JPH06508983A - ライブラリースクリーニング法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、標的ＤＮＡ断片（ｔａｒｇｅｔ　ＤＮＡ　ｆｒａｇｍｅｎｔ）と、Ｄ ＮＡ断片ライブラリーに導入された標的捕捉ＤＮＡ分子（ｔａｒｇｅＨｎｇ　Ｄ ＮＡ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ）中に存在するＤＮＡの間の相同組換えに基づいて真核 生物宿主細胞中のＤＮＡ断片ライブラリーから対象のＤＮＡ断片（標的ＤＮＡ断 片）を同定および単離する方法に関する。本発明はさらに、標的捕捉ベクター（ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｖｅｃｔｏｒ）および本明細書中で説明するようにして真 核生物宿主細胞中に構築したＤＮＡ断片ライブラリーに関する本発明の方法は、 相同組換えによって遺伝子組換え（宿主細胞中の人工ユニット（ａｒｔｉｆｉｃ ｉａｌ　ｕｎｉｔ）（またはエビソーム）あるいは染色体に存在するＤＮＡと宿 主細胞に導入されたＤＮＡの間の情報交換）が起こる真核生物宿主細胞中に構築 したＤＮＡ断片ライブラリーをスクリーニングするために用いられる。真核生物 宿主細胞中では、ＤＮＡ断片は、真核生物宿主細胞中で複製され得るエビソーム あるいは他の人工ユニットの形で増殖される。このエピソームまたは人工ユニッ トは、ＤＮＡ断片に加えて、細菌中での増殖のために使用され得る配列、細菌中 での選択のための１またはそれ以上のマーカー遺伝子、および真核生物宿主細胞 中での選択のための１またはそれ以上のマーカー遺伝子をも含んでいる。

真核生物宿主細胞が酵母である本方法の一つの態様においては、遺伝子組換えは 実質的に相同組換えのみによって起こる。ＤＮＡ挿入断片に加えて染色体が天然 に存在する宿主細胞染色体と同様の方法で宿主細胞複製と有糸分裂分離に関与す るために必要なりＮＡ配列のすべてを含む人工染色体の形で、宿主細胞中のＤＮ Ａ断片は増殖される。一般に、上記人工染色体はある宿主細胞中に単一コピーま たは低コピー数で存在する。

本発明の方法は、次のような特徴を有する標的捕捉ベクター（ｔａｒｇｅｔｉｎ ｇ　ｖｅｃｔｏｒ）またはビーイクルを利用するものである。すなわち、ｌ）少 なくとも標的ＤＮＡ断片の一部に対して相同である標的捕捉Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｔａ ｒｇｅｔｉｎｇ　ＤＮＡ）と呼ばれるＤＮＡ配列、および適当な条件下で宿主細 胞中で機能する選択可能なマーカー遺伝子を含み、２）宿主細胞中で複製しない 。標的捕捉ＤＮＡとしては、いかなるＤＮＡ配列も使用することができ、ゲノム ＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび公知の方法を用いて合成されたＤＮＡが含まれる。大腸 菌宿主から精製すると環状であるのが普通の標的捕捉ベクター中に存在する標的 捕捉ＤＮＡに二本鎖切断を作ることが好ましい。あるいは、標的捕捉ＤＮＡ中に ２個の切断を作ることによって（例えば適当に選んだ単数または複数の制限酵素 で）、ギャップを導入することも可能である。この切断またはギャップはベクタ ーを線状化させるとともに、宿主細胞人工染色体配列との相同組換えを刺激する ＤＮＡ末端を提供し、相同組換えによる安定的形質転換の効率を上げる。

ＤＮＡ断片ライブラリーを保持する細胞に標的捕捉ベクターを導入し、一部は標 的捕捉ベクターを含み一部は含まない宿主細胞の混合群を得る。得られた宿主細 胞群は、細胞内にすでに存在しているＤＮＡ　（すなわち標的捕捉ベクターの導 入の前）と標的捕捉ベクター中のものなどの相同配列の間の相同組換えに適した 条件下に保つ。次いで、この細胞群を相同組換えがすでに起きている宿主細胞の 選択に適した条件に置く。標的捕捉ベクターは宿主細胞中で複製する能力がない ので、選択可能なマーカーによる安定的形質転換は相同組換えによってしか起き 得ない。この選択可能なマーカー遺伝子は複製されるので、宿主中で複製可能な 配列との相同組換えがすでに起きている宿主細胞中においてのみ安定的表現型を もたらす。このような宿主細胞の同定、したがって対象の標的ＤＮＡ断片を含有 する宿主細胞の同定は、相同組換え（および安定的形質転換）がすでに起きてい る宿主細胞のみが生存できる条件下で宿主細胞の群を培養（例えば適当な培地上 での培養）することによって行なう。形質転換させた宿主細胞の成長は、標的Ｄ ＮＡ断片の存在の指標となる。その結果、標的ＤＮＡ断片を含有する宿主細胞が 、標的ＤＮＡ断片を含有しない宿主細胞から分離または単離される。標的ＤＮＡ 断片は、公知の技術を用いて宿主細胞から取り出して配列決定または操作（例え ばサブクローン化やマツピング）することができる。

あるいは、標的捕捉ＤＮＡおよび酵母中での選択のための選択可能なマーカーは 、ＤＮＡ断片ライブラリーを含有する酵母細胞中に、標的捕捉ＤＮＡと複製性酵 母線状プラスミドである標的捕捉ビービクル上の選択可能なマーカー遺伝子とを 含有する酵母菌株をそのライブラリーを含有する酵母宿主細胞と接合させること によって、導入することができる。この態様においては、２つの酵母菌株は反対 の接合型のものでなければならない。標的捕捉線状プラスミドと標的捕捉ＤＮＡ に対して相同なりＮＡを有するライブラリーＹＡＣの間に相同組換えが起き、そ れぞれがＹＡＣである２個の線状分子ができる。一つの態様においては、該線状 プラスミドは標的捕捉ＤＮＡ配列に隣接する陰性的に選択可能なマーカーを有す る。２個の組換え生成物のそれぞれは２個の陰性的選択可能なマーカーのうちの 一つを育しているので、２個の組換え生成物の識別選択が可能である。反対の接 合型の酵母菌株の接合を利用する本方法の他の態様においては、第１の酵母菌株 は、標的捕捉ＤＮＡと第１の選択可能なマーカー遺伝子が組換え事象により酵母 レプリコンから遊離することができ、そして陰性的に選択可能なマーカー遺伝子 である第２の選択可能なマーカー遺伝子がレプリコンそれ自体の選択に利用でき るように構築された酵母複製性プラスミドを含有している。この菌株が、ＹＡＣ ライブラリーのすべてのメンバーと接合すると、遊離させられた標的捕捉配列は そのライブラリー内のＹＡＣ分子との組換えを受けることができる。

上記複製性酵母プラスミドは、形質転換によってＹＡＣ含有宿主細胞にも導入す ることができる。

好ましい態様においては、酵母人工染色体（ＹＡＣ）中になどの酵母の中にＤＮ Ａ断片ライブラリーを構築する。各酵母宿主細胞は１個のＹＡＣまたは数個のＹ ＡＣを含んでおり、それぞれのＹＡＣは１個または数個のコピー数で存在する。

１個のＹＡＣは、ＤＮＡ断片に加えて染色体が酵母中で複製し、染色体を子孫に 伝え、染色体末端を安定させるのに必要なりＮＡ配列をすべて含んでいる。この 態様においては、使用する標的捕捉ベクターは酵母中で複製しない細菌プラスミ ドその他のベクターであり、標的捕捉ＤＮＡおよび酵母中で機能する選択可能な マーカー遺伝子を含んでいる。標的捕捉ベクターは、酵母細胞に導入する。この 際、細菌プラスミドの標的捕捉ＤＮＡ内に二本鎖切断を導入することによって線 状化されていることが好ましい。得られた酵母細胞混合群を標的捕捉ＤＮＡとＹ ＡＣ中の標的ＤＮＡの間に相同組換えが起きるのに適した条件下に保つ。次いで 、標的捕捉ＤＮＡと選択可能なマーカー遺伝子によって安定的に形質転換された 酵母細胞を選択する。酵母細胞の安定的形質転換によって、抗生物質耐性、（ア ミノ酸原栄養素性やヌクレオシド原栄養素性などの）原栄養素性、金属イオン耐 性、細胞サイクルの進行能力または細胞表層マーカーの発、現のような選択可能 表現型が該酵母細胞に与えられる。安定的に形質転換された細胞だけが生存でき る条件下での酵母細胞の成長は、標的ＤＮＡ配列の存在の指標となる。標的ＤＮ Ａは、公知の技術を用いて宿主細胞から取り出して配列決定又は操作することが できる。

本発明は、本発明の方法において有用な標的捕捉ＤＮＡ分子およびベクターにも 関する。ベクターとしては、酵母中で複製しない細菌プラスミドのような標的捕 捉ベクターが含まれ、標的捕捉ＤＮＡおよび酵母中で機能する選択可能なマーカ ー遺伝子を含んでいる。また、細菌中で選択するための選択可能なマーカー遺伝 子も含んでいる。付加的な標的捕捉ＤＮＡ分子としては、酵母線状プラスミドの ような複製性の分子が挙げられる。

本発明の方法において有用なＹＡＣアームベクターも本発明の対象である。これ らの例としては、酵母で選択可能なマーカー遺伝子、細菌の複製起点、細菌で選 択可能なマーカー遺伝子、酵母末端小粒、および標的捕捉ＤＮＡがベクターに導 入または挿入される位置である１個以上のクローン化部位などが挙げられる。ま た、ＹΔＣアームベクターには酵母動原体配列および／または酵母複製起点も含 めることができる。本発明の主題であるＹＡＣアームベクターとしては、ｐＴＫ ＥＮＤＡ、ｐＴＫＥＮＤＡ２、ｐＴＫＥＮＤＢ、ｐＴＫＥＮＤＣ，ｐＴＫＥＮＤ Ｄと名付けられたものおよびこれらの機能的同等物が挙げられる。

本発明はさらに、本明細書で説明しているようにして構築され、本願請求の方法 によってそれから対象（ｉｎｔｅｒｅｓｔ）Ｄ　ＮＡ断片を同定および単離する ことができるＹＡＣライブラリーの構築に有用である真核生物宿主細胞、特に酵 母細胞に関する。また、本発明は、上記真核生物宿主細胞中に構築したＤＮＡ断 片ライブラリー、特にＹＡＣライブラリーにも関する。

一つの態様において、ＤＮＡ断片ライブラリーは、４個の選択可能なマーカー遺 伝子の染色体上欠失（すなわち、酵母菌株ゲノム中に通常存在する４個の選択可 能なマーカー遺伝子が欠失している）を有する酵母宿主菌株中に構築される。

この酵母菌株は、一対のＹＡＣアームベクターをその中に組み入れられた、その 各々は、次の要素を含んでいる：酵母宿主菌株から欠失した４個の選択可能なマ ーカー遺伝子の１つである酵母の選択可能なマーカー遺伝子：細菌の複製起点； 細菌の選択可能なマーカー遺伝子および酵母の末端小粒。一対のＹＡＣアームベ クターの各メンバー中の酵母の選択可能なマーカー遺伝子は、その対の他のメン バー中に存在するものとは異なっている。一つの態様においては、酵母菌株は、 ＡＲＧ４遺伝子の染色体上欠失、ＴＲＰＩ遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子およびＵＲＡ ３遺伝子を持っている。一対のＹＡＣアームベクターは、これらのマーカー遺伝 子の対のどの組み合わせを含むこともでき、その対の各メンバーは、その対の他 のメンバー中に含まれるものとは異なるマーカー遺伝子を含む。ニーライブラリ ー系を用いる一つの態様においては、酵母宿主菌株は、４個の選択可能なマーカ ー遺伝子の染色体上欠失を有しており、そして二対のＹＡＣアームベクターが用 いられ、そのベクターの各々は酵母宿主菌株から欠失されており、それが使用さ れるＹＡＣアームベクターの対の他のメンバー中には存在しない選択可能なマー カー遺伝子を保持している。このような酵母宿主菌株とＹＡＣアームベクターに ついては、ここに詳細に記述される。

本発明における方法、標的捕捉ベクター（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｖｅｃｔ。

ｒｓ）、ＹＡＣアームベクターおよびＤＮＡ断片ライブラリーは、ゲノムＤＮＡ またはｃＤＮＡあるいは遺伝子全体、遺伝子の一部またはその他のＤＮＡ配列で あってもよい標的ＤＮＡ断片の同定および単離に有用である。本発明の方法によ ってスクリーニングされるＤＮＡ断片ライブラリー中のＤＮＡは、哺乳類（特に ヒト）、植物、昆虫、鳥、魚、甲殻類、軟体動物、ウィルス、線形動物、両生類 、爬虫類または原生動物などいずれのタイプのものであることもできるが、これ らに限定されるものではない。例えば、これらを用いて、特定の疾患、状態、表 現壓または量的形質に関係する遺伝子、ある生物のゲノム内部の関連遺伝子、お よびｃＤＮＡを同定および単離することができる。

さらに、本明細書に述べるように、物理的に隣接するＤＮＡ配列を酵母細胞中の ＹＡＣライブラリー（またはその他のＤＮＡ断片ライブラリー）中で同定し、染 色体位置地図の作成に利用することができる。すなわち、本発明の方法は染色体 歩行に有用である。この態様においては、本明細書に説明する本願請求の相同組 換え方法を用いて標的ＤＮＡ断片を含有する第１のＹＡＣを単離し、得られた断 片の末端をサブクローン化させる。多くの場合、染色体歩行の正しい進行方向を 決めるために両方の末端をサブクローン化させる。次いで、第１の標的ＤＮＡ断 片の末端を、ＹＡＣライブラリーに導入される標的捕捉ベクター中に存在する標 的捕捉ＤＮＡとして使用する。第１の標的ＤＮＡと配列が一部重複している標的 ＤＮＡ断片をその一部として保持している第２の標的ＹＡＣを単離する。第２の 末端をサブクローン化し、ＹＡＣライブラリーに導入される標的捕捉ベクター中 で標的捕捉ＤＮＡとして使用する。これにより、配列が第２の標的ＤＮＡ断片と 一部重複している標的ＤＮＡ断片を含有する第３のＹＡＣが単離される。このプ ロセスにより、部分的に重複している標的ＤＮＡ断片を含有する一連のＹＡＣが 単離される。そしてこのプロセスは、目的の位置地図の作成に必要なだけ何回で も繰り返すことができる。染色体歩行は、制限断片長多型性（またはＲＦＬＰ） を示すＤＮＡ、ＲＦＬＰに隣接するＤＮＡ断片またはｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを標的捕捉 ベクター中で標的捕捉ＤＮＡとして用いることにより、ＹＡＣライブラリーをス クリーニングする本発明の方法で実施することができる。このようにして単離し た標的ＤＮＡの末端をサブクローン化または単離し、得られた配列を用いて隣接 のＤＮＡ断片を単離する。位置地図の作成に必要な回数だけ、最も好ましくは、 例えばＲＦＬＰが関連している目的の遺伝子が得られるまでこれを繰り返す。

本発明の方法はＤＮＡライブラリーをスクリーニングする他の方法に比べて多（ の利点がある。例えば、同時に、多数回のＤＮＡ断片ライブラリーのスクリーニ ングが可能である。ライブラリーはクローンのプールとして保存されるので、多 くのフィルター膜に分布しているライブラリーを整理およびスクリーニングする のに必要な作業が不要になる。従来の方法の所要労力と比べて、ライブラリーを スクリーニングするのに要する時間が大幅に短縮される。さらに、末端配列が、 次の歩行段階に適した形で、サブクローニングの必要なく、ＹＡＣクローンから 単離される。

図面の簡単な説明 図１は、本発明の相同組換え選択方法によるＹＡＣライブラリー中の標的ＤＮＡ 断片の同定を示す。ＹＡＣは、末端小粒（矢印）、動原体／酵母複製起点（黒塗 り丸）、およびＤＮＡ断片を含み、クローン＃３の場合、該ＤＮＡ断片はその内 部に標的ＤＮＡ断片（黒塗り四角）を有する。

図２は、選択用に標識を付けたＹＡＣを作成するための標的化（相同的相互組換 え）を示す。

図３は、１段階遺伝子破砕法を用いる相同組換えによる、ＤＮＡ　ＹＡＣライブ ラリーからのＤＮＡクローンの選択を示す。

図４は、２つのＤＮＡ　ＹＡＣライブラリーを用いる相同組換えによるＤＮＡク ローンの選択を示す。

図５は、プラスミドｐ　１８４　ＤＬＡＲＧの地図であり、ＢはＢａｍＨＩ、Ｓ ｍはＳｍａ　Ｉ、ＰはＰｓ　ｔ　Ｔ、ＡＲＧ４は酵母ＡＲＧ４遺伝子（矢印は転 写の方向を示す）、Ｃｍはクロラムフェニコール耐性遺伝子、ＯＲＩ　（ｐＡＣ Ｙｏ　１８４）はｐＡＣＹＣ１８４由来複製起点、−一一一一はクローニング部 位に挿入された仮説的標的捕捉配列を示す。

