JPH06508512A - Ａ型肝炎ウイルス生産 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ａ型肝炎ウィルス生産 本発明は、培地内で増殖するＡ型肝炎ウィルスの収量を増加する改良された方法 に関するものである。

Ａ型肝炎ウィルス（ＨＡＶ）は、ピコルナウィルスの一種である（Ｍｅｌｎｉｃ ｋ、　Ｊ、　Ｌ、（１９８２）、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、１８．１０５− １０６）。それは世界中にみられる風土病で、疾病の大発生を引き起こす（Ｗ、 Ｈ，０，１９８８、Ｗｅｅｋｌｙ　Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｃｏ ｒｄ、６５．　９１−９２）。利用できるワクチンのない現在では予防は免疫性 ヒト免疫グロブリンＧの投与によって与えられる。殺したウィルスワクチンは、 現在臨床試験中であるか、組織培養系から得られるウィルスの低収量のために費 用効率のよいワクチンの生産が妨げられている。ウィルスの収量を改良する試み か行われ、細胞ＲＮＡポリメラーゼ−２阻害剤５，６−ジクロロ−１−β−ｄ− リポフラノシルヘンズイミダゾールを培養基に加えたとき、収量か２００−３０ ０％増加することが報じられた。ＨＡＶか組織培養により成長しうるとの立証は （Ｐｒｏｖｏｓｔ、　Ｐ、　Ｊ、　＆Ｈｉｌｌｅｒｍａｎ、　Ｍ、　Ｒ，（］　 ９７９　）　、　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ＳｏｃｉｅｔｙＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１　６　０　、２　１　３ 　−２２１）ウィルスの研究にとって、かなりの前進であった。それ以後、原集 落よりも急速にまたより高い力価に生長するＡ型肝炎の菌株が開発された。しか しなから、他のピコルナウィルスに比較して、その収量はまだ低く、最大の収量 に達する時間も長い。宿主酵素阻害剤の使用がＨＡＶの収量を増加するという報 告（Ｗｉｄｄｅｌｌ、　Ａ、。

Ｈａｎｓｓｏｎ、　Ｂ、　Ｇ、　Ｎｏｒｄｅｎｆｅｌｔ、　Ｅ、　ａｎｄ　Ｏｂ ｅｒｇ、　Ｂ、（１９８８）、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｖｉ ｒｏｌｏｇｙ、２４．　３６９−３７６）かあるがしかし、これらは高価であり 、ワクチン製造のためのウィルス生産として費用効率がよくなりそうもない。

本発明により、Ａ型肝炎ウィルスの増殖方法が提供される。その方法は、塩化ナ トリウムの濃度が等張濃度より３０ｍＭから１７０ｍＭ高い水溶性培養液中でウ ィルスに感染した細胞を培養することからなる。これにより、簡単で安価にＨＡ Ｖの収量を増加する改良された方法が提供される。

培養液中の塩化ナトリウムの濃度は、培養物の塩化ナトリウムの等張濃度より５ ０ｍＭから１５０ｍＭ高くあるのかよい。望ましい濃度は、培養物の塩化ナトリ ウムの等張濃度プラス８０ｍＭから１２０ｍＭ、最も望ましいのは１００ｍＭで ある。典型的には、塩化ナトリウムの等張濃度は、Ａ型肝炎ウィルスに感染した 細胞が増殖する培地としておよそ１５０ｍＭである。

もしも、培養物の塩化ナトリウムの等張濃度か知られていれば、培養液中の塩化 ナトリウムの絶対濃度が論理的に推理できるだろう。これにより、拳法ではＡ型 肝炎ウィルスは、塩化ナトリウムの絶対濃度か１８０ｍＭから３２０ｍＭの水溶 性培養液中で増殖させる。培養液中の塩化ナトリウムの適当な絶対濃度は、２０ ０ｍＭから３００ｍＭ、望ましくは２３０ｍＭから２７０ｍＭである。培養液中 の特に有効な塩化ナトリウムの絶対濃度は約２５０ｍＭである。

培養液中の塩化ナトリウムの濃度は、塩化ナトリウム水溶液を培養液に添加する ことによって等張濃度以上に上げることができる。追加の塩化ナトリウムは、培 養細胞のＡ型肝炎ウィルスによる感染前、感染と同時に、または感染後に、培養 物に添加することができる。Ａ型肝炎ウィルスの、どのような適当な菌株でも用 いることができる。塩化ナトリウムの水溶液は、培養物の中の細胞のウィルスに よる感染の１２から４８時間後、適当であるのは約２４時間後に、培養液に添加 するのが有利である。

