JPH06508689A - 特異的リガンドを検出するための検定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 特異的リガンドを検出するための検定 関連出願との関係 この発明はＴｚｅｎｇ他を発明者とする、１９９１年６月１３日出願の、出願連 続番号不明の米国特許出願の一部継続出願である。同出願の主題と共通である本 願の主題についてここに優先権を主張する。

発明の背景 近年の技術的進歩により広範囲な被検体、特にポリペプチド、ヌクレオチド、全 細胞、および細胞フラグメント等の数多くの抗原性を示す分子について検定を行 なうこと力（可能となった。一般に、現在利用されている検定の多くは液相また は固相形態の抗原性物質を「捕らえる」ため（こ抗体を使用する傾向にある。

しかしながら、抗原検出によって初期の段階で診断されない症状や疾病も多いた め、検定の感度を向上させることが望まれる。多くの場合、ある組織内の細胞ま たは分子の特定的な集団における増加を検出できることか好ましく、この集団と は特異的抗原性物質がこの組織に１侵入」シｔコニとにより作り出されるもので ある。

たとえば、あるウィルス性疾患の場合には、組織の血液中に十分に検出可能なウ ィルス粒子の量ができるこる（こ（よ、有効な治療の時期はかなり過ぎているか もしれなしＸｏまた、組織の免疫系によるかなり特異的だか概ね検出不可能な応 答を引起こす疾病は現在性なうことかできる検定によっては正確にまたは容易に 検出することはできない。その上免疫グロブリンの特定的な集団または小さな集 団による応答を引起こす薬剤は、結果として生じる疾病が本格的になるまで検出 されないことが多く、そのため診断および治療の選択肢が限られる。たとえば、 さまざまな免疫グロブリンの種を相互に区別して検出することを容易にすること を要件とする検定がＤｕｅｒｍｅｙｅｒの米国特許第４．　２９２．　４０３号 に記載されている。詳細には、この検定はＩｇＭｌｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、また はＩｇＥを含むクラスのうちの特定の免疫グロブリンクラスの抗原特異的免疫グ ロブリンをこの特異的免疫グロブリンクラスに対する抗抗体を使用することによ り検出することを目的とする。抗抗体を使用する先行技術に開示される他の多く の検定の場合と同様（Ａｄａｍｉｃｈ他の米国特許第４，８１８，６８８号、Ｍ ａｇｇｉ。

他の第４，８２８，９８１号、およびＴｏｄｄ他の第４，９６２．０２３号等） 　、Ｄｕｅｒｍｅｙｅｒに記載される検定は複雑で、かつ特殊な試薬を複数使用 する。さらに、これら検定のいずれもある免疫グロブリンクラスの抗原特異的小 集団をそのクラスの他の非抗原特異的メンバーと容易に区別することはできない 。すなわち、本願より以前には、単一の抗原性物質に対して正確に感作する、た とえば特異的１ｇＧまたはＩｇＭ分子の小集団を検出することは簡単なことては なかったのである。

感度か向上した検定の必要性については、抗体検出のための可能な検定、特に特 異的抗原に抗する免疫グロブリンの検出のための検定を考慮すればよくわかる。

ライム病が典型的な例である。

ライム病は１９７５年にコネチカット州のライムで最初に見つかった。現在ては 北米、ヨーロッパ、ロシア、アジア、アフリカおよびオーストラリアを含むいく つかの大陸にわたって発病が報告されている。この病気はマダニが媒介するスピ ロヘータボレリア・プルジョルフエリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅ ｒｉ）により引起こされる。感染によって他のものと混同し得る広範囲な症状が 出現し得る。したがって、正確な診断が重要である。

ライム病は米国で最も一般的に報告されるマダニによる病気である。この病気は 北東部、上部中西部、および西海岸の州でかなり顕著である。この疾病の時期的 な始まりはマダニの若虫の時期と一致する。したがって、この病気は夏および初 秋によく見られる。

ボレリア・プルジョルフエリに特異的な抗体タイターは典型的には病気の初期段 階では陰性である。遊走性紅斑のみを伴なう患者も抗体タイターがほとんと上昇 しない。特異的１ｇＭレヘレベ病気の開始後２週間て上昇し始めかつ３週間から ６週間でピークに達する。特異的１ｇＧレヘレベおよそ２週間特異的ＩｇＭタイ ターよりも遅れる傾向にあるが、遊走性紅斑の臨床段階の終わりの段階において 陽性である場合が多くかつ心臓炎、神経性疾患または関節炎等の症状を表わす第 ２および第３の臨床段階において通常陽性のままである。

一般に、ライム病の「自然な経緯」または進行は３つの臨床段階に分けることが できる。第１の段階は広がる円状の赤い湿疹状の皮膚の斑点である、遊走性紅斑 の広がりによって特徴付けられ、この紅斑はマダニか噛んだ部位に発生しかつ典 型的には２週間から４週間持続する。遊走性紅斑の次には第２段階の心臓、関節 および神経の異常が起こり、この症状はこの病気の始まりから１ケ月から４ケ月 して発生する。最後の段階は発症から３ケ月から起こり得るいくつかの大関節を 含む関節炎により特徴付けられる。この段階は数年にわたって続く可能性かあり また慢性的になる場合もある。初期段階での診断によって病気の進行を止めるこ とかできる適切な抗生物質での迅速な治療を施すことができる。

スピロヘータは患者の皮膚患部または体液から培養することか難しい場合が多い ので、ライム病については抗体を血清で検出することが施すことができる最良の 診断方法であると考えられている。ボレリア・ブルジョルフエリに抗する特異的 ＩｇＭは最初の２週間に検出てきる場合か少なく、通常初期感染後３週間から６ 週間してピークに達し、かつその後持続するか減少する。スピロヘータに対する 特異的１ｇＧの応答は４週間から６週間で検出てきることは珍しく、関節炎の段 階になってピークに達しかつ数年にわたって上昇したままである場合が多い。

したがって、さまざまなポリペプチド、ポリヌクレオチド、および免疫グロブリ ンを含む特異的リガンドを高い感度で検出することができる、さまざまな応用性 を持った検定方法の明白な必要性に応え、出願人は本願を開示するものである。

加えて、本件の検定は他の検定の凝集の問題を回避しており、それにより精度を 上げかつ分解能を高めるという目標が促進される。簡潔かつ的確な本願について その均等の範囲を含め出願人によりここに開示を行なう。

発明の概要 本願の一実施例において、出願人は体液内の被検抗体の検出または決定のための 分析装置を開示し、同装置は相互に隣接しかつ相互に吸収性接触状態にある複数 の実質的に平坦なゾーンからなる層を含み、この層はサンプル付与ゾーンと、可 動粒子に結合した抗原を含む結合ゾーンと、固定化された抗原を含む検出ゾーン とを含み、抗原は結合および検出ゾーン双方において同してありかつ被検抗体に 結合する抗原であり、液体サンプルは結合ゾーンを通ってサンプル付与ゾーンか ら検出ゾーンまで移動することが可能で、被検抗体がサンプルの中に存在してい れば、検出ゾーンで検出される。

もう１つの実施例では、可動粒子は着色されたプラスチック粒子または金属ゾル である。他の変形例は、抗原が抗体に結合して、今度は抗体がボレリア・ブルジ ョルフェリ微生物のエピトープに結合する装置を開示する。他の例では、可動粒 子は着色されたポリスチレン微粒子である。さらにもう１つの実施例においては 、この層はニトロセルロースから作られる。

この発明はこの開示の装置を使用する方法も開示し、同方法は被検抗体の含有が 疑われるサンプルをサンプル付与ゾーンに付与し、サンプルが検出ゾーンを通っ てこの層を横切るのに十分な時間待ち、かつ検出ゾーン内の結果を読取ることを 含む。ある変形例では、可動粒子は着色プラスチック粒子または金属ゾルである 。他の変形例では、使用する抗原は抗体に結合し、今度はこの抗体がボレリア・ ブルジョルフェリ微生物のエピトープに結合する。他の局面では、可動粒子か着 色ポリスチレン微粒子である点を開示する。他の実施例においては、この層はニ トロセルロースから製作される。