図６ａは、ｐＴＫＥＮＤＡのプラスミド地図である。

図６ｂは、ｐＴＫＥＮＤＢのプラスミド地図である。

図６ｃは、ｐＴＫＥＮＤＣのプラスミド地図である。

図６ｄは、ｐＴＫＥＮＤＤのプラスミド地図である。

図７は、ヒトイプシロン−およびベーターグロビン配列による標的化によって選 択したクローンの制限酵素・サザンプロット分析の結果を示す。

図８ａは、ＹＡＣアームベクターの構築に用いられるオリゴヌクレオチドを含む 。大文字の配列は、イン・ビトロで合成されたオリゴヌクレオチドに対応する塩 基を示す。小文字の配列は、アニーリングされたオリゴヌクレオチドの各対を用 いてイン・ビトロで埋められた塩基を示す。関連する制限酵素認識配列も示され ている。

図８ｂは、ＹＡＣアームベクターの構築に用いられるオリゴヌクレオチドを含む 。大文字の配列は、イン・ビトロで合成されたオリゴヌクレオチドに対応する塩 基を示す。小文字の配列は、アニーリングを受けたオリゴヌクレオチドの各対を 用いてイン・ビトロで埋められた塩基を示す。関連する制限酵素認識配列も示さ れている。

図８０は、ＹＡＣアームベクターの構築に用いられるオリゴヌクレオチドを含む 。下線を引いた塩基は、野生型配列からの変異を示す。

図９は、断片８Ａでスクリーニングすることによって単離された８個の酵母コロ ニーに由来するＤＮＡの制限酵素及びサザーンハイプリダイゼーションによる分 析の写真である。

レーン１〜４はクローン８Ａ、１，８Ａ、２．８Ａ、３．８Ａ、４、レーン５は プラスミドｐ１８４−８Ａを示す。レーン６と７はクローン８Ａ、５と８Ａ、６ 、レーン８は単位−長一線状バンド（ｕｎｉｔ−１ｅｎｇｔｈ−１ｉｎｅａｒ　 ｂａｎｄ）を示さない単離コロニーに由来するＤＮＡの例、レーン９はクローン ８Ａ。

１１を示す。１マイクログラムの全酵母ＤＮＡをレーン１〜４および５〜９にの せた。２ナノグラムのプラスミドｐ１８４−８Ａをレーン５にのせた。電気泳動 したＤＮＡ試料（すべてＫｐｎＴで消化した）をナイロン膜に移し、３２−Ｐ標 識ＡＲＧ４　ＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。矢印は、８．３ｋｂの位 置にある単位−長一線状ノくンドの位置を示す。

図１Ｏは、ＸｈｏｌおよびＫｐｎｌ（断片８Ａを用いるスクリーニングによって 単離したクローンの場合）またはＡｖａｌｌ（断片１０Ｂを用いるスクリーニン グによって単離したクローンの場合）のいずれかで消化した陽性クローンのそれ ぞれに由来するＤＮＡの制限酵素及びサザーンノλイブリダイゼーションによる 分析の写真である。試料を１％アガロースゲル上で電気泳動し、ナイロン膜に移 し、コ！Ｐ標識ｐＢＲ３２８［ベーリンガーマンハイムバイオケミカルズ（Ｂｏ ｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａ ｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）コとハイブリダイズさせた。レーン１〜７はクローン８ Ａ、Ｌ　８Ａ。

２．８Ａ、３．８Ａ、４．８Ａ、５．８Ａ、６．８Ａ、１１を示しくいずれも断 片８Ａを用いるスクリーニングによって単離）、レーン８〜ＩＯはクローン１０ Ｂ６．１０Ｂ、２９、ＩＯ８，４１（断片１０Ｂを用いるスクリーニングによっ て単離）を示す。

図１１は、ＡＲＧ４　ＤＮＡプローブにハイブリダイズするユニット長線状断片 の存在を調べるＹＡＣＤＮＡの分析結果を示し、レーンｌは、ｐ　１８４ＤＬＡ ＲＧのＰｓｔ１部位にクローニングしたヒトＡＤＡ座位由来の８５２塩基対のＰ ｓｔＩ断片を含有するプラスミドｐ　１８４　ＤＬＡＲＧ／ＰＣＲＦ、５のＥｃ ｏＮＩ消化断片を示す。１ナノグラムの消化プラスミドＤＮＡをのせた。レーン ２と３は空（試料をのせず）を示す。レーン３〜６は候補形質転換体１８４　Ａ ＤＡ、ＢＳ　１８４ＡＤＡ、Ｃおよび１８４ＡＤＡ、Ｄに由来するＥｃｏＮＩ消 化ＹＡＣＤＮＡ　（約１マイクログラム）を示す。電気泳動した試料をナイロン 膜に移し、３２−Ｐ標識ＡＲＧ４　ＤＮＡ断片とハイブリダイズさせた。矢印は Ｅｃ。

Ｎｌｌ線状化プラスミドル１８４ＤＬＡＲＧ／ＰＣＲ，５（５，２ｋｂ）の位置 を示す。

図１２は、線状酵母プラスミドを用いる組換えによって標的ＤＮＡを含有するＹ ＡＣを同定する本発明の相同組換え法の一つの態様の概略を示す。

ＡＴＣＣ寄託の簡単な説明 アメリカン　タイプ　カルチャー　コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ 　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）にて下記の寄託番号で下記の寄託が なされている（１９９０年６月２８日）。これらの寄託はブダペスト条約の規定 に基づくものであり、そしてそれらの入手の際のあらゆる制限は合衆国特許の付 与に際して取り除かれる。

１、サツカロミセス　セレビシ：ｒ−（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅ ｖｉｓｉａｅ）　ＴＤ７−１６ｄ菌株、ＡＴＣＣ第７４０１０号２、プラスミド ｐ　１８４ＤＬＡＲＧ、ＡＴＣＣ第４０８３２号 ３、プラスミドｐＴＫＥＮＤＡ、ＡＴＣＣ第４０８３、発明の詳細な説明 本発明は、真核生物細胞中で構築したＤＮＡ断片ライブラリーのスクリーニング および標的ＤＮＡ断片と呼ばれる対象ＤＮＡ断片の同定と単離の目的に真核生物 細胞中で起きる相同組換えのプロセスを利用することができるという本願出願者 の発見に基づくものである。

本発明は、相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ） によって遺伝子組換えが起こる真核生物宿主中に構築したＤＮＡライブラリーか ら標的ＤＮＡ断片と呼ばれる対象ＤＮＡ断片を単離する方法である。該標的ＤＮ Ａ断片は一般に該真核生物宿主細胞中に含まれる、より大型の断片中に存在する 。ＤＮＡライブラリーの構築に使用するＤＮＡは、ヒトその他の生物起源のｃＤ ＮＡまたはゲノムＤＮＡであってもよく、植物や他の哺乳動物のｃＤＮＡまたは ゲノムＤＮＡをも含む。この標的ＤＮＡ断片は、標的捕捉Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｔａｒ ｇｅｔｉｎｇ　ＤＮＡ）と適当な選択可能なマーカー遺伝子を含む非複製性標的 捕捉ビーイクル（ｎｏｎ−ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ　ｔａｇｅｔｉｎｇ　ｖｅｈ ｉｃｌｅ）をＤＮＡ断片ライブラリーに導入し、標的ＤＮＡと標−的捕捉ＤＮＡ の間で相同組換えが起きる真核生物宿主細胞を同定する本発明の方法によって同 定される。相同組換えによって、標的捕捉ＤＮＡ（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ＤＮＡ ）と選択可能なマーカー遺伝子が宿主細胞中のＤＮＡに安定的に組込まれ、宿主 細胞が選択可能なマーカー遺伝子で安定的に形質転換された結果生じる選択可能 表現型に基づいて同定する。例えば、それらは、安定的組込みが起きていない宿 主細胞の成長を許さない条件下（例えば薬剤または金属イオンの存在下または必 須栄養素の非存在下）で成長する能力に基づいて同定される。

本発明の方法において使用するＤＮＡライブラリーは、ＤＮＡ挿入断片を保持し ていて宿主細胞中で複製される人工染色体などのユニットを含有する酵母細胞な どの真核生物宿主細胞の群である。宿主細胞中で複製せず標的捕捉ＤＮＡ配列（ すなわち標的ＤＮＡに対して少なくとも一部は相同なりＮＡ配列）および宿主細 胞中の選択に有用な選択可能なマーカー遺伝子を有する細菌プラスミドなどの標 的ビーイクルを真核生物宿主細胞に導入することによって、このＤＮＡライブラ リーをスクリーニングして、人工染色体中に存在する単数または複数のＤＮＡ挿 入断片を探すのであるが、その人工染色体の全体または一部は標的ＤＮＡ断片で ある。標的捕捉ＤＮＡ配列と標的ＤＮＡの間に相同組換えが起きるのに適した条 件下で標的捕捉ビーイクル含有宿主細胞を培養する。続いて、選択可能なマーカ ーで安定的に形質転換された宿主細胞を同定する（すなわち、非安定的に形質転 換された細胞が成長できないで死滅する条件下で成長できる宿主細胞を同定する ことによって）。

一般に、標的捕捉ビーイクルは、細菌のプラスミドのような宿主細胞中では複製 せず、そして標的捕捉ＤＮＡ配列と宿主細胞中で選択するための選択可能なマー カー遺伝子とを含む。しかしながら、宿主細胞が酵母である場合の態様において は、標的捕捉ビーイクルは、酵母中での選択のためのマーカー遺伝子と桿的捕捉 ＤＮＡを含む酵母線状プラスミドのような複製性ビーイクルであってもよい。

下記の実施例によって例示される本発明の具体的態様においては、ＤＮＡライブ ラリーは、ＤＮＡ挿入断片を保持する人工染色体を有する酵母細胞群であり、こ のＹＡＣベクターライブラリーから標的ＤＮＡを有する宿主細胞を同定および単 離する。

酵母中で非複製性の細菌プラスミドなどの標的捕捉ビーイクル（ａ　ｔａｒｇｅ ｔｉｎｇ　ｖｅｈｉｃｌｅ）を、ＤＮＡ　ＹＡＣライブラリー含存酵母宿主細胞 群に導入する。該細菌プラスミドは、対象の標的ＤＮＡに対して少なくとも一部 相同である標的捕捉ＤＮＡ配列および酵母中で機能する選択可能なマーカー遺伝 子を有する。標的プラスミドは、標的捕捉ＤＮＡ配列に二本鎖切断をもたらす制 限エンドヌクレアーゼで切断することによって該細菌プラスミドを線状化させる とともに組換えを起こす性質のあるＤＮＡ末端を生ぜしめることでＹＡＣ配列と の相同組換えのプロセスを刺激するのが好ましい。その結果、相同組換えの効率 が上がる。該プラスミドは酵母中で複製しないので、選択可能なマーカーとの安 定的形質転換は天然のまたは人工的酵母染色体中への挿入によってしか進行し得 ない。

得られた酵母宿主細胞群は安定的に形質転換された酵母宿主細胞（すなわち、選 択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドが標的捕捉ビーイクルの導入に先立ち すでに宿主細胞中に存在しているＤＮＡに相同組換えにより安定的に組込まれて いる酵母細胞）および非安定的に形質転換された酵母宿主細胞を含んでおり、安 定的に形質転換された酵母細胞だけが成長できる条件下でこの酵母宿主細胞群を 培養する。正しく標的化された事例の場合、プラスミドの標的捕捉ＤＮＡ配列と ＹＡＣ中の相同配列（すなわち標的ＤＮＡ断片）の間の相同組換えによってプラ スミド全体が宿主酵母細胞に安定的に取り込まれる。しかし、線状標的捕捉分子 （ａ　１ｉｎｅａｒ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を使用する場合 など他の態様においては、選択可能なマーカー遺伝子をＹＡＣ中など宿主細胞中 にすでに存在するＤＮＡに導入するのに十分な程度に相同組換えが起きるのであ れば、プラスミド全体が安定的に取り込まれる必要はない。単数または複数の標 的ＤＮＡ断片を含有するとともに標的プラスミドとの相同組換えをすでに受けて いる少数の宿主酵母細胞だけが、使用条件下（例えば抗生物質含有培地または非 安定的に形質転換された細胞に必須の栄養分を欠く培地中）で成長できるからで ある。これは標的捕捉プラスミド上に含まれている酵母で選択可能なマーカー遺 伝子の導入によるものである。選択可能なマーカー遺伝子の安定的形質転換によ って生じた選択可能表現型に基づいてこれらの細胞を同定する。

プラスミドが保持する酵母選択可能なマーカー遺伝子と宿主酵母細胞中の相同配 列の間の相同組換え現象を防止するために、ＹＡＣベクターライブラリーに使用 する前に、宿主酵母細胞のゲノムから標的捕捉ベクター配列（ｔａｒｇｅｔｉｎ ｇ　ｖｅｃｔ。

ｒ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ）に相同な宿主細胞配列を欠失またはほぼ完全に欠失さ せておくことが好ましい。あるいは、導入される標的捕捉プラスミド（ｔａｒｇ ｅｔｉｎｇ　ｐｌａｓｍｉｄ）上の酵母で選択可能なマーカー遺伝子に対して相 同な宿主細胞配列を酵母染色体の変異誘導された非機能性部分として保持するこ とができる。

ただし、この方法を用いた場合、相同組換えの陽性度がより高いものをスクリー ニングして、相同組換え現象が確実に細菌プラスミド上の標的捕捉ＤＮＡ配列と ＹＡＣ上に存在する標的ＤＮＡ配列の間で起きるようにしなければならない。

図１は、本発明の方法によるＹＡＣベクターライブラリーからの標的ＤＮＡ断片 の単離の概略を示す。それぞれが異なるＤＮＡ断片を含有するＤＮＡ　ＹＡＣを 保持する酵母細胞群（楕円）に左端の標的捕捉プラスミドを導入する。このプラ スミドは、酵母中で選択するための選択可能なマーカー遺伝子（斜線部分）およ び二本鎖切断を導入しである標的捕捉ＤＮＡ断片（黒塗り部分）を含んでいる。

この例においては、１個の宿主酵母細胞（＃３）が、標的捕捉プラスミド上に保 持された配列に対して相同なＹＡＣ中にＤＮＡ断片を含んでいる（クローン＃３ 上の黒塗り部分）。これら２つの配列の間に組換えが起こり、その結果、プラス ミド上に保持された選択可能なマーカーが酵母染色体（ＹＡＣ）に安定的に組込 まれる。得られた細胞群を、選択可能なマーカー遺伝子で安定的に形質転換され た宿主酵母細胞の選択に適した条件下で培養する。例えば、それらを栄養分欠乏 培地などの適当な選択培地でプレート培養する。選択可能なマーカー遺伝子が機 能する細胞だけが成長する。これらの条件下で細胞が成長すれば、標的ＤＮＡ断 片が存在していることになる。本明細書ではＹＡＣが例示されているが、ＹＣｐ ベクター（ＹＣｐ５０、ＹＣｐ　１９）など他の酵母ベクターもＤＮＡライブラ リーの構築に使用することができる。

ＤＮＡ　ＹＡＣライブラリーから標的ＤＮＡ断片を選択する一般的手順を図２に まとめた。図２は、選択可能なマーカー（酵母ＡＲＧ４遺伝子；白抜き四角）お よびＤＮＡ　ＹＡＣライブラリー中の配列と相同なりＮＡのセグメント（標的捕 捉ＤＮＡ　ニブラスミド上の黒塗りの弧）を保持する標的捕捉プラスミド（ｐ　 ｌ　８４ＤＬＡＲＧ）の組込みを示す。細い線は、酵母人工染色体（ＹＡＣ）と して増幅させたヒトまたはその他の生物（酵母以外）のＤＮＡ挿入断片を示す。

黒塗り四角は、標的ＤＮＡ断片、すなわちライブラリー中に見られるＤＮＡクロ ーン中に存在するＹＡＣＤＮＡの一部であって標的捕捉配列に対して相同である ＤＮＡの配列を示す。

ＤＮＡ　ＹＡＣの残りの部分はＹＡＣベクターアームから成り、太い線は細菌中 における複製と選択のためのプラスミドベクター配列を示す。斜線四角は、酵母 中の選択に用いる遺伝子標識（酵母で選択可能なマーカーＵＲＡ３およびＴＲＰ ｌ）を示す。黒塗り矢印と丸印はそれぞれ末端小粒（置）および動原体／酵母複 製起点（ＣＥＮ／ＡＲ３）を示す。

