JPH06508513A

JPH06508513A - マイコバクテリウムタンパク質およびその使用

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Publication number: JPH06508513A
Application number: JP4510774A
Authority: JP
Inventors: マーシャル　ジル; ロマン　フェリ; ペシェ　パスカル
Original assignee: アンスティチュパスツール
Priority date: 1991-06-07
Filing date: 1992-06-05
Publication date: 1994-09-29
Also published as: FR2677365A1; DE69232483T2; CA2110389A1; ATE214399T1; EP0589943B1; DE69232483D1; WO1992021758A1; FR2677365B1; ES2170055T3; US5962240A; EP0589943A1; US6060259A; DK0589943T3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】マイコバクテリウムタンパク質およびその使用本発明は約４４．５〜４７．５ｋＤの分子量を有する、マイコバクテリウム、特にエム、ボビスのタンパク質およびこれらのタンパク質をコードするヌクレオチド配列に関する。

また本発明は抗結核抗体に対する特異的免疫反応性を示す、マイコバクテリウム　ボビスの培養から得たこれらのタンパク質画分に関する。

さらに本発明は結核の検出およびモニタリングのためのこれらタンパク質および画分ならびにワクチンとしての使用に関する。

結核は引き続き世界中の公衆衛生の問題である。結核に直接関連する年間の死者数は約３００万であり新しい症例の結核の数は約１５００万である。この結核による死者の数は先進国に対してさえ高い；例えばフランスではこれは１年間に１５００程度であり、公的な数字と組織的な分析の結果との間の差のルージャウの評価（Ｒｏｕｊｅａｕ’ｓ　ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）を考慮に入れる場合２または３倍確実に低く見積もられる。結核症例の最近の増加、または少なくともこの疾病の頻度の減少のレヘリングオフは、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ流行の進展に関連して考慮する必要がある。全体でフランスおよび先進国、しかし特に単一の疾病に関する人口の減少の本質的原因を構成する途上国における頻度で結核は主要な伝染病である。

現在、患者から採取した試料中に培養可能な桿菌が示されることにより行われる的確な診断は結核の症例の半分以下で得られるに過ぎない。肺結核でさえ、これは結核症例の８０〜９０％に現れ、さらにこれは桿菌の検出が最も容易な疾病の形態であり、喀痰の試験がこの症例の半分未満に対して陽性であるに過ぎない。

ＰＣＲ（ポリメライズド　チェイン　リアクション）のような最も感度の高い方法の開発は、常に試料の入手の必要性に直面している。女性および子供は習慣的につばを吐がないので、乳児に対するサンプリングにはしばしば特定の医学的介入が必要とされる（例えば神経節の生検または脳を髄液の腰椎穿刺によるサンプリング）。

他の観点では、Ｐｃｔ？反応自体の阻害が存在し、この阻害は試料がその起点の制御の不可能性のためにこの方法により用いることができないような種類である。

最後に、通常の細菌学的診断、顕微鏡試験および培養は、その感度の限界（試料中に１０’〜１０’個の桿菌の程度が最良）のため、前に桿菌およびこのような疾病が比較的十分に発生する必要がある。

マイコバクテリウム結核に対して向けられた特異的抗体の検出はこのように通常の形態の桿菌自体の検出が困難または不可能な疾病の診断の補助である必要がある。

研究者の連続した世代は結核に対する血清診断法を改善するために試験を行った。アードーイング（Ａｒｄｏｉｎｇ）の（Ｃ，ｒ、ｈｅｂｄ。

５ｅａｎｃ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｐａｒｉｓ：１８９８：１２６：　１３９８〜１４０１）がらミドルブロック（Ｍｉｄ、ｄｌｅｂｒｏｏｋ）およびデュポス（Ｄｕｂｏｓ）の（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ。

１９４８．８８：５２１〜５２８）まで、この診断のために用いた調製品はほとんどわずかにしかあるいはまったく精製されず、努力は特に感度の増加に向けられ特異性には向けられていない。また最近感度のみを増大させる傾向のある技術がＥＬＩＳＡまたはＲＩＡタイプの技術を用いて提案されている。

ダニエル（Ｄａｎｉｅｌ）およびヤニツキ（Ｊａｎｉｃｋｉ）の（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

Ｒｅｖ、　１９７８．４２；　８４〜１１３）またはウィンカ−（Ｗｉｋｅｒ）等の（Ｓｃａｎｄ。

Ｊ、　ＩｍＩａｕｎｏｌ、１９８Ｂ、２’７：　２２３〜２３９）のさらに最近の研究はマイコバクテリアの抗原の複雑性を示している。この研究の後、試験が行われこの本質的な抗原を診断目的に用いることができることが明確にされた〔チャン（Ｃｈａｎ）　等の、Ａｍ、　Ｒｅｖ、Ｒｅ５ｐｉｒ、Ｄｉｓ。

１９９０．１４２：３８５〜３９０〕。結果として血清学的試験が３または４年間商業玉入手し得た（八ＮＤＡ）。これは生化学的にあまり十分には特徴付けられていない、極めて複雑な抗原、コシト（Ｃｏｃｉｔｏ）およびハンリンデン（Ｖａｎｌｉｎｄｅｎ）　（ＣＩｉｎ、Ｅｘｐ、ｌｍｌ１ｕｎｏ１．１９８６．６６：２６２〜２７２）のＡ６０を用いる。この試験の特異性および感度は不十分である。これは診断にあまり役立つものではなくこれを広く用いた多数の生物学者により拒絶されなくても大いに批評された。

