JPH06508364A - ガス充填リポソーム及び超音波造影剤としてのそれらの使用 - Google Patents

ガス充填リポソーム及び超音波造影剤としてのそれらの使用

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ガス充填リポソーム及び超音波造影剤としてのそれらの使用本願は１９８９年１ ２月２２日提出の米国特許第４５５，７０７号の一部継続出願である１９９０年 ８月２０日提出の米国出願第５６９．８２８号と同時に係属する一部継続出願で あり、各明細書の記載事項は引用することにより本明細書の内容となる。
発明の分野 本発明は、超音波イメージングの分野にそして、更に詳細には、真空乾燥ガス注 入方法を使用して製造された、ガス充填リポソームに、そしてその内部に液体が 実質的にない、ガス充填リポソームに関する。本発明はまた、このようなリポソ ームを製造するための方法及び装置に、そして超音波イメージング用途にこのよ うなリポソームを用いるための方法に関する。
発明の背景 動物及びヒトの疾磨を検出しそして診断するために使用されてきた種々のイメー ジング技術が存在する。診断用イメージングのために使用された最初の技術の１ つはＸ線であった。この技術を通して得られる画像は、画像が形成される対象物 の電子密度を反映する。造影剤例えばバリウムまたはヨウ素は、種々の構造間の コントラストが増加するようにＸ線を減衰または遮蔽するために多年にわたって 使用されてきた。例えば、バリウムは、腸内腔を規定しそして腸の粘膜の表面を 可視化するための胃腸の研究のために使用されている。ヨウ素化された造影剤は 、血管造影法と呼ばれるＸ線方法により動脈を脈管内的に可視化するために使用 される。しかしながら、Ｘ線は、Ｘ線において用いられる放射線が電離性であり 、そして電離放射線の種々の有害な影響は累積性であるので、幾らか危険である ことが知られている。
磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）はもう一つの重要なイメージング技術であるが 、この技術は種々の欠点、例えば高価な費用及び、ボータプルな検査としてそれ を行うことができないという事項を有する。加えて、ＭＲｒは多くの医療センタ ーで利用可能ではない。
核医学において用いられる放射性核種は別のイメージング技術を提供する。この 技術を用いる際には、放射性核種例えばテクネチウムでラベルされた化合物を患 者の中に注入し、そして画像をガンマカメラから得る。しかしながら、核医学技 術は、乏しい空間解像度に苦しみそして動物または患者を放射線の有害な影響に 曝す。更にまた、放射性核種の取り扱い及び廃棄に伴う問題が存在する。
なお別の診断用イメージング技術である超音波は、それが電離放射線の有害な影 響に患者を曝さないという点で核医学及びＸ線とは同じではないつ更にまた、磁 気共鳴イメージングとは違って、超音波は比較的安価でありそしてポータプルな 検査として行うことができる。超音波技術を使用する際には、音は変換器によっ て患者または動物中に送られる。
音波が体を通って伝播する時に、それらは組繊及び体液からの界面に出会う。体 の中の組織及び体液の音響特性に依存して、超音波の音波は、部分的にまたは全 体的に反射または吸収される。音波が界面によって反射される時には、それらは 変換器中のレシーバ−によって検出されそして処理されて画像を形成する。体内 の組織及び体液の音響特性が、形成する画像中に現れるコントラストを決定する 。
近年、超音波技術において進歩があった。しかしながら、これらの種々の技術上 の改善にも拘わらず、超音波は、多数の面において、特に肝臓及び牌臓、腎臓、 心臓及び脈管系における疾患のイメージング及び検出に関して、血液の流れを測 定することを含めて、なお不完全な道具である。これらの事項を検出しそして測 定する能力は、組織または体液と取り巻く組織または体液との間の音響特性にお ける差に依存する。結果として、超音波イメージング及び疾患の検出を改善する ために、組織または体液と取り巻く組織または体液との間の音響の差を増すであ ろう造影剤がめられてきた。
超音波における画像形成の下に横たわる原理は、研究者を気体状造影剤の追求に 向けてきた。音響特性または音響インピーダンスにおける変化は、大幅に異なる 密度または音響インピーダンスを有する異なる物質の界面で、特に固体、液体及 び気体の間の界面で最も際立つ。超音波の音波がこのような界面に出会う時には 、音響インピーダンスにおける変化は、音波の一層強い反射及び超音波像におけ る一層強い信号を結果としてもたらす。音の効率または反射に影響を与える付加 的な要因は、反射する界面の弾性である。この界面の弾性が大きければ大きいほ ど、音の反射はそれだけ一層効率的である。ガスの泡のような物質は高度に弾性 的な界面を提供する。かくして、上述の原理の結果として、研究者は、ガスの泡 またはガス含有物体を基にした超音波造影剤の開発に焦点を合わせてきた。しか しながら、このような造影剤が効果的であるはずである理論的理由にも拘わらず 、全体としての診断の結果は、これまでのところ幾らか失望的であった。
超音波イメージングのための新しくモして／またはより良好な造影剤が必要とさ れる。本発明はこれらの及び／またはその他の重要な要望に答えることを指向す る。
発明の要約 本発明は超音波イメージングのための造影剤を提供する。
詳細には、１つの態様においては、本発明は、真空乾燥ガス注入方法によって製 造された、ガス充填リポソームを含んで成る超音波造影剤を提供し、そしてこの ようなリポソームは、本明細書中では時々真空乾燥されたガス充填リポソームと 称される。もう一つの態様においては、本発明はその内部に液体が実質的にない 、ガス充填リポソームを含んで成る造影剤に向けられる。
別の態様においては、本発明は本発明のリポソームを製造するための方法を提供 し、そしてこれらの方法は、（１）リポソームを除圧下に置（こと、（Ｕ）前記 リポソームから実質的にすべての液体を除去するのに十分な時間の間、前記リポ ソームを前記除圧下でインキュベートすること、及び（出）周囲圧力に到達する まで前記リポソーム中に選ばれたガスを注入することを含んで成る。上述の工程 を用いる方法は、本明細書中では真空乾燥ガス注入方法と称される。
なお別の態様においては、本発明は、真空乾燥ガス注入方法を使用して本発明の リポソームを製造するための装置を提供し、そしてこの装置は、（ｉ）リポソー ムを含む容器、（■）この中に入れられたリポソームから液体を引き出すために 容器に除圧をかけるための手段、（出）除圧をかける手段を容器に接続する導管 （この導管は液体の流れを方向付ける）、及び（ｉｖ）容器中のリポソーム中に ガスを導入するための手段を含有して成る。
さらなる態様においては、本発明は、患者の内部部位の画像を供給するための、 及び／または患者の疾患組織の存在を診断するための方法であって、（１）本発 明のリポソームを患者に投与すること、及び（ｉｔ）超音波イメージングを使用 して患者を走査して、患者の部位の及び／または患者の中のあり得る疾患組織の 可視画像を得ることを含んで成る方法を意図する。
最後に、本発明は、本発明の造影剤を含む、超音波イメージングのための診断用 キットを提供する。
