JPH06508634A - 弱毒化復帰変異体血清型１マレク病ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 弱毒化復帰変異体血清型１マレク病ワクチンマレク病（Ｍａｒｅｋ’ｓ　ｄｉｓ ｅａｓｅ　ＳＭＤ）　、即ちニワトリの高度流行性でかつ重要なリンパ増殖性疾 患は、商業用ニワトリにおいては、弱毒化又は天然無毒性ＭＤ関連ヘルペスウィ ルスからなる生ウイルスワクチンにより抑えられている。予防接種計画は全般的 に非常に有効と思われているが、家禽業界ではＭＤによる損失を受け続けている 。家禽業界に立ちはだかる経済的圧力ならびに時間と共に有毒化するＭＤウィル スの傾向からみて、非常に有毒な野生株による初期攻撃に対してより有効に防御 する、更に有効な製品開発が望まれる。本発明は、現存する市販ワクチンよりも 優れた防御を実際に示す、ＭＤに対する新規ワクチンに関する。

従来技術の説明 ニワトリにおいて見られるＭＤウィルスには３種の異なる血清型がある。すなわ ち、（１）血清型１、高及び低毒性ＭＤウィルスとそれらの弱毒化変異体を含め たその疾患に関与する発癌型；　（２）血清型２、非発癌性ＭＤウィルス；　（ ３）血清型３、七面鳥のヘルペスウィルス（ＨＶＴ）がある。

原型ＭＤワクチンは、％１ｔｔｅｒら（Ａｍ、ＪＪａｃ、Ｒｅｓ、３１：５２５ −５３８（１９７０））及び０ｋａｚａｋｉら、米国特許第３．６４２゜５７４ 号明細書で報告されたように、七面鳥から最初に単離された血清型３ウイルスか らなるものである。その発癌性の欠如、自己制限感染、良好なインビボ及びイン ビトロ複製、無細胞及び細胞性製剤としての利用可能性ならびに高い防御効力か ら、世界中でＭＤワクチンの標準としてＨＶＴを確立した。ＨＶＴの常用法はＦ Ｃｌ２６である。

天然無毒性５Ｂ−１株から産生されたワクチン（Ｓｃｈａｔｅｔ　ａｌ、、　Ｊ 、　Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、６０：１０１０７５−１０８２（１ ９７及び米国特許第４，１６０，０２４号明細書）、即ち血清型２ＭＤウィルス の単離物は、１９８４年から米国で許可されている。５Ｂ−１株は高度毒性Ｍｄ ５株に対してほとんど防御的でない。２種のウィルスが一緒になるといずれか一 方単独の場合よりも大きな防御を示すことから、それは二価ワクチンとしてＨＶ Ｔと組合せて通常用いられる（Ｓｃｈａｔ　ｅｔ　ａｌ、　Ａｖｉａｎ　Ｐａｔ ｈｏｌ、ｌｌ：５９３−６０８（１９８２）　；　Ｖｌｔｔｅｒ、　Ａｖｉａｎ 　Ｐａｔｈｏｌ、ｌｌ：４９−４９−６２（１９、これらは本明細書の開示の一 部とされる）。この現象は“防御相乗作用”と呼ばれている。ＳＢ　−１＋ＨＶ Ｔ二砒ワクチンは、現在ＭＤワクチンに関する米国市場の約１８％を占め、利用 しつる様々なＭＤ製品の中で最も有効であると考えられる。しかしながら、散発 的な被害がその使用にもかかわらず生じている。

ＣＶＩ　９８８クローンＣ（ＣＶＩ９８８／Ｃ）から産生きれたもう１つのＭＤ ワクチンが米国で市販用に最近許可されている。このワクチンは組織培養で連続 継代により弱毒化された弱毒性血清型ＩＭＤウィルスであり、ｄｅＢｏｅｒら（ Ａｖｌａｎ　Ｄｉｓ、３０：２７Ｂ−２８３（１９８Ｂ））により報告されたも のである。

Ｍｄ１ｌ（即ち非常に有毒な血清型ＩＭＤ野生単離物）に由来する実験ワクチン がＶｉｔｔｅｒ、前掲に報告されている。Ｍｄ１ｌは細胞培養で７５回の連続継 代により弱毒化され、得られたワクチンはＭｄ１ｌ／７５Ｃと呼ばれている。こ のワクチンによればは、Ｍｄ５および他のほとんどの高度毒性ＭＤウィルスによ る攻撃に対して、良好な防御が得られることが示されたが、但し、それはＨＶＴ 及び５Ｂ−１ワクチンで有効に防御されるＪＭ／１０２Ｗ株、原型ＭＤウィルス による攻撃に対しては、さほど有効ではなかった。更に、その効力は、ＨＶＴ抗 体を有するニワトリにおいては一貫してより低いものであった。