量的に豊富なタンパク質に対応する、十分特徴付けられた抗原がさらに血清学的診断のためのこれらの特異性および感度について試験された。

約３５ｋＤのα抗原がまず１９６５年に精製された；これは２５〜３５％のタンパク質が多数の株のエム、ツヘルクローシス、エム、カンサシイ（Ｍ、　ｋａｎｓａｓ　ｉ　ｉ）またはＢＣＧ　（フクイ等のＢｉｋｅｎ　Ｊ、１９６５．８：１８９〜１９９）の培地に存在することを示す。

またこれらを亜鉛を含まない状態で増殖させた後、培地のタンパク質の５０％より多くなるように、６４ｋＤの抗原を精製した〔デ　プルイン（Ｄｅ　Ｂｒｕｙｎ）等のＪ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１９８１．１２４：３５３〜３５７］。

さらに第２分子を、同一の培地でこれらのタンパク質が２５〜３０％を占めるように精製した。この３２ｋＤの分子は前に説明したα抗原に極めて類似しているが、相違する（デ　プルイン等の門１ｃｒｏｂｉｏ１．Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　１９８７．２　：　３５１〜３６６）。

同様に、１６ｋＤの分子を精製し、さらにその存在を特定のＢＣＧ（ＮＣＧ東京）およびエム、ボビス株ならびに他の株に対してその株が含まれないか低いレヘルのもの（ＢＣＧ　コペンハーゲ、パスツール）の培地中で検出した（ハーボエおよびナガイ、Ａｍ、Ｒｅｖ。

Ｒｅ５ｐｉｒ、Ｄｉｓ、１９８４．１３９　：　４４４〜４５２　）。

これらの著者により用いられるタンパク質の選択基準はこのように先ず第１に生化学的基準であった。これらのタンパク質は結核による感染を検出するためにそれらの能力について十分に試験されたにすぎない。

このようにこの方法の再現性のある結果はマイコバクテリアの６４ｋＤの熱シヨツクタンパク質に対する抗体の応答が結核に冒された患者の８０％でだけでなく、百日咳に冒された幼児の３０％でも高かった〔トーμ（Ｔｈｏｓｅ）等のＩｎｆｅｃｔ、Ｉｍｎ＋ｕｎ、１９８７．５５　：１４６６〜１４７５　）。

特異性が制限されたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体により生産物が認識される遺伝子クローニングのための分子体物学的方法の使用は、多少同一の結果になった。この場合、プローブとして用いた抗体は、細菌抽出物中あるいは死菌上に存在する抗原に対して調製された。これらの抽出物または細菌を一般にＢａ１ｂ／Ｃマウスに注射して、得られた応答のレパートリ−をこの単一クローニングラインのマウスの応答に制限し、さらに極めて類似した実験方法に従わせる。

このようにして、６５ｋＤまたは３２ｋＤのような特定のモノクローナル抗体により認識させるには、これら分子は既に従来の生化学的方法により精製されたものかあるいは精製途中のものである。

７０ｋＤまたは１９ｋＤのような新しい分子がさらにこの方法により検出された。しかし検出目的に用いる場合、これらの分子は結核に冒された患者と正常被検者または他の伝染病を患ったものとの間の区別を明白にさせない。

最近の研究ではマイコバクテリアの抗原の精製は結核の患者の血清の混合物を用いて行われイムノアトソーベントにより患者に認識される主要な抗原を部分的に精製し得る〔トングクラジャイ（Ｔｈｏｎｇｋｒａｊａｉ）等のＪ、Ｍｅｄ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１９８９．３０：１０１〜１０４〕。

従来技術で説明した方法は主としてこのようにタンパク質の生化学的特性によるタンパク質の予備的な単離に基づいている。

著者が結核に冒されたこれらの個体を検出するこれらのタンパク質の能力を試験たのはこの単離後までではない。

本発明までの主たる研究において、他の方法を選択し結核感染の抗原標本を選抜した。

本発明に従い、研究は結核に冒された患者からあるいは生きた桿菌を用いて免疫化したモルモットから生じる血清を用いて結核感染の抗原標本の明白な選抜に向けられた。

従来技術に記載されたこれらの実験と区別される、この方法により結核の抗原標本が単離でき、この疾病に冒された患者の明白な検出が可能になる。

このように本発明は約４４．５〜４７．５ｋＤの分子量を有する、マイコバクテリウム、特にエム、ボビスのタンパク質に関する。これらのタンパク質は約４５ｋＤまたは約４７ｋＤの分子量、±１０％の誤差の制限内で、さらに約３．７　（４５ｋＤまたは４７ｋＤのタンパク質）および約３．９の等電点ｐＨ（ρ旧）　（４７ｋＤのタンパク質）、±０．２％の誤差のｐＨ４範囲を有する場合がある。

分子量決定の１０％の誤差は特に用いた測定キットによる結果の変動のためである。

またこれらのタンパク質はＰＲＯに対し約２１．９％、ＭＳＮ／ＡＳＰに対し約１０．６％、ＴＨＲに対し約５．４％、ＳＥＰに対し約５％、ＧＬＮ／ＧＬＵに対し約６％、ＧＬＹに対し約７．４％、ＡＬＡに対し約１９．２％、ＶＡＬ　ニ対し約５．８％、ＩＬＨニ対し約２．３％、ＬＥＤ　ニ対し約４．７％、ＴＹＲに対し約２．２％、ＰＨＨに対し約２．２％、ＬＹＳに対し約２．９％、および／またはＡＲＧに対し約２．５％の頻度で表されるアミノ酸組成を有することがある。