驚くべきことに、真空乾燥ガス注入方法によって製造された、ガス充填リポソー ム、及び真空乾燥ガス注入方法に従って製造することができるその内部に液体が 実質的にない、ガス充填リポソームは、多数の予期できない高度に有益な特徴を 有する。本発明のリポソームは、超音波に対する強い反響性（ｅｃｈｏｇｅｎｉ ｃｉｔｙ）を示し、圧力に対して高度に安定であり、そして／または乾燥して若 しくは液体媒体中に懸濁して貯蔵される時のいずれにおいても長い貯蔵寿命を有 する。また、ガスが充填されそして、カップ状の形に不可逆的につぶれるよりは むしろそれらの元の円の形を再び取る、真空乾燥ガス注入方法の間のリポソーム の能力は驚くべきことである。
事実、ガスの泡またはガス含有物体を基にした先行技術の超音波造影剤が効果的 であるはずであるという理論的理由にも拘わらず、診断の結果は殆ど失望的に留 まっていた。従前の研究者によって開発された多数のガス状超音波造影剤は安定 化されていない泡を含んでいて、そしてこれらの造影剤の不安定性はこのような 造影剤の診断の有用性をひどく低減することが見い出された。従前の研究者によ って開発されたその他のガス状超音波造影剤は、かなりの量の液体もまた含む構 成体で安定化されたガスの泡を含んでいて、そして構成体中のかなりの量の液体 の存在は鳩尾のより少ない診断の結果を導くことが見い出された。事実、構成体 中の液体の存在は構成体中のガスの共鳴の特徴を不利に変えることが見い出され 、そして構成体中への更なる液体の（そして付随的には構成体からのガスの）拡 散を促進することが見い出された。本発明は、これらの及び／またはその他の重 要な必要性を扱う努力において、超音波イメージングのための新しい及び／また はより良い造影剤を提供する。
本発明のこれらのそしてその他の特徴及びその利点を、以下の図面及び説明にお いてより詳細に述べる。
図面の簡単な説明 図１は、真空乾燥ガス注入方法によって製造される、真空乾燥されたガス注入リ ポソーム及びその内部に液体が実質的にないガス充填リポソームを製造するため の本発明による装置を示す。
図２は、真空乾燥ガス注入方法によって製造されたその内部に液体が実質的にな い、ガス充填リポソームのｄＢ反射率のグラフ図である。このデータは、Ａｃｏ ｕｓｔｉｃ　Ｉｍａｇｉｎｇ（商標）モデル５２００走査機（Ａｃｏｕｓｔｉｃ 　Ｉｍａｇｉｎｇ、フエニソクス、アリシナ）を使用して７．５メガヘルツの変 換器によって走査することによって得られ、そして反射率を測定するためのシス テムテストソフトウェアを使用して描いた。このシステムは、各々の実験に先立 って既知の音響のインピーダンスによって標準化した。
本発明は、真空乾燥ガス注入方法によって製造された、ガス充填リポソームを含 んで成る超音波造影剤に向けられ、このようなリポソームは本明細書中では時々 真空乾燥されたガス注入リポソームと称される。本発明は、更に、その内部に液 体が実質的にない、ガス充填リポソームを含んで成る造影剤に向けられる。
真空乾燥ガス注入方法によって製造された、ガス充填リポソームと、その内部に 液体が実質的にない、ガス充填リポソームとの両方を製造するために用いること ができる真空乾燥ガス注入方法は、以下の方法を意図する。第一に、この方法に 従って、リポソームを除圧（即ち、減圧または真空状態）下に置く。次に、リポ ソームを、リポソームから実質的にすべての液体を除去し、それによって実質的 に乾燥されたリポソームを生成させるのに十分な時間、その除圧下でインキュベ ートする。実質的にすべての液体の除去ζは、そして実質的に乾燥されたリポソ ームとは、これらの文言が本明細書中で使用される時には、リポソームは液体が 少なくとも約９０％ない、好ましくは液体が少なくとも約９５％ない、最も好ま しくは液体がほぼ１００％ないことを意味する。最後に、周囲圧力に到達するま でリポソームにガスを付与することによってリポソームに選ばれたガスを注入し 、かくして本発明の主題の真空乾燥されたガス注入されたリポソーム、及びその 内部に液体が実質的にない、本発明のガス充填リポソームを生成させる。本明細 書中で使用される時には、その内部に液体が実質的にないとは、液体が少なくと も約９０％ない、好ましくは液体が少な（とも約９５％ない、最も好ましくは液 体がほぼ１００％ないことを意味する。
予想外にも、真空乾燥ガス注入方法に従って製造されたリポソーム、及びその内 部に液体が実質的にない、ガス充填リポソームは、多数の驚くべきしかし高度に 有益な特徴を有する。本発明のリポソームは、超音波に対する強い反響性を示し 、圧力に対して高度に安定であり、モして／または乾燥して若しくは液体媒体中 に懸濁されてのどちらかで貯蔵される時に一般的に長い貯蔵寿命を有する。リポ ソームの反響性は、本発明の診断に使用する上で明らかに重要であり、そして図 ２中に図示されている。好ましくは、本発明のリポソームは、２ｄＢより大きい 、好ましくは約４ｄＢ〜約２０ｄＢの反射率を有する。これらの範囲内で、本発 明のリポソームに関する最高の反射率は、より大きなリポソームによって、リポ ソームのより高い濃度によって、及び／またはより高い超音波周波数を用いる場 合に示される。リポソームの安定性もまた、実用上非常に重要である。本発明の リポソームは、既知の手順例えば加圧化またはその他の技術によって製造された 、その他のガス充填リポソームよりも、貯蔵の間大きな安定性を有する傾向があ る。例えば、生成の７２時間後では、従来のやり方で製造されたリポソームは、 しばしば本質的にガスがなく、ガスがリポソームから拡散してしまったか及び／ またはリポソームが破裂及び／または融解してしまって、結果として同時に反射 率の損失がもたらされる。これと比較して、本発明のガス充填リポソームは、一 般的に約３週間より長い貯蔵寿命安定性、好ましくは約４週間より長い貯蔵寿命 安定性、更に好ましくは約５週間より長い貯蔵寿命安定性、なお更に好ましくは 約３カ月より長い貯蔵寿命安定性、そしてしばしばもっとずっと長い、例えば６ 力月、１２力月、または２年をさえ越える貯蔵寿命安定性を有する。
また、ガスで満たされそして、先行技術から予期されるようにカップの形の構造 につぶれるよりもむしろそれらの元の円の形を取り戻す、真空乾燥ガス注入方法 の間のリポソームの能力は予想外である。例えば、本発明の真空乾燥ガス注入方 法にかけられるリポソームは、当業者には明らかであろう種々の慣用のリポソー ム調製技術の任意の１つを使用して製造することができる。これらの技術は、凍 結融解、並びに超音波処理、キレート透析、均質化、溶媒注入（ｉｎｆｕｓｉｏ ｎ）、マイクロ乳化、自発形成、溶媒蒸発、フレンチプレス細胞技法、制御され た洗浄剤透析及びその他のような技術を含む。所望の場合には、リポソームのサ イズは、真空乾燥及びガス注入に先立って、生成するリポソームの生物分布及び クリアランスを調節するために、種々の手順例えば押出、濾過、超音波処理、液 体の非混和性シース中に導入された液体のコアの層流を用いる均質化、及び類似 の方法によって調節することができる。
