JPH06508116A - ブラジキニンアンタゴニスト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ブラジキニンアンタゴニスト 本発明は、ブラジキニンアンタゴニストに関する。

本発明の背景 ブラジキニン（ＢＫ）は９個のアミノ酸（Ａｒｇ’　−Ｐｒｏ”　−Ｐｒｏ’− Ｇｌｙ’　−Ｐｈｅ’−３ｅｒ’　−Ｐｒｏ’　−Ｐｈｅ”　−Ａｒｇ”　）か ら成るペプチドであり、リジル−ＢＫ（カリジン）と共に、カリクレインと呼ば れるプロテアーゼによって前駆体キニノーゲンから放出される。血漿カリクレイ ンは不活性なチモーゲンとして循環し、そこからハーゲマン因子によって活性カ リクレインが放出される。組織カリクレインは、細胞内外の電解質輸送に関与し ていると考えられる部位の上皮細胞膜の外表面に主として局在しているように思 われる。

２つの主要なキニン前駆体蛋白である高分子量および低分子量ｔニノーゲンは肝 臓で合成され、血漿中を循環し、尿および鼻汁なとの分泌物中に見い出される。

高分子量キニノーゲンは、血漿カリクレインによる開裂でＢＫとなり、または組 織カリクレインによる開裂でカリジンとなる。しかしながら、低分子量キニノー ゲンは組織カリクレインのみに対する基質である。更にカリジンのアミノ末端の りジン残基か血漿アミノペプチダーゼによって除去されるため、カリジンがらＢ Ｋへの変換がある程度起り得る。キニンの血漿半減期は約１５秒であり、膝皿管 床を１回通過することにより８０〜９０％か崩壊する。血管床における主要な分 解酵素は、ジペプチジルカルボキシペブチダーセキニナーゼ［［またはアンギオ テンシン変換酵素（ＡＣＥ）である。より作用の遅い酵素であるキニナーゼ■ま たはカルボキシペプチダーゼＮはカルボキシル末端のＡｒｇを除去し、血漿中を 多量に循環している。このことは、生理学的にはこれがより重要な分解酵素であ るかもしれないことを示唆している。ＢＫまたはカリジンにキニナーゼＩが作用 することによってそれぞれ形成されるデスーＡｒｇ’−ブラジキニンまたはデス −Ａ　１ｇ１６−カリジンは、ＢＫ、レセプター作動薬として活性であるが、Ｂ Ｋおよびカリジンが共に強力な作動薬である更に多量に存在するＢＫ、レセプタ ーでは、比較的不活性である。

ブラジキニンは、疼痛を媒介するＣ線維求心性神経の、最も強力な天然に存在す る刺激物質のうちの１つであるということか知られている。またこれは強力な血 管拡張剤であり、浮腫形成剤であり、子宮、腸および細気管支のような組織中の 様々な血管性および非血管性の平滑筋に対する刺激物質である。またキニン／キ ニノーゲン活性化経路は、様々な生理的および病理生理学的過程において中心と なる役割を果たし、炎症反応において活性化される最初の系の１つであり、（ｉ ）ホスホリパーゼＡ２、従ってプロスタグランジンおよびロイコトリエンの生成 、および（２）ホスホリパーゼＣ１および従ってイノシトールリン酸およびジア シルグリセロールの放出、の最も強力な刺激物質の１つであるとも記載されてい る。

これらの作用は、Ｂ　Ｋ　ｆ型のＢＫレセプターの活性化によって主に媒介され る。

ブラジキニンの露出した皮膚への直接的適用、または動脈内または内臓内への注 射は、動物およびヒトにおいて痛覚を生じる。キニン様の物質か、様々な刺激に よって引き起こされた炎症部位から単離されてきた。更に、ブラジキニンレセプ ターは侵害受容性末梢神経路に局在し、ＢＫは痛覚を媒介する中心的な線維を刺 激することが示されていた。またブラジキニンは、疼痛の動物モデルにおいて痛 覚過敏を引き起こすことが可能であるとも示されている。（Ｂｕｒｃｈら、「ブ ラジキニンレセプター拮抗薬Ｊ　、Ｊ、　Ｍｅｄ、Ｃｈｅｍ、、３０　：２３７ 〜２６９　（１９９０）、およびＣ１ａｒｋ、、Ｗ、　Ｇ、、「キニン、および 末梢および中枢神経系」、実験的薬理学のハンドブック、ＸＸＶ　：ブラジキニ ン、カリジン、およびカリクレイン。

Ｅｒｄｏ、　Ｅ、　Ｇ、（監修）、３１’１〜３２２　（＋９７９）を参照され たい）。

これらの知見から、鎮痛剤としてＢＫ拮抗薬を使用することに多大な関心が向け られるようになった。多数の試験から、ブラジキニン拮抗薬は動物およびヒトの 両方において疼痛および痛覚過敏の双方を阻害または改善することが可能である ことか明らかになってきた。Ａｍ＋ｎｏｎｓ。

Ｗ、　Ｓ、ら、「心臓内ブラジキニンのＴ、〜Ｔ、内側を髄視床細胞（ｍｅｄｉ ａｌ　ｓｐｉｎｏｔｈａｌａｍｉｃ　ｃｅｌｌｓ）ｉこ対する作用」、τｈｅ　 Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ、０３６３〜 ６１１９　（１９８５）　；　Ｃ１ａｒｋ、Ｗ、　Ｇ、、「キニン、および末梢 および中枢神経系Ｊ　、Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＰ ｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、Ｘ　Ｘ　Ｖ巻：ブラジキニン、カリジン、およびカリ クレイン。Ｅｒｄｏ、Ｅ、Ｇ、（監修）、３１１〜３２２　（１９７９）　；　 Ｃｏ５ｔｅｌｌｏ、Ａ、　Ｈ，ら、「ブラジキニン拮抗薬による、カラゲナン誘 発痛覚過敏、温熱療法および浮腫の抑制Ｊ　、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａ ｌ　ｏｆ　ｐｈａｒｍａｃｏｉｏｇｙ。

１　７　１　：　２５９　〜２６３　（１９８９）　；Ｌａｎｅｕｖｉｌｌｅら 、「プラノキニンアナログは、ブラジキニンによって誘導されるラットのを髄侵 害反射の抑制を遮断する」、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈａ ｒｍａｃｏｌｏｇｙ、１３７　：　２８１−２８５　（１９８７）　；５ｔｅｒ ａｎｋａら、「ブラジキニン拮抗薬の抗侵害作用Ｊ　、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏ ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ。

１６：２６１〜２６２　（１９８年）　；　５ｔｅｒａｎｋａら、「疼痛メディ エータ−としてのブラジキニン：レセプターは知覚神経に局在し、拮抗薬は鎮痛 作用を有するｊｌＮｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇＹ、８５：３２４５〜３２４９　（１ ９８７）。

痛覚脱失に対して現在用いられる治療法は非常に限定されている。軽度から中度 の疼痛は非ステロイド抗炎症薬および他の弱い鎮痛剤を使用することによって軽 減することかできるが、外科的処置、火傷、および重篤な外傷に伴うような重度 の疼痛には麻薬性鎮痛剤の使用を必要とする。これらの薬剤は濫用の可能性、肉 体的および心理的な依存症、精神状態の変化、および呼吸抑制の限界を有し、こ のことがそれらの宵月性を著しく制限している。　７ ８に拮抗薬の分野におけるこれまでの努力は、そのような拮抗薬が様々な役割に 用いることができることを示している。これらは、火傷、手術時の疼痛、偏頭痛 および他の形態の疼痛、ショック、中枢神経系の損傷、喘息、鼻炎、早期分娩、 炎症性の関節炎、炎症性の腸疾患等の治療における使用を含む。

例えば、Ｗｈａｌｌｅｙらは、Ｎａｕｎｙｎ　Ｓｃｈｍｉｅｄｅｒｂｅｒｇ’５ Ａｒｃｈ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｉ、、３３６　：　６５２〜６５５　（１９８７ ）において、ＢＫ拮抗薬がヒト庖疹基礎モデルにおいてＢＫにより誘導された疼 痛を遮断することを明らかにした。このことは、そのような拮抗薬を局所的に適 用することにより、例えば多量の麻薬が長期間に渡り必要とされる重傷の火傷患 者において、および比較的軽傷の火傷または他の形態の局所的な皮膚損傷の局所 的治療に、火傷を負った皮膚における疼痛を抑制することができることを示唆し ている。

手術時の疼痛の管理には、過度の呼吸抑制を引き起こすことなしに、疼痛を軽減 するために十分な量の麻酔性の鎮痛剤を使用することが必要である。手術後の麻 酔によって引き起こされた換気低下は、患者に、手術後の発熱の一般的な原因で ある肺区域の崩壊を起こし易くし、またしばしば機械的換気の終了を遅らせる。

強力な非麻酔性の非経口的鎮痛剤か利用可能となることは、手術時の疼痛の治療 にとって意義ある追加となるであろう。慢性的な疼痛の管理に対する使用に適し た薬物動態的プロフィールを有する現在利用可能なりＫ拮抗薬は存在しないが、 手術時の疼痛の管理においては、頻繁な投与および持続注入か麻酔科医および外 科医によって既に一般に行われている。

いくつかの系列の証拠により、カリクレイン／キニン経路か片頭痛における血管 反応性および無菌性炎症の開始または増幅に関与し得ることが示唆されている（ 　Ｂａｃｋら、「様々な疾患の患者の脳を髄液中のカリクレイン−キニン系成分 の定量Ｊ　、Ｒｅｓ、　Ｃｌ１ｎ、　５ｔｕｄ、　Ｈｅａｄａｃｈｅｓ。

３：２１９〜２２６（１，９７２）を参照されたい）。片頭痛の予防的および非 麻薬的な治療法はいずれも作動性か限られており、またこれらの患者において麻 薬依存症の可能性もあるため、ＢＫ拮抗薬の使用はもう一つの非常に望ましい片 頭痛の治療法を提供するものである。

ブラジキニンは組織損傷中に産生され、冠状動脈の実験的閉塞後に冠状動脈洞血 液において見い出すことができる。また、ＢＫは、腹腔に直接注射した場合、内 臓型の疼痛を引き起こす（Ｎｅｓｓら、「内臓痛：実験的研究の総説Ｊ　、Ｐａ １ｎ、４１　：１６７〜２３４　（１９９０）を参照されたい）。多数の他のメ ディエータ−が前記以外の状況で疼痛および痛覚過敏の生成に関与していること は明らかであるが、ＢＫの拮抗薬はそのような形態の疼痛の軽減にも役割を果た しているものと考えられる。

細菌感染症に関連したショックは、重要な健康上の問題である。米国では毎年４ ００．０００例の細菌性敗血症が起きており、このうち２００．０００例がショ ックを起こし、これらの患者のうち５０％か死亡すると見積られている。現在用 いられている治療法は患者の体力を維持するのに左動であるか、最近の研究では 、グラム陰性エンドトキシンに対するモノクローン性抗体が疾患の結果に対し存 効な効果を示し得ることが示唆されている。この特異的治療にもかかわらず、死 亡率は以前高く、またかなりの割合の敗血症患者が抗エンドトキシン治療が作動 ではないと考えられるグラム陽性細菌に感染している。

多数の研究から、エンドトキシンに伴うショックの発生におけるカリクレイン／ キニン系の役割が示されている。Ａａｓｅｎら、［イヌにおけるエンドトキシン ショック中の血漿カリクレイン活性およびプレカリクレイン濃度Ｊ、Ｅｕｒ、　 Ｓｕｒｇ、、１０　：５０〜６２　（１９７７）　；Ａａｓｅｎら、「敗血症に おける血漿カリクレイン−キニン系」、Ａｒｃｈ、　Ｓｕｒｇ、、１１８：３４ ３〜３４６　（１９８３）　：　Ｋａｔｏｒｉら、「麻酔ラットにおいてエンド トキシンによって引き起こされた即時型低血圧症における、血漿カリクレイン／ キニン系の関与の証拠Ｊ　、Ｂｒ、　Ｊ。

Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、、９８　：１３８３〜１３９１　（１９８９）　；および Ｍａｒｃｅａｕら、「キニンの薬理学：それらの組織損傷オヨび炎症との関連性 ｊ、　Ｇｅｎ、、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、、１４　：２０９〜２２９（１９８２） を参照されたい。新た（二得られたＢＫ拮抗薬を用いた最近の研究から、動物モ デルにおいてこれらの化合物がエンドトキシンショックの進行に大きな影響を与 えることができることが明らかになった。（Ｗｅｉｐｅｒｔら、競合的ブラジキ ニン拮抗薬Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−［Ｈｙｐ”　、Ｔｈ　ｉ”　、Ｄ−Ｐｈｅ’　］　 −ＢＫを用いるラットのエンドトキシンショックでの動脈圧低下の抑制Ｊ　、Ｂ ｒ１ｔ、　Ｊ、　Ｐｈａｒｍ、、　９４．　２８２〜２８４（１９８８）を参照 されたい）。グラム陽性細菌による敗血症性ショックの発生におけるＢＫおよび 他のメディエータ−の役割に関しては、余りデータが得られていない。しかしな がら、同様のメカニズムが関与しているものと思われる。外傷にとって二次的な ショックは失血によることが多いが、カリクレイン／キニン系も活性化する。（ Ｈａｂｅｒｌａｎｄ、「キニンゲナーゼの役割、キニン形成及び外傷性ショック 後及び関連症状におけるキニンゲナーゼ抑制剤Ｊ　５Ｋｌｉｎｉｓｃｈｅ　Ｗｏ ｏｃｈｅｎ　−５ｃｈｒｉｆｔ、５６：３２５〜３３１　（１９７８）を参照さ れたい）。

多数の研究から、脳におけるカリクレイン／キニン系の活性の有意な濃度も明ら かになっている。カリクレインおよびＢＫは、ＣＮＳ損傷の動物モデルにおいて 脳血管を拡張する。（Ｅｌｌｉｓら、「特異的ブラジキニン拮抗薬によるブラジ キニン−およびカリクレイン−によって誘導される脳小動脈の拡張の阻害Ｊ　、 ５ｔｒｏｋｅ、１８　：　７９２〜７９５　（１９８７）、およびＫａｍｉｔａ ｎｉら、「脳循環の調節における脳カリクレインーキニン系の可能な役割に関す る証拠Ｊ、Ｃ１ｒｃ、　Ｒｅｓ、、５７：５４５＋−５５２（１９８５）を参照 されたい）。ブラジキニン拮抗薬は、脳外傷後の動物において脳水腫を減少する ことも明らかにされている。これらのデータから、ＢＫ拮抗薬が脳卒中および頭 部外傷の処理に有用であると考えられる。