米国特許第４，８９５，７１７号明細書において、ＷｉｔｔｅｒはＭｄ１ｌ／７ ５Ｃ／Ｒ２と称されたＭｄ　１１／７５Ｃの復帰変異誘導体にを開示している。

Ｍｄ　１１／７５Ｃ／Ｒ２は、いくつかの他の一部ワクチンよりも優れているこ とが示され、二価ＩＶＴ＋５Ｂ−１）ワクチンと同等のものであった（Ｖｌｔｔ ｅｒ、　Ａｖｉａｎ　Ｄｉｓ、３１ニア５２−７６５（１９８７））。しかしな がら、血清型１ウイルスの固有病原性およびより大きな病原性に復帰しうる弱毒 化法の可能性（Ｖｌｔｔｅｒら、Ａｖｉａｎ　Ｐａｔｈｏｌ、１３ニア５−９２ （１９８４））は、このような製品の許可にあたって考慮されなければならない 因子となる。

コノタメ、ＨＶＴＳＳＢ−１、ＣＶ　Ｉ　９８８／Ｃ５Ｍｄ１１／７５Ｃ及びＭ ｄ１ｌ／７５Ｃ／Ｒ２はすべて、あるＭＤワクチンに対して有効であるが、これ らのワクチンは、すべてのニワトリにおけるすべてのＭＤ攻撃ウィルスに対して 完全な防御にはならない。ＭＤの将来におけるどのような大規模発生をも防ぐた め、改良ワクチンに関する研究が続けられている。

理想的な血清型１ワクチンは、遭遇しそうなほとんどの病原性野生株とにおいて 相同性を最大化するために、非常に有毒なＭＤＶ病原型からおそらくは誘導され るべきである。それは商業用ニワトリに適用された場合に、安全といえる程度ま で弱毒化されて、復帰できないか又は横に広がるべきでない。それはインビトロ 及びインビボで容易に複製するものでなければならない。最後に、それは、あら ゆるウィルス血清型に対する母性抗体の存在下で、非常に有毒な野生株による初 期攻撃に対して高レベルの防御を与えるものでなければならない。

発明の概要 Ｍｄ１ｌ／７５Ｃ／Ｒ２のクローンとして誘導された２種の新規ＭＤワクチンを 今般私は見出した。それらのクローンは、Ｍｄ　１１／７５／Ｒ２／２３及びＭ ｄ１ｌ／７５／Ｒ２／２９と命名され、評偏された約４０のＭｄ　１１／７５Ｃ ／Ｒ２クローンブールから選択された。

本クローンは、それに相当する免疫原性の喪失なしに、親ウィルスと比較して著 しく低い病原性であることを最大の特徴点とする。高感受性系統のニワトリによ る実験で、双方のクローンはＭＤの肉眼的病変を引き起こさなかった。更に、双 方のクローンは。親ウィルスの場合にほぼ匹敵するＭＤＶの非常に有害な株によ る攻撃に対する免疫を誘導した。観察された免疫レベルは、二価（ＨＶＴ＋５Ｂ −１）ワクチンで得られる免疫と大きく異なることはなかった。

この知見によって、本発明はニワトリにおけるＭＤに対する新規高度防御血清型 １ワクチンの提供をその目的としている。

また、本発明は、商業用として現在のものより有効であるＭＤに対する一価及び 多価のワクチン双方の提供もその目的としている。

本発明は、ニワトリ、特にブロイラー及び産卵鶏の生存力及び生産力を改善する こと並びにＭＤに起因する家禽産業における経済的損失を減らすことをまたもう 一つの目的としている。

本発明の更なる目的は、急速な複製速度と、それによる高防御効力及びインビト ロ産生効率で特徴付けられるＭ　Ｄワクチンを提供することである。

本発明の他の目的及び利点は次の記載から容易に明らかになるであろう。

生物学的材料の寄託 弱毒化復帰変異体血清型１マレク病ウイルスクローンＭｄ　１１／７５Ｃ／Ｒ２ ／２３及びＭｄ　１１／７５Ｃ／Ｒ２／２９は、１９９１年５月２２日付でロッ クビル。

ＭＤのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔ ｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）にブダペスト条約の規定に従 い寄託され、各々受託番号ＡＴＣＣＶＲ２３２８及びＡＴＣＣＶＲ２３２７が付 されている。

発明の詳細な説明 “ワクチン２は、そのワクチンで接種された動物で免疫反応を賦活しつる投与形 における、あらゆるタイプの生物学的物質に関するものとして、本明細書ではそ の広い意味に定義されるものとする。本発明の目的にとって、ワクチンは、ウィ ルス自体又はウィルスの免疫原（抗原）成分のいずれからなるものであってもよ い。ワクチンはウィルスの免疫原成分をコードする遺伝子をその中に挿入したベ クターから生産されてもよい。

“復帰変異体″という語は、弱毒化ウィルスの継代培養物であって、その継代培 養物はその弱毒化形と比較して高毒性及び高インビボ複製であることを特徴とす るものに関し用いることとする。その用語は真の復帰変異体及び見掛けの復帰変 異体双方を包含するものとして、本明細書では包括的に用いられ、後者はクロー ン化ウィルスよりもむしろウィルス粒子群に由来する。

既に言及したように、Ｍｄ　１１／７５Ｃ／Ｒ２／２Ｂ及びＭｄ１１／７５Ｃ／ Ｒ２／２９クローンはＷｉｔｔｅｒ（米国特許第４，８９５，７１７号）、前掲 のＭｄ１ｌ／７５Ｃ／Ｒ２（Ｒ２）復帰変異体ウィルスに由来するものである。