しかしながら、規定されたサイズの細孔を通しての圧力下での押出が、リポソー ムのサイズを調節する好ましい手段である。上述の技術、並びにその他のものは 、例えば、米国特許第４．７２８．５７８号、英国特許出願ＧＢ２１９３０９５ Ａ、米国特許第４．７２８．５７５号、米国特許第４，７３７，３２３号、国際 出願ＰＣＴ／ＵＳ８５１０１１６１、Ａｃｔａ、８５８巻、１６１〜１６８頁（ １９８６）　、Ｈｏｐｅら、１２巻、５５〜６５頁（１９８５）、米国特許第４ ．５３３，２５４号、Ｍａ　ｙ　ｈ　ｅｗら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ ｍｏｌｏｇｙ、１４９巻、６４〜７７頁（１９８７）　、Ｍａｙｈｅｗら、Ｂｉ ｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ、７５５巻、１６９ 〜７４頁（１９８４）　、Ｃｈｅｎｇら、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ　Ｒａｄ ｉｏｌｏｇｙ、２２巻、４７〜５５頁（１９８７）、ＰＣＴ／ＵＳ８９１０５０ ４０、米国特許第４，１６２．２８２号、米国特許第４゜３１０．５０５号、米 国特許第４，９２１，７０６号並びにＬｉｐ。
ｓｏｍｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、Ｇ、編集、１巻、 ２９〜３７．５１〜６７及び７９〜１０８頁（ＣＲＣ出版社、Ｂｏｃａ　Ｒａ　 ｔｏｎ、ＦＬ、１９８４）中で議論されている。上述の特許、刊行物及び特許出 願の各々の開示事項は、それらの全体が引用によって本明細書中に組み込まれる 。多数の種々の技術の任意のものを用し）ることができるけれども、好ましくは 、リポソームはマイクロ乳化技術によって製造される。種々の慣用の手順によっ て製造されたリポソーム１よ、次に、本発明のリポソームを製造するために、本 発明の真空乾燥ガス注入方法において用いることができる。
本発明の真空乾燥ガス注入方法において用いられるべきリポソームを製造する際 に利用することができる物質は、リポソーム合成のために適切であるとして当業 者に知られている任意の物質またはそれらの組み合わせを含む。使用される脂質 は、天然または合成のどちらの起源のものでも良い。このような物質は、脂質例 えば脂肪酸、リソ脂質、ジノくルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジ ルコリン、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン、コレステロール、コレステ ロールヘミスクシネート、トコフヱロールヘミスクシネート、ホスファチジルエ タノールアミン、ホスファチジルイノシトール、リソ脂質、スフィンゴミエリン 、グリコスフィンゴ脂質、グルコ脂質、グリコ脂質、スルファチド、エーテル及 びエステル結合された脂肪酸を有する脂質、重合された脂質、リン酸ジアセチル 、ステアリルアミン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ホスファチジルセ リン、スフィンゴミエリン、カルシオリピン、長さが６〜８の炭素の短鎖脂肪酸 を含むリン脂質、非対称アシル連鎖を含む（例えば、６の炭素の一つのアシル連 鎖及び１２の炭素のもう一つのアシル連鎖を含む）合成リン脂質、６−（５−コ ーステン−３β−イロキシ）−１−チオーβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、ジガラ クトシルジグリセリド、６−（５−コーステン−３β−イロキシ）へキシル−６ −アミノ−６−デオキシ−１−チオーβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−（５− コーステン−３β−イロキシ）へキシル−６−アミノ−６−デオキシルー１−チ オ−α−ローマンノピラノシド、ジベヘノイルホスファチジルコリン、シミリス トイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、並びにジオ レオイルホスファチジルコリン、並びに／またはこれらの組み合わせを含むが、 それらに限定されない。本発明の精神を保持する当業者に明らかなその他の有用 な脂質またはそれらの組み合わせもまた、本発明によって包含される。例えば、 米国特許第４．３１０．５０５号中に述べられたように、脂質を有する炭水化物 を生体内標的化（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）のために用いて良い。本発明における使 用のために特に興味あるものは、真空乾燥ガス注入が行われる温度でゲル状態（ 液状結晶性状態と比較して）にある脂質である。種々の脂質の相転移温度は、当 業者には容易に明らかであろうし、そして、例えば、その開示が全体として引用 によって本明細書中に組み込まれる、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＳＧｒｅｇｏｒｉａｄｔｓ。
Ｇ、編集、１巻、１〜１８頁（ＣＲＣ出版社、Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ。
ＦＬ　１９８４）中に述べられている。加えて、任意のリポソーム膜中への少な くとも小量の負に荷電された脂質の組み入れは、必要ではないけれども、高度に 安定なリポソームを供給するために有益である。少なくとも小量とは、全脂質の 約１モル％を意味する。適切な負に荷電された脂質は、当業者には容易に明らか であろうし、そして、例えばホスファチジルセリン及び脂肪酸を含む。真空乾燥 ガス注入方法の後の合わせられた究極の反響性及び安定性の理由のために最も好 ましいのは、ジパルミトイルホスファチジルコリンから製造されたリポソームで ある。
一般的なガイダンスのために、ジパルミトイルホスファチジルコリンリポソーム は、ジパルミトイルホスファチジルコリン脂質をリン酸塩で緩衝された食塩水ま たは水の中に懸濁させること、及びジパルミトイルホスファチジルコリン脂質が ゲル状態から液状結晶性状態へ転移してリポソームを形成するために必要とされ る４５℃の温度より少し高い温度である約５０℃に脂質を加熱することによって 製造することができる。
約２ミクロンのむしろ不均一なサイズ分布の多重層小胞を製造するためには、リ ポソームを、次に、リポソーム溶液を約５０℃の温度で保持しながら手によって ゆっくりと混合して良い。次に、温度を室温に下げ、そしてリポソームをそのま まに留める。規定されたサイズのポリカーボネートフィルターを通してのジパル ミトイルホスファチジルコリンリポソームの押出は、所望の場合には、さらに均 一なサイズ分布のリポソームを作るために用いることができる。この技術のため の有用な装置は、押出が脂質に関するゲル状態−液状結晶性転移温度より上で好 都合に達成できるように熱バレルを備えた押出装置（Ｅｘｔｒｕｄｅｒ　Ｄｅｖ ｉｃｅ（商標）、Ｌｉｐｅｘ　Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ、バンク−バー、カナ ダ）である。
また、そして再び一般的なガイダンスのために、慣用の凍結融解手順を、オリゴ 層（ｏｌｉｇｏｌａｍｅｌｌａｒ）または単層のどちらかのジパルミトイルホス ファチジルコリンリポソームを製造するために使用して良い。凍結融解手順の後 で、次に、上で述べたような押出手順をリポソームに関して実施して良い。
