JPH06507969A - 蛍光団補助型炭水化物電気永動診断 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 蛍光団補助型炭水化物電気泳動診断 発明の分野 本発明は医療診断の分野、特に炭水化物組成における変化に基づく診断に関する 。

発明の背景 炭水化物は生体の機能において非常に重要な数多くの役割を果たす、それらの代 謝的及び貯蔵的役割に加えて、炭水化物はタンパク質及び脂質のような真人な数 のその他の分子に共有結合している。

糖タンパク質及び糖脂質のような分子は一般に複合糖質と呼ばれている。この複 合糖質の炭水化物領域の生物学的重要性は、例えば糖タンパク質のその生物学的 機能、例えばリガンド又はレセプター認識としてのその機能を果たす能力に影響 を及ぼすのに一役買うことにおいて見い出せる。

それらの多様な、且つ、重要な生物学的機能の結果、炭水化物の合成、分解又は 変質はいくつかの障害をもたらしうる。同様に、数多くの障害は身体の生理学を 変え、従って変質した炭水化物代謝をもたらすか、又はタンパク質、脂質及び身 体中のその他の複合糖質の不適切なグリコジル化をもたらす。

身体における数多くの生物学的活性炭水化物は多ｗｉ類及びオリゴＩ！類であり 、これらは単一の規定された構造を有するよりはむしろ様々な関連形態において 生産される。関連の炭水化物のこのような科（ファミリー）はしばしば同一の糖 タンパク質成分であることが見い出されている。同一のポリペプチド構造を有す るが、しがしながらグリコジル化パターンにおいて相違を示すこれらの糖タンパ ク質の科はグルコフオームと呼ばれている（Ｒａｄｅｓａｃｈｅｒら、Ａｎｎ、 Ｒｅｖ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　５７　Ｂ　７８９−８３８　（１９８８）。

比較的豊富にあるグリコフオーム科の構成員は一定の障害状態との関連性におい て変わることが示されている０例えば、肝臓障害に関連する線雑素原血症障害（ ｄｉｓｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎｅｍｉａ）はフイブリノゲンのグリコジル化の変異 に関連しくＭａｒｔｉｎｅｚ、　Ｊ、ら、Ｂｌｏｏｄ　６１　；　１１９６−２ ０２　（１９８３））　、そしてリウマチ型関節炎はＩｇＧのグリコジル化の変 化に関連している（Ｐａｒｅｋｈら、Ｎａｔｕｒｅ、３１６；４５２−４５７　 （１９８５））　。

複合糖質由来の炭水化物の不適切な代謝に基づく障害はよく知られている。障害 の一般的な分類は、リソソーム貯蔵障害、ヘテログリカン症、複合炭水化物代謝 の先天性異常、ムコ多糖症等を含む樺々な名称で知られている。これらの障害そ れぞれは、糖タンパク質、ムコ多糖もしくは糖脂質、又はこれら複合糖質の炭水 化物領域の逐次分解にとって必要な１又は数種の酵素の生産が遺伝子的に不能で あることの結果である。

分解経路におけるこれらの酵素のうちのどれかが不適切に生成されるか又は完全 性が失われているとき、分解経路の最後の有用な段階において生成された分子は 、身体がこの分子を更に分解することができないため、蓄積される。その際、分 解されなかった化合物は、身体中の広範囲にわたる様々な細胞における正常な生 物学的機能を妨害するに至るまで蓄積される。

このタイプの遺伝的欠陥の結果は様々な酵素欠失によって変わるが、しかしこれ らの障害の徴候には臓器巨大症、角膜混濁、骨格異常及び進行性精神遅滞が含ま れうる。

このような炭水化物代謝障害の診断は歴史的に難しいとされ、その理由は広範囲 にわたる様々な複合炭水化物の分離、検出及び同程にとっての方法があまりない ことにある。採用されている主たる二通りの方法は炭水化物染色技術と、クロマ トグラフィー及び検出法である。

炭水化物染色技術、例えばベリースポットテスト及びジメチルメチレンブルー（ ＤＭＢ）アッセイは科学染料と特定のクラスのオリゴ糖との特異的な反応に基づ く、これらの方法の主要途はムコ多糖症にあり、これはグリコースアミノグリカ ン分解の障害である。これらの検査は大量スケールスクリーニングを意図してい るが、しかしながらそれらはデザインされた化学物質に特異的な障害に限定され 、そしてこの検査は多数の偽陽性診断を伴う問題を有している。　Ｓｅｗｅｌｌ ら、Ｋ１１ｎ　Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ　、　５７　；５８１−５８５（１９７９ ）又はＬｕｒｉｎｃｚら、展Ｃ１ｎ　Ｌａｂ、　Ｓｃｉ、　１２　；　２５Ｂ− ２６６（１９８２）。

