手段とを含む診断キット。

２３、前記タンパク質アレルゲンが固体支持体に固定されている請求項２２に記載の診断キット。

個体を含む組成物であって、前記構造類似体がＩｇＥパラトープに結合する組成物。

２５、前記構造類似体が抗イデイオタイプ抗体である請求項２４に記載の組成物。

２６、Ｈ，ｐｙｌｏｒｉのポリペプチドアレルゲンに対する精製ポリクローナル抗体を含む組成物。

２７、Ｈ，ｐｙｌｏｒｉのポリペプチドアレルゲンに対するモノクローナル抗体を含む組成物。

国＠！Ｉ審着牛　、−−１＋−一−ｈ＋＋フロントページの続き（５１）Ｉｎｔ、Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｐ　２１１０８　８２１４−４８ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｑ　８３１０−２ＪＩ

Claims

【特許請求の範囲】

１．細菌性アレルゲンに免疫学的に結合するＩｇＥを測定する方法であって、前記１ｇＥを含むと推定される血清を固体支持体に結合させた前記細菌の抽出物と反応させ、洗浄し、標識抗ＩｇＥと反応させ、前記固体支持体に結合した標識抗ＩｇＥを検出することからなり、前記固体支持体に結合させた細菌抽出物と反応させる前に、前記血清からＩｇＡ及びＩｇＧを除去し得る組成物と前記血清を反応させるよう改良されており、前記組成物の使用量が、ＩｇＥが細菌性アレルゲンに結合するのを妨害するＩｇＡ及びＩｇＧを除去するのに十分な量である、前記方法。
２．更に、前記固体支持体に結合させた精製タンパク質アレルゲンを使用することを含む請求項１に記載の方法。
３．前記組成物がプロテインＡを含む請求項１に記載の方法。
４．前記組成物がプロテインＡを含む請求項２に記載の方法。
５．細菌から精製タンパク質アレルゲンを調製する方法であって、（ａ）タンパク質アレルゲンを含む細菌をアセトンで処理して脂質成分を除去し、（ｂ）前記アセトン処理した細菌を、緩衝液、塩、金属キレート化剤、プロテアーゼ阻害物質及びベンズアミジンを含む溶液中で破壊し、（ｃ）タンパク質含有フラクションを複合糖質及び核酸から分離し、（ｄ）分子量が約１，０００以上であるタンパク質を含む組成物を回収し、（ｅ）イオン交換クロマトグラフィーによって前記（ｄ）の組成物のタンパク質を単離することからなる方法。
６．前記イオン交換クロマトグラフィーを、アニオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムにおいて実施する請求項５に記載の方法。
７．前記精製タンパク質アレルゲンを請求項５に記載の方法によって調製する請求項２に記載の方法。
８．前記精製タンパク質アレルゲンを請求項６に記載の方法によって調製する請求項２に記載の方法。
９．請求項５に記載の方法によって調製されたタンパク質アレルゲンを含む組成物。
１０．請求項６に記載の方法によって調製されたタンパク質アレルゲンを含む組成物。
１１．細菌感染に対するアレルギー反応から生じた疾患に対し個体を治療する免疫療法であって、前記個体に、実質的に前記細菌由来のタンパク質アレルゲンからなる組成物を導入することからなり、前記導入の条件が前記アレルギー反応の症状を緩和するのに十分である、前記方法。
１２．個体がＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉに対してアレルギー反応を示すか判定する方法であって、（ａ）Ｈ．ｐｙｌｏｒｉアレルゲンに対するＩｇＥを含むと推定される個体由来の血清を与え、（ｂ）実質的にＨ．ｐｙｌｏｒｉタンパク質アレルゲンからなる組成物を与え、（ｃ）前記（ａ）の血清を前記（ｂ）の組成物と、ＩｇＥとそれに対するアレルゲンとの間で免疫学的結合が可能な条件下で反応させ、（ｄ）もしあれば前記（ａ）の血清中のＩｇＥと前記（ｂ）の組成物中のタンパク質アレルゲンとの間で形成されるＩｇＥ−アレルゲン結合体を検出することからなる方法。
１３．前記与えられた血清が、ＩｇＥ−アレルゲン結合体の形成を妨害するＩｇＧ及びＩｇＡを除去するのに十分な量の、該血清からＩｇＡ及びＩｇＧを除去し得る組成物と反応させてある請求項１２に記載の方法。
１４．前記組成物がプロテインＡを含む請求項１３に記載の方法。
１５．実質的にＨ．ｐｙｌｏｒｉのタンパク質アレルゲンからなる組成物。
１６．固体支持体に結合されたＨ．ｐｙｌｏｒｉのタンパク質アレルゲン。
１７．前記Ｈ．ｐｙｌｏｒｉのタンパク質アレルゲンが、請求項５に記載の方法に従って調製されている請求項１５に記載の組成物。
１８．前記Ｈ．ｐｙｌｏｒｉの精製タンパク質アレルゲンが、請求項６に記載の方法に従って調製されている請求項１５に記載の組成物。
１９．Ｈ．ｐｙｌｏｒ１誘発胃炎に対し個体を治療する方法であって、前記個体に、Ｈ．ｐｙＩｏｒｉの免疫原性エピトープを用いて免疫学的に同定可能な１つ以上のエピトープを含むポリペプチドを含む組成物を導入することからなり、前記ポリペプチドが、前記個体においてＨ．ｐｙｌｏｒ１に対するアレルギー反応を緩和するのに十分な量であり、前記組成物が更に適当な賦形剤を含んでいる、前記方法。
２０．前記組成物がＨ．ｐｙｌｏｒ１の精製タンパク質アレルゲンを含んでいる請求項１９に記載の方法。
２１．前記組成物が、Ｈ．ｐｙｌｏｒ１タンパク質アレルゲンのアレルゴイドを含んでいる請求項２０に記載の方法。
２２．適当な容器内に封入された、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉエピトープを用いて免疫学的に同定可能な少なくとも１つのエピトープを含むポリペプチドと、前記ポリペプチドと、もしあれば生物学的試料中のＩｇＥとで形成される免疫学的結合体を検出する手段とを含む診断キット。
２３．前記タンパク質アレルゲンが固体支持体に固定されている請求項２２に記載の診断キット。
２４．Ｈ．ｐｙｌｏｒｉアレルゲンのエピトープの構造類似体を含む組成物であって、前記構造類似体がＩｇＥパラトープに結合する組成物。
２５．前記構造類似体が抗イディオタイプ抗体である請求項２４に記載の組成物。
２６．Ｈ．ｐｙｌｏｒ１のポリペプチドアレルゲンに対する精製ポリクローナル抗体を含む組成物。
２７．Ｈ．ｐｙｌｏｒ１のポリペプチドアレルゲンに対するモノクローナル抗体を含む組成物。