このようにして製造されたリポソームは、次に、本発明の真空乾燥されたガス注 入リポソーム、及びその内部に液体が実質的にないガス充填リポソームを製造す るために、本発明の真空乾燥ガス注入方法にかけることができる。本発明の方法 に従って、リポソームを、リポソームに除圧（即ち、減圧または真空条件）をか けるために適切な容器中に入れる。
次に、リポソームから実質的にすべての液体を除去し、それによって実質的に乾 燥されたリポソームを生成させるのに十分な時間除圧をかける。
当業者が、一度本発明の開示を与えられると、認識するであろうように、種々の 除圧を用いることができ、そして重要なパラメーターは実質的にすべての液体が リポソームから除去されてしまったことである。一般的に、約２４〜約７２時間 かけられる、少なくとも約７００ｍｍＨｇそして好ましくは約７００ｍｍＨｇ〜 約７６０ｍｍＨｇ　（ゲージ圧力）の範囲の除圧が、リポソームから実質的にす べての液体を除去するのに十分である。その他の適切な圧力及び時間の期間は、 本明細書中の開示に鑑みて、当業者には明らかであろう。
最後に、周囲圧力に到達するまで選ばれたガスをリポソームにかけてリポソーム にガスを注入し、それによって本発明の真空乾燥されたガス注入リポソームを、 そしてその内部に液体が実質的にない、ガス充填リポソームを生成させる。好ま しくは、ガス注入は、ゆっくりと、即ち、少なくとも約４時間の時間の期間にわ たって、最も好ましくは約４〜約８時間の時間の期間にわたって行われる。種々 の生物適合性ガスを用いることができる。このようなガスは、空気、窒素、二酸 化炭素、酸素、アルゴン、キセノン、ネオン、ヘリウム、またはこれらの任意の そしてすべての組み合わせを含む。その池の適切なガスは当業者には明らかであ ろう。選ばれるガスはリポソームの提案された用途によってのみ限定される。
リポソームの製造のための上で述べた方法は、本明細書中で以後真空乾燥ガス注 入方法と称される。
所望の場合には、リポソームに除圧をかけるのに先立ってリポソームを冷却する が、このような冷却が好ましい。好ましくは、リポソームに除圧をかけるのに先 立って、リポソームを、０℃未満に、更に好ましくは約−１０℃〜約−２０℃に 、そして最も好ましくは一１０℃に冷却する。所望の除圧に達すると、次にリポ ソーム温度を、実質的にすべての液体がリポソームから除去されてしまうまで、 好ましくは０℃より高く、更に好ましくは約り０℃〜約２０℃に、そして最も好 ましくは１０℃に上げ、モして除圧を打ち切り、その時点で次に温度を室温に復 帰せしめる。
リポソームを０℃未満の温度に冷却する場合には、真空乾燥ガス注入方法を、凍 結保護剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔｓ）の存在下で初めから製造されたリ ポソームが、または本発明の真空乾燥ガス注入方法を実施するのに先立って凍結 保護剤を添加されたリポソームのどちらかに関して実施することが好ましい。こ のような凍結保護剤は、必ずしも添加されはしないが、低温でリポソーム膜の実 体を維持するのを助け、そしてまた膜の究極の安定性を加える。好ましい凍結保 護剤は、トレハロース、グリセロール、ポリエチレングリコール（殊に分子量４ ００のポリエチレングリコール）、ラフィノース、スクロース及びソルビトール であり、そしてトレハロースが特に好ましい。
本発明のリポソームは圧力の変化に対して高度に安定であることもまた驚くべき ことに発見された。この特徴のために、真空乾燥及びガス注入の後の規定された 細孔サイズのフィルターを通してのリポソームの押出を、比較的均一なそして規 定された細孔サイズのリポソームを作り出すために、所望の場合には、実施する ことができる。
使用に先立つ貯蔵のために、本発明のリポソームを、水性溶液例えば食塩水溶液 （例えば、リン酸塩で緩衝された食塩水溶液）、または単に水の中に懸濁させ、 そして好ましくは約り℃〜約１０’Ｃの温度で、好ましくは約４℃で貯蔵して良 い。好ましくは、水は無菌である。最も好ましくは、リポソームを高張食塩水溶 液（例えば、約０．　３〜約０．５％のＮａＣＩ）中に貯蔵するが、所望の場合 には、食塩水溶液は等強性で良い。水溶液はまた、所望の場合には、ｐＨ６，８ 〜ｐＨ７，４のｐＨ範囲を与えるように緩衝されていて良い。適切な緩衝剤は、 酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩及び重炭酸塩を含むが、これらに限定されない。
デキストロースもまた懸濁媒体中に含めて良い。好ましくは、水性溶液は、その 中にリポソームを懸濁させるのに先立って脱ガス（即ち、真空圧力下で脱ガス） される。細菌発育阻止剤もまた、貯蔵に際しての細菌による劣化を防止するため にリポソームと共に含まれて良い。適切な細菌発育阻止剤は、ベンザルコニウム クロリド、ベンゼトニウムクロリド、安息香酸、ベンジルアルコール、ブチルパ ラベン、セチルピリジニウムクロリド、クロロブタノール、クロロクレゾール、 メチルパラベン、フェノール、安息香酸カリウム、カリウムツルベート（ｓｏｒ ｂａｔｅ）、安息香酸ナトリウム及びソルビン酸を含むがこれらに限定されない 。更に、１以上の酸化防止剤も、脂質の酸化を防止するためにガス充填リポソー ムと共に含まれて良い。適切な酸化防止剤は、トコフェロール、アスコルビン酸 及びバルミチン酸アスコルビルを含む。種々の上述のやり方で製造されたリポソ ームは、少なくとも数週または数カ月の間貯蔵することができる。その代わりに 、本発明のリポソームは、所望の場合には、それらの乾燥された、懸濁されない 形で貯蔵しても良く、そしてこのようなリポソームもまた数週または数カ月より 長い貯蔵寿命を有する。
詳細には、いずれのやり方で貯蔵されても、本発明のリポソームは、一般的に約 ３週間より長い貯蔵寿命安定性、好ましくは約４週間より長い貯蔵寿命安定性、 更に好ましくは約５週間より長い貯蔵寿命安定性、なお更に好ましくは約３カ月 より長い貯蔵寿命安定性、そしてしばしばもっとずっと長い、例えば６力月、１ ２力月または２年をさえ越える貯蔵寿命安定性を有する。
本発明のもう一つの面として、本発明の真空乾燥されたガス注入リポソーム、及 びその内部に液体が実質的にない、ガス充填リポソームを製造するために有用な 装置もまた提供される。詳細には、リポソームを真空乾燥しそして乾燥されたリ ポソーム中にガスを注入するための好ましい装置を図１中に示す。この装置はリ ポソーム１９を入れるための容器８を含む。所望の場合には、装置は容器８を取 り巻くドライアイス１７を含む水浴５を含んで良い。氷浴５及びドライアイス１ ７はリポソームを０℃未満に冷却せしめる。真空ポンプ１が、容器に維持された （ＳＵｓｔａｉｎｅｄ）！圧をかけるために導管１５を経由して容器８に接続さ れている。好ましい態様においては、ポンプ１は、少なくとも約７゜ＱｍｍＨｇ の除圧、そして好ましくは約７００ｍｍＨｇ〜約７６０ｍｍＨｇ（ゲージ圧力） の範囲の除圧をかけることができる。マノメーター６が、容器８にかけられた除 圧の監視を可能にするために導管１５に接続されている。
