JPH06508169A - ポリアニオン性多糖の非水溶性誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ポリアニオン性多糖の非水溶性誘導体 発明の背景 本発明は化学的に改質されたポリアニオン性多糖から形成された生物適合性フィ ルム及びゲルに関する。

ヒアルロン酸（“ＨＡ”）は例えば滑液、硝子体液、血管壁及び謄帯と他の結合 組織でみられる天然ムコ多糖である。多糖は交互のβ　１−３　グルクロニジン 酸及びβ　１−４　ゲルコサミニジン酸結合により連結された交互のＮ−アセチ ル−Ｄ−グルコサミン及びＤ−グルクロン酸残基からなり、その結果反復単位は −（＋−４）−β−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１−＝３）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−であ る。水中でヒアルロン酸は溶解して、高粘稠液を形成する。天然源から単離され たヒアルロン酸の分子量は通常５Ｘ１０４〜１×１０７ドルトンの範囲内である 。

ここで用いられるようなＨＡ”という用語はヒアルロン酸と例えばヒアルロン酸 ナトリウム（ナトリウム塩）、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸マグネシウ ム及びヒアルロン酸カルシウムを含めたそのヒアルロン酸塩のいずれかを意味す る。

化学的に改質された（“誘導された”）形のＨＡは術後期間中に体組織の癒着又 は付着を防止するために外科補助品として有用である。誘導化ＨＡゲル又はフィ ルムは相互癒着を妨ぐために分離したままにされる組織間の箇所で注入又は挿入 される。有効であるためには、ゲルはそのゲルが最後に分散して組織が接触した ときにそれらがもはや癒着する傾向を有しないほど十分に長い期間にわたり適所 に留まって組織接触を妨げなければならない。

化学的に改質されたＨＡは制御放出薬物デリバリ−にとっても有用である。Ｂａ １ｘｚｓら、　１９８６の米国特許第４゜５８２．８６５号明細書では“ＨＡの 架橋ゲルはそこに分散されているが但しゲル高分子マトリックスに共有結合され ていない低分子量物質の放出を遅らせることができる”と述べている。Ｔ、　Ｊ 、　Ｒｏｓｅｍｔｎら、　ＣｏｎＨｏ１ｌｅｄＲｅｌｅｘ＋ｅ　Ｄｅｌｉｖｅ＋ ７　Ｓｙｓｔｅｍｓ　（制御放出デリバリ−系）。

Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｔ、　Ｉｎｃ、、Ｎｅｖ　ＹｏｌｋにおけるＲ、　Ｖ 、　Ｓｐｘ＋ｅｔら。

１９８３、Ｃｈｘｐ＋ｅ＋　６．ｐａｇｅｓ　１０７−１１９　では直接的に又 は中間連結基としてアラニン架橋を含むエステル複合体のいずれかでエステル結 合鎖によりヒアルロン酸に共有結合されたクロラムフェニコールの徐放性につい て記載している。

Ｉ、　Ｄａｎｉｓｈｅｌｓｋ７　ら、　１９７１．　Ｃａ＋ｂｏｈ７ｄｒｘｔｅ 　Ｒｅｓ、、　Ｍｏ１．１６゜ｐａｇｅｓ　１９９−２０５では水溶液中１−エ チル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（“ＥＤＣ” ）の存在下においてムコ多糖をアミノ酸エステルと反応させることでムコ多糖の カルボキシル基を置換アミドに変換することによるムコ多糖の改質について記載 している。彼らはグリシンメチルエステルをＨＡを含めた様々な多糖と反応させ た。得られた生成物は水溶性であり、即ちそれらは水又は体組織間で出会うよう な水性環境中で急速に分散する。

ＨＡ組成物を非水溶性にする提案としてはＨＡの架橋がある。Ｔ、　１．　Ｒｏ ｓｃｍａｎ　ら、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　ＤｅｌｉｙｅＢＳＨ ｔｃＩＩｌｓ、Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ、、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋにお けるＲ、　Ｖ。

Ｓｐａ＋ｅ＋ら、１９８３．Ｃｈａｐｔｅ【６．ｐａｇｅ＋　１（１７−１１９ ではシスティン残基をアミド結合でＨＡに付加することによりＨＡを改質し、し かる後付加されたシスティン残基間でジスルフィド結合を形成させることにより システィン改質ＨＡを架橋することについて記載している。システィン改質ＨＡ はそれ自体水溶性だが、ジスルフィド形への酸化による架橋のみで非水溶性にな った。

Ｄｅ　Ｂｅ１ｄ！＋らのＰＣＴ公開第ＷＯ８６１００９１２号明細書ではカルボ キシル含有多糖を二又は多官能性エポキシドで架橋することにより製造された術 後組織癒着防止用の線分解性ゲルについて記載している。低水溶性を有するＨＡ の架橋ゲルを製造する上で提案された他の反応性二又は多官能性試薬としては５ ０℃でアルカリ性媒体中１．２，３．４−ジェポキシブタン（Ｔ、　Ｃ，Ｌｘ＋ ＋＋ｅｎｔら、　１９６４．　Ａｃ＋ａ　Ｃｈｅｍ、　５ｃａｎｄ、　、　Ｖｏ ｌ、　１８．　ｐａｇｅ　２７４）　；アルカリ性媒体中ジビニルスルホン（Ｅ 、Ａ、　Ｂｘｌａｓｒら、米国特許第４．５８２，８６５号（１９８６））；ホ ルムアルデヒド、ジメチロール尿素、ジメチロールエチレン尿素、エチレンオキ シド、ポリアジリジン及びポリイソシアネートを含めた様々な他の試薬（Ｅ、Ａ 、Ｂａ１ａｓｓら、英国特許出願第８４２０５６０号（１９８４））がある。Ｔ 、Ｍａｌｓｏｎら、　１９８６．　Ｐ　ＣＴ公開第ＷＯ８６１０００７９号明細 書ではＨＡを二又は多官能性エポキシドのような二又は多官能性架橋試薬と反応 させることにより硝子体液代用品向けのＨＡの架橋ゲルを製造することについて 記載している。Ｔ、Ｍａｌｓｏｎら、　１９８６．　Ｅ　Ｐ　Ｏ第０１９３５１ ０号明細書では架橋ＨＡゲルを真空乾燥又は圧縮することによる成形品の製造に ついて記載している。

発明の要旨 一面において、本発明は非水溶性生物適合性組成物の製造方法を特徴とするが、 その方法では組成物を形成するために十分な条件下で水性混合液中においてポリ アニオン性多糖、活性化剤及び核剤を混合する。

本発明のこの面の好ましい態様において、用いられる活性化剤としてはベンゾト リアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムへキサフル オロホスフェート、０−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ。

Ｎ、Ｎ−、Ｎ−−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフエート、ブロモ トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムへキサフルオロホスフェート又はそれら の対応ハライド塩がある。

反応液中におけるポリアニオン性多糖の好ましい濃度は０．０００２〜０．１Ｍ １更に好ましくは０．０００５〜０．０２Ｍである。反応を実施する上で好まし いｐＨは３．５〜８．０である。好ましい試薬化学量論量はモル当量のポリアニ オン性多糖当たり少くとも０．１モル当量の活性化剤である。

本発明のもう１つの面は非水溶性生物適合性組成物の製造方法を特徴とするが、 その方法では組成物を形成するために十分な条件下で水性混合液中においてポリ アニオン性多糖、活性化剤、改質化合物及び核剤を混合する。

本発明のこの面の好ましい態様において、改質化合物としては１−ヒドロキシベ ンゾトリアゾール水和物、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール−水和物、Ｎ−ヒ ドロキシスルホスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、４−ニトロフ ェノール、２〜ニトロフエノール、４−ニトロチオフェノール、２−ニトロチオ フェノール、ペンタクロロフェノール、ペンタフルオロフェノール、イミダゾー ル、テトラゾール、４−ジメチルアミノピリジン又は他の関連化合物がある。活 性化剤は好ましくはジイミド、更に好ましくはカルボジイミド、例えば１−エチ ル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド及び１−エチル−３− （３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドメチオシドである。

更に本発明の第二面の好ましい態様において、好ましいポリアニオン性多糖は０ ．０００２〜０．１Ｍ、更に好ましくは０．００５〜０．０２Ｍの濃度で反応液 中に存在する。反応を実施する上で好ましいｐＨは３．５〜８．０である。好ま しい試薬化学量論量はモル当量のポリアニオン性多糖当たり少くとも０．１モル 当量の活性化剤及びモル当量の活性化割当たり少くとも１モル当量の改質化合物 である。本発明の方法で使用上好ましいポリアニオン性多糖としてはヒアルロン 酸（ＨＡ）　、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、カルボキシメチルアミ ロース（ＣＭＡ）　、コンドロイチン−６−硫酸、デルマチン硫酸、ヘパリン及 びヘパリン硫酸がある。ＨＡ。

ＣＭＣ及びＣＭＡが特に好ましい。２種以上のポリアニオン性多糖も本発明の方 法で用いてよいこともよく理解される。

更に本発明の双方の面において、活性化されたポリアニオン性多糖と反応するこ とができる好ましい核化合物としては、１つの富電子部分のみが核剤として活性 化ポリアニオン性多糖と反応するアミノ酸アミド（好ましくは、塩酸ロイシンア ミド）、−官能性アミン（好ましくは、３−アミノ−１−プロパツール）、アミ ノ酸エステル（好ましくは、メチルエステル又はｔ−ブチルエステルを含めたブ チルエステル）、アミノアルコール、アミノチオール、アミノフェノール、アミ ノカテコール、アミノ酸、アミノ酸の塩、ペプチド、タンパク質及び他の複合（ ａｍｂｉｄｅｎｔ）求核性化合物がある。