それらは、ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥ　Ｆ）中でＲ２を連続継代して、１００ 代目に無細胞ウィルス　゛を単離することにより得られたものである。Ｒ２に関 して、インビボ複製能力の増加および攻撃ウィルスに対する防御力の増加との間 には、正の相互関係があるように思える。このため、複製速度は攻撃ウィルスに 対する防御力の指標として用いられてよい。

非常に有毒なＭｄ１１株の誘導体として、両方のＲ２クローンはこの病原型の他 のウィルスと良好な相同性を有するべきである。それらは、希なケースを除いて 、遺伝的に感受性の母性抗体陰性ニワトリにおいても肉眼的又は組織的病変が誘 導されない、という程度まで弱毒化されている。双方ともニワトリにおける逆継 代でより大きな毒性に復帰したが、しかしこのような復帰に伴う危険はいずれの ウィルスも未接種ニワトリへ広がらないことで最小限に抑制される。クローンの 病原性に関する憂慮は、母性抗体又は遺伝的耐性のいずれかで防御されたニワト リによって特に最小限に抑えられる。

ウィルスはインビトロでよく複製し、容易に検出しうるウィルス血症をインビボ で誘導する。双方とも非常に有毒なＭＤウィルスによる初期攻撃に対してＨＶＴ 単独の場合を超えた水準の防御を誘導し、ＨＶＴ＋Ｓ　Ｂ　−に価又はＲ２ワク チンの場合と大きく異なることはない。

細胞性ワクチンは、インビトロ培養クローニング培地から直接製造できる。無細 胞ウィルス接種物を製造するために、感染宿主組織又は細胞培養物からの細胞が 超音波処理されるか又は他の方法で破壊される。細胞砕片は遠心により除去され 、遠心物が接種物として回収される。

無細胞接種物の場合、ウィルスは既に記載したようにして単離できる。死滅ウィ ルスから又はウィルスから分離された免疫原成分からワクチンを製造することも 本発明の態様に含まれる。例えば、サブユニットワクチンは、免疫原性質を有す ると確認された１種以上の精製ウィルスタンパク質を死滅ウィルスから分離する ことにより製造することができる。

クローン化ウィルスの防御能力に関与する免疫原成分をコードする遺伝子が、当 業者に知られるような組換え技術により適切なベクター系中に挿入されることは 、本発明の範囲内にあると考えられる。組換えＤＮＡ技術を伴う方法は、今日で は科学上日常的なものとなり、同様な応用面において十分に説明されている（　 Ｅ、Ｐａｏｌｅｔｔｌａｔ　ａｔ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ、Ａ、８１：１９３ｌ９３−１９７（１９）。具体的には、この方法にお いては、防御免疫の誘導にとり重要であるクローンのタンパク質又は他の構成成 分の同定をまず最初に行う。次いで、ウィルスゲノム（遺伝子）の特定領域が内 在プロモーターと共に、制限エン決定により同定及び特徴付けされる。次いで同 定された遺伝子は、（死滅タンパク質産物を産生ずるため）細菌プラスミドのよ うな発現ベクター又は（生理換えＤＮＡワクチンウィルスを産生ずるため）トリ ヘルペスウィルスもしくはトリポックスウィルスのような生ウイルス中に継がれ る。他のタイプの発現ベクターを用いることも可能である。必要なプロモーター 配列で適正に組み立てられると、発現ベクターは挿入遺伝子の産物、即ちクロー ンの重要な免疫タンパク質を産生ずるようになる。インビトロで増殖されたベク ターにより産生されるならば、免疫タンパク質は培地から得られ、精製され、ニ ワトリの免疫用の死滅ワクチンとして、適切なアジュバント及び希釈剤と共に用 いられる。ニワトリへのそれらの自然感染力から選ばれた他のベクターは、組換 え生ウイルスワクチンとして、ニワトリ中に直接接種される。次いでワクチンは インビボで免疫タンパク質を産生じ、この結果、追加接種の必要性なしに直接防 御される。

従って、Ｒ２／２３及びＲ２／２９クローンから派生して本発明の範囲内である と考えられるウィルス剤には、無細胞及び細胞性ウィルス並びに生及び死滅ウィ ルスの双方が含まれることは上記から明らかである。ニワトリでマレク病ウィル スに対する免疫反応を誘発させるために有効である抗原もウィルス剤として考え られ、それらの抗原はＲ２／２３もしくはＲ２／２９クローンから直接誘導して も又は前記のように組換えウィルスにより発現させてもよい。