複合糖質からのオリゴ糖のクロマトグラフィー分離もこのような障害をスクリー ニングする技術として意図されているが、しかしこのような障害の全てにおいて 蓄積する広範囲の炭水化物ベース化合物の分離を助長するであろう−クロマトグ ラフイー技術又は一連のクロマトグラフィー条件はない。

開発されている技術には、１層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）　、高性能液体ク ロマトグラフィー及びガスクロマトグラフィーが挙げられる。これらの方法それ ぞれは炭水化物代謝障害の診断においである程度の有用性を有するが、しかしそ れらの限界及び／又は複雑さの結果、臨床研究室においてあまり受け入れられて いないことがわかっている。

従って、炭水化物のレベルの変異により特徴付けられる様々な障害の診断のため の一般技術であって、この炭水化物の構造の推測的な詳細な知識を必要としてい ない診断技術を提供することに興味がもたれる。

発明の概要 本発明は課題の症状に冒された患者の組織における特定の炭水化物のレベルの変 異を特徴とする様々な障害又は障害にかかり易い性質の診断のための方法及びキ ットに向けられている。

本発明の方法は、炭水化物混合物の蛍光ラベリング及び電気泳動分離、それに続 くもとの混合物の中の特定の炭水化物の量の測定を包括する０分析に関する患者 サンプル中に存在している特定の炭水化物、即ち、診断炭水化物の量を、課題の 障害を有さない個体において存在するこの診断炭水化物のレベルと比較すること により、樺々な障害の症状が診断されうる。本発明の別の観点は遺伝障害のキャ リヤーの診断にある。本発明によって診断されることのできる障害の症状には、 炭水化物代謝障害、自己免疫障害、感染症障害、毒性化学物質への暴露及び癌が 挙げられる０本発明はヒト又は動物、好ましくは哺乳類から獲得したサンプルに 通用されうる０本発明の別の観点は幼児における障害の早期検出を提供すること にある。電気泳動分離に診断標準品を含ませることができる。

本発明の好ましい態様において、電気泳動分離により得られたラベル化炭水化物 のバンドパターンを、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラをペースとするイメージン グシステムを用いて識別化させる。このＣＣＤカメラからの情報は、次にデジタ ルフオームで保存され、そして個体間及び対照標準品間での診断炭水化物パター ンを比較するための様々なコンピュータープログラムによって分析されうる。更 に、ゲル分離された診断炭水化物は固定化用膜に転写、即ち、プロットしてよく 、次いで様々な診断炭水化物−特異性試薬でプローブされうる０本発明の別の観 点は、より容易に判断できる結果を提供するための、遠心、限外濾過、可溶化、 グリコシダーゼ又はグリコジルトランスフェラーゼ処理のような様々な手順によ るサンプルの予備処理にある。

特定態様の説明 本発明は数多くのヒト及び動物の障害の簡易な診断を提供する。

障害の診断とは、単に明白な徴候を有する障害の同定だけでなく、欅々な有害な 生理学的症状、例えば障害を発症する傾向にある個体の生理学的状況の同定、即 ち、予後的用途、子孫に障害を遺伝せしめる遺伝的能力を有する個体の同定、及 び毒性化学物質に対する個体の暴露の同定を意図する。更に、本出願の目的に関 して、「障害」なる語は不特定に用いられているとき、診断により同定されるこ とのできるような生理学的状況を含んでいる０診断する障害を明示している個体 は「冒された」個体と定義する。「個体」又は「患者」なる語は、動物、特にヒ トに加えて哺乳類を含んでいる。

本発明の原理特徴は、冒されたものと予測される個体から単離したサンプル中に 存在する診断炭水化物のレベルの測定にある。「炭水化物」なる語には、炭水化 物のみ、及び複合糖質、例えば糖タンパク質、糖脂質、プロテオグリカン等が含 まれる。「診断炭水化物」なる語は、冒されていない個体と比較したときの、冒 された個体における濃度の変化した炭水化物として定義され、ここでこの炭水化 物レベルにおける相違は冒された個体における課題の障害に関連している。

診断炭水化物は、ポリペプチドもしくは脂質に共有結合しているものか、又は他 の分子と独立しているものであってよい０診断炭水化物は単ｍ＊、オリゴＷ！類 又は多糖類であってよい、診断炭水化物は枝分れしていても枝分れしていなくて もよい、冒された個体由来のサンプル中の診断炭水化物は、冒された個体由来の サンプルに存在している診断炭水化物よりも多く又は少なくのいづれかで存在し ている、「多く」なる語には、全くないことに対立して、存在しているという炭 水化物の存在を含んでおり、同様に、「少なく」なる語は、若干量において存在 していることに対立して、炭水化物が全くないことを含んでいる。冒されたのと 冒されていない個体との診断炭水化物濃度の相違は全ての身体組織においである 必要はない。