更にもう１つの面において、本発明は組成物を形成するために十分な条件下でポ リアニオン性多糖及び活性化剤を混合することによる非水溶性組成物の製造方法 を特徴とする。

本発明のこの面による好ましいポリアニオン性多糖としてはヒアルロン酸（ＨＡ ）　、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）　、カルボキシメチルアミロース （ＣＭＡ）、コンドロイチン−６−硫酸、デルマチン硫酸、ヘパリン及びヘパリ ン硫酸がある。ＨＡ、ＣＭＣ及びＣＭＡが特に好ましい。

反応を実施する上で好ましいｐＨは３．５〜８．０、更に好ましくは４．０〜５ ．１、最も好ましくは４．７〜５．１である。多糖に関して好ましい濃度は０． ００５〜Ｏ，ＬＭ、更に好ましくは０．０１〜０．０２Ｍである。多糖対活性化 剤のモル比は好ましくは少くとも１：１、更に好ましくは約１．４である。好ま しい活性化剤はカルボジイミド、例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ プロピル）カルボジイミド及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル ）カルボジイミドメチオシドである。

ここで用いられる“水性混合液”という用語は主に水から構成される溶液に通常 開するが、但し極性非プロトン溶媒も１／２０部はどで含んでよい。好ましい非 プロトン溶媒としてはアセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ヘキサメチルホ スホルアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリジノン、１，４−ジオ キサン及びアセトンがある。

“ポリアニオン性多糖”は約ｐＨ４，０以上のｐＨ値で２以上の負電荷基、例え ばカルボキシル基を有する多糖である。

ここで用いられるポリアニオン性多糖の“モル又はモル濃度（Ｍ）”という用語 はポリマー内に含まれる反復モノマー単位のモルに関する。

ポリアニオン性多糖はポリアニオン性多糖におけるカルボキシル基が核攻撃され やすくするように水性混合液中で処理された場合に、その用語がここで用いられ るように、“活性化”されると言われる；　“活性化剤”とはポリアニオン性多 糖を含有する水性混合液中でポリアニオン性多糖をそのように活性化させる物質 である。

“改質化合物”は活性化ポリアニオン性多糖の存在下でポリアニオン性多糖の活 性化カルボキシル部分と反応して核剤と反応しつる新しい活性化種を形成する試 薬として定義される。

本発明の方法で生産された非水溶性組成物を形成する活性化ポリアニオン性多糖 はゲルの形でも又は繊維の形であってもよい。ブレンドも２種以上の異なる活性 化ポリアニオン性多糖を様々な量でミックスすることにより製造してよい。好ま しくは、ブレンドは活性化ＨＡ及び活性化ＣＭＣ又は活性化ＨＡ及び活性化ＣＭ Ａからなる。

本発明の組成物及びブレンドは癒着防止組成物の形、例工ばフィルム、フオーム 又はシリンジ内取込みに適した組成物の形で提供してよい。それらは全体的に分 散された薬学上活性な物質も含有してよく、それらを薬物デリバリ−系として有 用なものにする。適切な物質としてはタンパク質、成長因子、酵素、薬物、バイ オポリマー及び生物学上適合性の合成ポリマーがある。

ここで用いられる“フィルム”という用語はゲルもしくは繊維を圧縮するか又は ゲルもしくは繊維を脱水させることで形成された物質を意味する。本発明のいか なるゲル又は繊維もこのようなフィルムに形成してよい。

ここで用いられる“フオーム”という用語はガスバブルを本発明のゲル又は繊維 中に導入することで形成された物質を意味する。

“生物適合性”物質とは、その用語がここで用いられているように、生物学的機 能に関して医学上許容されない毒性又は有害作用を有しない物質である。

我々はポリアニオン性多糖を適切な活性化剤で処理することにより生産されたゲ ル、フオーム又はフィルムがいずれも別に加えられる二又は多機能性架橋剤の使 用なしに低い水溶性を有することを発見した。

“水溶性”ゲル又はフィルムとは、その用語がここで用いられているように、水 中１％重量／重量（゛マ／Ｗ′）ヒアルロン酸ナトリウムの水溶液を乾燥させる ことで形成されたもので、３ｃｍＸ３ｃｍＸ０．　３ｍｍの寸法を有するもので あり、２０℃で蒸留水５０ｍ１のビーカー中において攪拌せずに放置させたとき ３分間後にフィルムとしてその構造一体性を失い、２０分間以内で全体的に分散 されるようになるものである。ポリアニオン性多糖の１％水溶液を用いて形成さ れ、本発明に従い改質された同寸法を有する本発明の“非水溶性”フィルムは、 その語句及び類似用語がここで用いられるように、同様に２０℃で蒸留水５０１ のビーカー中攪拌せずに放置されたとき２０分間後も構造的にそのままである； フィルム境界及び端部は２４時間後もなお存在するが、フィルムは膨潤している 。

ゲル及びフィルムは非水溶性であるため、それらは未反応物質を除去するため使 用前に水で十分に洗浄することができる。

本発明のゲル、フオーム及びフィルムは反応混合液中に色素又は染料を含有させ ることで着色形に製造してもよい。このような着色フィルム及びゲルは適所にあ るとき又は配置中にもっと容易にみることができ、無色物よりも容易に外科処置 中取扱えるようになる。

本発明のフィルム、ゲル及びフオームは水和時であってもそれらの強度を留める 。それらは縫合の必要性なしに生物組織に付着するため、それらは術後癒着防止 膜として有用である。それらは出血の存在下でも組織に適用できる。

本発明の他の特徴及び利点はその好ましい態様の下記説明と請求の範囲から明ら かになる。

本発明のゲル、フオーム及びフィルムは通常下記のようにして製造される。ＨＡ が水に溶解され、得られた水性混合液のｐＨが下方に調整される；次いで溶解し たＨＡが適切な活性化剤を混合することで活性化され、適切なリジンエステルが 活性化ＨＡと混合され、望ましいゲルが生成するまで放置せしめられる。活性化 剤及びエステルはいかなる順序で混合してもよい。

本発明のリジン改質ゲル及びフィルムの好ましい製造方法は更に詳細に記載され る。当業者であれば認識しうるように、本発明のゲル及びフィルムは本発明の方 法に属しているがここで記載されたものとは詳細な点で異なるプロトコールを用 いて製造できる。

ヒアルロン酸又はヒアルロン酸ナトリウムのようなヒアルロン酸の塩のサンプル が水性混合液を得るため水に溶解される。様々な起源のうちいずれからのＨＡも 使用できる。周知のように、ＨＡは動物組織から抽出しても又は細菌醗酵の産物 として集めてもよい。ヒアルロン酸は例えばＰＣＴ公開第ＷＯ８６１０４３５５ 号明細書で記載されるようにバイオプロセス技術により商業的な量で産生ずるこ とができる。好ましくは、この第一水性混合液中におけるＨＡの濃度は０．４〜 ２．５％重量／重量（’　ｖ／ｖ’　）の範囲内である。その後の反応はそれよ り有意に低い濃度だと遅くて有効性が低く、一方それより有意に高い濃度ではそ れらの高粘度のせいで取扱いが困難である。

水性ＨＡ混合液は酸性、好ましくは４．０〜５．０、更に好ましくは４．３〜４ ．７５のｐＨを有しているべきである。それより低いｐＨ値では好ましい活性剤 ＥＤＣが不安定であり、それより高い値では反応速度が減少する。好ましくは塩 酸がｐＨを調整するために加えられるが、他の公知の酸も使用できる。

水性ＨＡ混合液のｐＨが調整されると、活性化剤が混合される。好ましい活性化 剤としてはカルボジイミド、最も好ましくはＥＤＣ（一部の参考文献においてこ の物質は１−　（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド又 は“ＤＥＣ”と称される）又はＥＴＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ プロピル）カルボジイミドメチオシド）がある。

次いで核性リジンエステルが水性ＨＡ−活性活性化合混合液合される。好ましい エステルとしてはメチル、エチル又はｔ−ブチルエステルがある。リジンはシリ ジン、トリリジン、ポリリジン又はそれらの塩酸塩の形であってもよい。

リジンエステル及び活性化剤はすべて一度に又は徐々にいずれかでｐＨ調整ＨＡ 混合液にいかなる順序で混合してもよい。

着色製品が望まれるならば、サーバ（Ｓｅｔマりにより“サーバ・ブルー”とし て配布される“クマシー（Ｃａｏｍａｓ＋ｉｅ”町　ブリリアントブルーＲ−２ ５０”としても知られる青色色素“ブリリアントブルーＲ″のような色素又は染 料の溶液がこの時点で反応混合液に混合できる。得られた製品は体組織の色と良 い対照をなす青色を有し、手術時に取扱われるとき及び適所にあるときにフィル ム又はゲルをみやすくさせる。