この発明はまたサンプル流体における被検抗体の存在または濃度を決定する方法 を開示し、同方法は、流体のサンプルを被検抗体のための第１の抗原と接触させ るステップと、そこにおいて、この第１の抗原は第１の抗原と被検抗体との間で 可溶性複合体を形成するように標識され、可溶性複合体を第２の抗原に接触させ るステップと、そこにおいて、第２の抗原は、第１の抗原と、被検抗体と、第２ の抗原とからなる不溶性複合体を形成するために、流体に溶解しない固相に結合 されており、この固相を流体サンプルと未反応の第１の抗原から分離するステッ プと、固相に結合された第１の標識した抗原かまたは第１の標識した抗原の未反 応の量を測定するステップと、最初の４つのステップに従い調製した被検抗体を 含まない対照サンプルに関して測定した第１の標識した抗原の量を関連付け、流 体サンプル内の被検抗体の存在を決定するか、または流体サンプルに関して測定 された第１の標識した抗原の量を最初の４つのステップに従い調製した、含んで いる被検抗体の量がわかっているサンプルに関して測定した標識した抗原の量に 関連付けて流体サンプル中の被検抗体の濃度を決定するステップとを含み、第１ および第２の抗原双方ともそれぞれ標識されるかまたは固相に付与される以前は 同じである。

当業者においては、標識が金のゾルもしくは着色されたまたは着色可能な微粒子 等の目に見える粒子である場合には、標識した抗原と被検抗体により形成される 複合体が不溶性であるかもしれない点を認識するであろう。

他の実施例においては、この標識は酵素または放射性同位元素である。さらに他 の実施例においては、抗原は抗体と反応し、今度はこの抗体がボレリア・ブルジ ョルフエリのエピトープと反応する。他の例は、標識がアルカリホスファターゼ でありかつ固相がビーズ、試験管の内壁またはマイクロタイタープレートのウェ ルであり、または標識がアルカリホスファターゼであり、固相が非クロマドグラ イ装置である。

この発明はさらに試験対象の流体に溶解しない固相に結合した第１の抗原と、標 識に結合した第２の抗原を含む試薬とを含む検定キットを開示し、固相と試薬と が流体内の被検抗体の少なくとも１回の検定を行なうのに十分な量存在しており 、かつ第１および第２の抗原がそれぞれ固相に結合されるかまたは標識される前 には同じである。他の例では、この標識は酵素または放射性同位元素である。ま た他の実施例では、この抗原は抗体に結合し、今度は抗体がボレリア・プルジョ ルフエリのエピトープに結合するという抗原である。他の変形例では、固相がビ ーズ、試験管の内壁または非クロマトグラフィ装置であり、かつ標識がアルカリ ホスファターゼである。他の実施例では、標識がアルカリホスファターゼであり かつ固相か非クロマトグラフィ装置である。

他の実施例では、検定キットが開示され、同キットは試験対象の流体には溶解し ない固相に結合した第１の抗原と、標識に結合した第２の抗原を含む試薬とを含 み、固相と試薬とは流体中の被検抗体の少なくとも１回の検定を行なうのに十分 な量たけ存在しており、かつ第１および第２の抗原はそれぞれ固相に結合される かまたは標識される前は同しである。

もう１つの実施例では、方法か開示され、それによれば、二の方法は流体におけ る被検抗体の存在または濃度を決定するための方法であって、ａ）流体のサンプ ルを第１および第２の抗原に同時に接触させるステップと、そこにおいて、第１ の抗原がこの流体に溶解しない固相に結合されかつ第２の抗原が標識され第１お よび第２の抗原と被検抗体との間に不溶性複合体を形成するように正確に測った 量で与えられ、ｂ）固体担体を未反応の第２の標識された抗原を含む流体サンプ ルから分離するステップと、Ｃ）固相に結合された第２の標識された抗原の量ま たは未反応の第２の標識された抗原の量を測定するステップと、ｄ）第２の標識 した抗原の量を、ステップ（ａ）から（Ｃ）に従い調製された被検抗体を含んで ぃないことがわがっている対照サンプルに関し測定された標識された抗原の量と 関連付け、流体サンプル中の被検抗体の存在を決定するが、または流体サンプル に関して測定された標識された抗原の量をａ）からＣ）までのステップに従い調 製された含んでいる被検抗体の量のわかっているサンプルに関して測定された標 識された抗原の量と関連付けて流体サンプル中の被検抗体の濃度を決定するステ ップとを含み、第１の抗原と第２の抗原とはそれぞれ固相に結合されるがまたは 標識される前は同しである。

他の実施例においては、この標識は酵素または放射性同位元素であり、さらに、 第１および第２の抗原は抗体に結合して、今度はこの抗体がボレリア・プルショ ルフエリのエピトープに結合するといったものでよい。もう１つの変形例では、 標識はアルカリホスファターゼでありがっ固相はプラスチックビーズ、試験管の 内壁、マイクロタイタープレートのウェルである。さらに他の実施例では、標識 はアルカリホスファターゼでありかっ固相は非クロマトグラフィ装置である。

他の実施例は、流体サンプル中の被検抗体の存在または量を決定するための方法 を開示し、同方法はａ）サンプルの標本を第１の抗原に接触させるステップと、 そこにおいて第１の抗原は第１の抗原と被検抗体との間に不溶性複合体を形成す るために、その流体に溶解しない固相に結合されており、ｂ）被検抗体と第１の 抗原との不溶性複合体から未反応の被検抗体を含む流体サンプルを分離するステ ップと、Ｃ）測定された量の第２の標識された抗原を第１の抗原と被検抗体との 不溶性複合体と反応させて第１および第２の抗原と被検抗体とからなる不溶性複 合体を形成するステップと、ｄ）未反応の第２の標識された抗原から固相を分離 するステップと、ｅ）固相に関連する第２の標識された抗原の量かまたは未反応 の第２の標識された抗原の量のいずれかを測定するステップと、 ｆ）測定された第２の標識された抗原の量を被検抗体を含んでいないことかわか っている、ステップａ）からｅ）に従い調製された対照サンプルに関し測定され た標識された抗原の量に関連させて流体サンプル中の被検抗体の存在を決定する か、または、流体サンプルにおいて測定された標識した抗原の量をａ）からｅ） のステップに従い調製され含んでいる被検抗体の量がわかっているサンプルに関 し測定した標識した抗原の量に関連させて流体サンプル中の被検抗体の濃度を決 定するステップを含み、第１および第２の抗原はそれぞれ固相に結合されるかま たは標識される前は同しである。

さまざまな代替的実施例において、この標識は酵素、放射性同位元素、またはア ルカリホスファターゼである。他の変形例では、第１および第２の抗原は双方と もにボレリア・ブルジョルフエリ微生物のエピトープと複合体を作る抗原である 。さらにもう１つの実施例は、固相がビーズ、試験管の内壁またはマイクロタイ タープレートのウェルであり、他の変形例では固相は非クロマトグラフィー装置 である。

詳細な説明 この発明は抗体等の特異的分子を区別することができる簡単でかつ素早くできる 検定のための装置および方法に関する。固体支持部としては都合のよい固体材料 を用いてもよく、大気と流体との界面から液体を毛管輸送することを可能にする のに使用され得る、いくっがの吸湿性または吸収性固体材料のうちのいずれか（ または複数）を使用することが好ましい。さまざまな吸湿性材料には、紙、セル ロース粒子、シリカゲル、セルロースビーズ、グラスファイバ、濾紙等が含まれ る。固体支持の表面は、たとえばシャープな帯または点の形で濃度の高い粒子の 部位を形成することが可能になるよう、比較的滑らかである必要がある。

吸湿性材料の大きさおよび形状は検定の目的に応して広く変更され得る。たとえ ば、この吸湿性材料は幅約１ミリから５ミリの細長いストリップに形作られても よいし、または他のいずれかの都合のよい幾何学的または非幾何学的形状にされ 得る。いずれの場合も、吸湿性材料は通常構造的強度を与える支持部を有する。