複数の診断炭水化物が特定の障害に関連していてよい。更に、複数の診断炭水化 物が一定の障害症状にかかわっているとき、個別の診断炭水化物のレベルは、障 害の存在及び進行に関連して、少なくとも一方の診断炭水化物の濃度レベルが上 昇し、そして他方の診断炭水化物の濃度レベルが減少しうるように濃度が変化し てよい。

サンプル中の診断炭水化物の濃度は蛍光団補助型炭水化物電気泳動によって測定 される。更に、蛍光団補助型炭水化物電気泳動は、広範囲にわたる欅々な検体に 由来する特定の炭水化物を検出及びその量を相対比較するために用いることがで き、それには例えば診断に関する患者検体のみでなく植物抽出物、食品、化粧品 、及び特定の非障害性関連遺伝子に関連する体液又は組織検体における炭水化物 の相違を検査すること、例えば血液型を検査することが含まれる。

蛍光団補助型炭水化物電気泳動技術は米国特許第４．８７４．４９２号及び１９ ８９年２月１４日提出の同時係属米国特許出願０７／３１７．４８０号に詳しく 述べられており、これらは引用することで本明細書に組入れる。

蛍光団補助型炭水化物電気泳動は炭水化物の複合混合物をゲル上で個別のバンド に電気泳動分離させることを可能とする。電気泳動の前に、分析する炭水化物混 合物を蛍光ラベルで処理し、これは分析する炭水化物の還元末端と結合する。こ の蛍光団ラベルは蛍光によりラベルされた炭水化物の定量測定を可能とする。こ の蛍光ラベルは荷電されているか、又はこの蛍光団自体が非荷電のときは電荷付 与物質と結合されていてよい。従って、このラベルは炭水化物に蛍光的にぶら下 っているだけでなく、イオン電荷を付与し、今まで非荷電であった炭水化物が電 場の中で泳動させることを可能とする。

適切な蛍光ラベルには８−アミノナフタレン−１，３，６−１−ジスルホン酸（ ＡＮＴＳ）、１−アミノ−４−ナフタレンスルホン酸（八Ｎ５Ａ）、１−アミノ −６，８−ジスルホン酸（ＡＮＤＡ）、ルシフェルイエロー及び２−アミノアク リドンが含まれる。本発明における利用に適する蛍光団の詳細は、１９９０年２ 月１６日提出の米国特許出１１０７／４８３．０４３号及び１９９０年９月２０ 日提出の英国出願ＧＢ／９０１０１４４８　、並びに公開ＰＣＴ出願ＷＯ９１／ 　０５２５６号に見い出され、これらは引用することで本明細書に組入れる。

炭水化物をラベルした後、続いてサンプルをポリアクリルアミドゲル電気泳動に かけるか、又は類似の電気泳動手段にがけてこのラベル化炭水化物をバンドへと 分離、且つ、集中させる。分離したバンドをＵＶ光のもとで光電子メニュー蛍光 により直接識別化し、そしてバンドパターンを写真で保存する。他方、分離させ た炭水化物を非電子手段、例えばレーザースキャナーホトマルチプライヤ−シス テム及び冷却電荷結合素子（ＣＣＤ）によって識別化させてよい、　ＣＣＤは発 光の高感度検出を可能とする半導体イメージング装置である。

ＣＣＤ及びその用途は、引用することで本明細書に組入れる米国特許第４，８７ ４，４９２号及び第４，８５２．１３７号ニ記載サレすいル。ＣＣＤニよす作ら れるイメージを次にコンピューターに伝達させ、ここでバンドは強度、移動度、 標準品に関して分析される。

蛍光団補助型炭水化物電気泳動診断を実施するとき、電気泳動分離は課題の障害 に特異的な診断炭水化物のバンドを個別に分解するのに十分なほどに行うべきで ある。電気泳動は、多少の炭水化物が電気泳動分離媒体から出てしまう地点を超 えるぐらいまで続けてよい。電気泳動は一次又は二次元であってよい。蛍光団補 助型炭水化物電気泳動による炭水化物の二次元分離は、引用することで本明細書 に組入れる米国特許第４．９７５．１６５号に記載されている。

蛍光団補助型炭水化物電気泳動診断は、障害にかかれる診断炭水化物のレベルの 変化をもたらす様々な障害の診断を可能にする。

蛍光団補助型炭水化物電気泳動診断の著しい利点は、診断炭水化物レベルの変化 を通じてそれ自体を明示する障害が、課題の診断炭水化物の構造の前もった知識 なしで同定されうることにある。

特に興味かもたられるのは炭水化物代謝障害の診断にある。炭水化物代謝障害は 特定の炭水化物構造物を生成又は分解できないことに寄因しうる。この無能力さ の結果、様々な診断炭水化物は冒された個体の様々な組織の中で異常な量で存在 しうる。