試薬（もしあるならば染料又は色素も）が混合されると、反応混合液は単純にし ばらく放置されるか、あるいはそれは連続的に又は時々攪拌又はかきまぜられる 。

試薬の混合時にｐＨは上昇するが、反応が進行しても酸の添加で望ましいｐＨに 維持できる。しかしながら、我々は様々な望ましい物理的性質を有するフィルム 及びゲルが反応の進行に従い単純にｐＨを上昇させることで得られることを発見 した。試薬、特にＥＤＣ及びリジンエステルの添加様式は重要でないが、但しこ れらの試薬対ＨＡの比率は重要である。我々はＨＡ　：　ＥＤＣ：リジンエステ ルの比率が１：２＋１〜１：４：１０の範囲である場合に最良の結果が得られる ことを発見した。それより低い値だと典型的にはより弱くてより不溶性でない製 品を生じ、一方それより高い値だと典型的にはより強くてより不溶性の製品を生 じる。

ポリアニオン性多糖改質ＨＡ ポリアニオン性多糖−改質ＨＡゲル及びフィルムは非水溶性沈澱物を形成するた めに（前記のような）ＨＡをポリアニオン性多糖及び活性化剤とミックスするこ とにより通常製造される。その沈澱物は術後癒着防止に有用な薄膜に流延するこ とができる。それは前記のように着色してもよい。沈澱物からのフィルム流延物 の強度を増加させるために、そのフィルムはそれらが約１０５℃で２４時間真空 下（約３０　ｍｍＨｇ）で加熱される脱水熱処理に付してもよい。

多糖及びＨＡは一緒にミックスでき、その後で活性化剤が加えられる。一方、多 糖は活性化剤と反応させ、しかる後ＨＡが加えられてもよい。第三のオプション はＨＡを活性化剤と混合し、しかる後多糖を加えることである。好ましい活性化 剤は前記のとおりであり、カルボジイミドＥＤＣ及びＥＴＣがある。反応はｐＨ ４〜５で実施されることが好ましい。好ましい多糖濃度は０．００５〜０．１Ｍ の範囲であり、更に好ましくは０．０１〜０．０２Ｍの範囲である。多糖対活性 化剤の好ましいモル比は少くとも１：１、更に好ましくは約１＝ポリアニオン性 多糖ゲル、フィルム及びフォームハ非水溶性物質を形成するために少くとも１種 のポリアニオン性多糖（例えばＨＡＳＣＭＣ，ＣＭＡ）を活性化剤とミックスす ることにより通常製造される。好ましい活性化剤としてはカルボジイミド、ＥＤ Ｃ及びＥＴＣがある。

反応は３．５〜８のｐＨで実施され、最適の反応条件はｐＨ４，７〜５．１であ る。反応で用いられる多糖分子量は９．０ｘｌＯ〜３．０ｘ１０６ドルトンの範 囲であり、好ましくは２．５Ｘ１０５〜１．０ＸＩＯ６ドルトンである。多糖対 活性化剤の好ましいモル比は少くとも１・１、更に好ましくは約１：４である。

この方法で形成された不溶性物質はゲルの形でも又は繊維の形でもよく、癒着防 止又は薬物デリバリ−向けに直接用いてもあるいは薄いフィルム又はフオームを 得るため平型に流延して風乾又は凍結乾燥してもよい。

加えて、ブレンドは異なる未精製又は精製された活性化ポリアニオン性多糖を様 々な量でミックスすることにより製造できる。これらのブレンドはオーバーヘッ ドスターラー及び／又は高剪断ミキサーでミックスすることにより均一に得られ る。未反応活性化剤は使用前に標準方法に従い分子量サイジング、透析、透析濾 過又は水溶性溶媒での分別沈澱により未精製混合物から除去してよい。精製混合 物は癒着防止及び／又は薬物デリバリ−向けに直接用いてもよくあるいはフィル ム又はフオームを形成するため平型に流延して風乾又は凍結乾燥してもよい。

Ｂｏｐ試薬活性化ポリアニオン性多糖 ポリアニオン性多糖非水溶性ゲル、フィルム及びフオームは望ましい不溶性組成 物を形成するために少くとも１種のポリアニオン性多糖（例えばＨＡ、ＣＭＣ。

ＣＭＡ）を水性混合液に溶解し、ポリアニオン性多糖をベンゾトリアゾール−１ −イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムへキサフルオロホスフェー ト（Ｂｏｐ試薬）のような活性化剤で活性化させ、活性化されたポリアニオン性 多糖を適切な核剤と反応させることによっても通常製造される。

反応は３．５〜８のｐＨで実施され、最適の反応条件はｐＨ４，６〜５．０であ る。反応で用いられるポリアニオン性多糖の分子量は６．０ＸＩＯ２〜４×１０ ６ドルトンの範囲であり、好ましくは５×１０５ドルトン以上である。好ましい 試薬化学量論量はモル当量のポリアニオン性多糖当たり少くとも０．１モル当量 の活性化剤及びモル当量のポリアニオン性多糖当たり少くとも１モル当量の核剤 である。

ポリアニオン性多糖のＢＯＰ活性化の１つの大きな予想外の利点はポリアニオン 性多糖の分子量が核剤とのカップリングで減少しないことである。この結果はカ ルボジイミド単独を要する反応とは対照的であり、その反応では我々は核剤カッ プリングでＨＡ分子量の減少について観察している。

本発明の不明確な面は有機溶媒中のみで使用のために前記された有機可溶性活性 化剤が水性環境中で核剤と水溶性ポリアニオン性多糖との化学的カップリングを 起こせることである。この観察はいかなる未反応活性化剤も反応溶液をいずれか 適切な非水混和性有機溶媒で抽出することにより簡単に非水溶性生成物から除去 できるという点でかなり予想外の追加利点を与える。このような溶媒の例として はジエチルエーテル、塩化メチレン、クロロホルム、酢酸エチル又はテトラヒド ロフランがある。

改質カルボジイミド活性化ポリアニオン性多糖ポリアニオン性多糖非水溶性ゲル 、フィルム及びフオームは望ましい不溶性組成物を形成するために少くとも１種 のポリアニオン性多糖（例えばＨＡＳＣＭＣ，ＣＭＡ）を水性混合液に溶解し、 ポリアニオン性多糖をジイミド、例えばＥＤＣ又はＥＴＣのような活性化剤で活 性化させ、活性化されたポリアニオン性多糖を１−ヒドロキシベンゾトリアゾー ル水和物（ＨＯＢ　ｔ）　、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール−水和物又は他 の前記化合物の１つのような改質化合物で改質し、活性化ポリアニオン性多糖を 適切な核剤と反応させることにより通常製造される。

反応で用いられるポリアニオン性多糖の分子量範囲は６．０Ｘ１０２〜４．０× １０６ドルトンであり、好ましくは５．０ＸＩＯ５ドルトン以上である。好まし い試薬化学量論量はモル当量のポリアニオン性多糖当たり少くとも０．１モル当 量の活性化化合物であり、更に好ましくは少くとも１：１である。更に、好まし い試薬化学量論量はモル当量の活性化割当たり少くとも１モル当量の改質化合物 を包含する。活性化剤との反応は３．５〜８のｐＨで実施され、最適の反応条件 は４．０〜４．８である。改質化合物によるポリアニオン性多糖の改質は３．０ 〜８．０のｐＨで実施され、最適の改質条件はｐＨ３，３〜４．５である。

用いられる活性化剤がジイミドであるケースにおいて、改質化合物は中間体Ｏ− アシルイソ尿素と反応して請求核剤に転位されうる新しい活性カルボニル基を形 成する。

水に低い溶解性を示す有機可溶性改質試薬が水性混合液中で核剤へのポリアニオ ン性多糖のカップリングを行えることは我々の発見である。改質剤とポリアニオ ン性多糖とのこの溶解度差のかなり予想外の利点は不溶性生成物がクロロホルム 、塩化メチレン、酢酸エチルもしくはジエチルエーテルのような適切な非水混和 性有機溶媒での抽出又はアルコール沈澱及び摩砕により精製できることである。

改質された活性化ポリアニオン性多糖への核剤のカップリングにより付与される 予想外の追加利点は、反応が複合求核性化合物（例えば、アミノアルコール、ア ミノ酸、アミノチオール、アミノフェノール、アミノカテコール、ペプチド及び タンパク質）との反応で特異性をコントロールしうる酸性条件下で実施でき、そ の結果潜在的ないくつかの富電子部分のうち１つのみが核剤として活性化ポリア ニオン性多糖と反応できることである。

フィルム及びゲル 前記に従い改質されたポリアニオン性多糖は直接的にフィルムとして流延できる 。典型的には、反応混合液は望ましいサイズ及び形状を有する容器に注がれ、風 乾される。一般に、厚く注入された混合液を乾燥することで形成されたフィルム は、それらは低い表面積／容量を有するのであるが、薄くて高い表面積／容量混 合液を乾燥することで形成されたフィルムよりも大きな強度を有する。

一方、フィルムは例えばＥＰＯ第０１９３５１０号明細書で記載されたように、 例えば少くとも一方が多孔質である２表面間でゲルを圧縮するような水を逃がす 条件下でゲルを圧縮することにより形成できる。

