JPH06508688A - グルコースに反応してインシュリンを産生する遺伝子工学的に処理された細胞に関する方法と組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 グルコースに反応してインシュリンを産生ずる゛　−工８的に　された　に　る 　法と本出願は１９９２年１月１３日の出願に係る米国出願第８１９．３２６号 の一部継続出願であり、１９９１年６月３日出願の米国出願第７１０，０３８号 の一部継続出願である。また更に１９９０年２月２０日出願の米国出願第４８３ ，２２４号の一部継続出願を構成する。引用することによりこれらの特許の開示 内容を本願の一部をする。

本発明は一般的に次の事項に関する。つまりグルコースに反応してインシュリン を分泌する能力を有するように工学処理した細胞の製法、培養、使用。糖尿病関 連の抗原の検出方法。−例として夏型糖尿病に使用するヒトインシュリン製造の 際における遺伝子工学的処理を行った細胞の使用方法。特定の態様において、本 発明は液体培養における生物工学的処理を行った細胞の発育及びこの細胞による グルコース仲介性のインシュリン放出の増加に関するものである。

インシュリン依存型糖尿病（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｅｎｔ　ｄｉａｂｅｔ ｅｓ　ｍｅｌｌｉｔｕｓ：　ＩＤＤＭ、若年型あるいは夏型糖尿病として知られ ている）は、ヒトの糖尿病の約１５％を占める。

ＩＤＤＭは、ＩＤＤＭの場合についてのみ、膵臓のランゲルハンス島のインシュ リン産生β細胞の特異的破壊が認められる点で、非インシユリン依存型（ｎｏｎ −ｉｎｓｕｌｉｎ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｄｉａｂｅｔｅｓ：　ＮＩＤＤＭ）と は明確に異なる。ＩＤＤＭの場合のβ細胞の破壊は、特異的な自己免疫攻撃の結 果と思われ、その際に患者自身の免疫機構がβ細胞を認識し破壊するが、ランゲ ルハンス島を包含する周囲のα細胞（グルカゴン産生性）あるいはβ細胞（ソマ トスタチン産生性）は破壊しない。

ＩＤＤＭでのβ細胞の認識及び破壊に係わる正確な機序は現時点では不明である が、免疫機構の「細胞性」成分と「体液性」成分の両者が関与していることは事 実である。ＩＤＤＭの場合、島β細胞の破壊は、究極的には細胞機構の結果であ る。つまり「キラーＴ細胞」がβ細胞を異物あるいは毒物と誤って認識し、破壊 するのである。免疫機構の体液成分は抗体産生性Ｂ細胞から構成されているが、 ＩＤＤＭ患者では、この体液性成分の活性か不適切であり、各種のβ細胞タンパ ク質に反応する抗体が血清中に存在する。細胞内タンパク質に対する抗体はβ細 胞の損傷の結果として発現するものと思われる。またこの損傷により免疫機構に とって過去に「見たことのない」タンパク質を放出するのである。

しかしながら、インシュリン、プロインシュリン、ｒ　３８ＫＤタンパク質」、 免疫グロブリン、６５ＫＤ熱シヨツクタンパク質、６４ＫＤ型及び６７、ＫＤ型 グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＢＡ）といった細胞表面エピトープに対する抗体 の出現が、ＩＤＤＭの発病と関連するものと考えられている（Ｌｅｒｎｍａｒｋ 、　１９８２年）。糖尿病患者の血清中の抗体は島ＧＬＵＴ−２グルコース輸送 体と相互作用する場合もある　（Ｊｏｈｎｓｏｎ等、１９９０年Ｃ）。

β細胞機能の進行性損失は、初期のＮＩＤＤＭ及びＩＤＤＭ。

更にＩＤＤＭにおける自己免疫性β細胞破壊以前ですら認゛められている。糖尿 病患者のランゲルハンス島においては、このような島はアミノ酸及びイソプロテ レノールといった非グルコース分泌促進物質に対しては相変わらず反応するにも かかわらず、グルコース誘発性インシュリン放出という特定の機能は喪失してい る（Ｓｒｉｋａｎｔａ等、　１９８３年）。

膵臓ランゲルハンス島の熱源うっ血（ｆｕｅｌ　ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ）への関 与の程度は、ペプチドホルモンを分泌することによる主要な代謝熱源の循環レベ ルの変動に対する反応能力により、大幅に影響を受けている。従って、島β細胞 からのインシュリン分泌は、アミノ酸や、グリセルアルデヒドといった三次糖類 、そして特にグルコースにより顕著に誘発を受けている。通常の島β細胞の血中 グルコース濃度の上昇に対する「感受」能力、及びグルコース量の上昇（炭水化 物を含有する食事を取った後に起こる）に反応して、インシュリンを分泌する能 力は、血中グルコース濃度をコントロールする上できわめて重大である。グルコ ース負荷への反応としてインシュリン分泌が増進されると、末梢組織特に筋及び 脂肪組織へのグルコースの取り込みを誘発することにより、健常者が慢性高血糖 にならないよう予防する。

成熟したインシュリンは、特異的な方法で結合したＡ及びＢの二つのポリペプチ ド鎖から成っている。しがしながら、β細胞でのインシュリン遺伝子による最初 のタンパク質産生物は、インシュリンではなく、プレプロインシュリンである。

この前駆物質は、次の二つの点で成熟インシュリンとは異なる。第一に、この前 駆物質は、ポリペプチドを粗面小胞体に導く所謂Ｎ末端「シグナル」シーケンス あるいは「前」シーケンスを有しており、この粗面小胞体でたんばく分解処理を 受ける。産生物であるプロインシュリンは、Ａ鎖とＢ鎖の間にＣペプチドとして 知られている付加的連結ペプチドをまた含んでおり、このＣペプチドにより分子 全体が正しく折り畳まれるようになっている。その後プロインシュリンは、ゴル ジ体まで運ばれ、そこで酵素的にＣペプチドの除去が始まる。この処理はゴルジ 体から特出した所謂分泌顆粒中で完了する。この分泌顆粒は、原形質膜へ運ばれ 、それと融合し、成熟ホルモンを放出する。

グルコースは、転写や、ｍＲＮＡ安定性、翻訳、タンパク質処理を増進すること により、新しいインシュリンの生合成を誘発する。またグルコースは、前貯蔵イ ンシュリンの放出を急速に誘発する。グルコース及び非グルコース分泌促進物質 の作用は、最終的にに＋とＣＡ＋◆のチャンネル活性の変化及び細胞内ＣＡ４＋ の増加を伴う最終共通経路を通じて起こり得る（Ｐｒｅｎｔｋｉ等、１９８７年 ；　Ｔｕｒｋ等、１９８７年）が、特定の熱源量の変化がらインシュリン分泌に 至る生化学的作用機序は、初期には多様である。グルコースの場合、β細胞中へ の運搬及び代謝は、分泌の為に絶対に必要である。そこで、グルコースの特異的 な誘発効果は解糖と関連経路を通過する速度の影響を受け、また比例していると の仮説が導き出される（　Ａｓｈｃｒｏｆｔ、１９８０年；　Ｈｅｄｅｓｋｏｖ Ｓ１９８０年；Ｍｅｇｌａｓｓｏｎ等、　１９８６年；　Ｐｒｅｎｔｋｉ等、　 １９８７年；　Ｔｕｒｋ等、１９８７年；　Ｍａｌａｉｓｓｅ等、１９９０年） 。３−０−メチルあるいは２−ジオキシグルコース等のグルコース非代謝性類似 体がインシュリン放出を誘発しないという事実の発見によりこの仮説に対する強 力な裏付けが得られている（　Ａｓｈｃｒｏｆｔ、１９８０年；　Ｍｅｇｌａｓ ｓｏｎ等、　１９８６年）。

島β細胞におけるグルコース代謝のコントロールの点で、ＧＬＵＴ−２として知 られている特定の促進拡散型グルコース輸送体とグルコース・リン酸化酵素であ るグルコキナーゼとを関連付ける証拠が相当量蓄積されてきている。両タンパク 質は、遺伝子ファミリーの構成要素であり、ＧＬＵＴ−２は、グルコース輸送体 タンパク質の５つの構成要素からなるファミリーの中ではグルコースに対し顕著 に高いＫｍとＶｍａｘとを有するという点で、特殊である。一方グルコキナーゼ は、ヘキソキナーゼのファミリーの中にあって、高いＫｍとＶｍａｘを有するＧ ＬＵＴ−２に対応している（　Ｗｅｉｎｈｏｕｓｅ、　１９７６年）。重要なの は両タンパク質がグルコースに対する親和性を有することであり、これによりグ ルコースの生理学的範囲での活性の点で劇的な変化がおこる。このことにより次 の仮説が導かれる。つまりこれらのタンパク質は、「グルコース感受性装置」と して協力的に働き、このような「装置」が解糖速度を調整することにより循環し ているグルコース濃度の変動に応じてインシュリン分泌を調整している（　Ｎｅ ｗｇａｒｄ等、１９９０年；　Ｊｏｈｎｓｏｎ等、１９９０年ａ）。

通常のβ細胞においては、グルコース運搬能力は解糖速度に比べて過剰である。

従って、グルコキナーゼが真に速度を規定する要素であるのに対して、ＧＬＵＴ −２輸送体はグルコース代謝のコントロールの点で概ねかなり任意的な役割を演 じている（　Ｍｅｇｌａｓｓｏｎ等、１９８６年；　Ｎｅｗｇａｒｄ等、１９９ ０年）。しかしながら、次のような予測がこの簡潔な説明に内在している。つま り、ＧＬＵＴ−２が非常に発現されにくい場合、ランゲルハンス島でのグルコー ス誘発性インシュリン分泌が減少する。これは実験的に作りだしたβ細胞機能障 害の動物モデル（Ｃｈｅｎ等、１９９０年；　Ｔｈｏｒｅｎｓ等、１９９０年ｂ ）と同様に自然発生的β細胞機能障害動物モデル（Ｊｏｈｎｓｏｎ等、１９９０ 年ｂ；０りｃｉ等、１９９０年）の研究により、最近実験的に強く裏付けられて いる見解である。またこのβ細胞機能障害の動物モデルは、ヒトのＮＩＤＤＭに おいて認められるβ細胞障害に明確な類似点を有している。更に島β細胞起源の ＲＩＮｍ５Ｆクローンのインシュリノーマ細胞は、ＧＬＵＴ−２の代わりに顕著 なグルコース輸送体として、グルコースに対して十分に低いＫｍとＶｍａｘを有 する輸送体であるＧＬＵＴ−１を分泌する。このことは、クローン細胞がインシ ュリン分泌促進物質としてのグルコースに反応しないという研究結果を説明して いると言えよう（Ｔｈｏｒｅｎｓ等、　１９８８年）。

現在特にＩＤＤＭにおいて糖尿病の診断と治療の双方に重大な欠陥が有る。−例 として、最も一般的な臨床診断検査である経口グルコース負荷試験（ｏｒａ　ｌ 　ｇ　１ｕｃｏｓｅｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｔｅｓｔ：　０ＧＴＴ）は、主観的判 定法であること及び進行した病状の患者を確認するのみの能力しかないと言った 点で、重大な欠点を有している。細胞質顆粒の高細胞抗体についての血清学的検 査（ＩＣＡ−ｃｙｔ）（Ｂｒｉｇｈｔ、１９８７年；　Ｇｌｅｉｃｈｍａｎｎ等 、１９８７年）は、糖尿病の発病を発見する診断手法であり、新鮮なヒト若しく は霊長類の膵臓の低温槽切片に患者抗体を結合させる手法である。この場合、新 鮮なヒト若しくは霊長類の組織が必要であると言う明確な不利益が有る。また更 に、次のような困難な点が有る。すなわち、有病誤診（偽陰性結果）の可能性（ ４０％）や、判定が主観的な二と、再現性が低いこと、特に損傷を受けたβ細胞 について知られている細胞表面指向性抗体の検出が不能であること（Ｄｏｂｅｒ ｓｏｎ等、１９８０年）などである。

糖尿病に対する新規の療法の開発についてはあまり進展が成されていない。恒久 的にインシュリン産生を取り戻す手段としてのランゲルハンス島あるいは膵臓の 部分的移植療法開発へ向けて相当な努力が成されている（　Ｌａｃｙ等、１９８ ６年）。しかしながら、この努力は、移植されたランゲルハンス島が患者本来の 島β細胞の破壊の原因となることに加え、自己免疫機構により認識され破壊され ていると言う研究結果や、組織の入手が困難であることからかなり難しいものと なっている。

糖尿病の主要な療法は、依然として一日に−、二回のインシュリンの自己注射に とどまっている。組換え型と非組換え型との両方法が、治療用のヒトインシュリ ンの工業的生産に現在採用されている。組換え型手法は一般的に、細菌若しくは 酵母での組換え型プロインシュリンの機能発現であり、引き続いて、成熟インシ ュリン分子のＡ、！：、Ｂの鎖の間の正しいジスルフィド結合を確実にする為に 、プロインシュリンの化学処理を行う。微生物が産生じたプロインシュリンを、 たんばく分解酵素の添加により、インシュリンへと処理する。

その後、成熟インシュリンペプチドを、添加したプロテアーゼからの精製と同様 に、細菌若しくは酵母から精製しなければならない。細菌による手法には４０の 異なった段階がある。非組換え型手法は、摘出したブタの新鮮膵臓あるいは膵臓 島からのブタのインシュリンの精製を一般的に含んでいる。上述の個々の手法は 、技術的に困難であること及び面倒であるとの欠点を有する。後者の手法は、イ ンシュリンを劣化させホルモンとして不活性化させ得る活性プロテアーゼを高レ ベルに含有する複雑なタンパク質様組織から、膵臓か構成されているという事実 によって、より難しいものとなっている。

従って、糖尿病の治療診断と現行の治療に使用するインシュリンの製法には、明 らかに改善が必要である。

本発明は、先行技術に存するこのような不利益に対処することを意図している。

一般的に、本発明は、組換え型ＤＮＡ技術と細胞培養手法をグルコースに応じて インシュリンを分泌する「人工β細胞」の製造の為に採用し得るとの発明者の発 見に基づいている。本発明は、人工β細胞の作成の手法を提供するものであり、 提案されているこの手法は、例えば糖尿病関連の抗原の検出、ＩＤｌ０Ｍの臨床 的治療、正確に折り重なったインシュリンの大量生産といった各種の応用が可能 である。その他の点で、本発明はゼラチン・ビーズ上の液体培地での人工β細胞 の増殖方法及び、このような組換え型細胞とグルコース含有緩衝体との膜融合に よるヒトインシュリンの増産方法を開示している。

先ず、グルコースに反応してインシュリンを分泌する細胞の組換え工学に向いた 実施例について述べると、本発明のこの側面は、一般的に遺伝子、望ましくは組 換え遺伝子であって、機能グルコース輸送体タンノくり質をコード化しているも のを含む、遺伝子工学的を処理された細胞に関する。ここで、この細胞は、グル コースに応じてインシュリンを分泌する。本発明のこの態様は、一般的に細胞が インシュリン分泌能力を有する場合、ＧＬＵＴ遺伝子など機能グルコース輸送体 タンパク質をコード化する遺伝子の導入を通して、このような普通の細胞をグル コース反応性細胞に変換しえるという研究結果に基づいている。究極的な糖尿病 治療に結び付けるという目的で考えると、ＧＬＵＴ−２を組換えグルコース輸送 体遺伝子として使用することが望まれている。これはＧＬｔＪＴ−２遺伝子がβ 細胞において認められ正常に機能が発現される遺伝子に対応するためであり、こ の遺伝子は他のタイプのグルコース輸送体よりも生理的に敏感に反応すると考え られている。

ここで使用している用語「遺伝子工学的処理（された）」細胞あるいは「組換え 」細胞は、機能グルコース輸送体タンパク質をコード化する遺伝子のような組換 え遺伝子を導入した細胞を意味している。従って、遺伝子工学的処理細胞は、遺 伝子組換えにより導入された遺伝子を含まない自然発生的細胞とは区別される。

遺伝子工学的処理細胞は、従って、人工的に導入した一つまたは複数の遺伝子を 含む細胞であり、遺伝子組換えにより導入される遺伝子は、ｃＤＮＡ遺伝子（即 ち、イントロンを含まない遺伝子）、ゲノム遺伝子のコピー、合成手法により生 産した遺伝子、そして（あるいは）特別に導入した遺伝子に自然には関連してい ないプロモーターに隣接して置かれる遺伝子である。

一般的に、組換え遺伝子として、遺伝子のｃＤＮＡバージョンを使用すると更に 便利である。ｃＤＮＡバージョンを使用すると、遺伝子のサイズが一般的にかな り小さいという点で有利であり、標的細胞原形質内移入という点で、ゲノム遺伝 子よりも容易に使用されていると考えられる。ゲノム遺伝子はｃＤＮＡ遺伝子よ りも一桁程変大きい。しかしながら、必要な場合に特殊な遺伝子のゲノムバージ ョンを使用する可能性を除外するものではない。

本発明の遺伝子工学的処理細胞は、一般的に分泌顆粒形成能を有する細胞から成 る細胞株に由来している。

一般に分泌顆粒は、その主な機能かペプチドの合成と分泌である咄乳動物細胞に 限定される。一般的に分泌顆粒は、内分泌細胞中に認められる。分泌顆粒は、ゴ ルジ体として知られている細胞内の膜構造の突出により形成されている。ポリペ プチドのホルモンは、通常プロホルモンとして合成され、より短い、成熟型ホル モンを生産する為にたんばく分解処理を受ける。

従って、例えばβ細胞中のインシュリン遺伝子のタンパク質産生物の最初のもの は、プレプロインシュリンである。この前駆物質は、所謂Ｎ末端に［ングナ／ｌ 、シーケンスｊを有するという点で、成熟インシュリンとは異なり、ポリペプチ ドを粗面小胞体に導く疎水性アミノ酸の伸長したものから構成されている。これ はまた、成熟インシュリン分子を構成するＡ、　Ｂ鎖間に「Ｃペプチド」として 知られている連結ペプチドを有する。

プレプロインシュリン分子は、小胞体に入る。その過程でその疎水性Ｎ末端の「 前」部位はたんばく分解的に除去される。処理済の正しく折り重なったプロイン シュリン分子は（依然としてＣペプチドを有してはいるが）、その後ゴルジ体へ と運ばれる。前駆物質がゴルン体を通して運搬されると、Ｃペプチド連結子の酵 素による除去が始まる。

分泌顆粒は、突出（出芽）工程と最終的な分離工程によりゴルジ膜から得られる 。結果的に生産された顆粒は、未処理のプロインシュリンと少量の成熟インシュ リンとの混合物を包み込んでいる。プロインシュリンからインシュリンへの処理 の多くは、分泌顆粒の形成の直後に行われている。またこれは、この処理に係わ る酵素の濃度が、この顆粒内で非常に高いという事実によるものである。分泌顆 粒は、グルコース等の分泌刺激に応じて、細胞の原形質膜の表面に運ばれる。

そしてそのすぐ後に、分泌顆粒は、原形質膜に融合して、貯蔵している成熟ホル モンを放出する。この機構の重要かつ特殊な特徴は、１）機能を果たすことか必 要な場合に、この分泌顆粒は特殊なホルモンを生産し貯蔵することと、２）顆粒 中に処理酵素か存在する為に前駆型ホルモンを成熟型に効果的に変えることが可 能であることである。従って、分泌顆粒を有しない細胞は、本発明のこの態様で の目的には使用出来ない。

従って、この態様で使用する細胞は、望ましくは下垂体細胞もしくは甲状腺細胞 等内分泌細胞より取り出す。特に適した内分泌細胞としては、脳下垂体前葉のＡ ＣＴＨ分泌細胞由来のＡｔＴ〜２０細胞、脳下垂体前葉の成長ホルモン産生細胞 由来のＧＨＩもしくは近い関係にあるＧＨ３細胞、あるいはこの腺由来の他の細 胞株があろう。

ＡｔＴ−２０細胞は、次のような理由により選択される。先ず、この細胞は、ウ ィルス・プロモーター／ヒトプロインシュリンｃＤＮＡ構成を伴う安定的形質移 入によりインシュリン遺伝子の役割が果たせる様に変更しである（　ＡｔＴ−２ ０細胞株のこの誘導は、ＡｔＴ−２０ｉｎｓとして知られている。親であるＡｔ Ｔ−２０細胞株とインシュリン発現ＡＬＴ−２０ｉｎｓ細胞株は、Ａｍｅｒｉｃ ａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃ−ｔｉｏｎ、１２３０１　Ｐａ ｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ　２０８５２より入 手可能である）。第２に、Ａｌ１−２０ｉｎｓ細胞は、正しく処理したインシュ リン・ポリペプチドを生産する為に、プロインシュリンｍＲＮＡとプレタンパク 質との処理か可能である。第３に、ｃＡＭＰ類似物質に対するインシュリン分泌 反応は、ハムスターの島β細胞由来の十分に分化したハムスター・インシュリノ ーマ（ＨＩＴ）細胞株に匹敵する。最後に、最近の発明者の実験室での研究によ ると、ＡＬＴ−２０ｉｎｓ細胞は、グルコキナーゼの高岡種型を十分量含有して おり、その為にこれがグルコキナーゼ遺伝子の作用が報告されている肝、島以外 の唯一の組織なのである。

Ｇ旧とＧＨ３細胞は、本来ラットの下垂体腫瘍から単離した同一群の細胞より得 られたものである。ＧＨ３細胞は、より多くの成長ホルモンを分泌し、更にプロ ラクチンを分泌するという点で、Ｇ旧細胞とは異なる（雨林は、Ａｍｅｒｉｃａ ｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎにて入手可能）。

組換えプレブロソマトスクチン遺伝子をこれらの細胞に導入すると、結果的に成 熟ソマトスタチン・ペプチドが分泌されるということが開示されているので、Ｇ 旧、ＧＨ３細胞は、本発明の実施に適すると考えられる（　５ｔｏｌｌｅｒ等、 １９８９年）。つまりこれはまた、内在性プレプロソマトスタチン遺伝子の処理 が、ランゲルハンス島のβ細胞で行われるということである。島ホルモン前駆物 質が下垂体前葉の成長ホルモン分泌細胞中で正確に処理され得るという研究結果 は、プロインシュリン処理もたぶんＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞中よりも更に有効的 にこれらの細胞で同様に行われるであろうことを示唆している。