障害の存在を決定することに加えて、蛍光補助型炭水化物電気泳動診断は障害の 処置をモニターするのに利用でき、これは処置の進行の際に観察する診断炭水化 物の量変化を介す。同様に、障害の進行は蛍光団補助型炭水化物電気泳動診断を 通じてモニターできる。

診断炭水化物レベルにおける変化は、有害な徴候をまだ示していない個体におけ る障害のスクリーニングによっても観察されうる。特に興味がもたれるのは出生 前及び新生児スクリーニングである。

数多くの炭水化物代謝障害は、様々な遺伝的突然変異に少なくともある程度原因 する。炭水化物代謝欠陥をコードする遺伝子を保有する個体は、たとえその冒さ れている個体が有害な徴候を示していなくとも、それらの組織における診断炭水 化物レベルの結果検出されうる。

遺伝子関連障害の蛍光団補助型炭水化物電気泳動診断は、課題の突然変異を有す る個体を同定するための常用の技術よりも著しい利点を有する。これらの利点に は、障害の原因である突然変異遺伝子を単離する必要のなさ、及びめんどうな核 酸ハイブリダイゼーション技術の利用からの解放にある。更に、蛍光団補助型炭 水化物電気泳動は十分に高感度であり、従って徴候をもたらすには不十分な量で 存在している診断炭水化物を検出しろる。

数多くの遺伝的炭水化物代謝障害、特にリソソーム貯蔵障害が発見されている。

これらの障害にはハーラー（Ｈｕｒｌｅｒ）障害（ＭＰＳ　ＩＩ。

即ち、！Ｈ髪型ムコ多糖症、シー（Ｓｃｈｅｉｅ）障害（ＭＰＳ　Ｉ）Ｉ）　、 ハーラーーシー障害（ＭＰＳ　Ｉ　Ｈ／Ｓ）、ハンター（Ｈｕｎｔｅｒ）障害（ ＭＰＳＩＩ）、サンフィリッポ（Ｓａｎｆｉｌｉｐｐｏ）障害（ＭＰＳ　ＩＩＩ ）　、モルキオ（Ｍｏｒｑｕｉｏ）障害（ＭＰＳ　ＩＶ）　、マロテウクスーラ ミー（Ｍａｒｏｔｅａｕｘ−Ｌａｗｙ）障害（ＭＰＳ　Ｖｌ）スライ（Ｓｌｙ） 障害（ＭＰＳ■）、マンノシド−シス、フコシド−シス、シアリド−シス、アス パリルグリコサミヌリア、ガーシャー（Ｇａｕｃｈｅｒ障害（グルコシルセラミ ド　リピドーシス）及びクラッペ障害（ガラクトセラミドーリピトーシス）、フ ァプリー（Ｆａｂｒｙ）障害、シンドラ−（Ｓｃｈｉｎａｌｅｒ）障害、ＧＭ＋ ガングリオシド−セス、ＧＭ！ガングリオシド−セス、ティーサックス（Ｔａｙ −５ａｃｈｓ）障害、サンドホッフ障害及びムコリビドーセスが含まれる。

本発明は診断炭水化物の組成を介して、障害又は障害を示すことが未だわかって いない遺伝的欠陥を診断するのに利用されうることが明らかであろう、かかる障 害又は遺伝的欠陥にとっての蛍光団補助型炭水化物電気泳動の有用性は、課題の 障害又は遺伝的欠陥を有することのわかっている患者とコントロール対象体との 間でのサンプルの炭水化物の組成を比較する蛍光団補助型炭水化物電気泳動を用 いることにより決定できる。様々な障害状態と診断炭水化物パターンとの相関は 、よく知られた統計学的技術を介して樹立されうる。

蛍光団補助型炭水化物電気泳動診断による決定にとって特に好ましい障害は、炭 水化物代謝又はタンパク質グリコジル化過程における異常の結果特徴付けられる 障害である。

蛍光団補助型炭水化物電気泳動診断は炭水化物代謝障害以外の数多くの障害を検 査するのにも利用されうる。蛍光団補助型炭水化物電気泳動診断により検出され うるその他の障害には、癌、器官特異的障害、例えば肝臓又は骨髄障害及び様々 な自己免疫障害が包抗される。

敞多くの腫瘍細胞は、固有な炭水化物構造を有する糖タンパク質を含み、これら は診断炭水化物として利用されうる９課題の腫瘍診断炭水化物は膜結合型又は分 泌型のいづれでもよい。細胞が癌性であることを示唆するに加えて、グリコジル 化における変異は細胞の代謝的能力に関連しうる。タンパク質のグリコジル化に おける数多くの変化は腫瘍に関連することが示されている：これらの変化の参考 は、Ｒａｄｅｍａｃｈｅｒら、Ａｎｎ　Ｒｅｖ、Ｂｌｏｃｈｅｍ　５７　；　７ ８５−８３８（１９８Ｂ）に見い出せうる。従って、腫瘍細胞の存在は蛍光団補 助型炭水化物電気泳動診断を利用することによって検出されうる。