非吸湿性材料としては水不透過性層またはコーティングが考えられる。

二の発明の一実施例は多孔性膜に結合された捕獲抗原として抗原を有する。多孔 膜はグラスファイバ、マイクロファイバ、および天然または合成材料を含むさま ざまな濾過またはクロマトグラフィーの材料のいずれかから製作される可撓性ま たは剛性のマトリクスから構成され得る。この多孔膜を通して流体が容易に流れ 込みかつ通過するようにてきる必要がある。膜はまた好ましくは少なくとも０． 　１μおよび好ましくは２０μを超えない孔の大きさを有する。

多孔膜は単独でまたはより精密な装置の一部として使用され得る。このような装 置はそれぞれ１９８６年１２月２０日および１９８８年２月２３日に発行された 、Ｖａｌｋｉｒｓ他の米国特許第４．６３２，９０１号と第４，７２７，０１９ 号に記載される非クワマドグラフィーＩＣ０Ｎ（登録商標）等の装置であり、こ こにこれらの文献を引用により援用する。ＩＣ０Ｎ（登録商標）は上に挙げたＶ ａｌｋｉｒｓ他の特許に記載される装置のＨｙｂｒｉｔｅｃｈ社（カリフォルニ ア州、サンディエゴ）の商標である。

より詳細には、Ｖａｌｋｉｒｓ他は液体サンプル中の標的抗原の検出のための装 置を記載し、同装置は（ａ）多孔性膜またはフィルタであってかつ標的抗原に抗 する抗体が結合されている第１の部材を含み、この部材は上部と下部表面を有し 、サンプルが上部表面に付与され、かつ抗体はサンプルが付与されている部材の 面積よりも小さい面積内に結合され、かつ（ｂ）第１の部材がその上に置かれる 表面を有しかつ第１の部材が上に置がれる表面に対し一般に横切る方向に通る毛 細管を有する吸収性材料の本体である第２の部材を含み、この毛細管は第１の部 材を透過して部材の毛細管に至る上部表面に添加された液体を引くように第１の 部材の下部表面上の孔と連通状態にあり、前記第１および第２の部材間の毛細管 連通状態は免疫検定プロセスにおいて装置に液体を与える前に成立しておりかっ この検定プロセスの間維持されている。

他のこのような装置は、１９８７年４月８日に公開されたヨーロッパ特許出願第 ２１７，４０３号に記載されるアボット・ラボラトリーズ（イリノイ州、ノース ・シカゴ）のテストパック（ＴｅｓｔＰａｃｋ）（登録商標）装置である。本願 において利用可能な多孔性膜を含む他のこのような装置には、１９７４年５月２ １日発行のＢａｕｅｒ他の米国特許第３，８１１，８４０号、１９９０年４月１ ０日発行のＢｒｏｗｎ　［［Ｉ他の米国特許第４，９１６，０５６号と、Ｉ９８ ３年ＩＯ月４日発行のＣｏ１ｅ他の米国特許第４，４０７゜９４３号、１９８１ 年１月２０日発行のＣｏ１ｅ他の米国特許第４，２４６，３３９号、■９８４年 ４月３日発行のＩｎｔｅｎｇａｎの米国特許第４，４４０，３０１号、１９８７ 年１１月３日発行のＪｏｌｌｅｙの米国特許第４，７０４，２５５号、１９８５ 年１月２９日発行の１（ａｔｚ他の米国特許第４．４９６．６５４号、および１ ９８２年１２月２８日発行のｒｏｍ他の米国特許第４，３６６．２４１号の装置 が含まれ、これらのすへてについてここに引用により援用する。

本願の方法はまたたとえば１９８８年４月２６日発行のＷｅｎｇ他の米国特許第 ４，７４０，４６８号（ここに引用により援用する）、および１９８６年７月２ 日公開のＹｕｅ他の公開ヨーロッパ特許出願第１８６，１００号に記載のもの等 のクロマトグラフィー法によっても実現され得る。

本願の多孔性膜は、たとえば１９８９年８月２９日発行の、Ｆｒ１ｅｓｅｎ他の 米国特許第４，８６１．７１１号、１９８９年８月８日発行のＲｏｓｅｎｓｔｅ ｉｎの米国特許第４，８５５゜４５３号、１９８９年８月１５日発行の、Ｕｌｌ ｍａｎの米国特許第４，８５７，４５３号（これらのすへてについてここに引用 により援用する）、および１９８８年１１月１７日公開のＭａｙ他のＥＰＯ公開 第２９１，１９４号、１９８９年１月１８日公開のＣｈｉｎｇ他のＥＰＯ公開第 ２９９，４２８号と、１９８９年７月１２日公開のＤｅｖｅｒｅａｕｘ他のＥＰ Ｏ公開第３２３，６０５号に記載されるクロマトグラフィー検定においても使用 され得る。

捕獲抗原は膜に直接的にまたは間接的に結合され得る。

直接的な結合は共有または非共有結合でグルタルアルデヒドおよびアミノシラン を使用する等の当該技術分野では知られた方法および［ｃｈｉｒｏ　Ｃｈｉｂａ ｔａ著［固定化酵素Ｊ　（Ｉｍｍ。

ｂｉｌｉｚｅｄ　Ｅｎｚｙｍｅｓ　）　ハルステッドブレス、ＮＹ（＋９７８（ １９７４年）に記載の他の方法により行なわれ得る。非共有結合は抗体の非合成 および特に合成ファイバへの自然粘着を利用する。こうして適切に緩衝された溶 液を膜と混合して蒸発させ、膜の上に所望のリガンドのコーティングを残すこと ができる。

このリガントを膜へ付与する非直接的方法は膜に結合させるか膜で閉じ込めるか した微粒子を使用し、この微粒子が膜のマトリクスの範囲で膜の表面上にあるか または他の粒子に結合して、この他の粒子が今度は膜に結合するようにする。微 粒子はとのような形状でもよいが好ましくは球状である。粒子の大きさは、問題 のある程度まで膜を通って移動しないようにする必要がある。粒子の大きさは様 々だが、一般には膜の最小孔径よりわずかに大きくかつ最大孔径よりも小さいも のでよくかつさらにまたは代替的には最大孔径よりも大きいものでもよい。こう して、粒子は膜の表面上で膜のマトリクス内に結合され得るかまたは膜に結合さ れる他の粒子に結合される。粒子はさまざまな天然発生のまたは合成材料から製 作され得る。このような粒子の例としてはポリエチレン、ポリアクリレート、ポ リアクリルアミド、および好ましくはポリスチレン、またはアガロース、デキス トラン、セルロース、スターチ等の架橋結合された多糖類のような天然発生の材 料である。主な要件は、この粒子が粒子が位置付けられるゾーンが膜のそれ以外 の部分とは違うシグナルを存する原因となり得るような、シグナル、通常は光の 吸収に寄与しないということである。

リガンドは微粒子に共有または非共有結合され得る。リガントの粒子への結合は 、リガンドを直接的に膜に結合するための上に述へたものと類似する方法によっ てもよいしまたは当該技術分野で当業者に知られる他の方法で行なってもよい。

リガントを粒子にコーティングするための好ましい方法は本明細書中の例の項で 記載する。

粒子は膜の表面領域内のゾーンにおいて膜に塗布（または「点在」）させてもよ い。したがって、点在させることで抗原コーティングされた粒子が膜上の分離し た領域に局所化されて、抗原コーティングされた微粒子が膜の上または膜内に局 所化される。当該技術分野において知られる方法のいずれを用いてもよい。その ような方法の１つによれば、多くが水性（「ラテックス」）である懸濁物を膜に 塗布するためにたとえはサンディ・スプリングス・スボッテインク・マシン（Ｓ ａｎｄｙ　Ｓｐｒｉｎｇｓ　Ｓｐｏｔｔｉｎｇ　＆Ｉａｃｈｉｎｅ）　（メリー ランド州、ジャーマンタウン）等のさまざまな機械的手段を用いる。

本願に関してこのような微粒子を調製しかつ使用する方法は１９８８年４月２６ 日発行のＷｅｎｇ他の米国特許第４゜７４０．４６８号（特に第１３欄−１５欄 を参照）（ここに引用により援用）、１９８７年４月８日公開のＢｒｏｗｎ　［ Ｉ　ｌ他のヨーロッパ特許出願節２１７．’４０３号、および１９８６年１１月 ５日公開のＡ、　Ｓ、　Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎのヨーロッパ特許出願節２００， ３８１号に詳しく記載されている。