通常インシュリノーマ細胞として知られているβ細胞由来の多くの細胞株もまた 本発明の実施に適しており、特に治療面での使用に関しては入手が容易である。

例えば、ハムスター・インシュリノーマ（ＨＩＴ−７１５）細胞は充分に研究さ れており、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｔｉ５ｓｕｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎよ り容易に入手出来る。多くのラット・インシュリノーマ細胞株も入手可能である 。ＲＩＮｍ５ＦとＲＩＮｒ１０４６−３８細胞株は、島β細胞の放射線誘発腫瘍 から得られている（　Ｇａｚｄａｒ等、１９８０年；　Ｃ１ａｒｋ等、１９９０ 年）。

ＭＳＬ−Ｇ２細胞は、島細胞腫瘍の肝臓転移細胞より得られている。これらの細 胞は、内在するインシュリン遺伝子の作用を維持する為に、動物宿主の体内で周 期的に継代する必要が有る（Ｍａｄｓｅｎ等、１９８８年）。最終的に、インシ ュリンプロモーターが操作するＴ抗原遺伝子が注入された遺伝子導入動物から、 最近はβ−ＴＣインシュリノーマ細胞株を得ており、その結果、島β細胞中にお けるＴ抗原の発現と、これらの細胞の不朽化が達成される　（Ｅｆｒａｔ等、　 １９８８年）。

ＲＩＮ　１０４６−３８細胞かＧＬＵＴ−２及びグルコキナーゼの両方を発現す ることか、発明者の実験室において明らかにされており（Ｈｕｇｈｅｓ等、１９ ９１年）、またＣ１ａｒｋ等により（１９９０年）、この細胞がグルコースに反 応するということも明らかにされている。この細胞からのインシュリン放出を誘 発するグルコース量は、最大でも０．５ｍＭである。しかしながら、これは通常 のβ細胞からのインシュリン放出を誘発するグルコース濃度を遥かに下回るもの である。最近の発明者の実験室での研究によるとＲＩＮ　１０４６−３８細胞の グルコースに対するこの高感受性は、高レベルのへキソキナーゼ活性によるもの と思われる。ヘキソキナーゼは、グルコキナーゼと同様の機能を発揮する（グル コース・リン酸化）が、遥かに低いグルコース濃度で機能する（ヘキソキナーゼ のグルコースに対するＫｍが約０．０５ｍＭであるのに対して、グルコキナーゼ では８ｍＭである）。以下に述べる組換えＤＮＡ工学の手法によってヘキソキナ ーゼの活性を低下させることにより、ＲＩＮ細胞を本発明の実施に使用可能なも のにできるかも知れないことが提案されている。

勿論、グルコース量に応じてインシュリンを分泌する細胞を作り上げる為に必要 な遺伝子工学的処理のタイプは、もとの細胞の特性に依存する。一般的に、本発 明者らの提案するところでは、分泌顆粒の形成能に加えて、当該遺伝子の機能作 用の発現能力が重要である請求められる機能遺伝子としては、インシュリン遺伝 子や、グルコース輸送体遺伝子、グルコキナーゼ遺伝子等がある。本発明の実施 にあったでは、一つあるいは複数のこれらの遺伝子が組換え遺伝子となる。従っ て、もとの細胞が機能的インシュリン遺伝子と機能的グルコキナーゼ遺伝子を有 し、これらの遺伝子がβ細胞におけるこれらの機能発現と同程度の量で機能を発 現するか、この細胞自体が機能的グルコース輸送体遺伝子を有しない場合、グル コース輸送体組換え遺伝子の導入が必要となる。反対に、もとの細胞が機能的に 、あるいは生理学的レベルで、上記の機能を発現しない場合、これら３種類全部 の導入が必要である。３種類全部の遺伝子の組換え用バージョンは、技術的に入 手可能であり、細胞へのこれらの遺伝子の導入の特殊技術が広く知られている。

したがって、これらの細胞の構築は、ここに特に開示をした内容がら、技術的に 充分に実施可能である。

上述のように、本発明の実施の為に特別に選択した内分泌細胞は、ＡｔＴ−２０ ｉｎｓ細胞である。この細胞は、正しく処理されたヒトインシュリンの生産を可 能にする為に、安定的に形質移入されている。また前述のように、一般的には組 換え細胞に機能的グルコース輸送体を供給する為に、ＧＬＵＴ−２同位酵素を使 用することが望ましい。本発明者は、これらの特色の双方を結合した遺伝子工学 的処理細胞を作り出しており、高レベルのＧＬＵＴ−２ｍＲＮＡ機能を発現する 細胞の型の一つをＣＴＧ−６細胞と名付けているが、この細胞が本発明の種々の 態様で特別に使用されるであろうことを、発明者は予測している。

一つ以上の前述の遺伝子の組換えバージョンの導入か必要である場合、それが遺 伝子工学的処理用に選択した細胞型において当該遺伝子の機能を効果的に発現さ せるプロモーターの管理下にあるというような、そのような遺伝子の導入が重要 である。一般的には、当該関心の対象となる遺伝子の機能を構成的（安定的）に 発現させるプロモーターの採用が望まれるであろう。

通常使用されている構成的プロモーターは、一般的に、ウィルス由来であり、サ イトメガロウィルス（ＣＭＶ）ブーロモーター、ラウス肉腫レトロウィルス（Ｌ ＴＲ）シーケンス、ＳＶ４０初期遺伝子プロモーターを含む。この構成的プロモ ーターの使用により、導入された遺伝子の高く安定したレベルの機能発現が確実 となる。当該関心対象の導入遺伝子由来の機能発現レベルがクローン細胞によっ て異なり得ると、発明者は認識しており、これは多分染色体ＤＮＡにおける組換 え遺伝子の装着部位の機能として考えられる。従って、その組換え遺伝子の機能 発現のレベルは、個々の形質移入実験により得られた個々のクローン細胞を評価 することにより選択することが出来る。細胞株が選択されると構成的プロモータ ーにより機能発現の希望するレベルでの恒久的維持が確実になる。インシュリノ ーマ細胞株中のインシュリン・プロモーターあるいは下垂体前葉細胞株における プロラクチンもしくは成長ホルモン・プロモーターといった遺伝子工学的処理に 使用する細胞のタイプに特異的なプロモーターを使用することが可能な場合もあ る。

本発明のいくつかの実施例は、親細胞株（遺伝子工学的処理を行う前の細胞株） と比較して低下したヘキソキナーゼ活性を有する遺伝子工学的処理を行った細胞 に関するものである。哺乳類には４つの同種型へキソキナーゼが知られている。

ヘキソキナーゼＩ、　ＩＩ、　ＩＩＩのグルコースに対するＫｍｓは非常に低く （親和性が高い）、約０．０５ｍＭである。ヘキソキナーゼＩＶは、グルコキナ ーゼであり、これはグルコースに対するＫｍが８−１０ｍＭと高い。島β細胞で は、グルコキナーゼが支配的なグルコース・リン酸化酵素である一方、培地型の クローン細胞の多くでは、低ＫｍヘキソキナーゼＩ同種型が支配的である。本発 明者の提案するところでは、遺伝子工学的処理に使用しているクローン細胞にお いてグルコキナーゼ以外のへキソキナーゼの高レベルの機能発現は、望ましい状 態よりも低いグルコース濃度でインシュリンを放出するという意味で、細胞をグ ルコース反応性にする。従って、ヘキソキナーゼ／グルコキナーゼ比が低いはと 、インシュリン反応は生理学的になる。

遺伝子工学的処理細胞においてへキソキナーゼの活性を低下させるためには、い くつかのやり方がある。

一つの方法としては、アンチセンスＲＮＡ分子の導入がある。アンチセンスＲＮ Ａ技術は、現在かなり広く確立されており、　［アンチセンスＪ　ＲＮＡ分子が 生産されるように、適切なプロモーターの後ろに送配向で標的遺伝子を並置する 工程を含むものである。そして、この「アンチセンス」構築物は、遺伝子工学的 処理細胞中に形質移入され、機能発現すると、ＲＮＡ分子を産生ずるが、このＲ ＮＡ分子は、標的遺伝子（この場合にはへキソキナーゼ遺伝子であるか）標的遺 伝子にすぐに結合し、この標的遺伝子により生産されたＲＮＡの処理及び翻訳を 防ぐ。

ヘキソキナーゼ作用を低下させる他の方法としては、陽陰選択（ｐｏｓｉｔｉｖ ｅ／ｎｅｇａｔｉｖｅ　５ｅｌｅｃｔｉｏｎ）として知られている技法によるも のがある。この技法は内在性のヘキソキナーゼ遺伝子を機能しないものとする働 きを持ったヘキソキナーゼ遺伝子分節の相同組換えの選択を含む。

他の実施例においては、本発明は、グルコース反応性インシュリン分泌の不足し ている哺乳動物に対するこの能力の付与についての技術に関する。この技術はグ ルコースに応じてインシュリンを分泌する遺伝子工学的処理細胞をこのような哺 乳動物に移植する技術を一般に含んでいる。本発明者が提案するところでは、ラ ンゲルハンス島の移植に現在使用している技術は、本発明に従って遺伝子工学的 に処理した細胞の移植に応用可能である。生物学的に適合性のあるコーティング で遺伝子工学的処理細胞を封入または被包することを含む技法も有る。この方法 では、被包化された細胞を免疫学的反応から守り、さらに遺伝子工学的処理細胞 のクローンの無秩序な増殖を防ぐのにも役立つカプセル・コーティングで、細胞 を被包・封入する。望ましい封入技術には、アルジネートーポリリジンーアルジ ネート（ａｌｇｉｎａｔｅ−ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ−ａｌｇｉｎａｔｅ）による 封入（被包）もある。この技術を使用して作成したカプセルは、一般的に数百の 細胞を含んでおり、その直径は約１ｍｍである。

他の方法としては、遺伝子工学的処理細胞を、Ａｍ１ｃＯｎ繊維に着床させるも のがある。細胞は繊維中でメツシュ状になり、これは半透性でありミクロ封入と 同様の方法で保護されている（　Ａｌｔｍａｎ等、１９８６年）。

封入（被包）化あるいは繊維着床完了後、一般的に約１，０００〜１０，０００ の細胞を、通常は大型ゲージ針（２３ゲージ）を通して腹腔内に注入することに より腹膜内に移植する。

多岐に渡るその他の封入（被包）技術が開発されており、本発明者が提案すると ころでは、本発明の実施に適用できる（例えば、Ｌａｃｙ等、１９９１年；　５ ｕｌｌｉｖａｎ等、１９９１年；ＷＯ９１１０４７０；　ＷＯ９１１０４２５； 　ＷＯ９０１５６３７；　Ｎｏ　９００２５８０　、　ＵＳ　５，０１１，４７ ２　；　ＵＳ　４，８９２，５３８　；　ＷＯ８９０１９６７゜を参照のこと。

これらはそれぞれ引用することにより本明細書の一部とする）。Ｃｙｔｏｔｈｅ ｒａｐｅｕｔｉｃｓ社は、封入化技術を開発しており、現在商品として入手可能 であり、本発明の実施においておそらく使用可能である。

マサチューセッツ州のＳｈｒｅｗｓｂｕｒｙにあるＢｉｏｈｙｂｒｉｄ社により 血管用の器具も開発されており、本発明の技術への応用もあり得る。

哺乳動物にグルコース反応性インシュリン分泌能を付与する為に使用し得る移植 技術に関して、最近Ｌａｃｙ等（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２５４：　１７８２−１７ ８４．１９９１年）と５ｕｌｌｉｖａｎ等（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２５２：　７１ ８−７２１．１９９１年）が述べている技術に特殊な利益が認められる場合が有 るということが注目されている。これらの文献は、引用することにより本明細書 の一部とする。これらの関心事としては、先ず封入化したランゲハンス島の皮下 への異種移植であり、次は「人工膵臓」における島組織の長期移植である。この 人工膵臓は動静脈シャントとして血管系に繋ぎ得るものである。これらの移植技 術は、先行技術の方法の「島組織」の代わりに、遺伝子工学的処理細胞を使用す ることにより、本発明に有益に応用出来る場合が有る。

更に発展させた実施例として、本発明は糖尿病の発病あるいはその危険性を判断 する手段として、サンプル中の糖尿病関連あるいは島細胞誘導性の抗体の検出技 術に関する。本発明の診断的あるいは抗体検出の態様についての使用のために、 遺伝子工学的処理細胞の多数の付加的タイプの重要性が証明されるであろう。

それは特に当該細胞の表面に選択された抗原のエピトープを示すタイプである。

模範的な抗原は、次のものを含む。特にＧＬＵＴ−２、グルタミン酸デカルボキ シラーゼ（６４ＫＤ島抗原及び抗原性のより低い６７ＫＤ型）、インシュリン、 プロインシュリン、島３８ＫＤタンハク質、６５ｋＤａ熱シヨツクタンパク質、 選択された免疫グロブリン、インシュリン受容器あるいは細胞質顆粒、あるいは その表面のいずれかの高細胞抗原のその他のタイプである。しかしながら、イン シュリンに対する抗体の反応が偽陽性反応に関係している点で、インシュリンを 分泌しない細胞を使用することが望ましい場合が有る。

一般的に、当該細胞は、量的に無制限に増殖し得る培養細胞株に関連エピトープ の機能発現をする遺伝子を導入することにより作成する。しかしながら、免疫学 的検出方法において、当該細胞がグルコース反応性であるか、あるいはインシュ リン分泌能を有するという必要性は無い。当該細胞がその表面で糖尿病発病に関 連するエピトープあるいは、更に一般的に高細胞のエピトープと関連したエピト ープの機能発現が必要である以外には何ら必要とされるものはない。更に、検出 がめられている抗体により認識されるエピトープの機能を当該細胞が発現するこ と以外に最終的には何ら必要とされるものは無いという点において、当該細胞が 実際に全タンパク質の機能を発現する必要性は無い。従って、本発明は抗原性エ ピトープを含有するサブフラグメントを完全抗原性タンパク質の代わりに使用す ることを意図している。

本発明による検出技術の第一段階には、一般的に糖尿病関連あるいは島細胞誘導 性の抗体を含有していると疑われる生体サンプルの入手が含まれる。一般的に、 生体サンプルには血清、血漿、血液、あるいはこのようなサンプルから単離した 免疫グロブリンが含まれる。

しかしながら、この技術はサンプルの採取源、由来に係わらず抗体を含むもので あれば何でも適用し得る。

次に、このサンプルは、糖尿病関連エピトープあるいは胚細胞機能発現性エピト ープの機能を発現する遺伝子工学的処理細胞と、機能発現をしたエピトープと当 該サンプル中に存在し得る抗体との間の免疫複合体の形成を可能にするのに有効 な条件のもとで、接触させられる。この点は、免疫複合体形成を助けるようなも のなら培養方法または条件はどのようなものでもよいので、本発明の効果的な実 施のために特に厳密なものでなれければならないとは考えられない。好ましい条 件としては、リン酸緩衝食塩水あるいはハンクス液といった等張性の媒体中での 当該細胞の血清培養かある。

最後に、この方法は、当該細胞により機能発現する糖尿病関連あるいは高細胞エ ピトープと当該サンプルに存在する抗体との免疫複合体の形成をテストすること により完了する。そこでは、陽性の免疫反応が当該サンプル中のそれぞれの抗体 の存在を示唆している。

このテストは、本発明の全体的な成功を得るために決定的なものであるとは考え られていない。免疫複合体形成の検出方法として、ＲＩＡＳＥＩＡ、　ＥＬＩＳ Ａ、間接免疫蛍光法等の多くのタイプが技術的に知られており、適用可能である 。一般的に、要求されているのは、当該サンプル中の免疫グロブリンと、遺伝子 工学的処理細胞の表面に機能発現したエピトープ間の相互作用の確認が可能な検 査・検出方法のみである。

上述の方法に関連して特定のアプローチをとることにより、特別な利益が期待で きる。そのような試みの一つとして、免疫複合細胞と、免疫複合抗体に親和性を 有する分子とを接触させる方法がある。一般的に、この結合分子は、当該免疫複 合抗体と結合する能力を有すれば、どのような分子でも使用可能であり、検出も されうる。理想的な結合配位子には、タンパク質Ａ１抗免疫グロブリン抗体、タ ンパク質Ｇ１　あるいは補体もはいる。結合配位子が免疫複合抗体の検出をする 際に都合のよいような関連標識を含むことが望ましい。典型的な標識としては、 放射性物質、蛍光性標識、酵素がある。アルカリホスファターゼ、ペルオキシダ ーゼ、ウレアーゼ、β−ガラクトシダーゼ、あるいは比色性基質の使用により検 出可能なその他の酵素を使用することにより良い結果を得る場合も少なくない。

その他の具体的な実施例としては、ビオチンのような関連配位子を使用する場合 も有る。この場合の配位子はアビジンあるいはストレプトアビジンと複合可能で あり、それによって、酵素あるいは他の標識を抗体あるいは結合配位子と結合さ せることになる。

標識を使用しての免疫複合細胞の検出は、セルソーター技術の応用により更に改 善され、自動化すら可能である。またこのセルソーター技術により、関連免疫複 合抗体を有する細胞を、同定あるいは定量することが可能である。特に、蛍光発 色セルソーター上の細胞の選別に結びつけて蛍光標識を使用することは、望まし い。本発明者が発見したところでは、このようなシステムは、単一の蛍光発色セ ルソーターを使用して一時間当たり４０〜５０の血清を検査することが可能であ る。

その他の実施例として、単純に顕微鏡スライドグラス上査を採用する場合もある 。この際にはポリリジン・コート・スライドグラス上で細胞を増殖させ、これを 被検サンプルに接触させ、その後免疫複合体形成の検出が可能な適切な試薬を使 用して処理する。顕微鏡での直接視により、複合体の存在を確認し得る。特に検 出試薬が蛍光マーカーで標識化した単一の抗体である場合は可能である。

このような実施例を拡張する例としては、抗原タンパク質の範囲内で特定の単一 のエピトープ（あるいは複数のエピトープ）の特徴を調べることに関するものが ある。この抗原タンパク質は、例えばＧＬＵＴ−２であり、糖尿病患者の血清中 の抗体により認識されるものである。突然変異体あるいはキメラタンパク質分子 は、組換えＡｔＴ−２０細胞での構築と機能発現が可能であり、また上述したよ うに患者の抗体の結合の検査に使用可能である。特定の欠損の後に突然変異体分 子に抗体が結合することができないことや、同様に、特異的な挿入の後にキメラ 分子への抗体の結合が可能であるということか、糖尿病に特異的なエピトープの 同定を可能にする。候補となるエピトープには、ＧＬＵＴ−２分子の多数の細胞 外「ループ」部位かある。このようなエピトープが同定されると、そのタンパク 質シーケンスの特異的な部位に対応する合成的ペプチドを生産し、より簡単な診 断手法を開発する為に使用することか可能である。診断手法の例としては、一つ の抗体・ペプチド複合体の形成の検出の為のＥＬＩＳＡあるいはＲＩＡの使用が 有る。

自己抗体により認識されるエピトープの機能を発現する遺伝子工学的処理クロー ン細胞選択の為の技術として、前述の方法を採用する場合もあると、さらに考え られている。つまり、例えば高細胞ｍＲＮＡに対して作られたｃＤＮＡを含み、 組換え細胞中でこれらＤＮＡの機能を発現し、ある既知の抗体成分をもつ組換え 細胞を選別するような一連のクローンを作り、上述のこれら特殊な抗原に加えて 、糖尿病関連の抗原を同定することができる。

更に発展した実施例としては、血清、血漿、血液のような生体サンプル中、ある いはそれから単離された免疫グロブリン中の糖尿病関連抗体の検出方法に、本発 明は関する。この方法は、糖尿病関連の抗体を含むと疑われるサンプルと、無損 傷のＧＬＵＴ−２機能発現性細胞とを、ＧＬＵＴ−２を伴って存在し得る抗体の 相互作用を効果的に可能にする条件で接触させることと、その後の当該細胞によ るグルコースの取り込みの程度を判定することとを含んでいる。グルコースの取 り込みか阻害されるなら、それはサンプル中に糖尿病関連抗体が存在することを 意味している。

二のような実施例に使用する望ましい細胞は、ＧＬＵＴ−２機能発現性の遺伝子 工学的処理細胞と、特にＧＬＵＴ−２機能発現性ＡＬＴ−２０ｉｎｓ細胞である 。この種の評価をするための適切な条件には、ＩｇＧサンプルと共に当該細胞を 培養し、３−〇−メチルーβ−Ｄ−グルコースを使用してグルコースの取り込み の程度の測定がある。

更に、重要な実施例としては、インシュリンの製造、特にＩＤＤＭの治療に使用 し得るヒトインシュリンの製造において、本発明の遺伝子工学的処理細胞を使用 する方法に関するものがある。ある態様において、遺伝子工学的処理を施した人 工β細胞を培地で増殖させ、次にグルコース含有の緩衝液に接触させる。このよ うに細胞を刺激して、回収可能で周囲の媒質がら精製可能なインシュリンを生産 し、分泌させる。本発明のこの態様に関して、ＣＴＧ−６遺伝子工学的処理細胞 の使用は特に有用であるが、グルコースに反応してインシュリンを分泌する様に 作られた細胞であれば、いずれも使用可能である。

本発明者か発見したところによると、上記の方法でヒトインシュリンを生産する 特に便利な方法は、液体培地で発育させた人口β細胞のグルコース刺激である。

それで、当該組換え細胞はカラム中に保持し、クレブスリンガ−塩（ＫＨ２）溶 液、ｐＨ７，４のような生理的ｐＨの緩衝液をカラムに流す。インシュリンの生 産と分泌を刺激するために、当該細胞のカラムとＫＨ２，５ｍＭグルコースのよ うなグルコース含有緩衝液で融合させる。この段階でカラムからのインシュリン 含有溶出液を回収する。この溶出液は、より大量のヒト用高品質インシュリンの 精製用の理想的な原材料となる。

ｒＤＤＭ冶療で使用するヒトインシュリンの単離及び精製の為のその他の方法は 、ＣＧＴ−６細胞あるいは他のＧＬＵＴ−２形質移入のＡｔＴ−２０細胞株から インシュリンを直接精製する方法である。この方法は現在実行可能である。

というのは、本発明者によりＧＬｔｌＴ−２を形質移入すると、ＣＧＴ−６細胞 中に約５倍の量の細胞内インシュリンを作り得ることが実証されているからであ る。従って、これら組換え細胞は、ＣＧＴ−６様細胞からヒトインシュリンを大 量に生産可能な程の充分量のインシュリンを含有している。