炭水化物代謝障害におけるその利用に加えて、蛍光団補助型炭水化物電気泳動診 断は感染障害生物を検査及び同定するのに利用できる。細菌、菌類及びウィルス 、並びに多細胞寄生虫を含む数多くの感染性生物は、この生物が寄生する身体組 織の中で通常は見い出されない炭水化物を保有する。蛍光団補助型炭水化物電気 泳動診断は、課題の感染性生物により生成される診断炭水化物構造物について検 体をスクリーングして調べることにより、身体における病原性微生物の存在を検 査するのに適用されうる。

蛍光団補助型炭水化物電気泳動診断によって分析するサンプルは対象体から取出 した数多くの組織又は体液より準備できる０分析のための組織又は体液は課題の 症状にかかれる少なくとも１種の診断炭水化物を含む必要がある。分析に適切な 組織又は体液には、血液、唾液、尿、皮膚、筋肉、骨髄、脳を髄液、滑液、リン パ液、羊膜液等が含まれる０分析にとって好ましい組織又は体液は、患者から簡 単に獲得できるような組織であり、尿及び血液が特に好ましい０本発明において 利用する組織の選択は分析すべき課題の障害に応じて変わる０分析のための組織 の選択に影響する要因には；サンプル中に存在する診断炭水化物の量、サンプル 中のバックグランド炭水化物の量、及びサンプル中の診断炭水化物の電気泳動分 離を妨害することのできる分子の存在が含まれる。

分析のためのサンプルは、蛍光団補助型炭水化物電気泳動による診断炭水化物の 分離及び定量の前に処理を必要としうる。一定の試験に関して採用されるサンプ ル処理の正確な方法は、サンプル組織の選択及び診断炭水化物の同定に寄因して 数多くの要因に応じて変わることがある；これらの要因には：診断炭水化物の濃 度、バックグランド炭水化物の濃度、妨害分子、即ち、診断炭水化物のバンド移 動度又は診断炭水化物の蛍光ラベリングに悪影響を及ぼす分子の存在、及び診断 炭水化物が細胞に結合しているが、この炭水化物が他の分子から自由であるか又 はそれに結合しているが、等が含まれる。サンプルを処理する適切な方法には： 妨害分子を除去するための透析；診断炭水化物を濃縮し、且つ、妨害粒子を除去 する、又は細胞を濃縮し、且つ、妨害分子を除去する限外濾過、妨害分子を除去 するための沈殿；及び細胞から診断炭水化物を遊離するための清浄剤可溶化、が 含まれる。

蛍光団補助型炭水化物電気泳動によって診断炭水化物を分離させた後、次にこの 炭水化物をその場で固定化用マトリックス、例えばナイロン膜のニトロセルロー スにエレクトロプロッティング等によって転写してよい。固定化された診断炭水 化物（及びもとの混合物中のその他の炭水化物）を含む膜を次に抗体又は類似の 特異的結合試薬でプローブして、課題の炭水化物の存在及び量を示させることが できる。蛍光団補助型炭水化物電気泳動分離させた炭水化物の固定化用マトリッ クスへの転写は、引用することで本明細書に組入れる１９９０年２月１６日提出 の米国特許出願０７／　４８１，３６７号に詳しく説明されている。

い（つかの診断炭水化物の構造を、電気泳動分離の前での炭水化物サブユニット 間の切断により改変させることが好都合でありうる。

切断の適切な方法には、エンドグリコシダーゼ又はエキソグリコシダーゼのいづ れかの解糖酵素の利用が含まれる。サンプルのグリコシダーゼ処理の理由には、 複合糖質からの診断炭水化物の遊離、及びより好適なゲル泳動速度を有する、即 ち、非診断炭水化物からより分離し易い新たな診断炭水化物の作製が挙げられる 。同様に、より好適な泳動速度をもたらしめることか必要ならば、供与Ｗ（ｄｏ ｎｏｒｓｕｇａｒ）と−緒にグリコジルトランスフェラーゼを利用することが好 都合でありうる。

特異的結合試薬、例えばレクチン又は抗体等を採用することが、診断炭水化物を 分析するとき、特に複合ＩＩ賞の成分である診断炭水化物を分析するときに注目 される（有用な抗体誘導体の詳細については、ＷｉｎｔｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ 、　Ｎａｔｕｒｅ、３４９　：　２９３−２９９（１９９１）を参照のこと）、 特異的結合試薬の利用は課題の診断炭水化物を濃縮、且つ、精製せしめることが でき、従ってより容易に判断できる蛍光団補助型炭水化物電気泳動診断結果を担 う。例えば、数多くのグリコフオームを有するが、組織の中で高い炭水化物バッ クグランドと一緒に存在している糖タンパク質のポリペプチド領域に特異的な抗 体は、この糖タンパク質を免疫沈殿せしめるのに利用でき、そして免疫沈殿した 糖タンパク質を蛍光団補助型炭水化物電気泳動を実施する前に炭水化物成分を遊 離するためのエンドグリコシラーゼ処理に付してよい、これにより、精製された グリコフオームは低められたバックグランドの存在下において容易に判断されう る。