拳法で使用するに適当な細胞は、典型的にはＡ型肝炎ウィルスの生長を支えるよ うな細胞系の細胞であり、特に、ワクチンの生産条件に合った細胞系の細胞であ る。

しかしながら、ウィルスに複製能力がある細胞培養系であればとの型も用いるこ とができる。したがって、細胞培養系は、第一に、連続的に培養した、または形 質転換した細胞から成るのがよい。細胞系は、ヒトまたはヒト以外の霊長類の腎 臓または肝臓由来のものであるのがよい。

適当な細胞培養系の例としては、ニホンザル、カニクイザル、キヌゲサルまたは オナガザルの胎仔または新生仔の腎臓細胞由来のあるいは、Ｗｌ−３８またはＭ ＲＣ−５細胞系（ＵＳ−Ａ−４３０１２４９）のようなヒトまたはヒト以外の霊 長類の肺組織由来の二倍体繊維芽細胞、ベロ細胞（ＵＳ−Ａ−４７８３４０７） ；ヒト肝臓腫瘍系ＰＬＣ／ＰＲＦ１５またはＨｅｐ、Ｇ２　（ＵＳ−Ａ−４７２ １６７５）；またはＢ５−Ｃ−１細胞などである。

適当なＡ型肝炎ウィルスの菌株は、ＨＭ１７５菌株、特にその１８Ｆ分離株であ る。“Ａ型肝炎ウィルスのＨＭ１７５菌株の起源”は、Ｇｕｓｔ、　Ｌｅｈｍａ ｎｎ、　Ｃｒｏｗｅ。

ＭｃＣｒｏｒｉｅ、　Ｌｏｃａｒｎｉｎｉ及びＬｕｃａｓ　（Ｊｏｕｒｎａｌ　 ｏｆｔｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ、　Ｖｏｌ、１５１＋　Ｎｏ、２ Ｔ　３６５−６７）により説明されてきた。組織培養物内に生長するこのウィル スの適応性は、Ｂｉｎｎ、　Ｌｅｍｏｎ、　Ｍａｒｃｈｗｉｃｋｉ。

Ｒｅｄｆｉｅｌｄ、　Ｇａｔｅｓ及びＢａｎｃｒｏｆ　ｔによる“霊長類細胞培 養物内のＡ型肝炎ウィルス菌株の一次分離と連続継代”（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ 　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　ｖｏｌ、　２０　、　Ｎｏ 。

１．２８−３３）に記述されている。

この方法は、ウィルスに感染した細胞が生長することができるとのような盟の細 胞培養液でも行うこてができる。培養液は、さらに、細胞の生長に必要な栄養素 、一般には、炭素同化源、窒素同化源または自由選択の金属塩から構成される。

特に適当な細胞培養液の例は、ウシ胎仔血清を補足したＥａｇｌｅ最小必須培地 である。

細胞は、通常のとの方法によってもウィルスに感染させられる。感染細胞系の増 殖条件は、用いた細胞系の性質に依存する。感染細胞は、最大生長速度を生ずる ことが知られている温度に保温することが有効である。細胞培養は、２５°Ｃか ら４０°Ｃ１例えば３４°Ｃがら３７℃で保温するのがよい。細胞成長は、細胞 変性効果が完了するまで継続させる。追加塩化ナトリウムを含む水溶性培養液内 におけるウィルス感染細胞の培養は、２日から４日で生長する。

本発明の方法で得たウィルスは、分離し、精製し、不活性化する。このように作 られた不活性Ａ型肝炎ウィルスは、これからワクチンを製造するために薬剤学的 に許容できる担体または稀釈剤で製剤化を行う。従って、本発明はまた、薬剤学 的に許容できる担体または稀釈剤、または活性成分として、拳法により生産され た不活性化Ａ型肝炎ウィルスから成るワクチンを提供するものである。

以下の例は発明を明らかにする。附属の図では、過剰の塩化ナトリウムを含んだ 培地（ｘ−ｘ）と、含まない培地（・−・）における、ＨＡＶの生産速度を図示 している。Ｙ軸は、感染後の日数を示す。Ｙ軸は、１分当たりのラジオイムノア ッセイの計数値を示す。