図１　組織及びＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞株中のＧＬＵＴ−２ｍＲＮＡの存在を実 証するノーザン法。各レーンは、総ＲＮＡ量、６μｇを含む。サンプルは未形質 移入（ＡｔＴ−２０ｉｎｓ）及びＧＬＵＴ−２形質移入（ＡｔＴ−２０ｉｎｓ　 ＣＧＴ−５及びＣＧＴ−６）　ＡＬＴ−２０ｉｎｓ細胞株からと同様、肝臓、下 垂体前葉、島組織試料から調整した。当該プロットを放射線標識化アンチセンス ＧＬＩＪＴ−２ｃＲＮＡを使用し調査をした。またゲル負荷用コントロールとし て１８Ｓ　ｒＲＮＡを調査するアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用した（Ｃ ｈｅｎ等、１９９０年）。

図２　組織、未形質移入細胞（ＡｔＴ−２０ｉｎｓ）及びＣＭＶ／ＧＬＩＪＴ− ２の構築物（ＡｔＴ−２０ｉｎｓ　ＣＧＴ−５及び−６）を形質移入された細胞 におけるＧＬＵＴ−２の免疫プロット法。

図３．　ＡＬＴ−２０ｉｎｓ細胞へのグルコースの輸送。図３Ａ：未形質移入Ａ ＬＴ−２０ｉｎｓ細胞（親）及びＧＬｔＪＴ−２形質移入ＣＧＴ−５とＣＧＴ− ６に関するグルコース濃度の機能としての３−Ｏ−ＣＨ３−グルコースの取り込 みの測Ｚ　シンボル記号をこのパネルの左上端に示す。図３Ｂ　：　ＧＬＵＴ− ２形質移入株、ＣＧＴ−５及びＣＧＴ−６に関するグルコース取り込みの逆数プ ロット対３−Ｏ−ＣＨ３〜グルコース濃度。グルコース輸送に関する算出、Ｋｍ とＶｍａｘ値、及びシンボル記号をパネルの左上端に示す。図３Ｃ：未形質移入 ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞（親細胞株）に関してのグルコース取り込み逆数プロッ ト対３−Ｏ−ＣＨ３−グルコース濃度。グルコース輸送のＫｍとｖＩＩｌａｘ値 を算出し示す。図３８．Ｃ間のスケールの相違に注意。

図４　グルコースに反応してのＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞のインシュリン放出及び ｆｏｒ３ｋｏｌｉｎ誘発性分泌のグルコース活性化。図４Ａ：３時間０−２０ｍ Ｍの範囲内での様々なグルコース濃度、あるいは０．５μＭ　ｆｏｒｓｋｏｌｉ ｎ　（Ｆ）あるいは０．５μＭ　ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ＋２．５ｍＭグルコース（ ＦＩＧ）と共に培養した未形質移入（ＡＬＴ−２０ｉｎｓ）及びＧＬＵＴ−２形 質移入（ＣＧＴ−６）　ＡｔＴ−２０細胞株インシュリン放出を測定した。

個々の分泌窩に存在する総細胞タンパク質にデータを標準化し、窩の状況により ３−９の独立した分泌について平均±ＳＥＭを表す。＊、　０ｍＭグルコースで の分泌と比較してｐ＜０．００１；　＃、　０ｍＭグルコースでの分泌と比較し てｐ＝０００２゜図４Ｂ：インシュリン放出は、凡例に示した組み合わせでの０ ．５μＭ　ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ　（Ｆｏｒｓ）と２．５ｍＭグルコース（Ｇｌｃ ）で培養した未形質移入（ＡｔＴ−２０ｉｎｓ）とＧＬＵＴ−２形質移入（ＣＧ Ｔ−６）　ＡｔＴ−２０ｉｎｓ株から測定した。個々の分泌窩での総細胞ＤＮＡ にデータを標準化して３−９の独立した測定値につき平均値±ＳＥＭとして表し た。

−Ｇｌｃ、　−Ｆｏｒｓコントロール関連の分泌における統計的に有意な増加が 記号＊により示されている（　ｐ＜０．００１）。

図５　特異的な免疫複合体の検出の為のＦＡＣ５技術の有用性。グラフ１及びグ ラフ２は抗ＧＬＵＴ−２抗体Ｘ６１７によるＧＬＵＴ−２機能発現性ＡｔＴ−２ ０ｉｎｓ細胞の処理及びフィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）で標 識化した抗うビットＩｇＧ第二抗体により処理することで得る。グラフ３及び４ はＧＬＵＴ−２機能発現性ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞と共に前培養した後抗体Ｘ６ １７と共に培養した細胞を表す。図６８でＧＬｔｌＴ−２の機能を発現しない親 ＡｔＴ−２０ｉｎｓで同様の実験を行った。これらの細胞において裸抗体とＧＬ ＵＴ−２機能発現性細胞で事前吸収をした抗体との間に何ら相違は認められない 。

図６　患者の血清についての予備的データ。第二抗体（フエコエリトリンで標識 化した抗ヒト・グロブリン）のみと培羨したＧＬＵＴ−２形質移入ＡｔＴ−２０ ｉｎｓ細胞の蛍光スペクトルを図６Ａに示す。図６Ｂでは、正常な患者から単離 した血清と共にＧＬＵＴ−２形質移入細胞を培養し、結果的に図６Ａに示したコ ントロールに比較して蛍光強度の変化か見られた。図６０では、新規発病のＩ型 糖尿病患者の血清で細胞を培養しており、ここでは結果的に更に大きな変化を得 た。

図７．１ｇＧサンプルのグルコース取り込み効果。非糖尿病被験者（閉鎖環）及 び新規発病のＩＤＤＭ患者（開環）由来の精製したＩｇＧの散在性ラット島細胞 （左図）、ＧＬＯＴ−２機能発現性ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞（中央図）、ＧＬＵ Ｔ−１機能発現性ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞（右図）による３−０−メチル−β− Ｄ−グルコースの取り込みについての効果を測定した。

島細胞とＧＬＵＴ−２機能発現性ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞に対するデータ・ポイ ントは６つの非糖尿病ヒト血清と７つの新規発病ＩＤＤＭ患者の血清から精製し たＩｇＧと共に培養した後側々の細胞型による３−０−メチル−β−Ｄ−グルコ ース取り込みの平均値（±ＳＥ）である。ＧＬＵＴ−１機能発現性ＡｔＴ−２０ ｉｎｓ細胞についてのデータは５人の非糖尿病の個人及び６人の新規発病のＩＤ ＤＭ患者由来のものである。非糖尿病の血清由来のＩｇＧ曲線と島細胞及びＧＬ ＵＴ−２機能発現性ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞におけるＩＤＤＭ患者血清由来のＩ ｇＧ曲線との間の率の相違はｐ＜０　、０５で有意である。

図８．　ＧＬＵＴ−２機能発現性ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞に結合する特異的１ｇ Ｇ０特異的結合は未形質移入ＡＬＴ−２０ｉｎｓ細胞を使用してＲ２で認められ る細胞のパーセンテージをＧＬＵＴ−２機能発現性ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞を使 用してＲ２において認められる細胞のパーセンテージから減算することにより決 定する。非糖尿病人口からＩＤＤＭ患者人口の分離はｐ〈０゜００旧で有意であ る。

図９　グルコースとｆｏｒｓｋｏｌｉｎによる潅流中のＧＬｔｌＴ−１形質移人 ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞からのインシュリン放出対ＧＬｔＪＴ−２形質移入Ａｔ Ｔ−２０ｉｎｓ細胞からのインシュリン放出。

約ｓｏｘ　１０６の細胞に０ｍＭグルコース（Ｉ、ＩＩＩ及びＶ相）、５ｗ＋Ｍ グルコース（■及び■相）、あるいは５ｍＭグルコース＋〇、５μＭ　ｆｏｒｓ ｋｏｌｉｎ　（Ｖｌ相）を含むＨＢＢＳ緩衝液を０．５ｍｌ／分の流速で潅流し た。溶出した媒体サンプルを（２５分毎に）　１．２５ｍ１分割量で採取し、放 射免疫測定法でインシュリン量を測定した。ＣＧＴ−６、ＧＬＵＴ−２形質移人 ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞；　ＧＴＩ−１５、ＧＬＵＴ−１形質移人ＡｔＴ−２０ ｉｎｓ細胞；　ＡｔＴ−２０ｉｎｓ、親細胞株。一つの典型的な実験の結果を示 す。

「人工　細胞の遺−工“的処理 インシュリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）は、インシュリン産生β細胞の自己免疫 破壊により引き起こされる。

ＩＤＤＭ治療の方法として、島移植が広範囲にわたり研究されているが、充分な 組織の入手が困難という問題を伴っている。本発明によれば、非晶細胞型を代謝 信号に反応してインシュリンを分泌するように遺伝子工学的処理可能な場合、島 組織供給に関する問題の解決が可能である。というのは、このような細胞が生体 外で無限に増殖可能だからであるという本発明者の認識に部分的に基づいている 。最終的には、この細胞が■型糖尿病の治療法である毎日のインシュリン注射に 変わりう　る。

膵臓ランゲルハンス島の熱源うっ血（ｆｕ６１１１ｅｍｅｏｓｔａｓｉｓ）への 関与は、ペプチドホルモンを分泌することによる主要な代謝熱源の循環レベルで の変動に対する対応能力により、大幅に影響を受けている。従って、島β細胞か らのインシュリン分泌は、アミノ酸や、グリセルアルデヒドといった三次糖類及 び特にグルコースにより、顕著に刺激を受けている。これら多岐にわたる分泌促 進物質の作用は、最終的にに＋とＣａ”十のチャンネル活性の変化及び細胞内Ｃ ａ”十の増加を伴い、最終共通経路を通じて起こりうる（Ｐｒｅｎｔｋｉ等、１ ９８７年；　Ｔｕｒｋ等、１９８７年）。一方、特定の熱源量の変化からインシ ュリン分泌に至る生化学的作用機序は、最初は多様である。グルコースの場合、 この糖のβ細胞への運搬及び代謝が分泌の為に絶対に必要である。そこで、グル コースの特異的な誘発効果は、解糖と関連経路を通過する速度の影響を受け、ま た比例しているとの仮説が導きだされる（　Ａｓｈｃｒｏｆｔ、　１９８０年； 　Ｈｅｄｅｓｋｏｖ、１９８０年；　Ｍｅｇｌａｓｓｏｎ等、　１９８６年；　 Ｐｒｅｎｔｋｉ等、　１９８７年；　Ｔｕｒｋ等、１９８７年；　Ｍａｌａｉｓ ｓｅ等、１９９０年）。３−０−メチルあるいは２−ジオキシグルコース等のグ ルコース非代謝性類似体がインシュリン放出を誘発しないという事実の発見によ り、この仮説に対する強力な裏付けが存在する（Ａｓｈｃｒｏｆｔ、１９８０年 ；　Ｍｅｇｌａｓｓｏｎ等、１９８６年）。

島β細胞におけるグルコース代謝のコントロールの点で、ＧＬＵＴ−２として知 られている特定の促進拡散型グルコース輸送体とグルコース・リン酸化酵素であ るグルコキナーゼを関連づける証拠が、相当量蓄積されてきている。両タンパク 質は、遺伝子ファミリーの構成要素であり、ＧＬＵＴ−２は、グルコース輸送に 対してＫｍとＶｍａｘが明らかに高いという点で、グルコース輸送体タンパク質 の５つの要素からなるファミリー（ＧＬＵＴｓｌ−５；Ｂｅ１１等、１９９０年 ；　Ｔｈｏｒｅｎｓ等、１９９０年ａ）の中では特殊である。グルコキナーゼ（ ヘキソキナーゼ■しても知られている）は、ヘキソキナーゼファミリーの中で高 いＫｍとＶｍａｘが高いＧＬＵＴ−２に対応するものである（Ｖｅｉｎｈｏｕｓ ｅ、１９７６年）。重要なことは、両タンパク質がグルコースに対して親和性を 有することである。そしてこの親和性により、グルコースの生理学的範囲での活 性に劇的な変化が起る。このことから、次の仮説が導かれる。つまり、これらの タンパク質は、　「グルコース感受性装置」として協力的に働き、この「装置」 は、解糖速度を調整することにより循環性グルコース濃度の変動に応じて、イン シュリン分泌を調整する（　Ｎｅｗｇａｒｄ等、　１９９０年：　Ｊｏｈｎｓｏ ｎ等、　１９９０年ａ）。

通常のβ細胞では、グルコース運搬能力は、解糖速度に比べて過剰である。従っ て、グルコキナーゼが真に速度を規定する要素であるのに対して、ＧＬＵＴ−２ 輸送体は、グルコース代謝のコントロールの点で、概ねがなり任意的な役割を演 じている（　Ｍｅｇｌａｓｓｏｎ及びＭａｔｃｈｉｎｓｋｙ、１９８６年；　Ｎ ｅｗｇａｒｄ等、１９９０年）。　しかしながら、次のような予測がこの簡潔な 説明に内在している。つま゛す、ＧＬＵＴ−２が非常に発現しにくい場合、ラン ゲルハンス島でのグルコース誘発性インシュリン分泌に損失が生じる。これは、 実験的に作りだしたβ細胞機能障害動物モデル（Ｃｈｅｎ等、１９９０年；　Ｔ ｈｏｒｅｎｓ等、１９９０年ｂ）や、自然発生的β細胞機能障害動物モデル（Ｊ ｏｈｎｓｏｎ等、１９９０年ｂ；０りｃｉ等、１９９０年）による研究がら最近 強い実験的裏付けを受けている見解である。

ＩＤＤＨの治療には、伝統的にはインシュリンの補充、古典的なものでは対外か らの投与、また実験的なものでは、島あるいは膵臓切片の移植が行われてきた。

後者の方法は、島を多数単離することが困難で費用も掛かるため、広く適用する ことが望ましいとは言えない。

本発明は、その他の方法に関する。生体外で無限に増殖可能でグルコースの刺激 によりインシュリンを分泌することのできる非晶細胞である「人工β細胞」を遺 伝子工学的に作りだす分子的技術を使用する方法である。

下垂体細胞株ＡｔＴ−２０ｉｎｓは、重要な点でβ細胞と似ているため、ここで 使用するのに適当である。まず、ウィルスプロモーター／プロインシュリンｃＤ ＮＡ構成の安定した形質移入によりインシュリン遺伝子の機能が発現するように この細胞を変更しである（　Ｍｏｏｒｅ等、１９８３年）。第二に、ＡｔＴ−２ ０ｉｎｓ細胞は正しく処理したインシュリン・ポリペプチドを産生ずるためにプ ロインシュリンｍＲＮＡ及びプレタンパク質の処理が可能である。

第三に、ｃＡＭＰの類似体に対するこの細胞の分泌反応は十分に分化したハムス ター・インシュリノーマ（ＨＩＴ）細胞株に匹敵する（　Ｍｏｏｒｅ等、１９８ ３年）。最後に、ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞はグルコキナーゼの高岡種型を十分量 含有しており（Ｈｕｇｈｅｓ等、１９９１年）、そのためにこれがグルコキナー ゼ遺伝子の作用が報告されている肝、島以外の唯一の組織である。

他方、ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞は、二つの重要な点で島と異なっている。第一に 、グルコースに応じてインシュリンを分泌することはなく、第二に、ＧＬＵＴ− ２ではな（Ｋｍの低いＧＬＵＴ−１グルコ一ス輸送体ｍＲＮＡを発現する（　Ｈ ｕｇｈｅｓ等、１９９１年）。本発明者は、ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞でのグルコ ース反応性の欠乏が能力の欠如あるいは通常の島に関連したグルコース取り込み の親和性の変化により説明可能であるという仮設をたてた。この仮説を確認する ために、ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞にＧＬＵＴ−２ｃ　ＤＮＡで安定的に形質移入 を行った。当該発明者は次のような意外な結果を得た。すなわち、この方法で遺 伝子工学的に作られた細胞は、用量・反応曲線が通常の島のものとは異なっては いるが、グルコース誘発性インシュリン分泌能力及び非グルコース分泌促進物質 誘発のグルコース増強作用を有していたのである。

ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞の遺伝子工学的処理には、一般的に、適切なＧＬＵＴ− ２機能発現媒体の構築、媒体を使用したＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞の形質移入及び 形質移入物質の選定が含まれた。これを完了するには、ラット島ＧＬＵＴ−２ｃ ＤＮＡ　（Ｊｏｈｎｓｏｎ等、１９９０年ａ）を媒体ｐＣＭＶ４　（Ａｎｄｅｒ ｓｏｎ等、１９８９年）の誘導体である媒体ｐＣＢ−７中にクローン化させた。

媒体ｐＣＭＶ４は、そのサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーターのすぐ次 の段階である。ｐＣＢ−７は、ＤａｌｌａｓにあるＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ 　Ｔｅｘａｓ、　Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｅｎｔｅｒの 生化学教室のＤｒ、　Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｒｏｔｈ及びＤｒ、　ＣｏｌＣｏ１１ｅ ｅｎＢｒｅにより構築され、本発明者に提供された。これはハイグロマイシン抵 抗遺伝子を含有するという点でｐＣＭＶ−４と異なっている。このようにして、 ｐＣＢ７／ＧＬＵＴ−２構築物で形質移入をおこなった細胞は、ハイグロマイシ ンでの処理によって媒体ＤＮＡが細胞のゲノムに安定して組み込まれるという理 由で選択された。ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞は、エレクトロポレーション（ｅｌｅ ｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用してこの構築物により形質移入され、安定し た形質移入体をハイグロマイシンにより選んだ。

ＧＬＵＴ−２ｍＲＮＡの機能発現を、ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞のプロット・ハイ ブリダイゼーション分析により評価した。この細胞は、サイトメガロウィルス（ ＣＭＶ）プロモーター／ＧＬＵＴ−２雑種遺伝子を形質移入しであるものか、あ るいは未形質移入のもののどちらかであり、ラットの肝、ランゲルハンス島およ び下垂体前葉組織の抽出物中に含まれている。放射性標識されたＧＬＵＴ−２ア ンチセンスＲＮＡプローブ（Ｊｏｈｎｓｏｎ等、　１９９０年ａ　；　Ｃｈｅｎ 等、１９９０年）を四種のＧＬＵＴ−２形質移入ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞株（Ｃ ＧＴ−１、ＣＧＴ−２、ＣＧＴ−５、ＣＧＴ−６）、未形質移入ＡｔＴ−２０ｉ ｎｓ細胞及び三種の一次組織由来の同量のＲＮＡを含む一つのプロットに混合し た（図１）。ＧＬＵＴ−２ｍＲＮＡの恒常状態での濃度はＣＧＴ−５、ＣＧＴ− ６において最も高く、前者はラット島の約半量、後者は同量のＧＬＵＴ−２ｍＲ ＮＡを含有していた。さらに比重走査を使用し１８５ｍＲＮＡプローブで得られ る信号に標準化することにより測定した結果、これらはそれぞれラット肝の１０ 倍量、１６倍量を含有していた。ＧＬＵＴ−２ｃＤＮＡをｐＣＢ−７媒体中へク ローン化をしている間に当該３°未翻訳部位の６３５の塩基対が除去された為、 形質移入された株は、肝あるいは島よりも転写が少なかった（２．２対２．８ｋ ｂ）。株ＣＧＴ−１及びＣＧＴ−２はＧＬＵＴ−２の活性の発現が少なかった。

未形質移入ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞及び−次下垂対前葉細胞は検出可能なだけの 量のＧＬＵＴ−２ｍＲＮＡを含んでいなかった。このことは本発明者の先に行っ た研究と一致している（　）ｌｕｇｈｅｓ等、１９９１年）。

形質移入されたＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞において機能発現したＧＬＵＴ−２タン パク質のレベル及び分子状態を評価するために、粗膜分画をＳＤＳ／ＰＡＧＥに 溶解し、分離されたタンパク質をニトロセルロースに移し、そのＣ−末端へキサ デカペプチド・シーケンスに対して製造された抗体を使用して、ＧＬＵＴ−２タ ンパク質の検出を行った（　Ｊｏｈｎｓ。

ｎ等、１９９０年ｂ）。抗体は、肝と島において明確な二本のハンドを認識した 。肝においては、その見掛は上の分子量は７０及び５２ｋｄであり、島において は僅かに異なり、７２及び５６ｋｄであった（図２、左）。ＲＮＡプロ、ノド・ ハイブリダイゼーションのデータと一致して、形質移入ＡＬＴ−２０ｉｎｓ細胞 にＧＬＵＴ−２タンパク質の欠如を認め、その一方、形質移入株の両者からの抽 出物において、約７０ｋｄの強い一本のバンドを認めた。抗体と抗原性ペプチド を前培養すると、全てのバンドがブロックされることから抗体の特異性が証明さ れた（図２、右）。

研究対象の細胞型に認められたＧＬＵＴ−２の分子の種類間に存在する相違に照 らして、プロット・ハイブリダイゼーション分析に使用した同じ抗体を使い、形 質移入ＡＬＴ−２０ｉｎｓ細胞中で免疫細胞科学分析及び光学顕微鏡により、機 能発現したＧＬＵＴ−２タンパク質の分布及び分類の評価を行った。最も高いＧ ＬＵＴ−２の発現を伴う株においては、細胞膜で十分なＧＬＵＴ−２の機能発現 を感知した。抗原性ペプチドを添加した抗体の前培養により、信号はすべてブロ ックされ、未形質移入細胞及びＧＬＵＴ−２未挿入の媒体を形質移入した細胞の 両者において信号は観察されなかった。このようにして、形質移入されたＡｔＴ −２０ｉｎｓ細胞は、ＧＬＵＴ−２ｍＲＮＡ及びタンパク質産生能を有するばか りではなく、タンパク質を細胞膜に振り分ける能力を有していた。島及び肝の両 者にも同様のことが起きる（　Ｔｈｏｒｅｎｓ等、１９８８年；　Ｔａ１等、１ ９９０年；　０ｒｃｉ等、　１９８９年；　０ｒｃｉ等、１９９０年）。