本発明の好ましいＩＩ様において、課題のサンプル中の診断炭水化物を分析する ために用いるゲルに診断標準品を含ませる。しかしながら、診断標準品により具 現化される情報、例えばバンド泳動距離及び強度は、分析のためにサンプルをさ らす条件に類似な条件のもとで前もって蛍光団補助型炭水化物電気泳動に付した 診断標準品より作った保存記録との比較からも得られうる０診断標準品は陽性、 即ち、冒された個体における完全な炭水化物パターンに相当するもの、又は陰性 、即ち、冒されていない個体に相当するもののいづれでよい。診断標準品は分析 のサンプルの組成とａ４Ｑのそれを有してよく、即ち、それらは診断炭水化物及 び実際のサンプルに認められる組成と類似のそれを有するバックグランド炭水化 物を含みうる。

診断標準品は冒された及び冒されていない個体から獲得したサンプルに由来しう る。他方、診断標準品はバックグランド炭水化物を含まないｌ又は数種の診断炭 水化物を含みうる。

診断標準品は分析のためサンプルのラベリングの前にラベル化してよい；しかし ながら、診断標準品は分析のための標準品についてのラベリングと同時にラベル されることが好ましい、更に、標準品中の診断炭水化物を定量して、分析するサ ンプル中の診断炭水化物の量との定量的又は定量的比較を担うようにすることが 好ましい。

本発明は蛍光団補助型炭水化物電気泳動診断を行うためのキットも含む、蛍光団 補助型炭水化物電気泳動診断キットは蛍光団補助型炭水化物電気泳動診断を実施 するために必要な試薬を提供する。適切なキットは研究室での蛍光団補助型炭水 化物電気泳動診断の篇易な実施を可能にする。キットは１又は数種の特定の障害 状態を同定する検査を実施するための試薬を含みうる。キットは診断標準品、蛍 光ラベル、プロッティング及び結合用材料、例えば膜、炭水化物特異的結合性試 薬、仕様書、サンプル容器及びポリアクリルアミドゲル試薬を含みうる。より完 壁なキットは蛍光団補助型炭水化物電気泳動を実施するための装置、例えばポリ アクリルアミドゲル装置、ＣＣＤ、コンピューター、ソフトウェア−等を含みう る。蛍光団補助型炭水化物電気泳動診断キットに含まれている試薬は予備決定し た量で供することが好ましい、このキットは本発明蛍光団補助型炭水化物電気泳 動方法を実施するための仕様書も含みうる。

本発明の好ましい態様において、診断炭水化物を分離及び定量するのに用いたゲ ルからの炭水化物バンドデーターをＣＣＤによって読み、そしてコンピューター に有用なフオームで保存する。　ＣＣＤ又はその他の検出システムにより検出し たイメージを、イメージ分析ソフトウェア−１例えば０ｐｔｔｓａｓ　（商標） 　（Ｂｉｏｓｃａｎ（商標））又は類似のイメージ分析プログラムによって分析 することができる。このデーターを様りなソフトウェア−プログラムによって分 析に付してよい０課題のソフトウェア−プログラムには、バンド強度の定量、バ ンド移動度の測定、炭水化物形成バンドの相対分子量の決定、標準品と分析する サンプルとの比較、不要なバックグランド情報の除去及び様々な形態の統計学的 分析の実施、を可能とするものが含まれる。本発明の好ましい態様においては、 蛍光団補助型炭水化物電気泳動から得た定量的データーを電子展開シートフオー ム、例えばロータ、２．１−２−３　（商標）　Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ　Ｅｘｃｅ ｌ　（商１）の中で処理及び／又は記録する。

本発明は、診断炭水化物の濃度における変化を通じてそれ自体を明示する障害状 況を診断するための常用の技術よりも数多くの利点を供する。本発明は複数のサ ンプル中の診断炭水化物の量の診断の同時測定を可能とする。更に、複数の障害 に特異的な診断炭水化物は同時に分析されうる。本発明の他の利点は、患者にお ける欠陥酵素の活性をアッセイする必要なく、炭水化物代謝障害を検出できる能 力にある。更に、本発明は障害の過程において蓄積する炭水化物の構造の同定を 可能とすることにある。更に、本発明は、化学的に特徴付けされていない炭水化 物に関する診断炭水化物レベルを確実にするために利用することができ、なぜな ら特異性の高い試薬を作る必要がないからである０本発明の更なる利点は検出シ ステムの感度の高さにある。