４７ｋＤのタンパク質種は次の配列：ＡＬＡ−ＰＲＯ−ＧＬＵ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＰＲＯ−ＰＲＯ−ＶＡＬ−ＰＲＯ− ＰＩＩＯ−ＡＬＡ−ＡＬＡ−ＡＬＡ−ＡＬＡ−ＰＲＯ−ＰＲＯ−ＡＬＡで示されるＮＨ，末端を有することがある。

さらに本発明はインスティテユート　パスツールのコレクション　ナチオナル　デ　力ルチュア　デス　ミクロオルガニズムズ（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ｄｅｓ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ）（ＣＮＣ門）の一部としてＮ０■、１０８１の下に１９９１年４月１２日に寄託したハイブリドーマライン、およびこのラインにより分泌された抗体に関する。

また上述のタンパク質は結核に冒された。ａ！、者または結核に冒され得る動物の血清中に存在する抗体、生きたエム、ボビス桿菌で免疫化して得た抗体、または上述のハイブリドーマラインＮ’　１．１０８１により分泌される抗体により認識され、かつ熱処理により殺菌したエム、ボビス桿菌でモルモットを免疫化して得た抗体または健康な患者もしくは結核以外の疾病に冒されたものの抗体によっては認識されない特性を有する。

さらにこれらのタンパク質はこれらが培地に存在し得るという事実により特徴付けられる。

本発明の一定の用途により、エム、ボビス以外の生物学的病原体由来の抗原決定基（エピトープ）はさらに上記タンパク質の１種に合体させることができる。

このようにして前記タンパク質の配列の全部または一部および抗原決定基に対応する配列を含むハイプリントタンパク質が得られた。

この決定基は、これら多数の抗原決定基に対する抗体の合成を誘導することができる免疫原性組成物を得るために、種々のタイプのものである場合があり特にタンパク質または糖タンパク質抗原のフラグメントであり得る。

タンパク質鎖を内部結合させる能力が良く知られている、グルタルアルデヒドもしくはベンゾキノンまたはＮ−ブロモスクシンイミドのような二官能性架橋側、あるいはグリコジル基とタンパク質を結合させるヒドラジドは、ハイブリッド分子を形成するのに用いることができる。これらのハイブリッド分子は担体分子の一部を構成しく４５〜４７ｋＤの複合体）、１種または種々の抗原決定基もしくは抗原フラグメント、例えばジフテリア毒またはそのフラグメント、破傷風前、Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原、灰白髄炎つィルスｖＰ１抗原と結合することができる。

ハイブリッド分子の合成工程は所望のタンパク質またはペプチド配列をコードするＤＮＡハイブリッドを構成するための遺伝子工学で用いられる方法を含む。

このようにかかるタンパク質はエム、ボビスタンパク質に存在しない抗原決定基に対応するタンパク質またはタンパク質フラグメントに対する免疫化を誘導することができる。

また本発明は上記タンパク質をコードするオリゴヌクレオチド、ＲＮＡまたはＤＮＡに関する。

さらに本発明はマイコバクテリウム、特にエム、ボビス培養から少なくとも次の段階ニー濾過による培地からの細菌の除去、 −モレキュラーシーブ上での濾液の透過、および溶出液の両分への分割、ならびに一特定の結核抗体に対するこれらの反応性を決定することによる両分の選択、を含む工程により得られたタンパク質両分に関する。

またモレキュラーシーブ上の濾過により得られた両分をイオン交換クロマトグラフィーにかけ任意に逆相クロマトグラフィーにかけることができる。

さらに本発明は特にヒトおよびウシの結核の検出およびモニタリングのために上述のもののようなタンパク質もしくはタンパク質両分または抗体の利用に関する。特にかかる検出はウェスタンプロット（イムノインプリント）法もしくは免疫酵素学的方法（ＥＬＴＳＡ）またはラジオイムノロジカル（ＲＩＡ）法により、これらのタンパク質ならびに特に免疫反応を行わせる緩衝液およびこの反応を現せる付加的物質を含む、測定パ・７りまたはキットを用いて実施することができる。

また本発明は上記のもののような少なくとも１種のタンパク質、１種のタンパク譬両分、または１種の抗体を含むワクチンもしくは医薬品に関する。

合体させていないタンパク質を含むワクチンは個体を結核に対して免疫するのに用いることができる。エム、ボビス以外の生物学的病原体から生じる抗原決定基を有するタンパク質は他の疾病に対する免疫化の構成において用いることができる。

指摘のように、５０〜５００μｇのタンパク質を個々のドーズ、すなわち皮肉の方法による１０５〜１０６個の組換え細菌／個体、について用いることができる。

さらに本発明は少なくとも製薬上効果的な量の上記のようなタンパク質、タンパク譬画分または抗体を含み、製薬上許容し得る希釈液またはアジュバントを組み合わせた医薬組成物に関する。

他の観点では、本発明は既に上述したようなタンパク質、タンパク質両分または抗体を結核の処置または予防用の医薬品の製造のために使用することに関する。

本発明を、いかなる制限も与えず、次の実施例および添付の図面を参照して示す：図１はエム、ボビス培地の分子濾過（Ｓｉ　３００）の２２０および２８０ｎｍでの光学強度（ＯＤ）プロファイルを示す。