図２８は、ＹＡＣ中の標的ＤＮＡ断片に合わせて並んだ標的捕捉ＤＮＡ　（標的 捕捉ベクター中に存在する）を示す。図２ｂは、標的捕捉ＤＮＡと標的断片の間 の相同組換えの生成物を示す。標的捕捉プラスミドは標的配列中の縦矢印に対応 する部位で標的捕捉ＤＮＡ中で特異的に切断されている。ＵＬＬは、ＹＡＣ上の 標的配列（および制限部位）の複製によって生じるユニット長線状制限断片を示 す。実施例Ｉで説明するように、ＵＬＬは、問題の制限酵素部位を含むとともに 標的捕捉プラスミド上の制限酵素部位の再合成（修復による）が可能な程度に十 分な相同性がその部位の周辺に含まれているＤＮＡ配列への組込みが起こる場合 に限って得られる。ＵＬＬを示す候補クローンは相同組換え現象であると考えら れるので、これらをさらに分析する。

この方法の別の態様においては、導入する標的捕捉ＤＮＡ分子上の酵母で選択可 能なマーカー遺伝子は、酵母で発現するように設計された細菌の遺伝子であって 、酵母細胞に薬剤耐性を付与するもの、例えばＴｎ９やＴｎ　９０３由来のＣＡ Ｔ遺伝子またはｎｅｏ遺伝子であることができ、あるいは、細菌のアミノ酸遺伝 子またはヌクレオシド原栄養性遺伝子、例えば大腸菌のａｒｇＨ，ｔｒｐＣおよ びｐｙｒＦ遺伝子であることができる。

本発明の方法の別の態様においては、標的捕捉ベクターはＹＡＣライブラリーか ら同定および／または単離する標的ＤＮＡ断片に対して相同な標的捕捉ＤＮＡ配 列を含む線状ＤＮＡ断片である。この態様においては、選択可能なマーカー遺伝 子を標的捕捉ＤＮＡに挿入して、２個の非隣接領域を含む標的捕捉ＤＮＡ配列を 得る。この態様については、実施例ＩＩで詳細に説明するとともに、図３に概略 を示す。実施例Ｉに述べたようにして、酵母中で複製しない線状配列である標的 捕捉ベクターをプールしたＤＮＡ　ＹＡＣライブラリーに形質転換する。標的捕 捉ＤＮＡと標的ＤＮＡ断片の間に相同組換えが起きる。

上記態様以外にも、標的捕捉ＤＮＡを宿主細胞に導入する他のアプローチを利用 することができる。例えば、標的捕捉（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）　Ｄ　Ｎ　Ａは、 ライブラリーに使用する宿主菌株の接合型と反対の接合型の酵母菌株中で複製性 酵母線状プラスミド上に存在していてもよい［ムレイとスジスタフ（Ｍｕｒｒａ ｙ、　Ａ、Ｗ、　ａｎｄ　５ｚｏｓｔａｋ、　Ｊ、Ｗ、）　、Ｎａｔｕｒｅ　３ ０５：１８９−１９３　（１９８３）］。この線状プラスミドは、標的捕捉（ｔ ａｒｇｅｔｉｎｇ）　Ｄ　Ｎ　Ａ配列の両端に選択可能なマーカーを有するが（ すなわち標的捕捉（ｔａｒｇｅｔｉｌｇ）ＤＮＡの各末端に１個づつ）、いずれ の標識もＹＡＣライブラリーの構築に使用するものと異なっており、排除的に選 択することができる（すなわちＬＹＳ　２、ＵＲＡ３、ＣＹＨ２などの陰性的に 選択可能なマーカー）。２個の線状分子の間の相同組換えによって、それぞれが ２個のペアレント分子の雑種である２個の線状分子ができる。標的捕捉線状プラ スミドとライブラリーＹＡＣの間に組換えが起きるこの態様においては、２個の 組換え生成物のそれぞれがＹＡＣであり、それぞれが２個の陰性的選択可能なマ ーカーのうちの１つを保持しているので、２個の組換え生成物の分離選択が可能 になる。

この分離選択の基礎を図１２に示した。黒筐りの丸印と矢印、および白抜き四角 はそれぞれ動原体配列、末端小粒配列、およびマーカー遺伝子配列を示す。斜線 の四角は標的捕捉配列または標的配列を示す。ＵＲＡ３”細胞は、ヌクレオシド 類似体である５−フルオロオロチン酸（５ＦＯＡ）を含有する培地で成長させる ことにより、排除的に選択する（ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ａｇａｉｎｓｔ）　（死滅 させる（ｋｉｌｌｅｄ））ことができ、一方、ＬＹＳ２°ｍ胞は、アミノ酸類似 体アルファーアミノアジピン酸（ａａａ）を含有する培地で成長できないことを 基準として選択することができる。分子ｌは、ＡＲＧ４とＴＲＰＩを選択可能な マーカー（表現型ａｒｇ”ｔｒｐ″″５ＦＯＡ’αａａ”）として用いてベクタ ー系中で構築した標的ＹＡＣである。分子２は、標的捕捉配列が両端にＵＲＡ３ とＬＹＳ　２（表現型ａｒｇ−ｔ　ｒｐ−５ＦＯＡ”　ａａａ”　）を有する線 状標的捕捉プラスミドである。組換えられていない形で分子１と分子２を保持す る細胞の表現型はａｒｇ“ｔｒｐ”５ＦＯＡ”ａａａ”である。分子３と分子４ は分子１と分子２の閏の組換えの生成物であり、標的捕捉配列と標的配列の間の 交叉によって生じたものである。分子３の表現型はａｒｇ”ｔｒｐ−５ＦＯＡ” 　ａａａ”であり、アルギニンを欠＜５ＦＯＡプレート培地上での成長により選 択することができる。

分子４の表現型はａｒｇ−ｔｒｐ”　５ＦＯＡ”　ａａａ”であり、トリプトフ ァンを欠くαａａプレート培地上での成長により選択することができる。したが って、非組換え体分子を１個または２個含存する細胞ならびにこれらの組換え生 成物のいずれか一方を含有する細胞を区別して選択することができる（１個だけ または他の組換え生成物を保持する細胞がランダムな喪失現象によって生じる） 。

このようなスキームにおいては、標的捕捉線状プラスミドを保持する酵母細胞を ライブラリーのすべての細胞と接合させ、自然的または誘発的な相同組換え（例 えば減数分裂や紫外線照射によって誘発）に適した条件下に保つ。組換え標的Ｙ ＡＣは、線状プラスミド上の標的捕捉配列と適当な標的配列を保持するＹＡＣ分 子の間の相同組換えで生じた組換え生成物の特異的な表現型に基づいて選択する 。２個のＹＡＣ生成物のそれぞれを標的ＤＮＡ配列の位置で切断し、上記識別選 択法を利用して２個の生成物を別々に単離する。単一現象で生じた２個の生成物 を単離するためには、組換え体の選択に先立ち、ＹＡＣと線状標的捕捉プラスミ ドを保持する酵母細胞を平板培養またはグリッド培養（ｇｒｉｄｄｅｄ　ｏｕｔ ）によって排除しておくのが好ましい。選択は、適当な選択プレート培地上でレ プリカプレート培養することによって行なう。

この態様においては、線状標的捕捉プラスミド上の２個の（陰性的に）選択可能 な標識に対する標的捕捉（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）配列の相対的方向が重要である 。標的捕捉ＹＡＣと２方向の標的捕捉線状プラスミドのうちの一方の間に組換え が起きると、安定な組換え体（すなわち動原体をただ１個だけ保持する組換え体 ）ができる。２個の動原体を有するＹＡＣ分子はしばしば切断を起こして不安定 な表現型を示し、動原体を持たないＹＡＣ分子は分離バイアスによって非常に不 安定である。一つの態様においては、線状標的捕捉プラスミドは、標的捕捉配列 が両方向に存在するように構築され、別々の接合においてライブラリーに導入さ れる。

線状標的捕捉プラスミドをライブラリーに導入するための接合を行なう代わりに 、実施例Ｉに述べたものと実質的の同じやりかたで形質転換によりＹＡＣ含有宿 主細胞に線状標的捕捉プラスミドを導入することができる。

別の態様においては、自然的または誘発的な組換え現象によって酵母レプリコン から標的捕捉ＤＮＡと選択可能なマーカー（ＳＭ　Ｉ　）を遊離させることがで きるとともにＵＲＡ　３、ＬＹＳ２、ＣＹＨ２などの陰性的に選択可能なマーカ ー（３Ｍ２）に基づいてレプリコンそのものを排除的に選択することができるよ うなやりかたで、標的捕捉配列を保持する酵母複製性プラスミドを構築すること ができる。この目的にかなうように作成することができる誘導可能な組換え系の 例としては、酵母２ミクロンプラスミドのｆｌｐ関与組換え経路およびバクテリ オファージＰｉのｃｒｅ−ｆｏｘ組換え系が挙げられる。プラスミドは、ライブ ラリー構築に使用した宿主菌株の接合型と反対の接合型の酵母菌株に導入する。

ＹＡＣライブラリーのすべての細胞に接合を行なった後、標的捕捉ＤＮＡ配列と 選択可能なマーカーを非複製性分子として遊離させるが、該選択可能なマーカー は適当な標的ＤＮＡ配列を保持するＹＡＣとの相同組換えによってしか安定化さ れない。標的化組換え体は、ＳＭＩを有利に選択し、かり３Ｍ２を排除的に選択 する培地でプレート培養することによって選択する。

上のパラグラフで述べたプラスミドの導入のために接合を行なう代わりに、実施 例■に述べたものと実質的の同じやりかたで形質転換を行った後、酵母レプリコ ンから標的捕捉基質を遊離させる誘発ステップを実施することによって、プラス ミドを導入することができる。

相同組換えを利用した標的ＤＮＡ断片の同定と単離上記本発明の方法の態様は、 遺伝子全体、遺伝子の一部、またはその他のヌクレオチド配列であってもよい標 的ＤＮＡ断片の同定と単離に有用である。例えば、β−グロビン遺伝子やアデノ シンデアミナーゼ遺伝子などの対象遺伝子を本願請求の方法を用いてＤＮＡ断片 ライブラリー中で同定し、必要に応じて公知の方法により宿主細胞から単離する ことができる。本発明の方法による標的ＤＮＡ断片の同定については、実施例Ｔ 、Ｖ、およびＶｌで詳細に説明する。

相同組換えによる染色体歩行 標的ＤＮＡ断片をＤＮＡライブラリーから単離する本発明の方法は、染色体位置 地図の作成のためにＤＮＡ　ＹＡＣライブラリーから位置的に隣接するＤＮＡセ グメントを単離するのに有用である。すなわち、先に同定しておいた領域と重複 しかつそれを越えて延びるＹＡＣに由来する標的捕捉（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）　 Ｄ　Ｎ　Ａを各回ごとに用いて反復的に使用した場合、本発明の方法は染色体歩 行の手段となる。本発明の染色体歩行方法においては、上記のようにしてＹＡＣ 中に存在する標的ＤＮＡ断片を単離する。この第１の標的ＹＡＣ断片の末端をプ ラスミドベクターにサブクローン化する。したがって、第１の標的ＹＡＣ断片の 末端は、第２の標的捕捉ＤＮＡ配列として用い、これをＤＮＡ　ＹＡＣライブラ リー含有宿主酵母細胞に導入する。すると、第１の標的ＤＮＡ配列と隣接する第 １のＤＮＡ断片の末端は第２の標的捕捉ＤＮＡ配列となる。本願において使用す る場合、「隣接する」という用語は、第１の標的配列に直接隣接する配列および 第１の標的配列の付近または近辺に存在する配列（すなわち単数まなは複数の介 在ヌクレオチドによって第１の標的配列から隔離されている）を包含する。この 第２の標的捕捉ＤＮＡ配列は、次に第２のＤＮＡクローンとの相同点においてＹ ＡＣに導入される際に、選択した第２のＤＮＡクローンが異なる末端ＤＮＡ配列 を有するように、第１の標的捕捉ＤＮＡ配列といかなる相同性をも有していては ならない。第２のＤＮＡクローン由来の末端サブ断片を用いて、次の（すなわち 第３の）ＤＮＡクローンを単離する。先に単離したＤＮＡクローンの末端サブ断 片との相同性に基づいてつぎつぎにＤＮＡクローンを単離する。この手順を繰り 返すことによって一連の重複クローンが得られるが、目的の位置地図ができるま で必要に応じてこの手順を繰り返す。末端ＤＮＡ断片を連続的に回収することに より、同じライブラリーまたは第２のライブラリーの再スクリーニングによる重 複クローンの探索が可能になる。

本発明の一つの態様においては、疾患を引き起こす遺伝子などの対象遺伝子の染 色体上の位置を決定するために、対象遺伝子に遺伝的に結合したＲＦＬＰを示す ＤＮＡ断片またはＲＦＬＰに隣接する一つの断片を標的捕捉ベクター中の標的捕 捉ＤＮＡとして用いて染色体歩行を行なう。細菌プラスミドなどの標的捕捉ベク ターは、標的捕捉ＤＮＡとしてのＲＦＬＰ発現ＤＮＡまたは該ＲＦＬＰ発現ＤＮ Ａに隣接する断片またはｃＤＮＡおよび選択可能なマーカー遺伝子を有している が、これをヒトＤＮＡ　ＹＡＣライブラリーに導入する。

標的捕捉ＤＮＡとライブラリー中の標的ＤＮＡ断片の間の相同組換えによって、 対象遺伝子への歩行の第１歩が起きる。

このようにして、標的ＤＮＡ断片を有するＹＡＣを同定する。標的ＤＮＡ断片の 片方または両方の末端を標的捕捉（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）ベクター中で標的捕捉 （ｔａＢｅｔｉｎｇ）　Ｄ　Ｎ　Ａとして用いて、同じライブラリーの再スクリ ーニングまたは第２のライブラリーのスクリーニングを上記のようにして行なう 。やはり上記のようにして、前の段階で単離した標的ＤＮＡ断片の末端を標的捕 捉ＤＮＡとして各回ごとに使用して、この手順を繰り返す。対象遺伝子が同定さ れるか目的の位置地図ができるまでこれを続ける。

相同組換え染色体歩行の本発明の他の態様においては、ＤＮＡ　ＹＡＣ挿入部か らの末端断片はプラスミドレスキュー法によって単離することができる。この態 様は、実施例ＩＩＩで詳細に記述され、図４に模式的に示される。この場合、Ｙ ＡＣベクターは、ＤＮＡ断片（クローン）挿入部の末端に隣接するＹＡＣベクタ ーアームが宿主細菌中でプラスミドの複製および選択を許容するような配列を含 むように設計される。選択されたＹＡＣＤＮＡクローンを制限酵素により消化す ると、一方の端がＤＮＡクローン配列の末端内にあり、そしてＹＡＣベクターア ーム中に延びている断片が得られる。

この断片は、大腸菌中での複製および選択に不可欠な細菌プラスミド配列を含み 、そして選択されたＹＡＣＤＮＡクローンの末端由来のＤＮＡ断片に共有結合し ている。プラスミドレスキューは、選択された酵母クローン由来の全酵母ＤＮＡ の制限酵素消化、消化された酵母ＤＮＡのライゲーションによる環状モノマーの 生成、そしてこの結合（ｌｉｇａｔｅｄ）　Ｄ　ＮＡ混合物の大腸菌中へのトラ ンスフォーメーション、ついで大腸菌中でマーカー遺伝子の選択、を含んでいる 。

プラスミドレスキュー技法との関連で使用するために、二つの異なったＤＮＡ　 ＹＡＣライブラリーを設計することができる。各ライブラリーは、異なる対の選 択可能マーカーを利用する。二つの異なるライブラリーに対して適当な選択可能 マーカーを有する４個のＹＡＣアームの一組が設計される。各ＹＡＣアームは、 他のライブラリーの宿主酵母細胞の選択に適する酵母で選択可能なマーカーを含 んでいる。図４においては、ライブラリー１における酵母での選択可能なマーカ ーは、ＡＲＧ４とＴＲＰＩであり、そしてライブラリー２におけるそれはＬＥＵ ２とＵＲＡ３である。

第１の標的化されたＤＮＡ　ＹＡＣクローンを含有する細胞由来の全酵母ＤＮＡ は、酵母中で複製機能と安定化機能を付与する配列を、細菌での選択および増殖 を可能とするＹＡＣクローニングベクター領域と酵母で機能する選択可能なマー カーの領域から分離する制限エンドヌクレアーゼで消化、する（図４のステップ ３）。この領域は、第１の標的化されたＤＮＡ断片の末端を含む配列に共有結合 したままである。ＹＡＣＤＮＡクローン末端のこの断片は、第１の標的化された ＤＮＡクローン末端配列のほかに、細菌での複製に必要な配列、細菌での選択の ための選択可能なマーカー、および酵母での選択のための選択可能なマーカーを 含んでいる。この断片は、環状化されそして細菌中で増幅される（図４のステッ プ４）。この生産物は、次いでＤＮＡクローン末端に対応する配列内に（すなわ ち、標的捕捉ＤＮＡ配列内に）２本鎖切断を導入した後、第２のＤＮＡライブラ リーを形質転換するための標的捕捉プラスミドとなる（図４のステップ５および ６）。この２つのＤＮＡ　ＹＡＣライブラリー即ち、ライブラリー１とライブラ リー２は、各々のアームが異なったベクター配列によって安定化され、そして各 アームは酵母で選択するためのユニークな選択可能マーカーと細菌で選択するた めのユニークな選択可能マーカーとを有するように構築される。