リポソームから除去された液体がポンプ１に入るのを防止するために、一連のト ラップを導管１５に接続してリポソームから引き出された液体（及び液体蒸気、 本明細書中ではすべてを集合的に液体と呼ぶ）を収集するのを助ける。好ましい 態様においては、２つのトラップを利用する。
第一のトラップは、好ましくは、ドライアイス１７を含む氷浴４中に配置された フラスコから成る。第二のトラップは、好ましくは、その回りにチューブ１６が 螺旋状に配置されているカラム３から成る。カラム３は、そのトップ端で導管１ ５にそしてその底端でチューブ１６の一端に接続されている。チューブ１６の他 端は導管１５に接続されている。図１中に示すように、ドライアイス１７を含む 氷浴２がカラム３及びチューブ１６を取り囲む。所望の場合には、ドライアイス １７を、液体窒素、液体空気またはその他の低温貯蔵用の物質で置き換えること ができる。
氷浴２及び４は、トラップ中への収集のために、リポソームから引き出された液 体を収集しそして液体蒸気を凝縮するのを助ける。本発明の好ましい実施態様に おいては、アイストラップ２及び４は、各々少なくとも約−７０℃の温度で維持 される。
ストップコック１４が、選ばれたガスがガスボトル１８から容器８中にそしてリ ポソーム１９中に導入せしめられるように容器８の上流で導管１５中に配置され ている。
本発明の装置はリポソーム１９を容器８中に入れることによって利用される。好 ましい実施態様においては、ドライアイス１７を含む氷浴５が、リポソームの温 度を０℃未満に、更に好ましくは約−１０℃〜約−２ロー２０そして最も好まし くは一１０℃に低下させるために使用される。ストップコック１４及び９を閉じ ておいて、真空ポンプ１を機動する。次に、ストップコック１０．１１．１２及 び１３を注意深く開いて、真空ポンプ１によって容器８中に真空を作り出す。少 なくとも約７００ｍｍＨｇのそして好ましくは約７００ｍｍＨｇ〜約７６０ｍｍ Ｈｇ　（ゲージ圧力）の負圧が達成されるまでマノメーター６によって圧力を測 定する。本発明の好ましい実施態様においては、ドライアイス１７を含む水浴４ によって冷却された容器７、並びにドライアイス１７を含む氷浴２によって冷却 されたカラム３及びコイル１６が、−緒にまたは別々にリポソームから引き出さ れた液体蒸気を凝縮しそして液体をトラップして、その結果このような液体及び 液体蒸気が真空ポンプ１に入るのを防止する。本発明の好ましい態様においては 、アイストラップ２及び４の温度は、各々、少なくとも約−７０℃の温度で維持 される。所望の除圧は一般的に少なくとも２４時間維持され、その結果液体及び 液体蒸気は容器８中のリポソーム１９がら除去されそして容器３及び７中で凍結 される。システム内の圧力を、マノメーター６を使用して監視しそして一般的に 約２４〜約７２時間維持するが、この時間には実質的にすべての脂質がリポソー ムから除去されてしまっている。この時点で、ストップコック１０をゆっ（りと 閉じそして真空ポンプ１を停止する。次に、ストップコック１４を徐々に開き、 そしてガスをガスボトル１８からストップコック１４を通して導管１５を経由し てゆっくりとシステム中に導入し、容器８中のリポソーム１９中にガスを注入す る。好ましくは、このガス注入は、システムが周囲圧力に到達するまで、少なく とも約４時間の時間の期間にわたって、最も好ましくは約４〜約８時間の時間の 期間にわたってゆっくりと行われる。
本発明の真空乾燥されたガス注入されたリポソーム、及びその内部に液体が実質 的にない、ガス充填リポソームは、超音波コントラストイメージングのための優 れた特徴を有する。詳細には、本発明は、一般的に患者の像を作る際に、モして ／または患者の中の病気の組織の存在を診断する際に有用である。患者はいずれ のタイプの哺乳類でも良いが、最も好ましくはヒトである。かくして、本発明の 更なる態様においては、患者の内部の体の部位の画像を与える方法が提供される 。この方法は、患者に本発明のリポソームを投与すること及び超音波イメージン グを使用して患者を走査して部位の可視画像を得ることを有して成る。患者の中 の疾患組織の存在を診断するための方法であって、患者に本発明のリポソームを 投与するこ払及び次に超音波イメージングを使用して患者を走査して患者の中の 存在しつる疾患の組織の可視画像を得ることを含んで成る方法もまた提供される 。患者の部位とは、患者全体、または患者の特別な領域若しくは部分を意味する 。例えば、本発明の方法を使用することによって、患者の心臓、及び患者の脈管 構造（即ち、静脈または動脈系）を可視化することができ、及び／または病気の 組織を診断することができる。患者の脈管構造を可視化する際には、本発明の開 示に鑑みて当業者によって十分に理解されるであろうように、血液の流れを測定 することができる。本発明はまた、患者の右心、即ち超音波によってはこれまで 容易には画像を形成できなかった部位の中の疾患を可視化及び／または診断する 際に特に有用である。患者の肝臓、牌臓及び腎臓の部位もまた、本発明の方法を 使用して容易に可視化し及び／またはそれらの中の病気検出をすることができる 。
本発明のリポソームは種々のサイズのもので良いが、好ましくは、それらが約３ ０ナノメートル〜約１０ミクロンの平均外径を有するサイズ範囲のものであり、 そして好ましい平均外径は約２ミクロンである。当業者には知られているように 、リポソームのサイズは生物分布に影響を与え、そしてそれ数種々の目的のため に異なるサイズのリポソームを選んで良い。例えば、脈管内の使用のためには、 リポソームのサイズは、平均外径で、一般的に約５ミクロンより大きくはなく、 そして約３０ナノメートルより小さくはない。器官例えば肝臓の超音波増進（ｅ ｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）を供給しそして通常の組織からの腫瘍の弁別を可能にす るためには、平均外径が約３０ナノメートル〜約１００ナノメートルのもっと小 さなリポソームが有用である。
超音波イメージング装置の種々のタイプの任意のものを本発明の実施の際に用い ることができ、そして装置の特定タイプまたはモデルは本発明の方法にとって限 定的ではない。一般的には、本発明の診断用途用のためには、約３．０〜約７． ５メガヘルツの超音波周波数が用いられる。
当業者が認めるであろうように、本発明の造影イメージング剤の投与は、種々の やり方で、例えば脈管内に、リンパ管内に、非経口的に、皮下に、筋肉内に、腹 膜内に、間質的に、高圧的に（ｈｙｐｅｒｂａｒｉｃａｌｌｙ）、経口的にまた は腫瘍内に種々の投薬形を使用して実施して良い。１つの好ましい投与のルート は脈管内へである。脈管内の使用のためには、本発明の造影剤は、一般的に静脈 内に注射されるが、同様に動脈内に注射しても良い。投与される有用な投薬量及 び投与の方式は、年齢、体重、及び診断される哺乳動物、及び意図された特別な 診断の応用に依存して変わるであろう。典型的には、投薬量を比較的低いレベル で始めそして所望のコントラスト増進が達成されるまで増す。一般的には、本発 明の造影剤は、水または食塩水溶液（例えば、リン酸塩で緩衝された食塩水）中 のような水性懸濁液の形で投与される。好ましくは、水は無菌である。また好ま しくは食塩水溶液は高張性食塩水溶液（例えば、約０，３〜約０，５％のＮａＣ １）であるが、所望の場合には、食塩水溶液は等強性で良い。また所望の場合に は、溶液を緩衝してｐＨ６゜８〜ｐＨ７，４の範囲のｐＨを与えても良い。加え て、デキストロースを好ましくは媒体中に含めて良い。好ましくは、水性溶液を 、その中にリポソームを懸濁させるのに先立って脱ガス（即ち、真空圧力下で脱 ガス）する。