図２は上記分子濾過中に得た画分２から生じる分子のイオン交換カラム（ＤＥＡＥ）での分離の２２０ｎｍの光学強度プロファイルを示す。

図３はイオン交換クロマトグラフィーから生しる画分１の逆相カラムクロマトグラフィーの２２０ｎｍでの光学強度プロファイルを示す。

図４Ａおよび４Ｂは殺菌した（Ａ）あるいは生きた（Ｂ）桿菌で免疫化したモルモットからの血清の混合物のそれぞれが存在する下でのＰνＤＦ膜の写真である。

図４０は出発材料（０）およびモレキュラーシープで得た両分（１〜６）のクーマシーブルーによる着色後の電気泳動ゲルである。

同一のゲルをＰＶＤＦ膜上に移し殺菌した（４Ａ）あるいは生きた（４Ｂ）゛桿菌で免疫化したモルモットからの血清により明らかにした。

図５Ａおよび５Ｂはイオン交換カラムで得た両分（１〜３）およびモレキュラーシーブ濾過により得た百分２の移動により得たゲルに対応するＰＶＤＦ膜を示し、前記膜は殺菌した（Ａ）あるいは生きた（Ｂ）桿菌でそれぞれ免疫化したモルモットからの血清の抗体の存在下に配置した。

図５０は図５Ａおよび５Ｂのトランスファ後に、クーマシーブルーで着色した最初のゲルを示す。

図６Ａおよび６Ｂはイオン交換カラムで得た画分１（０）および逆相クロマトグラフィーにより得た画分（１〜５）の移動に対応する膜上に、殺菌した（６Ａ）あるいは生きた（６Ｂ）桿菌でそれぞれ免疫化したモルモットからの血清の抗体の存在下に配置した、ゲルの痕跡を示す。この精製段階の画分１では、逆相クロマトグラフィーカラムの負荷が高すぎるために出発材料による汚染があることに注意する必要がある。

図７Ａ〜７Ｌは出発材料（０）、モレキュラーシーブ濾過により得た両分（１〜６）の電気泳動により得た膜上のゲルの痕跡を示し、これは患者（Ｎ’　７７、Ｎ’　１１５、Ｎ’　１１７、Ｎ’　１０８、Ｎ’　１０４、Ｎ’　１０５）からの血清にそれぞれ対応する結核（７Ａ〜７Ｆ）またはボレリア感染（７Ｇ〜７Ｋ）またはエルシュア症（７Ｌ）を患う患者から生しる個々の血清に冒された患者からの個々の血清の存在の下に配置した。

図８は逆相クロマトグラフィーにより得た画分５の電気泳動に対応するＰＶＤＦ膜上のゲルの痕跡を示す。この膜は約３１１ＩＩｎのストリップに切断し、さらに各ストリップを結核に冒された患者からの血清（患者Ｎ０７７．１０４．１０５．１０８．１１５．１１７．１２４．１３１．１３４．１２３．３ａ、２ｇ、２ｄ、および２ａにそれぞれ対応するバンド１〜１４）、またはボレリア感染（バンド１５〜１９）、レプトスピラ症（ハンド２０〜２２）、エルシュア症（バンド２３および２４）、またはプルセラ症（ハンド２５〜２７）を患う患者からの個々の血清（１／２０に希釈）の存在下に配置した。引用符“ａ“はこの技術の通常の人工産物に対応する。

図９は４５〜４７ｋＤのタンパク質（画分５）に対して硝酸銀で着色した二次元ゲルの写真である。

実施例１：抗原精製工程１）抗原の調製：ＢＣＧ培養（株１１７３　Ｐ２　）を従来の方法〔ゲオルグヒウ（Ｇｈｅｏｒｇｈｉｕ）等のＢｕｌｌ、［ｎ５ｔｉｔｕｔ　Ｐａ５ｔｅｕｒ　１９８３．８１　：　２８１〜２８Ｂ　）に従い１３０ｎ＋１の合成ツートン培地を含むフラスコ中に形成させた。

培地を３７゛Ｃで１４日後に収集し、４°Ｃで静かに注いで濾過（０，２２μｍ）Ｌり。培地を２　ｂａｒの窒素圧力の下にアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）（ＰＭＩＯ）膜上に配置し４°Ｃに保ち、４％のブタノールを含む逆浸透水を用いて強く洗浄し、次いで最初の容積に関して１０〜２０倍ニｆｉ　縮した。アミコンＰＭＩＯ膜により排除されていない分子ヲ含むこの濃縮培地を凍結乾燥し、秤量し、さらに粉末の形態で一２０°Ｃに貯蔵した。以下に記載した精製機構に用いた出発材料の１２ｇは３０１　の培地から得られた。

精製機構：２）ゲル濾過：５０　Ｘ　７５０ｍｍの３　μｎ１（ＳＥＲＶＡ）の、５ｉ３００調製カラムは４％のブタノールを含む緩衝溶液（Ｋ）１．ＰＯ，でｐＨ７，５に調整した５０　ｍＭのＮａＪＰＯｎ）を通過させて平衡化した：この溶液は予め０．２２μｍの膜上で濾過した。カラム流速は１．２５ｎ＋１／分に調整した；最大圧力は、４５ｂａｒに設定したが、これに達することはなかった。

カラムに注入すべき材料を緩衝液／ブタノール溶液中で５０ｍｇ／ｍｌの濃度で調製し、４０．０００ｇで２時間超遠心分離し、次いで０．２２μｍの膜で濾過した。１０ｍ１の試料を調製し一２０゛Ｃで凍結した。解凍後に再度濾過しカラムに注入した、各１０ｍ１の試料は約５００ｍｇの粗材料を含んでいた。２８０および２２０ｎｍでの光学強度プロファイルを代表的分離順序について図１に示した。プロファイルに基づいて選択した６つの主な両分を４°ｃｔ’濃縮して４％のブタノールを含む逆浸透水を用いてアミコンＰＭＩＯ膜上で強く洗浄した。