他の研究から、ＢＫレセプターが肺に存在し、ＢＫが動物およびヒトにおいて気 管支収縮を引き起こすことができ、ＢＫの気管支収縮作用に対する感受性は喘息 患者で高くなることが明らかになっている。

いくつかの研究から、動物モデルでのＢＫ及びアレルゲンにより誘導される気管 支収縮はいずれもＢＫ拮抗薬によって抑制されることを明らかにすることができ た。

これらの研究は、喘息の治療にＢＫ拮抗薬を臨床薬として使用することができる ことを示している。（Ｂａｒｎｅｓ。

「炎症性のメディエータ−レセプターおよび喘息Ｊ　、　Ａｍ、。

Ｒｅｖ、　Ｒｅ５ｐｉｒ、　Ｄｉｓ、、１３５　：Ｓ２６〜Ｓ３１　（１９８７ ）；Ｂｕｒｃｈら、「ブラジキニンレセプター拮抗薬」、Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｃｈ ｅｍ、、３０　：　２３７〜２６９　（１９９０）　；Ｆｕｌｌｅｒ、ｒヒトに おけるブラジキニンによって誘導された気管支収縮Ｊ　、Ａｍ、　Ｒｅｖ、　Ｒ ｅ５ｐｉｒ、　Ｄｉｓ、、　１３５　：　１７６〜１８０　（１９８７）；　Ｊ ｉｎら、［合成の８ルセブター拮抗薬によるモルモットにおけるブラジキニンに よって誘発された気管支収縮の抑制、Ｂｒ、　Ｊ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、。

９７：５９８〜６０２　（１９８９）、およびＰｏ１ｏｓａら、「アトピー性喘 息における吸込されたブラジキニンによって誘発される気管支収縮に対するヒス タミンおよびプロスタノイドの寄与Ｊ　、Ａｌｌｅｒｇｙ、４５　：　１７４〜 １８２（１９９０）を参照されたい）。ブラジキニンは、アレルギー性およびウ ィルス性鼻炎における発症にも関与していた。これらの研究には、鼻の洗浄体液 にはカリクレインとＢＫとか含まれていること、およびこれらの物質の濃度が鼻 炎の症状とよく相関することを明らかにすることかある（　Ｂａｕ＋ｎｇａｒｔ ｅｎら、「ヒトの鼻の分泌物中の腺カリクレインの濃度は、実験的に誘導された アレルギー性鼻炎の際に上昇するＪ　、　Ｊ、　［ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１３７ ：１３２３〜１３２８　（１９８６）；　Ｊｉｎら、［モルモットにおけるブラ ジキニンによって誘導された気管支収縮の合成り２レセプター拮抗薬による抑制 Ｊ　、Ｂｒ、　Ｊ。

Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、、９７　：５９８〜６０２　（１９８９）　；及びＰｒｏ ｕｄら、「ブラジキニンによる鼻の刺激によって、鼻炎の症状および咽喉痛が誘 発されるＪ　、Ａｍ、　ｒｅｖ　。

Ｒｅ５ｐｉｒ、　Ｄｉｓ、、　１３７：６１３〜６１６　（１９８８）を参照さ れたい）。

また、ＢＫ自体が鼻炎の症状を引き起こすことができることか研究によって明ら かになっている。

Ｓｔｅｗａｒｔ及びＶａｖｒｅｋは、「ペプチドブラジキニン拮抗薬の化学」、 ブラジキニン拮抗薬：基礎的および化学的研究、Ｒ，Ｍ、　Ｂｕｒｃｈ　（監修 ）、５１〜９６　（１９９１）において、ＢＫの作用に対するペプチドＢＫ拮抗 薬およびそれらの可能な使用について論じる。改良された特性を有するこのよう な拮抗薬を開発するために多くの研究努力が成されてきた。しかしながら、その ような改良されたＢＫ拮抗薬を見い出す大きな努力にもかかわらず、更に有効な りＫ拮抗薬が未だ必要である。

現在利用可能なりＫ拮抗薬の２つの重要な問題点は、それらの効力が低い水準に あり、活性の持続時間が極めて短いことである。したがって、本発明の重要な目 的は、効力と作用持続時間が増加したことを特徴とする新規なりＫ拮抗薬ペプチ ドを提供することである。他の目的は、下記の説明からも明らかになるであろう 。

発明の要約 本発明は、一つの重要な態様では、２種類以上のブラジキニン拮抗薬（ＢＫＡ） ペプチドであって、これらか化学的に互いに連結して、二量体または高次オリゴ マー（ｒｍｅｒ」）を形成するペプチドから成る化合物か親ブラジキニン拮抗薬 ペプチド自体より強い効力および／または作用の持続時間を示すことを見出だし たことに基づいている。

広義には、本発明の化合物は、゛この態様によれば、式％式％（１） （式中、ＢＫＡはブラジキニン拮抗薬ペプチドの核であり、Ｘは結合基であり、 ｎは１より大きい整数である）で現すことができる。好ましくは、ｎは２であり 、これによって二量体が提供される。しかしながら、この化合物は、２個を上回 るＢＫＡ置換基を有することができ、すなわち、化合物は、三量体、または連結 基の性状によって許容される限界まで更に高次のｒｍｅｒＪであることができる 。

ＢＫＡ置換基は全部同じにして、ある意味では均質な化合物を提供するようにす ることができる。一方、場合によっては、化合物か異なる置換基を有することが 好ましいことがあり、すなわちこの化合物がＢＫＡ置換基に対して異種であるか または１以上のＢＫＡ及び異なる性質のリガンドまたはリガンド混合物を含むこ とができる。

同種およびまた異種の態様は、下記において更に詳細に説明されるように、本発 明によって考察される。

代謝の安定性、選択性及びレセプター結合のような特性を改善するため製薬上活 性な物質の二量体を提供するという考え方は、他の系について以前に報告されて いる。

この先行研究は、ペプチド作動薬及び拮抗薬を二量体化して効力およびまたは作 用の持続時間を増加されることから成っている（　Ｃａｐｏｒａｌｅら、Ｐｒｏ ｃ、１０　ｔ　ｈ。

Ａｍｅｒｉｃａｎ　ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｍｐ、、　Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃ ａｌ　Ｃｏ、、　ロックフォード、イリノイ州、４４９〜４５１　（１９８８） 、およびＲｏｓｅｎｂｌａｔｔら、欧州特許出願第ＥＰ　２９３１３０Ａ２号明 細書を参照されたい）。例えば、ペプチド作動薬の二量体化は、エンケファリン ／エンドルフィン（Ｓｈｉｍｏｈｉｇａｓｈｉ、　Ｙ、ら、ＢＢＲＣ，１４６， １１０９〜１１１５．１９８７）；物質Ｐ　（Ｈｉｇｕｃｈｉ、　Ｙ、ら、Ｅ、 　Ｊ。

Ｐ、、１６０，４１３〜４］、６．１９８９）；ブラジキニン（Ｖａｖｒｅｋ、 　Ｒ，及びＳｔｅｗａｒｔ、　Ｊ、、　Ｊ、　Ｐｒｏｃ、　８　ｔ　ｈＡｍｅｒ 、　Ｐｅｐｔ、　Ｓｖｍｐ、、３８１〜３８４．　１９８３）　；ニューロキニ ンＡ及び１３　（Ｋｏｄａｍａ、　Ｈ，ら、Ｅ、　Ｊ、　Ｐ、、１５１゜３１７ 〜３２０．１９８８）；インスリン（Ｒｏｔｈ、　Ｒ。

Ａ、ら、ＦＥＢＳ、１７０．３６０〜３６４．１９８４）、および心房性利尿ペ プチド（Ｃｈｉｎａ、　Ｎ、ら、ＢＢＲＣ。

１４１．６６５〜６７２．１９８６）に関して開示されている。拮抗薬の二量体 化は副甲状腺ホルモンについて示されている（Ｃａｐｒｏａｌｅ、　Ｌ、　Ｈ， ら、Ｐｒｏｃ、１０　ｔ　ｈＡｍｅｒ、　Ｐｅｐｔ、ＳｙｍＰ、、４４９〜４５ １．　１９８７）、しかしながら、本明細書で考察されるＢＫ拮抗薬の二量体ま たは高次ｒｍｅｒＳＪは、文献に開示されていない。

更に、先行する二量体化の検討の結果、本発明の化合物の一端または両端から二 量体化することの方が好ましかったが各種のＢＫ拮抗薬を、これらのリガンドの 末端の遊離のα−アミノまたはカルボキシル基を用いて外部位置から二量体化し てもこれらの薬剤の活性を増大する−とは思われず、はとんどの場合に減少する ことを本発明の一部として見出した。したがって、本発明は、好ましい態様とし て、関与するペプチドの両端の中間の位置にあるＢＫＡペプチドリガンドを連結 することを考察する。

本発明のもう一つの態様では、式 ％式％（［ の「モノマー性」化合物の新規な群、すなわち式（Ｉ）においてｎが１であり、 改質剤ＸがＢＫＡ置換基によって現される親ＢＫＡペプチドの拮抗薬特性を改良 する働きをする化合物が提供される。この改良は、例えば効力および／または作 用の持続時間の増加によって示すことができる。また、改質剤Ｘは、ペプチド鎖 内に位置するのが、すなわちペプチド鎖の末端にはないことが有利である。

もう一つの態様では、本発明は、式 ％式％（［ （式中、Ｘ及びＢＫＡは前記と同じ意味であり、Ｙは非ブラジキニンレセプター に対して拮抗薬または作動薬活性を示すリガンドである）を育する二量体につい て考察する。

したがって、要約すれば、本発明は、（ａ）式（Ｉ）のブラジキニン拮抗薬ペプ チドであって、同種または異種の二量体または高次のｒｍｅｒｓＪであることが できるもの、（ｂ）式（ＩＩ）のモノマーであって、ＢＫＡを改質して基Ｘを含 むようにしたもの、及び（Ｃ）ブラジキニン拮抗薬活性及び非ＢＫレセプター活 性を示す式（Ｉ［Ｈの異種二量体（拮抗薬または作動薬）に関する。

発明の詳細な説明 多数のＢＫ拮抗薬ペプチドが当該技術分野に知られており、これらの任意のもの を本発明の目的に用いてＢＫ置換基を提供することができる。イン・ビトロで最 も強力なりＫＡの一つは、式 ％式％ Ａｒｇ”を有するペプチドである（Ｒｅｇｏｌｉら、Ｔｒｅｎｄｓｉｎ　Ｐｈａ ｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ、１１　：　１５６〜１６１（１９ ９０）を参照されたい）。このペプチドは、本明細書では便宜上ＣＰ−００８８ と表され、本発明の目的に対して、ＢＫＡ活性を育する同じまたは異なるペプチ ドと連結させて式（１）で表される拮抗薬を提供するのに用いることができる。

本発明の様々な側面を例示するためにＣＰ−００８８が本明細書に用いられるが 、本発明は、本発明の目的に対して任意の利用可能なまたは既知のＢＫ拮抗薬ペ プチドの使用について考察するものであることを強調する必要がある。例えば、 最近の特許文献にはＢＫ拮抗薬ペプチドの多種多様な改質物が提案されており、 これらを用いて本発明の生成物のＢＫＡ成分または複数の成分を提供することが できる。（例えば、９個以上のＢＫ拮抗薬ペプチドであって、ある種のアミノ酸 残基が改質されたものを開示している欧州特許第Ａ−０３３４２４４号明細書（ Ｐｒｏｃｔｅｒ　ａｎｄ　Ｇａｍｂｌｅ）を参照されたい）。欧州特許第−Ａ− ０３７０４５３号明細書（Ｈｏｅｃｈｓｔ）及びＷＯ８９１０１７８０号明細書 及びＷＯ３９１０１７８１号明細書（Ｓｔｅｗａｒｔ等）にも、ＢＫ拮抗薬ペプ チドが記載されている。これらの特許公表明細書のいずれにも、同種または異種 の二量体、または高次のｒｍｅｒｓＪまたは本発明において考察されるようなリ ンカ−改質モノマーは示されていないと思われる。しかしなから、前記のように 、これらの刊行物のペプチドを本発明の実施に用いることかできる。したがって 、ＣＰ−００８８を例示の目的で用いるが、本発明はそれに限定されるものと考 えるべきではない。

本発明の一態様によれば、リンカ−Ｘは、ペプチド鎖の中のシスティン（ｃｙｓ ）残基を介して親ペプチド拮抗薬に育利に結合する。これには、出発ペプチドを 最初に改質して、それがペプチド鎖の中の適当な位置にｃｙＳ残基を含むように することが必要なことがある。

本発明は、ＣＰ−００８８の各種のＣｙｓ誘導体であって、ＣｙｓがＣＰ−００ ８８ペプチド鎖のＳｅｔまたはある種の他のアミノ酸に取って代わったものを用 いて例示される。

Ｃｙｓは、その反応性のスルフヒドリル基を介して適当なリンカ−Ｘの共有結合 し、安定なチオエーテルを好都合に提供することが見出されている。本発明のこ の態様によれば、ＣＰ−００８８の「６」位にシスティン残基を組み込むことが 好ましい。この位置は、以前は比較的重要でないものと考えられていた。（Ｓｔ ｅｗａｒｔ、　Ｊ、　Ｍ。

およびＶａｖｒｅｋ、　Ｒ，Ｊ、（１９９１）、「ペプチドブラジキニン拮抗薬 の化学」、ブラジキニン拮抗薬：基礎及び臨床的研究、Ｒ，Ｍ、　Ｂｕｒｃｈ　 （監修）　、Ｍａｒｃｅｌ　ＤｅｋｋａｒＩｎｃ、　、ニューヨーク、５１〜９ ６頁を参照されたい）。

しかしなから、本発明の重要な側面は、この一般に認められている６位の見解と は対照的にこの特異的座が二量体化及びモノマーを改質してその結果生じる生成 物に最適の特性を提供するのに重要であることを見出したことに基づいている。

しかしながら、本発明は「６」位における改質に限定されないことが理解される であろう。

これ以後に示されるように、多種多様なリンカ−Ｘの任意の一つを本発明の目的 に用いることができる。この基は、２個以上のペプチドであってその一方または 両方ともがＢＫＡであるものと化学的に結合する働きをする。

これがリンカ−の唯一の機能であることがある。しかしなから、リンカ−はそれ 自身か、後で示されるような全体の拮抗薬特性を改善する働きをすることもでき る。好ましくは、リンカ−は柔軟な線形基であり、所望なリガンドと容易に反応 する。好ましいリンカ−には、ビスマレイミドアルカン（ＢＭＡｓ）、例えばビ スマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）が挙げられる。このようなリンカ−との反応は 、そのマレイミド基どペプチド鎖内部のシスティン残基のスルフヒドリル基との 間で起こり、Ｓ−スクシンイミド誘導体を提供する。例えば、１．６−ビス−Ｓ −スクシンイミドヘキサン（ＢＳＨ）二量体は、Ｃｙｓ−食前ペプチド拮抗薬２ 等量とビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）１等量とを反応させることによって調 製することができる。他の好適な結合性基Ｘについては、後記する。