本発明による超音波イメージングのための有用なキットは、慣用の超音波イメー ジングキット構成要素に加えて、真空乾燥ガス注入方法によって製造された、ガ ス充填リポソーム、及びその内部中に液体が実質的にない、ガス充填リポソーム を含有して成る。このような慣用の超音波イメージングキット構成要素は良く知 られていて、そして、例えば投与に先立って細菌のコンタミを除去するまたはリ ポソームの集塊を破壊するためのフィルターを含む。
本発明のリポソームは、物理的及び機能的特徴の両方における多数の態様におい て先行技術のリポソームとは異なると信じられる。例えば、本発明のリポソーム は、その内部中に液体が実質的にない。定義によって、先行技術におけるリポソ ームは、水性媒体の存在によって特徴付けられてきた。例えば、Ｄｏｒｌａｎｄ ’ｓ　ｌ１ｌｕｓｔｒａｔｅｄ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ、　９ ４６頁、第２７版（Ｗ、Ｂ、５ａｕｎｄｅｒｓ社、フィラデルフィア１９８８） を参照されたし。更にまた、本発明のリポソームは、驚くべきことに、超音波造 影剤としてのリポソームの使用にとって大きな利益のある特徴である、超音波に 対する強い反響性を示し、そして長い貯蔵寿命を有する。
本明細書中で詳細に述べられた用途を越える、本発明のリポソームのための種々 のその池の用途が存在する。このような付加的な用途は、例えば、超音波のため の高体温相乗剤のようなそして薬配達ビヒクルのような応用を含む。このような 付加的な用途及びその他の関連する主題は、“新規なリポソームドラッグデリバ リ−システム”及び“ガス充填リポソームを使用して生物の組織及び体液に局在 化された治療の熱を供給するための方法”という標題の本発明と同時に出願され た出願人の特許出願中に述べられそして特許請求されている。なおこれらの特許 出願の各々の開示事項は、その全体が引用によって本明細書中に組み込まれる。
本発明を以下の実施例において更に具体的に説明する。実施例１〜８は、真空乾 燥されたガス注入リポソームの製造及びテストを述べている事実上の実施例であ り、ガス充填リポソームはその内部に液体が実質的にない。実施例９〜１１は、 本発明のリポソームの使用を述べている予言的な実施例である。以下の実施例は 、添付された請求の範囲の範囲を限定すると考えられてはならない。
ジパルミトイルホスファチジルコリン（１グラム）を１０ｍ１のリン酸塩で緩衝 された食塩水中に懸濁させ、この懸濁液を約５０℃に加熱し、そして次に約３０ 分問丸底フラスコ中で手によって渦を巻かせた。熱源を除去し、そして懸濁液を 室温に冷却せしめながら更に２時間渦を巻かせて、リポソームを生成させた。
このようにして製造されたリポソームを、図１中に示したものと類似の装置中の 容器に入れ、約−１０℃に冷却し、そして次に高い負の真空圧力をかけた。次に 、リポソームの温度を約１０℃に上げた。高い負の真空圧力を約４８時間維持し た。約４８時間後に、約４時間の期間にわたって室の中に窒素を徐々に注入し、 この時間の後で圧力を周囲圧力に戻した。生成した真空乾燥されたガス注入され たリポソーム（ガス充填リポソームはその内部中に何ら液体が実質的にない）を 、次に、１０ｃｃのリン酸塩で緩衝された食塩水中に懸濁させ、そして約４℃で 約３カ月貯蔵した。
実施例２ 実施例１のリポソームを超音波検査的にテストするために、これらのリポソーム の２５０ｍｇのサンプルを、３００ｃｃの脱ガスされた（即ち、真空圧力下で脱 ガスされた）リン酸塩で緩衝された食塩水中に懸濁させた。次に、これらのリポ ソームを、Ａｃｏｕｓｔｉｃ　Ｉｍａｇｉｎｇ　モデル　５２００　走査機（Ａ ｃｏｕｓｔｉｃ　Ｉｍａｇｉｎｇ。
フェニックス、ＡＺ）を使用しモしてｄＢ反射率を測定するためのシステムソフ トウェアを用いる７、５ｍＨｚの変換器によって種々の時間間隔で走査した。こ のシステムはリポソームをテストするのに先立って既知の音響インピーダンスの 陰影によって標準化した。ｄＢ反射率を示すグラフを図２中に与える。
実施例３ ジパルミトイルホスファチジルコリン（１グラム）及び凍結予防保護剤トレハロ ース（１グラム）を１０ｍ１のリン酸塩で緩衝された食塩水中に懸濁させ、この 懸濁液を約５０℃に加熱し、そして次に約３０分問丸底フラスコ中で手によって 渦を巻かせた。熱源を除去し、そして懸濁液を室温に冷却せしめながら更に約２ 時開局を巻かせて、リポソームを生成させた。
次に、このようにして製造されたリポソームを、実施例１中で示した手順に実質 的に従って真空乾燥しそしてガスを注入して、真空乾燥されたガス注入リポソー ムを生成させたが、ガス充填リポソームはその内部に何らの液体も実質的に存在 しなかった。次にこれらのリポソームを１０ｃｃのリン酸塩で緩衝された食塩水 中に懸濁させ、そして次に約４℃ゝ　で数週間貯蔵した。
実施例４ 実施例３のリポソームを超音波検査的にテストするために、実施例２の手順に実 質的に従った。これらのリポソームのｄＢ反射率は、実施例２中で報告したｄＢ 反射率と類似であった。
実施例５ ジパルミトイルホスファチジルコリン（１グラム）を１０ｍ１のリン酸塩で緩衝 された食塩水中に懸濁させ、この懸濁液を約５０℃に加熱し、そして次に約３０ 分問丸底フラスコ中で手によって渦を巻かせた。次に、この懸濁液を、約５０℃ で温度を維持しながら、押出に先立って慣用のの凍結融解処理をしてモしてしな いでの両方で、熱バレルによって覆ゎＢｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ、バンク−バー 、カナダ）にょる５サイクルの押出を施した。熱源を除去し、そして懸濁液を室 温に冷却せしめながら更に約２時開局を巻かせて、リポソームを生成させた。
次に、このようにして製造されたリポソームを、実施例１中で示した手順に実質 的に従って真空乾燥しそしてガス注入して、真空乾燥されたガス注入されたリポ ソームを生成させたが、ガス充填リポソームはその内部中に何ら液体が実質的に なかった。次にこれらのリポソームを１０ＣＣのリン酸塩で緩衝された食塩水中 に懸濁させ、そして次に約４℃で数週間貯蔵した。
実施例６ 実施例５のリポソームを超音波検査的にテストするために、実施例２の手順に実 質的に従った。これらのリポソームのｄＢ反射率は、実施例２中で報告したｄＢ 反射率と類似であった。
実施例７ 本発明のリポソームの安定性をテストするために、実施例１のリポソーム懸濁液 を、約６００ｐｓｉの圧力で５回、押出装置（Ｅｘｔｒｕｄｅｒ　Ｄｅｖｉｃｅ （商標）、Ｌｉｐｅｘ　Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ。
バンク−バー、カナダ）中の２ミクロンのポリカーボネートフィルターを通過さ せた。押出処理の後で、実施例２中で述べたようにして、リポソームを超音波検 査的に検討した。驚くべきことに、高い圧力下での押出の後でさえ、本発明のリ ポソームはそれらの反響性を実質的に保留しｔこ。