各濃縮画分を凍結乾燥し、秤量し、さらに−２０°Ｃで貯蔵した。この段階の画分２は生きた桿菌で免疫化したモルモットからの抗体または結核患者からの抗体により認識される主要な分子を含む、この画分のみを次の段階にかけた。

３）イオン交換カラム：２１．５Ｘ　１５０ｍｍのＤＥＡＥ−ＴＳＫ　５四調製カラム（ＬＫＢ）を４％のブタノールを含む緩衝溶液（１０ｍＭのＮａｚＨＰＯａ／ＮａＨｚＰＯ４、ｐＨ７，５および１０ｍＭのＮａＣ１）で平衡化した。最大圧力は５　ｍｌ／分の流速に対して３０ｂａｒ未満であった。溶出緩衝液としてＮａＣｌ濃度（ＩＭ）のみを変化させた。上記材料の１００ｍｇのすべてを含む４ｍｌの試料を注入した後直線勾配を圀２に示した機構に従って適用した。主な両分を２２０ｎｍの光学強度プロファイルに従って収集した。この画分をＰＩ’ｌｌＯ（アミコン）膜上で４％のブタノールを含む逆浸透水を用いて濃縮して洗浄し、次に凍結乾燥した。秤量後、各画分を一２０°Ｃで貯蔵した。この段階の画分１のみが生きた桿菌で免疫化したモルモットの抗体により認識される多数の分子を含んでいた：これを次の分離段階にがけた。

４）逆相カラム：４．６　Ｘ　２５０ｎｕ＋＋のＲＰ　３００　Ｃｉ　１０μｍカラムを１１５ｂａｒの最大圧力　゛の下に２　ｍｌ／分の流速を用いて０．２２μＩで濾過した酢酸アンモニウム（２０ｍＭのＮＨ４Ｃ００ＣＨｚ）緩衝液で平衡化した。９０％のアセトニトリルを含む溶出緩衝液は１ｍｌの容量の１０＋ｗｇの試料を注入した後回３に示すプロファイルに従って用いた。２２０ｎｏ＋の光学強度プロファイルにより、４０°Ｃでの減圧蒸発により濃縮し、次に凍結乾燥した５つの主要な両分を分離させた。

５）抗原の免疫検出（ｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）　：１０％のポリアクリルアミド、０．１％のＳＤＳ変性ゲルをラエムリ（Ｌａｅｍｓｌｉ）の通常の方法（Ｎａｔｕｒｅ　１９７０．２７７：　６８０〜６８５）により調製した。

１０〜２μｇの材料を含む試料を、精製段階に従って、各ゲルトラック中の１０＋ａｌの容積の５％のメルカプトエタノール、３％のＳＯ５およびブロモフェノールブルーのトレースを含む緩衝液に加えた。青色の移動限界にまで電気泳動した後試料中に存在する分子を適当な電界を一昼夜印加することによりＰＶＤＦ　（ミリポア）シート上に移した〔バーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）の、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　［ｅｄｓｌ　１９８８　）。

１分未満の間のクーマシーブルー溶液によるＰＶＤＦシートの着色後、脱色し、分子量マーカーを確認して、この形の輪郭をペンシルマークで記した。すべての脱色後、シートを実験室の温度でＰＢＳｔ３％のトリトンｘ１００で３０分間洗浄し、次にＰＢＳ単独で５分間３回洗浄した。次にシートを５％の脱脂粉乳を含むＰＢＳ　テ３７°Ｃ１時間浸し、次イテＰＢｓ十トウイー：／２０（０，２％）で３回洗浄した。

インキュベーションはＰＢＳ＋トウィーン２０（０，２％）＋５％粉末ミルク中で１７２０に希釈した抗血清（免疫血清）を用いて３７°Ｃで１時間３０分間周期的に振盪させて実施した。次にＰＢｓ十トウイーンを用いた３回の洗浄をアルカリフォスファターゼで標識した抗免疫グロブリン抗体とインキュベーションする前に実施した。フォスファターゼ〔バイオシス（Ｂｉｏｓｙｓ）　）で標識したヒト抗免疫グロブリン抗体およびモルモット抗免疫グロブリン抗体をＰＢＳ　＋　）　ライ−７２０（０，２％）＋ミルク（５％）中テ１／２ｏニ最終的に希釈して用いた。３７°Ｃで１時間３０分インキュベーションした後、ＰＶＤＦシートをＰＢＳ＋）ウィーン中で３回洗浄し、次いで実験室温度で、Ｂ（ＪＰおよびＮＢＴを含む表示緩衝液（ｒｅｖｅａ　ｌ　ｉｎｇｂｕｆｆｅｒ）中で５〜ｌＯ分間インキュベーションした（バーロウおよびレーンの上記文献）０反応を停止させ乾燥後シート自体を撮影した。

６）アミノ酸組成：全アミノ酸組成のための分析をインスティテユート　パスツール　オ！レガニンク　ケミストリー　デパートメントにおける各クロマトグラフィーの両分について実施した。ベックマンＬＳ６３００分析器を使用した。

４５〜４７ｋＤのタンパク質のアミノ酸頻度で現された全組成は次のようである：ＡＳＮ／ＡＳＰ　：１０．６％、ＴＨＲ：　５．４％、ＳＥＲ：５％；　ＧＬＮ／ＧＬυ　：６％、ＧＬＹ　：　７．４％；ＡＬＡ　：１９．２％、ＶＡＬ　：　５．８％、ＩＬＥ　：　２．３％、ＬＥＵ　：４．７％、ＴＹＩ？　：　２．２％；ＰＨＥ　：　２．２％、ＬＹＳ　：　２．９％、ＡＲＧ　：　２．５％；ＰＲＯ：２１．９％。