ウィルス剤は、生理塩水又は組織培地のような薬学上許容されるキャリア又は希 釈剤と共に、有効な免疫用量で処方され投与用に製造される。“有効な免疫用量 ”という表現は、んＩＤの育毒株による攻撃に対してニワトリで免疫を誘導する 量であると定義される。免疫は、ニワトリ群の防御レベルが非予防接種コントロ ール群の場合よりも有意に高いときにそのニワトリ群で誘導されたと考えられる 。防御レベルの１つの尺度は、防御インデックス（Ｐ　Ｉ）であり、これは非予 防接種Ｍ　Ｄウィルス攻撃コントｃｒ−ルのＭ　Ｄ％から予防接［ＭＤウィルス 攻撃群のＭＤ％を差し引き、その差を非予防接種ＭＤウィルス攻撃コントロール のＭＤ％で割り、その値に１００を掛けることにより計算される。典型的には、 ワクチンは少くとも約１５００　ＰＦＵ（プラーク形成単位）、好ましくは２０ ００〜５０００　ＰＰＵのウィルスを含有する。ワクチンは、ニワトリが免疫適 格性を獲得した後であればいつでも有効に投与で、それは保温（３日間のプレバ ッチ）の大体約１８８目であるが、それは通常にはバッチ処理後２４〜４８時間 以内に接種により投与される。

当業者に知られているような、適切なアジュバントもワクチン処方に含有させて よい。多くの場合において、予防接種効力は二価又は多価ワクチン中に他のウィ ルス剤と共にＲ２／２３又はＲ２／２９を混ぜることにより高めることができる 。

下記例は本発明を更に説明するためだけであり、特許請求の範囲で規定される本 発明の範囲を制限するためで本発明によるワクチンとして有用な２つのクローン は、ＣＥＦでＲ２復帰変異体を連続継代することによりＭｄ１１／７５Ｃ／Ｒ２ （以下Ｒ２と記される）から製造した。１００代目Ｋ１無細胞ウィルスを音波処 理重度感染ＣＥＦ培養物から単離し、３０クローンを創始するために用い、その 各々を１０１代目代目評価のためストックに増殖させた。これらのクローンをＲ ２／１〜Ｒ２／３０と命名した。

例２ 例１で得られた３０クローンを群に分け、各々をニワトリにおけるウィルス血症 、肉眼的病変及び組織的病変の誘導に関する６回の試験のうちの一つで評価した 。この実験で用いられたニワトリは、Ｒｅｇｉｏｎａｌ　ＰｏｕｌｔｒｙＬａｂ ｏｒａｔｏｒｙ）系統１５Ｉ６雄性及び系７１雌性のＦ１世代（１５Ｘ７）であ った。雌性親はＭＤウィルス及びＨＶＴに対する抗体を有しない非予防接種ブリ ーダー雌鶏であり、その子孫ニワトリは母性抗体に関して陰性と考えられた（　 ａｂ−）。ニワトリを１日齢目に２００００　ＰＦＵのウィルスで腹腔内接種し た。８週間にわたり隔離装置で保った後、それらを殺し、肉眼的病変について試 験した。血液サンプルをウィルス血症測定用に得て、組織を組織的病変について 試験した。各試験に関するコントロールには、（８７代目の）Ｒ２で接種された ２組が含まれ、１つの組はＭｄ５で接種し、１つは未接種とした。

Ｍｄ５ウイルスストツクは、−１９６℃で１０％ジメチルスルホキシドにより凍 結保存された感染組織培養細胞の懸濁液であった。評価の結果は下記表工で示さ れる通りである。９つの調製物は、肉眼的ＭＤ病変が存在せず、検出しうるウィ ルス血症を誘導し、その特徴は候補ワクチンウィルスとして望ましいと思われた 。肉眼的病変が存在しないことは、親Ｒ２ウィルスが１２回の反復試験の各々に おいて１例以上のニワトリで肉眼的病変を誘導していたことから、重要と思われ た。

例３ クローンＲ２／１３、Ｒ２／２２、Ｒ２／２３及びＲ２／２９を候補ワクチンウ ィルスとして更に評価のために選択した。例１に記載したニワトリ（１５Ｘ　７ 　ａｂ−）を、１日齢目に２００００　ＰＰＵのウィルスで腹腔内接種した。

２．４．８又は１８週間にわたり隔離装置で保った後、ニワトリを殺し、例２の ようにウィルス血症、肉眼的病変及び組織的病変に関して試験した。報告するウ ィルス血症値は、２つの白血球（ＷＢＣ）プール（各鳥３例）の平均ＰＦＵカウ ント、１０６バフイーコート細胞／培養液である。各処理において、体重は性別 に調整された１７週目における全生存トリの平均値として調べた。結果は表Ｉ＋ で報告されている。

例１の試験とは逆に、クローンＲ２／１３及びＲ２／２２は、Ｒ２親ウィルスの 場合と同様の頻度で肉眼的及び組織的病変を起こした。しかしながら、クローン Ｒ２／２３は肉眼的又は微視的病変を誘導しなかった。クローンＲ２／２９も比 較的非病原性のようであったが、しかし１例のニワトリは見掛上肉眼的ＭＤ病変 で１７週目に死んだ。このニワトリは組織学的に試験されず、１８週目に殺され た同一カゴ内において肉眼的又は組織的病変が存在しないことを考慮すれば誤診 であったかもしれない。Ｒ２／２３及びＲ２／２９の双方はウィルス血症を誘導 したが、しかしＲ２又は他のクローンより低い力価であった。各群の体重は未接 種コントロールの場合と異らなかった。