実施例ＩＩＩに記述されるＤＮＡクローン末端のレスキュー法は、この末端がＹ ＡＣベクターアームの断片に共有結合しているようにＤＮＡクローンを切断する ために、制限エンドヌクレアーゼを利用する。通常の技術水準にある者には、ポ リメラーゼ、チェイン・リアクション（ＰＣＲ）の種々の態様（例えば、インバ ースＰＣＲまたはアンカードＰＣＲ）の利用によりＤＮＡクローン末端を単離す る方法が知られており、この方法では、ＤＮＡクローニング部位に直接隣接する ＹＡＣベクターにアニーリングする少なくとも１つのユニークなプライマーを利 用し、最初の鎖の合成はＹＡＣベクターアームから進行してクローン化ＤＮＡを コピーし、特異的制限酵素切断部位は、ＤＮＡ　ＹＡＣ由来の末端断片のサブク ローニングを容易にするＰＣＲプライマーの一方または両方の部分を含んでいる ようなものである。

相同組換えスクリーニングをしない場合であっても、２つのライブラリー系は、 染色体歩行にとって特に有用である。

このような２つのライブラリー系が有する２つの鍵となる特徴は、 １）最終的な２つのライブラリーの中に存在しなければならない４つのアームの 全てに、大腸菌でのプラスミド選択のための同一マーカーを共有するアームがな いこと、そして２）２つの異なるライブラリー中で用いられる細菌性プラスミド レプリコンの間における相同性が限られているかまたは全くないことである。

この系においては、第１のＹＡＣライブラリー（ライブラ＋Ｊ　−１）からプラ スミド・レスキュー（実施例ＩＩＩ参照）により単離されたクローン由来の２つ のユニークな末端配列を、異なる選択培地プレート上に筒布することにより、独 立に簡単に単離することができる。末端配列を含む単離されたプラスミドは第２ のＹＡＣライブラリー（ライブラリー２）中に存在するいずれのベクターアーム に対する相同比も制限されるかまたは全く存しないので、これらのプラスミドは 、プラスミド由来の末端配列をサブクローニングすることなしに、従来のフィル ター・ハイブリダイゼーシコンスクリーニングに使用することができる。大腸菌 でレスキューされたプラスミドは、精製し、ラベル化する（例えばニック・トラ ンスフォーメーションまたはランダム・ヘキサマー・ブライミングにより）こと ができる、そして第２のライブラリーをスクリーニングするために直接使用する ことができる。ライブラリー２から単離されたＹＡＣクローンは、それ自体ライ ブラリー１から単離されたＹＡＣクローン由来の末端配列を持っているレスキュ ーされた完全なプラスミドでスクリーニングすることによって単離されたもので あるが、これは、染色体歩行でとられるステップを表している。歩行の各ステッ プは、このようにして、２つのライブラリーのうちの１つから単離されたＹＡＣ 分子の末端由来のラベル化プラスミドを、他の相補的ライブラリーを直接スクリ ーニングするために用いることにより、進行する。この方法は、直接ラベル化及 びライブラリースクリーニングに適した形で差別的選択をすることにより、２つ のＹＡＣ末端の各々を独立に単離するための迅速な方法を提供することにより、 従来のフィルタースクリーニング技法の効率を大きく改善するものである。この 方法は、重なり合っているＹＡＣクローンをラベル化し、スクリーニングするた めに末端断片をサブクローニングする必要性または逆に精製する必要性をなくす ものである。

プラスミド・レスキューに用いられるＹＡＣベクターアームおよび制限酵素の設 計は、酵母で選択可能なマーカー（動原体の末端小粒の、および酵母複製の配列 も同様に）が、レスキューされたプラスミド配列およびＹＡＣクローン末端から 分離されるようなものとすべきである。こうすると、ライプラＩＪ−１および２ の構築に際し、異なった酵母選択可能マーカーを使用する必要をなくし、そして 、ライブラリー１および２におけるＹＡＣクローンを選択するために用いられる 選択可能なマーカーの完全に欠落した宿主酵母菌株を構築する必要をなくす。４ つのアームのそれぞれに対する独自の選択可能なマーカーとしては、これらが大 腸菌でのプラスミド選択を可能にするのであるが、例えば、クロラムフェニコー ル、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、スペクチノマイシン、ス トレプトマイシン、またはエリスロマイシンのような抗生物質に対する抵抗性を コードしている遺伝子、あるいは適当な栄養要求性宿主を生存可能とする生合成 マーカー（ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｍａｒｋｅｒ）をコードしている遺伝子 等が挙げられる。

２つのライブラリー中のレプリコン間の相同性を限定するために用いることがで きる細菌のレプリコンとしては、例えば、ｐ１５ＡＳＣｏｌＥｌ、ファージＭ１ ３、ファージｆ１、ファージλおよびそれらの同等物が挙げられる。

宿主細胞のタイプと特徴 この項では、細菌プラスミド中に存在する標的捕捉（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）　Ｄ ＮＡ配列を用いて酵母細胞中に構築したＹＡＣＤＮＡライブラリーのスクリーニ ングに特に言及して、本発明の方法について説明する。ただし、この説明はあく までも例示の目的に限られること、またベクターが保持するＤＮＡと宿主細胞中 にすでに存在するＤＮＡの間に相同組換えによる遺伝子組換えが起きかつ適当な 非複製性の標的捕捉ベクターが利用可能であれば他の宿主細胞タイプを用いても 本発明の方法を実施することができるものと解すべきである。

適当な真核生物宿主細胞としては、通常（天然に存在する状態）は実質的に相同 組換えに限って遺伝子組換えを受ける使用する場合、「実質的に限って（ｅｓｓ ｅｎｔｉａｌｌｙ　ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙ）」という用語は、使用条件下では 有意なレベルの非相同組換えを伴わないで相同組換えが起きることを意味する。

ＤＮＡクローンの相同組換え選択は、１）適当なりＮＡクローニング系が存在し 、２）その細胞を遺伝子工学または遺転子操作によって操作または誘導すること によって主にＤＮＡ配列相同性に基づ（組換えを行なうことができるか、好まし い組換えの態様として相同組換えに関与するようなやり方で標的捕捉ＤＮＡを処 理することができる生物の細胞中での選択方法として利用することができる。こ れらの基準が満たされれば、組換えＤＮＡ技術に習熟せる者であれば、ＤＮＡラ イブラリーからのＤＮＡクローンの相同組換え選択を実施い。

ＮＡ配列相同性のみに基づく組換え経路にのせる能力があるので、相同組換えを 利用したＤＮＡクローンの選択に好ましい宿主生物である。

ＤＮＡ断片ライブラリーを構築する宿主細胞のいくつかの特徴を考慮し、おそら くは修正して例えば非標的化現象を減らして本発明の方法の効率を上げることに よって本発明の方法における上記細胞の使用を最適化させねばならない。例えば 、以下に述べるように、標的捕捉ベクター中に存在する選択可能なマーカーを酵 母宿主細胞から取り除き、標的捕捉ベクターがＤＮＡライブラリーの増幅に使用 したベクター配列中の配列と相同の配列を含むことがないようにして標的捕捉ベ クターを構築する必要が生じる場合がある。

以下に述べるように、標的捕捉（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）ベクターのために選ぶ単 数または複数の選択可能なマーカー遺伝子は通常は宿主酵母ゲノム細胞中に存在 していてはならず、また、宿主酵母菌株中の正常な染色体上の位置から欠失させ ねばらならいことがわかっている。この宿主菌株の改変を行なわないと、選択可 能なマーカーと酵母ゲノムの間の組換え現象が高率で起きるはずである。ヒトゲ ノムをほぼ完全（〉９９％）にカバーするためには、平均断片サイズ３００ｋｂ のＤＮＡＹＡＣライブラリーであれば約５０，０００個のクローンから成る［マ ニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、）ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ ｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　ｐｇ　２７１．　Ｃｏ１ｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８２］。

このようなライブラリー中で１度だけ出現する配列を単離するためには、標的化 現象と非標的化現象の比率を５０．０００対ｌに近付けるかそれを越えなければ ならない。なぜなら、この比率では、正しいクローン１個につき１個の正しくな い（非標的化）クローンが単離されるからである。しかし、多くの場合、このラ イブラリー中の配列は３〜５回現われ、１０．０００〜１７，０００対ｌの比率 が適当である。標的捕捉プラスミドと酵母ゲノム中の相同性領域の間の組換えに よって非標的化現象が起きるが、そのような相同性の程度を下げることによって これを最小限に抑えることができる。実施例ｖＩ■で説明するように、使用する ベクター中に存在する選択可能なマーカー遺伝子の染色体コピーを欠失させると 非標的化現象の発生が減るので、これが望ましいことがわかった。実施例ｖ■Ｉ で説明するように、これらの結果は、ＤＮＡＹＡＣライブラリーから標的クロー ン（標的ＤＮＡ断片）を選択することが可能であって、標的捕捉ベクター上に存 在する選択可能なマーカーに対する相同性を有さない宿主酵母細胞中で特に効果 的であることを示している。

非標的化現象は、細菌プラスミド複製起点や薬剤耐性標識などの標的捕捉ベクタ ー上の配列と、ＤＮＡライブラリーの構築に使用したＹＡＣベクターアーム上の 相同配列の間の相同組換えの結果起きることもある。この相同性は、ＹＡＣベク ター中に存在しない薬剤耐性マーカーを用いて標的捕捉ベクターを構築するか、 ＹＡＣベクターアーム上に存在する起点とは異なるか非相同性である細菌プラス ミド複製起点を用いることによって、最小限に抑えることができる。実施例ＶＩ ■に示した結果は、非相同性組換えの頻度が約０．００３％（３０，７２９分の １）であり、本願発明と一致することも示している。形質転換させた細胞１０． ０００個のうち１個だけしかそのような相同性を有していなかった場合でも、標 的捕捉ベクターに対する相同性を育する酵母細胞を選択することができた。実際 、この希釈水準では、標的化現象は多数回（４回）単離されたが、このことは、 ４０．０００個のクローンのライブラリー中で１回だけ出現するクローンを単離 することができることを示している。

標的捕捉（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）ベクタ一本明細書に説明する方法において有用 な標的捕捉（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）ベクターまたはビーイクルも本発明の対象で ある。本発明の標的捕捉（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）ベクターの一つのタイプは２つ のキーとなる特徴を有する。すなわち、このベクターは、ＤＮＡ断片ライブラリ ーを構築する宿主細胞中で複製しないこと、及び本発明の目的のためにはＤＮＡ ライブラリー中で同定されかつそれから単離されるべき目的のクローンの全体ま たは一部を含有するＤＮＡ断片である標的ＤＮＡ断片に対して少なくとも部分的 には相同な標的捕捉ＤＮＡと呼ばれるＤＮＡ配列を有することである。標的捕捉 ベクターは、特に酵母細胞宿主を用いる場合には、一般にＹｌｐクラスの細菌プ ラスミドである。他のタイプの細胞宿主に適したベクターも公知の技術を用いて 構築することができる。

標的捕捉ベクター中で標的捕捉（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）　Ｄ　Ｎ　Ａとして使用 する配列は標的ＤＮＡ断片に対して完全に相同であってもよいが、必ずしもそう でなくてもよい。細胞に導入するベクター保持ＤＮＡと細胞中のＹＡＣの中のＤ ＮＡの間に宿主細胞組換え経路またはプロセスによる遺伝子組換えが使用条件下 で起きるのに十分な程度に相同的である必要がある。標的捕捉ＤＮＡ配列に二本 鎖切断またはギャップを導入するのが好ましい。あるいは、二本鎖ギャップを導 入することもできる。上記切断またはギャップに隣接する遊離末端を変化させて （例えばＤＮＡの末端をホスファターゼ処理したり、２種類の制限酵素を使用し て非相補性末端を作ることにより、またはそのＤＮＡの１本鎖からヌクレオチド を除去して１本鎖テールを作ることにより）再環状化を防止することができる。

文献を調べると、１本１（３’）のオーパーツ１ングは、酵母やその他の種にお いては遺伝子組換えの中間体である（サン（Ｓｕｎ　、　Ｈ，）ら、Ｃｅ１ｌ、 　６４：１１５５−１１６１（１９９１）；　ｖリオンとキャロル（Ｍａｒｙｏ ｎ、　Ｅ、　Ｃａｒｒｏｌｌ、　Ｄ、）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、： １１：３２６８−３２７７）。この場合の２本鎖切断の一方または両側に作用し て、ＤＮＡ２本鎖（５′→３゛極性を持つ鎖のような）の一方の鎖を分解し、そ の結果２本鎖切断またはギャップの一方または両側に１本鎖３゛オーバーハング を持つ分子を生成させるＤＮＡ修飾酵素を利用することは、相同組換えライブラ リースクリーニングで標的捕捉分子として機能する能力を向上させた基質を作る 際に有用であると予想するのは理に適っている。

標的捕捉（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）ベクターは、標的捕捉（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ） ＤＮＡ以外にも、酵母中で機能する選択可能なマーカー、複製起点、および細菌 （例えば大腸菌）中で機能する選択可能なマーカーを含む。この選択可能なマー カー遺伝子は、ＤＮＡ断片ライブラリー構築に使用する宿主細胞タイプ中で機能 する（形質転換された細胞の選択を可能にする）ものである。酵母で選択可能な マーカー遺伝子は、例えばＡＲＧ４、ＬＥＵ２、ＨＩＳ３、ＨＩＳ４、ＴＨＲＩ 、ＵＲＡ３、ＴＨＲＩ、ＬＹＳ２、ＡＤＥ２、ＡＤＥ８、およびＭＥＴ２など多 様な内在性酵母遺伝子座位から選ぶことができる。あるいは、酵母で選択可能な マーカーは、酵母ゲノムに内在しない、例えば酵母中で発現されて酵母細胞に薬 剤耐性を付与するように作られた細菌遺伝子（それぞれトランスポゾンＴｎ９と Ｔｎ　９０３に由来するＣＡＴ遺伝子やｎｅｏ遺伝子）、またはアミノ酸原栄養 性やヌクレオシド原栄養性のような栄養素原栄養性を付与する細菌遺伝子（大腸 菌のａｒｇＨ，ｔｒｐＣ，ｐｙｒＦ遺伝子など）など選択可能な表現型を与える 外来遺伝子であるマーカー遺伝子であってもよい。この目的に適した他の選択可 能なマーカー遺伝子としては、金属イオン耐性を与える遺伝子（例えば鋼イオン 耐性を与えるＣＵＰ　１遺伝子）、変異体表現型を有する細胞内で細胞サイクル を進行する能力を与える遺伝子、および細胞表面マーカーの発現を引き起こす遺 伝子などが挙げられる。

細菌中での選択に適した選択可能なマーカー遺伝子としては、抗生物質であるク ロラムフェニコール、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、スペク チノマイシン、ストレプトマイシン、エリスロマイシンに対する耐性あるいはそ の他の標識をコードする遺伝子などが挙げられ、対応する栄養素要求性細菌宿主 が存在する生合成酵素をコードする一遺伝子を含む。

細菌の複製起点は様々なものから得ることができ、ｐ１５Ａ（例えばプラスミド ｐＡＣＹＣ１８４の起点）、Ｃｏ１Ｅ１、ファージＭ１３、ファージｆ１、ファ ージラムダ、その地固等の機能を与えると当該技術に習熟せる者が認めるレプリ コンなどが挙げられる。

ＹＡＣＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために構築され使用されるベク ターについては、実施例［ＩＩで詳細に説明するとともに、図５および６ａ−６ ｄに概略を示す。

標的捕捉プラスミドｐ　１８４ＤＬＡＲＧは、酵母中で機能する選択可能なマー カー（ＡＲＧ４）および−細菌の複製起点（ｐＡＣＹＣ１８４由来）を含んでい る。

標的捕捉ＤＮＡ分子はＹｌｐクラスの分子に限定されない。標的捕捉ＤＮＡは、 他の配列のうちの細菌レプリコンまたは酵母レプリコンによって目的の標的捕捉 配列が分断されるようなやり方で構築したプラスミドを用いて大型のプラスミド から精製したＤＮＡ断片であってもよい。該プラスミドは、標的捕捉配列の内部 セクションからレプリコンを遊離させる制限酵素による切断が起きると、酵母で 選択可能なマーカーが標的捕捉配列の外側の２個の末端と共有結合した状態を保 っているような方法で構築される。