さらに次のことが発見された。すなわち、高レベルのＧＬＵＴ−２機能発現（Ｃ ＧＴ−５，ＣＧＴ−６）を伴う遺伝子工学的処理味は、非常に迅速にグルコース を運搬し、グルコースに対するＫｍは推定１８ｍＭであり、Ｖｍａｘは１９ミリ モル／分／リットル細胞スペースであった。対照的に、未形質移入の親ＡｔＴ− ２０ｉｎｓ株のグルコースを運搬する効率は非常に低く、グルコースに対する見 かけのＫｍは２ｍＭで、Ｖｍａｘは０５であった。これは、はとんどのクローン 細胞株に認められるＫｍの低いグルコース輸送体をコード化するＧＬＬＩＴ−１ ｍＲＮＡ　（Ｈｕｇｈｅｓ等、１９９１年）の機能発現と一致した（Ｆｌｉｅｒ 等、１９８７年；　Ｂｉｒｎｂａｕｍ等、１９８７年）。形質移入されたＡＬＴ −２０ｉｎｓ細胞は、単離された散在性のランゲルハンス島と非常に類似したグ ルコース輸送速度特性を有し、グルコースに関するＫｍは１８ｍＭで、Ｖｍａｘ は２４ミリモル／分／リットル細胞スペースである（　Ｊｏｈｎｓ。

ｎ等、１９９０年ａ）。このようにしてＧＬＵＴ−２ｃＤＮＡは、島と肝におけ る高いＫｍグルコース輸送活性に関与するタンパク質を明確にコート化し、この 活性をＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞株内へ輸送することが可能である。形質移入され たＡｔ７−２０ｉｎｓ細胞内でＧＬＵＴ−２のタンパク質の大型種のみを検出す ることにより、それが活性グルコース輸送体であることが判る。

ＧＬＵＴ−２形質移入および未形質移入細胞からのインシュリン分泌を、０〜２ ０ｍＭのグルコース濃度範囲で測定した。ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞及びＣＧＴ− ６細胞からのグルコース誘発性インシュリン分泌の測定において、グルコースが ￥ｉｌｌ　ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞からのインシュリン分泌に有意４こ影響しな いことか判明した。これは先の結果と一致して０る（　Ｈｕｇｈｅｓ等、１９９ １年）。ＧＬＵＴ−２未挿入のｐＣＢ７媒体を形質移入したＡｔＴ−２０ｉｎｓ 細胞がグルコースに反応しないことも判明した。対照的にＧＬＵＴ−２形質移入 細胞は、明確にグルコースに反応した。グルコースＯｍＭにおけるインシュリン 放出に関連した、最大以下ではあるが有意な（ｐ＝０．００２）インシュリン放 出の増加を、グルコース濃度が最低（５μＭ）の場合に観察した。１０μＭ〜２ ０ｍＭ（ｐ≦０．００１）の範囲で高濃度の場合、最大誘発は約２５倍であった 。これらの結果が親ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞のグルコース反応性並集団のクロー ン選択によるものであるという可能性はほとんどない。何故ならば、二つの独立 したＧＬＵＴ−２機能発現株（ＣＧＴ−５及びＣＧＴ−６）は、グルコース感受 性を得たが、ＧＬＵＴ−２を欠如した媒体を形質移入された細胞は反応しなかっ たためである。

通常の島では、グルコースは、細胞内ｃＡＭＰレベルを上昇させる試薬なと様々 なβ細胞分泌促進物質に対するインシュリン分泌反応を増強する（　Ｕｌ　１ｒ ｉｃｈ及びＷｏｌｌｈｅｉｍ、１９８４年；　Ｍａｌａｉｓｓｅ等、１９８４年 ）。それ故、本発明者は、ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ、ジブチリルｃＡＭＰ、及びＩＢ ＭＸが存在する場合に、グルコースかインシュリン分泌にあたえる増強効果を調 査した。細胞タンパク質１ｍｇ当たりのインシュリン放出量、あるいは細胞ＤＮ Ａ１ｍｇ当たりのインシュリン放出量としてデータを表示した場合、グルコース か親ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞からのｆｏｒｓｋｏｒｉｎ誘発インシュリン放出に 与える誘発効果は小であった。対照的に、グルコースは、形質移入されたＣＧＴ −６細胞からのｆｏｒｓｋｏ１ｉｎ誘発インシュリン放出に対しては、強い増強 効果を有していた。グルコース濃度が１〜５ｍＭの範囲であれば、反応には変化 が無く、ジブチリルｃＡＭＰ及びＩＢＭＸ誘導分泌に対しても同様な増強作用を グルコースは示した。

インシュリン分泌の実験では、問題の分泌促進物質と共に細胞を３時間静的に培 養した。このためインシュリン放出の動的メカニズムについての情報は殆ど得う れなかった。そのため本発明者は液体培地のゼラチン・ピース上で親及び形質移 入されたＡＬＴ−２０ｉｎｓ細胞株の培養を行った。それらの分泌の性状は、グ ルコース含有媒体を潅流することにより調査可能であった。この方法では、グル コースの潅流開始後、数分以内にインシュリンが放出され、分泌反応は、正常β 細胞の特性と同様に、第−相と二相を示した。インシュリン放出に対する最大誘 発は、グルコースによる潅流開始後最初の十分間に起こり（第−相）基準（グル コース不在）の１０倍であった。

この研究における顕著な発見は、この細胞内のグルコース無感受性のラウス肉腫 ウィルスすなわちレトロウィルス増強剤／プロモーターは、インシュリン遺伝子 機能発現を操作するという事実かあるにもかかわらす、ＧＬＵＴ−２ｃＤＮＡを ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞に形質移入した場合、細胞内のインシュリン含有量が増 加することである。

天然のＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞及びＧＬＵＴ−２形質移入ＣＧＴ−６細胞を、低 濃度（１ｍＭ）あるいは高濃度（２５ｍＭ）のグルコースを追加した媒体中で３ 日間培養した。ＣＧＴ−６細胞は、低濃度および高濃度のグルコースで実験を行 った場合、それぞれＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞の３６倍、５４倍のインシュリン含 有量を認めた（両者の比較の点でｐ＜０．００１）。さらに、インシュリン含有 量は、高濃度グルコースで培養されたＣＧＴ−６細胞では、低濃度で培養された 同様の細胞に比較して、約２倍であった（ｐ＜ｏ、ｏｏｌ）。対照的に、未形質 移入ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞では、高濃度グルコースにおいてもインシュリン含 有量は２０％の増加にとどまった。

本発明者は、グルコース誘発性インシュリン分泌を伴うＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞 株の遺伝子工学的製造に成功したが、この細胞からの最大インシュリン分泌は、 通常の島に観察されるよりかなり低いグルコース濃度で発生する。

通常の島は、約４〜５ｍＭの空腹時グルコース濃度より低い濃度では反応せず、 生理的グルコース濃度（１０ｍＭ）範囲のうちの高い方の濃度においても最大分 泌に達することはない。ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞からのｆｏｒｓｋｏｌｉｎ、ジ ブチリルｃＡＭＰあるいはＩＢＭＸ誘導インシュリン分泌に与えるグルコースの 増強作用もまた、低グルコース濃度で最大となる。グルコースの直接作用及び増 強作用へのＧＬＵＴ−２形質移人ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞の高められた感受性は 、インシュリン分泌（β細胞）腫瘍由来の多くの細胞株の記憶によるものである （　Ｐｒａｚ等、１９８３年；　Ｈａｌｂａｎ等、１９８３年；　Ｇｉｒｏｉｘ 等、　１９８５年；　Ｍｅｇｌａｓｓｏｎ等、　１９８７年：Ｃ１ａｒｋ等、１ ９９０年）。例えば、細胞培養において短時間経過後（６〜１７継代）調査する と、ラット・インシュリノーマ細胞株ＲＩＮ　１０４６−３８は、形質移入され たＡＬＴ−２０ｉｎｓ細胞における場合と同様に、準生理学的グルコースレベル で最大反応とはなるものの、グルコースに対して反応する。培養が長時間経過す るに従い（継代数が５０より大）、全てのグルコース誘発インシュリン分泌か消 失する（　Ｃ１ｅｒｋ等、１９９０年）。低継代のＲＩＮ　１０４Ｇ−３８細胞 は、グルコキナーゼ及びＧＬＵＴ−２の両者を含むが、高継代において調査する と、これらの遺伝子の機能発現は消失している。

形質移入されたＡＬＴ−２０ｉｎｓ細胞及び低継代数のＲＩＮ１０４６−３８細 胞の両者ともがグルコキナーゼとＧＬＵＴ−２の機能発現にもかかわらず、準生 理学的レベルのグルコースに反応するという事実は、これらの細胞が高いＫｍを 有する構成要素の調節機能を越える機能を持つ代謝性決定因子を共有していると 言うことを示唆している。

また、通常の島のグルコース輸送速度特性が、ＧＬＵＴ−２形質移入ＡｔＴ−２ ０ｉｎｓ細胞にも当てはまるとして、クローン細胞のグルコースに対する感受性 の上昇を、グルコースのリン酸化の調節の変更により説明できるかもしれない。

高細胞の抽出物におけるヘキソキナーゼの活性は、容易に測定可能であるが、そ の−力無損傷の島細胞内で、この酵素は、強い阻害（９５％の高率による）を受 ける可能性があると考えられている（Ｔｒｕｓ等、１９８１年；　Ｇｉｒｏｉｘ 等、１９８４年）。このようにして、グルコースの誘発濃度では、通常の島は、 十分なグルコキナーゼ活性と阻害を受けたヘキソキナーゼ（ヘキソキナーゼの阻 害剤であるグルコース−６−リン酸のレベルはグルコースの刺激がある間上昇す る）の両者を有し、グルコキナーゼ活性（高山のＫｍは約１０ｍＭ）に直接に結 び付けられることになるグルコース代謝のコントロールか可能である（Ｍｅｇｌ ａｓｓｏｎ等、１９８６年）。

ＡＬＴ−２０ｉｎｓ細胞は、グルコキナーゼ活性を有するが、これはこの細胞内 の総グルコース・リン酸化の９％を担っているに過ぎず、通常の島では活性の３ ２％が測定されるのみである（下記の例Ｉの表１）。ＲＩＮ　１０４６−３８細 胞中のグルコース・リン酸化酵素の比率は、ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞中のそれと 類似している（Ｎｅｗｇａｒｄ、　Ｃ，Ｂ、、未発表観察）。殆どのクローン細 胞株中に存在する同種体（イソ型タンパク質）であるヘキソキナーゼＩ　（Ａｒ ｏｒａ等、１９９０年）は、ミトコンドリアと結合の結合状態および自由な細胞 質ゾルの形態をとっており（Ｌｙｎｃｈ等、１９９１年）、前者の状態では、当 該酵素はグルコース−６〜リン酸の阻害に対する感受性が低い（Ｗｉｌｓｏｎ、 　１９８４年）。

このように、ＡＬＴ−２０ｉｎｓ細胞のグルコキナーゼ活性が減少しているとい う事実に加え、ヘキソキナーゼが研究対象となったどのようなグルコースの濃度 でも有力なグルコース・リン酸化酵素として作用するように、ＡＬＴ−２０ｉｎ ｓ細胞がへキソキナーゼの調節を変更することもあるかもしれない。

ＧＬＵＴ−２機能発現ＡＬＴ−２０ｉｎｓあるいはＲＩＮ細胞の感受性の増加は 、次のように説明可能である。即ち、当該ＧＬＵＴ−２輸送体の機能発現は、輸 送に関するＫｍを上昇させるだけてはなく、研究対象のすべてのグルコース濃度 においても輸送能を上昇させる。我々のデータは、例えば、２．５ｍＭグルコー スでは、ＧＬＵＴ−２形質移入細胞におけるグルコースの取り込みが、その親株 と比較して約１０倍に上昇することを示している（図３Ａ参照）。これの意味す る所は、島に対して準誘発性であるようなグルコース濃度であッテも、ＧＬＵＴ −２形質移人ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞への輸送は速やかであり、ヘキソキナーゼ 活性（グルコースに関するＫｍは〜０．０１ｍＭ）は最大となる。更に、結果と して゛、グルコース関連分泌信号の発生壜　低グルコース濃度で最大となる。本 発明者はＧＬＵＴ−２形質移入ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞中で分子技術により、ヘ キソキナーゼグルコキナーゼ比か変化可能であるかを調査して０る。そして、そ のような場合に島のそれと類似して（するグルコース容量・反応曲線を得ること が可能であるかについても調査している。

上述のように、ヘキソキナーゼ：グルコキナーゼ比の不釣り合いにより、準生理 学的グルコース濃度において最大インシュリン分泌反応がもたらされる場合力（ ある。本発明の遺伝子工学的処理細胞中におけるヘキソキナーゼ活性を「ノック アウト（圧倒）」することより、生理学的なグルコース反応の増大を達成しうる と本発明者は提案する。一つの方法としては、これらの細胞とアンチセンスへキ ソキナーゼ構築物との相互形質移入がある。これは例えば、プラスミドがビュー ロマイシンあるいはヒスチジノールのような交代性抵抗遺伝子を含みうるという 例外はあるが、ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞株がネオマイシン（ＳＶ４０−インシュ リン−ネオキメラ構築物の安定組み込みの為）及びハイグロマイシン（ＣＭＶ− ＧＬＵＴ−２−アヒグロマイシンキメラ構築物の安定組み込みの為）の両者に対 する抵抗性を有する為、ＧＬＵＴ−２形質移入に関したＣＭＶ媒介体系を使用し て完了することが可能である。最近、マウス肝癌細胞に機能発現するヘキソキナ ーゼ同位酵素は、クローン化され、特徴づけされ（Ａｒｏｒａ等、１９９０年） 、ラット脳（Ｓｃｈｗａｂ等、１９８９年）及びヒト腎臓（Ｎ１５ｈｉ等、１９ ８８年）由来のへキンキナーゼｌシーケンスに約９２％の確率で同一性を示して いる。

遺伝子工学的処理細胞に対して機能発現されているヘキソキナーゼＩの同族体と 全く同一のシーケンスを有するアンチセンスプローブを産生ずるために、この細 胞中に存在するヘキソキナーゼ変異体をｍＲＮＡの逆転写及び当該ＤＮＡ産生物 の増幅によりｃＤＮＡに転換した。これは、島、ＲＩＮ細胞、ＡＬＴ−２０ｉｎ ｓ細胞及び−吹下垂体細胞由来のグルコキナーゼｍＲＮＡの増幅の為に、本発明 者の実験室で採用している手法である（　Ｈｕｇｈｅｓ等、１９９１年）。増幅 の為に使用しているオリゴヌクレオチドは、マウス肝癌へキソキナーゼ■公開さ れたシーケンスに基づくものであった（Ａｒｏｒａ等、１９９０年）。このオリ ゴヌクレオチドはその５°末端に、増幅ｃＤＮＡをアンチセンス配向において選 択された媒介体へ容易に方向性クローン化する制限酵素認識シーケンスが存在す る。

当該媒介体は、クローン化カセットの次の段階である転写終結及びポリアデニル 酸化シグナル配列（シーケンス）の両者を含んでいるため、アンチセンス転写の 処理は、正常に進行しうる。ＧＬＵＴ−２／ＣＭＶ構築物により得たデータから この証明が可能である。この構築物は、３゛末端から約６００の塩基を除去する ＧＬＵＴ−２ｃＤＮＡの３′未翻訳領域における制限部位を使用して調製した。

ＧＬＵＴ−２０１ＲＮＡの転写あるいは翻訳に影響を与えることのない手法であ る。多くの研究者が無削除のアンチセンス・メツセージを伴うアンチセンス技術 の成功あるいは部分的転写の成功を報告しているため、ヘキソキナーゼ・シーケ ンスの様々な異なる部分を選択する研究者もいる。この部分的転写は、当該ＡＴ Ｇ開始暗号及び周辺シーケンスあるいは、当該３′未翻訳部位及びポリＡ末端を 標的としている１Ｊａｌｄｅｒ、　１９８８年）。

遺伝子工学的処理株へのエレクトロポレーション（ｅＬｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉ ｏｎ）による、アンチセンス構築物の形質移入が提案されている。確実にアンチ センス・ヘキソキナーゼ構築物を自身のゲノムに組み込んだコロニーを得る為に 適切な選択を行った後、アンチセンス０ＩＲＮＡの機能発現の評価は、標識セン スＲＮＡに対する雑種形成により可能となる、例えば、ｐＧＥＭ媒介体系で調整 される（　Ｐｒｏｍｅｇａ）。ＲＮＡ　：　ＲＮＡ二重鎖を巻き戻すことが知ら れている細胞因子がこのＲＮＡを変更するため、プロ・ソト・ハイブリダイゼイ ション分析は、アンチセンス構築物に対応するプローブと共に行うばかりではな く、外側の部位に対しても行う。そういうわけで、ノーサン法においてその検出 との間に干渉が生じる（ｗａｔａｅｒ。

１９８８年）。アンチセンスｍＲＮＡの存在がヘキソキナーゼタンパク質のレベ ルに影響しうるかどうかを関連へキソキナーゼ配列（シーケンス）に対する抗体 を使用して評価することもある。

前述の一般的なアンチセンス方法により、特に選択したシステムで適当なヘキソ キナーゼの抑制が得られない場合、変更したアンチセンス・オリゴヌクレオチド の使用も考えられる。例えば、アンチセンス・オリゴヌクレオチドを当該ＡＴＧ 開始暗号をとりまく及び／あるいは含む配列（シーケンス）に調整する。また例 えば、高濃度のオリゴヌクレオチドを含む媒体中でこの細胞を単純培養すること により、細胞中に導入する。

この方法によれば、構築物から合成された長いアンチセンス・ヘキソキナーゼ転 写の安定性が不確実になるのを回避し、機能的影響を評価するに十分な期間へキ ソキナーゼ活性を抑制することができる。否定的な側面は、オリゴヌクレオチド ・アンチセンス手法は、内在的機能発現において一時的に活性を抑制するのみで 、安定した「人工」β細胞の遺伝子工学的処理には適用不可能である点である。

アンチセンス手法の有効性に関する問題を回避するための第二番目の代替的方法 は、陽性／陰性選択プロトコルを使用して対象細胞の内在性へキソキナーゼ遺伝 子をキックアウトする方法である（　Ｍａｎｓｏｕｒ等、１９８８年；　Ｃａｐ ｅｃｃｈｉ、１９８９年；　Ｚｈｅｎｇ等、１９９０年）。このプロトコルは内 在性へキソキナーゼ遺伝子の機能を消失させるヘキソキナーゼ遺伝子分節の相同 性組換えを選択するものである。この方法は、ライブラリースクリーニングある いはＰＣＲ増殖により遺伝子工学的処理細胞内に出現したヘキソキナーゼ遺伝子 の少なくとも一分節のクローン化と、推定ＡＴＰあるいはグルコース結合部位を コード化する構造配列を好ましくは含むゲノム切片を含有する媒介体の構築とを 含んでいる（　Ａｒｏｒａ等、１９９０年；　Ｓｃｈｗａｂ等、　１９８９年； 　Ｎ１５ｈｉ等、　１９８８年；　Ａｎｄｒｅｏｎｅ等、１９８９年）。その後 これらはまた抗生物質抵抗性の遺伝子（例えば、ビューロマイシン）の挿入によ り割り込まれ、例えば単純ヘルペスウィルス（Ｈ５Ｖ）チミジンキナーゼ基質子 の写しに隣接した標的媒介体内にクローン化される。

その後、このプラスミドをエレクトロポレーションによって細胞に導入し、相同 性組換えの作用を、最近はチミジンキナーゼ基質か紹介されているが、ビューロ マイシン及びＦＩＡＵ中での細胞培養により選択した（Ｃａｐｅｃｃｈｉ、１９ ８９年；　Ｄｒ、　Ｒｉｃｈａｒｄ　Ｗｈｉｔｅ、　Ｂｒｉｓｔｏ１Ｍｙｅｒｓ ／５ｑｕｉｂｂ社、　Ｗａｌｉｎｇｆｏｒｄ、コネチカット州より入手可能であ る）。ＦＩＡＵ作用は、次のように使用されている。、組換えが非相同性部位で 発生する場合、細胞のＦＩＡＵに対する感受性を非常に高めながら、ウィルス性 チミジンキナーゼ遺伝子はゲノム中に依然として存在し機能を発現する。分裂し た遺伝子がその相同性部位に挿入された場合（内在性へキソキナーゼ遺伝子）、 対照的にウィルス性チミジンキナーゼ遺伝子は消失し、細胞は耐薬力を得る。哺 乳動物細胞での相同性組換えは比較的稀である一方、方法の選択は正しく、最近 は哺乳動物組織の培養細胞に適用されている（　Ｚｈｅｎｇ等、１９９０年）。

グルコキナーゼ活性は、ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞中に存在するが、その０　、７ Ｕ／ｇタンパク質の活性は、通常の島細胞における活性の約２５％であり、通常 の島細胞では３　、　ＩＵ／ｇのタンパク質を有している。それ故、グルコキナ ーゼの高岡柵体（イソ型タンパク質：　ｉｓｏｆｏｒｍ）　（Ｎｅｗｇａｒｄ。

１９９０年；　Ｈｕｇｈｅｓ等、１９９１年）に関したｃＤＮＡクローン、上述 の手法及び媒介体系を使用して遺伝子工学的処理細胞のグルコキナーゼ活性が上 昇することが望まれる。

ヘキソキナーゼの過剰機能発現についての仮定が正しいならば、グルコース反応 性に与える影響を観察するためヘキソキナーゼ活性が低くなっている遺伝子工学 的処理細胞においてグルコキナーゼの発現を増加することが必要である場合があ る。ＧＬＵＴ−２’、インシュリン４、グルコキナーゼ−の過剰機能発現、ヘキ ソキナーゼ細胞株の創造には、抵抗性遺伝子を含むプラスミドは限られた数しか 入手可能でないため、いくつかの関連構築物の相互形質移入が必要とされる。エ レクトロポレーションあるいはＣａＰＯ４沈殿析出形質移入方法のどちらを使用 する場合でも（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９年）、効果的な相互形質移入か期 待できる。

インシュリンを分泌することによりグルコースに反応する遺伝子工学的処理細胞 を、インシュリン依存性糖尿病の動物に導入することも可能であることが提案さ れている。理想的にはランゲル／１ンス島のグルコース用量・応答特性により密 接に似かよったグルコース帽ト応答特性が得られるように細胞に遺伝子工学的処 理を施すが、ＣＧＴ−５、ＣＧＴ−６、ＧＬＵＴ−２機能発現性細胞の移植もま た本発明と一致して利益をもたらすと考えられている。Ｍａｄｓｅｎと共同研究 者の実験によると、動物へのラットの低分化インシュリノーマ細胞の移植は、代 謝熱源に応じて増加したインシュリン分泌により示されているように、より分化 した状態へもどると言う結果となることは指摘しておくべきである（Ｍａｄｓｅ ｎ等、１９８８年）。生体内環境への遺伝子工学的処理細胞株の接触は、分泌促 進物質への反応において有効である場合が有ると、これらの研究は示唆している 。