さまざまな検定のフォーマット（たとえば正、同時、および逆）のための分離ス テップは当該技術分野で知られる方法のいずれを用いて行なってもよい。膜およ びフィルタに関しては、緩衝液を用いてさらに洗浄することで十分な場合が多く 、好ましくは膜またはフィルタの反対側に真空を付与しまたはフィルタもしくは 膜の反対側を、毛細管作用等により液体を引く液体吸収部材等に接触させること により膜またはフィルタを通って液体が引かれる。本願の一実施例においての使 用が好ましい、ＩＣ０Ｎ（登録商標）装置（Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ社カリフォルニ ア州、サンディエゴ）は後者の方法を利用する。

さらに、本願によれば非クロマトグラフィ装置および検定が使用に適している。

たとえばビーズ検定はクロマトグラフィ検定に対する代替的な方法である。１９ ８５年５月１４日発行のＧｅ　ｉ　ｇｅ　！他の米国特許第４，５１７，２８８ 号を参照、なお本文献についてはここに引用により援用する。

検定を行なうには通常中庸の温度か使用される。検定が一般に対照サンプルとの 比較を伴わずに行なわれる場合にのみ測定期間中は一定の温度が要求される。決 定のための温度は一般に約１５°Ｃから４５°Ｃの範囲である。

［標識した抗原ｊという用語は興味の特定の抗体に特異的反応性を有する任意の 抗原を指す。このような抗原に従来技術の方法で標識してシグナル発生システム の全部または一部を構成してもよい。たとえば、抗原は放射性同位元素、酵素、 ヒオチン、アビジン、発色性または蛍光発生物質、化学発光標識、コロイド状金 属粒子、着色微粒子、着色可能な粒子、および着色可能なラテックス粒子で標識 され得る。

こうして、標識した抗原は当該技術分野で周知の方法を用いてトリチウム、炭素 １４、リン３２、ヨード１２５、およびヨード１３１等の放射性同位元素に共有 結合され得る。たとえば、７１２５は、クロラミン−Ｔ処理等の処理によって、 ラクトペルオキシダーゼ処理によって酵素的に、または前標識ポルトン−ハンタ ー（Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ　）技術により導入することがてきる。これら の技術および他の技術かり、Ｖａｎ　ＶｕｎａｋｉｓおよびＪ、　Ｊ、　Ｌａｎ ｇｏ’ｎｅ編集のＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ巳ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　７吐バートＡ（ １９８０年）に記載される。

また放射性標識の他の例に関してはここに引用により援用する、１９７２年２月 ２９日発行の米国特許第３，６４６゜３４６号および１９７９年１２月１３日発 行の第４，０６２．７３３号を参照されたい。発色性標識は可視紫外線波長で光 を吸収する化合物である。そのような化合物は通常染料でありかつキノリン染料 、トリアリールメタン染料、フタレイン染料、昆虫染料、アゾ染料、アントラキ モイド染料、シアニン染料、およびフェナゾキソニウム染料を含む。

蛍光発生物質には光の照射に続く紫外線または可視波長の光を放つものが含まれ る。蛍光発生物質は単独でまたは消光剤とともに用いられ得る。主要な蛍光発生 物質はローダミン、フルオレセイン、およびウンベリフェロンの群のものである 。これらおよび他の蛍光発生物質のための結合および使用の方法は当該技術分野 で見出され得る。たとえば、ＬａｎｇｏｎｅおよびＶａｎ　ＶｕｎａｋｉｓのＭ ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥｎｚｙｍｏｌｏｇＬ召：パーｈｃ（１９８１年）の特に 第３頁目−１０５頁目を参照されたい。他の適当な蛍光発生物質の代表的なもの は１９８２年１２月２８日発行のＴｏｍ他の米国特許第４゜３６６．２４１号の 特に第２８８と２９欄、および米国特許第３，９９６，３４５号に挙げられてお り、これらの文献の双方についてここに引用により援用する。

化学発光標識も本願において使用され得る。たとえば、１９７８年８月１日発行 のＭａｉｅｒ他の米国特許第４，１０４．０２９号（ここに引用により援用）に 挙げられる標識を本願における検出シグナルとして使用してもよい。

検出の代替的な方法には、着色ラテックス粒子およびコロイド状金属粒子を含む 、着色微粒子および着色可能な粒子の使用が含まれる。当該技術分野で知られる 着色微粒子と検定におけるそれらの使用については、たとえば１９８７年１０月 ２７日発行のＣａｍｐｂｅｌｌ他の米国特許第４，７０３．０１７号に記載され るものが含まれ、同文献についてはここに引用により援用する。検定におけるコ ロイド状金属粒子の使用も当該技術分野では周知である。たとえば、１９８２年 ２月２日発行のしｅｕｖｅｒｉｎｇの米国特許第４，３１３．７３４号、１９８ ８年１０月４日発行のＭｏｅｒｍａ口Ｓ他の米国特許第４．７７５，６３６号（ 双方についてここに引用により援用する）、および１９８９年１月１１日公開の ＥＰＯ公開番号第２９８，３６８号を参照されたい。着色可能な粒子および着色 可能なラテックス粒子もマーカーとして有効であることが当該技術分野において 知られておりかつたとえば１９８３年２月１５日発行のＧｒｉｂｎａｕ他の米国 特許第４，３７３，９３２号、１９８９年６月６日発行のｄｅＪａｅｇｅｒ他の 米国特許第４，８３７，１６８号にそれぞれ記載されており、これらの文献の双 方についてここに引用により援用する。

これらの非酵素シグナルンステムは本願にとり十分である。しかしながら、当業 者においては、酵素触媒シグナルシステムが非酵素システムよりも一般に感度が 高いため好ましい点を認識するであろう。触媒標識は当該技術分野では周知であ りかつアルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ 、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒ ドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ等の単一および二重（ 「チャネルのＪ）酵素を含む。二重触媒システムには、たとえばグルコース−６ −リン酸を初期物質として使用するアルカリホスファターゼおよびグルコースオ キシダーゼか含まれる。二重触媒システムの第２の例はグルコースオキシダーゼ でグルコースを酸化させて過酸化水素にするというものであり、この過酸化水素 かロイコ染料と反応してシグナル発生種が生成される。触媒システムについては より詳細な説明が、ｒｏｍ他の米国特許第４゜３６６．２４１号の特に第２７欄 −４０欄、１９８９年６月２７日発行のいｔｍａｎ他の米国特許第４，８４３． ０００号、および１９８９年７月１８日発行のいｔｍａｎ他の米国特許第４，８ ４９，３３８号に開示されており、これらの文献のすへてをここに引用により援 用する。また、同しく引用により援用する、Ｗｅｎｇ他の米国特許第４，７４０ ．４６８号の特に第２ｆｌｉ！と第６欄−８ｍを参照されたい。

抗原に酵素を結合する処理については当該技術分野では周知でありかったとえは Ｋｅｎｎｅｄｙ他のＣｌ１ｎ、Ｃｈｉｍ、ＡＣＴＡ　７０：Ｉ（１９７６年）に 記載されている。この処理に使用され得る試薬はたとえはグルタルアルデヒド、 ｐ−トルエンジイソシアネート、さまざまなカルボンイミド試薬、ｐ−ベンゾキ ノン、ｍ−過ヨウ素酸塩、Ｎ、Ｎ’　−ｏ−フ二二レンジマレイミド等が含まれ る。

触媒システムのための物質にはパラ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ） 等の単純な発色性物質および蛍光発生物質と、β−Ｄ−グルコース（プラスおそ らくは適当なレドックス染料）、ホモバニリン酸、０−ジアニシジン、ブロモク レゾールパープルパウダー、４−アルキル−ウンベリフェロン、ルミノール、パ ラ−ジメチルアミノロフィン（ｐａｒａ−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｌｏｐｈ ｉｎｅ　）　、パラメチルオキシロフィン（ｐａｒａｍｅｔｈｙｌｏｘｙｌｏｐ ｈｉｎｅ）等を含み、インドキシルホスフェートが好ましい基質である。