クローンＲ２／２３及びＲ２／２９はロックビル、ＭＤのアメリカン−タイプ・ カルチャー・コレクションにブダペスト条約に従い寄託され、各々寄託番号ＡＴ ＣＣＶＲ２３２８及びＡＴＣＣＶＲ２３２７が付された。

データをスチューデントを検定のボンフェロニ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）修正法 により分析したが、その場合に２群に関するｔの値は全群から計算された分散に 基づき、統計学的有意性に必要なｔの値は実施された対観察の数で調整した。

例４ 一連の実験を、毒性ＭＤウィルスでの攻撃に対してニワトリを免疫しうるＲ２／ ２３及びＲ２／２９の能力について評価するために行った。ニワトリは例２で用 いられたように１５×７であったが、但しそれらは３種すべての血清型、即ちＭ ｄ１ｌ／７５Ｃ（血清型１）、５Ｂ＝１（血清型２）及びＦＣｌ２６　（血清型 ３）により各ウィルスにつき１ｏ　ｏ　ｏ　ｐｐｕの用量で予防接種されたブリ ーダー雌鶏から得て、母性抗体に関して陽性と考えられた（　ａｂ＋）。最初の 実験において、各ニワトリを１日齢目に２０００　ＰＦＵのＲ２、Ｒ２／２３、 Ｒ２／２９、ＦＣｌ２６／２又はＦＣｌ２６／２＋ＳＢ−１（各２００ＯＰＦｔ ｌ）で接種し、修正ホースフォール−７くウアー（Ｈｏｒｓｒａｌ　Ｉ−Ｂａｕ ｅｒ）隔離装置にいれた。ＦＣｌ２６／２はＦＣｌ２６のクローンである。予防 接種後５回目に、各ニワトリを５００　ＰＦＵのＭｄ５ウイルスで攻撃させた。

。 トリを攻撃後約５６日間保ち、殺し、検死し、肉眼的病変の存在を記録した。実 験中に死んだトリは肉眼的病変に関して調べた。危険状態にあると考えられたト リはＭＤ病変に関して陽性のトリ＋病変なしに生存するトリであった。防御率は 非予防接種攻撃コントロールのＭＤ％から予防接種攻撃群のＭＤ％を差し引き、 非予防接種攻撃コントロールのＭＤ％で割り、１００を掛けて計算した。

３回の反復処理を行ったが、まとめた結果は下記表ＩＩＩに示される通りであっ た。Ｒ２／２３及びＲ２／２９双方のクローンはＨＶＴ　（ＦＣｌ２６／２）単 独の場合より大きく、Ｒ２又はＨＶＴ＋５Ｂ−１ワクチンの場合と統計学的に異 らない防御を示した。

帆乏 ２回目の攻撃実験は実質的に例４に記載したように行ったが、但し血清型１攻撃 ウィルスＲＢＩＢ、２９５及び２８７ＬをＭｄ５の代わりに用いた。結果は下記 表１ｖに示される通りである。

毀ゑ ３回目の攻撃実験は実質的に例４に記載したように行ったが、但し防御は様々な ニワトリ種で評価した。用いられた種は、１５Ｘ７ａｂ÷と２種の商業用ホワイ ト・レグホン（Ｗｈｉｔｅ　Ｌｅｇｈｏｒｎ）ストックＷＬ−Ａ及びＷＬ−Ｂで あった。ＷＬ−Ａ及びＷＬ−Ｂは双方とも血清型２及び３ＭＤワクチンをうけた 親からであり、その結果母性抗体に関して陽性と考えられた。結果は下記表Ｖに 示される通りである。

帆ユ クローンＲ２，／２３及びＲ２／２９を、細胞培養物中のウィルスストックの追 加継代で防御が減少するかどうか調べるために評価した。例４の操作を繰り返し たが、但しクローンは１０５代目又は１１５１０００ずれかまで行った。結果は 下記表Ｖｌに示される通りである。

鯉五 Ｒ２クローン＋陽性コントロールとして、低継代Ｍｄ１１を例２に記載したよう にａｂ−ニワトリで逆継代して、大きな毒性に復帰しうるウィルスの能力を観察 した。２．３及び４代目用の接種物は先代における接種ニワトリから誘導した。

加えて、各群は自然経路により拡散しうるウィルスの能力を観察するため接触コ ントロールニワトリを含むものとした。

ウィルス血症値は、代表ニワトリ２例からプールされた。血液の１つの０．２１ サンプルにおけるバフィーコート細胞から決定した。血液は各逆継代で２週間目 に集めた。アッセイはニワトリ又はアヒル胚繊維芽細胞培養物で標準操作により 三重に行った。抗体はＲ２ウィルスで感染された細胞からなる抗原を用いて間接 免疫ケイ光試験により試験ニワトリの血清で検出した。

逆継代の結果は表Ｖｌ＋に示される通りである。双方のＲ２クローンの病原性及 びウィルス血症力価は逆継代と共に増加した；はとんどの増加は第−及び第二逆 継代の間で生じた。逆継代２〜４で接種されたニワトリにおける肉眼的ＭＤ病変 の頻度に基づくと、クローン逆継代Ｒ２／２９　（１６／３６陽性）の毒性は逆 継代クローンＲ２／２３　（６／３６陽性）の毒性よりも大きいようであった（ Ｐ　＜　０．　０５）。重要なことに、どちらのＲ２クローンも、あらゆる逆継 代における接触コントロールニワトリで８週間にわたる肉眼的病変又は抗体の欠 如により示されるように水平に広がらなかった。