あるいは、選択可能なマーカーと標的捕捉配列をイン・ビトロでつなぎ合わせ、 標的捕捉配列の１コピーと選択可能なマーカーの１コピーから成る連結反応生成 物（または標的捕捉配列と選択可能なマーカー配列とが一定方向に交互に繰り返 されたものより成るマルチマー）を精製する。これらの連結反応生成物をイン・ ビトロで環状化させ、制限酵素で切断して、二本鎖切断またはギャップを標的捕 捉配列中に導入し、選択可能なマーカーは元のままに保つ。

最後に、イン・ビトロにおける単回の３方向連結反応によって選択可能なマーカ ーに標的捕捉配列の２個の半断片をつないで形質転換に適した標的捕捉分子を得 ることができる。

酵母アームベクター 酵母の人工染色体を作成するために用いられる酵母アームベクターまたはＹＡＣ アームベクターも、本発明の主題である。ＹＡＣアームベクターは、酵母の選択 可能なマーカー遺伝子、細菌の複製起点、細菌の選択可能なマーカー遺伝子およ び酵母の末端小粒を含む。それらは、さらに酵母の複製起点（ＡＲ３）および／ または酵母の動原体配列を含んでいてもよい。これらのＹＡＣアームベクターの 成分は、それらが天然に現れる資源から、もしくは組換え、または遺伝工学的手 法、または化学合成を用いて作り出すことができる材料から得ることができる。

例えば、末端小粒配列、動原体配列、およびＡＲ３は、酵母または他の生物から 得ることができる。それらは、それぞれ末端小粒、動原体、ＡＲ３として宿主で ある酵母細胞中で機能することだけが必要である。それらの起源（例えば、酵母 または他の起源）にかかわりなく、同等の機能を有する成分を、ここでは対応す る酵母成分の機能的同等物と呼ぶ。

下記の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、これらの実施例は、本発 明を何ら限定するものではない。

実施例で使用する方法 特に注記がない限り、プラスミド精製方法、プラスミドＤＮＡの制限酵素消化及 びゲル電気泳動、ＤＮＡ改変酵素の使用、連結、細菌の形質転換、酢酸リチウム 法による酵母の形質転換、酵母ＤＮＡの調製とサザンプロット分析、酵母の四分 子分析、大腸菌及び酵母の培養のための液体培地及び固体培地の調製、及び全て の標準的な分子生物学的並びに微生物学的手法は、アラシュベル（Ａｕ５ｕｂｅ １．　Ｆ、　Ｍ、　）ら［ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅ ｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓ 。

ｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−ｒｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、　Ｎｅｗ　Ｙ ｏｒｋ、　１９８７　］に述べられているのと実質的に同じ方法で行なうことが できる。

プラスミドｐＹＡＣ４（ＡＴＣＣ１３７３８０）を用いてヒトゲノムＤＮＡのラ イブラリーを構築した。白血球からヒ）ＤＮＡを単離し［プルケ（Ｄ、　Ｂｕｒ ｋｅ）　、　Ｐｈ、Ｄ、　Ｔｈｅｓｉｓ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　Ｕｎｉｖｅ ｒｓｉｔｙ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ，、１９８８］　、Ｅ　ｃ　ｏ　Ｒ Ｉで部分消化し、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化したｐＹＡＣ４アームに連結し た。

次いで、この連結混合物を用いてスフェロプラスト法［バーガーズとパーシバル （Ｂｕｒｇｅｒｓ、　Ｐ、Ｍ、Ｊ、　ａｎｄ　Ｐｅｒｃｉｖａｌ、　Ｋ。

Ｊ、）　、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１６３：３９１ −３９７　（１９８７）］により酵母宿主菌株ＭＧＤ１３１−１０ｃまた＋１Ｉ Ｖ−１６ｄを形質転換させた（適当な標識欠失を有する宿主菌株ＭＧＤＩ３１− １０ｃおよびＴＶ−１６ｄの構築については、以下の実施傍目Ｉで説明する）。

ｐＹＡＣ４ベクターは酵母選択可能なマーカーＴＲＰＩとＵＲＡ３を保持してい るので、トリプトファンとウラシルを欠くプレート上での成長を指標として形質 転換体を選択することができる。平均サイズ１９０ｋｂ（ヒトのゲノムの０．７ ３倍に相当）を有する１１，６２５個のＹＡＣを９６穴マイクロタイタープレー トの穴で個別に培養する。各穴から０．１ｍｌを取り、それぞれ約４．０００個 のクローンより成る３個のサブプールにプールした。

各サブプールにつき、等量の３０％グリセリンを加え、サブプールを分取し、− ７０℃で凍結した。

１個のゲノムの７３％の部分より成るライブラリーに関して、またすべてのクロ ーンが等しく発現されると仮定して、そのクローンが特定のヒトＤＮＡ配列を含 有する確率はちょうど０．５以上である。６個の異なるＤＮＡ断片のうちの１つ がライブラリー中で発現される確率は１−　（０，５）　＠、すなわち０，９８ である。

標的捕捉プラスミド９１８４ＤＬＡＲＧの構築については以下に説明する。また 、図５にその概略を示す。このプラスミドは酵母ＡＲＧ４遺伝子［ビーチャム（ Ｂｅａｃｈａｍ、　１．　Ｒ，）ら、Ｇｅｎｅ　２９＋２７１−２７９　（１９ ８４）］を選択可能なマーカーとして保持しており、また、その細菌複製起点は ｐＡＣＹＣ１８４［チャンと：１−エン（Ｃｈａｎｇ、　Ａ、Ｃ，Ｙ、　ａｎｄ 　Ｃｏｈｅｎ、　Ｓ、Ｎ、　）、（１９７８）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃ ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　１３４：１１４１−１１５６１に由来するものであって、 ｐＹＡＣＪ上で使用するｐＢＲ３２２起点とは限られた配列相同性しか示さない 。ＡＲＧ４の染色体全体ノコピー（２，０ｋｂのＨｐａｌＤＮＡ断片）はライブ ラリー宿主菌株ＩＶ−１６ｄおよびＭＧＤ１３１−１０ｃでは欠失していた。ｐ １５Ａ複製起点とクロラムフェニコール耐性遺伝子を含有するｐＡＣＹＣ１８４ ［チャンとコーエン（Ｃｈａｎｇ、Ａ、Ｃ，Ｙ、ａｎｄ　Ｃｏｈｅｎ、Ｓ、Ｎ、 ）（１９７８）Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＢａｃｔｅＩ断片をＢａｍＨＴ−Ａｃｅ 　Ｉ消化ｐＭＬＣ２８［ｐＵＣ１８多重クローン化部位を保持するｐｓＤｃ１２ 誘導体：レビンソン（Ｌｅｖｉｎｓｏｎ）ら、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇ ｅｎ、、　２：５０７−５１７　（１９８４）　；プラスミドｐＵＣ１８（ＡＴ ＣＣ１３７２５３）はここで述べるり１８４　ＤＬＡＲＧの構築においてｐＭＬ Ｃ２８に置換しうる］に連結した。ＢａｍＨＩとＡｃｃｌを用いてそれぞれ１回 づつこのプラスミドをポリリンカー中で切断する。ｐＭＬＣ２８ポリリンカー中 で切断する５ａｃＩとＨｉｎｄｌｌｌで連結混合物を消化し、得られた消化ＤＮ ＡをＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端を作った。このＤＮＡを希釈条 件下で連結して環状化を促進し、細菌中への形質転換に先立ち、連結混合物を制 限酵素Ａｖａ　Ｉ　Ｉで処理した（ペアレント分子を線状化するために）。ｐＡ ＣＹＣｌ　８４の２個のＢａ１ｒ−Ｃ１ａｌ断片のうちの大きい方の断片中に含 まれている配列およびｐＭＬＣ２８ポリリンカーの一部を変更したものだけを保 持する１個のプラスミドｐ１８４ＤＬを同定した。プラスミドｐＨｐａ５　［シ ュルテスとスジスタフ（Ｎ、　５ｃｈｕｌｔｅｓ　ａｎｄ　Ｊ、　５ｚｏｓｔａ ｋ）　、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｍ。

１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　Ｇｅｎｅｒ ａｌ　Ｈｏ５ｐｉｔａ１．　Ｂｏｓｔ。

ｎ、　ＭＡ　０２＋１４より供与］は、ｐＭＣＬ　ｌ　２　［ｐＵＣ１２多重ク ローン化部位を保持するｐＳＤＣ１２誘導体：レビンソン（Ｌｅｖｉｎｓｏｎ） 　ら、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎ、、　２：５０７−５１７　（１９ ８４）］のＨｉｎｃ　Ｉ　Ｔ部位に挿入した２、ＯｋｂのＨｐａＩ断片としてＡ ＲＧ４遺伝子を保持する。このプラスミドをＡＲＧ　４挿入断片に隣接するＰｓ ｔＴおよびＳｍａ　１部位にて切断し、ＡＲＧ４断片をＰｓｔｌ−３ｍａＩ切断 ｐ１８４ＤＬに連結した。図５に示した方向に挿入されたＡＲＧ４遺伝子の単一 コピーを保持するプラスミドを単離し、ｐ　１８４ＤＬＡＲＧと命名した。図５ はプラスミドｐ　１８４　ＤＬＡＲＧの地図である。

チロシンヒドロキシラーゼ（染色体１１）、メタロチオネインＩＩ偽遺伝子（染 色体４）および無泡ＤＮＡマーカーＤ１６ｓ３およびＤ１６Ｓ３７　（染色体１ ６）のゲノム断片、およびイプシロングロビン遺伝子（染色体１１）の５′側に 位置する１、９ｋｂのＨｉｎｄＴＩＩ断片をｐ１８４ＤＬＡＲＧにサブクローン 化し、これを用いて組換えによりＹＡＣライブラリーからクローンを選択した。

チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子断片以外のすべての断片を７４ＤＮＡポリメラ ーゼ処理により平滑末端化させ、Ｓｍａｌ切断ｐ１８４ＤＬＡＲＧに連結した。

チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子断片は、ｐ　１８４ＤＬＡＲＧのＢａｍＨＩ部 位にクローン化した。

ベータグロビン遺伝子（染色体１１）の５′末端からの１４３ｋｂのＨｐａ　Ｉ −ＢａｍＨＩ断片をｐ　１８４ＤＬＡＲＧの構築に使用したものと同じ２．２ｋ ｂのＢｃｌｌ−Ｃ１ａｌ断片に平滑末端連結した。ベーターおよびイプシロン− グロビン断片は、染色体１１上のヒトベーターヘモグロビン座位由来のそれぞれ １．３ｋｂと１．９ｋｂの断片である。ベーターグロビン断片（ＡＴＣＣ１３９ ６９８）をＩ）ＨＵ５’べ−タ［トレコ（Ｔｒｅｃｏ、　Ｄ、　）ら、Ｍｏ１． 　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　５：２０２９−２０３８．１９８５　］からサブ クローン化したが、これはゲンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ　）　ＨＵＭＨＢ　Ｂ配 列中の６１，３３８　（Ｈｐａ１部位）　〜６２，６３１　（ＢａｍＨ１部位） の位置に由来する配列を含んでいる。この断片は、ヒトベーターグロビン遺伝子 の５′末端を含んでいる。ゲンバンク地図位置６２，４４７にあるＡｖａ　１１ 部位を用いて、標的捕捉（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）検出のための二本鎖切断を導入 して、切断の一方の側に１２Ｉｋｂおよび０．１８ｋｂの相同部分を作成した。

５′イブシロンーグロビンブローブ（ＡＴＣＣ＃５９１５７）はＨｉｎｄ　Ｉ　 Ｉ　Ｉ断片であり、ゲンバンク）（ＵＭＨＢＢ配列中の３．２６６位から５，１ ７２位までにわたる、イプシロン−グロビン遺伝子まで約１５ｋｂ５’　の距離 だけ中心に寄せた配列（ＡＴＣＣ＃５９１５７）を含んでいる。地図位置４．３ ６１と４，６２４にあるＡｐａ１部位を用いて、標的捕捉（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ）検出のための０．２６ｋｂの二本鎖ギャップを作成し、ギャップのいずれかの 側に１．ｌｋｂと０，５ｋｂの相同部分を作った。

残りの４個のゲノムＤＮＡ断片の性質は次のとおりである。チロシンヒドロキシ ラーゼ（染色体１１．２．３ｋｂのＢａｍＨＴ断片；ＡＴＣＣ＃５９４７５　、 末端から０．６ｋｂの位置にＨｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉによる二本鎖切断ができてい る）、メタロチオネイン偽遺伝子（染色体４；２．８ｋｂのＨｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　 Ｉ−ＥｃｏＲＩ断片；ＡＴＣＣ＃５７１１７；末端から０．４ｋｂの位置にＮｄ ｅＴによる二本鎖切断ができている）、無泡ＤＮＡマーカーＤ１６Ｓ３　（染色 体１６；１．５ｋｂのＨｉｎｄＩ１１断片；ＡＴＣＣ＃５９４４７；末端から０ ．７５ｋｂの位置にＡｐａｌによる二本鎖切断ができている）　、Ｄｉ　６Ｓ３ ７　（染色体１６；２．３ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片；ＡＴＣＣ＃５９１８９； 末端から０．９５ｋｂの位置にＡｐａｌによる二本鎖切断ができている）。

ヒトＤＮＡ　（標的捕捉ＤＮＡ）内で切断を行なう制限酵素で各標的捕捉（ｔａ ｒｇｅｔｉｎｇ）プラスミドを線状化させ、２０μｇの消化されたＤＮＡを用い てプールライブラリーを形質転換した。等量の３個のライブラリーサブプールを 融解、混合し、カナマイシンとアンピシリンをそれぞれ４０μｇ／ｍｌ含むＣＭ −ｕｒａ−ｉｒｐ培地に接種した。この培養物を、よく攪拌しながら３０°Ｃで １夜培養し、１．８６ｘｌＯフ細胞／ｍｌの密度に達した時点で採取した。酢酸 リチウム法［アラシュベル（Ａｕ５ｕｂｅ１．　Ｆ、　Ｍ、　）ら、Ｃｕｒｒｅ ｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｓｕ ｐｐｌｅｍｅｎｔ　５．　Ｇｒｅｅｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓ５ｏｃｉａ ｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−１ｎｔｅｒｓｃｊｅｎｃｅ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ 　１９８７　］を用いて細胞を形質転換した。２０μｇのヒトＤＮＡ内切断プラ スミドを用いて０．２ｍｌ容量中の７ｘｌＯ”個の細胞を形質転換し、形質転換 混合物全体を８枚の選択用プレート（ウラシル、トリプトファン、アルギニンを 欠く完全最小培地）の表面に塗布し、３０°Ｃで３〜７日インキュベートした。

制限酵素消化およびサザンハイプリダイゼーション分析によって形質転換体を分 析した。各候補からＤＮＡを調製し、標的捕捉プラスミドの線状化に使用したも のと同じ酵素で消化した。サザンプロットは２！Ｐ放射標識ＡＲＧ４ＤＮＡでプ ローブした。線状化された形質転換用ＤＮＡ分子と全く同じサイズの単一バンド ［「ユニット長線状Ｊバンド（ＵＬＬ）；図２］にハイブリダイゼーションした ことによって相同組込み現象を同定した。問題の制限酵素部位を含有し、かつ標 的捕捉プラスミド上での制限酵素部位の再合成（修復による）を可能とするのに 十分な相同性をその部位の周辺に保持しているＤＮＡ配列への組込みが起きたと きに限り、ＵＬＬが得られる。ＵＬＬを示す候補は相同組込み現象であると推定 し、更に分析に付す。ユニット長線状断片は、分析した２１個のイプシロン−グ ロビン候補のうちの６個、及び１４個のベーターグロビン候補のうちの３個につ いて見られた。用いた他の標的捕捉断片のいずれにより単離した候補クローンに おいてもユニット長線状断片は見られなかった。

図７は、ヒトイプシロン−およびベーターグロビン配列による標的化によって選 択したクローンの制限酵素・サザンプロット分析の結果である。左側では、ａｒ ｇ″″として選択した９ＨのクローンにＤＮＡをＡｖａｉｌ（ベーターグロビン 標的捕捉配列中に二本鎖切断を作るのに用いた酵素）で消化した。右側では、ａ ｒｇ″″として選択した９個のクローンのＤＮＡをＡｐａｌ（イプシロン−グロ ビン標的捕捉配列中に二本鎖切断を作るのに用いた酵素）で消化した。アステリ スクは相同組換えによって正しく選択されたクローンを示す。