標識および触媒信号生成システムの性質に依存して、信号は光を照射しかつ蛍光 レベルを観察し、染料が目でまたは分光光度計で観察できかつ蛍光か目でまたは フルオロメータで観察され得る、色素、蛍光または化学発光を生成する触媒シス テムを設けることにより、もしくは化学発光または放射性標識の場合には、放射 線計数管を使用することにより検出され得る。適当な装置がない場合には、目に 見える色が出る発色団を出させることが通常望ましい。精密な装置か用いられる 場合には、これら技術のうちいずれを用いてもよい。たとえば、アルカリホスフ ァターゼの好ましい混合物か酵素として使用されかつインドキシルホスフェート が基質として使用される場合には、色の変化は定性陽性反応に関して目で検出さ れ得る。定性分析に関しては、ＩＣ０Ｎ（登録商標）リーダーおよび付随のソフ トウェア（カリフォルニア州、サンディエゴ、Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ　社）を製造 者の注意事項に従って使用してもよく、かつ本願での使用に好ましい。

本願に関連してラテックス粒子を使用するのが好ましい傾向にあるが、他の粒子 を使用しても成果が得られる点に留意されたい。たとえば、検定に含まれる粒子 がサンプルに存在していてもよく、試薬として加えられるがまたは原位置で形成 されてもよい。粒子の性質は広い範囲にわたり、すなわち天然由来もしくは合成 、単一のもの、数種類のものまたは広範囲な物質の混合物といった具合である。

天然発生の粒子には、核、マイコプラズマ、プラスミド、ブラスチド、哺乳類細 胞、単細胞微生物（たとえばバクテリア）が含まれる。合成粒子はポリエチレン ポリアクリル酸エステルまたはアガロース等の多糖なとの天然由来の物質などか ら作られる金属コロイドまたはラテックス粒子等の合成または天然由来の素材か ら調製され得る。非天然由来粒子は特定の検定、検定のプロトコール、または他 の考察によって変更され得る。（たとえば、さまざまな粒子の使用を記載する、 Ｇｏｕｌｄ他の米国特許第４，８３７，１６８号を参照）。

均一なラテックス粒子（ｒＵＬＰＪ　）は一般には小さな直径の極めて均一な球 である。典型的な直径は約ｏ、１μｍを下回るものから約１００μｍに及ぶ。５ μｍより小さい粒子は通常乳化重合により調製される。この工程の結果極めて均 一な粒径分布を伴なう一連の粒子が得られる。

ＵＬＰの基本的な用途は医学診断の領域においてであり、粒子がラテックス凝集 試験に用いられるのである。他のさまざまな粒子たとえばアミド修飾ラテックス （ｒＡＭＬＪ）およびカルボン酸エステル修飾ラテックス（ｒｃＭＬ」）はその 表面にそれぞれアミドおよびカルボキシル酸基を有している。これらの官能基に よりリガンドー−たとえば抗原または抗体−一のＵＬＰ表面への共有結合か可能 となって、凝集テストが改善される。

たとえば、特定の抗体（ｒＡｂ」）を測定しようとする場合、適切な抗原（ｒＡ ｇＪ　）がラテックス粒子にコーティングされる。Ａｂは二価なので、２つの隣 接する粒子上の同じ場所に結合しかつこれらをともにつなぐかもしれない。した がって、ある人のサンプルに存在するＡｂがＡｇコーティングされた粒子と混合 されると、粒子の凝集または凝固が引起こされ、これらの凝集体は通常肉眼でも 見ることができる。この現象が本質的にラテックス凝集テスト（「ＬＡＴＪ）の 基礎となっている。

可動粒子にまつわる１つの大きな問題点は、コーティングされた粒子が自然に凝 集する傾向にあるという事実である。特にラテックスの懸濁物は疎水性粒子のコ ロイド状懸濁物である。この懸濁物の安定性は表面活性電荷に依存し、少量の蛋 白質（ラテックス１ミリグラムあたりおよそ１０８ｇ）を加えるとアグロメレー ンヨンが起こり、より多い量の蛋白質を加え続けると粒子の安定性が向上する傾 向にある。このタイプの凝集は着色または可視粒子を使用してのクロマトグラフ ィ検定においても問題である。

この問題および非特異的凝集に伴なう問題のさまざまなが含まれる。しかしなが ら、これらの提案のうち完全に満足のいく結果をもたらすと証明されたものはな く、いずれも検定に干渉する傾向にあり、その多くが凝集を抑止するような形で 干渉する。これはもちろん多くの検定にとって全く許容できない結果である。

濃度の高い部位でまたはそこから離れて検出可能な信号　、を検出するための手 段は粒子の内的性質がもしれないしそうでないかもしれない。粒子は放射性核種 、染料、蛍光物質、酵素等の検出を可能にするさまざまな材料または目で見て観 察可能なもしくは装置を利用して検出可能な検出可能信号を与える他の都合のよ い標識で標識され得る。通常さまざまな標識を適宜リンキングアームを利用して 粒子に対し共有結合することが考えられる。標識は表面に結合されるか、可能で あれば粒子を貫通させる。

粒子の大きさは通常約０．０５がら１００マイクロメータ（μｍ）の範囲で、よ り一般的には約０．１から７５μｍの範囲にある。粒子はプラスまたはマイナス のいずれかに荷電されるか、両性すなわち電荷をなくして中立状態になり得る。

電荷の有無は、検定にまつわる他のパラメータに影響を与え得る。

診断検定における用途が見出されたさまざまな標識を記載する数多くの特許が発 行されている。さまざまなブトロコールが、これら標識を有利に使用し得るよう な態様で展開され得る。そのような特許を挙げると、米国特許第３゜８５０．７ ５２号、第４，２５５，３２９号、第４，２３３．４０２号、および第４，２０ ８．４７９号である。

検定を行なうために、さまざまな補助的な材料と組合せてさまざまな試薬が予め 定められた量で混合されサンプルと混合されるかまたは検定における他の用途に 供されるキットが提供される。プロトコールおよび試薬の多様性に鑑み、広範囲 なキットか準備され得る。一般には、方法が粒子の添加を含む場合には、キット は粒子に共有または非共有結合されたりガントを有する粒子を含むことになる。

また、粒子の表面に結合されたかまたは粒子内に分散された標識、特に目で見え る範囲で着色され得る染料を用いてもよい。以下の文献はさまざまな標識方法を 記載する、すなわち化学発光（Ｍａｉｅｒ他、米国特許第４，１０４，０２９号 ）、着色粒子（Ｃ，ａｍｐ　ｂｅ　ｌ　Ｉ他、米国特許第４，７０３，０１７号 ）、着色可能な粒子（ｄｅＪａｅｇｅｒ他米国特許第４．８３７．１６８号）ま たは蛍光（ＬａｎｇｏｎｅおよびＶａｎ　Ｖｕｎａｋｉ使用してもよい。（たと えば、放射性同位元素の標識方法を記載するＬａｎｇｏｎｅおよびＶａｎ　Ｖｕ ｎａｋｉｓ編集のＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　７０　：バート Ａ（１９８０年）を参照されたい。

）他の例では、粒子は酵素で標識してもよい。

粒子が含まれていない場合には、試薬は標識した受容体またはリガンドを通常含 むことになり、標識は検出可能な信号をもたらしかつ検定媒体に存在する粒子の 移動の抑止を図り得る。標識した試薬に加えて、緩衝剤、安定剤、界面活性剤お よび適当てあれば酵素のための基質等の補助試薬、充填剤等を用いてもよい。ま たこのようなキットに加えられる可能性があるのはストリップ形状または何らか の他の都合のよい形で調製されるウィッキング（ｗｉｃｋｉｎｇ　）物質が考え られる。本願の好ましい実施例では、検定キットは乾燥剤を含み、より好ましく はこの乾燥剤が検定装置またはハウジング内に含まれる。