鯉盈 試験は、追加インビトロ継代がＲ２クローンの無毒性質を変えるかどうかを調べ るために行った。ａｂ−ニワトリを例４で記載されたように接種して攻撃した。

１０５及び１１５代目間の差異は肉眼的もしくは組織的病変、察されなかった。

双方のウィルスは親Ｒ２ウィルスよりも低病原性であり、低ウィルス血症力価を 誘導した。奇妙にも、体重は未接種コントロールよりもウィルス接種ニワトリの 方が多かった。結果は下記表Ｖｌｌ＋に示される通りである。

例１〇 ニワトリ胚繊維芽細胞培養物中におけるＲ２、Ｒ２／２３及びＦＣｌ２６／２の 増殖速度を比較した。培養物を各ウィルス約１００　ＰＦＵで接種し、ウィルス 当たり６つの重複培養物を１．３．５．７及び９日目に細胞性感染力について調 べた。結果は原接種物の滴定で調べられるようにＰＰＵ対インプットＰＰＵの比 率として表示した。

７日目に、ウィルス当たり更に６つの重複培養物を無細胞感染力について調べた 。無細胞ウィルスアッセイでは所定プレートをトリプシン処理し、細胞収集物を ５ＰＧＡ緩衝液１．０１に再懸濁し、超音波処理機（ＨｅａｔＳｙｓｔｅＩｌｓ 　Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ　、　Ｆａｒｉｉｎｇｄａｌｅ　、　Ｎ　Ｙ）によりパ ワーセツティング２及びワットセツティング４０で２サイクル（１５秒間及び５ 秒間）処理し、６０００Ｘｇで１０分間遠心した。上澄を除去し、０，１１で排 出培養物の接種により調べた。培地は３０分間にわたる吸収後に再補給した。

Ｒ２／２３、Ｒ２及びＦＣｌ２６／２のインビトロ複製の比較速度は表ＩＸに示 される通りである。Ｒ２／２３の力価（ＰＦＵ／インプットＰＦＵ）は１．３及 び５日目でＲ２の場合よりやや低かったが（Ｐ＜０．０５）、但し７及び９日目 にはＲ２と異らなかった。しかも血清型１ウイルスはＦＣｌ２６／２はど高い力 価までいつでも複製しなかった。しかしながら、ＰＰＵ／インプットＰＦＵの差 異は複製速度よりも感染効力で差異を反映するようである。

接種７日後における感染培養物の超音波処理による無細胞ウィルス回収率は、双 方の血清型１ウイルスに関して無視でき、ＦＣｌ２６／２の場合と比較してかな り低かった（Ｐｒｏ、０５）。

例１１ ９６ウエルプレート中におけるＣＥＦ培養物を血清型１．２及び３の選択ＭＤウ ィルスで感染させ、プラークが顕在化したときに冷アセトン−アルコール中で固 定した。培養物を血清型特異性モノクローナル抗体Ｈ１９及び２ＢＮ９０　（血 清型１）　、Ｙ５　（血清型２）及びＲ７８（血清型３）の連続希釈物で間接免 疫ケイ先決により染色した。力価は感染細胞抗原で陽性反応を生じた抗体の最大 希釈倍率であった。

表Ｘに示される血清型特異性モノクローナル抗体による抗原分析は、Ｒ２／２３ 、Ｒ２／２９及び親Ｒ２ウィルスが同様の結果を与えることを示した；各々は他 の血清型の抗体とではなく血清型１特異性抗体Ｈ１９及び２８Ｎ９０と強く反応 した。他の文献における報告によれば、ＣＶ　Ｉ　９８８／Ｒ１５ｐｅｎｓ及び ＣＶ　Ｉ　９８８／Ｃは双方ともＨ１９抗体との反応性を欠いたが、但しそれら と２８Ｎ９０との反応性により血清型１株として分類することができた。コント ロール抗体Ｙ５及びＲ７８は各々血清型２及び３抗原のみを染色した。

以上の詳細な説明は、単に説明のために示されており、修正及び変更が本発明の 精神及び範囲から逸脱せずに行えると理解されなければならない。

表Ｉ Ａｂ−ニワトリにおけるＲ２誘導クローンの評価肉眼的　組織的 ・・・　ＮＤ　ＮＤ　Ｏ／１２　０／１２ａ１日齢目に２００００　ＰＦＵのウ ィルスで接種された母性抗体に関して陰性のニワトリ。接種８週間後に観察を行 った。一連の試験を６回実施した；各試験に関するコントロールにはＲ２で接種 された２組を含み、１つの組はＭｄ５で接種し、１つは未接種であった。

−ン ｄ次の研究のために選択されたクローン表Ｉ＋ ４つのＲ２クローンの病原性８ ａ１日齢目に各ウィルス２００００　ＰＦＵで接種された母だ。組織検査は行わ なかった。