実施例８ 実施例１のリポソームを、３〜７．５ｍＨｚで変わる変換器周波数を使用する超 音波によって走査した。結果は、超音波の周波数が高ければ高いほど、反響性は それだけ急速に衰え、これは比較的高い共鳴周波数及びより高い周波数に伴うよ り高いエネルギーを反映することを示した。
以下の実施例、実施例９．１０及び１１は、予言的実施例である。
実施例９ 心筋虚血の疑いのある患者に、２ミクロンの平均径を有する、窒素ガスを内部に 閉じ込めている５００ｍｇの真空乾燥されたガス注入されたリポソーム（ガス充 填リポソームはその内部中に液体が実質的にない）の静脈内投与量を投与し、そ して左心室心筋を超音波検査的に検討する。
実施例１０ 心筋虚血の疑いのある小者に、２ミクロンの平均径を有する、窒素ガスを内部に 閉じ込めている５００ｍｇの真空乾燥されたガス注入されたリポソーム（カス充 填リポソームはその内部中に液体が実質的にない）の静脈内投与量を投与し、そ して左心室心筋を超音波検査的に検討する。
実施例１１ 肝転移の疑いのある１者に、２ミクロンの平均径を有する、窒素ガスを内部に閉 じ込めている５００ｍｇの真空乾燥されたガス注入されたリポソーム（ガス充填 リポソームはその内部中に液体が実質的にない）の静脈内投与量を投与し、そし て肝臓を超音波検査的に検査する。
本明細書中で示されそして説明されたものに加えて、本発明の種々の改変が、上 述の説明から当業者には明らかであろう。このような改変もまた、添付された請 求の範囲の範囲内に入ると意図される。
特表十６−５０８３６４　（１１） ロ

Claims (61)

    【特許請求の範囲】
  1. １．真空乾燥ガス注入方法によって製造された、ガス充填リポソームを含んで成 る、超音波イメージングのための造影剤。
  2. ２．該リポソームが、脂肪酸、リソ脂質、ジパルミトイルホスファチジルコリン 、ホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン、コレステロ ール、コレステロールヘミスクシネート、トコフェロールヘミスクシネート、ホ スファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、リソ脂質、スフ ィンゴミエリン、グリコスフィンゴ脂質、グルコ脂質、グリコ脂質、スルファチ ド、エーテル及びエステル結合された脂肪酸を有する脂質、並びに重合された脂 質から成る群から選ばれた脂質材料を含んで成る、請求の範囲１記載の造影剤。
  3. ３．該リポソームがジパルミトイルホスファチジルコリンを含んで成る、請求の 範囲２記載の造影剤。
  4. ４．該リポソームが、空気、窒素、二酸化炭素、酸素、アルゴン、キセノン、へ リウム及びネオンから成る群から選ばれたガスによって満たされている、請求の 範囲１記載の造影剤。
  5. ５．該リポソームが窒素ガスによって満たされている、請求の範囲４記載の造影 剤。
  6. ６．該リポソームが水性媒体中に懸濁されて貯蔵される、請求の範囲１記載の造 影剤。
  7. ７．該リポソームが乾燥して貯蔵される、請求の範囲１記載の造影剤。
  8. ８．該リポソームが約３週間より長い安定性を有する、請求の範囲１記載の造影 剤。
  9. ９．該リポソームが約２ｄＢより大きい反射率を有する、請求の範囲１記載の造 影剤。
  10. １０．該リポソームが約２ｄＢ〜約２０ｄＢの反射率を有する、請求の範囲９記 載の造影剤。
  11. １１．その内部に液体が実質的にない、ガス充填リポソームを含んで成る、超音 波イメージングのための造影剤。
  12. １２．該リポソームが、脂肪酸、リソ脂質、ジパルミトイルホスファチジルコリ ン、ホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン、コレステ ロール、コレステロールヘミスクシネート、トコフェロールヘミスクシネート、 ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、リソ脂質、ス フィンゴミエリン、グリコスフィンゴ脂質、グルコ脂質、グリコ脂質、スルファ チド、エーテル及びエステル結合された脂肪酸を有する脂質、並びに重合された 脂質から成る群から選ばれた脂質材料を含んで成る、請求の範囲１１記載の造影 剤。
  13. １３．該リポソームがジパルミトイルホスファチジルコリンを含んで成る、請求 の範囲１２記載の造影剤。
  14. １４．該リポソームが、空気、窒素、二酸化炭素、酸素、アルゴン、キセノン、 へリウム及びネオンから成る群から選ばれたガスによって満たされている、請求 の範囲１１記載の造影剤。
  15. １５．該リポソームが窒素ガスによって満たされている、請求の範囲１４記載の 造影剤。
  16. １６．該リポソームが水性媒体中に懸濁されて貯蔵される、請求の範囲１１記載 の造影剤。
  17. １７．該リポソームが乾燥して貯蔵される、請求の範囲１１記載の造影剤。
  18. １８．該リポソームが約３週間より長い貯蔵寿命安定性を有する、請求の範囲１ １記載の造影剤。
  19. １９．該リポソームが約２ｄＢより大きい反射率を有する、請求の範囲１１記載 の造影剤。
  20. ２０．該リポソームが約２ｄＢ〜約２０ｄＢの反射率を有する、請求の範囲１９ 記載の造影剤。
  21. ２１．（ｉ）リポソームを陰圧下に置く工程、（ｉｉ）該リポソームから実質的 にすべての液体を除去するのに十分な時間の間、該リポソームを該陰圧下でイン キユベートする工程、及び（ｉｉｉ）周囲圧力に到達するまで該リポソーム中に ガスを注入する工程を含んで成る、超音波イメージング用造影剤の製造方法。
  22. ２２．工程（ｉ）に先立ってそしてその間、該リポソームを約−１０℃〜約−２ ０℃の温度に冷却せしめること、工程（ｉｉ）の間、該リポソームを約１０℃〜 約２０℃の温度に加温せしめること、及び工程（出）の間、該リポソームを周囲 温度に加温せしめることを更に含んで成る、請求の範囲２１記載の方法。
  23. ２３．該陰圧が約７００ｍｍＨｇ〜約７６０ｍｍＨｇでありそして約２４〜約７ ２時間かけられる、請求の範囲２１記載の方法。
  24. ２４．該ガスを約４〜約８時間の期間にわたって該リポソーム中に注入する、請 求の範囲２１記載の方法。
  25. ２５．該ガスが、空気、窒素、二酸化炭素、酸素、アルゴン、キセノン、ネオン 及びへリウムから成る群から選ばれる、請求の範囲２１記載の方法。
  26. ２６．該ガスが窒素である、請求の範囲２５記載の方法。
  27. ２７．工程（ｉｉｉ）の後で、該リポソームを選ばれた細孔サイズの少なくとも 一種のフィルターを通して押出すことを更に含んで成る、請求の範囲２１記載の 方法。
  28. ２８．（ｉ）リポソームを約−１０℃〜約−２０℃の温度に冷却せしめる工程、 （ｉｉ）該リポソームを約７００ｍｍＨｇ〜約７６０ｍｍＨｇの陰圧下に置く工 程、 （ｉｉｉ）該リポソームを約１０℃〜約２０℃の温度に加温せしめながら、該リ ポソームを該陰圧下で約２４〜約７２時間インキュベートして該リポソームから 実質的にすべての液体を除去する工程、及び（ｉｖ）該リポソームを周囲温度に 加温せしめながら、周囲圧力に到達するまで約４〜約８時間の期間にわたって該 リポソーム中にガスを注入する工程、 を含んで成る、超音波イメージング用造影剤の製造方法。