所望であれば、ゲル又はフィルムは例えば水又はＩＭ水性塩化ナトリウムでの潅 流により使用前に洗浄することができる。一方、反応混合液はフィルムとして流 延する前に残留試薬を除去するために透析できる。残留試薬又は置換尿素類のよ うな試薬由来物質を除去するための洗浄はフィルム又はゲルが治療適用向けに用 いられるならば望ましい。前記のようにブリリアントブルーＲで青に着色された ゲル又はフィルムはこのような洗浄時にそれらの着色を失わない。試薬又は反応 生成物の除去は高圧液体クロマトグラフィーでモニターできる。

発明の詳細な説明 本発明は下記例で更に詳細に記載される。これらの例は説明のために示され、請 求の範囲で記載されたことを除き本発明を制限するためではない。

例１：この例において、ヒドロゲルは活性化剤としてＥＤＣ及び核剤としてロイ シンメチルエステル塩酸塩を用いて製造した。

１×１０６〜２×１０６の分子量を有するヒアルロン酸ナトリウム（４００ｍｇ ；　１．　０＋＋＋ｍｏｌのカルボキシル基）を蒸留水１０ｍ１に溶解した。水 溶液のｐＨを０．１ＮＨＣＩの添加でｐＨ４，７５に調整した。次いでＥＤＣ３ １４ｍｇ　（１，６４ｍｍｏｌ）をすべて一度に加え、しかる後り一ロイシンメ チルエステル塩酸塩１９０＋ｇ（１，０５ｍｍａｌ）を加えた。その後に反応混 合液のｐＨは２時間で６．２まで上昇した。反応混合液を室温で５時間保ったと ころ、それは濃厚な不溶性ヒドロゲルを形成した。このヒドロゲルはその物理的 性質の喪失なしに残留試薬を除去するためＬＭ　ＮａＣ１溶液で洗浄できた。

例２：この例では様々なＥＤＣ／ロイシン：ＨＡ比率をゲル形成及び性質の比較 のために用いた。

操作は例１のとおりであるが、水１５１中でヒアルロン酸ナトリウム（４００ｍ ｇ；　１．　Ｏｍｍｏｌのカルボキシル基）を用いた。次いで別の実験として、 下記量のＥＤＣ及びロイシンメチルエステル塩酸塩を加えた：　ＥＤＣｌ　５３ ｍｇ　（０，８ｍｍｏｌ）　１０イシンメチルエステル塩酸塩１８２ｍｇ　（１ ，Ｏｍｍｏｌ）　；　ＥＤＣ７６ｍｇ　（０，４ｍｍｏｌ）／ロイシンメチルエ ステル塩酸塩９０ｍｇ　（０，５ｍａｏｌ）　；ＥＤＣ３８ｍｇ　（０，２ＩＩ １ｍｏｌ）　／ロイシンメチルエステル塩酸塩４５ｍｇ　（０，２５ｍｍｏｌ） 。強いヒドロゲルは最高比率のＥＤＣ及びロイシンメチルエステル塩酸塩のとき に例１のようにして得られた。最低比率の反応剤（０，２ｍｍｏ１１０．２５〜 １．０ｍｍｏｌＨＡカルボキシル基）のときには弱いゲルを得たが、これは２週 間後に液体に崩壊した。

例３：この例ではＨＡ濃度を得られたゲル性質の比較のために半分に減少させた 。

操作は例１のとおりであるが、但しＨＡ（４００ｍｇ；１、Ｏｍｍｏｌのカルボ キシル基）を水１５ｍ１ではなく３０ｍ１に溶解した（ＨＡ　１−１／３％Ｖ／ Ｖ）。ヒドロゲルを形成させたが、それは例１で得られた場合よりも弱かった。

例４：この例においてフィルムは活性化剤としてＥＤＣ及び核剤としてロイシン メチルエステル塩酸塩を用いて製造した。

ヒアルロン酸ナトリウム（４００ｍｇ；　１．　０１１！ｉｏ＋のカルボキシル 基）を蒸留水４０ｍ１に溶解した。溶液のｐＨを０．ｌＮＨＣｌの添加でｐＨ４ ，７５に調整した。

次いでＥ　Ｄ　Ｃ（３１４ｍｇ；　１．　６４ａ＋ａ＋ｏｌ）を一度に加え、し かる後り一ロイシンメチルエステル塩酸塩１９０ｍｇ（１，０５ｍｍｏｌ）を加 えた。反応混合液のｐＨは２時間で６．２に上昇したが、その後で溶液を面積６ ３６０−のペトリ皿に注ぎ、２日間かけてフィルムになるまで乾燥させた。こう して生産されたフィルムは強く、水及び１Ｍ水性ＮａＣ１に不溶性であった。そ のフィルムはそれらの物理的性質の喪失なしに残留試薬を除去するため例１のよ うに水又は水性ＮａＣ１で洗浄できた。このようなフィルムの赤外線分光分析で は約２１３０　ｃｍ”でカルポジイミド吸収を示さず、約１７４０　ｃｍ　、　 １７００ｃｍ−１，１６５０ｃｍ−１及び１５５０　ｃｍ−’で吸収を示した。

例５：この例では様々なＨＡ濃度を得られたフィルム性質の比較のためにフィル ム製造に際して用いた。

例４で記載された操作を繰り返したが、但しＨＡ（４００ｍｇ；　１．　Ｏｍｍ ｏｌのカルボキシル基）を蒸留水３０ｍ１．４０ｍ１又は１００ｍ１に溶解する ことで得られた３つの異なる初期ＨＡ濃度を用いた。これら各初期濃度のＨＡを 用いて生産されたフィルムは強く、水及び１Ｍ水性ＮａＣ１に不溶性であり、一 定濃度範囲のＨＡが使用できることを示した。これらフィルムの各々ははその物 理的性質の喪失なしに水又は水性ＮａＣ１で洗浄できた。

例６：この例は、フィルムを形成した後でそれを洗浄した場合と比較されるよう に、フィルムを形成するため流延する前に反応混合液を透析した効果について示 す。

ヒアルロン酸ナトリウム（水４０１中４００　ｍｇ）、ＥＤＣ（３１４ｍｇ；　 １．　６４ｍｍｏｌ）及びｌ、−ｏイシンメチルエステル塩酸塩（１９０ｍｇ； 　１．　０５ｍｍｏｌ）を例４のように反応させた。反応（２時間）の終了後、 反応混合液は残留試薬を除去するため１２．ＯＯＯＮＭＷ力・ソトオフ透析管で 水に対して透析した。次いで透析混合液を例４のようにフィルムとして流延した 。こうして得られたフィルムは強く、水及び１Ｍ水性ＮａＣ１に不溶性でで混合 液を乾燥して生産されたフィルムの性質を比較するためにもっと厚く注入された 反応混合液を乾燥させることにより形成した。

例４のようにして得られた反応混合液（反応液容量４０ｍ１）を小さなペトリ皿 （面積３３３０ｍｍ２）に流延した。こうして得られたフィルムは１Ｍ水性Ｎａ Ｃ１及び水（１００℃；１時間）に不溶性であった。

例８：この例においてフィルムは他のアミノ酸エステル及びＥＤＣで活性化され たＨＡを用いて製造した。

ＨＡ　（Ｈ２０４Ｏｍ　ｌ中４００　ｍｇ）の溶液を０．１ＮＨＣＩでｐＨ４， ７にした。次いでＥＤＣ（３１４ｍｇ；１　、　６　ｍｍｏｌ）をすべて一度に 加え、しかる後１ｍｍｏｌのアミノ酸誘導体を加えた。反応混合液をペトリ皿に 注ぎ、乾燥させた。不溶性フィルムはＬ−バリンメチルエステル塩酸塩、Ｌ−イ ソロイシンメチルエステル塩酸塩、Ｌ−プロリンメチルエステル塩酸塩及びＬ− フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩から得た。

例９：この例においてフィルムは核剤として単純な一級アミン（アニリン）を用 いて製造した。

ＨＡ　（Ｈ２０４Ｏｍ　ｌ中４００　ｍｇ）の溶液を０．１ＮＨＣＩでｐＨ４， ７にした。次いでＥＤＣ（３１４ｍｇ；１、　６ｍｍｏｌ）をすべて一度に加え 、しかる後１ｍｍｏｌのアニリンを加えた。反応混合液をペトリ皿に注ぎ、乾燥 させ、不溶性フィルムを得た。

ステルを用いて製造した。

ＨＣＩでｐＨ４，７にした。次いでＥＤＣ（３１４ａ＋ｇ；１．　６１１１０１ ０１）をすべて一度に加え、しかる後１ｍｍｏｌのロイシンエステルを加えた。

反応混合液をペトリ皿に注ぎ、乾燥させた。不溶性フィルムはＬ−ロイシンエチ ルエステル塩酸塩及びＬ−ロイシンｔ−ブチルエステル塩酸塩の双方から得た。

例１にこの例においてゲルは他のアミノ酸メチルエステルを用いて製造した。

ＨＡ　（Ｈ２０１５ｍ　ｌ中４００　ｍｇ）の溶液をｐＨ４，７にし、ＥＤＣ（ ３１４ｍｇ；　１．　６ｍｍｏｌ）　Ｌかる後アミノ酸誘導体（ｌ　ｍｍｏｌ） を加えた。反応混合液は５〜２４時間以内で濃厚なゲルを形成した。非水溶性ゲ ルはＬ−バリンメチルエステル塩酸塩、Ｌ−イソロイシンメチルエステル塩酸塩 、Ｌ−アルギニンメチルエステル塩酸塩、Ｌ−プロリンメチルエステル塩酸塩及 びＬ−ヒスチジンメチルエステル塩酸塩を用いて得た。