Ｍでマークしたレーンには、Ａｖａｌｌ（左側）で消化した精製ベーターグロビ ン標的捕捉プラスミド、またはＡｐａＩ（右側）で消化した精製イプシロン−グ ロビン標的捕捉プラスミドをのせた。このマーカー断片のサイズは、正しく標的 化された現象について予想されるサイズと同じであった。矢印は、正しく標的化 された現象について予想される断片サイズを示し、左側では５．６ｋｂ１右側で は６．２ｋｂである０ハイブリダイゼーシヨンはｓｔｐ標１１１＋ＡＲＧ４ＤＮ Ａ４に対して行なった。

ベーターおよびイプシロン−グロビン陽性クローンのうちの３つづつをＣＨＥＦ ゲル電気泳動［チュウ、ポルラス、およびデビット（Ｃｈｕ、　Ｇ、、　Ｖｏｌ ｌｒａｔｈ、　Ｄ、、　ａｎｄ　Ｄａｖｉｄ、　Ｒ，Ｗ、）、　５ｃｉｅｎｃｅ 、　２３４：１５８２−１５８５　（１９８６）　Ｅ　、およびイプシロン−ま たはベーターグロビンＤＮＡを適宜プローブとして用いる制限酵素・サザンハイ ブリダイぜ−ション分析によってさらに分析した。これら２個の遺伝子はヒト染 色体１１上でわずか４０ｋｂＬか離れていないことから予想されたとおり、６個 のＹＡＣのいずれもが同一であってベーターとイプシロン−グロビンＤＮＡの両 方を保持していることがこの分析で証明された。６個のＹＡＣのいずれにおいて も、ＡＲＧ　４　ＤＮＡは１９０ｋｂのＹＡＣに組込まれており、ｐ１８４ＤＬ ＡＲＧ構築物は予想どおりグロビン座位内の相同ＤＮＡに組込まれていた。

相同組換えを利用してＤＮＡ　ＹＡＣライブラリーから特定の遺伝子を単離する のに成功している。単離したＹＡＣは、約１３０ｋｂのフランキングＤＮＡに沿 ってイプシロン遺伝子まで少なくとも１６ｋｂ５’　の位置からベーターグロビ ン遺伝子までベーターグロビン座位全体にまたがっている。

また、同じＤＮＡ　ＹＡＣライブラリーを用いて同様の選択プロトコルを実施し たところ、ライブラリーを１４力月以上にわたり一７０℃で保存した後でβ−グ ロビン座位からＹＡＣが単離された。したがって、相同組換え選択によってヒト ＤＮＡ　ＹＡＣライブラリーからクローンを単離することが可能であることが初 めて明らかになった。

相同組換えによるＤＮＡライブラリーからのクローンの選択に一段遺伝子破壊法 ［ロススタイン（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ、　Ｒ，Ｊ、　）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ 　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　１０１：２０２−２１１．＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒ ｅｓｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８３］を応用することができる。この態様においては 、選択可能なマーカーを標的捕捉配列に挿入する。続いて、選択可能なマーカー を組込んだ標的捕捉配列を単一の線状断片として単離しく図３に示したようにし て）、実施例Ｉで述べるようにしてプールＤＮＡ　ＹＡＣライブラリーに形質転 換させる。標的捕捉分子とライブラリー内の特定のＤＮＡクローンの間に相同組 換えが起きた結果生じる正しく標的化されたクローンは、選択可能なマーカーの 存在によって破壊される標的捕捉配列の単一コピーを保持しているはずであり、 ＡＲＧ４または標的捕捉配列のいずれかを放射標識プローブとして用いる制限酵 素消化・サザンプロット分析の後では特定かつ予想可能な位置に移動しているは ずである。これは、正しく標的化されたＤＮＡクローンは選択可能なマーカーの 両側に隣接する標的捕捉配列の２個の未分断コピーを有する実施例■で述べたプ ロセスと対照的である。

図３は、一段遺伝子破壊法を利用した相同組換えにょるＤＮＡ　ＹＡＣライブラ リーからのＤＮＡクローンの選択を示す。細い線は、酵母人工染色体（ＹＡＣ） の形へのＤＮＡ挿入断片を示す。黒塗り四角は、ＤＮＡ断片、すなわち標的捕捉 配列に相同なライブラリー中に見られるＤＮＡ　ＹＡＣクローンの一部をなすＤ ＮＡの配列を示す。図中、標的捕捉配列（黒塗り四角）は、酵母ＡＲＧ４遺伝子 （白抜き四角）の挿入によって改変されている。ＤＮＡ　ＹＡＣの残りの部分は ＹＡＣベクターのアームから成り、太い線は細菌中の複製と選択のためのプラス ミド配列を示す。斜線四角は酵母中の選択に使用する遺伝子マーカー（酵母で選 択可能なマーカーＵＲＡ３およびＴＲＰＩ）を示す。黒塗りの矢印と丸印はそれ ぞれ末端小粒（置）と動原体／酵母複製起点（ＣＥＮ／ＡＲＳ）を示す。図３ａ は、ＤＮＡ　ＹＡＣ上の標的配列に合わせて並んでいる標的捕捉分子を示す。図 ３ｂは、標的配列を置換している標的捕捉配列と標的配列の間の相同組換えの生 成物を示す。

この基本概念の態様の具体例として、１．９ｋｂ　（Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ）の ５°イプシロン−グロビン断片（実施例Ｉ参照）をｐＵＣ１８（ＡＴＣＣ＃３７ ２５３）のＨｉｎｄｌ１１部位にサブクローン化する。得られたプラスミドをＡ ｐａｌで消化して、０．２６ｋｂのＡｐａｌ断片を５°イプシロン−グロビン挿 入断片の中央部から切除する。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて３’Ａｐａ１オ ーバーハングを平滑末端化し、得られたものをＡＲＧ４の２．　Ｏｋｂの精製Ｈ ｐａＩ断片につなぐ［ビーチャム（Ｂｅａｃｈａｍ、ＩＲ，）　、Ｇｅｎｅ、　 ２９：２７１−１７９．１９８４］。

得られたプラスミドは、ＡＲＧ４により５′イプシロン−グロビン配列が破壊さ れているが、これを実施例Ｉに述べたよ　゛うにＨｉｎｄｌｌｌて消化しＤＮＡ 　ＹＡＣライブラリーに形質転換する。上記具体例では、Ａｐａｌは標的捕捉配 列において特異的でないので、５′イプシロン−グロビンＤＮＡの０．２６ｋｂ がＡＲＧ４配列で置換される。しかし、標的捕捉配列において特異的である酵素 の場合、単純な挿入となろう。

Ａ、１）　サツカロミセス　セレビシェ宿主菌株の構築 前述した４つのＹＡＣベクター上の選択可能マーカーとして使用される４つの遺 伝子のそれぞれの染色体欠失を有するニス、セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓ ｉａｅ）菌株の構築を以下のようにして行うことができる。

Ａ、１．ａ）　ＡＲＧ４の欠失： 希釈条件下（１μｇ／ｍｌ）でのＨｐａｌによる消化とＤＮＡの再連結によって 、酵母アルギニノコハク酸リアーゼ遺伝子（ＡＲＧ４）の構造遺伝子全体と調節 要素を保持する２、Ｏｋｂの内部Ｈｐａｌ断片を、ｐＵｃｌ　９　（ＡＴＣＣ＃ ３７２５４）のＢａｍＨ１部位に挿入したｐ　（ＳＰＯ１３）２［ワング（Ｗａ ｎｇ、　Ｈ−Ｔ、）ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉ ｏｌｏｇｙ、　７：１４２５−１４３５．１９８７］から単離した１ｌｋｂのＢ ａｍＨＩ断片より成るプラスミドから欠失させる。得られたプラスミドをＢａｍ ＨＩで消化し、ＡＲＧ４、ＴＲＰＩ、ＵＲＡ３、およびＬＥＵ２の野性型対立遺 伝子を保持するとともに非復帰性ｈｉｓ３一対立遺伝子を保持するニス、セレビ シェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株に導入する。この形質転換は、酵母Ｃ ＥＮ要素とＡＲ３要素および酵母ＨＴＳ３遺伝子を保持するプラスミドと組み合 わせて、標準的な共形質転換条件［アラシュベル（Ａｕｓｕｂｅｌ　Ｆ、Ｍ、、 ）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉ ｏｌｏｇｙ。

Ｃｈａｐｔｅｒ　１３．　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓ５ｏｃｉ ａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−［ｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒ ｋ、　＋９８９］を用いて行う。この目的に有用なプラスミドは、ｐＲ８１５（ ＡＴＣＣ＃　３７０６２）由来の１．７ｋｂのＢａｍＨＩ断片をｙｃｐｓｏ　（ ＡＴＣＣ＃３７４１９）のＢａｍＨＴ部位にサブクローン化することによって容 易に構築することができる。ＣＭ−アルギニンプレート上でレプリカ平板培養す ることによってアルギニン栄養要求性を指標にＨｉｓ’″細胞をスクリーニング する。ＨＩＳ３選択を行わないでＨｉｓ”　ａｒｇ−細胞を培養し、単一コロニ ーを単離し、ヒスチジン栄養要求体を探すスクリーニングに付す。Ｈｉｓ”ａｒ ｇ−コロニー由来のＤＮＡを調製し、制限酵素およびサザンプロット分析で調べ てＡＲＧ４欠失（ａｒｇ４△）を有する形質転換体を同定する。このプロトコル を用いて上記実施例Ｉで使用する菌株ＭＧＤ１３１−１０Ｃを作成する。

Ａ、１．ｂ）　ＴＲＰＩの欠失 上記で使用したものと反対の接合型の酵母菌株で、やはりＬＥＵ２およびＵＲＡ ３の変異対立遺伝子（Ｉｅｕ２−１ｕｒａ２）を保持する酵母菌において、Ｎ− （５°−ホスホリボシル）アンスラニレ−トイツメラーゼ（ＴＲＰＩ）酵母遺伝 子（ＴＲＰＩ）の欠失を有するＤＮＡの線状断片を用いること以外は同じ手順を 実施する。これは、ｐＢＲ３２２−３Ｃ４１２０［ステインチコーム（Ｓｔｉｎ ｃｈｃｏｍｂ、　Ｄ、Ｔ、）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　 Ｂｉｏｌｏｇｙ、　１５８：　１５７−１７９．　＋９８２］由来のＢａｍＨＩ −Ｘｈｏｌ断片をＢａｍＨＩ−Ｘｈｏｌ切断ｐＧＥＭ７　（プロメガ社（Ｐｒｏ ｍｅｇａ、　Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）］にサブクローン化した 後、ＴＲＰＩとＡＲ３１を含有する１゜２ｋｂのＥｃｏＲｆ断片を欠失させるこ とによって行う。得られたプラスミドｐＫ２をＢａｍＨＩとＸｈｏｌで消化し、 上記Ａ、１．ａ）のようにしてＨｉｓ３−ＣＥＮ−ＡＲＳプラスミドで共形質転 換させ、ヒスチジン原栄養体を選択し、上記のＡ、１．ａ、）に概略を示した方 法に従ってＴＲＰＩ欠失（ｔｒｐｌ△）を有する細胞を同定する。これらの細胞 をａｒｇ４△を保持する細胞と接合させ、上記２つの欠失についてヘテロ接合性 の二倍体を単離する。これらの細胞を、ａｒｇ４を保持する細胞と接合させ、上 記２つの欠失についてヘテロ接合性の二倍体を単離する。この菌株ＴＤ７−１６ ｄを胞子形成させ、四分子分析に付し、適当な表現型を有する胞子を制限酵素・ サザンプロット分析に付して対立遺伝子ａｒｇ４△とｔｒｐｌ△の両方を有する 菌株（上記実施例１−ＣＪ用１．ｔニーＩＶ−１６ｄ）を同定スル。ＴＤ７−１ ６ｄ（７）遺伝子型は、ａ　／　ａ、ａｒｇ４△／ＡＲＧ４、ＬＥＵ２／Ｉ　ｅ ｕ２−３，１１２、ａｒｇ３−５２／ＵＲＡ３、ｔｒｐｌ−２８９／　ｔ　ｒ　 ｐ　１Δ、ａｄｅ２−１０１／ａｄｅ２−１０１、ｃｙｈ”　／ｃｙｈ’　、（ ＣＹＨ２／ｃｙｈ２）　、ｈ　ｉ　ｓ　３△１／　ｈ　ｉ　ｓ　３△ｌである。

Ａ、１．ｃ）　ＬＥＵ２とＵＲＡ３の欠失：菌株ＴＤ７−１６ｄは、まず酵母の β−イソプロピルマレイド　デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＬＥＵ２）に対応する１ ゜３ｋｂ　Ｈｊｎｃｌｌ−Ａｃｅ　Ｉ断片の内部欠失をもつ線状ＤＮＡ断片で、 そして続いて酵母のオロチジン−５゛−ホスフェイト　デカルボキシラーゼ遺伝 子（ＵＲＡ３）に対応する０、８５ｋｂ　ＰｓｔＩ−ＮｓｉＩ断片の内部欠失を もつ線状断片で行う付加的な共−形質転換実験において受容体として用いられる 。プラスミドＹＥり１３（ＡＴＣＣ＃３７１１５、ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ、　 Ｊ、Ｒ，）ら、Ｇｅｎｅ、８　：１２１．１９７９）およびＹＩｐ３０　（ＡＴ ＣＣ＃３７１０９．ボトシュタイン（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ、　Ｄ、）ら、Ｇｅｎｅ 、８　：１７−２４．１９７９）はそれぞれＬＥＵ２およびＵＲＡ３の欠失誘導 体を構築するための材料として用いられる。４つの欠失すべてに対してヘテロ接 合体である二倍体は胞子を形成し、四分子分析に付され、最小遺伝子ＷＭＡＴａ 　ａｒｇ４Δ　ｔｒｐｌΔ　１ｕｅ２Δ　ｕｒａ３Δを有するハブロイドコロニ ーに対してスクリーニングされる。これはライブラリー１および２を構築するた めの受容体菌株である（図４参照）。

Ａ、２）　酵母人工染色体（ＹＡＣ）ベクターの構築人工染色体の構築は、線状 ＤＮＡ分子の末端を安定化することができる配列（末端小粒または置要素）がク ローニングのために選択されるＤＮＡの各末端に結合されることを要求する。さ らに、各末端は次のものを有する必要がある、１）ライブラリーの初期構築にお ける遺伝子選択のために、および続いて相同組換えによりライブラリーからクロ ーンを選択する際に使用するための選択可能なマーカーとして使用するために用 いられ得る酵母遺伝子、および２）大腸菌での複製を許容し、そして大腸菌に抗 生物質耐性を付与する配列（選択可能なマーカー）。各末端はＤＮＡ複製のため の開始位置として機能する配列（ＡＲ３要素）をも有する。最後に、二つの末端 のうちの一方、そして一方のみが、酵母の動原体として機能する配列（ＣＥＮ要 素）を有しなければならない。

酵母に形質転換される線状ＤＮＡ分子の各々が二つの異なる末端（その一つのみ がＣＥＮ要素を有する）を有することを確保するために、各末端を独自に同定回 収することを容易にするために、そして二つのＹＡＣライブラリー（ライブラリ ー１およびライブラリー２）を作成するために、四つの異なる末端の全てが必要 とされ、そして、四つの異なる酵母遺伝子および四つの異なる抗生物質耐性マー カーを利用する。

上述の種々の要素の全てが大腸菌中で増殖し、操作される酵母人工染色体ベクト ルを作成するために独特の配列で結合される。ライブラリー２の人工染色体の末 端とライブラリーｌから単離された標的捕捉プラスミドの間の相同組換えの可能 性を最小にするために個々のライブラリーのそれぞれの構築において用いられる ベクトル上の細菌の複製起点は異なった材料からとられる。最終のベクトルがコ ンパクトであり、操作が容易であり、そして複製された細菌複製起点による再配 列を起こさないようにするために、四つの末端の各々は、米国特許Ｎ　ｏ　、　 ４．８８９．８０６中に記載された発明とは対照的に、細菌中で異なるプラスミ ドとして保持される。

Ａ、２．ａ）　ＣＥＮ−ＡＲＳ要素の構築ｐＵｃ１９　（ＡＴＣＣ＃３７２５４ ）のＰｓｔＩ部位はＴ４　ＤＮＡ　ポリメラーゼで平滑化することにより除去さ れ、そしてＴ４　ＤＮＡリガーゼで再環状化される。その結果得られるプラスミ ド（ｐｃＵ１９／Ｐｓｔ−はＥｃｏＲＩおよびＳｍａｌで切断され、そしてＡ７ ５ｐ９由来の３．　１ｋｂＥｃｏＲＩ−Ｓｍａ　Ｉ断片）マレ−（Ｍｕｒｒａｙ 、　Ａ、Ｗ、）とシスタック（Ｓｚｏｓｔａｋ、　Ｊ、Ｗ、、　Ｎａｔｕｒｅ、 　３０５：１８９−１９３．１９８３）が挿入される。得られるプラスミド（ｐ ＴｌｏＨ）は５ｔｕＩとＢａｍＨＩで切断され、ＴＲＰＩ遺伝子と全てのＣＥＮ ３配列を除去する。ｐＵｃ１９／Ｐｓｔ−のバックボーンおよびＡＲ３Ｉを有す るＳｔｕｌ−ＢａｍＨＩ断片はゲルにより精製され、そしてＡ７５ｐ９から単離 されたＣＥＮ３を有する３８２ｂｐの５ａｕ３Ａ−３ｃａｒ断片に結合される（ マレ）は公表されたＴＲＰＩ配列〔チャンバー（Ｔｓｃｈｕｍｐｅｒ　Ｇ、）お よびカーボン（Ｊ、　Ｃａｒｂｏｎ）、　Ｇｅｎｅ、　１０：１５７−１６６、 １９８０）中の第８２９位から１４５３位までのＡＲ３＋配列を有する、そして ＡＲ３Ｉ配列はＣＥＮ３配列１−３８２に結合されており〔ブルーム（Ｂｌｏｏ ｍ、　Ｋ、Ｓ、）およびカーボン（Ｊ、　Ｃａｒｂｏｎ）。