表１１１ 弱毒化Ｒ２クローンからのワクチンの比較効力３Ｒ２／２３　１Ｂ１５１　３１ ．４　６９ｂ　４９　７０ｇ、２ｂＲ２／２９　１７１５１　３３Ｊ　８７ｂ　 ４９　７０５．１ｂＦＣ１２Ｂ／２　３９１５１　７Ｂ、５　２４ａ　５０　７ ０７．６ｂＦＣ１２Ｂ／２＋５Ｂ−１１１１５０２２，０７８ｂ　４９　７１Ｂ 、ｇｂなし　５１１５１　１００．０　４５　５２３．８ａなしく無攻撃）　（ １／１５　Ｑ、Ｑ　１５　７５９．Ｂｈａ母性抗体に関して陽性のニワトリを１ 日齢口に各ウィルス２０００　ＰＦＵで接種し、予防接種後５日目に５００ＰＦ ＵのＭｄ５ウイルスで攻撃し、攻撃後８週間口に評価した。

ｂカイ二乗（防御）、ボンフニロニを検定（体重）による統計。値は異なる文字 表示のとき異なる（Ｐｒｏ、０５）。

表１■ 異なる攻撃ウィルスに対するＲ２クローンによる防御８ワクチン　攻撃　＋／ｌ ｏｔ　％ＭＤ　防御％Ｒ２／２３　ＲＢＩＢ　８／１７　４７．１　５０ａｂＲ ２／２９　Ｂ／１７　３５．３　８３ａＦＣ１２Ｂ／２　ｇ／１７　４７．１　 ５０ａＰＣ１２６／２＋５Ｂ−１０／１７　０．０　１０Ｏｂなし　１Ｂ／１７ 　９４．１ Ｒ２／２３　２９５　ｇ／１７　４７．Ｌ　３８ａＲ２／２９　１１／１８　８ Ｂ、８　１０ａＦＣ１２Ｂ／２　１１／１７　Ｂ４．７　Ｌ５ａＦＣＬ２Ｂ／２ ＋５Ｂ−Ｌ　ｔｏ／１７　５１１４　２３ａなし　１３７１７　７８．５ Ｒ２／２３　２＋１７Ｌ　Ｂ／１７　３５Ｊ　６２ａＲ２／２９　４／１７　２ ３．５　７５ａＦＣ１２Ｂ／２　９／１７　５２．９　４４ａＦＣ１２Ｂ／２＋ ＳＢ（９／１７　５２．９　４４ａなし　１５／１８　９３．８ １？２７２Ｂ　全部　２２１５１　４３．１　５１ａＲ２／２９　２１１５０　 ４２．０　５２ａＦＣＬ２８／２　３ｇ１５１　５４．９　３８ａＦＣ１２Ｂ／ ２＋５Ｂ−１１９１５１ＨＪ　５８ａなし　４４１５０　８８．０ ａ母母性体に関して陽性のニワトリを１日齢口に各ウィルス２０００　ＰＦＵで 接種し、予防接種後５日目に適切なウィルス５００　ＰＦＵで攻撃し、攻撃後８ 週間口に評価した。

ｂカイ二乗による統計。値は異なる文字表示のとき異なる（Ｐ＜０．０５）。

表Ｖ ワクチン　ニワトリ　＋／ｌｏｔ　％ＭＤ　防御％Ｒ２／２３　１５Ｘ７ａｂ＋ 　４／１７　２３．５　７６ｂｂＲ２／２９　８／１７　４７．１　５３ａｂＦ Ｃ１２８１３／１７　７８．５　２４ａＦＣ１２Ｂ＋！３Ｂ−１３／１８　１８ ．８　１１１ｂなし　１７／１７　１００．０ Ｒ２／２３　ＷＬ−＾　０／１Ｇ　０．０　１００ａＲ２／２９　１／１７　５ ．９　９４ａなし　１４／１５　９３．３ Ｒ２／２３　ＷＬ−Ｂ　２／１Ｂ　１２．５　８２ａＲ２／２９　１／１８　６ ．３　９１ａＰＣ１２Ｂ　３／１７　１７．６　７５ａＦＣ１２Ｂ＋５Ｂ−１０ ／１７　０．０　１００ａなし　１２／１７　７（１，６ プールされたデータ： ＦＣ１２Ｂ／２＋５Ｂ−１４／４９　８．２　９Ｌｂなし　４３／４９　１１７ ．８ る（Ｐ＜Ｑ、０５）。

表Ｖ＋ 防御に関する追加細胞培養継代の効果８ワクチン　継代　＋／ｌｏｔ　％ｐｏｓ 　防御％Ｒ２／２３　１０５　１６／３４　４７．１　５３ａｂＲ２／２３　１ １５　１２／３４　３５．５　８５ａＲ２／２９　１０５　１２／３２　３７． ５　８３ａＲ２／２９　１１５　１７／３４　５０．０　５Ｏａなし　３４／３ ４　１００．Ｏ ａａ性抗体に関して陽性のニワトリを１日齢口に各ウィルス２０００　ＰＦＵで 接種し、予防接種後５日目に５００ＰＦＵのＭｄ５ウイルスで攻撃し、攻撃後８ 週間口に評価した。データは２回の反復試験からプールした。