実施例２：タンパク質およびタンパク譬両分の免疫学的特異性の決定。

Ａ、　生きた桿菌で免疫化したモルモットからの抗体により認識される抗原の単離。

１２〜１５匹のモルモットの群（実験の初めに２５０〜３００ｇの健康雌）は生きたマイコバクテリアＣ０，１ｍｌの生理食塩液中での２回の皮肉注射でＢＣＧの２Ｘ１０’の生菌単位（ｖｉａｂｌｅ　ｕｎｉｔｓ））、または同一の株からの２ｍｇの熱殺菌（１２０’Ｃ１３０分）したマイコバクテリアを筋向に不完全フロインドアジュバントの０．５　ｍｌの生理食塩液エマルジョン（１／１）　として受け入れた。異なる群のモルモットからの血清試料を免疫化後７〜１２カ月採取し、濾過しく０．２２μｍ）、次に少量に分離してこれを一２０°Ｃで凍結し貯蔵した。種々の群の抗血清の試験を実施した（生きた細菌で免疫化した後の５種および殺菌した細菌で免疫化した後の６種）。

報告した結果は各タイプの免疫化の血清標本の群で得られた；群間の差は同一の免疫化法について最少であった。

１）Ｓｉ　３００での分子濾過の段階出発材料を成す培地（洗浄し、濃縮し、さらに凍結乾燥した）をＳｔ　３００カラム上に５０ｋｇの材料を含む１０ｍ１の試料容量で注入した。画分１〜６を図１に示したプロファイルに従って分離し、２４回の連続した注入のために収集し、次に洗浄し、−ａ縮して、さらに凍結乾燥した。表１には凍結乾燥後の各両分の総重量ならびに各両分のアミノ酸分析（ベックマンＬＳ　６３００分析器）により決定した各標準的なアミノ酸の濃度から計算した、対応するタンパク質の最少重量を示す。

各両分（１０ｔＩｇ　）をＳＯＳゲルトラック上に配置し；次に、電気泳動に連続して、Ｐｖ叶膜上に移して免疫検出し、種々の血清と反応する主なタンパク質を含む画分を確認した。

図４はクーマシーブルー（図４Ｃ）で着色したゲルおよび殺菌した桿菌（４Ａ）または生きた桿菌（４Ｂ）で免疫化したモルモットからの血清で示された同一ゲルの２つのイムノ−インプリントを示す。通常の抗原は両タイプの血清、例えば画分４．５および６に存在する３０ｋＤの抗原ならびに画分５の３８ｋＤ抗原により認識される。画分３．４．５および６の分子量１０〜１６ｋＤの抗原は主として殺菌した桿菌で免疫化したモルモットからの抗体により認識された。画分２に存在する４５および４７ｋＤの２種の抗原は主として生きた桿菌で免疫化した動物からの抗体により認識された。この画分は精製の第２段階のために選択した。

２）イオン交換カラムの段階：上記画分の１００ｍｇの試料をＤＥＡＥ−ＴＳＫ　調製カラム上に負荷しＮａＣ１勾配を用いて溶出した。溶出した分子の２２０ｎｎ＋のプロファイルは３つの主要な画分に特定された（図２）。収集後、材料の連続した注入により得た各画分を洗浄し、濃縮して凍結乾燥した（表２）。

ＳＯＳゲル上で上記画分のそれぞれの５μｇを電気泳動した後、ＰＶＤＦ　シートのイムノ−インプリントが殺菌しあるいは生きた桿菌で免疫化したモルモットからの血清により明らかにされた（図５Ａおよび５Ｂ）。画分１−ＤＥＡＥは殺菌した桿菌で免疫化した動物からの抗体により認識されるわずかの抗体を含むにすぎない：約１０および１４ｋＤの２つの薄いバンド、５２ｋＤの薄いハンドおよび６７ｋＤ辺りのあまり明白でない影。他方、この同一の画分１−ＤＥＡ’Ｅは生きた桿菌で免疫されたモルモットからの抗体により強く認識される４５／４７ｋＤの２本線、さらに６７〜９４ｋＤの強い悪く輪郭を描かれたスポットを含む。この画分１−ＤＥＡＥを次の精製段階のために選択した。

３）逆相カラムの段階：酢酸アンモニウム緩衝液（２（ｌｎＭ）で平衡化した、１０μｍのＲＰ３００カラムには上記画分１−ＤＥＡＥの最大５〜１０ｍｇを含む１ｍｌの試料を入れた。図３の機構に従った０〜９０％のアセトニトリル勾配を用いた溶出により５つの主要な両分が回収できた。多量のアセトニトリルを除去するためにこれらの両分を４０°の減圧蒸発を用いて濃縮し、その後凍結乾燥した。表３は各両分の重量を示す。

２５〜３０％のアセトニトリルの溶出に対応する画分４は殺菌した桿菌で免疫化した動物の血清に存在する抗体により認識される１０〜１５ｋＤの抗原ならびに生きた桿菌で免疫化した動物から生じる抗体により認識される少量の４５／４７ｋＤ抗原を含む。次の画分５（３０〜５０％のアセトニトリル勾配）は生きた桿菌および主としてこれらの分子で免疫化した動物からの抗体により認識される多数の分子を含んでいた（図６）。

Ｂ）結核または他の伝染病に冒された被検者から生じる抗体の試験 ■）肺結核再発（９名の患者）または最初の発病（５名の患者）を示す、１４名の患者から由来の血清はエム、ラベルクローシスによる感染中にヒトで識別される主要な抗原の特徴付けのために用いられた。