本発明を説明してきたが、下記の実施例は本発明を例示するために提供し、限定 する意図はない。

実施例 蛍光団補助型炭水化物電気泳動の実施 的１００μｌの患者の尿を遠心濃縮機、例えば　ミリボア　ウルトラ　フリー　 デバイスを用いて部分精製して、尿中の高分子量化合物を除去する。このサンプ ルを次にマイクロ遠心チューブに入れ、そして遠心真空エバポレーター遠心真空 エバポレーターを用いて乾かす、乾燥サンプルそれぞれに酢酸／水（３：　１７ 　ｖ／ｖ　）中の０．２Ｍのアミノナフタレン−１，３，６−）リスルホン酸（ ＾ＮＴＳ）　５μｌ及びジメチルスルホモンド（ＤＭＳＯ）中の１．０ＭのＮａ ＣＮＢＨｉ溶液５μｌを加える。この溶液をポルテックス混合し、ｔｏ、ｏｏｏ 　ｇで遠心して全ての反応物がチューブの先端にくることを確実にし、そして３ ７°Ｃでｔｓｈインキュベートする。この反応混合物を真空のもとで４ｈ、約４ ５°Ｃで遠心真空エバポレーターの中で乾かし、そして適当な濃度の電気泳動サ ンプルバッファーに溶かし、ラベル化ｔｅａの濃度を１００ｐ■ｏｌ／μｍにす る。

ラベル化サンプルを例えばＨｏｅｆｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎ５ｔｒｕ ｓ＋ｅｎｔｓ由来の標準型電気泳動装置を用いてポリアクリルアミドゲル電気泳 動に付する。用いる電気泳動バッファーはＬａｅｓｎｌｉのトリス／ＲＣＣ／グ リシン不連続系を基礎とするが、しかしＳＯ５は省いた。このポリアクリルアミ ドゲルは、架橋剤として１％（ｗ／ｖ）のＮＮ’−メチレンビスアクリルアミド を含む３５％（１１／ν）のポリアクリルアミドより成る。ゲルの重合は１０％ （ｗ　／いの過硫酸アンモニウム２０μｌ及びＮＮＮ’　Ｎ’−テトラメチレン −シアメン１０μＩを１２ｍ１のゲル溶液に加えることにより開始させる。分解 用ゲルサイズは高さ１０（ｌｓ＋ｍＸ幅１２０＋ｗｓ　Ｘ厚さ約０．３ｎ＋ａ＋ とじた。スタッキングゲルを用いた。サンプルウェルは幅７ＩＩＩＩｍとした。

サンプルを、バッファーフロントがゲルペースから約５〜１０ａ−に達するまで ２０００　Ｖで２４０分間泳動させた。

電圧は常に一定に保った。ゲルは、その廻りで攪拌されたロアー電極バッファー によって５〜７°Ｃに冷却した。

このゲルを冷却ＣＣＤカメラシステム、例えば＾ｓｔｒｏｍｅｄ　ＣＣＤカメラ を用いて撮影した（引用することで組入れる米国特許第４，８７４，４９２号を 参照のこと）、ゲルを、そのカセットから取外し、そして３０２ｎ＋ｗの最大放 射波長及び約７００μＷ／ｃｍ”の出力を有するＵ、　Ｖ、ライトボックス（例 えばトランスイルミネーター、７Ｍ４０型）の上に置いた後も撮影した。ネガ及 びポジ写真の両方を供するポラロイドタイプ５５フイルム（１５０５０）　、Ｗ ｒａｔｔｅｎ　８ゼラチンフイルター（Ｋｏｄａｋ）　、ｆ４．５の口径及び５ ０５の露出時間を利用した。

複合糖質代謝障害の診断 シアリド−シス、マンノシド−シス、ＧＭ、ガングリオシドーシスレン−１，３ ，６−）リスルホン酸（ＡＮＴＳ）でラベルし、そして前述の電気泳動に付した 。

患者サンプルより得られた炭水化物バンドパターンは互いと区別でき、そして健 康な個体から獲得した尿より得られたパターンからも区別できた。

以上の明細書は当業者が本発明を実施するのに十分であると考える。事実上、本 発明を実施するための前述した態様の、臨床化学の分野又は関連の分野に属する 当業者に自明である様々な変更は、下記の請求の範囲内にあると考えられる。

１、、ｌ−１＾−ｋｃｍ−Ｎ・　ＰＣＴハＪＳ　９２１０３７４０フロントペー ジの続き （５１）Ｉｎｔ、Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｑ　１／４８　Ｚ　６ ８０７−４８ＧＯＩＮ　２１／６４　Ｚ　７４１４−２Ｊ（８１）指定国　ＥＰ （ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ 、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ、ＲＵ、　ＳＤ、　Ｓ Ｅ Ｉ