ＣＢＬＬ、　２９：３０５−３１７．１９８２）　、両断片ともにｐＵｃ１９／ Ｐｓｔ−ポリリンカーのＥｃｏＲ１部位とＢａｍＨＴ部位の間に挿入されている 。

ｐＭＬＣ２８（ｐＵＣ１９ポリリンカーを有するｐＳＤＣラーゼで平滑化するこ とによって除去され、そしてＴ４　ＤＮＡリガーゼで再環状化される。得られる プラスミド（ｐＭＬＣ２８／５ａｕ）はＥｃｏＲＴとＢａｍＨＩで消化され、オ リゴヌクレオチドｌおよび２とアニーリングされ（図８ａ）、そしてＴ４　ＤＮ Ａリガーゼ、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼ、およびＴ４　ＤＮＡリガーゼで順次処 理される。この処理された分子は大腸菌中に形質転換され、そしてクロラムフェ ニコール耐性の形質転換体がこのオリゴヌクレオチドを有する組換えプラスミド 中に見出されると予期されるＡｐａ１部位の存在に対してスクリーニングされる 。ＥｃｏＲ１部位およびＢａｍ８１部位をも再生するプラスミドは、ジデオキシ ＤＮＡ配列分析に付される。正しい配列（ｐＭＬＣ２８／Ｓ　Ｌ）を有する一つ のプラスミドは、ＥｃｏＲＩで消化され、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼで平滑化さ れ、そして酵母のＡＲＧ　４遺伝子をもつ２．０ｋｂＨｐａｌ断片に結合される 〔ビーチャム（Ｂｅａｃｈａｍ、［、Ｒ，）ら、Ｇｅｎｅ、　２９：２７１−２ ７９．１９８４〕。その結果得られるＨｐａｌ断片（ｐＴ２０）の挿入物を一つ だけ有するプラスミドは、ＢａｍＨＩとＨｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩで切断され、精製 された０、７ｋｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ置断片およびＡＲ３ＩとｐＴ１２Ｈ （セクションＡ。

２、ａ）由来のＣＥＮ３を含む１．０ｋｂＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎ　ｄ　ＩＩＩ断片 と混合される。この三方法によるライゲーションから得られる形質転換体は、制 限酵素分析によってスクリーニングされる。正確なプラスミド（ｐＴ２１）は、 ＳｍａＩとＢａｍＨＴとで消化され、大腸菌由来の１．８ｋｂＳｍａｌ−Ｂａｍ ＨＩ断片に結合される。その結果得られるプラスミドはｐＴＫＥＮＤＡと命名さ れる。図６ａは、ｐＴＫＥＮＤＡのプラスミド地図を関連する性質および制限酵 素部位と共に示す。ＮはＮｓ　ｉ　Ｉを、Ａｔ！Ａｐａｌを、ＳｍはＳｍａＩを 、ＢはＢａｍＨＩを、ＨｄはＨｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩを、ＸはＸｈｏｌを、ＲはＥ ｃｏＲＩを、ｘｂはＸｂａｌを、ＳはＳａ　Ｉ　Ｔ　（Ｈｉｎｄ［Ｉ）を、ｓｐ はｓｐｈ　Ｉを、ＡＲＧ４は酵母ＡＲＧ４遺伝子を、Ｃｍはクロラムフェニコー ル耐性遺伝子を、ＯＲＩ　（ｐＭＬＣ２８）はｐＭＬＣ２８の複製起点を、ＣＥ Ｎ３．ＡＲ３ｌは酵母ＣＥＮ３　（動原体）およびＡＲ３＋（複製起点）をそれ ぞれ示す。置は酵母における末端小粒形成を開始させる配列を、ｅｘＲは前のＥ ｃｏＲ１部位を、破線は大腸菌由来のシュドファーＤＮＡ断片を示す。

矢印はＡＲＧ４転写の方向を示す。

ｐＴＫＥＮＤＡで用いられるＣＥＮ３−ＡＲ３Ｉ要素はＤＮＡ　ＹＡＣライブラ リーを構築するために使用する配列としては好ましくない。ｐＴＫＥＮＤＡをよ り好ましい誘導体に転換するために、ｐＴＫＥＮＤＡをＸｂａｌで消化し、次い で平滑末端をつくるために大腸菌のＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片で処 理する。このＤＮＡは次いでＢａｍＨＩで切断し、原始的にｐＴＩ２Ｈに由来す るＣＥＮ３−ＡＲ８！要素および置配列を除去する。ＡＲＧ４を有する６、５ｋ ｂ断片（この修飾では断片へと呼ばれる）、大腸菌ＤＮＡのンユトファー断片お よびタロラムフェニコール耐性遺伝子をゲルによりＩＩＩ製する。別に、ｐＴＫ ＥＮＤＡをＨｉｎｄ　［１１とＢａｍＨＩで消化し、そして０．７ｋｂ　置断片 （この修飾において断片Ｂと呼ばれる）をゲルにより精製する。

プラスミドＹＣｐ１９　（ＡＴＣＣ＃３７３６４）をＨｉｎ　ｄ　ＩＩＩ　、　 Ｐ　ｖ　ｕ　［１、およびＸｂａｌて消化し、ＣＥＮ４とＡＲ３Ｉを有する２、 ６ｋｂのＨｉ　ｎ　ｄ［ＩＩ　−Ｐｖｕｒｌ断片（この修飾において断片Ｃと呼 ばれる）をゲルにより精製する。断片Ａ、ＢおよびＣは共に結合され、大腸菌に 形質転換され、そしてクロラムフェニコール耐性コロニーが断片Ａ。

ＢおよびＣの一個のコピーをもつプラスミドに対してスクリーニングされる。そ の結果得られるプラスミドはｐＴＫＥＮ酵母のＴＲＰＩ遺伝子をもつＹＲｐ７　 （ＡＴＣＣ＃３７０６０）由来の８２７ｂｐ　ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＴ断片をＴ４ 　ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、次いでＨｉｎｃｌｌ切断ｐＵｃ１９　（ＡＴ ＣＣ＃３７２５４）に結合される。一つのプラスミド、ｐＴ３２８は、ＴＲＰＩ 遺伝子の転写の方向がｐＵｃ＋９ポリリンカーのＥｃｏＲＩ部位から離れる向き であるように単離される。このプラスミドはＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断され 、オリゴヌクレオチド（Ｏｌｉｇｏｓ）　３および４とアニーリングされ（図８ ａ）、そしてＴ４　ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼ、およびＴ４　 ＤＮＡリガーゼで順次処理される。処理された分子は大腸菌に形質転換され、そ してアンピシリン耐性の形質転換体が、そのオリゴヌクレオチドをもつ組換えプ ラスミド中に見出されると予想されるＡｐａ１部位の存在に対してスクリーニン グされる。

ＥｃｏＲ１部位をも再生するプラスミドはジデオキシＤＮＡ配列分析に付される 。正しい配列（ｐＴ３２ＬＨ）をもつ一つのプラスミドはさらに使用するため、 精製される。

プラスミドｐＢＳ／＋（ストラタジーン　クローニングシステムズ社、　Ｌａｊ ｏｌｌａ、　ＣＡ）はＡａｔｌｌとＥｃｏＲＩで切断され、ＴＪ　ＤＮＡポリメ ラーゼで平滑化されＬａｃＺ遺伝子を欠失させる。得られる分子はＴＪ　ＤＮＡ リガーゼで環状化され、そしてアンピシリン耐性の大腸菌形質転換体がＥｃｏＲ １部位を再生する正しい欠失誘導体に対し、分析される。一つのプラスミド（ｐ ＢＳΔ）はＥｃｏＲＩとＰｓｔｌ（両者ともｐＢＳ／＋ポリリンカー内で切断す る）で切断され、モしてｐＴ３２ＬＨ由来の０．８５ｋｂ　ＴＲＰＩ　ＥｃｏＲ Ｉ−Ｐｓｔｌ断片に結合される。このライゲーションにより得られるアンピシリ ン耐性形質転換体について、正しい構造（ｐ７３２ＢＨ）をもつ分子に対し、制 限酵素分析によってスクリーニングする。ｐ７３２ＢＨは、次いでｐＴＫＥＮＤ Ａ由来のＢａｍＨＩ−Ｘｈｏｌ　置断片で切断し、そして形質転換体を置断片の 挿入物−個を有する分子に対して制限酵素分析（セクションＡ、２．ｂ、）によ りスクリーニングする。このプラスミド、ｐＴ３３Ｈは、５ｐａＩで切断され、 ＴＪ　ＤＮＡポリメラーゼで処理することにより平滑化され、そしてＴＪ　ＤＮ Ａリガーゼで再環状化される。その結果得られるプラスミドは、ｐＴ３４Ｈであ る。

ｐＴ３４Ｈは、５ｎａＢ　ＩとＢａｍＨＩで消化され、プラスミドｐＢＲ：βａ 　（ＡＴＣＣ１３９６９Ｂ）由来の１．　２ｋｂ　ＳｎａＢＩ−ＢａｍＨＩ断片 に結合される。得られるプラスミドはｐＴＫＥＮＤＢと命名される。図６ｂは、 ｐＴＫＥＮＤＢのプラスミド地図であり、関連する特徴と制限酵素認識部位も示 す。ＮはＮｓ　ｉ　Ｉを、ＡはＡｐａｌを、Ｓｎは５ｎａＢＩを、ＢはＢａｍＨ Ｉを、ＨｄはＨｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩを、ＸはＸｈｏｌを、ＲはＥｃｏＲＩを、ｘ ｂはＸｂａｌを、ＨｅはＨｉ　ｎ　ｃ　ＩＩを、ｓｐはｓｐｈ　Ｉを、ＰはＰｓ ｔＩを、ＴＲＰＩは酵母のＴＲＰＩ遺伝子を、Ａｐはアンピシリン耐性遺伝子を 、ＯＲＩ　（ｐＢＳ／＋）は１）ＢＳ／＋（７）複製起点を、ＡＲ３ｃはコンセ ンサスＡＲ８配列（ＴＡＡＡＣＡＴＡＡＡＡ、ブローチ（Ｂｒａｏｃｈ、　Ｊ、 ）ら、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、　Ｑｕａｎｔ、　Ｂ ｉｏｌ、　４７：１１６５（１９８３）　）を示す。置は酵母における末端小粒 形成を開始させる配列を、ｅｘＲは前のＥｃｏＲ１部位を、ｅｘＰは前のＰｓｔ １部位を、破線はヒトベーターグロビンＤＮＡ由来のシュドファーＤＮＡ断片を 示す。矢印はＴＲＰ１転写の方向を示す。

ｐＡｃＹｃ１８４　（ＡＴＣＣ＃３７０３３、チャン（Ｃｈａｌｌ−Ｈｉｎｄｌ ｌ［断片をＳａ　１１−Ｈｉｎｄｌ［Ｉ切断ｐ１３Ｓ／−（ストラタジーン　ク ローニングシステム社、ＬａＪｏｌｌａ、　ＣＡ）にサブクローニングし、ｐＴ ４０Ｈを作成する。宿主菌株ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ　（ストラタジーン　クローニン グシステム社、ＬａＪｏｌｌａ、　ＣＡ）を野生型Ｍ１３（バイオ−ラッドラボ ラトリーズ社、ロックビルセンター、ニューヨーク）で感染させ、そして野生型 とｐＴ４０Ｈのファージ粒子の混合物を単離する。ｄｕｔ−ｕｎｇ−の大腸菌株 ＣＪ２３６（バイオ−ラッドラボラトリーズ社、ロックビルセンター、ニューヨ ーク）の細胞をこのファージ混合物で感染させ、そしてｐＴ４０ＨおよびＭ１３ の一本鎖ＤＮＡの混合物を分離する。オリゴ１３（図８ｃ）は、クンケル（Ｋｕ ｎｋｅｌ、　Ｔ、Ａ、　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎ ａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　ＵＳＡ、８２：４８８−４９ ２、１９８５）によって記述されたように、ｐＡＣＹＣ１８４の１８７０位に相 当するＸｈｏ［１部位においてＣのＴへの置換を導入し、ｐＴ４０／Ｘ−Ｈを作 成するために、不可欠的に用いられる。ｐＴ４０／Ｘ−Ｈ由来の６２２ｂｐのＳ ａ　１１−Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ断片を分離し、ゲル電気泳動によって精製され たｐＡＣＹＣｌ　８４の３．６ｋｂ　５ａｉｌ−Ｈｉｎｄｌｌｌ断片に結合する 。その結果得られるプラスミド（ｐＴ４１Ｈ）をＸｍｎ１と５ｔｙｌで切断し、 ＴＪ　ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑化し、ＥｃｏＲＩリンカ−（ＣＧＧＡ ＡＴＴＣＣＧ）に結合し、そしてＥｃｏＲＩで切断し、ＥｃｏＲＩのオーバーハ ング末端を作成する。２２３７ｂｐのＥｃ。

Ｒ１結合Ｘｍｎｒ−Ｓｔｙｒ断片をゲル電気泳動により精製する。

ＢａｍＨＩリンカ−をＵＲＡ３遺伝子を有するＹＩｐ３０（ＡＴＣＣ＃３７１０ ９）由来の１．１ｋｂ　Ｈｉｎｄｌｌｌ断片上に結合させる。この断片を、ＵＲ Ａ３転写の方向がポリリンカー中のＥｃｏＲ１部位から離れる向きになるように ｐＢＳ／＋（ストラタジーン　クローニング　システムズ社、　ＬａＪｏｌｌａ 、　ＣＡ）のＢａｍＨ１部位中に挿入する。得られるプラスミドをＨｉ　ｎ　ｄ 　ＩＩＩで切断し、ＴＪ　ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、そしてＴＪ　ＤＮＡ リガーゼで再環状化して、ポリリンカーのＨｉ　ｎ　ｄ　１１１部位を除去する 。得られるプラスミドをＮ５ｉｌと５ａｌＴで切断し、またＴＪ　ＤＮＡポリメ ラーゼで平滑化し、そしてＴＪ　ＤＮＡリガーゼで再環状化して、そのプラスミ ド中のＮｓ　ｉ　Ｌ　ＢａｍＨＩ　（ＵＲＡ３の３′側のみ）、ＸｂａＬおよび ５ａｉｌ部位を除去する。その結果、精製するプラスミドをＥｃｏＲＩとＢａｍ ＨＩで切断し、そして図８ｂに示されるオリゴヌクレオチド（０１ｉｇｏｓ）５ および６とアニーリングさせる。その混合物をＴＪ　ＤＮＡリガーゼ、ＴＪ　Ｄ ＮＡポリメラーゼ、および再度Ｔ４　ＤＮＡリガーゼで処理し、そして細菌中に 形質転換させる。アンピシリン−耐性形質転換体について、そのポリリンカーに より導入されるＡｐａ１部位の存在に対し、制限酵素分析によってスクリーニン グする。そして再生するプラスミドとＥｃｏＲ１部位は、ジデオキシＤＮＡ配列 法に付され、正しいポリリンカー配列を確認する。このプラスミドはｐＵＲＡ３ ＬＨである。

宿主菌株ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ　（ストラタジーン　クローニングシステム社、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）を野生型Ｍ１３（パイオーラッドラボラトリーズ社、ロッ クビルセンター、ニューヨーク）で感染させ、そして野生型とｐＵＲＡ３ＬＨの ファージ粒子の混合物を単離する。ｄｕｔ−ｕｎｇ−の大腸菌株ＣＪ２３６（バ イオ−ラッドラボラトリーズ社、ロックビルセンター、ニューヨーク）の細胞を このファージ混合物で感染させ、そしてｐＵＲＡ　３　ＬＨおよびＭ１３の一本 鎖ＤＮＡの混合物を分離する。オリゴヌクレオチド１２（図８ｃ）は、クンケル （Ｋｕｎｋｅｌ、　Ｔ、Ａ、　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔ ｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ　ＵＳＡ、８２：４８８− ４９２．１９８５）によって記述されたよウニ、公表されたＵＲＡ３配列〔ロー ズ（Ｒｏｓｅ　Ｍ、Ｇｒｉｓａｆｉ）ら、Ｇｅｎｅ、　２９：１１３−１１４） 中の９０６位におけるＸｈｏｌｒ部位における塩基置換を導入するために、不可 欠的に用いられる。