本願はその好ましい実施例を示す以下の例によりよりよく理解され得るが、これ らは本願の範囲を限定するものとしては解釈されない。

例Ｉ ライム抗体検定 抽出されたライム抗原がアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから購 入したボレリア・プルジョルフエリ株Ｂ−３１から調製される。この微生物は以 下に説明する修飾したＢＳＫＩＩ培地で増殖された。これを３３℃でインキュベ ートして遠心分離によって収集した。収集した細胞は５ｍＭ　ＭｇＣＬを含むリ ン酸塩緩衝塩水（ｐＨ７，４）で３回洗浄した後１ｍＭのＥＤＴＡを含むトリス 緩衝液（ｐＨ８，２）Ｉ　０ｍＭ中２％サルコシルで抽出した。この抽出処理は すべてのサルコシル溶解物質が抽出されるまで行なった。不溶性物質はさらにオ ムニミキサーで混合した。この混合した物質をこれ以降「ライム抗原」と呼ぶこ とにする。なお、同じライム抗原または同じ源からのライム抗原を牛、犬、猫お よびヒトを含むさまざまな哺乳類におけるライム特異的抗体の検出に使用し得る 点に留ラテックス粒子が上記の実験において使用されるが、他の粒子を使用して もよい結果が得られ得る点に留意されたい。リガンドと結合しない微粒子がさま ざまな例においてリガンド−粒子結合体に添加されるが、このような添加が本願 の実施に必要ではない、本願のさまざまな実施例が存在する点を理解されたい。

均−ｔＳラテックス粒子（ｒＵＬＰｊ）は一般に直径の小さい極めて均一な球で ある。典型的な直径は約０．１μｍを下回るものから約１００μｍにわたる。５ μｍを下回る粒子は通常乳化重合により一調製される。

ａ、リガンド−粒子結合体の調製 たとえば単純な吸収または共有結合を介してのりガント−粒子結合の基本的なプ ロセスは、着色ラテックス粒子の使用と同様、当該技術分野においては周知であ り、検定の分解能および読取り能力を高める。１９８９年米国臨床化学学会の第 ４１口金国大会のワークショップて提出されたＢａｎｇｓ、　Ｌ、　Ｂ、による 「均一ラテックス粒子」には一般的な用語でさまざまな方法が記載されておりか つインディアナ州インディアナポリスのＳｅｒａｇｅ口Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ 社から印刷物で入手可能であり、またはＧａｌｌｏｗａｙ、　Ｒ，Ｊ、の［微粒 子テストと免疫検定の発達」インディアナ州インディアナポリス５ｅｒａｔｙｎ 社に記載される。これらの文献およびこれらの文献に引用される文献についてこ こに引用により援用する。

たとえばコーティングされたラテックス粒子のある調製方法としては吸収法があ る。一般的には、１）純粋の試薬を使用し、２）コーティングの前に粒子を清浄 し、かつ３）粒子とりガントの化学的性質に関するの定量的表面被覆率を決定す ることが必要である。

たとえば、リガンド−ラテックス結合体（ｒＬ−ラテックス」）は以下のような 方法で調製することができる、すなわち一番簡単な場合には、適切なリガンドを 緩衝液に溶かし、ラテックス懸濁液に添加し、かつ数分間から２４時間を超える 範囲の時間にわたって攪拌する。平衡化を行なった後、ラテックスを遠心分離し て吸収されなかったりガントを含む上澄み液を捨てる。ラテックスは新たな緩衝 液に再懸濁されて、遠心分離され、上澄みが再び捨てられる。

これらのステップはラテックスから残留する未吸収リガンドがすへて洗い落とさ れたと判別されるまで繰返される。

この段階でラテックスコーティングプロセスを完了してもよくかつこのラテック スはラテックス凝集検定での使用の準備ができている。

共有結合はラテックス粒子表面へのリガンドまたは他の物質の永久または共有結 合を含む。共有結合を選択した場合には、まずリガンドをラテックス粒子に結合 する必要があり、それからラテックス粒子懸濁物の安定性を維持し、その後蛋白 質の変性を防止する必要がある。（共有結合技術の一般的な議論およびより詳細 な参照については、Ｂａｎｇｓ、　Ｌ、　Ｂ、の［均一ラテックス粒子Ｊを参照 されたい。なおこの文献についてはすてに引用により援用している。）これまで の説明はラテックス粒子に関して行なったか、これに限られるわけてはないが、 天然由来（たとえばプラスミド）または合成粒子（たとえばポリマー）、および 金属コロイドまたは粒子（たとえば金ゾル粒子）を含む他の粒子を使用してもよ い点を理解されたい。これらの粒子およびその抽出または調製方法については当 該技術分野において周知である。

ｂ、ＢＳＡ−ラテックス結合体の調製 牛血清アルブミン−ラテックス結合体（ｒＢＳＡ−ラテックスＪ）の調製は、上 記のりガント−ラテックス（Ｌ−ラテックス）調製に類似しており、調製におい てリガンドが使用されずＢＳＡが代わりに使用される点が相違する。

代替的には、非特異的結合を防止することができる他のアルブミン（ラクトアル ブミンを含む）、カゼイン、グロブリン、非特異的免疫グロブリン（抗原−抗体 反応に加わらない）等の他の蛋白質をＢＳＡの代わりに使用してもよい。

Ｃ，リガンド−ラテックスとＢＳＡ−ラテックスの混合し一ラテックスとＢＳＡ −ラテックスは、行なうテストに応じて、さまざまな比で混合される。たとえば 、例のいくつかに示されるような使用のための混合物を調製する場合には、Ｌ− ラテックスとＢＳＡ−ラテックスは容量比でおよそ２：１から５：１の比で混合 されて検定に使用された。検定の性質に依存して、この比を実質的に変更しても よく、蛋白質標識ラテックスの量が多ければ非特異的結合はより減少するという 結果が得られる。リガンドが付与されていないラテックス（または他の粒子）の 量は非特異的結合または誤った陽性反応を評価できる程度減らすのに有効な量で あればどのような量でもよい。この量については自明の経験的な方法によって簡 単に決定される。

ｄ、リガンド−ラテックスと「裸の」ラテックスの混合し一ラテックスと裸のラ テックスとはりガント−ラテックス／ＢＳＡ−ラテックス混合物に関して上に述 べたのと同様、行なわれるテストに依存してさまさまな比で混合される。上記の とおり、Ｌ−ラテックスの裸のラテックスに対する比は実質的に変更することが でき、蛋白質−標識ラテックスの量が多ければ非特異的結合の減少が大きいとい う結果がもたらされる。リガンドを付与されてｐｓｆｌｌｔ’ラテックス（また は他の粒子）の量は、非特異的結合または誤った陽性反応を評価できる程度に減 少するのに有効な量であればどのような量でもよい。この量については自明の経 験的な方法によって簡単に決定される。

例ＩＩＩ Ｂｏｒｒｅｌｉａ結合体の調製 Ｍａｇｓｐｈｅｒｅから入手した、５０ｍｇ／ｍｌ固体を有する１０ｍ１の青色 カルボキシル化ラテックス（好ましくは直径約０．　４ｔｔ）を１０％スクロー スと２０ｍＭのＭＥＳ緩衝液ｐＨ５，５中に０．５ｍｇ／ｍｌまで希釈する。ス ルホ−ＮＨ３（Ｐｉｅｒｃｅ）とＥＤＡＣ（ミズリー州セントルイス、　Ｓｉｇ ｍａ　）を最終濃度がそれぞれ１．　０８７ｍｇ／ｍ　１と２ｍｇ／ｍｌになる まで添加する。エンドツーエンドの回転で約３０分間混合する。活性化したラテ ックスは０゜２μｍナイロン膜を有するアミコン濃縮器で、２０ｍＭＭＥＳｐ８ ６．５中に１０％スクロース、０．０２％ＳＤＳで５回洗浄する。１０％スクロ ース、２ｍＭ　ＭＥＳ（ｐＨ６，５）でおよそ５０ｍｇ／ｍｌまで再懸濁し各回 １５秒間で４回音波処理する。

約０．５ｍｇの抽出ホレリア・プルジョルフエリ抗原を１０％スクロースと５０ ０ｍｇの活性ラテックス懸濁物を含む、０．０１％ＳＤＳ、２ｍＭ　ＭＥＳ緩衝 液（ｐＨ６゜５）中で混合する。ラテックスと抽出ボレリア・ブルジョルフェリ は２２°Ｃで２時間にわたって反応させられる。