本発明による式（１）の好ましい二量体拮抗薬の１つは、本明細書において表記 を容易にするためにＣＰ−０１２７として同定する。この化合物は、前記のよう に当該技術分野において知られている更に強力なりＫ拮抗薬の一つであると考え られているＣＰ−００８８のような現在まてに知られているＢＫＡのほとんどよ りも著しく強力で且つ半減期か長いことが見出されている。ＣＰ−０１２７の改 良された拮抗薬特性は、２種類以上のペプチド拮抗薬を組合わせることの通常の 累積的作用として考えられるものより大きいという点て、全く予想外のものであ る。

化合物ＣＰ−０１２７は、ＢＫＡとしての製薬用途に必要な総ての特性を示し、 例えば、この化合物は、敗血症性ショックおよび手術時の疼痛のような急性徴候 の治療における非経口的使用に適当であるが、構造上は下記のように示される。

ＣＰ−０１２７は、リンカ−に結合している２個のペプチド鎖が同じであるとい う意味において同種二量体であることは明らかであろう。この化合物はＢＫＡ　 ＣＰ−００８８のＣｙｓ″誘導体、すなわち「６」位のＳｅｒがシスティン（Ｃ ｙｓ）によって置換されたＣＰ−００８８の２等量であって、Ｃｙｓのスルフヒ ドリル残基とビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）との反応によって互いに共有結 合したものから成る。結果として得られる生成物はＣｙｓ’　ＣＰ−００８８の １，６−ビス−Ｓ−スクシンイミドヘキサン（ＢＳＨ）二量体である。ＣＰ−０ ０８８のシスティン誘導体（Ｃｙｓ”）は、通常の手段によって調製することが できる。このＣｙｓ”誘導体は表記を容易にするためＣＰ−０１２６として同定 されるが、これを次に所望のビスマレイミド試薬と反応させることができる。ビ スマレイミド試薬がビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）であるＣＰ−０１２７の 場合（こ（よ、二量体（ＣＰ−０１２７）は下記の反応工程図（こしたカベって 得られる。

前記の工程図は、式（１）の生成物を調製する一つの可能な方法だけを示してい る。別の方法では、リンカ−をＢＫＡペプチドの一つのフラグメントに結合し、 他のペプチドフラグメントをリンカ−の他端に結合し、それぞれのペプチド（Ｂ ＫＡ）の残りは他のペプチドフラグメントか必要とされるものを加えることによ って完結させることかできる。当業者であれば、どの様な工程段階を用いても、 各種の官能基、特にペプチドまたはそのフラグメントのアミノ及びカルボキシ末 端基が望ましくなしＸ反応を起こさないように注意を払う必要があることを認識 するであろう。

ＢＭＨは好ましい結合基Ｘを提供するが他のビスマレイミドアルカン（ＢＭＡ） 　、例えば任意のビスマレイミド試薬であって、アルカンが１〜１２個の炭素原 子を有するものを用いることができる。アルカン基は、例えばカルボニルおよび ／またはアミノ基によって置換されていたりまたはこれらが間に介在することも できる。ＢＭＡにおけるアルキル鎖の長さは前記のように変動することかできる が、この長さが１個から１２個の炭素まで増加しても、ｐＡｚはほとんど変化し ない。しかしながら、回復の抑制は、増加する。また、アルキル鎖の長さが８個 の炭素原子を越えて上昇するので、部分的作動薬作用が示されることがある。一 般的に言えば、ＢＭＡリンカ−をＢＫ酸成分してのＣＰ−０１２６と共に用いる ときには、アルキル鎖の長さが６〜９個の炭素原子の範囲で細孔のｐ　Ａ　２値 か得られ、これらのリンカ−のうち、最良の結果はＢＭＨ（ビスマレイミドヘキ サン）を用いて得られ、指摘されたＢＳＨ結合が提供される。しかしなから、前 記のように、有効な結果は他の種類のリンカ−を用いて得ることかできる。した がって、基Ｘはスクシンイミド置換基を有し、但し用いられる改質が拮抗薬特性 に好ましくない影響を与えること無＜ＢＫＡペプチド置換基と結合するのに有効 であるということは本質的なものではない。

結合基としてのＢＭＨに対する代表的な代替物を、本明細書において後で用いら れ、リンカ−構造の左（＝示される生成する二量体の名称と共に下記（こ示すカ （、それぞれの場合において、二量体／三量体のＢＫＡ成分１ｔｃｐ−０１２６ の場合と同しであること力（理解される。

二量体／三量体　リンカー 本発明では、多種多様なリンカ−Ｘを親ＢＫ拮抗薬ペプチド（ＢＫＡ）のＣｙｓ −改質物と共にまたはなしでの使用を考察する。前記の種類のリンカ−に対する もう一つの代替物であって、前記ののＢＳＨの種類に就いて記載したシスティン による改質を行う必要がないものを下記に示す。

＊　キラリティーは、「ＤＪまたは「Ｌ」アミノ酸と同じくすることができる。

Ｒ／Ｒ“′は、Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ、Ｆｍｏｃ、Ｎｐｙｓのような保護基の任意の組 み合わせであることができる。

Ｒ’　／Ｒ”は、メチルエステル、エチルエステルまたはベンジルエステルのよ うな保護基の任意の組み合わせであることができ、保護基Ｒ，Ｒ’　、Ｒ’及び Ｒ“′は差別的に除去して、ペプチドフラグメントを共有結合的に結合して、必 要に応じてＢＫ、　、ＢＫ、　、ＮＫ、、ＮＫ、レセプター拮抗薬またはμオピ オイドレセプター作動薬を作成することができるものである。

ＩＮおよびＩＩ型のリンカ−の一般的な合成は、下記の方法で行うことができる 。有機リンカ−と適当に保護されたアミノ酸から成る数種類の別個のフラグメン トを調製して、互いに結合させる。次に、生成するフラグメントを、塩基によっ て触媒される環化の条件下を用いて、分子内環化させて一般的なヒダントイン構 造とする。

更に具体的には、ＩＮのリンカ−の合成には、下記の別個のフラグメントの調製 を含む。

フラグメント（１）、（２）及び（３）を互いに結合して、下記のフラグメント （４）を形成させる。

次に、フラグメント（４）をエチルクロロホルメートで処理した後、塩基によっ て触媒される環化条件により所望なＩ型の別種のリンカ−を生成する。

［ＩＷのリンカ−の合成は、次の別々のフラグメントの調製から成っている。

フラグメント（５）、（６）及び（７）を結合させて下記のフラグメント（８） を形成させる。

次に、フラグメント（８）をエチルクロロホルメートで処理した後、塩基によっ て触媒される環化条件により所望なｌ１ｆｆｉの別種のリンカ−を生成する。

群■またはＩＩからの所望なリンカ−を合成したならば、適当なペプチドフラグ メントと縮合して、所望なヘテロ−またはホモ−二量体を形成することができる 。このような合成を模式的に表したものを下記に示す。

脱保護　脱保護 例＝　Ｒ′＝メチルまたはエチルエステルＲ’＝ベンジルエステル Ｒ＝３−二トロビリジルスルフィド（Ｎ、、、’）Ｒ”　’　＝ＦＭＯＣ フラグメント： Ａ＝ＮＨ，−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ Ｂ＝ＮＨｔ　−ＤＰｈｅ−Ｌｅｕ−ＡｒｇＣ＝Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ −Ｇｌ　ｙ−ＰｈｅＣＯｘＨ Ｄ＝ＤＡｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−ＧｌｙＰ　ｈ　ｅ　ＣＯｘ　Ｈ 前記の合成は、異種二量体であって、リンカ−の各々の反応性基を差別的に脱保 護して、異種二量体の全ての４種のフラグメントを別々に加えることができるよ うになっているものの製造を示している。

前記の種類のリンカ−は、リガンドを「相殺」することができ、すなわちリガン ドを差別的にリンカ−にカップリングすることかできることが理解されるであろ う。

例えば、薬理学的理由から望ましいと考えられる場合には、一方の側では「６」 位から結合し、他の側では「５」位から結合するリガンドを作成することが可能 である。この種の好ましい異種二量体の一例は、後で例示するＢ　Ｋ　２拮抗薬 ／ＮＫ、拮抗薬異種二量体であって、ＮＫ、拮抗薬リガンドの４．５および６位 が好ましいものである。或いは、式（ＩＩＩ）成分に関連して後で説明するμ− オビオイド作動薬も、Ｃ−末端からのカップリングがこの種の異種二量体にとっ て好ましい合成法であるので、１個のフラグメントしかりンヵーにカップリング する必要がないことを除けば、この種のリンカ−に用いることができる。

前記のことから、本発明による式（Ｉ）〜（ＩＩ）の化合物を容易に利用可能な 手法を用いて調製することができることか認められるであろう。拮抗薬ペプチド 部分は容易に利用可能であるか、または固相若しくは液相ペプチド合成法を用い てばらばらに調製することができる。

既知の手法を用いてペプチド鎖内の所望な位置にＣｙｓ残基を提供することがで き、リンカ−改質の添加及び任意の引き続＜ｒｍｅｒＪ形成には従来の化学が関 与する。

本発明を、本発明の各種の側面を示している下記の実施例及び関連した第１Ａ、 ＩＢ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ，３，４，５Ａ、５Ｂ、６．７及び８　（ａ）　〜８　 （ｃ）で説明ＣＰ−０１２７の調製 二量体化したビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）にあってＣＰ−０１２７を生成 するペプチドである、ＣＰ−Ｏ１２６を、ペプチド分野においては普通の標準的 な段階的ペプチド鎖の伸張法を用いて固相ペプチド合成によって生成した（　Ｊ 、　Ｍ、　ＳｔｅｗａｒｔおよびＪ、　Ｄ、　Ｙｏｕｎｇ著、固相ペプチド合成 、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、社、１９８４年）。簡潔に述へれば 、固相ペプチド合成は合成樹脂に結合したアミノ酸のＮ　−脱保護から始める。

この段階に続いて、脱保護されたアミノ酸含有樹脂の中和および洗浄を行い、こ の樹脂が次のアミノ酸と反応し、ジシクロへキシルカルボジイミドおよび１−ヒ ドロキシベンゾトリアゾールによって活性化されて最初のペプチド結合（−Ｃｏ −ＮＨ−）の形成を促進する。続いて（ジ）ペプチド含有樹脂となった樹脂を洗 浄し、その後所望な樹脂か生成するまで一連のことを同様に行う。次いで、完成 したペプチドを樹脂から開裂させると同時に個々のアミノ酸側鎖の保護基を全て 除去する。

本明細書中に記載した合成に用いられる試薬は全て、標準的な販売元より購入し た。

固相ペプチド合成は、混合用の撹拌源として通気する窒素ガスを用いる手動の方 法によって行う。全てのペプチド結合において一時的な保護基としてＮ　−第三 −ブチルオキシカルボニル（Ｎ−ｔ−ＢＯＣ）保護基を用いた。更に具体的には 、以下の樹脂および保護されたアミノ酸を遂時的に使用した：　Ｎ　−ｔ−ＢＯ Ｃ−Ｌ−Ａ　ｒ　ｇ（Ｔｏｓ）−ＰＡＭ樹脂、Ｎ　−ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−Ｌ　ｅ　 ｕ。

Ｎ　−ｔ−ＢＯＣ−Ｄ−Ｐｈ　ｅ、　Ｎ　−ｔ−ＢＯＣ−Ｌ　−Ｃｙ　ｓ　（４ −Ｍｅ　ｂ）　、Ｎ　−ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−Ｐｈ　ｅ、Ｎ　−ｔ−ＢＯＣ−Ｇ　１ 　ｙＳＮ　−ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−Ｈｙｌ）（Ｂｚ　Ｉ）　、Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−Ｌ− Ｐｒｏ、　Ｎ−ｔ　−ＢＯＣ−Ｌ−Ａｒｇ　（Ｔｏｓ）　、Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−Ｄ −Ａ、ｒｇ（Ｔｏｓ）。

完成したペプチジル樹脂を真空で乾燥させ、その後Ｐｅｎ１ｎｓｕｌａ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉ　Ｗ　ＨＦ装置の反応器に入れる。カルボカチオンスカ ベンジャを用いない標準的ＨＦ法により、ＣＰ−０１２６を樹脂から開裂させる 。真空中でＨＦを除去した後、樹脂をジエチルエーテルで洗浄生成するペプチド （ＣＰ−０１２６）の２等量を、０．０５Ｍ重炭酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ８ ，４）中でビスマレイミドヘキサン（Ｐｉｅｒｃｅ）の１等量（０，５モル比） と反応させ、１時間撹拌した。続いて反応混合物を真空で濃縮し、生成する濃縮 物を０．１　Ｍ重炭酸アンモニウム（ｐＨ５）中に再溶解した。溶液を全部スル ホプロピル（Ｓ　Ｐ）セファデックス（Ｓｉｇｍａ）のカラム上に載せ、そのカ ラムを１時間にわたりＩ）Ｈ５〜９のグラディエンドにより溶出した。その後、 ペプチド結合体を含む画分を組み合わせ、真空で＃綻し、脱イオン水に再溶解し 、凍結乾燥した。

最終的なペプチドニ量体ＣＰ−０１２７の純度を、逆相ＨＰＬＣ、アミノ酸分析 、ペプチド配列分析およびエレクトロスプレーマススペクトル分析法によって評 価した。

実施例２ 化合物ＣＰ−０１２７は、下記の方法であって、数個の別個のペプチドフラグメ ントを調製し、結合基（ＢＳＨ）を加えて２つのフラグメントを結合させ、次に 、生成するフラグメントニ量体にその他の必要なペプチドフラグメントを加えて 完成する方法によって調製することもできる。

更に具体的には、この方法は下記の別々のペプチドフラグメントを調製すること から成っている。

（１）　Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−ＤＰｈｅ （２）　Ｌｅｕ−Ａｒｇ （３）　ｄＡｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒ。

（４）　Ｈｙｐ−Ｇｌｙ 但し、その好適な保護基については以下に説明する。フラグメント（１）および （２）を、互いに結合して、（５）　ＮＨｚ　−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−ＤＰｈｅ−Ｌ ｅｕ−Ａｒｇ−ＯＦｍ （但し、ＯＦｍはα−フルオレンメチルであり、ＣｙｓはＡｃｍ基により保護さ れている）を形成する。次に、中間体（５）の２分子を、ＢＭＨを用いてそれぞ れのＣｙｓスルフヒドリトリを介して互いに結合させ、（６）　Ｎｌ２−Ｐｈｅ 　−Ｃｙｓ　−ＤＰｈｅ−Ｌｅｕ　−Ａｒｇ　−ＯＦｍＢＳＨ を形成する。