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. １．炭水化物の混合物を含むサンプルの中に存在している炭水化物のレベルの測 定のための方法であって、下記の工程；蛍光団補助型炭水化物電気泳動によって 前記サンプル中に存在しうる前記炭水化物の混合物から前記炭水化物を分離させ 、前記サンプル中に存在している少なくとも一種の炭水化物の量を、標準品中に 存在している同じ炭水化物の量と比較すること、を含んで成る方法。
2. ２．障害を診断する方法であって、請求項１に記載の方法を含んで成り、ここで 前記炭水化物は診断炭水化物であり、前記サンプルは患者サンプルであり、そし て前記標準品は前記障害を有さない個体において存在している前記診断炭水化物 の量にある、方法。
3. ３．前記障害が、炭水化物代謝障害、自己免疫障害、感染障害、毒素化学物質暴 露及び癌より成る群から選ばれる、請求項２に記載の方法。
4. ４．前記障害が炭水化物代謝障害である、請求項３に記載の方法。
5. ５．前記障害が、ハーラー障害、シー障害、ハーラーシー障害、ハンター障害、 サンフィリッポ障害、モルキオ障害、マロテウクスーラミー障害、スライ障害、 マンノシドーシス、フコシドーシス、シアリドーシス、アスバリルグリコサミヌ リア、ガーシャー障害、クラッベ障害、ファブリー障害、シンドラー障害、ＧＭ １ガングリオシドーセス、ＧＭ２ガングリオシドーセス、ティーサックス障害、 サンドホック障害及びムコリピドーセスより成る群から選ばれる、請求項４に記 載の方法。
6. ６．前記障害が遺伝的に決定される、請求項４に記載の方法。
7. ７．前記障害がキャリアー状態において存在している、請求項６に記載の方法。
8. ８．前記の蛍光団補助型炭水化物電気泳動工程が、８−アミノナフタレン−１， ３，６−トリスルホン酸、１−アミノ−６，８−ジスルホン酸、ルシフェルイエ ロー及び２−アミノアクリドンより成る群から選ばれる染料の添加を含んで成る 、請求項２に記載の方法。
9. ９．前記サンプルが血液、尿、皮膚、骨髄、脳脊髄液、滑液、羊膜液及びリンパ 液より成る群から選ばれる組織又は体液である、請求項２に記載の方法。
10. １０．前記サンプルが固体組織に宙来する、請求項２に記載の方法。
11. １１．前記方法が、前記サンプルの遠心の工程を更に含んで成る、請求項２に記 載の方法。
12. １２．前記方法が、前記サンプルの限界濾過の工程を更に含んで成る、請求項２ に記載の方法。
13. １３．前記方法が、前記サンプルの清浄剤可溶化の工程を更に含んで成る、請求 項２に記載の方法。
14. １４．前記方法が、前記サンプルヘのグリコシダーゼの添加の工程を更に含んで 成る、請求項２に記載の方法。
15. １５．前記方法が、前記サンプルヘのグルコシルトランスフェラーゼ及び供与糖 の添加の工程を更に含んで成る、請求項２に記載の方法。
16. １６．前記方法が、前記サンプルヘのグリコシダーゼ活性を有する少なくとも一 種の酵素の添加の工程を更に含んで成る、請求項２に記載の方法。
17. １７．前記診断炭水化物の少なくとも一種が複合糖質の成分である、請求項２に 記載の方法。
18. １８．前記方法が、診断標準品の添加の工程を更に含んで成る、請求項２に記載 の方法。
19. １９．前記蛍光団補助型炭水化物電気泳動が二次元である、請求項２に記載の方 法。
20. ２０．前記炭水化物の量をＣＣＤにより測定する、請求項２に記載の方法。
21. ２１．前記ＣＣＤからの測定をコンピュータープログラムにより分析する請求項 ２０に記載の方法。
22. ２２．前記サンプルをヒトから獲得する、請求項２に記載の方法。
23. ２３．前記ヒトが幼児である、請求項２２に記載の方法。
24. ２４．前記方法が、前記分離炭水化物をその場で固定化用マトリックスに転写さ せる工程を更に含んで成る、請求項２に記載の方法。
25. ２５．前記方法が下記の工程 前記固定化用マトリックスに特異的な結合性試薬を加える（ここで前記特異的な 結合性試薬は診断炭水化物に特異的である）ことを更に含んで成る、請求項２４ に記載の方法。
26. ２６．前記特異的な結合性試薬が抗体及びレクチンより成る群から選ばれる、請 求項２５に記載の方法。
27. ２７．変化した炭水化物レベルにより特徴付けられる障害の診断のためのキット であって、 サンプルとの比較のための炭水化物標準品を含んで成るキット。
28. ２８．前記キットが、 電荷蛍光炭水化物ラベルを更に含んで成る、請求項２７に記載のキット。