抽出ボレリア・プルジョルフエリ抗原に結合されていない表面カルボキシル基を 中和するために、トリスバッファ（ｐＨ８，５）の溶液を２０ｍＭまで添加し、 その後カゼイン溶液（Ｓｉｇｍａ　）とＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３−１２　（カ リフォルニア州、サンディエコＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の溶液をそれぞれ０．５ ％と０．１％添加する。ボレリア・プルジョルフェリーラテックスは２０％スク ロース、２０ｍＭ）リス（ｐＨ８゜５）、０．１％Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ３− １２．０　、５％カゼイン、および０．３％ＢＳＡ−ラテックスを含む所望の濃 度まで希釈され固形支持体またはマトリクスへのプリントの準備が１．８ＳＫ− ＩＩ媒体の調製 グルタミンを含まない強化ＰＲＭＩ−１６４０１リットルに以下のものを添加し よく混ぜる、すなわち５ｇのネオペプトン（Ｎｅｏｐｅｐｔｏｎｅ）　（Ｄｉｒ ｃｏ　）および５０ｇのＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ　Ａ−４５０３、ミズーリ州セント ルイス）。ネオペプトンとＢＳＡとを完全に溶かした後以下のものを添加する。

すなわち２ｇのＴＣイーストレート（Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）　（Ｄｉｒｃｏ） 、６ｇのＨＥＰＥＳ　（Ｓｉｇｍａ　）　、０．　７　ｇのクエン酸ナトリウム 、５ｇのグルコース、０．８ｇのピルビン酸ナトリウム、０．４ｇのＮ−アセチ ルグルコサミン（Ｓｉｇｍａ）、および２．２ｇの炭酸水素ナトリウムである。

ｐＨを７．６−７．８に調整する。

修飾ＢＳＫ−１１媒体はＢａｒｂｏｕｒ、　Ａ、　Ｇ、のＹａｌｅ　Ｊ、Ｂ、Ｍ ｅｄ。

５７：５２１−５２５　（１９８４年）に示される方法により調製されたが、同 文献についてはここに引用により援用する。修飾された媒体はグルタミンを含ま ない強化されたＰＲＭＩ−１６４０および７％ゼラチンから調製された。

２、Ｂｏｒｒｅｌｉａ培養物の摂取および収集使用した装備は２　、　２　Ｌ　 Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコと、トラップを備えた減圧装置と、０．２ミクロ ン１リツトルフイル々ユニツト（Ｎａ１ｇｅｎｅ９０ｍｍ直径）と、層流フード を含む。

培地は適切で安全な実験室での処理によりＢｏｒｒｅｌ　ｉａを摂取された。培 地フラスコは念のため１晩３３°−３５°Ｃでインキュベートして汚染を調べた 。汚染の兆候には濁りの様子および／または酸性ｐＨシフトが含まれる。

例Ｖ 検定の調製と処理 １、固相の調製 固相検定フォーマットでの本願の用途の一例は本質的には以下のとおりに進めら れ得る。典型的な反応装置は検定のための固体支持部を含む固体のｍ−典型的に はプラスチックのｍ−ハウジングから構成される。一般に、ニトロセルロース等 の膜の断片が使用され、好ましくは免疫クロマトグラフィストリップが使用され る。たとえば、膜の右端かサンプルのウェルとの接触をもたらす。サンプルウェ ルは膜に沿って右から左へのサンプル流体の均一な流れを与える吸収パッドを含 む。可動粒子は膜の第１のゾーンーーたとえばラテックスビーズーーに与えられ 、この粒子は適切なリガンドまたは抗リガンドと結合する。たとえば、ボレリア ・プルジョルフエリから抽出された抗原は本明細書に記載したｌ実験において使 用された。ウィルスまたは細菌性抗原の分離および調製のさまざまな方法が当該 技術分野において知られている。たとえば、これに限られるわけてはないが、Ａ ｆｆｉ肝炎の抗原は米国特許第４，３０１，２４９号に記載されるＭａｒｋｕｓ 他の方法に従い調製され得、この文献をここに引用により援用する。

膜上の第２のゾーンにおいて、リガンドまたは抗リガンドが固定化される。第３ の試薬が使用されてもよく、たとえばこのような試薬は固体支持部上のゾーンに おいて固定化され得る。この試薬はサンプルが添加された後に第１のゾーンから 移動する粒子を結合することができるものであればよい。この第３の試薬は処理 の対照として作用しかつたとえば第３の試薬が固定化されたゾーン内で検出可能 な応答が発生した場合に検定が完全であること、または適切に実行されたことを 示す役割を果たし得る。

典型的なりロマトグラフイ検定テスト工程では、液体の標本が第１のゾーンに近 接する固体支持部に付与される。

流体は毛細管作用により膜の第１のゾーンへ移動し、可動粒子を移動させる。流 体は粒子を膜を横切って次のゾーン（または複数のゾーン）へ移動させ続ける。

被検体がサンプル内に存在する場合、固相抗原／被検体／抗原結合粒子の　［サ ンドウィッチ］構造が形成されかつ検出可能な結果が生じる。流体が膜を横切っ て粒子を移動させ続けると、流体／粒子が支持部上に固定化される第３の試薬と の接触状態に至る。そこで検出可能な応答が起こり、テストが有効であるかまた はテストが完了したことを示すはずである。

２、テスト経過 固相検定（または膜のみ）をよ（光の当たる平な表面上に置く。第１のゾーンに 近接するサンプル付与領域内／上に液体サンプルの１ｉｌｌｉ　（５０μＬ）を 落とす。付与領域は検定の性能をさらに促進するために緩衝液を含んでいてもよ い。このような緩衝液の一例はＯ，１Ｍ）リス（ｐＨ８゜０）中に２％のカゼイ ンと０５％のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔを含む。

代替的には、サンプルは、サンプルまたはサンプル混合物をサンプル付与領域に 投与する前に、他の物質−一たとえば生理食塩水−一と混合してもよい。その直 後にサンプル付与領域に展開剤溶液を数滴（好ましくは約６滴）添加する。有効 な展開剤溶液は水溶液でたとえば１％のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ、１％のトライ トン（Ｔｒｉｔｏｎ）　ｘ　−１００，０，０２％のＳＤＳ、０．２％のＮａＮ ３、および５０ｍＭ）リス緩衝液　（ｐＨ８，５）を含む。

このテストを約１０分間行ない結果を読取る。１０分が経過する前にシグナルが 第３のゾーンに表れるかもしれないが、１０分間いっばいまで待った方がはるか に正確に結果は読取れるようである。適当な時間が経過した後、適切なシグナル が適切な領域（または複数の領域）で検出された場合、検定結果を読み取っても よい。たとえば、シンボルが第３ゾーンに表れると、テスト結果は有効および陰 性と解釈され得る。シンボルが第２および第３のゾーンに表れると、結果は有効 で陽性と解釈され得る。

検定結果との比較目的でまたは試薬の生存度をテストするために対照溶液をさら に加えてもよい。たとえば陽性の対照溶液は２ｍｇ／ｍｌのウサギのガンマグロ ブリンと５０ｍＭ）リス（ｐＨ８，０）中に約０．５ｍｇ／ｍｌｌ製ウサギ抗ラ イム抗体を含み得る。陰性の対照は５０ｍＭ）リス（ｐＨ８，０）中に２ｍｇ／ ｍｌのウサギのガンマグロブリンを含み得る。これらの溶液は本明細書中に開示 した試薬および検定成分のいずれかまたはすべてでキットの形で与えられ得る。

本願は特定の実施例に基づき記載したが、特許の権利範囲はこれら特定の実施例 に限られるのではなく以下の特許請求の範囲を参照して決定されることを意図す るものである。

国際調査報告　ｅ＋Ｍ／ｌｉｅ　６９１ＭＬＤ。

ＰＣＴ／ＬＩＳ　９２１０３６８０ フロントページの続き （８１）指定−ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、ＡＵ、ＣＡ 、ＦＩ、ＪＰ、ＫＲ，Ｎ○（７２）発明者　ワン、ドウーメイ アメリカ合衆国、９２０２４　カリフォルニア州、エンシニタス、シルバー・ピ ーク・ブレイス、２２１６