フラグメント（３）および（４）を互いに結合して、（７）（ＢＯＣ）−ＤＡｒ ｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−ＯＨ （式中、ＢＯＣは第三−ブチルオキシカルボニルである）を形成させた後、（７ ）の２分子を（６）に結合して ＢＳＨ を生じる。続いて、Ｎ末端およびＣ末端保護基を除去し、二量体ＣＰ−０１２７ を得る。

この方法については、更に具体的に下記に概説する。

フラグメント（２）は、下記のとおり調製する。

Ｎ−Ｔ−ＢＯＣ−Ｌ　ｅ　ｕ　（１６，６８ｇ、６７ｍｍｏｌｅ）おおよびＡｒ ｇ−〇Ｆｍ、２８Ｃ１（２９，６８ｇ、７０ｍｍｏｌｅ）を、１４０ｍ１のＮ、 Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解し、その後１６ｍ１のジフェニルホスホリルア ジド（２０，４３ｇ、７４　ｍｍｏｌｅ）および２５ｍ１のジイソプロピルエチ ルアミン（１８，５５ｇ、１４３ｍｍｏｌｅ）を加える。

反応は、シリカゲル上で薄層クロマトグラフィー（ｎ　−ブタノール：酢酸：水 　４　：　１　：　１）により完了するまで室温下で行われる。

反応か完了したら、反応混合物を初めの容積の約ｌＯ％になるまで真空で濃縮す る。生成するスラリーを、酢酸エチル（１５０ｍｌ）中に溶解し、２５Ｏｎ＋１ 分離漏斗中で１０％炭酸水素ナトリウム（３Ｘ１００ｍｌ）、水（２ｘ　１００ ｍ１）　、０．１Ｍ塩酸（３Ｘ　１００ｍ１）および水（２Ｘ１００ｍしで洗浄 する。次に最終有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空で濃縮乾固する。

この時点で、固形物あるいは油性物を少量の酢酸エチル中に溶解し、ヘキサンを 用いて結晶化させる。固形物を真空濾過し、真空中で乾燥する。

Ｎ−ｔ−ＢＯＣ基をジオキサン（１００ｍｌ）中４ＮＨＣＩを用いて室温で１時 間除去する。その後溶媒を真空で除去し、生じた固形物（あるいは油性物）を少 量のメタノール（２０ｍｌ）中に溶解する。エチルエーテルを加えると、結晶化 が起こり、生成する固形物を真空濾過によって単離し、エチルエーテル（２ｘ５ ０ｍｌ）で洗浄し、真空中で乾燥させる。

フラグメント４は、同じ方法で調製する。フラグメント１および３は、追加のア ミノ酸を加えること以外は、同じ方法を用いて調製する。この時点で、Ｎ−ｔ− ＢＯＣ基は、フラグメント１および３上に残し、エステル基は下記のとおり除去 する。

エステル（メチルまたはエチル）は、ペプチドを１００ｍ１メタノール中に溶解 し、水酸化ナトリウム１．５等量を加え、次に、反応混合物をＯ″Ｃで１時間撹 拌することによって除去する。反応混合物をＩＮ　ＭＣＩによって中和し、真空 中で約３０ｍ１容積まで濃縮する。水（１００ｍｌ）を加え、続いてＩＮ　ＨＣ Ｉも加えて溶液のｐＨが約１になるようにする。ペプチドを、酢酸エチル（２Ｘ １００ｍｌ）を用いて水性溶液から抽出しする。そして−緒に纏めた酢酸エチル を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮する。生成する油状生成 物を少量の酢酸エチルに溶解し、ヘキサンを用いて結晶化する。

フラグメント（１）および（２）を結合し、上記と同じ方法で処理し、Ｎ末端ペ ンタペプチドを得る。フラグメント（３）および（４）を結合し、上記と同じ方 法で処理し、Ｃ末端ペンタペプチドを得る。

Ｃ末端ペンタペプチド（１０ｇ）を、１００ｍ１の４ＮＨＣＩ／ジオキサンを用 いて１時間脱保護する。ジオキサンを真空中で除去して油状生成物を得て、それ を２０ｍ１のメタノール中に溶解し、そして過剰量のエチルエーテルで処理する と白色の粉末を得る。このようにして生成した粉末を９０ｍ１の水に溶解し後、 １０ｍ１のメタノールを加えて、次にヨウ素（Ｉ２）を飽和した酢酸３０ｍ１を 加える。次いで、１時間撹拌を行う。反応混合物を等容のクロロホルムで２回抽 出し、水層を凍結乾燥する。

生成する灰白色の粉末を２０ｍ１の水に溶解し、活性化したＲｅｄｕｃｔａｃｒ ｙｌ樹脂（ＣＡＬＢ　ＩＯＣＨＥＭ）で２０分間処理する。Ｒｅｄｕｃｔａｃｒ ｙｌを濾過によって除去し、その後樹脂を２０ｍ１の０．１　Ｍアンモニウム重 炭酸塩緩衝液（ｐＨ８）で洗浄する。−緒に纏めたペプチドを含有する濾液を、 ３ｍｌのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド中で１．６ｇのビスマレイミドヘキサン （Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて処理し、２時間撹拌する。次に、反応混合物を真空中 で濃縮し、生成する濃縮物を５０ｍ１の０．１Ｍ重炭酸アンモニウム緩衝液（ｐ Ｈ５）中に再溶解する。溶液を全てスルホプロピル（Ｓ　Ｐ）セファデックス（ Ｓｉｇｍａ）の５０ｇカラム上に載せ、毎分３ｍｌで１時間にわたってカラムを ｐＨ５〜９のグラディエンドにより溶出する。ペプチドを含む両分をまとめ、真 空で濃縮し、ｌｏＯ［０１の水に再溶解し、乾燥凍結する。

この時点で、Ｎ末端ペプチド（フラグメント７）の２等量を、フラグメント２に ついて前記したのと同じプロトコルを用いてＣ末端二量体ペプチド（フラグメン ト６）に結合させる。

最終ペプチドの保護の除去は、３０％のピペリジンを含有する７５ｍ１のＮ、Ｎ −ジメチルホルムアミド中に５ｇのペプチドを溶解し、続いて２０分間撹拌する ことによって行う。溶媒を真空中で除去し、生成する油状生成物を１００ｍ１の 水に溶解する。次に、ｐＨを、ｌＮＨＣｌによって約１まで低下させ、生成物を 酢酸エチル（３×１００ｍ１）中に抽出する。−緒に纏めた酢酸エチルを真空中 で除去すると油状生成物が生じ、これを次に４ＮＨＣ１／ジオキサンに溶解し、 １時間撹拌する。ジオキサンを真空で除去し、生成する油状生成物を３０ｍ１の メタノール中に溶解する。最終的に過剰量のエチルエーテルを加えたところ、白 色粉末状の生成物か得られる。

ペプチドニ量体の最終的精製は、５ｇを０．１　Ｎ重炭酸アンモニウム緩衝液（ ｐＨ５）に溶解し、その溶液をスルホプロピル（Ｓ　Ｐ）セファデックス（Ｓｉ ｇａ＋ａ）の５０ｇカラム上に載せ、１時間にわたりｐＨ５〜ｐＨ９のグラディ エンドを行いながら１０ｍ１の画分を収集することにより行われる。各両分の純 度を分析ＨＰＬＣにより評価し、純粋な画分をまとめ、水を用いて３度凍結乾燥 する。

最終生成物の純度を逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃ’、アミノ酸分析、ペプチド配列分析およ びエレクトロスプレーマススペクトル分析法によって評価する。

前記の合成を行う際、各アミノ酸のアミノ基を、Ｎ−第二一ブトキシカルボニル （Ｎ−ｔ−ＢＯＣ）などにより必要に応じて保護することに留意するべきである 。アミノ酸のカルボキシル基も保護されるが、この場合はエステル官能基（例え ばエチル、メチルまたは９−フルオレンメチルエステル）で保護される。アルギ ニン（Ａｒｇ）のグアニジノ側鎖は塩酸（ＨＣＩ）塩として保護され、システィ ン（Ｃｙｓ）の硫黄原子はアセタミドメチル基（Ａｃｍ）によって保護されてい る。

実施例３ 実施例１に記載の方法で調製した化合物ＣＰ−０１２７を、当該技術分野におい てよく知られている試験を用いてＣｙｓ”−改質ペプチドＣＰ−０１２６および 親ペプチドＣＰ−００８８と、生物活性について比較した。イン・ビトロでの試 験を、標準的分析系、すなわちモルモットの回腸（ＧＰ　１）、ラット子宮（Ｒ Ｕ）およびウサギの頚静脈（ＲＪＶ）において実施した。これらの組織か各々、 ＢＫ、分類であるがそれぞれ異なるサブタイプであるＢＫレセプターを有するこ とはよ（知られている。各化合物の効力はＡｒｕｎ　１ａｋｓｈａｎａと５ｃｈ ｉｌｄによるＢｒ、　Ｊ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、、１ ４　：　４８〜５８（１９５９）の方法に基づき、ｐ　Ａ　を値として評価した 。

ｐＡ２は、作動薬の効力が２分の１に減少する、つまり一定の反応を起こすため にその拮抗薬の存在下では、それが不在の時の２倍の量の作動薬が必要となる作 動薬の存在下にて拮抗薬のモル濃度の負の対数であると定義できる。拮抗薬作用 の効力が高いことが高いｐ　Ａ　２値で示され、すなわち低濃度の拮抗薬か効果 的である。

各分析に関して、化合物についての回復率（％ＲｅＣ）もまた測定した。回復率 は、作用の持続性の基準であり、回復率値が低いほど、化合物の作用の持続性は 高い。

ＧＰＩ、ＲＵおよびＲＪＶ分析におけるＣＰ−００８８、ＣＰ−０１２６および ＣＰ−０１２７のＩ）Ａｔ値および回復率（％Ｒｅｃ）値は、表Ａに示した。

表へ 各組織において、親ペプチドＣＰ−００８８は、Ｃｙｓ’−改質ペプチド（ＣＰ −０１２６）とほぼ効力が等しいことがわかる。対照的に、二量体であるＣＰ− ０１２７は、ＣＰ−０１２６あるイハＣＰ−００８８より有意に強い効力がある 。ＣＰ−０１２７の効力の増加は、各組織におけるＣＰ−０１２６及びＣＰ−０ ０８８より有意に大きく、ＲＪＶ分析において最も大幅な増加が認められた。Ｇ ＰＩ及びＲＵついてのＣＰ−０１２７対ＣＰ−０１２６の効力の増加は、あまり 目立ったものではなかったが、それでもかなりのものであった。ＲＵおよびＲＪ Ｖ分析ニオイテ、ＣＰ−０１２７はｃｐ−。

０８８およびＣＰ−０１２６と比べて有意に低い％ＲｅＣを示すこともわかるだ ろう。ＲＪＶ分析におけるＣＰ−０１２６の％Ｒｅｃも、ＣＰ−００８８で得た 値より著しく良いものであった。

活性の持続性に関しては、最高濃度の拮抗薬への暴露後、各組織を十分に洗浄し 、次いで拮抗薬作用からの回復を評価したことに留意する。図ＩＡおよびＩＢは 、（ＩＡ）ＣＰ−０１２６及び（ＩＢ）ＣＰ−０１２７を用いた管内でのラット の子宮におけるＢＫに対する濃度作用曲線を表わす。ＢＫ回復曲線における差に 留意すべきである。図ＩＡかられかるように、ＣＰ−０１２６暴露後のＢＫに対 する濃度作用曲線は対照群においてみとめられるものにほぼ回帰した。対照的に ＣＰ−０１２７を用いた場合、繰り返し洗浄を行った後もまだＢＫの有意な拮抗 薬作用が認められた（図ＩＢ）。これにより、ＣＰ−０１２７の活性の持続性が ＣＰ−０１２６より長いことかわかる。

実施例４ ＣＰ−０１２６とＣＰ−０１２７の作用を比較するための試験に３例の生体内モ デルを用いた。これらは、以下のように（ａ）ウサギの皮膚血管透過性、（ｂ） ラットにおけるＢＫにより誘発された低血圧、および（Ｃ）麻酔ラットにおける ＬＰＳにより誘発された低血圧症、これらの実験において、２つのプロトコール を用いた。

第一のプロトコールは、従来の分析法であって、ＢＫを単独あるいは検討を行う 化合物と組み合わせて陵内注射し、次いでエバンスブルー染料を静脈内投与する ものを用いた。化合物を含有したまたは含有しないＢＫの陵内注射から３０分後 に、動物を層殺し、その皮膚を除去し、「青く染まっている」部分（すなわち、 血管透過性、あるいは浮腫）を測定した。このプロトコールを用いた結果は図２ Ａに示されている。このプロトコールを用いたところ、ＣＰ−０１２６がＣＰ− ０１２７より効力を有することかわかる。

第２のプロトコールには、試験化合物を予め注射し、その１５分あるいは３０分 後にＢＫを同じ部位に注射することを含有する。これらの結果は、それぞれ図２ Ｂおよび２Ｃに示す。ＣＰ−０１２７がブラジキニンに対する完全な阻害反応を 有する一方、ＣＰ−０１２６がその効力において有意に劣っているということは 明らかである。

（ｂ）ラットの血圧 麻酔ラットにおいて、ＣＰ−０１２６とＣＰ−０１２７拮抗薬の効力の比較を行 った。これらの動物におけるＢＫに対する低血圧症の用量−反応曲線の計算に続 いて、９　ｎｍｏｌ／　ｋｇ／分のＣＰ−０１２６あるいはＣＰ−０１２７いづ れかの静脈内注射の前、間、そして後に約３分の間隔をおいて、血圧を最大に低 下させる最低用量を反復投与した。図３は９　ｎｍｏｌ−ｋｇ−’　・分−１の ＣＰ−０１２６あるいはＣＰ−０１２７いづれがの静脈内注射の前、間、そして 後のＢＫ（４Ｘ１０−”モル）に対するラットの平均動脈圧における変化率に関 して得た結果を示している。

図３から、ＣＰ−０１２７がほぼ完全に高容量のＢＫに対する反応を抑制したが 、ＣＰ−０１２６はほとんど有効でないということがわかる。ＣＰ−０１２７の 注射を停止した後　ＢＫへの反応はゆっくり戻り、約２０分後には完全にか、に 戻ったということかわかる。

ラットにおけるＬＰＳによって誘発された低血圧症は、敗血性ショックの標準的 動物モデルである。このモデルにおいて、麻酔ラットに１５　ｍｇ／　ｋｇの大 腸菌のＬＰＳを静脈内に注射する。これにより、平均動脈圧の急激かつ大幅な低 下（５０〜６０％の変化）が生じる（図４）。