遺伝子工学的処理細胞は、最近Ｆｒ１ｔｓｃｈｙ等（１９９１年）により述べら れている修正を加えて、０°５ｈｅａと５ｕｎ（１９８６年）によるアルジネー トーポリリジン封入（被包）化技術を使用して移植し得る。遺伝子工学的処理細 胞を１３％のアルギン酸ナトリウムに浮遊させ、当該細胞とアルジネートの懸濁 液とを注射器を使用してＣａＣｌ２中に滴下させることにより封入化した。洗浄 を数回行った後に、液滴をポリリジン中に懸濁させて再度洗浄した。カプセル中 のアルジネートをその後１＋ｎＭ　ＥＧＴＡ中で懸濁させることにより再液化し 、次にＫｒｅｂｓの平衡塩類緩衝液で再度洗浄する。カプセルは数百の細胞を含 み、直径は約１ｍｍ程である必要が有る。

非封入化島に比較して異種移植片の生存を長期化させることにより、上記技術に よる封入（被包）化した島の糖尿病の動物モデルへの移植が、通常の糖血症コン トロール期間を有意に延長させることが示されている（０’５ｈｅａ等、１９８ ６年；　Ｆｒ１ｔｓｃｈｙ等、１９９１年）。また、封入化によりクローン細胞 の無秩序な増殖を防ぐこととなる。細胞を含有するカプセルを（動物−頭当たり 約１，０００〜１０，０００個）腹膜内に移植し、血糖とインシュリンを監視す るために血液サンプルを毎日採取する。

最近、島組織を哺乳動物に移植する更に展開した技術が述べられている（　Ｌａ ｃｙ等、１９９１年；　５ｕｌｌｉｖａｎ等、１９９１年；引用することにより 本明細書の一部とする）。

先ず、Ｌａｃｙと共同研究者は、ラットの島を中空アクリル繊維中に封入し、こ れらをアルジネート・ヒドロゲル中に固定化した。封入（被包）された島を糖尿 病マウスの腹膜内へ移植した後、報告によると血糖は正常にもとった。また、繊 維上に適切に構築した外表面を有する移植を皮下に行うことにより同様の結果を 得ている。従って、本発明の遺伝子工学的処理細胞もまた同様の皮下注射により 簡単に哺乳動物に「移植」可能であると考えられる。

選択透過膜で島組織を封入（被包）して、ノくイオハイブリツドをまき散らした 「人口膵臓」もまた、報告されている（　５ｕｌｌｉｖａｎ等、１９９１年）。

これらの研究では、保護ハウジング内で半透過性膜をコイル状にして、高細胞の 為のスペースを提供するようにした。この膜の個々の端は、動脈のポリテトラフ ルオロエチレン（ＰＴＦＥ）移植片に接続された。この移植片は、保護ノ）ウン ングを越えて、動静脈シャントとしてこの装置を血管系に繋いだ。高岡種移植片 を含むこのような装置を膵臓除去大へ移植することにより、１０中６の動物で空 腹時血糖値のコントｄ−ルが結果的に出来たとの報告がある。遺伝子工学的処理 細胞を封入（被包）するこのタイプの移植片もまた本発明に従って使用し得る。

封入する他の方法として、グルコース感受性細胞を糖尿病のマウスあるいはう・ ノドの肩甲部あるＣ１；！腹腔に単純に注射する方法が有り、これらの細胞力く そこで腫瘍を形成するとの報告が有る（　５ａｔｏ等、１９６２年）。

この方法による移植は少なくとも短期間ではあるが、封入法に相対する生存力あ るいは機能上の問題を防止し得る。この方法は実験動物での当該細胞の機能の検 査を可能にするが、ヒトの糖尿病の治療方法として利用出来ないのは明らかであ る。

クローン細胞株の遺伝子工学的処理から分かったことをもとに、患者から単離し た１次細胞の遺伝子工学的処理が究極的に可能であるかも知れない。マサチュー セッツ工科大学のＲｉｃｈａｒｄ　Ｍｕｌｌｉｇａｎ博士と共同研究者は、骨髄 細胞への外来遺伝子の導入目的としてのレトロウィルス媒介体の使用では、パイ オニアである（例えば、Ｃｏｎｅ等、１９８４年；　Ｄａｎｏｓ等、１９８８年 を参照）。骨髄細胞を多分化能性幹細胞として知られている共通の祖先から由来 している。また多分化能性幹細胞は、赤血球、血小板、リンパ球、マクロファー ジ、顆粒白血球を含む多種の血液性細胞のもとである。興味深いことに、特にマ クロファージがそうであるが、これらの細胞の中には腫瘍壊死因子及び特異的な 刺激に反応するインターロイキンｌのようなペプチドの分泌能を有するものもあ る。また、これらの細胞がβ細胞の分泌顆粒と構造的に同様の顆粒を含むという 証拠が有る。しかしなから、このような顆粒がβ細胞と同様にマクロファージの 内側で収集・貯蔵されるという点については、明確な証拠はない（５ｔｏｓｓｅ ｌ、１９８７年）。

但し、１次細胞を遺伝子工学的処理するクローン細胞のところで述べた方法によ って組換えインシュリン遺伝子と共同してグルコース輸送体とグルコース・リン 酸化酵素の為の組換えＤＮＡを使用することが究極的に可能であるかもしれない 。またこの１次細胞はグルコース誘発性インシュリン分泌を誘発するものである 。患者自身の骨髄細胞が遺伝子工学的処理及びその後の再移植に使用されるので 、この方法は細胞の封入化の必要性を完全に無くすものである。次いで、これら の細胞は、分化した型に成長して（即ち、マクロファージ）、血液中を循環する 。血液循環中、これらの細胞は、インシュリンを分泌することにより循環グルコ ース量の変化を感受することができる。

免旌痢のＩＤＤＭの診　の為の゛　−工“・　ｒの吏四 上述のように、島タンパク質に対する抗体は、新規に発病をしたＩＤＤＭ患者に おいて、見いだされている。

これらの抗体は、島β細胞の崩壊及びその後のインシュリン生産の損失の時期に 先立って出現すると思われる。近年、免疫機構により認識される特殊なタンパク 質の同定における進歩は、かなりのものが有る。非島細胞株での、このような一 つの潜在的抗原即ちＧＬＵＴ−２島β細胞グルコ一ス輸送体の機能発現により、 ここに述べたように特定の島抗原を伴う患者の血清の免疫反応を検査することが 現在可能である。望ましいものとして、本発明者が意図している特定のエピトー プが他に有り、それは、細胞質顆粒及び表面島細胞抗原のエピトープ（Ｌｅｒｎ ｍａｒｋ、　１９８２年）、インシュリン（５ｒｉｋａｎｔａ等、１９８６年） 、プロインシュリン（Ｋｕｇｌｉｎ等、１９８８年）、島６４Ｋｄ及び３８Ｋｄ タンパク質（Ｂａｅｋｋｅｓｋｏｖ等、１９８２年）、免疫グロブリン（ＤｉＭ ａｒｉｏ等、１９８８年）、哺乳動物の６５Ｋｄ熱シヨツクタンパク質（Ｅｌｉ ａｓ等、１９９１年）及び更にインシュリン受容器（Ｌｕｄｗｉｇ等、１９８７ 年）などである。

本発明者の提案するところでは、前述のエピトープの一つの特定の機能発現の為 に遺伝子工学的処理をした細胞、あるいは自己免疫性の糖尿病においてそれに続 いて同定され得るエピトープの為に遺伝子工学的処理をした細胞を、糖尿病の診 断の為の検査において使用可能である。このような検査の原則には、選択した抗 原あるいはこのような抗原のエピトープの機能発現をする細胞を伴う患者の血清 における抗体の反応、及びその次にヒトの免疫グロブリン（抗体）を認識する第 二抗体との反応による抗原／抗体の複合体の検出が有る。検査を受ける血清が当 該関心の抗原の機能発現の為に遺伝子工学的処理を受けた細胞とは反応するが、 親（遺伝子工学的処理を受けていない）細胞株とは反応しない場合には、検査は 陽性として記録される。機能発現をした抗原と患者の血清との反応を次の事実を 利用して間接的に測定する。その事実とは、使用した抗免疫グロブリン抗体が直 接的検査あるいは機械的測定によりその検出を可能にする分子により「ラベル化 」か「タッグ化」されているということである。商業的に作製可能な抗ヒトの免 疫グロブリンに結びついている最も一般的な「タッグ」はフルオレセインあるい はテトラメチルローダミンのような蛍光性の分子である。

次に開示するように、診断の際の評価におけるＧＬＵＴ−２抗原の機能を発現す る遺伝子工学的処理細胞の使用は、患者の血清の迅速、有効、再現可能な分析を 可能にする点で、非常に利益が有る。ＧＬＵＴ−２機能発現性ＡｔＴ−２０ｉｎ ｓ細胞のような遺伝子工学的処理済ＧＬＵＴ−２機能発現性細胞は、免疫複合体 形成あるいは一例としては３−〇−メチルーβ−Ｄ−グルコース使用のような、 グルコース取り込みの抑制のいずれかに基づく診断評価において使用することが 出来る。しかしながら、ＧＬＵＴ−１抗原の機能を発現する遺伝子工学的処理細 胞もまた有用性が有るということが理解されるであろう。特に、これらの評価に おいて、ＧＬＵＴ−１機能発現性細胞に伴うＩＤＤＭ血清の反応か検出されない ことから、ＧＬＵＴ−１抗原の機能を発現する遺伝子工学的処理細胞は診断の際 の検査で１対照」細胞として使用され得る。

免疫複合体形成に関して、抗原−抗体一抗抗体の複合体の形成により得られる蛍 光シグナルの測定の為には、二つの方法が可能である。第一は、蛍光顕微鏡を使 用しての細胞の単純直接検査である。この方法で、細胞はポリーＬ−リジンをコ ートした顕微鏡スライドグラスあるいはカバーグラスに付着する。その後、細胞 を０５％パラフォルムアルデヒド処理により軽く固定するが、あるいは未処理で 放置する。パラフォルムアルデヒドによる細胞の処理は、細胞の膜構造に変化を 来し、これは抗原分子の構造を結果的に変化させる。全てではないが、抗体のい くつがでは、抗原の構造をこの方法により変更した場合、抗体と抗原のさらにし っがりとした結びつきが可能となる。その後、遺伝子工学的処理細胞と対照細胞 を、患者由来の粗血清あるいは精製免疫グロブリン（ＩｇＧ）に接触させる。こ れは、機能発現をした抗原に対する抗体の検査をする為である。洗浄の後、細胞 をヒトのＩｇＧを認識する抗体に接触させ、そして抗原−抗体一抗抗体の複合体 を、適切な波長の光に晒すことにより、蛍光標識の発光により顕微鏡下で観察出 来るようにする。

さらに他のより定量的な方法としては、免疫複合体の形成を記録する為の蛍光発 色セルソーター（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　 ５ｏｒｔｅｒ：　ＦＡＣ５）の使用が有る。

この方法では、細胞を患者の血清と標識化した第二抗体で処理する。これは、ス ライドグラスに付着させるのではなく、懸濁液中の当該細胞で培養をする点を除 いて、顕微鏡スライド法のところで述べた通りである。

抗ヒトＩｇＧ抗体で処理をした後、細胞をＦＡＣ５に充填する。

第二の抗体の蛍光標識を発光させる波長の光源装置を通るように、このＦＡＣＳ 内に当該細胞を一つづつ通す。

その後、当該細胞は、細胞からの蛍光発光を測定する検出器を通過する。データ を蛍光強度についての柱状図表としてプロットする。抗体−抗原一抗抗体の陽性 反応は、検査された殆どの細胞での蛍光の増加としてあられれる。反対に、存在 する特定の抗原に対する抗体が欠乏する血清に細胞を接触させた場合、結果的に 蛍光は殆ど発しない。ＦＡＣＳを使用すると、サンプル中の細胞の全ての蛍光強 度の表示及び蛍光の強度を分布としてデータをプロットすることが可能となる。

このように、陽性のサンプルのグラフの細胞分布のピークが非反応性のサンプル と相関的に右に移動している（より大きな蛍光の強度に応じて）。

現在まで本発明者は、顕微鏡法及びＦＡＣＳ法による通常の血清の場合と比較し てＩＤＤＭ患者の血清で処理をしたＧＬＵＴ−２形質移入ＡＬＴ−２０ｉｎｓ細 胞における蛍光シグナルの顕著な増加を観察している。重要なことは、ＧＬＵＴ −２分子の剥き出しになった部分（細胞外の）に対して形成された抗体が、蛍光 の点で移動（増加）の原因となることが本発明者により認められている。またこ の蛍光の移動は糖尿病患者の血清による移動と同様のものである。このように、 ＧＬＵＴ−２は新規発病のＩＤＤＭ患者の診断、更に糖尿病発病の予測の為に特 に有用なエピトープであるように思われる。

１９９０年２月２０日出願の同時係属の米国出願第４８３，２２４号において、 ＩＤＤＭ患者の血清にはβ細胞によるグルコースの取り込み抑制が可能な自己抗 体か含まれているということが実証されている。この観察により患者のＩＤＤＭ 発病の危険性についての診断の為の生物学的検査が開発された。残念ながら、こ の方法は多少厄介である。従って、免疫学に基づく検査の開発を中心として、こ の診断の為の検査の単純化と改善の為に多岐にわたる方法が取られた。

研究された方法には、グルコース輸送率の測定に対立するものとしてＥＬＩＳＡ とウェスタン法に基づく検査があった。これらの技法を使った試みは成功したが 、この段階では診断された偽陽性正常患者の数が問題であった。グルコース輸送 検査により認められた健常者と糖尿病患者人口との更に優れた分離方法があるの で、ウェスタン法とＥＬＩＳＡ法での変性タンパク質の使用方法に対立するもの としての輸送検査における無傷の細胞タンパク質の使用によりその相違を説明出 来るかもしれないとの仮説が立てられている。

この仮説を実証する為に、グルコース輸送検査で本発明の人工β細胞の試験を実 施した。これらの研究において、健常者のＩｇＧでは何らの効果も見られなかっ たが、ＩＤＤＭ患者からのＩｇＧは人工β細胞中でグルコース輸送を有効に抑制 している、ということが明らかとなった。更にＧＬＵＴ−２タンパク質を含まな い細胞に対して、グルコース取り込みの点で新規発病の１型患者由来のＩｇＧか らは何らの効果も認められなかった。

これらのデータは、患者の自己抗体とグルコース輸送体機構との抗原抗体相互反 応の流動血球計算に基づく免疫蛍光検査の開発に繋がった。このような機構の開 発の為の初期の試みは、成功したものもあったが、不成功に終わったものもあっ た。この不定性の原因がサンプルの日々の取扱にあるかもしれないとの疑惑があ った。従って、輸送検査に可能な限り近い条件で細胞の均一な増殖、細胞の採り 入れ、細胞の処理を確実にする為に、あるプロトコルを開発した。これらの条件 は次の通りであった。

１、ＡｔＴ　２０　ＧＴ６細胞を種培養の集合体で１．１０に分割した後、７２ 時間増殖させた。

２、細胞をゴム製ポリスマンでプレートから擦り取り、ｐＨ７，６のＤｕｌｂｅ ｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水に入れた。

３、　この細胞を約１０６細胞数／ｍｌの濃度に再度懸濁させ、Ｄｕｌｂｅｃｃ ｏのリン酸緩衝生理食塩水を使い５００ｘｇで遠心分離により洗浄した。そして ３７℃で１５分間振とうしながら培養し、その後１５０μｍの患者の血清で４℃ で１時間培養した。

４、Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水を使い５００ｘｇで遠心分離をす ることにより２回洗浄した後、細胞を２００μｌのＲ−フィコエリトリン（ｐｈ ｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）標識化ヤギの抗ヒトＩｇＧ（Ｈ鎖特異的）に再度懸濁 させ、軽くかき混ぜ二重作動振とう機で４℃で１時間培養した。

５、Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水を使い５００ｘｇで遠心分離をす ることにより２回洗浄をした後、細胞を５００μｌのＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸 緩衝生理食塩水に再度懸濁させ、流動血球計算機を使用して抗原抗体の相互反応 につき分析をした。

例■において更に詳細に渡り議論をしたように、この流動血球計算機に基づく免 疫蛍光検査は、新規発病ＩＤＤＭ患者の血清を非糖尿病被験者から区別をする点 で特に有用であることが認められた。３１検体の非糖尿病患者の内の２９検体（ ９４％）がＧＬＵＴ−２に結びっ＜ＩｇＧにつき陰性である一方、ＩＤＤＭ患者 からの血清３０検体の内２３検体（７７％）が陽性であることが認められた（図 ８）。

このように、陰性結果の８１％か非糖尿病患者由来であり、陽性結果の内９２％ はＩＤＤＭ患者由来のものであった（表２）。

本発明者の最近の発見によると、ＧＬＵＴ−１形質移入ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞 は、ＦＡＣＳに基づく診断の際の検査において、正常血清から糖尿病の血清を識 別しない。これについては、糖尿病の血清には島ＧＬＵＴ−２グルコース輸送体 に対する特異的抗体が存在するという強力な証拠がある。従って、本発明の人工 β細胞が特異的なエビト−ブあるいは抗体と相互反応をするＧＬＵＴ−２内のタ ンパク質の分節の同定に使用可能であろうと想像される。

ＧＬＵＴ−１シーケンスとＧＬＵＴ−２シーケンスとの比較により、二分子の部 位に渡る二つの推定上の膜が強い疎水性と酷似したシーケンスを示すということ が明らかである。

これらの疎水性分節は、シーケンス保持か非常に少ない「ループ」により繋がっ ている（Ｂｅｌ１等、１９９０年、引用することにより本明細書の一部とする） 。特に、ＧＬＵＴ−２には１と２の部位に渡る膜間の非常に大きな細胞外のルー プが有る一方、ＧＬＵＴ−１にはＧＬＵＴ−２と殆どシーケンス相同性のない、 かなり小さなループが存在する。

本発明者が提案するところでは、孤立的あるいは多数の「ループ」部位が代用さ れているキメラＧＬＵＴ分子の構築物が糖尿病の血清と反応するＧＬＵＴ−２の 特異的エピトープの同定に通じ得る。従って、例えばＧＬＵＴ−２の大細胞外ル ープをコード化するＤＮＡをＧＬＵＴ−１ｃＤＮＡシーケンスにおけるＧＬＵＴ −１の小細胞外ループ及びＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞において機能発現しているこ のキメラ分子の代わりに挿入できる。キメラが糖尿病の血清と反応する場合（天 然ＧＬＵＴ−１分子は反応しない）、付加されたＧＬＵＴ−２細胞外ループは特 異的エピトープである。このようなエピトープが概略上述した方法により同定さ れると、タンパク質シーケンスのこの部位に対応する合成ペプチドを製造し、同 様の診断的方法の開発に使用することが出来る。実例としては、ペプチドエピト ープが検査血清と反応し、また抗体／ペプチドの複合体の形成がＥＬＩＳＡある いはＲＩＡのような充分に確立された技術により実証されるというような単純な 検査が有る。

言インシュリン　”　−工“・　理　からのインシュリン製造 ここにＧＬＵＴ−２形質移入が、ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞株、ＣＧＴ−６におい て約５倍の細胞間インシュリン増加の原因となることを示す。この所見により、 これらの細胞あるいは関連細胞から直接のインシュリン回分抽出がＩＤＤＭ治療 への使用の為のヒトインシュリンの単離と精製化の為の他の方法である、という ことが実証されている。ＣＧＴ−６細胞は、溶液中のゼラチン・ビーズ上で成長 させた場合、１０６個の細胞当たりヒトインシュリン約１ｍ単位を含んでいる。

平均的なＩＤＤＭ患者は血糖値管理の為にインシュリンを一日当たり約３０単位 必要としている。５×１０９細胞／リツトルの細胞培養媒体は現行の液体培養形 態において容易に達成可能である。このことは、５単位／リットルのインシュリ ンが製造され得ることを意味している。現在商業的に実施可能な技術を使用して 更に高濃度が達成可能である（例、Ｎｅｗ　Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ　５ｃｉｅｎｔ ｉｆｉｃより入手可能）。

更に、当該細胞の細胞内インシュリン含有量を次の方法のどれか一つにより更に 増加し得る可能性か高い。

１）ラウス肉腫ウィルス／ネオマイシン抵抗遺伝子等の抵抗遺伝子を含むｃＤＮ ＡプラスミドのヒトプロインシュリンによるＡＬＴ−２０ｉｎｓの再形質移入。

形質移入遺伝子の機能発現のレベルは染色体でのプラスミドの挿入部位に依存す るように見える。このように、インシュリン機能発現の高いレベルが単純にプラ スミドの再導入と新しい抵抗クローンの単離により達成される確立は高い。２） プラスミドの構築、この場合はこのプラスミドにおいてヒトプロインシュリンｃ ＤＮＡの機能発現が他のプロモーターにより導き出される。例としては、ＣＭＶ プロモーターがある。これは、本発明者の実験室ではＣＧＴ−６細胞株の創造に おいてＧＬＵＴ’−２の機能発現について非常に高いレベルを達成する為に使用 された。あるいは３）ジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ）　、アデノシンデ アミナーゼあるいはグルタミンシンセターゼのような抵抗性遺伝子の次にクロー ン化によるウィルスプロモーター／ヒトのプロインシュリンｃＤＮＡ　（Ｓａｍ ｂｒｏｏｋ等、１９８９年）の増幅（Ｃｏｃｋｅｔｔ等、１９９０年）。これら の中で、ＤＨＦＲが最も一般的に使用されているシステムであるが、これは一般 的にはＤＨＦＲの内在的な機能発現を有する細胞株での有用性は限られている（ これはＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞株について真実である）。グルタインシンセター ゼ・システムは、グルタミンシンセターゼの内在性機能発現の存在下でも当該関 心のある遺伝子の増幅を可能とする。

細胞はシーケンスをコード化するハムスターグルタミン・シンセターゼに隣接す る転写単位（例、ヒトプロインシュリン遺伝子にフックしているウィルス・プロ モーター）を含むプラスミドの安定した形質移入を受ける。クローンの選択と組 み込まれた転写単位／ＧＳ遺伝子の増幅は、組織培養媒体へのメチオニン・スル フオキシドの付加により行われる（　Ｃｏｃｋｅｔｔ等、１９９０年）。