例１２：この例においてフィルムは核剤としてアミノ酸アミド（ロイシンアミド ）を用いて製造した。

ＨＡ　（８２０４０ｍ　ｌ中４００　ｍｇ）の溶液を０．１ＮＨＣＩでｐＨ４， ７にした。次いでＥＤＣ（３１４ｍｇ；１、　６ｍｍｏｌ）をすべて一度に加え 、しかる後１ｍｍｏｌのＬ−ロイシンアミド塩酸塩を加えた。反応混合液をペト リ皿に注ぎ、乾燥させ、不溶性フィルムを得た。

ル塩酸塩を用いて製造した。

ＨＡ　（Ｈ２０１５１１１１中４００　ｍｇ）の溶液をｐＨ４，７にし、ＥＤＣ （３１４ｍｇ；　１．　６ｍｍｏｌ）　Ｌかる後ロイシンエチルエステル塩酸塩 （１、Ｏｎｌｌ０Ｉ）を加えた。

混合液は５〜２４時間以内で濃厚な非水溶性ゲルを形成化剤としてＥＴＣを用い て製造した。

１×１０６〜２×１０６ドルトン範囲の分子量を有するヒアルロン酸ナトリウム （４００℃１ｇ；　１．　Ｏｎ＋ａ＋ｏｌのカルボキシル基）を水（１０ｍｌ及 び３０ｍ１）に溶解した。

各水溶液のｐＨを０．ｌＮＨＣｌの添加でｐＨ４，７５に調整した。次いでＥＴ Ｃ４７５ｍｇ（１，６ｍｍｏｌ）をすべて一度に加え、しかる後り一ロイシンメ チルエステル塩酸塩１９０ｍｇ　（１，０５ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合 液のｐＨは次の２時間でｐＨ６，２まで上昇した。

水１０ｍ１含有反応混合液は不溶性ゲルを形成した。水３０ｍ１含有反応混合液 は乾燥後に不溶性フィルムを与えた。

例１５：この例は着色フィルムの製造について示す。

ＨＡ　（Ｈ２０３Ｏｍ　ｌ中４００　ｍｇ）の溶液を例１３のようにｐＨ４，７ ５にし、しかる後ＥＴＣ（４７５ｍｇ；１．６ｍｍｏｌ）及びロイシンメチルエ ステル塩酸塩（１９０ｍｇ；　１．　０５ｍｍｏｌ）を加えた。次いでＨ２０（ ０、５ｍｌ）中“サーバブルー”　（５ｍｇ／ｍｌ）の希溶液を反応混合液に加 えた。得られた混合液をペトリ皿に注ぎ、非水溶性青色フィルムを１６時間後に 得た。青色はフィルムをＬＭ　ＮａＣＩＬかる後Ｈ２０で洗浄したときにフィル ムに留まった。

例１６：この例は化学的改質ＨＡのフィルムの組織生物適合性について示す。

例４で記載された操作に従い製造された４枚のフィルムと２枚のＵＳＰネガティ ブコントロール片を白色ニューシーラントウサギ（２匹／試験）のを椎傍筋肉中 に外科的に埋込んだ。試験部位は７２時間後に肉眼的に又は７日間後に完全組織 病理学的にいずれかで評価した。

Ｕ、Ｓ　Ｐ　ＸＸＩ　、ｐ、　１２３７によれば、試験物質はプラスチック物質 の評価に関するＵＳＰ埋込試験の要求を満たした。

例１７：この例はリジン改質ＨＡの製造について示す。

水中ＨＡの０．４％（ｖ／ｗ）溶液を調製した。この溶液のｐＨを酸の添加で４ ．３〜４．７５に調整した。この溶液各１００ｍ１にＥＤＣが完全に溶解するま で攪拌しながらＥＤＣｏ、７６ｇを加えた。ＨＡ／ＥＤＣ溶液各１００ｍ１にＬ ＭＥが完全に溶解するまで攪拌しながらリジンメチルエステル（ＬＭＥ）０．２ ０ｇを加えた。

ＨＡ、ＥＤＣ及びＬＭＥの添加は室温で行った；最終ＨＡ／ＥＤＣ／ＬＭＥ溶液 が形成されたら、それを必要時まで４℃で貯蔵した。

ＬＭＥ改質ＨＡ物質は最終適用例に応じて様々な形状、サイズ及び粘稠度に加工 処理できる。薄いシートの物質が望まれるならば、混合液は平坦な表面上に注ぐ ことができる。次いでこの物質は環境又は高温下で水を蒸発させることにより固 体に変えることができる。その物質のシートの代替生産法はそれを凍結乾燥に付 すことである。

最終製品の孔径は初期凍結温度を調整することでコントロールできる。湾曲表面 及び他の形状は最初にゲルを反対像表面上に流延し、しかる後前記のように加工 処理することで同様に生産できる。乾燥シートは所望であればカーバー（Ｃｘｒ ｖｅ＋）実験室用プレスで規定厚まで圧縮することにより更に加工処理できる。

これはスペースが限られた解剖学的構造間に薄いフィルムをいれることを要する 適用例で特に有用である。

標準塩水で再水和された凍結乾燥物質の機械試験では１７０〜９００　ｇ／ａｌ の破断値であった。この物質に関する破断値までの伸び率は３３〜６２％であっ た。

例１８：この例はＣＭＣ改質ＨＡの製造について示す。

ＨＡ　（０，４％ｖ／ｖ、　０　、　ＯＩ　Ｍ）と２５０，０００の分子量及び ０．６５〜０．９０範囲の置換度を有するアクアロン（Ａｑｕａｌｏｎ）　タイ プＣＭＣ（０，１９％ｖ／ｖ。

０、ＯＩＭ）を水溶液中室温で一緒にミックスした。混合液のｐＨをＬＭ　ＨＣ Ｉの添加でｐＨ４，７〜４．８に調整して維持した。この溶液各１００１にＥＤ Ｃ０．６７ｇ　（０，０４Ｍ）を加えた。ＥＤＣとの反応中に溶液（７）ｐ）ｌ を０．１Ｍ　ＨＣＩの添加１’ｐＨ４，７〜４．８に維持し、反応を１時間進行 させたところ、その時間中に沈澱物が生じた。未反応ＥＤＣを酸性水（ｐＨ４， ０）に対する２４時間の透析で沈澱物から除去したが、３及び１９時間目に２回 透析物交換した。次いでＨＡ／ＣＭＣスラリーを平型中に流延し、室温で２４時 間風乾させた。

ＨＡ／ＣＭＣ膜は実験動物モデルにおいて術後癒着形成の発生率を減少させるこ とが示された。ラット盲腸剥離モデルを用いた実験において、ＨＡ／ＣＭＣ膜を 外科剥離ラット盲腸周辺においた；以前の研究では癒着が制御的に剥離されたラ ットの盲腸で容易に生じることを実証した。ＨＡ／ＣＭＣ膜又はＯＲＣ膜〔癒着 防止用にジョンソン＆ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ　＆　Ｉｏｈｎｓｏｎ）市販 のインターシード（Ｉｎｌ！＋ｃｅｃｄ）　Ｔ　Ｃ７膜〕いずれかを受容した動 物群における盲腸癒着を盲腸が剥離されたが但しいかなる膜も受容していない動 物における癒着コントロールと比較した。これら実験の結果はＨＡ／ＣＭＣ膜が コントロール動物及びインターシードＴＣ７フイルムを受容した動物と比較して 一貫して癒着形成を減少させることす。

ＨＡ　（１，０ＸＩＯ６ドルトン）を２５℃で一夜攪拌することにより水に溶解 させて０．８％Ｗ／マ溶液を得た。

反応混合液のｐＨを０．ＩＮ　ＨＣｌｔ’ｐＨ４，７５１，：調整した。ＥＤＣ （４：１モル比のＥＤＣ対ＨＡ、最終濃度１．５３ｖ／マ）を連続攪拌下でこの 溶液に加え、０．１ＮＨＣ１の追加で１時間にわたり一定ｐＨ（４，７〜５゜１ ）で維持した。未反応ＥＤＣ及び他の低分子量不純物の除去は標準方法を用いて 分子量サイジング、透析又は透析濾過のいずれかで行った。非水溶性の透明なゲ ルをこのプロセスの後に得た。

例２０：この例は水溶性溶媒によるＥＤＣ活性化ＨＡの分別沈澱の効果について 示す。

例１９で記載された操作を繰り返したが、但し未反応ＥＤＣ及び他の低分子量不 純物は適切な水溶性溶媒（例えば、Ｃ−０３アルコール、アセトン）を用いて分 別沈澱により除去した。これらの条件下で非水溶性繊維をＣＭＣ（２５０Ｘ１０ ３ドルトン）を室内環境温度（２２〜２５℃）で−夜攪拌することにより水に溶 解させて０．８％Ｗハ溶液を得た。反応混合液のｐＨをＱ、ＩＮＨｃＩでｐＨ４ ，７５に調整した。ＥＤＣＷ／マ）を連続攪拌下でこの溶液に加え、ｐＨを０． １ＮＨＣＩの追加で１時間にわたり４．７０〜５．１０に維持した。未反応ＥＤ Ｃ及び他の低分子量不純物の除去は分子量サイジングクロマトグラフィー、透析 、透析濾過又は適切な水溶性溶媒（例えば、Ｃ−Ｃアルコール、アセトン）によ るＣＭＣの分別沈澱のいずれかで行った。