ＬＰＳ注射の６０分前、間及び後１：　ｌ　８　ｎｍｏｌ／ｋｇ−’／分″′の ＣＰ−０１２７を静脈内注入した場合、血圧の急激な低下の有意な減衰がみとめ られ、その後血圧は急速に正常値まで回復した。正常血圧は、その後試験が終了 するまで（約３〜４時間）続いた。これは、超低血圧が続いた対照群とは全く異 なっていた。実際、動物３例は、ＬＰＳ注射から２０分以内に死亡した。ＬＰ３ １５ｍｇ／ｋｇの静脈内全量注射に対する麻酔ラットの平均動脈圧における変化 率を表わす図４を参照のこと。

上記で参照したデータから、敗血性ショックの既知の動物モデルにおける特異的 刺激（すなわちＢＫ）および非特異的刺激（ＬＰＳ）に対する拮抗薬の効力を評 価するための探準的分析系を用いた場合、ＢＫ活性の管内および生体内モデル両 方において、二量体ＢＫ拮抗薬（ＣＰ−０１２７）は、Ｃｙｓ’単量体拮抗薬（ ＣＰ−０１２６）より有意に優れた効力を有することがわかる。

管内のデータによって、各分析組織におけるｃｐ−。

１２７の非常に優れた効力が示されており、特にウサギの頚静脈において最も顕 著な活性か認められる。既に述べたように、化合物ＣＰ−００８８は報告されて いる従来の管内分析系において最も効力がある（標準的ｐＡ　２定量によって評 価した）ＢＫＡであるため、それを試験目的のために文献から選択した。同じ判 定基準（ｐ　Ａ　２定量）を用いると、ＣＰ−０１２７の効力は、既存のＢＫＡ が全て報告されていないとしてもそのほとんどより、特にウサギ頚静脈において 優れているようである。

ＣＰ−０１２７のｐＡｍ値の最高値は、血管性試料、つまりウサギ頚静脈におい て得られ、また、この塁のＢＫＡはＢＫが関連する血管性の経過を治療するのに 好適であるようだ。従って、炎症におけるＢＫの役割を考慮すると、ＣＰ−０１ ２７の透過性／浮腫および血管拡張における作用は、特別な関連性を有する。２ つの拮抗薬、ＣＰ−０１２６とＣＰ−０１２７をＢＫと共に注射した場合、ＣＰ −０１２６はＣＰ−０１２７より有効であることがわかったため、皮膚の血管透 過性の試験から得られたデータは、興味深いものである。しかし、ＢＫによる誘 発の１５分〜３０分前ｆ：ｃＰ−０１２７およびＣＰ−０１２６をあらかじめ注 射した場合、ＣＰ−０１２６かＢＫと共に注射されたときに比べかなり効力が劣 ったのに対し、ＣＰ−０１２７はＢＫへの反応を完全に阻害した。この差の理由 はわからないが、おそらくそれは、二量体が受容体との平衡により多くの時間を 要し、また単量体と比べ１度結合すると置き換えが難しいためであろう。更に、 ＣＰ−０１２７はＣＰ−０１２６より代謝上、より安定しているようである。

既に述べたように、ＢＫがグラム陰性の細菌性感染に起因する敗血性ショックに 深く関っているという明白な証拠がある。これに関して、本二量体（ＣＰ−０１ ２７）か、麻酔ラットにおけるＢＫの最大用量に対する低血圧性の反応を効果的 に阻害する用量のＬＰＳへの反応を完全に逆転させるということに留意すべきで ある。ＣＰ−０１２６はＬＰＳ敗血性ショックモデルにおいて評価されていなか ったが、高用量のＢＫに対してこの化合物（ＣＰ−０２１６）か前動でないこと を考慮すると、これは同用量のＣＰ−０１２７よりその効力がかなり劣ると考え られている。

したがって、簡潔に述べると、ここに提供している管内および生体内のデータに よって、その絶対的効力、洗浄に対する耐性および作用の持続性において、単量 体（ＣＰ−０１２６）と二量体（ＣＰ−０１２７）ＢＫ拮抗薬の間に有意な量的 差かあることかわかる。

ＣＰ−０１２７の生体内利用効率については、単回用量（３，６μｍｏｌ　／ｋ ｇ）を皮下に（Ｓ、Ｃ，’）投与することによって、ＢＫに対する血圧および疼 痛反応を少なくとも２時間（実験の持続時間）完全に阻害し得ることが証明され ている。麻酔ラットを用いて、ＢＫに対する用量−反応曲線を構築し、ＥＤ５０ を同定した（図５ａ参照）。その後、ＣＰ−０１２７の単回Ｓ、Ｃ，注射前、そ して注射後に１５分間隔で、ＥＤ５０を注射した。図５ｂより、ＢＫへの反応が 実験の実施時間（２時間）を通して完全に阻害されていることかわかるだろう。

別の試験では、予め（４８時間前に）頚動脈に留置カニユーレ管の移植を受けた 無麻酔ラットにおける、ＢＫの動脈内注射への反応による疼痛を評価した。ブラ ジキニン（２０ｎｍｏｌｅｓ／　ｋｇ）を、経動脈的に注射したところ、持前の 対側足挙上、および頭部と体の回転が起こり、次いで静態期間に入った。観察さ れた行動による反応の程度を反映して、この反応を０〜５の上位目盛として定量 化した。

図６に示したデータにより、３．６μｍｏｌ／ｋｇでのＣＰ−０１２７の単回Ｓ 、Ｃ，注射が、試験の実施時間中（約２時間）持続する阻害作用によってＢＫに 対する反応を完全に消失させることか証明されている。対照群は、試験の実施時 間を通じて安定した反応パターンを示した。

実施例５ この実施例によって、ＣＰ−００８８の鎖に沿った異なる位置に、Ｃｙｓ残基、 およびその結果としてのリンカ−を導入することの効果を具体的に説明する。以 下の表Ｂにおいて同定した様々な化合物は、Ｃｙｓ残基を親ＣＰ−００８８の指 示した位置に導入し、次いで指示した通りにＣｙｓ残基のスルフヒドリル基とＢ ＭＷを反応させて二量体を得ることを伴う、実施例１の方法に従って調製する。

Ｃｙｓ改質した単量体、および生成する二量体の活性を、前記と同様に標準的組 織浴槽／ストレインゲージシステムを用いてモルモット回腸において管内で試験 した。ｐ　Ａ　２に基づく結果は、ＣＰ−００８８、ＣＰ−０１２６およびＣＰ −０１２７の結果と共に、表Ｂに表わした。示した通り光学異性体を合作してい ることを表わすため「Ｌ」およびｒＤ」の表示を用いた。

表Ｂ 表Ｂ　（続き） 上記の結果から、表Ｂに示した、結合位置に基づき並べである二量体の効力の順 位は、 ５≧６≧１≧２＞３＞０＞＞＞４．７．８．９であり、４．７．８、および９位 の二量体は不活性であることがわかる。更に表Ｂにおいて、１．２．３．５およ び６位にＣｙｓを有する総ての活性二量体は、対応する単量体より効力が強いこ とが示されている。これは、測定したし−及びＤ−異性体形態の両方においても いい得ることである。

実施例６ 実施例５において言及した様々な単量体および二量体について、そのラット子宮 モデルにおけるＢＫ活性のｐＡ２および％回復値を測定し、基準化合物ｃｐ−ｏ 。

８８、ＣＰ−０１２７及び親Ｃｙｓ’−含有単量体（ＣＰ−０１２６）ついて得 た対応する値と比較した。この結果を下記の表Ｃに示す。

＊Ｐ、Ａ、＝部分拮抗薬 表Ｃに示したラット子宮モデルにおける相対的な効力は、実施例５でモルモット 回腸において得たものと幾分異なっているが、ＣＰ−００８８の４．７．８およ び９位におけるＣｙｓ改質に基づいた化合物はここでもまた不活性であるという ことは注目すべきことである。更に、ラット子宮から得た結果により「６」位で の改質が優先的である。しかし、例えば関与するレセプターの型あるいはサブタ イプ次第で、他の結合あるいは改質も好適であり得ることか理解されるであろう 。

実施例７ ホモ−二量体ＣＰ−０１２７より得られたデータによって、この化合物が文献に 記載されている他の化合物と比べ有意に改良されていることがわかるが、二量体 化の効果がこの選択された特異的リンカ−１つまりＢＭＨ特有の態様ではないこ とを理解することが重要である。基本化合物ＣＰ−０１２６及びビスマレイミド アルカンリンカ−から得られる一連の二量体を下記に示す（表Ｄ）。

これらのデータは、様々なビスマレイミドアルカンを用いて前動なりＫ拮抗薬二 量体を形成することができることを明白に示している。好ましい化合物の選択は 、所望の特異的薬物動態品質に基づいて意図とする用途によって変化する。

表Ｄ リンカ−の長さの効果 実施例８ 本発明による下記の化合物を、ＣＰ−０１２６の改質物としても調製した。

但し、 は、ＣＰ−０１２６を表す。これらの化合物は、ＣＰ−Ｏ１２６、すなわち ＤＡｒｇ−Ａｒｇ−ＰＲＯ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−ＤＰｈｅ−Ｌｅ ｕ−ＡｒｇＨ を、本質的に実施例１に記載の方法で所定のリンカ−化金物と反応させることに よって調製される。

表記の化合物には、改質されたペプチド単量体（ＣＰ−０１７４、−０１７５・ ・・−０１３９）、二量体（ＣＰ−０１３８・・・−０１６３・・・および・・ ・−・・・０１７０）、および、二量体（ＣＰ−０１６４および−０１７６）か あることか理解されるであろう。

表Ｅで、モルモット回腸（ＧＰＩ）及びラット子宮でのＣＰ−０１２６及びＣＰ −０１２７を用いた試験における活性について前記の化合物を検定した時に得ら れるｐＡｚ値を比較する。

表Ｅ 表りおよびＥに挙げたデータは、下記のものを示す。

１、ｒＢＪ位のシスティンを遊離マレイミドと反応させることによって、これを Ｓ−スクシンイミド−し−システィン残基に変換すると、効力が向上する（ＣＰ −０１２６をＣＰ−０１３９，−０１７４、−０１７５と比較する）。しかしな がら、ある種類としての単量体は、それらの構造とは無関係に耐「洗い落とし」 性に関してはある種類としての二量体とは異なる挙動を示すことも見出した。緩 衝液を１回交換することによって、単量体を除去することができ、組織の投与量 ／反応プロフィールは処理前状態に戻るが、二量体ではその活性を逆転させ、系 をベースラインに戻すには、何回もの洗浄を必要とする。ＢＫ拮抗作用の単量体 対二量体の活性のイン・ビトロでのモデルのこの態様は、イン・ビボで二量体の 作用が長時間持続することを示している。

２、二量体化により改良された効力は、リンカ−が線状で且つ柔軟であるかぎり 、リンカ−によって大幅に影響されるとは思われない。しかしながら、更に柔軟 性がなく且つ制約されたリンカ−（ＣＰ−０１７０）は、対応する単量体（ＣＰ −０１２６）に関しては効力を改良しない。この点を強調するため、試験を行っ た二量体のうちで最も制約され且つ柔軟性に乏しいと思われるジスルフィドニ量 体（ＣＰ−０１３８）も比較的活性に乏しい。

実際のところ、この系ではその抑制活性はＣＰ−０１２６単量体と少しも異なら ない。

３、二量体化（ＣＰ−０１６４及びＣＰ−０１７６）は、二量体化（ＣＰ−０１ ２７、−０１６３および−０１６６）によって得られたものを越えて効力を改良 するとは思われない。

実施例９ リガンドに関するこの概念の普遍性を示すために、もう一つの代表的なりＫＡ　 （ＣＰ−０１８１）　、すナワチＤＡｒｇ’　−Ａｒｇ’−Ｐｒｏ’−Ｈｙｐコ ーＧｌｙ’　−Ｐｈｅ’　−８ｅｒ”　−ＤＰｈｅ’　−Ｐｈｅ”　−Ａｒｇ” を、「６」位にＣｙｓを導入し、ＢＭＷで二量体化してＢＳＨ二量体（ＣＰ−０ ２１５）を形成させることによって改質した。

ラットの子宮での分析についてのｐＡｚ値及び回復率は、このＢＳＨ二量体に関 して測定し、ＣＰ−００８８及びＣＰ−０１２７と比較した。結果を下記の表Ｆ に示すが、それらの対応する対照単量体と比較すると、これらの二量体ではｐＡ ｚの結果及び回復率が改良されていることが理解されるであろう。

表Ｆ 前記の結果（実施例３〜９）から、二量体が親または改質拮抗薬より効果的であ り、二量体は単量体よりも良好であるが、二量体を上回る改良を示さないことが 判る。

最良の結果は、それ自身ペプチド結合基としての単純な直鎖状炭化水素によって 好ましく結合されている反応性のビスマレイミド残基を用いて得られるとも考え られる。

ペプチドの付加に続いて２個の新たな不整中心を導入して光学的に異なる化合物 （すなわち、ジアステレオマー）を生成させても、拮抗薬の活性に好ましくない 影響を与えるとは考えられない。

前記の結果から、各種の改質を本発明の精神及び範囲から離反することなく行う ことができることが理解されるであろう。例えば、ＣＰ−００８８と呼ばれるＢ Ｋ拮抗薬は例示した二量体の調製において各種の位置にＣｙｓを挿入することに よって改質されたが、任意の親拮抗薬を用いて、全く改質なしにまたは異なる種 類の改質を有する青用な二量体を形成することができる。本発明の化合物を形成 するのに用いられるリンカ−も、前記のように変化させることができる。本発明 のこの態様を更に例示するものとしては、リンカ−がデキストランであって、デ キストラン分子の長さにそって無作為に改質して、最終的に下記のような反応性 マレイミド残基を存するようなものから成ることが注目される。

デキストラン　マレイミド改質デキストラン法に、生成するマレイミド置換デキ ストランを前記と同様の方法で遊離のスルフヒドリル食前ペプチドと様々なモル 比で反応させ、様々な置換密度及び全般的な大きさのペプチド−デキストラン包 合体を生成させることができる。

前記のように、本発明の重要な態様は、異種二量体または高次の異種ｒｍｅｒｓ Ｊであって、式（１）の化合物を提供するのに異なるＢＫＡを用いて居るものを 提供することである。この「異種」態様により、例えば２種類以上の異なるブラ ジキニンレセプター、例えばＢＫ。