結果的に得られたクローンは、これは増幅したグルタミンシンセターゼ遺伝子と 関連が有るという長所により、非常に増えたコピー数の転写単位を含んでいる。

結果として、非常に大量のインシュリンが組換え細胞により生産される。これと 同時に、組換え細胞をヒトインシュリン生産の為の更に良い生きた物質とする。

インシュリン生産用に遺云　工８的　理した　の１生亙１１ 糖尿病治療の新しい方法の開発には殆ど進展がないので、糖尿病患者の治療は未 だに患者自身によるインシュリンの反復注射を中心とするものにとどまる。現在 この療法で使用される為のヒトインシュリンの生産の為に採用されている方法に は、精製した組換えインシュリンＡ鎖とＢ鎮の化学的合成、あるいは摘出したば かりの新鮮なブタの膵臓が膵臓島がらのブタのインシュリンの精製である。両方 法とも技術的に困難であり労力がかかり、また後者は元となる組織に多量の活性 プロテアーゼが存在する為更に複雑である。

インシュリン生産の為に現在採用されているこれらの方法に存在する欠点を考察 して、本発明はグルコースに応じてインシュリンを分泌するクローン化β細胞を 使用することにより正確に組まれたヒトインシュリンが比較的単純且つ迅速に生 産し得ると意図している。

これを達成する最も適切な方法がゼラチン・ビーズに付着させたＣＴＧ−６細胞 を充填したカラムへの潅流であることを本発明者は見いだしている。ＫＨ２，５ ０１Ｍグルコース、ｐＨ７，４のようなグルコース含有緩衝液をこのような人工 β細胞のこのようなカラムを通すことが、周囲の媒体へのインシュリンの分泌を 促進させるものであることを見いだしている。その後、この分泌されたインシュ リンを採集して、組換えインシュリンの精製用の開始時原料として使用可能であ る。

潅流媒体からのインシュリンの精製が下記の一つあるいはそれらの組み合わせに より迅速に達成される。

ｌ）親和性クロマトグラフィー。例として、抗インシュリン抗体充填カラムにイ ンシュリン含有媒体を通す。

カラムの洗浄により非インシユリンタンパク質と他の不純物を除去した後、塩濃 度を上げた緩衝液あるいはｐＨを減少させた緩衝液を使用することによりインシ ュリンの特異的溶出が可能である。２）調整用高速液体クロマトグラフィー。３ ）通常のサイズ排除クロマトグラフィーによるサイズ選択。

本発明の望ましい実施例を実証するものとして、次の例か挙げられる。次に述べ る例において開示された技術が本発明の実施において充分に機能する為に本発明 者が発見した実験室的技術を説明していることは、当該分野の技術者により評価 を受けるべきである。従って、これらの技術は本発明の実施の為の望ましい諸態 様を構築出来るものと考えられる。しかしながら、当該分野の技術者は本公開に 照らして、公開された特異的実施例において多くの応用が可能であり、本発明の 精神とその範囲から離れることなく同様の結果が得られることを正しく評価すべ きである。

創 １、ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞及び組織分離使用するＪｔＴ−２０ｉｎｓはカリフ ォルニア州すンフランシスコ大学のＲｅｇｉｓ　Ｋｅｌｌｙ博士により供給され ており、インシュリンｃＤＮＡの機能発現を引き出す為のＳＶ４０の初期遺伝子 プロモーターの代用としてラウス肉腫ウィルス・レトロウィルスが使用されてい ることを除いて、これは最初に述べられた細胞株に類似したものである（　Ｍｏ ｏｒｅ等、１９８３年）。当該細胞は、ウシ胎児血清１０％、ストレプトマイシ ン１００μｇ／ｍｌ、ネオマイシン２５０μｇ／ｍｌを補足したＤｕｌｂｅｃｃ ｏの修正Ｅａｇｌｅｓ培地（ＤＭＥＭ）で増殖させた。不規則授乳ウィスターラ ットの下垂体前葉と肝臓を切り取りサンプルを得て、島は前述の１０−２０の動 物より分離しく　Ｊｏｈｎｓｏｎ等、１９９０年ａ、１９９０年ｃ）　ＲＮＡ抽 出あるいはグルコース・リン酸化検査用の均質化の為に集められる。

２、ＧＬＵＴ−２をＡｔＴ−２０ｉｎｓに安定的に形質移入ラットの島ＧＬＵＴ −２ｃＤＮＡ　（Ｊｏｈｎｓｏｎ等、　１９９０年Ｓ）を、そのサイトメガロウ ィルス（ＣＭＶ）プロモーターのすぐ下の段階にある媒介体ｐｃＭＶ４の誘導体 （Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ等、１９８９年）、媒介体ｐＣＢ−７にクローン化した。

ｃＤＮＡをＨｉｎｄ　ｍを伴うその３°末端で二分割し、結果的に３′不飽和の ６３５塩基対が取り除かれる。ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞をエレクトロポレーショ ンを使用してこの構築物で形質移入した。細胞を軽いトリプシン処理で前融合プ レートから回収し、リン酸緩衝化生理食塩水で２回洗浄し、２０ｍＭＨｅｐｅｓ 　（ｐＨ７，０５，１３７ｍＭ　ＮａＣ１，５ｍＭ　ＫＣＬ、　０．７ｍＭＮａ ２ＨＰ０４）、６ｍＭグルコース及び０．５ｍｇ／ｍｌサケ精巣ＤＮＡを含む水 溶液で３ｘ　１０６細胞／ｍｌとなるように再度懸濁化した。エレクトロポレー ション・セル中で当該細胞の温度を室温と平衡させた後（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａ ｂｓ　；電極間隙幅０．４ｃｍ）、静電容量を９６０μＦ、電圧を０．２−０． ３ｋｖに調整して単一パルスを引き出した。当該細胞を５分間緩衝液に浸け、そ の後組織培養シャーレに塗った。安定した形質移入物質をハイグロマイシンで選 択した。と０うのは当該プラスミドもまたこの薬物に対する抵抗性遺伝子を含む からである。４つのコロニーを得て、純粋株を得る為にノ・イグロマイシシの存 在化で数回継代培養した。

３、ＲＮＡプロット・ハイブリダイゼーション分析グアニジニウム・イソチオシ アネート抽出でＲＮＡを作製し、ホルムアルデヒド／アガロースゲルに溶解させ 、そして前述した（　Ｎｅｗｇａｒｄ等、１９８６年）ナイロン膜（Ｍｉｃｒｏ ｎ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　Ｉｎｃ、）に運んだ。プロットを連続的に３２ｐ で標識化したアンチセンスＧＬＵＴ−２あるいは１８ＳｒＲＮＡプローブで混合 した。これは、前述したように（Ｃｈｅｎ等、１９９０年）混合形成物間のプロ ットを０．１％ＳＤＳで３０分間沸騰することによる逆抽出で調整した。

４、免疫プロット法 肝原形質膜をＡｘｅｌｒｏｄとＰｉｌｃｈ法（１９８３年）により調整し、軽い 原形質膜断片のみを使用した。島とＡＬＴ−２０ｉｎｓ細胞膜を前述のように調 整した（　Ｊｏｈｎｓｏｎ、　１９９０年ｂ）。ただし、ショ糖密度勾配は抹消 し、また均質化緩衝液の構成を５０！ＩＩＭ　）リス緩衝液、ｐＨ７，４，５ｍ Ｍ　ＥＤＴＡ。

０．１ｍＭ　ｐ−クロロメルカールベンゼン・スルフォン酸（ＰＭＳＦ）、１０ ｍＭベンザミジン、及び、１％トラジロール（Ｔｒａｓｙｌｏｌ）とした。サン プルをニトロセルロースに輸送し、前述（Ｈｕｇｈｅｓ等、１９９１年；　Ｑｕ ａａｄｅ等、１９９１年）したように抗ＧＬＵＴ−２多りローン性抗血清（Ｊｏ ｎｓｏｎ等、１９９０年ｂ）の１　：　１０００希釈あるいはＰＢＳに溶解した 抗原性ペプチドの１ｍｇ／ｍｌ溶液の同量で１０分間前培養した後希釈抗血清で 正確に免疫プロットした。第二の抗体は、１２二！標識化ヤギの抗うビット抗１ ｇＧであり、結果として得られた免疫複合体をオートラジオグラフ法で視覚的に 認識可能にした。

５．ＡＬＴ−２０ｉｎｓ細胞におけるＧＬＵＴ−２免疫蛍光法親ＡｔＴ−２０ｉ ｎｓ細胞あるいは形質移入株ＣＧＴ−５及びＣＧＴ−６を１００ｍｍシャーレ当 たり５Ｘ　１０６細胞の濃度に増殖させ、ＰＢＳで００２％ＥＤＴＡの水溶液、 ３７℃で培養することにより回収した。２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ含有ＤＭＥＭ中で ３回洗浄し、約１．５Ｘ１０５細胞を１２ｍｍのポリーＬ−リジンでコートした カバーグラス上に移した。そこに付着させ、３０分間３７℃で培養した。その後 当該細胞を室温で３０分間ＰＢＳにおいて３％パラホルムアルデヒドで固定化し た。そしてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７，９中で０．１Ｍ　ＮＨ４ Ｃｌを使用して培養した。ＰＢＳで４回洗浄した後、細胞を５分間０．１％Ｔｒ ｉｔｏｎ　Ｘ−１００で透過性にし、その後ＰＢＳで３回洗浄した。２％ＢＳＡ で前培養を１回行った後、同量の抗原性ペプチド（Ｉｍｇ／ｍｌ）の存在下ある いは不在下でＧＬＵＴ−２抗血清（１：　２５００）を適用した。スライド・グ ラスを一晩培養し、Ｏ，１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７で０１％ＢＳＡを使用して５ 回洗浄することにより過剰の抗体を排除した。その後細胞を３７°Ｃで２時間Ｆ ｒＴＣ接合ヤギ抗ラビットＩｇＧを使用して培養し、ＢＳＡ／リン酸緩衝液と水 でで連続的に洗浄した。カバーグラスを装着した後、スライド・グラスを蛍光光 学顕微鏡で視覚的に認識可能にした。

６グルコース輸送測定法 細胞をゴム製ポリスマンで擦り取ることにより回収し、６００Ｘ　ｇで遠心分離 をすることによりハンス平衡塩類溶液で洗浄し１０％ウシ胎児血清及び５ｍＭグ ルコースを付加したＤｕｌｂｅｃｃｏ修正イーグルの媒体で再度懸濁させた。

細胞を３７℃で３０分間培養し、洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水で再度懸濁させ 、−前述したように（Ｊｏｈｎｓｏｎ等、１９９０年ｃ）　３−０−メチルグリ コースの取り込みを検査した。

結果をｍｍｏｌｅｓ３−０−メチルグリコースの取り込み／分／リットル細胞ス ペースとして表した。取り込みの初速度は、形質移入細胞株を使用して、グリコ ースの個々の濃度を３．６．１５秒時点で重複測定することにより得た。そして ３．１５．３０秒時点で親細胞株使用のものを測定した（この細胞では輸送速度 が遅い為）。

７グリコース・リン酸化検査 グリコース・リン酸化とグルコキナーゼの活性は、前述のように（Ｋｕｗａｊｉ ｍａ等のｒＢＪ法、１９８６年）、Ｕ−１４（グルコースからＵ−１４０グルコ ース−６−リン酸への変換により測定する。培養細胞あるいは組織を１０ｍＭ　 Ｔｒｉｓ。

１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１５０ｍＭ　ＫＣＩ、１ｍ１Ｊ　ＤＴ Ｔ、ｐＨ７，２を含有する５分量の緩衝液に均質化した。均質化したものは１２ ．０００ｘｇで遠心分離しクリアーにして、その上澄みをグルコース・リン酸化 の検査に使用した。反応は合計容量１５０μｌで３７℃で行われ、先ず１０〜３ ０μｌの抽出物を、　１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ、５ｍＭ　ＡＴＰ、１０ｍＭ　Ｍｇ Ｃｌ２、１００ｍＭ　ＫＣＩ、１ｍＭ　ＤＴＴ、　ｐＨ７，２，１５あるいは５ ０ｍＭグルコース及び６．２μＣｉの［Ｊ−１４（グルコース（３００ｍ　Ｃｉ ／　ｍｍｏｌ　：　Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ社）を含有する反応 混合物に付加する。グルコキナーゼ活性とへキソキナーゼ活性とを区別する為に 、１０ｍＭグルコース−６−リン酸の存在下及び不在下で検査を行った。これは へキソキナーゼ活性を強力に抑制するが、グルコキナーゼ活性は抑制しない。反 応は９０分間行われ、反応混合物５０μｌを９５％エタノール中の３％メタノー ル１００μｌに添加することにより終了する。一定量のこの混合物をニトロセル ロースのフィルター環（Ｇｒａｄｅ　ＮＡ　４５．　５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆ 　５ｃｈｕｅｌ１社）に運ぶ。このフィルター環は、リン糖酸を結び付け、空気 乾燥の後標識化したグルコースを取り除く為に良く水洗する。

その紙の上での放射活性をその後液体シンチレーション計測により検出する。ま た抽出物中の総タンパク質含有量によりグルコース・リン酸化活性を表す。

８、分泌促進物質に応じてのＡＬＴ−２０ｉｎｓ細胞からのインシュリン分泌 親あるいはＧＬＵＴ−２形質移入株ＣＧＴ−５及びＣＧＴ−６を軽いトリプシン 処理で増殖用シャーレから取り除いた。そして大当たり５Ｘ１０”細胞の濃度で ６個の穴シャーレ（Ｃｏ５ｔａｒ）に再移植した。その後、細胞を３日間１ｍＭ 含有培養基（上記参照）で増殖させた。３日目に、細胞を１０分間２回それぞれ Ｉ％ＢＳＡ　（ｆ（ＢＳＳ）を含有しグルコースを含まないＨＥＰＥＳ平衡塩類 溶液で洗浄した。分泌実験はＨＢＳＳと０−２０Ｍｍ範囲のグルコース濃度の添 加により始められるか、あるいは次の３つの内の１つの存在下で始められた。つ まりグルコースの存在下あるいは不在下で、非グルコース分泌顆粒、ｆｏｒｓｋ ｏｌｉｎ　（０５μＭ）、’）１−ｆ−リルｃＡＭＰ　（５ｍＭ）、あるいはイ ソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ、０．１ｔｎＭ）。細胞を３時間分泌促進 物質で培養した。その後、媒体をインシュリン放射性免疫測定の為に回収した。

９細胞ないインスリンの検査 細胞を回収し１ｍｌの５Ｍ酢酸に採取し、凍結融解法を３回行って溶解し、凍結 乾燥した。乾燥溶解産物をその後５ｍｌのインシュリン検査用緩衝液（５０ｍＭ 　ＮａＨ２ＰＯａ、０．１％　ＢＳＡＳｏ、２５％　ＥＤＴＡ、　１％７プｔ： Ｆ　ｆ−ン、ｐＨ７、１）で再構成した。そしてその一定量をインシュリンにつ き放射性免疫測定法で検査をした。

Ｌ且１ １形質移入したＡＬＴ−２０ｉｎｓ細胞におけるＧＬＵＴ−２ｍＲＮＡの機能発 現 ＧＬＵＴ−２ｍＲＮＡの機能発現を、ラットの肝、ランゲルハンス島、下垂体前 葉組織の抽出物中でサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター／　ＧＬＵＴ −２雑種遺伝子を形質移入あるいは未形質移入のＡｔＴ−２０ｉｎｓのプロット ・ハイブリダーゼイション分析により評価した。放射線標識化ＧＬＵＴ−２アン チセンスｌ？ＮＡプローブ（Ｊｏｈｎｓｏｎ等、　１９９０年ａ　；　Ｃｈｅｎ 等、１９９０年）を、４つのＧＬＵＴ−２形質移人ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞株（ ＣＧＴ−１、ＣＧＴ−２、ＣＧＴ−５ＣＧＴ−６）、未形質移入ＡｔＴ−２０ｉ ｎｓ細胞、及び３つの１次組織がら同量のＲＮＡを含有するプロットに混成した （図１）。ＧＬＵＴ−２ｍＲＮＡの恒常状態レベルは、ＣＧＴ−５とＣＧＴ−６ で最高であった。前者はラット島の約半分量のＧＬＵＴ−２ｍＲＮＡを含有し、 後者は同量のＧＬＵＴ−２ｍＲＮＡを含有した。またそれぞれラット肝臓の１０ 倍、１６倍量を含有していた。尚、これらは比重走査と１８３ｒＲＮＡプローブ で得られたシグナルへの標準化により測定した。形質移入を受けた株は、肝臓あ るいは島よりも小さなＧＬＵＴ”２転写を含んでいた（２．２　ｖｓ。

２．８　ｋｂ）。というのは、３゛未未開部位の６３５塩基対がＧＬＵＴ−２ｃ ＤＮＡをｐＣＢ−７媒介体にクローン化する経過中に取り除かれたためである。

ＣＧＴ−１株とＣＧＴ−２株はＧＬＵＴ−２についてあまり積極的に機能発現を していなかった。未形質移入ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞と１次下垂体前葉細胞は、 検出可能量のＧＬＵＴ−２ｍＲＮＡを含んでいなかった。これは従前の研究結果 に一致している（　Ｈｕｇｈｅｓ等、１９９１年）。

２組織及び細胞株におけるＧＬＵＴ−２タンパク質の機能発現 形質移入をしたＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞において機能発現をしたＧＬＵＴ−また ばく質のレベルと分子の状態を評価する為に、粗膜断片をＳＤＳ／ＰＡＧＥに溶 解し、このタンパク質をニトロセルロースに運び、そのＣ末端へキサデカペプチ ド・シーケンスに対して出来た抗体でＧＬＵＴ−２タンノくり質を検出した（　 Ｊｏｈｎｓｏｎ等、１９９０年ｂ）。当該抗体は、肝臓と島で２つの明確なバン ドを認識し、見かけの分子量として肝臓では７０と５２ｋｄ、島では多少サイズ が異なり７２と５６ｋｄであった（図２、左）。ＲＮＡプロット・ハイブリダイ ザ−ジョンのデータに一致して、未形質移入ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞はＧＬＵＴ −２タンパク質を欠乏していることか認められた。一方形質移入ＣＧＴ−５株と ＣＧＴ−６株の両方の抽出物において、約７０ｋｄの一本の強烈なバンドを認め た。当該抗体の特異性は抗原性ペプチドでの抗体の前培養により全てのバンドが ブロックされたという事実により実証されている（図２、右）。Ｔｈｏｒｅｎｓ 等（１９８８年）が事前に報告しているところでは、ＧＬＵＴ−２の為のｃＤＮ Ａシーケンスかラットでも（Ｊｏｈｎｓｏｎ等、１９９０年ａ）、ヒトでも（Ｐ ｅｒｍｕｔｔ等、１９８９年）、肝臓と島で同一であるという事実にも係わらず 、同様の抗ペプチド抗体が肝臓（５３ｋｄ）と島（５５ｋｄ）での別の分子量の ＧＬＵＴ−２タンパク質を認識する。しかしながら、彼らはここに提示した更に 大きなバンドについては報告しなかった。これは多分膜の調整の為に使用される プロトコールの相違によるものと思われる。

３形質移入したＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞におけるＧＬＵＴ−２の免疫細胞化学 形質移入したＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞におけるＧＬＵＴ−２タンパク質の機能発 現を、ＧＬＵＴ−２のＣ末端へキサデカペプチドに対して出来た抗体を使用して 、蛍光抗体法の諸技術により調査した（　Ｊｏｈｎｓｏｎ等、１９９０年ｂ）。

ＧＬＵＴ−２ｍＲＮＡレベルが最高である株（ＣＧＴ−５及び−６）において、 細胞間接触部位に対して殆ど分極している細胞内のシグナル同様、細胞膜におい て豊富なＧＬＵＴ−２免疫蛍光を検出した。このシグナルは抗原性ペプチドを伴 う抗体の前培養によりブロックされ、未形質移入細胞においてもＧＬＵＴ−２未 挿入の媒介体を形質移入した細胞においても認められなかった。形質移入Ａｊ７ −２０ｉｎｓ細胞におけるＧＬＵＴ−２タンパク質の機能発現及び未形質移入親 株における機能発現の不在を、免疫プロット分析により確認した。従って、Ａｔ Ｔ−２０ｉｎｓ細胞と未形質移入親株におけるＡＬＴ−２０ｉｎｓ細胞の不在を 、免疫プロット分析で確認した。このように、ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞は、島と 肝臓の両方で生しるように、ＧＬＵＴ−２ｍＲＮＡ及びタンパク質の生産能を有 するのみならず、その生じたタンパク質を細胞膜に振り分ける　（Ｔｈｏｒｅｎ ｓ等、１９８８年：０ｒｃｉ等、１９８９年；Ｔａ１等、１９９０年；　０ｒｃ ｉ等、１９９０年）。細胞間接触部位での優先的機能発現は最近の一つの報告に 一致している（Ｏｒｃｉ等、１９８９年）。この報告が明らかにするとるこでは 、島β細胞におけるＧＬＵＴ−２の機能発現は相同ではなく、毛細管あるいは細 胞間間隙に面している部位とは反対に、微絨毛の豊富な膜部位及び隣接する内分 泌細胞に面している部位において最も豊富である。この現象の機能的重要性につ いては現在のところ分かつていない。

４親とＧＬＵＴ−２機能発現性ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞におけるグルコース輸送 測定　″ ＧＬＵＴ−２ｃＤＮＡ肝臓（Ｔｈｏｒｅｎｓ等、１９８８年）及び島（Ｐｅｒｍ ｕｔｔ等、１９８９年；　Ｊｏｈｎｓｏｎ等、１９９０年ａ）の両方からクロー ン化されており、両組織は高Ｋｍグルコース輸送活性を有している。ｃＤＮＡは 細菌中（Ｔｈｏｒｅｎｓ等、１９８８年）及び卵子中（Ｐｅｒｍｕｔｔ等１９８ ９年）で機能発現しているが、これらのシステムは、動力学的検査用には使用さ れていない。このように、ＧＬＵＴ−２ｃＤＮＡが高Ｋｍグルコース輸送活性を 与えるタンパク質をコード化するという直接的な証拠は、現在のところ知られて いない。