約３００〜８００μｍ長及び１０〜２０μｍ幅の非水溶性繊維がこれらの反応条 件から生産される。

例２２：この例はＥＤＣ活性化ＨＡとＥＤＣ活性化ＣＭＣとのブレンドの製造に ついて示す。

ＥＤＣ活性化ＨＡ及びＣＭＣを例１９及び２１で記載されたように別々に製造し たが、但し各反応生成物はブレンド前に精製しなかった。活性化ＨＡ３００ｍｌ 及び活性化ＣＭＣ３００ｍ１を１０１００Ｏビーカーニイれ、ツラツクス（Ｔｕ ＋目りブランドブレンダ−により６０００　ｒｐｍ　。

２５℃で１０分間ブレンドした。この得られた混合液を３回の透析物交換により ２０：１比で２４時間にわたりｐＨ４，０水に対する透析で精製した。透析後に 混合液を平型に注ぎ、薄い非水溶性フィルムになるまで風乾させた。混合物中に おける繊維の量は一緒にブレンドされる活性化ＣＭＣ及び活性化ＨＡの相対量を 変えることによりコントロールできる。

例２３：この例はＨＯＢｔ及びＥＤＣを用いたＨＡとヒスチジンとのカップリン グについて示す。

水（４０ｍｌ）中ヒアルロン酸ナトリウム（２００ｍｇ。

０、　５ｍｍｏｌ、ＭＷＩ、７００．０００）及びｌ−ヒスチジン（１５５，２ ｍｇ、　１．　０ｍｍｏｌ）の溶液に１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物 （ＨＯＢｔ）（６７，６ｍｇ５　Ｏ、５ｍｍｏｌ）を加え、しかる後ＩＮ　ＨＣ ＩでｐＨを３．３５に調整した。１時間の攪拌後に１−（３−ジメチルアミノプ ロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）　（１５４，４ｍｇ、　 ０．　８ｍａ＋ｏｌ）を加え、ｐＨをＩＮ　ＨＣＩの添加で２時間にわたり４． ０〜４．８に維持した。飽和炭酸ナトリウムを加えてｐＨを７．０１に調整し、 生成物を９５％エタノール（〜１５０　ｍｌ）の添加により沈澱させた。得られ た固体物を真空濾過で集め、無水エタノール（３Ｘ２０ｍｌ）で洗浄し、凍結乾 燥により乾燥させた。改質ポリマーの全収率は６５％であった。その物質は更に 精製せずに直接３−ジメチルアミノプロピルアミンとのカップリングについて示 す。

水（３ｍｌ）中３−ジメチルアミノプロピルアミン（１０２ｍｇ、　１．０ｍｍ ｏｌ）をＩＮ　ＨＣＩでｐＨ７，０に調整し、水（４０＋ｌ）中ヒアルロン酸ナ トリウム（２００ｍｇ、　ｏ、　５ｍｍｏｌ、ＭＷＩ、７００，０００）の溶液 に加えた。１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ）（６７，６ｍ ｇ、０．５１１１１０１）を加え、ｐＨをＩＮ　ＨＣＩで３．３５に調整した。

１時間の攪拌後に１−　（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジ イミド塩酸塩（ＥＤＣ）（１５４，４ｍｇ。

０、　８ｍｍｏｌ）を加え、ｐＨをＩＮ　ＨＣＩ及び／又は１０％Ｗ／マ炭酸ナ トリウムの添加で５０分間にわたり４．６に維持した。次いで飽和炭酸ナトリウ ムを加えてｐＨを７．０に調整し、生成物の半分を下記のような限外濾過又はエ タノール沈澱法のいずれかにより精製した。

一部（２０ｍｌ）の反応溶液を水で３回の容量交換に対して環境温度で限外濾過 （１０００ＭＷＣＯ）により精製した。保留液を約１２ｍ１に濃縮し、更に精製 せずに用いた。

更に一部（２０ｍｌ）の反応溶液を１０％Ｗ／マ水性ＮａＣ１（５ｍｌ）に加え 、しかる後９５％エタノール（〜７５ｍ１）を加えた。これにより沈澱を形成さ せ、それを真空濾過により集め、無水エタノール（３Ｘ２０ｍｌ）で洗浄し、凍 結乾燥により乾燥させた。生成物は更に精製せずにヒドロゲルを製造するために 直接用いた。

例２５：この例はＨＯＢｔ及びＥＤＣを用いたＨＡとジヒドロキシフェニルアミ ン（ジーＤＯＰＡ）とのカップリングについて示す。

水（４０ｍｌ）中ヒアルロン酸ナトリウム（２００ｍｇ。

０、　５ｍｍｏｌ、ＭＷ２，１００，０００）及びｄ、１−ＤＯＰＡ　（２００ ｍｇ、　１．　０ｍｍｏｌ）の溶液に１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物 （ＨＯＢｔ）（６７，６ｍｇ。

Ｑ　、５　ｍｍｏｌ）を加え、しかる後ＩＮ　ＨＣＩでｐＨを４．３５に調整し た。１時間の攪拌後に１−　（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカル ボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（１５４，４ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）を加え、ｐＨ をＩＮ　ＨＣＩ又は１０％Ｗハ水性炭酸ナトリウムいずれかの適切な添加で２時 間にわたり４．０〜４．８に維持した。飽和炭酸ナトリウムを加えてｐＨを７． ０に調整し、生成物を９５％エタノール（〜１５０　ａｌｌ）の添加により沈澱 させた。得られた固体物を真空濾過で集め、無水エタノール（３Ｘ２０ｍｌ）で 洗浄し、凍結乾燥により乾燥させた。その物質は更に精製せずにヒドロゲルを製 造するために直接用いた。酸化から物質を保護するために空気とのゲル接触を制 限させる注意が払われると３−ジメチルアミノプロピルアミンとのカップリング について示す。

水（３ｍｌ）中３−ジメチルアミノプロピルアミン（１０２ｍｇ、　１．０ｍｍ ｏｌ）をＩＮ　ＨＣＩでｐ）ｉ’７．０に調整し、水（２０ｍｌ）中ＣＭＣ（１ ２５ｍｇ、０．５ｍの０１、ＭＷ２５０．０００）の溶液に加えた。１−ヒドロ キシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ）（６７，６ｍｇ、　０．　５ｍｍｏ ｌ）を加え、ｐＨをｌＮＨＣｌで４．０に調整した。１時間の攪拌後に１−（３ −ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（１ ５４，４ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）を加え、ｐＨをＩＮ　ＨＣＩ及び／又は１０％ 炭酸ナトリウムの添加で１時間にわたり４．７に維持した。反応の最後に１０％ 炭酸ナトリウムを加えてｐＨを７．０に調整した。生成物はエタノール沈澱後に 白色固体物として得た。

例２７・この例はＢｏｐ活性化ＨＡとグリシンメチルエステルとのカップリング について示す。

水（４０ｍｌ）中ヒアルロン酸ナトリウム（２００ｍｇ。

０、　５１１１ｍｏｌ、　ＭＷ２．　１００．　０００）の溶液にジメチルホル ムアミド（１１）中ベンゾトリアゾールー１−イルオキシトリス（ジメチルアミ ノ）ホスホニウムへキサフルオロホスフェート（Ｂｏｐ）（４４２，３ｍｇ、１ 　、　０　ｍｍｏｌ）を加え、しかる後ｐＨをＩＮ　ＨＣＩで４．６に調整した 。１５分間の攪拌後にグリシンメチルエステル塩酸塩（１２６Ｂ、　１．　０ｍ ｍｏｌ）を加え、反応混合液を環境温度で４０時間攪拌した。反応混合液を分岐 漏斗に移し、塩化メチレン（３Ｘ５０ｍｌ）で抽出した。

水層を除去し、生成物を９５％エタノールで沈澱させ、真空濾過により集めた。

固体物を少量の無水エタノールで洗浄し、風乾させた。この物質は更に精製せず に直接ヒドロゲルを製造するために用いた。

例２８：この例はＢｏｐ活性化ＨＡと３−アミノ−１−プロパツールとのカップ リングについて示す。

水（２０ｍｌ）中ヒアルロン酸ナトリウム（２００ｍｇ。

０、　５ｍｍｏｌ、ＭＷｌ、７００，０００）の溶液にベンゾトリアゾール−１ −イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムへキサフルオロホスフェ− ｈ　（４４２，３ｍｇ、　１　、Ｏｍｍｏｌ）を加えた。１５分間後に３−アミ ノ−１−プロパツール（４５，１ｍｇ、　０．６ｍｍｏｌ）をジメチルホルムア ミド（３ｍｌ）と共に加え、反応混合液のｐＨを１．０ＮＨＣＩで４．８に調整 した。環境温度で一夜攪拌後にこの反応混合液のｐＨを飽和炭酸ナトリウムで〜 ７．０に調整し、反応混合液を塩化メチレン（３×５０ｍ１）で抽出した。水相 を分離し、９５％エタノール（”＝１００ｍｌ）を加えて生成物を沈澱させた。

固体物を真空濾過により集め、無水エタノール（３Ｘ２０ＩＩｌｌ）で洗浄し、 減圧上収率６０％で乾燥させた。その物質は更に精製せずにヒドロゲルを製造す るために直接用いた。