  29. ２９．該ガスが、空気、窒素、二酸化炭素、酸素、アルゴン、キセノン、ネオン 及びへリウムから成る群から選ばれる、請求の範囲２８記載の方法。
  30. ３０．該ガスが窒素である、請求の範囲２９記載の方法。
  31. ３１．工程（ｉｖ）の後で、該リポソームを選ばれた細孔サイズの少なくとも一 種のフィルターを通して押出すことを更に含有して成る、請求の範囲２８記載の 方法。
  32. ３２．（ｉ）リポソームを入れるための容器、（ｉｉ）この容器中に入れられた リポソームから液体を引き出すために容器に陰圧をかけるための手段、 （ｉｉｉ）陰圧をかける手段を容器に接続する導管（この導管は液体の流れを方 向付ける）、及び （ｉｖ）容器中に入れられたリポソーム中にガスを導入するための手段を含んで 成る、超音波イメージング用造影剤の製造装置。
  33. ３３．陰圧をかける手段が真空ポンプである、請求の範囲３２記載の装置。
  34. ３４．容器中に入れられたリポソームを冷却するための手段を更に含んで成る、 請求の範囲３２記載の装置。
  35. ３５．前記冷却手段が容器中に入れられたリポソームを約−１０℃〜約−２０℃ に冷却するための手段を有する、請求の範囲３４記載の装置。
  36. ３６．前記冷却手段がアイスバスを含有して成る、請求の範囲３５記載の装置。
  37. ３７．前記導管中を流れる液体を収集するための手段を更に含んで成る、請求の 範囲３２記載の装置。
  38. ３８．前記収集手段がトラップである、請求の範囲３７記載の装置。
  39. ３９．トラップを冷却するための手段を更に含んで成る、請求の範囲３８記載の 装置。
  40. ４０．トラップがそれを通して流れる流体を方向付けるのに適した第一及び第二 部材を含んで成り、これらの部材が相互に、そして導管と流れを連絡していて、 第二部材が第一部材の回りに螺旋状に配置されていて、そしてトラップが、第一 及び第二部材の少なくとも一部を取り囲む氷浴を含んで成る冷却手段を含んで成 る、請求の範囲３８記載の装置。
  41. ４１．（ｉ）リポソームを入れるための容器、（ｉｉ）この容器中に入れられた リポソームを冷却するための手段、（ｉｉｉ）この容器中に入れられたリポソー ムから液体を引き出すために容器に陰圧をかけるための手段、 （ｉｖ）陰圧をかける手段を容器に接続する導管（この導管は液体の流れを方向 付ける）、 （ｖ）導管中を流れる液体を収集するための手段、及び（ｖｉ）容器中に入れら れたリポソーム中にガスを導入するための手段を含んで成る、超音波イメージン グのための造影剤を製造するための装置。
  42. ４２．患者の内部の身体の部位の画像を提供する方法であって、（ａ）真空乾燥 ガス注入方法によって製造された、ガス充填リポソームを含有して成る造影剤を 患者に投与すること、及び（ｂ）超音波イメージングを使用して患者を走査して 前記部位の可視画像を得ること を含んで成る方法。
  43. ４３．患者を、患者の左心の領域で走査する、請求の範囲４２記載の方法。
  44. ４４．患者の内部の身体の部位の画像を提供する方法であって、（ａ）その内部 に液体が実質的にない、ガス充填リポソームを含んで成る造影剤を患者に投与す ること、及び（ｂ）超音波イメージングを使用して患者を走査して前記部位の可 視画像を得ること を含んで成る方法。
  45. ４５．患者を、患者の左心の領域で走査する、請求の範囲４４記載の方法。
  46. ４６．患者の中の疾患組織の存在を診断するための方法であって、（ｉ）真空乾 燥ガス注入方法によって製造された、ガス充填リポソームを含んで成る造影剤を 患者に投与すること、及び（ｉｉ）超音波イメージングを使用して患者を走査し て患者の中に存在しうる疾患組織の可視画像を得ること を含んで成る方法。
  47. ４７．患者を、患者の左心の領域で走査する、請求の範囲４６記載の方法。
  48. ４８．患者の中の疾患組織の存在を診断するための方法であって、（ｉ）その内 部中に液体が実質的にない、ガス充填リポソームを含んで成る造影剤を患者に投 与すること、及び（ｉｉ）超音波イメージングを使用して患者を走査して患者の 中に存在しうる疾患組織の可視画像を得ること を含んで成る方法。
  49. ４９．患者を、患者の左心の領域で走査する、請求の範囲４８記載の方法。
  50. ５０．真空乾燥ガス注入方法によって製造された、ガス充填リポソームを含んで 成る超音波イメージングのためのキット。
  51. ５１．慣用の超音波イメージング構成要素を更に含んで成る、請求の範囲５０記 載のキット。
  52. ５２．その内部に液体が実質的にない、ガス充填リポソームを含んで成る超音波 イメージングのためのキット。
  53. ５３．慣用の超音波イメージング構成要素を更に含んで成る、請求の範囲５２記 載のキット。
  54. ５４．請求の範囲２１記載の方法によって製造された生成物。
  55. ５５．請求の範囲２８記載の方法によって製造された生成物。
  56. ５６．（ｉ）リポソームを陰圧下に置く工程、（ｉｉ）該リポソームから実質的 にすべての液体を除去するのに十分な時間の間、該リポソームを該陰圧下でイン キユベートする工程、及び（ｉｉｉ）周囲圧力に到達するまで該リポソーム中に ガスを注入する工程、を含んで成る、ガス充填リポソームの製造方法。
  57. ５７．（ｉ）リポソームを約−１０℃〜約−２０℃の温度に冷却せしめる工程、 （ｉｉ）該リポソームを約７００ｍｍＨｇ〜約７６０ｍｍＨｇの陰圧下に置く工 程、 （ｉｉｉ）該リポソームを約１０℃〜約２０℃の温度に加温せしめながら、該リ ポソームを該陰圧下でインキユベートして該リポソームから実質的にすべての液 体を除去する工程、及び （ｉｖ）該リポソームを周囲温度に加温せしめながら、周囲圧力に到達するまで 約４〜約８時間の期間にわたって該リポソーム中にガスを注入する工程、 を含んで成る、ガス充填リポソームの製造方法。
  58. ５８．（ｉ）リポソームを入れるための容器、（ｉｉ）この容器中に入れられた リポソームから液体を引き出すために容器に陰圧をかけるための手段、 （ｉｉｉ）陰圧をかける手段を容器に接続する導管（この導管は該液体の流れを 方向付ける）、及び （ｉｖ）容器中に入れられたリポソーム中にガスを導入するための手段を含んで 成る、ガス充填リポソームの製造装置。
  59. ５９．（ｉ）リポソームを入れるための容器、（ｉｉ）この容器中に入れられた リポソームを冷却するための手段、（ｉｉｉ）この容器中に入れられたリポソー ムから液体を引き出すために容器に陰圧をかけるための手段、 （ｉｖ）陰圧をかける手段を容器に接続する導管（この導管は液体の流れを方向 付ける）、 （ｖ）導管中を流れる液体を収集するための手段、及び（ｖｉ）容器中に入れら れたリポソーム中にガスを導入するための手段を含んで成る、ガス充填リポソー ムの製造装置。
  60. ６０．請求の範囲５６記載の方法によって製造された生成物。
  61. ６１．請求の範囲５７記載の方法によって製造された生成物。
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