グルコース輸送動力学的態様における劇的な相違が形質移入ＡｔＴ−２０ｉｎｓ 細胞、未形質移入ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞との間に認められた。図３Ａは、濃度 のプロットがＡＬＴ−２０ｉｎｓ細胞株におけるグルコース取り込みに依存して おり、未形質移入（親）　ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞と比較して、ＣＧＴ−株とＣ ＧＴ−６株におけるグルコース輸送速度の劇的増加の実証を示している。Ｌｉｎ ｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋｅのデータ分析の示すところでは、ＣＧＴ−５株とＣ ＧＴ−６株には、１６と１７ｍＭ、　Ｖｍａｘ値で２５と１７ミリモル／分／リ ットル細胞スペースと、それぞれグルコースについて明らかなＫｍがある（図３ Ｂ）。

反対に未形質移入親ＡＬＴ−２０ｉｎｓ株のグルコースに対するＫｍは２ｍＭで あり、Ｖｍａｘは０．５　ミリモル／分／リットル細胞スペース（図３Ｃ）であ り、これは、はとんどのクローン細胞株において認められる低Ｋｍグルコース輸 送体をコート化しているＧＬＵＴ−１ｍＲＮＡ　（Ｆｌｉｅｒ等、１９８７年； Ｂｉｒｎｂａｕｍ等、１９８７年）についての機能発現（Ｈｕｇｈｅｓ等、１９ ９１年）と一致していた。形質移入ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞は、グルコースに対 するＫｍが１８ｍＭでありＶｍａｘが２４ミリモル／分／リットル細胞スペース である単離された散在性のランゲルハンス島（Ｊｏｈｎｓｏｎ等、１９９０年ａ ）に酷似しているグルコース輸送の動力学的態様を示す。このように、ＧＬＵＴ −２ｃＤＮＡは、島と肝臓における高いＫｍグルコース輸送活性を司るタンパク 質を明確にコード化しており、この活性をＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞株に転写する ことが可能である。

５、ＡＬＴ−２０ｉｎｓ細胞からのグルコース誘発性インシュリン分泌 ＧＬＵＴ−２形質移入及び未形質移入細胞からのインシュリン分泌を０−２０ｍ Ｍのグルコース濃度の範囲で測定した。

図４ＡにおいてＡｔｒ−ｚｏｉｎｓ細胞とＣＧＴ−６細胞からのグルコース誘発 性インシュリン放出を、放出インシュリン量ｍＵ／総細胞タンパク質量ｍｇで表 現することにより比較した。従前の結果（Ｈｕｇｈｅｓ等、１９９１年）と一致 して、グルコースは、親ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞からのインシュリン放出に対し て重要な影響は与えなかった。ＧＬＵＴ−２挿入を欠＜　ｐＣＢ７媒介体で形質 移入したＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞はまた、グルコースには反応しないことが認め られた。対照的にＧＬＵＴ−２形質移入細胞は、明確にグルコース反応性である （　ＣＧＴ−６株のみについてのデータを示す。ＣＧＴ−５株についての結果は 定性的に同等のもの）。０ｍＭグルコースでのインシュリン放出と比較しての亜 最大であるが統計的に有意な（ｐ・０．００２）インシュリン放出の増大を、調 査した中では最低のグルコース濃度（５μＭ）で認めた。約２５倍の最大誘発性 を１０μＭ−ＺＯｍＭの高濃度の範囲で認めた（ｐ≦０．００１）。これらの結 果が親ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞のグルコース反応性並集団クローン性選択による ものとされることは殆どない。というのは、ＧＬＵＴ−２を欠く媒介体を形質移 入した細胞は反応せず、一方二つの独立したＧＬＵＴ−２機能発現性株（ＣＧＴ −５とＣＧＴ−６）はグルコース感受性を得たからである。

通常の島においてグルコースが、細胞内ｃＡＭＰレベルを増加させる因子を含む 多種のｂ細胞分泌促進因子に反応するインシュリン分泌を増強する（　Ｕｌｌｒ ｉｃｈとＷｏｌｌｈｅｉｍ、１９８４年：　Ｍａｌａｉｓｓｅ等、　１９８４年 ）。従って、ｆｏｒｓｋｏｌＬｎ、ジブチリルｃＡＭＰと１８ＭＸ存在下でのグ ルコースがインシュリン分泌に与える効果の増強を調査した。グルコースは、親 ＡＬＴ−２０ｉｎｓ細胞からのｆｏｒｓｋｏｌｉｎ誘発性インシュリン放出につ いて軽度の誘発性効果を有する。この際のデータをインシュリン放出／細胞タン パク質ｍｇ　（図４Ａ）あるいはインシュリン放出／細胞ＤＮＡ　ｍｇ　（図４ Ｂ）と表わした。対照的にグルコースは、形質移入ＣＧＴ−６細胞からのｆｏｒ ｓｋｏｌｉｎ誘発性インシュリン放出についての強力な増強効果を有する。この 反応はグルコース濃度１−５ｍＭの範囲では安定している。またジブチリルｃＡ ＭＰとＩＢＭＸ誘発性分泌についてのグルコースの増強効果を同様に認めた。

インシュリン分泌実験には、分泌促進物質を伴う細胞の３時間に渡る静的培養が あるが、インシュリン分泌の動力学的態様についての情報は、殆ど与えられてい ない。本発明者は、液体培地中ゼラチン・ビーズ上で親と形質移入ＡｔＴ−２０ ｉｎｓ細胞株を増殖させることに成功し、従ってグルコース含有媒体での潅流に より分泌性状の研究が可能になった。図９に示すように、このシステムで増殖し た細胞はグルコース誘発後数分以内でインシュリンを放出した。更に、インシュ リン分泌反応は、先ず強烈な、続いてあまり強烈ではないか強さを維持する様相 を示した。これは正常のβ細胞の特徴を示している。

６天然と遺伝子工学的処理ＡＬＴ−２０ｉｎｓ細胞のインシュリン含有量 本研究の画期的な発見は、インシュリン遺伝子の機能発現か、ＡｔＴ−２０ｉｎ ｓ細胞中のグルコース非感受性ラウス肉腫ウィルス・レトロウィルスの増強構造 ／プロモーターにより操作されているとの事実にも係わらず、ＧＬＬＩ丁−２ｃ ＤＮＡでのＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞の形質移入が細胞内インシュリン含有量の実 質的な増加を結果的にもたらしていることである。天然ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞 及びＧＬＵＴ−２形質移人ＣＧＴ−６細胞を、低濃度（１ｍＭ）あるいは高濃度 （２５ｍＭ）グルコースを補充した媒体中で３日間増殖させた。

ＣＧＴ−６細胞は、低濃度及び高濃度グルコースで調査した場合のＡＬＴ−２０ ｉｎｓ細胞よりもそれぞれ、３６倍及び５４倍多くのインシュリンを含むことが 分かった（両者の比較としてｐ＜０．００１）。更に、インシュリン含有量は、 低濃度グルコースで増殖させた同じ細胞と比較して、高濃度グルコースで増殖さ せたＣＧＴ−６細胞では約２倍であった（　ｐ＜０．００１）。対照的に、未形 質移入ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞においては、高濃度グルコースは２０％のインシ ュリン含有量の増加を見たのみであった。

７、ＡＬＴ−２０ｉｎｓ細胞でのグルコース・リン酸化ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞 に、島に対して準誘発性であるグルコース濃度において、インシュリン分泌ＧＬ ＵＴ−２で形質移入した。対グルコース増強感受性は、グルコース輸送の動力学 的態様により説明されていない。というのは、ＣＧＴ−５とＣＧＴ−６の雨林か 、実質的には島と同一である速変と濃度依存性でグルコースを運ぶ為である。こ れに代わるものとして、低グルコース濃度でのインシュリン分泌誘発性は、β細 胞に比較してＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞におけるグルコース・リン酸化の特質的な 調整により説明出来る場合もある。従って、これらの細胞のへキソキナーゼ：グ ルコキナーゼ活性比を、正常なランゲルハンス島と肝臓で認められる活性と比較 した。本実験質及び他の実験室（Ｉｙｎｅｄｊｉｉａｎ等、１９８９年　Ｍａｇ ｎｕｓｏｎと５ｈｅｌｔｏｎ、１９８９年；　Ｎｅｗｇａｒｄ等、　１９９０年 ；　Ｈｕｇｈｅｓ等、　１９９１年）が明らかにするところでは、単一のグルコ キナーゼ遺伝子は、肝臓と島で選択的に調整され処理される。その結果として、 特徴的なＮ末端を伴うタンパク質を予測する明確な転写を得る。両回柵体（ｉｓ ｏｆｏｒｍ）のグルコースに対するＫｍは、８〜１０ｍＭの範囲内である。

ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞は、グルコキナーゼの高量柵体（ｉｓｌｅｔｉｓｏｆｏ ｒｍ）の機能を表現する（　Ｈｕｇｈｅｓ等、１９９１年）。

放射性同位元素グルコース・リン酸化検査を実施した（Ｋｕｗａｊｉｍａ等「Ｂ 法」、１９８６年）。これにより、１０＋ｎＭのグルコース−６−リン酸の存在 下及び不在下で実施した場合にグルコキナーゼ活性とへキソキナーゼ活性との識 別が可能となった。というのは、この代謝産物はへキソキナーゼの有効な阻害剤 であるが、グルコキナーゼを阻害しないからである（　Ｗｉｌｓｏｎ、　１９８ ４年）。表１に示すように、総グルコース・リン酸化能とグルコキナーゼ活性は 、形質移入（ＣＧＴ−６株）対米形質移入（親）ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞におい て、有意な差はない。雨林は肝臓及び島におけるものと同様の総グルコース・リ ン酸化能を有する。しかしながら、ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞でのグルコキナーゼ 活性は、島におけるものの高々３２％、肝臓の１０％である。更に、グルコキナ ーゼはＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞の総グルコース・リン酸化活性の高々９％でしが ない（残りの９１％は、ヘキソキナーゼ活性に由来するものであると推測できる ）。これに比べて通常の島では２４％、通常の肝臓では８６％である。ＡｔＴ− ２０ｉｎｓ細胞での変更を受けたヘキソキナーゼ：グルコキナーゼ比は結果的に グルコース代謝のＫｍを下げる。またこのことは、低グルコース濃度でのインシ ュリン分泌反応を明らかにしている。

表１９組織と細胞株におけるグルコース・リン酸化活性ＡｔＴ−２０ｉｎｓ　９ ．１９±０．２７　０．６３±０．０６’　６．８％（親）　０．４３±０．０ ８ｂ ＡｔＴ−２０ｉｎｓ　８．０９±０．２０　０．８６±０．１８”　１０．６％ （ＧＣＴ−６株） 島　９，６１±２．１０　２．３１±０．３５”　２４．０％肝臓　８．４２± １．０９　７．１９±１．３１”　８５．４％＊総グルコース・リン酸化を１４ Ｃグルコースの１４Ｃグルコース−６−リン酸への変換をモニターする検査法（ Ｋｕｗａ　ｊ　ｉｍａ等「Ｂ法」、１９８６年）を使用して、５０ｍＭグルコー スで粗ホモジネートの１４．０００ｘｇで得た上澄みで測定した。＃グルコキナ ーゼ活性はＳＯ（＆）あるいは１５（ｂ）ｍＭグルコースで総グルコース・リン 酸化に使用したものと同様の検査法で測定した。但し、ヘキソキナーゼ抑制の為 の１０ｍＭグルコース−６−リン酸の存在する場合は例外とする。値は平均値± ＳＥＭとして、肝臓と島に関する３つの独立した測定値及び未形質移入（親）と ＧＬＵＴ−２形質移入（ＣＧＴ−６）　ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞に間する４つの 独立した測定値を表している。

１、蛍光顕微鏡法による免疫反応性細胞の直接検査親及び遺伝子工学的処理Ａｔ Ｔ−２０ｉｎｓ細胞は、１００ｍｍシャーレ当たり、５Ｘ１０６細胞の密度にな るまで増殖させ、０．０２％ＥＤＴＡのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液中 で、３７℃で培養後、回収する。２０ｍＭのＨｅｐｅｓを含有するＤＭＥＭ媒体 中で細胞を洗浄後、約１．５Ｘ　１０”の細胞を１２ｍｍのポリーＬ−リジンで コートしたカバーグラス上に移す。細胞は３７℃での３０分の培養中にカバーグ ラスに付着する。

その後当該細胞は、望まれる固定の程度により様々な量（０，５〜３．０％）の パラホルムアルデヒドで固定される。

抗ＧＬＵＴ−２抗体あるいは血清での研究に関しては、本発明者は軽い固定（０ ５％パラホルムアルデヒド）が最も適当であるとしている。２％ＢＳＡでの前培 養の後、細胞を覆うのに十分な量の血清サンプル（通常ＢＳＡ中に１：ｌの割合 で希釈されている）を当該サンプルに加える。

陽性の対照として、ラットＧＬＵＴ−２輸送体の特徴的な細胞外ループ・ペプチ ドに対して生じた抗体（Ｘ６１７と命名）を、ＰＢＳに１：１００の割合で希釈 して使用する（この抗体は、ＤＡＷＥＥＥＴＥＧＳＡＨＩＶ（７）　シーケンス を持つペプチドに対して発生し、ラットＧＬＵＴ−２−次構造のアミノ酸６４− ７７に認められる）。

スライドガラスを一晩、血清あるいは抗体と共に培養した後、０．１Ｍリン酸緩 衝液、ｐＨ７，９中で０．１％ＢＳＡを使用して洗浄し過剰の抗体を除去する。

その後、細胞をＦＩＴＣ接合ヤギ抗ヒトＩｇＧ　（ヒト血清サンプルの場合）あ るいはＦＩＴＣ接合ヤギ抗ウサギつｇＧ　（ウサギ体内中に発生した抗体Ｘ６１ ７の場合）と共に培養する。　カバーグラスの適用後、蛍光光学顕微鏡法により スライドガラスを視覚的に認識可能にする。特殊な血清サンプルについては、明 確な蛍光シグナルを親ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞内ではなく、ＧＬＵＴ−２機能発 現ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞の膜表面に認める場合に検査評価を陽性とする。抗体 Ｘ６１７との反応が陽性であることから更に、ＧＬＵＴ−２タンパク質が適切な 配向で機能発現しており細胞表面に存在が予測されるエピトープが本当に認識可 能であることがわかる。

２゜免疫複合体形成を記録する為の蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）の使用 本質的には、顕微鏡スライドガラス法で述べたようにＦＡＣ５分析用に細胞を調 整する。ただし、細胞を顕微鏡スライドガラスに付着させて培養するのではなく 懸濁液中で培養する点が異なる。簡単に言えば、親ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞ある いはＧＬＵＴ−２機能発現ＣＧＴ−６細胞を含む近融合性組織培養シャーレをＰ ＢＳで洗浄した後、シャーレから細胞をはぎ取る為に３７℃で１５分間０．０２ ％ＥＤＴＡに接触させる。この散在性細胞を培養基、続いてＰＢＳで洗浄した後 、無損傷の生きた細胞として使用するがあるいは室温で１５分間、０．５％パラ ホルムアルデヒド／　ＰＢＳ中で静かに固定する。この生細胞あるいは固定化細 胞を１００μｌの親血清中で培養し；　ＰＢＳの割合は１：１１細胞を散在させ ておくために添加した０、００２％ＥＤＴＡを伴う。４℃で１時間培養した後、 ＰＢＳで細胞を３回洗浄し、４℃で１時間フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙ ｔｈｒｉｎ）で標識された抗ヒトＩｇＧあるいは抗ヒトグロブリン断片と共に培 養する。続いて、細胞をＰＢＳで洗浄し、レッド・チャンネルで流動血球計算器 を通過させる。ＦＩＴＣ標識抗体測定に使用するグリーン・チャンネルでＡＬＴ −２０ｉｎｓ細胞が天然の蛍光を有することを発見したため、フィコエリトリン を蛍光標識として使用する。

Ｌ痘１ １、顕微鏡スライドガラス法 本発明者の実験室でＧＬＵＴ−２の外部ループ・ペプチドに対して生じる抗体（ Ｘ６１７）を使用すると、ＧＬＵＴ−２を発現する遺伝子工学的処理ＡｔＴ−２ ０ｉｎｓ細胞の表面に蛍光が斑点状に明確に発光する。しかし、ＧＬＬＩＴ−２ が機能発現するように遺伝子工学的処理を行っていない親細胞では、このような シグナルは得られない。更に、ＧＬＵＴ−２を形質移入された細胞でのシグナル はペプチドを伴う抗体Ｘ６１７の前培養により遮蔽が可能である。抗体Ｘ６１７ は当該ペプチドに対して発生する。これらの結果より、ＧＬＵＴ−２タンパク質 の外部（細胞外）エピトープに伴う免疫複合体の形成の可能性があり、かつ容易 に検出可能であることがわかる。新規発病■型糖尿病患者から採取した血清（年 齢は１０歳−２０歳）及び正常対照として相当する年齢に関しての予備研究で、 正常血清ではなく糖尿病血清において、未形質移入の対照に比較してＧＬＵＴ− ２を形質移入した細胞に対してより大きな免疫活性が観察される。

２　、　ＦＡＣ５技術 ＦＡＣ５法か特異的免疫複合体を検出する為の適切な方法であることが判明した （図５）。図５Ａのグラフ１及びグラフ２を、抗ＧＬＵＴ−２抗体Ｘ６１７によ るＧＬＵＴ−２機能発現性ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞への処理から、及びフィコエ リトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒ　ｉｎ）で標識化した抗つサギＩｇＧ第二抗 体による処理から得た。グラフ３及び４は、抗体Ｘ６１７と培養した細胞を表し ている。この抗体はＧＬＵＴ−２機能発現性ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞と共にあら かじめ前培養されたものである。細胞はＦＡＣＳに充填され、ＦＡＣＳは第二抗 体の蛍光標識を発光させるような波長で光源装置を通りすぎる細胞を一つ一つ通 過する。細胞は、その後細胞からの蛍光放射を測定する検出器を通過する。デー タを蛍光強度の柱状図としてプロットする。図に見られるように、曲線１と２は 、曲線３と４に比べ右に移動しており、これらの細胞中のより強い蛍光強度を示 している。同様の実験をＧＬｔｌＴ−２の機能を発現しない親ＡｔＴ−２０ｉｎ ｓ細胞についても行った（図５Ｂ）。この細胞において、裸抗体とＧＬＵＴ−２ 機能発現細胞で前吸収された抗体の間に相違は見られない。全体として考えれば 、これらのデータは、特異的反応がＧＬＵＴ−２の細胞外領域と反応することが 知られている抗体に適応可能であることから、当該技術を有効に使用する為に役 立つ。

この方法は糖尿病患者の血清の予備分析に使用された（図６）。図６Ａは、第二 抗体のみ（フィコエリトリン標識化抗ヒト・グロブリン）と培養したＧＬＵＴ− ２形質移人ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞の蛍光スペクトルを表している。図６Ｂでは 、ＧＬＵＴ−２形質移入細胞は正常患者がら採取した血清と培養され、結果とし て図６Ａの対照と比較して蛍光強度が変化している。図６Ｃでは、細胞を新規発 病■型糖尿病の患者の血清と共に培養している。重要なことに、この血清により 正常あるいは非血清対照に比較して、非常に著しい右方向への蛍光の移動が発生 する。

示されているサンプルは現在までに分析を受けた他の殆どの糖尿病及び正常血清 の典型的なものである。

匠」 を　る　、　と°　−工“　・ ＡＬＴ−２０ｉｎｓ　を　る　病、　の血°の　互次に示す例は糖尿病患者及び 非糖尿病被験者から得た血清サンプルの分析の為のものである。特に、ラットの 島細胞を含む精製ｒｇＧサンプルと遺伝子工学的処理ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞を 含む精製１ｇＧサンプルとの相互作用を結合分析とグルコース取り込みの抑制に 基づく分析の両者を使用して調査した。次に示す結果は、このような分析が診断 及び予後徴候試験において有用であることを実証している。

Ａ　”　血　！ ＡＬＴ−２０ｉｎｓ細胞及びＧＬＵＴ−２機能発現ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞をＤ ｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７、６中でゴム製ポリスマンで細 胞を除去して回収した。Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水において、室 温での５００Ｘｇで３０秒間の遠心沈殿により２回洗浄した後、細胞はチューブ 当たりにつき細胞約１０５個の濃度で１　、５０１１マイクロフユージ・チュー ブに分注した。細胞を、時々撹拌しながら１５０μｇの患者血清中で４℃で１時 間培養した。その後、細胞をＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７ 、６中で、３０秒間、５００Ｘｇで遠心分離をすることにより２回洗浄し、Ｒ− フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）標識ヤギ抗ヒト、重鎮特異的 ＩｇＧ　（Ｒ−ＰＥＡｂ）　（Ｆｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に再懸 濁させ、時々振とうしながら４℃で１時間培養した。

Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７、６中で、３０秒間、５００Ｘ 　ｇでの遠心分離により更に２回洗浄した後、細胞を５００μｌのＤｕｌｂｅｃ ｃｏのリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７，６に再懸濁させ、流動血球計算法を使用 してＩｇＧ結合について分析する。

流動血球計算法は、ＦＡＣ３ｃａｎ　（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社） 流動血球計算器で行った。Ｅ−０１前方散乱検出器を使用し、前方散乱限界値を １００に設定した。光電子増倍管を２７４ボルトに設定して、比例増幅器により 前方散乱６１８と９０度周光散乱１２２を得た。前方および９０度胸先散乱を、 均等目盛り上に読み取り、蛍光測定は対数目盛りで行った。調整は非発光細胞の サンプルを使用して行い、５３０±１５ｎｍ　（ＦＬＩ）柱状図の観察中、機序 の発生が目盛り上にある様に光電子増倍管の電圧を上昇させた。その後、Ｒ−フ ィコエリトリン標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ　（Ｒ−ＰＥＡｂ）のみで発色する細胞サ ンプルを、５７５±１３ｎｍ（ＦＬ２）柱状図の測定中、機序の発生が目盛り上 にある様に光電子増倍管の電圧を調整する為に使用した。

更に対照検体を、ＦＬ２柱状図発生機序が目盛り上に最小に止まる様に、ＦＬ２ 光電子増倍管の電圧を調整するために使用した。ＦＬ２−ＦＬＩ間の代償作用は 、蛍光の重なりが最小になる様に調整され、これらの細胞に関して４５．９％の 設定が使用された。検体あたり１０４０発生機序の獲得がめられ、データを分析 の為フロッピーディスクに蓄積した。