例２９：この例は例２３〜２８の反応生成物を用いたヒドロゲルの形成について 示す。

例２３〜２８のいずれかの反応生成物の固体部分（２０ｍｇ）を０．９％ｖ／を 塩化ナトリウム溶液（２０＋＋）に加え、混合液を環境温度で一夜放置した。こ の時間経過後に透明無色のヒドロゲルが生じたが、これは残留塩化ナトリウム溶 液をデカントすることで単離した。次いでこれらの得られたゲルは物理的及びイ ンビボ評価のために直接用いた。

例３０：この例はＨＯＢｔ及びＥＤＣを用いたＨＡ及びＣＭＣと３−ジメチルア ミノプロピルアミンとのカップリングについて示す。

水（５００ｍｌ）中ヒアルロン酸ナトリウム（４，０ｇ。

１０ｍｍｏｌ、　ＭＷ２．　３００．　０００）及びカルボキシメチルセルロー ス（５，１ｇｓ　２０ｍｍｏｌ、ＭＷ２５０．０００）の溶液に１−ヒドロキシ ベンゾトリアゾール水和物（４，１ｇ、　３０ｍｍｏｌ）及び３−ジメチルアミ ノプロピルアミン塩酸塩（４，２ｇ、　３０ｍｍｏｌ）を加え、ｐＨをＩＮ　Ｈ ＣＩで４．６０に調整した。すべての化合物が溶解した後で１−　（３−ジメチ ルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（８，０ｇ　ｓ　４０　 ｍｍｏｌ）を加え、ｐＨをＩＮ　ＨＣＩ又は１０％Ｎａ２ＣＯ３いずれかの添加 で１時間にわたり４．６〜５．０に維持した。次いでｐＨを１０％Ｎａ２ＣＯ３ で５．０に調整し、溶液の半分を４倍反応液容量のエタノールでエタノール沈澱 させ、更にエタノールで洗浄し、風乾した。残り半分はｐＨ４，７５に調整され た水（２０倍容量）に対して２４時間透析した（１２．ＯＯＯＮＭＷカットオフ 透析管）。

本発明のフィルム、フオーム又はゲルは、例えばＤｅＢｅｌｄｅ＋らのＰＣＴ公 開第ＷＯ８６１００９１２号明細書で記載されたように、外科業界で知られる操 作に従い術後又は治癒期間中に体組織の癒着又は付着を妨げるために外科補助品 として使用できる。手術中に１枚以上のゲル又はフィルムが分離させたままにし ておく組織の間又は中に適宜に挿入又は注入される。

本発明の不溶性物質は生物耐久性及び廣蝕性ポリマー表面に共有及び／又は非共 有双方で結合された表面調整剤；潜在的漏出部位の共接着又は封止を要するカテ ーテル、腸吻合、内視鏡外科処置、血管移植片及びあらゆる補綴装置用の吻合部 位における封止剤；糸、組み紐、織布及び不織布、織物、マットに加工する上で 可能な新しい生物適合性繊維及び創傷閉鎖用の縫合糸；静脈瘤血管除去、腫瘍及 び動脈瘤用の硬化剤；皮膚裂傷及び熱傷で組織代替用の人工細胞外マトリックス 物質としても使用できる。

本発明のフィルム、フオーム又はゲルは更に徐放薬物デリバリ−に用いることも できる。デリバリ−される薬物は例えばＴ、　Ｊ、　Ｒｏｓｅｍａｎら、Ｃｏｎ ｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅ１ｅａｓｅＤｅｌｉｙｅＢ　Ｓｙ＋ｌｅｍｓ、Ｍａ＋ｃｅ ｌ　Ｄｅｋｋｅ＋、Ｉｎｃ、、Ｎｃｖ　Ｙｅｔ目こおいてＲ，Ｖ、　５ｐａｒｅ ｒら、１９８３．Ｃｈａｐｔｅｒ６．ｐａｇｅｓ　１０７−１１９で記載された ようにゲル又はフィルムに共有結合させることができる；次いでゲル又はフィル ムはデリバリ−が望まれる箇所で埋込み又は注入できる。

他の態様 他の態様は下記請求の範囲内に属する。例えば、反応の規模は本発明の組成物の 商業生産のために増加させてもよい。ポリアニオン性多糖対活性化剤の比率変更 がポリアニオン性多糖の官能度をコントロールすることも当業者であればよく理 解される。

フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＳＥ）、　ＡＵ、 　ＣＡ、　ＦＩ、ＪＰ、　Ｎｏ（７２）発明者　ズウ、ズウエイアン アメリカ合衆国マサチューセッツ州、ケンブリッジ、レインジ、アベニュ、７エ ム、

Claims (94)