ｂカイ二乗による統計。値は異なる文字表示のとき異なる（Ｐ＜０．０５）。

表Ｖ＋＋ Ｒ２クローンの逆継代 Ｒ２／２３１　０　８／７　０／７　０　０／７　０／１１２　１５０　ｌ／１ ２　３／１２（０）　Ｏ（１／１０　０／１２３　Ｂ？　＋２７１２．　ｌ／１ ２　０　Ｇ／１２　０／１２４　５７　１２／１２　２／１２（０）　ＯＯ／１ １　０７１１Ｒ２／２９　１　３　８／７　０／７　０　０／６　０／Ｂ２　３ ７５　１１／１２　４／１２（０）　０　０／Ｉｔ　Ｏ／１１３　４８　Ｉｔ／ １２　４／１２（０）　ＯＯ／１２　０／１２４　５ｕ　１２／１２　８／１２ （０）　ＯＯ／１２　０／１２Ｍｄｌｌ　１　８　１／ｌ　Ｂ／６（Ｂ）　０　 ４７ｆｌ　６７６（０）２　２１３　０／ｌ　ＩＩ／１１（１１）　０　８／１ １　１２／１２（０）３　：１８０　ＮＤ　Ｉ２／１２（１２）　０　８／１１ 　ｔｏ／１１（０）４　３８２　ＮＤ　１１／１１（Ｉｔ）　０　８／１１　ｔ ｏ／１２（１）コント　Ｉ　０　０／４　０１５ ｏ−ル２　０　０／＋２　０７１２ ３　０　０／ＩＩ　Ｏ／１２ ４　０　０／１２　Ｇ／１２ のＰＦＵ　、血液は２週間目に集めた（逆継代１〜４）。

めた。陽性数／試験数 表Ｖｌｌ＋ Ｒ２クローンの病原性及び複製に関する追加組織培養継代の効果３ なし　Ｏ／１０　０．０　０／１０　０．０５２１．５．ａ　Ｏ，Ｏａａ母性抗 体に関して陽性のニワトリを１日齢口に各ウィルス２０００　ＰＦＵで接種し、 予防接種後５日目に５００ＰＦＵのＭｄ５ウイルスで攻撃し、攻撃後８週間目に 評価した。

ｂボンフエロニを検定による統計。値は異なる文字表示のとき異なる（Ｐ＜０． ０５）。

表ｌＸ Ｒ２クローンの複製 Ｒ２８，０ｂＬＢ３．２ｂ　５８８．２ｂ　８３３．４ａ１４８Ｌ、５ａ　１． ４ａＦＣ１２６／２１３．８ｃ　２３７．３ｃ　１１１９Ｊｃ　１３２３．５ｂ 　１９０５．８ｂ　１００．５ｂａ異なる文字で付記された同日の値はボンフェ ロニを検定によると異なる（Ｐｒｏ、０５）。値は６回反復の平均であり、ＰＦ Ｕ／インプットＰＦＵとして表示される。

表Ｘ モノクローナル抗体によるＲ２クローンの抗原分析Ｒ２１０２４００２５８００ （５０＜５ＯＲ２／２３　５１２００　２５６００　（５０＜５ＯＲ２／２９　 ５１２００　２５６００　（５０＜５０ＣＶ１９８ｇ／Ｒｉｓ＋）ｅｎｓ　（５ ０１２８００＜５０　＜５０ＣＶ１９８８／Ｃ（５０１２８００（５０（５０Ｓ Ｂ−１（５０＜５０　１２８００　（５０ＰＣ１２６／２　＜５０　＜ｓｏ　＜ ５０　２５６００ａ力価は間接免疫ケイ光アッセイにおいてウィルス抗原と反応 する抗体の最大希釈倍率の逆数である。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｍｄ１１／７５Ｃ／Ｒ２／２３もしくはＭｄ１１／７５Ｃ／Ｒ２／２９と実 質的に同じ特徴を有する弱毒化復帰変異ウイルスのクローン、および／または、 マレク病ウイルスに対する免疫反応を誘発させる上で有効なＭｄ１１／７５Ｃ／ Ｒ２／２３もしくはＭｄ１１／７５Ｃ／Ｒ２／２９の抗原から選択されるウイル ス剤の有効免疫用量を、薬学上許容されるキャリア又は希釈剤とともに含んでな る、ワクチン。
2. ２．ウイルス剤が細胞性調製物中における生ウイルスである、請求項１に記載の ワクチン。
3. ３．ウイルス剤が無細胞調製物中における生ウイルスである、請求項１に記載の ワクチン。
4. ４．ウイルス剤が細胞性調製物中における死滅ウイルスである、請求項１に記載 のワクチン。
5. ５．ウイルス剤が無細胞調製物中における死滅ウイルスである、請求項１に記載 のワクチン。
6. ６．ウイルス剤がサブユニットワクチンである、請求項５に記載のワクチン。
7. ７．ウイルス剤が発現ベクターの産物である、請求項１に記載のワクチン。
8. ８．マレク病に対するニワトリの防御のための、請求項１〜７のいずれか一項記 載のワクチンの使用。