及びＢＫ、レセプターにとって前動な二量体を設計することができる。これらの ２種類のレセプターは、極めて多量に存在するものと思われ、各種の組織におい て最大の寄与を行うことは明らかである。一般には、Ｃ−末端アルギニンが、循 環しているまたは組織に関連したカルＢ　Ｋ　１からＢ　Ｋ　＋　までのこの転 換の例では、選択性がブラジキニンからｄｅｓ−Ａｒｇ’−ＢＫまで、及びカリ ジンからｄｅｓ−Ａｒｇｌｏ−カリジン間での転換で見られる。この事は、一般 的なりＫ拮抗薬がＢＫ、及びＢ　Ｋ　ｘレセプター拮抗薬活性を含むことが好ま しいことを示している。一方、この拮抗薬はＢＫ、及びＢ　Ｋ　２レセプターに 対してだけ選択的に有効である状況がある。

これらの２種類のレセプター系の分布及び相対的重要性は組織毎及び種毎に変化 する。更に、各種の病理生理学的過程によりこれらの２種類のレセプター系の分 布及び重要性が同じ動物内で経時的に変化することがある。

すなわち、投薬を受けたことがない動物におけるレセプター分布は、病理生理学 的過程（例えば、敗血症）が暫くの間進んだ後の同じ動物におけるレセプター分 布とかなり異なることがある（　Ｍａｒｃｅｕａ、　Ｆ、ら、「キニンの薬理学 ：組織損傷と炎症に対するそのｌ！Ｉ連性Ｊ　、　ＧｅｎｅｒａｌＰｈａｒｍａ ｃｏｌｏｇｙ、１４　、　２０９〜２２９を参照されたい）。

その結果、どの種類の拮抗薬が所定の用途に最も適当であるかを知ることは困難 であり、ＢＫｔ拮抗薬から況では可能でないことがある。本発明による異種二量 体を提供することにより、例えば、Ｂ　Ｋ　＋及びＢ　Ｋ　ｘレセプターが両方 とも関与しているような状況を扱うことができる。

本発明による代表的な異種二量体であって、所定のＢＫ、及びＢＫ、拮抗薬単量 体を基剤とするものを、下記に示す。

ＢＫ、拮抗薬単量体 ＢＫ、拮抗薬単量体 ＢＫ、／ＢＫ、ｍ抗薬Ｂ　Ｓ　Ｈ異種二量体これらの異種二量体を用いることに よって、この二量体のそれぞれの「側」をそのそれぞれのレセプターに作用させ ることが可能であり、すなわち、ＢＫ、拮抗薬の側がＢＫ、レセプターを遮断し 、ＢＫｔ拮抗薬はＢ　Ｋ　２レセプターを遮断する。これを下記において説明す る。

実施例１゜ 数種類の異種二量体を、ラット子宮（Ｂ　Ｋ　！−レセプター）におけるＢＫま たはウサギ大動脈（ＢＫ、−レセプター）上のｄ　ｅ　５−Ａｒ　ｇ”　−ＢＫ 　（ＢＫ＋−レセプターの選択的作動薬）に対するそれらの拮抗薬活性に関して イン・ビトロで評価した。ラット子宮での分析により効力を前記と同様にして評 価し、ｐ　Ａ　を値を測定した。

これらを表Ｇに示す。

ウサギ大動脈における効力は、下記の方法で評価した。

製剤を供給してから１時間及び３時間後に、ｄｅｓ−Ａｒｇ’−ＢＫに対して濃 度効果曲線を構築した。５時間後に、単一濃度（１０−７Ｍ）のｄｅｓ−Ａｒｇ ”　−ＢＫを加え、持続的な収縮を起こした。次にそれぞれの拮抗薬を累積的に 最大収縮時に加え、濃度の５０％逆転（Ｉ　Ｃｉｏ）を引き起こす拮抗薬のモル 濃度の負の対数を測定した。これらのデーターを表Ｇに示す。

表Ｇ ＢＫ＋　Ａｎ／ＢＫｔ　Ａｎ単量体、同種二量体及び異種二量体 表Ｇのデータから、異種二量体の各部分は、そのそれぞれに対するレセプター上 で互いに独立して作用することができるということが明らかである。このことは 、ＢＫおよびＢＫ２レセプター双方が関係していると考えられる疾患の治療を可 能とする可能性がある。

更に表Ｇに示されたデータは、ＢＫ／ＢＫ２拮抗薬異種二量体を合成することは できるが、それぞれのジェミナルリガンドに対して得られる活性は、同種二量体 または対照単量体のいずれのものとも異なるということを示している。このこと は、二量体（同種または異種）の活性の向上において、その少なくとも一部は要 素を連結したことに起因するかもしれないこと、および最適の連結位置および化 学的性質の研究は、リンカ−で改質した単量体の合成および試験により、ジェミ ナルリガンドそれぞれに対し別々に研究することができることを示している。こ の理論に基づいて合成および試験した化合物の例を下記の例１１に記載する。

例１１ 改質した単量体を用いた、リンカ−の化学的性質の試験： 所望の同種または異種二量体の合成に先立ちリンカ−の化学的性質を最適化する ため、二量体化合物の合成および精製は行わずに、単一の対照リガンドを用いて 一連のリンカ−をスクリーニングすることが望ましい。下記（表Ｈ）の例示はジ ェミナルリガンドの１つとリンカ−とを連結したものの化学的性質を、同種また は異種二量体の構築に用いるための基準に近づけるために供する、対照リガンド ＣＰ−０１２６および様々な改質剤から作成した一連の改質ＢＫ、拮抗薬単量体 について示したものである。この一連のものには様々なモノマレミドアルカン改 質化合物が含まれており、それらに対応する前述の同種二量体と比較することが できる。

ＣＰ−０１２６の５−（Ｎ−アルキルスクシニミド）−Ｌ−システィン誘導体か ら成る表Ｈに示した改質単量体を、以下のように調製した： ＣＰ−０１２６（１等量）とＮ−アルキルマレイミド（１，５等量）とをＤＭＦ 　（ミリモルのペプチド当たり約２１ｍＬ）中で混合した混合物に、１０倍量の ＰＢＳ（ｐＨ７，５）を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌しく分析用逆相 ＨＰＬＣによって定期的にモニターする）、得られた５−（Ｎ−アルキルスクシ ニミド）改質ペプチドを調製用逆相ＨＰＬＣによって精製した。凍結乾燥した後 、綿毛状の白色固形物として、６０−８０％の収率で純粋なペプチドを得た。こ の一般的な工程によって調製したＣＰ−０１２６の誘導体には、ＣＰ−０１３９ ，２６４，２５７，１７４，１７５，２５６および２６６が含まれる。これらの ペプチドに対する特性の（マススペクトルによる）データを表Ｉに示す。

表１．　システィン改質誘導体ＣＰ−０１２６のマススペクトル特性 ａ、エレクトロスブシ・−マたはプラズマ脱着マススペクトルｂ、ｔＫ験せず 表Ｈのデータは、一般的に、得られた単量体のｐＡ。

はアルキル鎖の長さが増すに従って上昇し、その対応する同種二量体のｐＡｚと よ（相関することを示している。

このデータは、５−（Ｎ−へキシルアセタミド）−システィンで改質した単量体 より、５−（Ｎ−アルキルスクシニミド）−システィンで改質した単量体のほう がより強力であることも示している。更に、この結果はラセミ混合物および個々 の光学異性体の双方が機能的に有用であり、ラセミ混合物がレセプター相互作用 の異種性を提示するのに好ましいという可能性があることを示している。

表Ｈのデータが、改質単量体はそれ自体有効であり、また本発明の記載に基づい た使用に適当であるあることを示しているが、対応するリンカ−で改質した単量 体よりも二量体またはそれ以上の高次ｒｍｅｒｓ」　（同種または異種）を用い ることが通常好ましく、これは一般的に言って、後者は非改質ペプチド単量体よ りもいっそう強い活性を示すからである。更に、異なるレセプター集団と相互作 用することができる異種二量体は、活性および有用性において既知の改質単量体 のいずれとも分類上具なるであろうということも認められるであろう。

単一の対照リガンドおよび一連の異なる改質剤を用いる所望の同種または異種二 量体の構築を形成するのに適したリンカ−の化学的性質をより効率的に探索する ことが可能であるのとちょうど同じように、同種および異種二量体の構築を最も 効果的に最適化する目的のために、限られた数の代表的な改質剤を用いて一連の 所望される可能性のあるジェミナルリガンドを検討することも可能である。その ような一連の改質ＢＫ、拮抗薬単量体の１つを、得られた結果と共に例Ｉ２に示 し、図７に図の形で例示する。

例１２ 本例はＣＰ−０２９８の５−（Ｎ−へキシルスクシニミド）−Ｌ−システィン類 似体の調製を例示するものであり、Ｃｙｓの位置をＯから８まで変化させること によって５−（Ｎ−へキシルスクシニミド）残基をペプチド鎖に沿って移動させ る。

Ｃｙｓ含有Ｂ　Ｋ　＋ペプチド拮抗薬（１等量）およびＮ−へキシルマレイミド （１，５等量）をＤＭＦ　（ミリモルのペプチド当たり約２１ｍＬ）中で混合し た混合物に、１０倍量の０．１Ｍ　ＮＨａ）ＨＣＯｓ　（ｐＨ８）を添加した。

反応混合物を室温で一晩撹拌しく分析用逆相ＨＰＬＣによって定期的にモニター する）、得られたＣＰ−０２９８の５−（Ｎ−へキシルスクシニミド）−Ｌ−シ スティン類似体を調製用逆相ＨＰＬＣによって精製した。凍結乾燥した後、綿毛 状の白色固形物として、６０−８０％の収率で純粋なペプチドを得た。この一般 的な工程によって調製したＣＰ−０２９８の類似体には、ＣＰ−０３１１，３２ ２，３２４，３２６，３２８，３０７，３０５，３０９および３１３が含まれる 。これらのペプチドに対する特性の（マススペクトルによる）データを表Ｊに示 す。

表Ｊ ＣＰ−０２９８の５−（Ｎ−へキシルスクシニミド）−Ｌ−システィン類似体の マススペクトル特性ｂ　エレクトロスプレーマススペクトル対照リガンドとして のＣＰ−０２９８および表Ｊに示された類似物を、ウサギ大動脈を用いた分析法 でイン・ビトロで比較し、その結果を第７図にグラフに示した。

実施例１１及び１２によって提供されるデーターから、改質単量体法を用いるこ とにより、好ましい種類の連結化学並びに所望な同種または異種二量体を形成す る好ましい位置に関して重要な知見を速やかに得ることができるといったことな どの多数の重要な点が得られる。

Ｂ　Ｋ　を系の同種二量体の場合と全く同様に、生成するＢＫＩ化合物の活性に ついてリンカ−／改質剤の位置の大きな効果がある。興味深いことには、第７図 に示されているＢ　Ｋ　Ｉ拮抗薬系の化合物の改質剤位置−活性の関係は、同種 二量体のＢＫ２拮抗薬系列で見られるリンカ−位置−活性の関係とは著しく異な っている。これは、対応する対照リガンドを「６」位で改質または連結する効果 を比較するときに、最も明らかとなると思われる。

Ｂ　Ｋ　を拮抗薬同種二量体及び改質単量体系列の化合物では、この位置は、生 成する化合物の活性を促進し、作用持続時間を向上させる上で好ましい位置であ ることが判った。しかしながら、ＢＫ、系列では、同種位置は、実際上同様な改 質を行うのに最も好ましくない位置の一つＢＫ、拮抗薬／ＢＫ、拮抗薬異種二量 体（ＢＫ、Ａｎ／Ｂ　Ｋ　ＩＡ　ｎ　） この例では、実施例１２に記載した構造活性の関連性に基づいて合成され、試験 された一連のＢＫｚＡｎ／ＢＫ＋Ａｎ異種二量体を開示する。表には、これらの 検討に用いられる代表的なモノマー、その構造、ＢＫ、レセプターによって媒介 される活性についてウサギ大動脈において測定された効力を示したものである。

表りはこれらのモノマー由来の代表的なりＫｚ　Ａｎ／ＢＫ＋　Ａｎ異種二量体 を表に表わしたものであり、前例に開示された原理に基づいた強力な二重活性化 合物を作成することができることを示している。

表Ｋ ＢＫ、レセプター拮抗薬単量体 表しに示されるＣｙｓ−（ビススクシンイミドヘキサン）−（、ｙＳＢＫ２　／ ＢＫ＋拮抗薬異種二量体は、下記のようにして調製した。

ＣＰ−０１２６（１等量）とビスマレイミドヘキサン、　（ＢＭＷ、２等量）と をＤＭＦ　（ペプチド１ミリモル当たり約２１ｍ１）中で混合したものに、０． １　ＭＮＨ，ＨＣＯｉ　（ｐＨ８）を１０倍容積で加えた。反応混合物を室温で 約１時間撹拌しく分析用逆相ＨＰＬＣによって定期的に観察）、生成するＣＰ− ０１２６の５−（Ｎ−へキシルマレイミド）スクシンイミド誘導体を調整用逆相 ＨＰＬＣによって精製した。凍結乾燥した後、約７０％の収率で単離された生成 するペプチドを、次にＤＭＦ　（前記と同じｍｌ／ミリモル）中でＣｙｓ−含有 ＢＫ、ペプチド拮抗薬（１，５等量）と組み合わせた。Ｏ８ｔＭ　ＮＨ４ＨＣＯ ３（ｐＨ８）の１０倍容積を加え、約１時間室温で二量体化を進行させた。生成 するＣｙｓ−（ビススクシンイミド△・キサン）−Ｃｙｓペプチドニ量体を調製 用逆相ＨＰＬＣによって精製し、凍結乾燥すると、白色の綿毛状固形物を得た。

全収率は、４０〜５０％の範囲であった。この一般的方法で調製した異種二量体 には、表しに示されているＣＰ−０２７３，３６４゜３６５．３８６．３８２及 び３８３が挙げられる。

これらのペプチドについての特性決定（マススペクトル）データーを、表Ｍに示 す。

表Ｍ Ｂ　Ｋ　ｔ　Ａ　ｎ　／　Ｂ　Ｋ　＋　Ａ　ｎ異種二量体のマススペクトルによ る特性決定 ａ：　ＢＳＨ＝ビススクシンイミドヘキサン、ｂ：　ＥＳＣ＝ニブシロンスクシ ンイミドｎ−カプロイル、 Ｃ：　プラズマ脱着マススペクトル。