【特許請求の範囲】
1. １．非水溶性生物適合性組成物の製造方法であって、上記組成物を形成するため に十分な条件下においてポリアニオン性多糖、求核剤及び活性化剤を水性混合液 中で混合することからなる方法。
2. ２．２種以上のポリアニオン性多糖が用いられる、請求項１に記載の方法。
3. ３．ポリアニオン性多糖がカルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルアミ ロース、ヒアルロン酸、コンドロイチン−６−硫酸、デルマチン硫酸、ヘパリン 及びヘパリン硫酸からなる群より選択される、請求項１又は２に記載の方法。
4. ４．ポリアニオン性多糖がヒアルロン酸である、請求項１に記載の方法。
5. ５．ポリアニオン性多糖がカルボキシメチルセルロースである、請求項１に記載 の方法。
6. ６．ポリアニオン性多糖がカルボキシメチルアミロースである、請求項１に記載 の方法。
7. ７．２種のポリアニオン性多糖がヒアルロン酸及びカルボキシメチルセルロース である、請求項２に記載の方法。
8. ８．活性化剤がベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ） ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、０−ベンゾトリアゾール−１−イル −Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、 ブロモトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、ブ ロモトリス（ピロリジニル）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート及びそれ らの対応ハライド塩からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
9. ９．ポリアニオン性多糖が０．０００２〜０．１Ｍの濃度で存在する、請求項１ に記載の方法。
10. １０．ポリアニオン性多糖が０．０００５〜０．０２Ｍの濃度で存在する、請求 項９に記載の方法。
11. １１．方法がｐＨ３．５〜８．０で実施される、請求項１に記載の方法。
12. １２．活性化剤対多糖の化学量論量がモル当量のポリアニオン性多糖当たり少く とも０．１モル当量の活性化剤である、請求項１に記載の方法。
13. １３．求核剤がアミノ酸アミド、一官能性アミン、アミノ酸エステル、アミノア ルコール、アミノチオール、アミノフェノール、アミノカテコール、アミノ酸、 アミノ酸の塩、ペプチド及びタンパク質からなる群より選択される、請求項１に 記載の方法。
14. １４．ポリアニオン性多糖対求核剤の化学量論量がモル当量のポリアニオン性多 糖当たり少くとも１モル当量の活性化剤である、請求項１に記載の方法。
15. １５．非水溶性生物適合性組成物の製造方法であって、 上記組成物を形成するために十分な条件下において１種以上のポリアニオン性多 糖、改質化合物、求核剤及び活性化剤を水性混合液中で混合し、その場合に上記 改質化合物が上記ポリアニオン性多糖において新しい活性カルボニル基の形成を 引き起こすことからなる方法。
16. １６．２種以上のポリアニオン性多糖が用いられる、請求項１５に記載の方法。
17. １７．ポリアニオン性多糖がカルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルア ミロース、ヒアルロン酸、コンドロイチン−６−硫酸、デルマチン硫酸、ヘパリ ン及びヘパリン硫酸からなる群より選択される、請求項１５又は１６に記載の方 法。
18. １８．ポリアニオン性多糖がヒアルロン酸である、請求項１５に記載の方法。
19. １９．ポリアニオン性多糖がカルボキシメチルセルロースである、請求項１５に 記載の方法。
20. ２０．ポリアニオン性多糖がカルボキシメチルアミロースである、請求項１５に 記載の方法。
21. ２１．２種のポリアニオン性多糖がヒアルロン酸及びカルボキシメチルセルロー スである、請求項１６に記載の方法。
22. ２２．改質化合物が１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物、１−ヒドロキシ ベンゾトリアゾール一水和物、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド、Ｎ−ヒド ロキシスクシンイミド、４−ニトロフェノール、２−ニトロフェノール、４−ニ トロチオフェノール、２−ニトロチオフェノール、ペンタクロロフェノール、ペ ンタフルオロフェノール、イミダゾール、テトラゾール及び４−ジメチルアミノ ピリジンからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
23. ２３．活性化剤がカルボジイミドからなる、請求項１５に記載の方法。
24. ２４．カルボジイミドが１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル ボジイミド又は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ ドメチオジドからなる、請求項２３に記載の方法。
25. ２５．ポリアニオン性多糖が０．０００２〜０．１Ｍの濃度で存在する、請求項 １５に記載の方法。
26. ２６．ポリアニオン性多糖が０．０００５〜０．０２Ｍの濃度で存在する、請求 項２５に記載の方法。
27. ２７．方法がｐＨ３．５〜８．０で実施される、請求項１５に記載の方法。
28. ２８．ポリアニオン性多糖対活性化剤の化学量論量がモル当量のポリアニオン性 多糖当たり少くとも０．１モル当量の活性化剤である、請求項１５に記載の方法 。
29. ２９．改質剤対活性化剤の化学量論量がモル当量の活性化剤当たり少くとも１モ ル当量の改質化合物である、請求項１５に記載の方法。
30. ３０．求核剤がアミノ酸アミド、一官能性アミン、アミノ酸エステル、アミノア ルコール、アミノチオール、アミノフェノール、アミノカテコール、アミノ酸、 アミノ酸の塩、ペプチド及びタンパク質からなる群より選択される、請求項１５ に記載の方法。
31. ３１．請求項１、２、１５又は１６の方法に従い製造された非水溶性組成物。
32. ３２．組成物がゲルの形である、請求項３１に記載の組成物。
33. ３３．組成物が繊維の形である、請求項３１に記載の組成物。
34. ３４．組成物が膜の形である、請求項３１に記載の組成物。
35. ３５．組成物がフオームの形である、請求項３１に記載の組成物。
36. ３６．組成物が癒着防止組成物の形である、請求項３１に記載の組成物。
37. ３７．組成物内に分散された薬学上活性な物質を更に含む、請求項３１に記載の 組成物。
38. ３８．薬学上活性な物質がタンパク質、成長因子、酵素、薬物、バイオポリマー 及び生物学上適合性の合成ポリマーからなる群より選択される、請求項３７に記 載の組成物。
39. ３９．ポリアニオン性多糖、求核剤及び活性化剤の反応生成物を含む非水溶性組 成物。
40. ４０．２種以上のポリアニオン性多糖、求核剤及び活性化剤の反応生成物を含む 非水溶性組成物。
41. ４１．活性化剤がベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、０−ベンゾトリアゾール−１−イ ル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート 、ブロモトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、 ブロモトリス（ピロリジニル）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート及びそ れらの対応ハライド塩からなる群より選択される、請求項３９又は４０に記載の 非水溶性組成物。
42. ４２．ポリアニオン性多糖、改質化合物、求核剤及び活性化剤の反応生成物を含 む非水溶性組成物。
43. ４３．２種以上のポリアニオン性多糖、改質化合物、求核剤及び活性化剤の反応 生成物を含む非水溶性組成物。
44. ４４．ポリアニオン性多糖がカルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルア ミロース、ヒアルロン酸、コンドロイチン−６−硫酸、デルマチン硫酸、ヘパリ ン及びヘパリン硫酸からなる群より選択される、請求項３９、４０、４２又は４ ３に記載の組成物。
45. ４５．ポリアニオン性多糖がヒアルロン酸である、請求項３９又は４２に記載の 組成物。
46. ４６．ポリアニオン性多糖がカルボキシメチルセルロースである、請求項３９又 は４２に記載の組成物。
47. ４７．ポリアニオン性多糖がカルボキシメチルアミロースである、請求項３９又 は４２に記載の組成物。
48. ４８．２種のポリアニオン性多糖がヒアルロン酸及びカルボキシメチルセルロー スである、請求項４０又は４３に記載の組成物。
49. ４９．求核剤がアミノ酸アミド、一官能性アミン、アミノ酸エステル、アミノア ルコール、アミノチオール、アミノフェノール、アミノカテコール、アミノ酸、 アミノ酸の塩、ペプチド及びタンパク質からなる群より選択される、請求項３９ 、４０、４２又は４３に記載の組成物。
50. ５０．改質化合物が１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物、１−ヒドロキシ ベンゾトリアゾール一水和物、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド、Ｎ−ヒド ロキシスクシンイミド、４−ニトロフェノール、２−ニトロフェノール、４−ニ トロチオフェノール、２−ニトロチオフェノール、ペンタクロロフェノール、ペ ンタフルオロフェノール、イミダゾール、テトラゾール及び４−ジメチルアミノ ピリジンからなる群より選択される、請求項４２又は４３に記載の組成物。
51. ５１．活性化剤がカルボジイミドからなる、請求項４２又は４３に記載の組成物 。
52. ５２．カルボジイミドが１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル ボジイミド又は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ ドメチオジドからなる、請求項５１に記載の組成物。
53. ５３．組成物がゲルの形である、請求項３９、４０、４２又は４３に記載の組成 物。
54. ５４．組成物が繊維の形である、請求項３９、４０、４２又は４３に記載の組成 物。
55. ５５．組成物が膜の形である、請求項３９、４０、４２又は４３に記載の組成物 。
56. ５６．組成物がフォームの形である、請求項３９、４０、４２又は４３に記載の 組成物。
57. ５７．組成物が癒着防止組成物の形である、請求項３９、４０、４２又は４３に 記載の組成物。
58. ５８．組成物内に分散された薬学上活性な物質を更に含む、請求項３９、４０、 ４２又は４３に記載の組成物。
59. ５９．薬学上活性な物質がタンパク質む、成長因子、酵素、薬物、バイオポリマ ー及び生物学上適合性の合成ポリマーからなる群より選択される、請求項５８に 記載の組成物。
60. ６０．非水溶性生物適合性組成物の製造方法であって、 上記組成物を形成するために十分な条件下においてポリアニオン性多糖及び活性 化剤を水性溶液中で混合することからなる方法。
61. ６１．ポリアニオン性多糖がカルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルア ミロース、ヒアルロン酸、コンドロイチン−６−硫酸、デルマチン硫酸、ヘパリ ン及びヘパリン硫酸からなる群より選択される、請求項６０に記載の方法。
62. ６２．ポリアニオン性多糖がヒアルロン酸である、請求項６１に記載の方法。
63. ６３．ポリアニオン性多糖がカルボキシメチルセルロースである、請求項６１に 記載の方法。
64. ６４．ポリアニオン性多糖がカルボキシメチルアミロースである、請求項６１に 記載の方法。
65. ６５．活性化剤がカルボジイミドからなる、請求項６０に記載の方法。
66. ６６．カルボジイミドが１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル ボジイミド又は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ ドメチオジドからなる、請求項６５に記載の方法。
67. ６７．ポリアニオン性多糖が０．００５〜０．１Ｍの濃度で存在する、請求項６ ０に記載の方法。
68. ６８．ポリアニオン性多糖が０．０１〜０．０２Ｍの濃度で存在する、請求項６ ７に記載の方法。
69. ６９．方法がｐＨ３．５〜８．０で実施される、請求項６０に記載の方法。
70. ７０．ポリアニオン性多糖対活性化剤のモル比が少くとも１：１である、請求項 ６０に記載の方法。
71. ７１．ポリアニオン性多糖対活性化剤のモル比が約４：１である、請求項６０に 記載の方法。
72. ７２．請求項１の方法に従い製造された非水溶性組成物。
73. ７３．組成物がゲルの形である、請求項７２に記載の組成物。
74. ７４．組成物が繊維の形である、請求項７２に記載の組成物。
75. ７５．ポリアニオン性多糖及び活性化剤の反応生成物を含む非水溶性組成物。
76. ７６．ポリアニオン性多糖がカルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルア ミロース、ヒアルロン酸、コンドロイチン−６−硫酸、デルマチン硫酸、ヘパリ ン及びヘパリン硫酸からなる群より選択される、請求項７５に記載の組成物。
77. ７７．ポリアニオン性多糖がヒアルロン酸である、請求項７５に記載の組成物。
78. ７８．ポリアニオン性多糖がカルボキシメチルセルロースである、請求項７５に 記載の組成物。
79. ７９．ポリアニオン性多量がカルボキシメチルアミロースである、請求項７５に 記載の組成物。
80. ８０．活性化剤がカルボジイミドからなる、請求項７５に記載の組成物。
81. ８１．カルボジイミドが１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル ボジイミド又は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ ドメチオジドからなる、請求項８０に記載の組成物。
82. ８２．ゲル内に分散された薬学上活性な物質を更に含む、請求項８０に記載の組 成物。
83. ８３．薬学上活性な物質がタンパク質、成長因子、酵素、薬物、バイオポリマー 及び生物学上適合性の合成ポリマーからなる群より選択される、請求項８２に記 載の組成物。
84. ８４．組成物が癒着防止組成物の形である、請求項７５に記載の組成物。
85. ８５．組成物が膜の形である、請求項７５に記載の組成物。
86. ８６．組成物がフォームの形である、請求項７５に記載の組成物。
87. ８７．第一ポリアニオン性多糖及び活性化剤の反応生成物を第二ポリアニオン性 多糖及び活性化剤の反応生成物と一緒に含む非水溶性混合物。
88. ８８．第一ポリアニオン性多糖がカルボキシメチルセルロースであり、第二ポリ アニオン性多糖がヒアルロン酸である、請求項８７に記載の混合物。
89. ８９．第一ポリアニオン性多糖がカルボキシメチルアミロースであり、第二ポリ アニオン性多糖がヒアルロン酸である、請求項８７に記載の混合物。
90. ９０．ブレンド内に分散された薬学上活性な物質を更に含む、請求項８７に記載 の混合物。
91. ９１．薬学上活性な物質がタンパク質、成長因子、酵素、薬物、バイオポリマー 及び生物学上適合性の合成ポリマーからなる群より選択される、請求項８７に記 載の混合物。
92. ９２．混合物が癒着防止組成物の形である、請求項８７に記載の混合物。
93. ９３．混合物が膜の形である、請求項８７に記載の混合物。
94. ９４．混合物がフオームの形である、請求項８７に記載の混合物。