Ｂ結果 １、高細胞、ＧＬＵＴ−２機能発現ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞、ＧＬＵＴ−１機能 発現ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞による３−０−メチル−β−Ｄ−グルコース取り込 みへの、糖尿病患者及び非糖尿病性被検者由来のＩｇＧの効果 ヒトＩｇＧの無損傷細胞によるグルコース取り込みへ与える影響を調査する為に 、次の分析を行った。引用することにより本明細書の一部とするＪｏｈｎｓｏｎ とＵｎｇｅｒのＰＣＴ特許出願Ｗ０９１／１３３６１に従って行った。

新規発病ＩＤＤＭ患者７例および非糖尿病の６例から得た精製１ｇＧの作用を検 査した結果、ラット島細胞による３−０−メチル−β−Ｄ−グルコースの取り込 みは、ＩＤＤ）Ｊ患者由来のＩｇＧ存在下で著しく阻害された（図７）。非糖尿 病患者の血清由来１ｇＧ存在下では、取り込みの初速度は平均１５ミリモル３− ０−メチルグルコース／分／リットル島細胞スペースであるが、ＩＤＤＭ患者の 血清由来ＩｇＧ存在下では９ミリモル３−０−メチルグルコース／分／リットル 島細胞スペースであった（ｐ＜０．０５）。これらの速度から、ＩＤＤＭ患者由 患者由来１在Ｇ存在下ルコース輸送は４０％阻害されるという解釈を得る。

この阻害がＧＬＵＴ−２活性への抗体の作用の結果である場合、ＧＬＵＴ−２形 質移人ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞株についても明白であるべきである。しかし、Ｇ ＬＵＴ−１形質移入ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞についてはその必要はない。この細 胞株におけるＧ　Ｌ、Ｕ　Ｔ　−２の機能発現は、高細胞に認められるものと非 常に類似したグルコース輸送の特徴を与える。新規に発病した同じＩＤＤＭ患者 からの精製１ｇＧにより、ＧＬＵＴ−２機能発現ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞におけ るグルコース輸送の初速度は、１５．５ミリモル３−０−メチルーグルコース／ 分／リットル細胞スペースから６２ミリモル３−０−メチルーグルコース／分／ リットル細胞スペースに減少した（ｐ＜　０．０５）　（図７）。これは、非糖 尿病被検者から得たＩｇＧ存在下での取り込みに比べ、ＩＤＤＭ患者から得たＩ ｇＧ存在下でのグルコース輸送が、６０％減少することを表わしている。

ラットの高細胞は、二つの動力学的に明確な促進拡散グルコース輸送体機能を提 示しており、それはＧＬＵＴ−２に基づく高Ｋｍ機能及び未確認輸送体に基づく 低Ｋｍ輸送機能である。糖尿病ＩｇＧ誘発の高細胞へのグルコース輸送抑制の詳 細な動力学的分析結果の示すところでは、この抑制は高ＫｍあるいはＧＬＵＴ− ２の媒介を受けている機能に対して向けられている。ＧＬＵＴ−２抑制の特異性 の検査としてＧＬＵＴ−１機能発現ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞での測定を追加して 実施した。未形質移入ＡｊＴ−２０ｉｎｓ細胞は、構成成分としてＧＬＵＴ−１ の機能発現をするが、ＧＬＵＴ−１形質移入細胞株はこのタンパク質を過剰に機 能表現し、グルコース取り込みの速度を１０倍以上に増加させる。これは輸送測 定の精度を増す。新規発病ＩＤＤＭ患者由来のＩｇＧで処理されたＧＬＵＴ−１ 形質移人ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞におけるグルコースの取り込みと、非糖尿病個 人由来のＩｇＧ存在下での輸送は区別不可能であった（図７）。これらのデータ は次のことを示す。すなわち、新規発病ＩＤＤＭ患者由来のＩｇＧは、ＧＬＵＴ −２以外のグルコース輸送体を促進する機能を発現するＡＬＴ−２０ｉｎｓ細胞 においてグルコース輸送を阻害しない。

２、　ＧＬｔｌＴ−２機能発現ＡＬＴ−２０ｉｎｓ細胞に関する、新規発病ＩＤ ＤＭ患者由来の血清と非糖尿病性患者由来の血清との相互反応の特異性 ｌＩ！ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞と結合するＩｇＧの分析を行うこと１こより、無 損傷のＧＬＵＴ−２機能発現ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞１こ結合するＩｇＧの特異 性を立証することが重要であった。ＧＬＵＴ−２機能発現ＡＬＴ−２０ｉｎｓ細 胞株を使用するＲ２に認められる細胞のパーセンテージからの、未形質移入Ａｔ Ｔ−２０ｉｎｓ［胞株を使用するＲ２に認められる細胞の）く−センテージの減 算は、ＩｇＧとＧＬＵＴ−２の特異的結合を反映して０ると考えられる。個々の 血清に関九てこのような分析を実施し、陽性相互反応を、非糖尿病性患者集団１ こ観察される平均値からの２標準偏差より大きいＩｇＧ結合の増加として定義し た。非糖尿病性集団の３１例のうち２９例（９４％）は、ＧＬＵＴ２へのＩｇＧ 結合に関して陰性であるが、ＩＤＤＭ患者からの血清の３０例のうち２３例（７ ７％）は陽性であった（図８）。このように、陰性結果の８１％は、非糖尿病性 患者由来であり、陽性結果の９２％はＩＤＤＭ患者由来であった（表２）。これ らの結果より、ユーデン指数（Ｙｏｕｄｅｎ　Ｉｎｄｅｘ）　Ｊ　＝　０．７３ を得た（表２）。更に、二つの集団の分離の有意水準はｐ＜　０．０００１であ った。

偽陽性率　２／２５　（８％） 偽陰性率　７７３６　（１９％） 肛 インシュリン産生増加のためのＣＧＴ−６細胞を、するカラムの潅流 Ｌ１丑 ＣＧＴ−６（ＧＬＵＴ−２機能発現ＡｔＴ−２０ｉｎｓ）細胞からのインシュリ ン分泌を、カラム潅流法を用いて評価した（Ｋｎｕｄｓｅｎ等、１９８３年）。

細胞を液体培地中、微小担体ビーズ上で増殖させた（　ＩｎｖｉｔｒｏＧｅｎ） 。約５０Ｘ１０６個の細胞をゆるやかな遠心分離により回収しく　５ｏｒｖａｌ ｌ　Ｒ７６０００Ｂ卓上遠心分離機を使用して５０θｒｐｍで行う）、４ｍｌの クレブス・リンガ−塩類（ＫＨ２）溶液、ｐＨ７、４に再懸濁させ、Ｐｈａｒｍ ａｓｉａ　ＰＩＯ／１０カラムに充填した。細胞数は次のような方法でカラムに 充填する直前に得られた。細胞の一定量を取り、１．２Ｕ／ｍｌのＤｉｓｐａｓ ｅ　（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）でビーズを温浸し、細胞塊は２ ５ゲージの針から押し出、して分散させた後、直接細胞数を数えた。

カラムにビーズを充填後、カラムの一番上の可動柱を静かに挿入した後、装置全 体を３７℃の水浴に浸けた。

細胞はその後、下記の方法で潅流された。

Ｌ措】 初期の分泌に関する研究では、細胞を組織培養シャーレで増殖させ、比較的長時 間、分泌促進物質含有媒体に接触させる（３時間）という静的培養手法を用いた 。

この技術が新しい細胞株の調査において重要であることは判明したが、インシュ リン放出の動力学的振る舞いに関しての情報は提供していない。それ故、この問 題に対処し、ＧＬＵＴ−２機能発現ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞からのグルコース誘 発性インシュリン分泌が迅速な島β細胞反応と同様な時間枠内で発生するかどう かを評価する為に潅流実験を実施した。　− ＧＬＵＴ−２及びＧＬＵＴ−１形質移入株と同様に、天然ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細 胞を液体培地において微小担体ビーズ上（ＩｎｖｉｔｒｏＧｅｎ）で増殖させ、 Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＰＩＯ／１０カラムに回収し、さらにグルコースを含まな いＨＢＳＳで１５分間洗浄した。

ＣＧＴ−６株（ＧＬＵＴ−２形質移入）、ＣＧＴＩ−１５株（ＧＬＵＴ−１形質 移入）、親ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞株に関して、グルコースに応じてインシュリ ンを分泌する能力を比較した（図９）。

グルコース欠損ＨＢＳＳの潅流を１５分間流した後、更に２５分間続けられた（ 図９、相１）。この間、全三種の細胞株からのインシュリン放出は徐々に減少し た。相ＩＩは、５ｍＭのグルコース含有ＨＢＳＳ緩衝液に変換することにより開 始された。ＣＧＴ−６細胞からのインシュリン放出は、グルコース含有緩衝液に 変換後、最初の２．５分間に採取された第一のサンプルで１０倍に増加した（図 ９）。この増加は、２サンプルで維持され（合計で５分間を意味する）、その後 、インシュリン分泌は、グルコース以前のレベルの３倍である第二の平坦域に減 少した。インシュリン放出のこの二相型は、通常の島へのグルコース誘発で観察 されるものと類似している。相■の親ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞あるいはＧＬＵＴ −１形質移入ＣＧＴＩ−１５株では、インシュリン放出にわずかな変化を認めた のみであった。

５ｍＭグルコースで２５分間潅流した後、細胞を再びグルコースを含まないＨＢ ＳＳで潅流した（図９、相■）。ＣＧＴ−６細胞からのインシュリン分泌は、グ ルコースを含まない緩衝液に変換倹約１０分間グルコース誘発性レベルを維持し たが、その後急速に減少した。親ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞およびＣＧＴＩ−１６ 細胞からのインシュリン放出の低レベルはグルコースを含まない媒体での潅流中 、更に減少した。相■で、細胞を再び５ｍＭグルコース含有緩衝液の潅流に変え た。ＣＧＴ−６細胞は再びグルコースに対して更に非常に強い分泌反応を示した が、その反応は急激ではなく　（最大に達する為に１５分間を要する）、明確な 第−相及び第二相は認められなかった。

相Ｖで、グルコースを含まない緩衝液への変換すると、ＣＧＴ−６細胞からのイ ンシュリン放出は、劇的ではあるが遅延性の減少を示した。最後の相の２５分間 （図９、相■では、細胞は５ｍＭグルコースと０．５μＭ　ｆｏｒｓｋｏｒｉｎ の組み合わせを含有するＨＢＳＳで潅流した。初期の静的培養実験の結果と一致 して、ＧＬＵＴ−２機能発現ＣＧＴ−６細胞は、親細胞あるいはＧＬＵＴ−１形 質移入細胞よりもグルコースとｆｏｒｓｃｏｒｉｎを合わせたものに対して強い インシュリン分泌反応を示した。ＣＧＴ−６株のグルコースとｆｏｒｓｃｏｒｉ ｎを合わせたものに対する反応は、実験の終了まで維持され、これは細胞は、潅 流実験の間インシュリンを枯渇する二とがないことを示す。この解釈と一致して 、潅流実験の前後に単離したどの細胞株にもインシュリン含有量の変化を認めな かった。

＊＊＊ 本発明の構成と方法が好適実施例によって既に述べられているが、本発明の概念 、精神、範囲から逸脱することなく、諸応用をここに述べた構成、方法及び方法 の諸段階あるいは一連の段階において、適用可能であることは、当該分野の技術 者にとって明白である。

更に、化学的にも生理学的にも関連のある作用因子は、同様のあるいは類似の結 果が得られると思われるが、ここに述べた作用因子に代替することが可能である ということが明確である。当該分野の技術者に明らかなこのような類似の代用物 及び変更の全てが、添付した請求の範囲により明らかにした本発明の精神、範囲 、概念の範噴に入るものとみなされる。

引用文献 下記の参考文献のリストを、背景を補足し、説明し、提供し、あるいはここに採 用する方法論、技術及び／あるいは構成を教示するという範囲で引用し、本願の 一部とするためにここに添付する。

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Ｕ、Ｓ、Ａ、、８６：７８３８−７８４２Ｊｏｈｎｓｏｎ等　（１９９０ａ）、 Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６５：６５４８−６５５１Ｊｏｈｎｓｏｎ 等　（１９９０ｂ）、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２５０：’５４６−５４９Ｊｏｈｎ ｓｏｎ等　（１９９０ｃ）、Ｎ、　Ｅｎｇｌ、Ｊ、　Ｍｅｄ、、３２２：６５３ −６５９Ｋｕｇｌｉｎ等　（１９８８）、　Ｄｉａｂｅｔｅｓ、　３７：１３０ −１３ｌ３０−１３２Ｋｕ等　（１９８６）、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、 　２６１：８８４９−８８５３Ｌａｃｙ等　（１９８６）、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ 、　Ｍｅｄ、、　３７：３３−４０Ｌａｃｙ等　（１９９１）　５ｃｉｅｎｃｅ 、　２５４：１７８２−１７８４Ｌｅｎｚｅｎ等　（１９８７）、　Ａｃｔａ　 Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｉｃａ。

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Ｕ、Ｓ、Ａ、、８６：８６８８−８６９２Ｐｒａｚ等　（１９８３）、　Ｂｉｏ ｃｈｅｍ、Ｊ、、　２１０：３４５−３５２Ｐｒｅｎｔｋｉ等　（１９８７）、 　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｒｅｖ、。

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３：２８９−３２０ Ｓａｍｂｒｏｏｋ等　（１９８９）、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ ｏｒＰｒｅｓｓ、ｐｐ、１６．３０−１６．５５Ｓａｒｋａｒ等　（１９８８） 、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、。

８５：５４６３−５４６７ ５ａｔｏ等　（１９６２）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　Ｕ、Ｓ、Ａ、。

４８：１１８ｌｌ８４−１ １９０Ｓｃｈ等　（１９８９）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、。

８６　：２５６３−２５６７ Ｓｈｉｍｉｚｕ等　（１９８８ａ）、　Ｄｉａｂｅｔｅｓ、　３７：５６３−５ ６８Ｓｈｉｍｉｚｕ等　（１９８８ｂ）、　Ｄｉａｂｅｔｅｓ、　３７：１５２ ４−１５３０Ｓｒｉｋａｎｔａ等　（１９８３）、　Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊｒｎ ｌ、　Ｍｅｄ、。

３０８　：　３２２−２５ Ｓｒｉｋａｎｔａ等　（１９８６）、　Ｄｉａｂｅｔｅｓ、　２５：１３９−１ ４２Ｓｔｏｌｌｅｒ等　（１９８９）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、。

２６４・６９２２−６９２８ Ｓｔｏｓｓｅｌ、Ｔ、（１９８７）、ｉｎ　Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂａ ５ｉｓ　ｏｆＢｌｏｏｄ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｃｈａｐｔｅｒ　１４．ｐｐ、４ ９９−５３３゜Ｗ、Ｂ、５ａｕｎｄｅｒｓ　Ｃｏ、Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ、 ＰＡＳｕｌｌｉｖａｎ等　（１９９１）　５ｃｉｅｎｃｅ、　２５２ニア１ｇ− ７２１Ｔａ１等　（１９９０）、　Ｊ、　Ｃ１１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、　８６： ９８６−９９２Ｔｈｏｒｅｎｓ等　（１９８８）、　Ｃｅ１ｌ、　５５：２８１ −２９０Ｔｈｏｒｅｎｓ等　（１９９０ａ）、　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　Ｃａｒｅ、 １３：２０９−２１８Ｔｈｏｒｅｎｓ等　（１９９０ｂ）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、。

８７・６４９２−６４９６ Ｔｒｕｓ等　（１９８１）、　Ｄｉａｂｅｔｅｓ、　３０：９１１−９２２Ｔｕ ｒｋ等　（１９８７）、　Ｐｒｏｇ、　Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ、、　２６：１２５ −１８１Ｕｌｌｒｉｃｈ　＆　Ｗｏｌｌｈｅｉｍ、（１９８４）、Ｊ、Ｂｉｏｌ 、Ｃｈｅｍ、。

２５９：４１１１−４１１５ Ｖｅｒａ等　（１９８９）、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　９：４２８ ７−４２９５Ｖｉｓｃｈｅｒ等　（１９８７）、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、２４１ ：２４９−２５５Ｗａｌｄｅｒ、Ｊ、（１９８８）、Ｇｅｎｅｓ　＆　Ｄｅｖｅ ｌｏｐｍｅｎｔ。

２：５０２−５０４ Ｗｅｉｎｈｏｕｓｅ、Ｓ、（１９７６）、Ｃｕｒｒ、Ｔｏｐ、Ｃｅ１１．　Ｒｅ ｇｕｌ、。

１１　：１−５０ Ｗｉｌｓｏｎ、Ｊ、Ｅ、（１９８４）、Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃａｒｂ ｏｈｙｄｒａｔｅＭｅｔａｂｏｌｉｓｍ、ｅｄ、、Ｂｅ１ｔｎｅｒ、Ｒ，（ＣＲ Ｃ，ＢｏｃａＲａｔｏｎ、ＦＬ）、ｐｐ、４４５−８５Ｚｈｅｎ等　（１９９０ ）、Ｎａｔｕｒｅ、３４４：１７０−１７３ＦｉＧ、４４ ＦＩＧ、４Ｂ ＦｆＧ、５Ａ ＦＩＧ、５Ｂ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ　営ｆ３弓暇ｎしＦＩＧ、６Ａ ＦｊＧ、６Ｂ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ　＠尤ｇ’１ＬＦＩＧ、６Ｃ Ｎｏｎｄｉａｂｅｔｉｃ　ＩＤＤＭ ＦＩＧ、８ 国際調査報告 フロントベージの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ５，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、 ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ、ＲＵ、　ＳＤ、ＳＥ、　ＵＳ （７２）発明者　ジョンソン、ジョン・エイチ

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．下記の工程からなる、サンプル中の糖尿病関連抗体の存在を測定する方法。 （ａ）糖尿病関連抗体を含有すると思われる生物学的サンプルを入手する工程と 、 （ｂ）糖尿病関連エピトープの機能発現細胞とサンプルとを接触させる工程と、 ここで、該細胞により機能発現したエピトープと該サンプル中に存在すると思わ れる抗体間の免疫複合体の形成を可能にするのに有効な条件下で該サンプルを該 細胞に接触させる、（ｃ）該細胞により機能発現している糖尿病関連エピトープ と該サンプル中に存在する抗体間の免疫複合体形成の検査を行う工程、ここで、 陽性の免疫反応は、糖尿病関連自己抗体の該サンプル中の存在を示す。
2. ２．下記の工程からなる、島細胞により機能表現したエピトープを認識する抗体 のサンプル中の存在を測定する方法。 （ａ）島細胞により機能発現したエピトープを認識する抗体を含有すると思われ る生物学的サンプルを入手する工程と、 （ｂ）このようなエピトープの機能発現をする細胞をサンプルと接触させる工程 と、ここで、該細胞により機能発現をしたエピトープと該サンプル中に存在する と思われる抗体間の免疫複合体の形成を可能にするのに有効な条件下で該サンプ ルを該細胞に接触させる、（ｃ）該細胞により機能発現している島細胞エピトー プとサンプル中に存在する抗体間の免疫複合体形成の検査の検査を行う工程、こ こで、陽性の免疫反応は、島細胞誘導性抗体のサンプル中の存在を示す。
3. ３．上記細胞が遺伝子工学的に処理された細胞である請求項１または２記載の方 法。
4. ４．上記遺伝子工学的に処理された細胞がＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞である請求項 ３記載の方法。
5. ５．上記生物学的サンプルが血清、血液、血漿、あるいはこれらから得た免疫グ ロブリンからなる請求項１または２記載の方法。
6. ６．上記糖尿病関連エピトープはＧＬＵＴ−２、グルタミン酸、脱炭酸酵素、イ ンシュリン、プロインシュリン、島２８ＫＤタンパク質、６４ＫＤ抗原、６５Ｋ Ｄ熱ショックタンパク質、あるいはインシュリン受容器エピトープからなる請求 項１記載の方法。
7. ７．上記エピトープがＧＬＵＴ−２エピトープからなる請求項６記載の方法。
8. ８．上記エピトープがグルタミン酸脱炭酸酵素エピトープからなる請求項６記載 の方法。
9. ９．上記島細胞エピトープがＧＬＵＴ−２、グルタミン酸脱炭酸酵素、あるいは インシュリン・エピトープからなる請求項２記載の方法。
10. １０．上記島細胞エピトープがＧＬＵＴ−２エピトープからなる請求項９記載の 方法。
11. １１．上記細胞が抗原的に検出可能な量のインシュリンを機能発現しない請求項 １または２記載の方法。
12. １２．上記細胞が請求項１による細胞として更に定義される請求項１または２記 載の方法。
13. １３．免疫反応の検査が、更に免疫複合化抗体に対する結合親和性を有する結合 配位子と免疫複合体細胞とを接触させることからなる請求項１または２記載の方 法。
14. １４．上記結合配位子が関連標識を有する請求項１記載の方法。
15. １５．上記関連標識が蛍光標識からなる請求項１４記載の方法。
16. １６．免疫複合体形成の検査が、関連免疫複合化抗体を有する細胞を同定あるい は定量するために上記細胞を細胞選択の対象とすることからなる請求項１または ２記載の方法。
17. １７．上記細胞が蛍光発色セルソーターでの細胞選択の対象となる請求項１６記 載の方法。
18. １８．上記細胞を本質的に均一な細胞培養体から得る請求項１または２記載の方 法。
19. １９．下記の工程からなる、サンプル中の糖尿病関連抗体の存在を測定する方法 。 （ａ）糖尿病関連抗体を含有する思われる生物学的サンプルを入手する工程と、 （ｂ）ＧＬＵＴ−２機能発現無損傷細胞と該サンプルとを接触させる工程と、こ こで、該サンプルに存在すると思われる抗体とＧＬＵＴ−２との相互作用を可能 にする為に有効な条件下で該細胞を該サンプルに接触させる、（ｃ）該細胞への グルコース取り込みの程度を測定する工程、ここで、グルコース取り込み抑制が 該サンプル中の糖尿病関連自己抗体の存在を示す。
20. ２０．グルコース取り込みの程度を３−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコースを使用 して測定する請求項１９記載の方法。
21. ２１．上記細胞が遺伝子工学的に処理された細胞である請求項１９記載の方法。
22. ２２．上記細胞がＧＬＵＴ−２機能発現ＡｔＴ−２０ｉｎｓ細胞である請求項２ １記載の方法。
23. ２３．上記生物学的サンプルが血清、血液、血漿、あるいはこれらから得た免疫 グロブリンからなる請求項１９記載の方法。
24. ２４．上記生物学的サンプルがＩｇＧからなる請求項２３記載の方法。