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. １．体液中の被検抗体の検出または決定のための分析装置であって、互いに隣接 しかつ互いに吸収接触状態にある複数の実質的に平坦なゾーンからなる層を含み 、前記層が、ａ）サンプル付与ゾーンと、 ｂ）可動粒子に結合した抗原を含む結合ゾーンと、ｃ）固定化された抗原を含む 検出ゾーンとを含み、抗原が結合および検出ゾーン双方において同じでありかつ 被検抗体に結合する抗原であり、液体サンプルが結合ゾーンを通ってサンプル付 与ゾーンから検出ゾーンへ移動可能でありかつ前記被検抗体がサンプルに存在し ている場合には検出ゾーンで検出される、装置。
2. ２．可動粒子が着色されたプラスチック粒子または金属ゾルである、請求項１に 記載の装置。
3. ３．抗原が抗体に結合し、抗体がボレリア・プルジョルフェリ微生物のエピトー プに結合する、請求項２に記載の装置。
4. ４．可動粒子が着色されたポリスチレン微粒子である、請求項３に記載の装置。
5. ５．層がニトロセルロースから製作される、請求項４に記載の装置。
6. ６．被検抗体を含む疑いのあるサンプルをサンプル付与ゾーンに添加しかつサン プルが検出ゾーンを通って層を横切るまで十分な時間待機し、かつ検出ゾーンに おける結果を読取ることを含む、請求項１に記載の装置を採用する方法。
7. ７．可動粒子が着色されたプラスチック粒子または金属ゾルである、請求項６に 記載の方法。
8. ８．使用する抗原が抗体に結合し、抗体がボレリア・プルジョルフェリ微生物の エピトープに結合する、請求項７に記載の方法。
9. ９．可動粒子が着色されたポリスチレン微粒子である、請求項８に記載の方法。
10. １０．層がニトロセルロースから製作される、請求項９に記載の方法。
11. １１．流体中の被検抗体の存在または濃度の決定のための方法であって、 ａ）流体のサンプルを被検抗体の第１の抗原と接触させるステップを含み、第１ の抗原と被検抗体との間に可溶性複合体を形成するために第１の抗原が標識され 、ｂ）可溶性複合体を第２の抗原と接触させるステップを含み、第１の抗原、被 検抗体、および第２の抗原からなる不溶性複合体を形成するために、前記第２の 抗原が流体に溶解しない固相に結合され、 ｃ）流体サンプルと未反応の第１の抗原から固相を分離するステップと、 ｄ）固相に結合された第１の標識した抗原または第１の標識した抗原の未反応量 を測定するステップと、ｅ）ステップａ）からｄ）に従い調製した、被検抗体を 含まない対照サンプルに対し測定した第１の標識した抗原の量を関連付けて前記 流体サンプル中の被検抗体の存在を決定するか、または流体サンプルに関して測 定した第１の標識した抗原の量をステップａ）からｄ）に従い調製した含んでい る被検抗体の量がわかっているサンプルに関し測定した標識した抗原の量に関連 付けて流体サンプル中の被検抗体の濃度を決定するステップとを含み、第１およ び第２の抗原双方がそれぞれ標識されるか固相に付与される前は同じである、方 法。
12. １２．標識が酵素または放射性同位元素である、請求項１１に記載の方法。
13. １３．抗原が抗体と反応し抗体がボレリア・プルジョルフェリのエピトープと反 応する、請求項１２に記載の方法。
14. １４．標識がアルカリホスファターゼでありかつ固相がビーズ、試験管の内壁ま たはマイクロタイタープレートのウェルである、請求項１３に記載の方法。
15. １５．標識がアルカリホスファターゼでありかつ固相が非クロマトグラフィ装置 である、請求項１４に記載の方法。
16. １６．テスト対象の流体に溶けない固相に結合された第１の抗原と標識に結合さ れた第２の抗原を含む試薬とを含む検定キットであって、固相および試薬が流体 中の被検抗体に関し少なくとも１回の検定を行なうのに十分な量を存在しかつ第 １および第２の抗原が、それぞれ固相に結合されるかまたは標識される前は同じ である、検定キット。
17. １７．標識が酵素または放射性同位元素である、請求項１６に記載の検定キット 。
18. １８．抗原が抗体に結合する抗原で、抗体がボレリア・プルジョルフェリのエピ トープに結合する、請求項１７に記載の検定キット。
19. １９．標識が酵素である、請求項１８に記載の検定キット。
20. ２０．固相が非クロマトグラフィ装置である、請求項１９に記載の検定キット。
21. ２１．標識がアルカリホスファターゼでありかつ固相がプラスチックビーズ、試 験管の内壁またはマイクロタイタープレートのウェルである、請求項２０に記載 の検定キット。
22. ２２．流体中の被検抗体の存在または濃度を決定するための方法であって、 ａ）流体のサンプルを第１および第２の抗原に同時に接触させるステップを含み 、第１および第２の抗原と被検抗体との間に不溶性複合体を形成するために第１ の抗原が流体に溶解しない固相に結合されかつ第２の抗原が標識されて測定され た量で与えられ、 ｂ）未反応の第２の標識された抗原を含む流体サンプルから固体担体を分離する ステップと、 ｃ）固相に結合された第２の標識された抗原の量または未反応の第２の標識され た抗原の量を測定するステップと、ｄ）第２の標識された抗原の量を、ステップ （ａ）から（ｃ）に従い調製し被検抗体を含んでいないことがわかっている対照 サンプルに関し測定した標識した抗原の量に関連付けて流体サンプル中の被検抗 体の存在を決定するか、または流体サンプルに関し測定した標識した抗原の量を 、ステップａ）からｃ）に従い調製し含んでいる被検抗体の量がわかっているサ ンプルに関し測定した標識した抗原の量と関連付けて流体サンプル中の被検抗体 の濃度を決定するステップとを含み、 第１および第２の抗原はそれぞれ固相に結合されかつサンプルされる前は同じで ある、方法。
23. ２３．標識が酵素または放射性同位元素である、請求項２２に記載の方法。
24. ２４．第１および第２の抗原が抗体に結合し、抗体がボレリア・プルジョルフェ リのエピトープに結合する、請求項２３に記載の方法。
25. ２５．標識がアルカリホスファターゼでありかつ固相がプラスチックビーズ、試 験管の内壁、またはマイクロタイタープレートのウェルである、請求項２４に記 載の方法。
26. ２６．標識がアルカリホスファターゼでありかつ固相が非クロマトグラフィ装置 である、請求項２４に記載の方法。
27. ２７．流体サンプル中の被検抗体の存在または量を決定するための方法であって 、 ａ）流体のサンプルを第１の抗原に接触させるステップを含み、第１の抗原と被 検抗体との間に不溶性複合体を形成するため第１の抗原が流体に溶解しない固相 に結合され、ｂ）被検抗体と第１の抗原とからなる不溶性複合体から未反応の被 検抗体を含む流体サンプルを分離するステップと、 ｃ）測定した量の第２の標識した抗原と第１の抗原および被検抗体からなる不溶 性複合体とを反応させて第１および第２の抗原と被検抗体とかちなる不溶性複合 体を形成するステップと、 ｄ）未反応の第２の標識した抗原から固相を分離するステップと、 ｅ）固相に結合された第２の標識した抗原の量または未反応の第２の標識した抗 原の量を測定するステップと、ｆ）測定した第２の標識した抗原の量を、ステッ プａ）からｅ）に従い調製し被検抗体を含んでいないことがわかっている対照サ ンプルに関し測定した標識した抗原の量と関連付けて被検抗体の存在を決定する か、または流体サンプルにおいて測定した標識した抗原の量を、ステップａ）か らｅ）に従い調製した含んでいる被検抗体の量がわかっているサンプルに関し測 定した標識した抗原の量と関連付けて流体サンプル中の被検抗体の濃度を決定す るステップとを含み、 第１および第２の抗原がそれぞれ固相に結合されるかまたは標識される前は同じ である、方法。
28. ２８．標識が酵素または放射性同位元素である、請求項２７に記載の方法。
29. ２９．第１および第２の抗原が双方ともにボレリア・プルジョルフェリの微生物 のエピトープと複合体を構成する、抗原である請求項２８に記載の方法。
30. ３０．標識がアルカリホスファターゼである、請求項２９に記載の方法。
31. ３１．固相がビーズ、試験管の内壁、またはマイクロタイタープレートのウェル である、請求項３０に記載の方法。
32. ３２．固相が非クロマトグラフィ装置である、請求項３０に記載の方法。