イン・ビトロスクリーニング 化合物ＣＰ−０２７３及びＣＰ−０３８６を比較目的で選択したが、これらの異 種二量体は同じＢＫ、拮抗薬リガンド（ＣＰ−０１２６）と同じリンｈ−（ＢＳ Ｈ）を用いており、２個のジェミナルリガンド（ＣＰ−０２５４及びＣＰ−０３ ７６’）は二量体化の位置が異なっているだけであるからである。前者の化合物 は、二量体の両側で１８３位で二量体化しているが（それぞれ、ＢＫ、及びＢＫ Ｉ拮抗薬に対して最も好ましい位置及び最も好ましくない位置）、後者の化合物 は改質された単量体分析によって測定されたジェミナルリガンドのそれぞれに対 して最も好ましい位置を用いている（それぞれ、「６」及び「１」位）。データ ー（表し）から理解されるように、ＢＫ、レセプター拮抗作用に関する２種類の 化合物の効力は、分析系の実験誤差の範囲内で同一であるが、ＢＫ、拮抗薬活性 は、それぞれの改質された単量体によって予想されるように、はぼ１００倍の差 がある。

異種二量体のレセプターに特異的な活性に関して活性の唯一の予測体として改質 された単量体を用いることには限界があることに留意すべきである。これらの限 界は、二量体性構築物の最終的活性を決定する際のジェミナルリガンドと問題と なっているリガンドとの相互作用が重要であることも示している。この相互作用 の重要性の例は、化合物ＣＰ−０３８２とＣＰ−０３８３であって、ＢＫ、拮抗 薬作用は保持されたが、Ｂ　Ｋ　を活性は完全な拮抗作用から実質的な部分が作 動薬作用へと変化したものとなったものである。ＢＫ、拮抗薬リガンド（ＣＰ− ０３７４およびＣＰ−０３７５）は、単量体として試験したときには、ラット子 宮のＢＫ２レセプター系では作動薬としても拮抗薬としても測定可能な活性は示 さなかった。ジェミナルリガンドの活性の明確な変化は、試験したリンカ−とリ ガンドとによって引き起こされる二量体全体に対する作用だけに起因するものと 考えることができ、全体としての二量体構築物の重要性及び潜在的な有用性を明 らかに示している。

イン・ビボ分析 異種二量体構築物を傷ついて動物に投与すると、２種類の異なるレセプターに起 因すると考えられる活性が同時に遮断されることは、ＢＫ！及びＢＫ、レセプタ ー活性の標準的分析法を用いて知られている（ｄｅＢｌｏｉｓ。

Ｂｏｕｔｈｉ　ｆｌｉｅｒ及びＭａｒｃｅａｕ、　Ｂｒ１ｔ、　Ｊ、　Ｐｈａｒ ｍ、、　１０３　。

１０５７−１０８６．１９９１を参照されたい）。正常なウサギでは、全身的な 動脈血圧は、ＢＫ、レセプター作動薬を投与しても全く変化しない。しかしなが ら、ＢＫ２作動薬に対しては予測可能で再現性がある反応が本質的に存在する。

ＬＰＳで刺激すると、Ｂ　Ｋ　＋　レセプター活性が経時的に現れ、以前は全く 重要でながったＢＫ、作動薬の投与量に対して大きな反応が３〜４時間後には認 められるようになる。ＢＫ２作動薬に対する反応は、これらの動物では変化しな い。この点で、異種二量体性拮抗薬を用いて、ＢＫ、及びＢＫ、にょって媒介さ れる全身の血圧低下を同時に遮断する能力を直接試験することができる。

第８ａ、ｂ及び０図は、代表的な異種二量体（ＣＰ−０３６４）かＢＫ、−及び ＢＫ２−にょって媒介される低血圧反応を同時に遮断することができることを示 す目的で設計された一連の実験からの実際の血圧の軌跡である。第８ａ図は、Ｂ 　Ｋ　２桔抗薬ＣＰ−００８８（７）不在または存在下で静脈内全量注射として 放出されたＢＫ、及びＢＫ２作動薬に対してエンドトキシンで前処理した後の正 常なウサギの群の血圧反応曲線である。第８ｂ図は、選択的なりＫ、拮抗薬ＣＰ −０２９８の存在下での同じ動物群の反応曲線を示している。最後に、第８ｃ図 は、Ｂ　Ｋ　２　Ａ　ｎ　／　Ｂ　Ｋ　＋　Ａ　ｎ異種二量体ＣＰ−０３６４の 不在及び存在下でのＢ　Ｋ　＋およびＢ　Ｋ　２作動薬に対する同様に処理した 動物の群の反応曲線である。これらの軌跡から判るように、選択的な作動薬はそ れぞれの作動薬に対する反応のみに影響を与えるが、異種二量体はいずれの作動 薬に対する反応曲線を同時に遮断することができる。これは、任意の所定の異種 二量体分子が２一つの異なる種類のレセプターに同時に関与していることを意味 するものではなく、異種二量体分子の個体数が同じ動物のＢ　Ｋ　Ｉ及びＢＫ２ レセプターの個体数に同時に拮抗することができることを意味している。単量体 、同種二量体及び異種二量体の代表的な群からのデーターを、表Ｎに纏める。

予想される拮抗薬活性は、表におよびＬに纏めたデーターに基づいたものである 。記録されたイン・ビボでの実験的データは、実験開始の２０時間前に致死量以 下のＬＰＳ（１０μｇ）を投与されたウサギで３段階の異なる投与量（１１３お よび１０μｇ−ｋｇ−’−分−１）テノ拮抗薬活性の定性的な測定である。ｒ＋ Ｊという記号は、（第８図に示されるように）適当な作動薬に対して血圧の応答 が完全に遮断されることを示し、「±Ｊは部分的に遮断されることを示し、「− 」は記載されている投与量では観察し得るほどの効果が見られないことを示して いる。これらのデーターから、これらの化合物の拮抗薬活性のイン・ビトロでの 特性決定はイン・ビボでの活性の比較的精確な尺度であり、所望な活性を得る目 的で異種二量体をスクリーニングするための有用な手法であることは明らかであ る。

表Ｎ 前記のように、本発明のもう一つの態様は、式（Ｙ’）（Ｘ）（ＢＫＡ）　（Ｉ ｎ （式中、Ｘ及びＢＫＡは前記と同じ意味であり、Ｙは非ＢＫレセプター、すなわ ちＢＫ（例えば、ＢＫ、　）及び非−ＢＫレセプター固体群を標的とした異種二 量体に対して拮抗薬または作動薬活性を示すペプチド鎖を表わす）を有する化合 物を提供することである。本発明によるＢＫ＋／ＢＫｚ拮抗薬異種二量体は両方 の種類のレセプターに対する効果的な二重活性を提供することが出来ることは前 記から明らかであるので、本発明の開示及び教示内容にしたがって他の強力な異 種二量体を調製することができることが理解されるであろう。このことは、関与 している活性が緊密な関連性を存する場合には特に重要である。

多数の病態生理学的に重要な過程には、炎症性及び神経性メディエータ−には緊 密な相互作用があることが知られている。これは、例えば、組織外傷（事故及び 術後）、手術後の）に伴う苦痛や喘息で見られる。いずれの場合にも、組織及び 血漿由来のメゾイエイタ−（ＢＫ２レセプターに作用するキニン）と神経由来の 因子、例えば物質Ｐ　（ＮＫ、レセプター）及びニューロキニンＡ　（ＮＫ２　 レセプター）には複雑な相互作用がある。

最後に、刺激を加えることにより種類には関係なく神経原性ペプチド（物質Ｐ、 ニューロキニンＡ、ニューロキニンＢ、コレシストキニン、Ｃ０ＲＰなど）の放 出を抑制することができるμｍオピオイド類の局所作用性の神経レセプターがあ る。

これら及び他の炎症性及び神経原性メゾイエイタ−に相互作用を仮定すれば、病 態生理学に付随する症状を改善するのに一薬剤ではあらゆる場合に有効であると は思われない。しかしながら、本発明による異種二量体は、二重の選択性を有す る単一薬剤でこれらの問題点を解決するのに特に有用である。更に、本発明によ る異種二量体を用いて、選択性が極めて高い薬剤の開発で直面する多くのこれま での極端な問題点を回避することができると思われる。例えば、ＢＫ拮抗薬につ いての場合のように、物質Ｐ及びニューロキニンＡ拮抗薬やμｍオピオイド作動 薬ペプチドは、いずれも関連した組織の多く並びに可溶性のエンド−及びエキソ ペプチダーゼによって速゛やかに不活性化されてしまうといった共通の問題点を 育している。本発明の異種二量体は、本明細書に記載したＢＫ、同種二量体につ いて見出されているような効力及び特異性を損なうことなく速やかな不活性化を 防止することができると思われる。エンケファリンやオピオイド作動薬は、中枢 神経系に接近すると、乱用または依存性の可能性がかなり高く、極端な精神的及 び認識上の副作用を有するといった問題点も有する。また、異種二量体は、μｍ オピオイドレセプター作動薬がカチオン性の高いＢＫ拮抗薬に共育結合的に結合 し、有意な程度間で血液脳関門を透過するとは思われないということによる好ま しくなく且つ極端な中枢神経系の副作用のない例外的なものではないにしても適 度な抹消での活性を考慮巣癖であると考える。

下記の実施例では、対照ＢＫ２リガンド、ＣＰ−０１２６を各種のＮ　Ｋ　＋及 びＮＫ２拮抗薬並びに一連の作動薬ペプチドで二量体化することによって形成さ れる様々な異種二量体について説明する。当業者には明らかなように、このよう な異種二量体の設計、合成及び使用は、本発明の開示に例示されている具体的な 化合物に限定されるものではなく、標準的な化学を用いて、過度の実験を行うこ となく多数の適当なリガンドの任意の２個を組み合わせることによって行うこと ができる。

実施例１４ ＢＫ２拮抗薬／ＮＫ、拮抗薬異種二量体（ＢＫｔＡｎ／ＮＫ＋Ａｎ） ２個の異なるレセプター固体群を単一の化合物で遮断できることを示すために、 コンセンサスＮＫ、レセプター拮抗薬（ＤＡｒｇ−ＤＰｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ− Ｇｌｎ−Ａｓｎ−ＤＰｈｅ−Ｐｈｅ−ＤＴｒｐ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ）を合成した。

この拮抗薬は、ＮＫ、レセプター活性の標準的モルモット回腸による分析法では 物質Ｐに対して試験したところｐＡ、が５．６であることが判った。この対照り ガントの活性を確認したならば、対照ペプチドを介して逐次的にリジン残基を系 統的に置換することによって形成した一連のりジン食前単量体を合成した。次に 、これらの化合物を異種二官能性連結剤であるニブシロンマレイミドｎ−カプロ イルＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）を用いてｃＰ−０１２ ６＋＝連結して、−表０ ”　ＥＳＣ＝ニブシロンスクシンイミドｎ−カプロイル、ＣＴ−０００８＝　Ｄ −Ａｒｇ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ −Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−ＣＯＮＨｚ表０に示したＣｙｓ−（ニブシロン スクシンイミドｎ−カプロイル）　Ｌｙｓ　ＢＫ２　Ａｎ／ＮＫ＋　Ａｎ異種二 量体は、下記の通りに調製した。

Ｌ−Ｌｙｓ　（ＦＭＯＣ）含１ｒＮＫｌペプチド拮抗薬−樹脂（ＭＢＨＡ、０． ５ミリモルペプチド）を５０％ピペリジン／ＤＭＦ　（約２０ｍ１）に加えた。

生成する混合物＋：　Ｎ　ｘ　（ｇ　）を２０分間通じて（Ｌｙｓ）ＦＭＯＣ保 護基を完全に除去した後、ペプチド−樹脂をＤＭＦで十分に洗浄した。ペプチド −樹脂をＤＭＦに再懸濁し、ＥＭＣ３（ニブシロンマレイミドｎ−カプロン酸Ｎ −ヒドロキシスクシンイミドエステル）１．５等量を加えた。アシル化反応を室 温で２〜３時間行い（アシル化が完了したことはカイザー試験によって確認した ）、その後ペプチド−樹脂をＤＭＦで十分に洗浄し、次いで１０％（Ｖ／ｖ）Ｎ Ｈ４ＨＣＯｓ　／ＤＭＦ　（保存濃度：０．ＩＭ、ｐＨ８）で洗浄した。ＣＰ− ０１２６の１０％（ｖ／ｖ）ＮＨ，ＨＣＯｓ　／ＤＭＦ中で３等量をマレイミド 含有ペプチド−樹脂に加え、次いで共役付加（ｌ、４−付加）を室温で数時間行 った。次に、ペプチド−樹脂を、１０％ＮＨ，ＨＣＯ＊　／ＤＭＦ、ＤＭＦおよ びジクロロメタンで（連続的に）十分洗浄した。真空で十分乾燥した後、異種二 量体を０℃で無水のＨＦで脱保護し／ペプチドー樹脂から開裂させた後、調製用 の逆相ＨＰＬＣによって精製した。凍結乾燥したところ、純粋なペプチドを５０ 〜６０％の収率で綿毛状の白色固形物として得た。この一般的手法によって調製 した異種二量体には、ＣＰ−０３９０，３９１，３９２，３９３，３９４，３９ ５，３９６，３９７，３９８，３９９及び４００が挙げられる。

これらのペプチドについての特性決定（マススペクトル）データーを、表Ｐに示 す。

表Ｐ ”　ＥＳＣ＝ニブシロンスクシンイミドｎ−カプロイル、ゝＣＴ−０００８＝Ｄ −Ａｒｇ−Ｄ−Ｐｒｏ−ＬＹｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ −Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−ＣＯＮＨｚ°得られたプラズマ脱着マススペク トル、’　ＮＴ＝試験せず。

前記に関連して、マレイミド含１ｒＮＫ、ペプチド拮抗薬をペプチド−樹脂から 開裂させ、精製した後、必要または所望であれば、溶液中でＣＰ−０１２６と縮 合させることができる。

この一連の化合物に対して異なる連結法を用いて、本発明の手段にはシスティン を基礎とする化学が必要でなく、二量体構造の形成に用いることができる可能な 化学の幅を示したことに留意することも重要である。これらのデーターから判る ように、ＢＫＩとＮ　Ｋ　Ｉ　との両方のレセプター活性に拮抗することができ る異種二量体は、その特異的なレセプターについて適当なジェミナルリガンドの 活性を保持または改良するが、この種の合成法を用いて可能である。この実施例 では、ＮＫ、拮抗薬のジェミナルリガンドにおける４、５及び６位がＮＫ、拮抗 薬並びにＢＫ、拮抗薬の活性を保持または改良する上で最適である。この種のＣ ｙ　ｓ　／　Ｃｙ　ｓ異種二量体もある種の応用には可能であり且つ好ましいこ とがあるのは明ＢＫ、拮抗薬／ＮＫ、拮抗薬異種二量体（Ｂ　Ｋ　ｔ　Ａ　ｎ　 ／ＮＫ＊Ａｎ） ＢＫ２　Ａｎを基剤とする異種二量体が他の２種類のレセプター個体群を効果的 に遮断することができることを例示し且つ更に証明するために、一連のＢＫｔＡ ｎ／ＮＫｘ　Ａｎ異種二量体を他の異種二量体構造について前記の方法で調製し た。この場合には、Ｃ７Ｓ　／　Ｃｙ　ｓ連結法を用いたがＣｙ　ｓ　／　Ｌ　 ｙ　ｓまたは他の方法も容易に用いることができることを理解すべきである。