Ｂ５−Ｃ−１細胞は、アメリカ型培養コレクション（ＡＴＣＣＣＣＬ　２６）か ら入手し、５３から７ウシ胎仔血清（Ｆ　ＣＳ）を含む１９６９培地（５ｅｅｆ ｒｉｅｄ。

Ａ、、　ＨｅａｌＹ、　Ｇ、　Ｍ、、及びＭａｃｍｏｒｉｎｅ、　Ｈ，Ｇ、、　 （１９７０）　、　Ｊｕｇｏｓｌａｖｅｎｋａ　Ａｋａｄｅｍｉｊａ　Ｚｎａｎ ｏｓｔｉ　［Ｕｍｊｅｔｎｏｓｔｉ（ヒト２倍体細胞に関するシンポジウム）及 びＨｅａｌｙ、　Ｇ。

Ｍ、、　Ｔｅ１ｅｋｉ、　Ｓ、、　５ｅｅｆｒｉｅｄ、　Ａ、、　Ｗａｌｔｏｎ 、　Ｍ、　Ｊ、、及びＭａｃｍｏｒｉｎｅ、　Ｈ，Ｇ、、　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍ ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、（１９７１）　。

Ｖｏｌ、２１．　Ｎｏ、ｌ、１−５）で成長させた。

ウィルス成長 Ｂ５−Ｃ−１の密集細胞単層は、細胞当たりｌからｌＯラジオイムノフォーカス 単位／ＨＡＶの細胞を与えるために、室温で１時間、収集ウィルスに感染させた スは、Ｄｒ、Ｓ、　Ｌｅｍｏｎから提供されたＨＡＶの８Ｍ１７５変異型の１８ Ｆ組織培養適応分離体であった。シートをＥａｇｌｅｓ最小必須培地（ＭＥＭ） 内で洗い、２％ＦＣＳを含むＥａｇｌｅｓ　Ｍ　Ｅ　Ｍ内に３４°Ｃで保温した 。通常、２４時間後に、異なった濃度の塩化ナトリウム（ＮａＣ１）を添加した 。感染後、色々な時間間隔で、フラスコを−２０°Ｃに保管した。

ウィルス抗原の製造 細胞を凍結−解凍で３回処理した。細胞破片を低速遠心分離でペレットにし、１ ０ｍＭ　ＴＲｌ５，１０ｍＭＮａＣ１，１，５ｍＭ　ＭｇＣＩｓ、１％　Ｎｏｎ １ｄｅｔＰ４０及び０．５％アルキルジメチルアミンベタイン中に再懸濁した（ Ｅｍｐｉｇｅｎ、　Ａｌｂｒｉｇｈｔ及びＷｉ　ｌｓｏｎＣｈｅｍｉｃａｌｓ） 。懸濁液を室温で１時間保温した。この懸濁液を低速遠心分離によって清澄にし 、上澄みを、凍結−解凍した細胞から得られた上澄みに加えた。これはラジオイ ムノアッセイ（ＲＩＡ）またはラジオイムノフォーカスアッセイ（ＲＩＦＡ）用 として、直接使用した。

別に、ｌｏＯｍＭ　ＴＲｌ５　ｐＨ７，６，１００ｍＭ　ＮａＣｌ、３ｍＭ　Ｅ ＤＴＡ及び１％添加サルコシルによってウィルス溶液を製造した。３７°Ｃに１ 時間放置後、ウィルスを５°Ｃで１８時間、ｔｏｏ、ｏｏｏｘｇで遠心分離にか けてペレットにした。ウィルスペレットを２００ｍ１の１００ｍＭ　ＴＲｌ５　 ｐＨ７，６及び１００ｍＭ　ＮａＣｌ中に再懸濁してＲＩＡまたはＲＩＦＡ用に 用いた。

った。簡単にいうと、ウィルスを抗−ＨＡ、Ｖ　ポリクローナル抗血清を用いて 捕獲した。洗浄後、捕獲した抗原は、ポリクローナル抗−ＨＡＶ　”’Ｉ　Ｉ　 ｇＧを用いて検出した。

ラジオイムノフォーカスアッセイ（ＲＩＦＡ）ＨＡＶ伝染力は、ＲＩＦＡによっ て決定した（　Ｌｅｍｏｎし、次いで、２％ＦＣ３を補足し、０．５％アガロー スを含んだＥａｇｌｅｓＭＥＭ中で、細胞をかぶせた。細胞を３５°Ｃで７日間 ５％ＣＯ２下で保温した。細胞シートをアセトンで固定後、ウィルス複製の焦点 は、　Ｉｔｓ　■抗−ＨＡＶポリクロナールＩｇＧとの反応とその後のす一トラ ジオグラフィーによって検出された。