Ｎ０性　年齢７７Ｍ３３３回目の発病、急性粟粒結核１０４　Ｆ　４７　２回目の発病、急性粟粒結核１０５Ｍ４９　２回目の発病、中間結核（ｉ　ｎ　ｔｅｒｍｅｄ　ｉａ　ｔｅｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）１０８Ｍ３８　２回目の発病、先の急性後効果後の軽度の結核１１５Ｍ６４　２回目の発病１１７Ｍ２４　２回目の発病１２４Ｍ６３　２回目の発病１３１Ｍ６４　２回目の発病、現在極めて急性な結核１３４Ｍ３３　１回目の発病、急性粟粒結核１２３Ｆ２６　１回目の発病、中間結核３ＡＭ４５１回目の発病、急性粟粒結核２ＧＦ１７１回目の発病、中間結核２０Ｍ２７１回目の発病、中間結核２ＡＭ５２１回目の発病、急性粟粒結核２）最近の既知の結核病歴を持たず伝染病に冒された１３名の患者由来の血清をエム、ツヘルクローシス感染に直接関連しない抗原の特徴付けに用いた。血清試料を採取しボレリア感染（５つのケース）、レプトスピラ症（３つのケース）、エルシュア症（２つのケース）、またはプルセラ症（３つのケース）の診断を確立あるいは確認した。

結核または他の感染に冒された患者からのこれらの血清は抗ＨＩＶおよび抗Ｈｂｓ（Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原）抗体の存在について陰性であった。

Ｓｉ　３００の第１分離段階後に得た画分を電気泳動にかけ、次いでＰＶＤＦ膜に移した。同一の膜を調製し結核または他の伝染病に冒された患者からの血清の存在下に個々に置いた。

結核に冒された６名の患者および他の感染に冒された６名の患者からの結果は画分４．５および６に存在する３０ｋＤの抗原ならびに画分５からの３５／３８ｋＤの抗原がすべての血清により認識されることを示した０画分２でいくつかの抗原、特に２５ｋＤの抗原はまたすべての血清により認識された。一方、結核に冒された患者からの血清だけが領域４５／４７ｋＤに位置する抗原と強く相互作用した（図７）。

上述のように精製した、これらの４５／４７ｋＤの抗原を極めて広いハンドのＳＯＳゲル上に置き、次に、電気泳動させた後、それらをＰＶＤＦ膜上に移し次に約３＋ｎｍのストリップに切断した。各ストリップを１名の患者の血清の存在下でインキユベーシヨンした。図８に示すように、結核に冒された患者由来の１４種の血清のうち１２種は４５／４７ｋＤの抗原を認識したが、他の感染に冒された患者からの血清はいずれもこれら抗原を認識しなかった。

０．４５〜４７ｋＤ群のタンパク質の二次元電気泳動分子量群４５〜４７ｋＤのタンパク質の二次元電気泳動を実施し、次にゲルを銀で着色した（図９）。

次いで分子をＰＶＤＦシート上に移しその後生きた桿菌で免疫化したモルモットからの抗体または殺菌した桿菌で免疫化したモルモットからの抗体の存在下に置いた。

トランスファの結果は銀で着色した分子が生きた桿菌で免疫化したモルモットからの抗体により検出されることを示したが、それらは殺菌した桿菌で免疫化したモルモットからの抗体によっては認識されなかった。

一方、この複合体の４７ｋＤ分子はさらにＮ　’　１．ＬＯ８１としてＣＮＣＭに寄託したハイブリドーマラインからのモノクローナル抗体により認識された。

結論：報告した結果（図７）はマイコバクテリア調製物、ここでは培地に、結核患者からの血清および他の感染症に冒された患者からの血清により同時に認識される抗原が存在することを示す。

一方４５／４７ｋＤ　ｗ４域に位置し５ｉ３００力ラム分画の画分２に存在する抗原は結核に冒された患者からの血清により認識されるに過ぎず他の感染に冒された患者からの血清によっては認識されない。

４５／４７ｋＤの分子は、これらの抗原性能力（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ　ｃａｐａｃｉｔｙ）により精製され生きた桿菌で免疫化したモルモットからの血清と明確に反応するが、不動化ゲル（ｉｍｎ＋ｏｂｉｌｉｎｅ　ｇｅｌ）上で決定されたような、３．７〜３．９の等電点ｐｕを有する。

二次元ゲルにおいて４７ｋＤのバンドは硝酸銀を用いた着色の後３．７および３，９のｐ旧値で２種の主要なスポットに分離し、４５ｋＤのバンドはｐＨ４３，７の主要なスポットになった。中程度の強度のスポットもこの方法により示され、４５／４７ｋＤの複合体の一部であった。このようにして二次元ゲルで検出された種々の分子は生きた桿菌で免疫化した動物からの血清によりすべて認識された。

他に認識できる分子はクーマシーブルーまたは銀を用いたゲルの着色後に存在しなかった。

同様に、Ｐｖ叶膜へのトランスファ次いで熱殺菌した桿菌で免疫化したモルモットからの血清を用いて免疫検出した後、目に見えるスポットは４５／４７の抗原領域、あるいはどこにも存在しなかった。

マイコバクテリアの抗原の粗調製物に対して免疫化されたラビットからの血清は４５／４７ｋＤの分子を検出するに過ぎず、このようにしてこれらの生化学的および免疫化学的基準に従ってこれらの純度が示された。