対照リガンド（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−ＤＴｒｐ−Ｖａ　１−ＤＴｒｐ−ＤＴｒｐ−Ａ ｒｇ−ＣＯＮＨ２）のＣｙｓ−（ビススクシンイミドヘキサン）−ＣｙｓＢＫｔ 　／ＮＫ、拮抗薬異種二量体は、下記の通りに調製した。

Ｃｙｓ含有Ｂ　Ｋ　２ペプチド拮抗薬（１等量）及びビスマレイミドヘキサン（ ＢＭＨ，２等量）をＤＭＦ　（ペプチド１ミリモルに対して約２１ｍ１）中で混 合したものに、１０倍容（７）０．１Ｍ　ＮＨ，ＨＣＯｓ　（ｐＨ８）を加えた 。

反応混合物を室温で数時間撹拌しく分析用逆相ＨＰＬＣで定期的に観察し）、生 成するＢ　Ｋ　を拮抗薬の５−（Ｎ−へキシルマレイミド）スクシンイミド誘導 体を調製用逆相ＨＰＬＣによって精製した。凍結乾燥の後約７０％の収率で単離 された生成するペプチドをＤＭＦ　（前記と同じｍｌ／ミリモル）中テＣＰ−０ １２６（１，５等量）と結合させた。０．１　Ｍ　ＮＨ４ＨＣＯＩ　（ｐＨ８） 　ヲ１０容加え、二量体化を室温で数時間行った。生成するＣｙｓ−（ビススク シンイミドへ牛サン）−Ｃｙｓペプチドニ量体を調製用逆相ＨＰＬＣで精製し、 凍結乾燥して、白色線毛状固形物を得た。全収率は４０〜５０％であった。

この一般的手法によって調製した異種二量体には、ＣＰ−０４１１，４１２，４ １３，４１４，４１５，４１６及び４１７がある。これらのペプチドの特性決定 （マススペクトル）データーを表Ｑに示す。

表Ｑ “ＢＳＨ＝ビススクシンイミドヘキサン、”　ＣＴ−００２２＝Ａｓｐ−Ｔｙｒ −Ｄ−Ｔｙｐ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−ＣＯＮＨｚ“得られ たプラズマ脱着マススペクトル。

このようにして得られた異種二量体を前記と同様にして活性を試験し、結果を表 Ｒに示す。この表において、１０ｇ［Ｍ］は、ニューロキニンＡによって生じた 持続性収縮反応を５０％減少させるのに必要な拮抗薬のモル濃度の負の対数であ る。

表Ｒ ＢＫ２　Ａｎ／ＮＫｔ　Ａｎ異種二量体’　ＢＳＨ＝ビススクシンイミドヘキサ ン、”　ＣＴ−００２２＝Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｙｐ−Ｖａｌ−Ｄ−Ｔｒｐ− Ｄ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−ＣＯＮＨａ表Ｒに示したデーターはＢ　Ｋ　ｚ　Ａ　ｎ　 ／　Ｂ　Ｋ　１Ａ　ｎ及びＢ　Ｋ　２　Ａ　ｎ　／　Ｎ　Ｋ　ＩＡ　ｎ異種二量 体の場合と同様に、Ｂ　Ｋ　２　Ａ　ｎ　／　Ｎ　Ｋ　２　Ａ　ｎ異種二量体も 有用であることを明確に示している。これらの結果及び前記の結果に基づけば、 他の式（Ｉ［［）の種類の異種二量体を本明細書に示した３系列の異種二量体性 拮抗薬に用いられるリガンドとして調製することができ、文献に記載された拮抗 薬の代表的なものであることは明らかである。

実施例１に の実施例では、ＢＫ、拮抗薬／μ−オビオイドレセプター作動薬異種二量体（Ｂ ＫｚＡｎ／μＡｇ）の調製を説明する。拮抗薬／拮抗薬異種二量体がそれぞれレ セプター固体群と相互作用することができることは明らかであるが、同様にそれ ぞれのレセプターと相互作用することができる拮抗薬／作動薬異種二量体を調製 することもできる。

本発明のこの態様を説明するため、一連のモノマー−性のμ−オピオイドレセブ ター作動薬であって、カルボキシ末端システィン残基を既知の阻害ペプチドに付 加したものを作成した。これらの新規な拮抗薬を、次に一連のビスマレイミドア ルカンでＣＰ−０１２６に連結し、標準的なμ−オビオイドレセブター活性の分 析法並びに標準的な前記の異種二量体について用いた標準的なり　Ｋ　ｉ分析系 で試験した。

実施例におけるＣｙｓ−（ビスマレイミドアルカン）−Ｃｙ　ｓ　Ｂ　Ｋ　を拮 抗薬／μｍオピオイドレセプター作動薬異種二量体は、次のとおりに調製した。

Ｃｙｓ−含有μｍオピオイドレセプターペプチド作動薬（１等量）とビスマレイ ミドアルカン（２等量）とをＤＭＦ　（ペプチド１ミリモル当たり約２１　ｍｌ ）中で混合したものに、１ｏ容の０．１Ｍ　ＮＨ４ＨＣＯ＊　（ｐＨ８）を加え た。反応混合物を室温で約１時間撹拌しく分析用逆相ＨＰＬＣで定期的に観察） 、生成するμ−オピオイドレセブター作動薬の５−（Ｎ−アルキルマレイミド） スクシンイミド誘導体を調製用逆相ＨＰＬＣによって精製した。凍結乾燥の後、 約７０％の収率で単離された生成するペプチドを、次にＤＭＦ　（前記と同じｍ ｌ／ミリモル）中でＣＰ　−０］　２６　（１，５等量）　ト結合すセｆ：。０ ゜１Ｍ　ＮＨ，ＨＣＯ２（ＰＨ８）をＩＯ容加え、二量体化を室温で数時間行っ た。生成するＣｙｓ−（ビススクシンイミドアルカン）−Ｃｙｓペプチドニ量体 を調製用逆相ＨＰＬＣで精製し、凍結乾燥して、白色綿毛状固形物を得た。全収 率は４０〜５０％であった。この一般的手法によって調製した異種二量体には、 ＣＰ−０４２７からＣＰ−０４３２までがある。

これらのペプチドの特性決定（マススペクトル）データーを表Ｓに示す。

表Ｓ ’　ＢＳＨ＝ビススクシンイミドヘキサン、”　ＢＳＢ　＝ビススクシンイミド ブタン、−ＢＳＤ＝ビススクシンイミドドデカン、４得られたプラズマ脱着マス スペクトル。

表Ｔのデーターから判るように、これらの種類の化合物は、それぞれのレセプタ ー固体群と予想された仕方で相互作用を行うこともできる。これらの化合物は、 術後の苦痛及び喘息のような多くの疾病状態の治療に用いられることが予想され る。

表Ｔ 同種及び異種二量体のような本発明のＢＫ拮抗薬及び改質単量体は、拮抗薬と製 薬上許容可能な担体とを含んで成る従来の製薬組成物の形態で用いることができ る。

このような組成物は、局所、経口、エアゾール状、筋肉内、皮下または静脈内投 与に適合させることができる。

これらの組成物に含まれる拮抗薬の量は、例えば、用途及び投与方式によって重 量で約０．００１〜９０．０％の範囲になるが、これ以上の活性成分を用いるこ ともできる。

通常の投与量は、意図する用途及び投与方式によってかなり変化し、例えば、体 重１ｋｇ当たり毎分当たり０．１〜１００μｇか敗血症性ショックの状況で使用 される。

本発明の範囲は下記の請求の範囲に定義される。

浄書（内容に変更なし） Ｑ−（）　Ｂ　Ｋ　Ｎ　＝　４ ・−・ＣＰＯＩ２６−７Ｍ ＦＩＧ、ｌＡ −ＬＯＧ　［モルＪ度］ −ＬＯＧ　［モル１度」 ８にの注射の１５分前のＣＰＯｉ　２６／７の予信注射−ＬＯＧ［モルＩ］ −ＬＯＧ［モル濃ｒｔ］ ラットでのＢＫ　［４ｘ　ｌ　Ｏ−”モル〕に対する血圧反応に対するＣＰＯ１ ２６及びＣＰＯｉ　２７の効果 時間［分］ Ｃ−０ＣＰＯ１２７ｎ＝３ 時間［分］ ラット血圧の投与！応答細線 フ“ラジ千ニン（ナノモル） 麻酔ラット（こおけるＢＫに対する投与盟応答臼線。これからＥＤ５０を選定す る０　４ナノモル。垂直のバーは　口＝１０の工如優の標準誤差を示す。

時間［分コ 時間［分コ 二二二改質剤なし ■１１　改質剤あす ｂ）。

手続補工書、自発）−″ 平成５年１１月２９日

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. １．式 Ｘ（ＢＫＡ）ｎ （式中、ＢＫＡはブラジキニン拮抗薬ペプチドのペプチド鎖であり、Ｘは結合基 であり、ｎは１より大きい整数である）を有するプラジキニン拮抗薬。
2. ２．リンカーＸがスクシンイミド基から成る、請求の範囲第１項に記載のブラジ キニン拮抗薬。
3. ３．ペプチド基（ＢＫＡ）がチオエーテル結合によりリンカーに共有結合的に結 合している、請求の範囲第２項に記載のプラジキニン拮抗薬。
4. ４．ペプチド基がシステイン残基を含み、スクシンイミド基がシステイン残基を 介して各ペプチド鎖に結合している、請求の範囲第３項に記載のプラジキニン拮 抗薬。
5. ５．ｎが２であり、リンカーがビススクシンイミドアルカンである、請求の範囲 第４項に記載のブラジキニン拮抗薬。
6. ６．アルキル鎖の長さが２〜１４個のメチレン基である、請求の範囲第５項に記 載のプラジキニン拮抗薬。
7. ７．結合基が、式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ｍは２〜１４である） を有する、請求の範囲第６項に記載のブラジキニン拮抗薬。
8. ８．ｎが２であり、結合基が下記の式 Ｉ）▲数式、化学式、表等があります▼ＩＩ）▲数式、化学式、表等があります ▼（式中、ｍは２〜１２であり、ｎ１及びｎ２は１〜１２であり、Ｒ、Ｒ′、Ｒ ′′及びＲ′′′が保護基である）によって表わされるものの一つである、請求 の範囲第１項に記載のブラジキニン拮抗薬。
9. ９．ペプチドがデカペプチドであり、システイン基がプラジキニン付番系に基づ いて「６」位にある、請求の範囲第４項に記載のブラジキニン拮抗薬。
10. １０．ペプチドがＤＡｒｇ０−Ａｒｇ１−Ｐｒｏ２−Ｈｙｐ３−Ｇｌｙ４−Ｐｈ ｅ５−Ｃｙｓ６−ＤＰｈｅ７−Ｌｅｕ８−Ａｒｇ９である、請求の範囲第９項に 記載のプラジキニン拮抗薬。
11. １１．ｎが２であり、結合基がチオエーテル結合を介してＣｙｓ６−基に結合し たビススクシンイミドヘキサンである、請求の範囲第１０項に記載のブラジキニ ン拮抗薬。
12. １２．少なくとも２個の異なるＢＫＡ置換基を含む、請求の範囲第１項に記載の プラジキニン拮抗薬。
13. １３．異なるＢＫＡ置換基が別のレセプターに対して拮抗薬である、請求の範囲 第１２項に記載のブラジキニン拮抗薬。
14. １４．一方のＢＫＡ置換基がＢＫ１レセプター拮抗薬でありもう一方がＢＫ２レ セプター拮抗薬である、請求の範囲第１３項に記載のブラジキニン拮抗薬。
15. １５．式 Ｘ（ＢＫＡ） （式中、ＢＫＡはブラジキニン拮抗薬ペプチドのペプチド鎖であり、Ｘは改質基 である）を有するブラジキニン拮抗薬。
16. １６．Ｘがペプチド鎖ＢＫにおけるシステイン残基のスルフヒドリル基を介して 結合している、請求の範囲第１５項に記載のブラジキニン拮抗薬。
17. １７．システイン残基がペプチド鎖の「６」位にある、請求の範囲第１６項に記 載のブラジキニン拮抗薬。
18. １８．ＸがＮ−アルキルスクシンイミド基である、請求の範囲第１５項に記載の ブラジキニン拮抗薬。
19. １９．ＸがＮ−アルキルスクシンイミド基であり、アルキル鎖が１〜１０個のメ チレン基から成る、請求の範囲第１５項に記載のブラジキニン拮抗薬。
20. ２０．式 （Ｙ）（Ｘ）（ＢＫＡ） （式中、ＢＫＡはブラジキニン拮抗薬ペプチドのペプチド鎖であり、Ｘは結合基 であり、Ｙはブラジキニン以外のレセプターに対する拮抗薬または作動薬である リガンドである）を有する、ブラジキニン拮抗薬異種二量体。
21. ２１．ＢＫＡがＢＫ１またはＢＫ２選択的拮抗薬のペプチド鎖であり、Ｙがニュ ーロペプチドレセプター拮抗薬である、請求の範囲第２０項に記載のブラジキニ ン拮抗薬。
22. ２２．ニューロペプチドレセプターがＮＫ１またはＮＫ２レセプターである、請 求の範囲第２１項に記載のブラジキニン拮抗薬。
23. ２３．リンカーがビススクシンイミドアルカンである、請求の範囲第２０項に記 載のブラジキニン拮抗薬。
24. ２４．リンカーが請求の範囲第７項または第８項に記載されているものである、 請求の範囲第２３項に記載のプラジキニン拮抗薬。
25. ２５．ＢＫＡがＢＫ１またはＢＫ２レセプター拮抗薬であり、Ｙがオピオイドレ セプター作動薬である、請求項２０項に記載のブラジキニン拮抗薬。
26. ２６．ＢＫＡがＢＫ１またはＢＫ２レセプター拮抗薬であり、Ｙがμ−オピオイ ドレセプター作動薬である、請求項２５項に記載のブラジキニン拮抗薬。
27. ２７．請求の範囲第１項、第１５項または２０項のいずれか１項に記載の拮抗薬 とその担体を含んで成る、製薬組成物。
28. ２８．ブラジキニン拮抗薬の使用を必要とする方法において、請求の範囲第１項 、第１５項または第２０項のいずれか１項に記載の拮抗薬を用いることを含む改 良法。