結果 成長培地への１００ｍＭ　ＮａＣ１の添加は、−貫して、より急速な細胞変性効 果（ＣＰ　Ｅ）をもたらした。

通常、感染後７日間でＣＰＥが完了したが、対照培養では感染後ｌＯ日日間も完 了が見られなかった。ラジオイムノアッセイで測定したＨＡＶの収量を表１に示 す。初期の収集と超遠心分離による濃縮物質の両方に収量の明らかな増加が見ら れた。

表　１ ＊１表１における稀釈１／１は、細胞上澄み中のウィルスと、洗浄剤で細胞から 除かれたウィルスとの混合である。細胞単層を感染するために用いられた物質は 、上澄みの中だけのウィルスであり、全ウィルスの約５０％であろう。稀釈１／ １０と１／１００はそれぞれ、Ｉ／１稀釈の１０倍と１００倍稀釈である。

ウィルス収量を高めるための塩化ナトリウムの最適濃度を決定するために、細胞 をウィルスに感染させ、２４時間後に色々な濃度の塩化ナトリウムを添加した。

細胞を７日後に収集し、ＰＴＡとＲＴＦＡによってウィルス収量を測定した。そ の結果が表２に示されている。

表　２ 追加塩の有無によるＨＡＶの成長曲線 高張性ＮａＣ１の１つの効果はＣＰＨの速度を増加することにあり、また先の実 験では感染後７日で完了したので、ＮａＣｌのレベル増加か絶対収量を増加する のかまたは単にＨＡＶか生産される速度を増加するのかを決定することが重要と 考えられた。２５ｃｍフラスコを１０ラジオイムノフオ一カス単位／細胞で感染 させ、感染後直ちに添加した追加塩化ナトリウム（１００ｍＭ）の存無で保温し た。フラスコを２４時間間隔で収集し、ウィルスを抽出し、超遠心分離で濃縮し た。ＮａＣ１の濃度上昇は、ウィルス生産速度に差を生じないように見えた（図 １）。どちらの場合も、最大の増加は２日と３日の間にあり、最大収量は３日と ４日の間で得られた。追加のＮａＣ１により収量の増加か得られたけれども、こ の増加は以前の実験よりはかなり低かった。これは、初期の実験ては追加ＮａＣ １が感染の２４時間後に添加されたが、この実験では感染直後に添加された事に 関係かあるのかも知れない。

明細書、請求の範囲及び賞約書翻訳文の浄書（内容に変更なし）国際調査報告　 １１ｒＴ／ｌ！。。つ／１１ｎＱ’１７

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．塩化ナトリウムの濃度が塩化ナトリウムの等張濃度よりも３０ｍＭから１７ ０ｍＭ高い水溶性培養液中で、ウイルスに感染した細胞を培養する方法から成る Ａ型肝炎ウイルスの増殖方法。
2. ２．塩化ナトリウムの濃度が塩化ナトリウムの等張濃度よりも８０ｍＭから１２ ０ｍＭ高い、請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．塩化ナトリウムの濃度が塩化ナトリウムの等張濃度よりも約１００ｍＭ高い 、請求の範囲第２項記載の方法。
4. ４．培養中の細胞のウイルスにより感染後１２時間から４８時間に、塩化ナトリ ウム水溶液を培養液に添加する、請求の範囲第１項から第３項のいずれかに記載 の方法。
5. ５．細胞培養がＢＳ−Ｃ−１細胞から成る、請求の範囲第１項から第４項のいず れかに記載の方法。
6. ６．培養液がＥａｇｌｅｓ最小必須培地とウシ胎仔血清から成る、請求の範囲第 １項から第６項のいずれかに記載の方法。
7. ７．当該培養は２日から４日間が有効である、請求の範囲第１項から第６項のい ずれかに記載の方法。
8. ８．さらに、こうして成長したＡ型肝炎ウイルスを回収することから成る、請求 の範囲第１項から第７項のいずれかに記載の方法。
9. ９．さらに、回収したＡ型肝炎ウイルスを不活性化することから成る、請求の範 囲第８項記載の方法。
10. １０．薬剤学的に許容しうる担体または稀釈剤及び活性成分として請求の範囲第 ９項の方法により生産される不活性化Ａ型肝炎ウイルスから成るワクチン。