マウスから調製されたモノクローナル抗体はＰＶＤＦ膜上の二次元ゲルに存在する分子のトランスファ後の免疫検出試験において種々の４７ｋＤ分子を認識した。

試験された免疫学的試薬（生きた細菌を用いた免疫化の種々の期間の後のモルモットの血清、結核に冒された患者からの血清）は抗原活性に基づいて４５／４７ｋＤの複合体の分子を解離することができる。

この複合体のタンパク質の全アミノ酸組成はこれらの間の密接な関係に一致している。

表■−各Ｓｉ　３００両分の合計重量および対応するタンパク質重量の評価表■説明最小２．２ｇのタンパク質を含む、１２ｇの原材料から、６つの両分をＳｉ　３００上の分子濾過により得た。タンパク質に対する最小重量の計算は全アミノ酸組成の結果から行った。

合計収率は総重量収率について１９％および計算したタンパク質収率について４４％であった。

表２−各ＤＥＡＥ画分の合計重量およびタンパク質に対応する重量の評価表２説明：上記Ｓｉ　３００画分２をＤＥＡＥ−ＴＳＸ調製カラムに負荷した。カラムにより保持されない画分は画分１−ＤＥＡＥを構成し、画分２および３はイオン強度の増加（１ｈＭ〜６００ｍＭのＮａＣ］　）による溶出に対応した。

収率は総重量収率について６３％および各画分のアミノ酸組成の分析後にこのタンパク質のために計算した収率については７５％であった。

表３−各ＲＰ　３００逆相画分の合計重量および対応するタンパク質重量の評価表３説明：上記画分１−ＤＥＡＥをＲＰ　３００　Ｃアクアボア（Ａｑｕａｐｏｒｅ）　〕カラムに負荷し、次に図５に示す機構に従って０〜９０％のアセトニトリル勾配を用いて溶出した。

Ｆｉｇｕｒｅ　ＬＴＬｇｕｒｒ　２ ―介：　１　２３　４　５Ｆｉｇｕｒｅ’　３フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１５１０４　８３１８−４ＨＣＩ２Ｎ　１５／３１　ＺＮＡＣ１２Ｐ　２１１０８　８２１４−４８ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｄ　８３１０− ２Ｊ３３１５６９　Ｆ　８３１０−２Ｊ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０２Ｃ１２Ｒ１：３２５）（Ｃ１２Ｎ　１５／３１Ｃ１２Ｒ１：３５）（Ｃ１２Ｐ　２１１０８ＣＩ２　Ｒ１：９１）Ｉ

Claims

【特許請求の範囲】

１．ＳＤＳ存在下に約４４．５〜４７．５ｋＤ、特に約４５〜４７ｋＤの分子量を有することを特徴とする、マイコバクテリウム特にエム、ボビスからのタンパク質。
２．約４５ｋＤの分子量を有することを特徴とする請求項１記載のタンパク質。
３．約４７ｋＤの分子量を有することを特徴とする請求項１記載のタンパク質。
４．約３．７のｐＨｉを有することを特徴とする請求項１または２に記載のタンパク質。
５．約３．９のｐＨｉを有することを特徴とする請求項１または３に記載のタンパク質。
６．次の配列：【配列があります】で示されるＮＨｚ末端を有することを特徴とする請求項３に記載のタンパク質。
７．ＰＲＯに対し約２１．９％、ＡＳＮ／ＡＳＰに対し約１０．６％、ＴＨＲに対し約５．４％、ＳＥＲに対し約５％、ＧＬＮ／ＧＬＵに対し約６％、ＧＬＹに対し約７．４％、ＡＬＡに対し約１９．２％、ＶＡＬに対し約５．８％、ＩＬＥに対し約２．３％、ＬＥＵに対し約４．７％、ＴＹＲに対し約２．２％、ＰＨＥに対し約２．２％、ＬＹＳに対し約２．９％、および／またはＡＲＧに対し約２．５％の頻度で表されるアミノ酸組成を有することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質を含む画分。
８．ＣＮＣＨでＮ°Ｉ　１０８１として寄託したことを特徴とするハイブリドーマライン。
９．請求項８に記載のハイブリドーマラインにより分泌されたことを特徴とする抗体。
１０．生きたエム．ボビス桿菌を用いて免疫化して得た抗体、結核患者からの抗体または請求項９に記載の抗体により認識され、さらに熱殺菌したエム、ボビス桿菌を用いて免疫化して得た抗体または健康な患者もしくは結核以外の病気に影響された患者からの抗体によっては認識されないことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
１１．培地中に存在することを特徴とする請求項１〜７および１０のいずれか１項に記載のタンパク質。
１２．配列に請求項１〜７、１０および１１のいずれか１項に記載のタンパク質の全部または一部の配列および抗原決定基に対応する配列を含むことを特徴とするハイブリッドタンパク質。
１３．請求項１〜７および１０〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質をコードすることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
１４．マイコバクテリウム、特にエム、ボビス培養から少なくとも次の段階： −濾過による培地からの細菌の除去、 −モレキュラーシーブ上での濾液の透過、および溶出液の画分への分割、ならびに −特定の結核抗体に対するこれらの免疫学的反応性を決定することによる分画の選択、を含む工程により得られたことを特徴とするタンパク質画分。
１５．モレキュラーシーブ上での透過後にイオン交換クロマトグラフィーを行うことを特徴とする請求項１４に記載のタンパク質画分。
１６．イオン交換クロマトグラフィーの後に逆相クロマトグラフィーを行うことを特徴とする請求項１５に記載のタンパク質画分。
１７．請求項１〜７および９〜１６のいずれか１項に記載のタンパク質もしくはタンパク質画分または抗体を結核、特にヒトおよび畜牛の結核の進行の検出およびモニタリングのために使用すること。