その結果得られるプラスミドを、ｐＵＲＡ３ＬＨＸ−を、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨ Ｉで切断し、ｐＴＫＥＮＤＡ　（セク’／ａンＡ、２．ｂ、）由来の０．７ｋｂ 　ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＴ　置断片に結合させる。得られるプラスミド、ｐＴ４ ２Ｈを、ＥｃｏＲＩで完全に、そしてＰｓｔｌで部分的に切断し、Ｔ４　ＤＮＡ ポリメラーゼで平滑化し、ＥｃｏＲＩリンカ−（ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧ）に結合 し、そしてＥｃｏＲＩで切断してＥｃｏＲＩオーパーツ１ング末端を作成する。

１．７ｋｂのＥｃｏＲＴ結合断片をゲル電気泳動によって精製し、先に精製した ｐＴ４１Ｈ由来のＥｃｏＲＩ結合断片に結合する。テトラサイクリン耐性の形質 転換体については、いずれかの方向における各断片の単一コピーをもつ分子に対 し、制限酵素分析によって分析される。このプラスミドをＢａｍＨＩとＳｍａＴ で消化し、そしてこれにｐＴＫＥＮＤＡの構築に用いられた大腸菌由来の同じ１ ．８ｋｂシユドフア一断片を挿入する。その結果得られるプラスミドを、ｐＴＫ ＥＮＤＣと名付ける。図６Ｃは、ｐＴＫＥＮＤＣのプラスミド地図であり、関連 する特徴と制限酵素認識部位とをともに示す。ＮはＮｓ　ｉ　Ｉを、ＡはＡｐａ ｌを、ＳｍはＳｍａｌを、ＢはＢａｍＨＩを、ＨｄはＨｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩを、 ＸはＸ　ｈ　ｏ　Ｉｆを、ＲはＥｃｏＲＩを、ＡｈはＡ　ｈ　ａ　１１１を、Ｕ ＲＡ３は酵母ＵＲＡ３遺伝子を、Ｔｃはテトラサイクリン耐性遺伝子を、ＯＲＩ 　（ｐＡＣＹＣｌ　８４）はＰＡＣＹＣｌ　８４の複製起点を、ＡＲ３ｃはＡＲ ３のコンセンサス配列（ＴＡＡＡＣＡＴＡＡＡＡ、ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ、　 Ｊ、）ら、（１９８３）　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、　 Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉｏｌ、　４７：１１６５）を示す。置は酵母における末端小 粒形成を開始させる配列を、ｅｘＳ、ｅｘＭ、ｅｘＮ、ｅｘＰ、ｅｘＢ、ｅｘＸ は前の（ｆｏｒｍａｒ）Ｓ　ｔ　ｙ　Ｉ、Ｘｍｎ　Ｌ　Ｎｓ　ｉ　Ｉ、Ｐｓ　ｔ 　Ｉ、ＢａｍＨＩおよびＸｈ。

■１部位を、それぞれ表わし、破線は大腸菌由来のシュドファーＤＮＡ断片を表 わす。矢印はＵＲＡ３転写の方向を示す。

ｐＡｃＹｃ１７７　（ＡＴＣＣ＃３７０３１、チャン（Ｃｈａｎｇ、　Ａ、Ｃ， Ｙ、）とコーエン（Ｃｏｈｅｎ、　Ｓ、Ｎ、）、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃ ｔｅｒｉｏｌｏｇＹ、１３４：１１４１−１１５６．１９７８　）を、５ａｕ９ ６で切断し、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼで処理することにより平滑化し、そして カナマイシン耐性遺伝子を有する１、２ｋｂ断片をゲル電気泳動によって単離す る。この断片を、Ｈｉｎａｌｌで切断されたｐＢｓ／＋（ストラタジーン　クロ ーニングシステム社、ＬａＪｏｌｌａ、　ＣＡ）に結合する、そしてクロラムフ ェニコールおよびカナマイシン耐性クローンをｐＢＳ／＋ポリリンカー中のＥｃ ｏＲＴ部位から転写の方向が離れるように挿入されたカナマイシン遺伝子による 組換え体に対してゲル電気泳動により分析する。５ａｕ９６部位の平滑末端化お よび、それに続＜　Ｈｉ　ｎ　ｃ　ＩＩで切断したｐＢＳ／十への結合により、 左側および右側の結合部位に５ａｌＩ部位を生ずる。このプラスミドは、ｐＴ５ ０Ｈである。カナマイシン耐性遺伝子を両側にある二つの逆の繰り返しく転写の 方向に関して５′の逆の繰り返し）の一つを除去するためにｐＴ５０ＨをＳａＩ ！とＤ　ｒ　ａ　ＩＩＩで切断し、カナマイシン耐性遺伝子を含む１．０８ｋｂ 断片を精製し、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼで処理することにより、平滑末端化し 、そしてＨｔ　ｎ　ｃ　ＩＩで消化されたｐＢＳ／十に結合する。その結果得ら れるプラスミドは、ｐＢＳ／＋ポリリンカー中のＥｃｏＲ１部位から離れてい（ 方向にカナマイシン耐性遺伝子の転写を受けるが、これはｐＴ５０ＨΔＳＤであ る。ｐＴ５０ＨΔＳＤを、宿主菌株ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ　（ストラタジーン　クロ ーニングシステム社、ＬａＪｏｌｌａ、　ＣＡ）中に導入し、続いて野生型Ｍ１ ３（バイオ−ラッドラボラトリーズ社、ロックビルセンター、ニューヨーク）で 感染し、そして野生型およびｐ’ｒｓｏΔＳＤのファージ粒子の混合物を単離す る。ｄｕｔ−ｕｎｇ−の大腸菌株ＣＪ２３６（パイオーラッドラボラトリーズ社 、ロックビルセンター、ニューヨーク）の細胞を、このファージ混合物で感染し 、そしてｐＴ５０ＨΔＳＤおよびＭ１３の一本鎖ＤＮＡ混合物を単離する。オリ ゴヌクレオチド１４．１５および１６（図８ｃ）は、クンケル（にｕｎｋｅｌ、 　Ｔ、Ａ、）、　ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇＳｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａ ｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　ＵＳＡ、８２：４８８−９２．１９８ ５〕によって記述されたように、二つのＮ５ｉＩ部位（公表されたｐＡＣＹＣ１ ７７の２２０３位および２４６９位）およびｐＡＣＹＣｌ　７７の２６０２位の Ｘｈｏ［１部位における塩基置換を導入するために、不可欠的に用いられる。得 られるプラスミド、ｐＴ５０ＨＸをＥｃｏＲＩおよびｓｐｈ　１で切断し、Ｔ４ 　ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、そしてＴ４　ＤＮＡリガーゼで環状化する（ ＥｃｏＲ１部位を再生する）。その結果得られるＤＮＡＩＩ製物を、次いでＸｂ ａＩで切断する。この断片を、プラスミド複製起点を存するＩ）ＡＣＹＣ１７７ の８８２塩基対のＡｃｃｌ−Ｘｈｏｆｌ断片（それはＴ４　ＤＮＡポリメラーゼ で平滑化し、Ｘｂａｌリンカ−（ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣ）と結合し、そしてＸｂ ａｌで処理しＸｂａＴオーバーハングを形成させる）に結合し、プラスミドｐＴ ５１Ｈ（いずれの方向も満足する）を形成させる。

プラスミドｐＴ５２Ｈは、プラスミドＹＩｐ３３（ＡＴＣＣ＃３７０６４）を、 ＨｐａｌおよびＡｃｃｌで切断し、酵母のＬＥＵ２遺伝子〔アンドレアディス（ Ａｎｄｒｅａｄｉｓ、　Ａ、）ら、　Ｃｅ１１．３１：３１９−３２５．１９８ ２）　）を含む１．６ｋｂ断片を遊離させることにより構築される。この断片を Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、モしてＨｉｎｃｌ［で切断されたｐＵＣ Ｉ８　（ＡＴＣＣ＃３７２５３）に結合させる。得られるプラスミドをＢａｍＨ ＩおよびＸｂａｌで切断し、そしてオリゴヌクレオチド７および８（図８ｂ）と アニーリングさせる。この混合物をＴ４　ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４　ＤＮＡポリメ ラーゼ、および再度Ｔ４　ＤＮＡリガーゼで処理し、そして細菌中に形質転換さ せる。アンピシリン耐性形質転換体をポリリンカーと共に導入されたＡｐａ１部 位の存在に対して制限酵素分析によりスクリーニングし、モしてＢ　ａ　ｍ　Ｈ １部位を再生するプラスミドは、正しいポリリンカー配列を確認するためにジデ オキシＤＮＡ配列決定法に付される。その結果得られるプラスミドは、ｐＴ５２ ＬＨである。ｐ’ｒｓ　２ＬＨを、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで消化し、ゲルに より精製された！、６ｋｂ断片をＢａｍＨＩとＰｓｔｌで切断したｐＴ５１に結 合させる。その結果、生ずるプラスミド、ｐＴ５３Ｈを５ｃａｌおよびＢｇｌｌ ［で消化し、図８ｃ中に示す二本鎖オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド９ Ａおよび９Ｂ）に結合させる。得られるプラスミド（ｐＴ５３ＨＬ）をＨｉ　ｎ 　ｄ　ＩＩＩで部分的に消化し、次いでＢ　ｇ　１　［１で完全に消化し、そし て線状化したｐＴ５３ＨＬ（約３．７ｋｂ）にサイズの対応する消化産物を精製 する。このスピーシーズはオリゴヌクレオチド７および８（ｖＪ８ｂ）経由で導 入された隣接するＨｉ　ｎｄ目■およびＢｇｌ１１部位における切断を示す。プ ラスミドｐＴＫＥＮＤＡ　（セクションＡ、２．ｂおよびＡＴＣＣ寄託番号４０ ８３３）をＥｃｏＲＩで消化し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片で処 理して、平滑末端を形成させる。このＤＮＡを次いでＢａｍＨＩで消化して、０ ．７ｋｂ　置断片をゲルで精製する。プラスミドＹＣｐ１９　（ＡＴＣＣ＃３７ ３６４）をＨｉｎｄ［Ｉ［、Ｐｖｕ［、およびＰｖｕ　Ｉで消化し、ＣＥＮ４お よびＡＲＳＩを有する２、６ｋｂＨｉｎｄｌｌ［−Ｐｖｕｌｌ断片をゲルにより 精製する。精製されたＣ　Ｅ　Ｎ　４−ＡＲＳＩと置断片とをＢｇｌ目−Ｈ１ｎ ｄｌＩＩ消化ｐＴ５３ＨＬに結合し、そして大腸菌に形質転換する。カナマイシ ン耐性形質転換体については、ＣＥＮ４−ＡＲＳＩ、置、およびＴ５３ＨＬ断片 の各単一コピーを有するプラスミドに対してスクリーニングする。その結果得ら れるプラスミドはｐＴ５４Ｈである。ｐＴ５４Ｈを、Ｐ　ｖ　ｕ　ＩＩおよび５ ａｃｌで消化し、バクテリオファージラムダにューイングランド　バイオラボ社 、Ｂｅｖｅｒｌｙ、　Ｍ＾）地図上の２５．８８１−２７．４１４位間に存在す る１゜５ｋｂの５ａｃｌ−Ｐｖｕ［［断片に結合する。得られるプラスミドは、 ｐＴＫＥＮＤＤである。図６ｄはｐＴＫＥＮＤＤのプラスミド地図と関連する特 徴および制限酵素認識部位を表わす、ＮはＮ５ｉｌを、ＡはＡｐａＩを、ＢはＢ ａｍＨＩを、ＨｃはＨｉ　ｎ　ｃ　ＩＩＩを、ＰｖはＰ　ｖ　ｕ　ＩＩを、Ｐは ＰｓｔＩを、ＳはＳａ　１１　（Ｈｉｎａｌｌ）を、ＨｄはＨｉ　ｎ　ｄ　ＩＩ Ｉを、ＸはＸｈｏｌｌを、ｘｂはＸｂａｌを、Ｓａは５ａｃＩを、ＡｈはＡ　ｈ 　ａ　ＩＩＩを、ＬＥＵ２は酵母ＬＥＵ２遺伝子を、Ｋｍはカナマイシン耐性遺 伝子を、ＯＲＩ　（ｐＡＣＹＣ１７７）はＰＡＣＹＣ１７７の複製起点を、ＡＲ ＳｃはＡＲＳのコンセンサス配列（ＴＡＡＡＣＡＴＡＡＡＡ、ブローチ（Ｂｒ。

ａｃｈ、Ｊ、）ら、（１９８３）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓ ）ｎ＋ｐ、　Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉｌ、灯：１１６５　：＋を示す。ＣＥＮ４／Ａ ＲＳＩはＹＣｐ１９（本文参照）のＣＥＮ４／ＡＲ３Ｉ断片を、置は酵母におけ る末端小粒形成を開始させる配列を、ｅｘＲ，ｅｘＰｖ。

ｅｘＮ、ｅｘＸは前の（ｆｏｒｍｅｒ）Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ　、　Ｐ　ｖ　ｕ　Ｉ Ｉ、Ｎ５ｉｆおよびＸｈｏ目部位を、それぞれ示す。破線はバクテリオファージ 　ラムダ由来のシュドファーＤＮＡ断片を示す。

矢印はＬＥＵ２転写の方向を示す。

Ａ、３）　酵母人工染色体（ＹＡＣ）ライブラリーの構築ヒトの白血球のＤＮＡ を調製し、そして実質的に記載されたとおりに〔バーク（Ｄ、　Ｂｕｒｋｅ、　 Ｐｈ、　Ｄ、　ｔｈｅｓｊｓ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔ。

ｎ　Ｕｎｉｖ、、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ（１９８８）　）制限エンドヌク レアーゼで部分的に消化する。ＤＮＡ　（好ましくは、１．５メガ塩基より大き な平均的サイズをもった）を、ＡｐａＩ、Ｎｓ　ｉ　１゜または平滑末端を残す 酵素で部分的に消化する。ライブラリー１を構築するために、プラスミドｐＴＫ ＥＮＤＡ２およびｐＴＫＥＮＤＢを用いる。ｐＴＫＥＮＤＡ２はＢａｍＨＩおよ びＡｐａ　Ｉ、Ｎｓ　ｉ　Ｔ、またはＳｍａｌのいずれかで切断して、シュドフ ァー断片を遊離させる。ｐＴＫＥＮＤＢはＢａｍＨＩおよびＡｐａ　Ｉ、Ｎｓ　 ｉ　Ｉ、または５ｎａＢＩのいずれかで切断し、シュドファー断片を遊離させる 。ライブラリー２の構築のためには、プラスミドｐＴＫＥＮＤＣおよびｐＴＫＥ ＮＤＤを用いる。ｐＴＫＥＮＤＣはＢａｍＨＩおよびＡｐａｌ、Ｎ５ｉＩ、また はＳｍａＩのいずれかで消化し、シュドファー断片を遊離させる。ｐＴＫＥＮＤ Ｄは５ａｃ１およびＡｐａ　Ｉ、Ｎｓ　ｉ　ＩまたはＰ　ｖ　ｕ　ＩＩのいずれ かで消化し、シュドファー断片を遊離させる。

各ベクターを供給者により推奨された条件下でウシ小腸のアルカリホスファター ゼで処理し、そしてフェノール抽出およびエタノール沈澱により精製する。各々 のライブラリーに対して、ヒトＤＮＡの５０μｇおよび各対（ｐＴＫＥＮＤＡ２ −ｐＴＫＥＮＤＢまたはｐＴＫＥＮＤｃ−ｐＴＫＥＮＤＤ）における各ベクター の２５μｇを混合し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いて１２°Ｃで、２日間酵素供 給者により推奨されたライゲーションバッファー中で結合させる。結合されたＤ ＮＡを低−ゲル化温度アガロース（エフエムシー社、　Ｒｏｃｋｌａｎｄ、　Ｍ ａｉｎｅ）中におけるフィールド　インバージョン　ゲル電気泳動〔カール（Ｃ ａｒｌｅ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、　２３２：ｐｐ６５−６８．１９８６）または ＣＨＥＦゲル電気泳動〔チュー（Ｃｈｕ）ら、１９８６　前掲文献中〕により、 サイズ分画する。そして、２５０−４５０ｋｂのＤＮＡを含むゲルの部分を切取 り、ＴＥバッファー＋４５ｍＭ　ＮａＣ１と平衡化させる。

セクションＡ、３．ａ、において記述されたように調製されたＤＮＡは、ｐＴＫ ＥＮＤＡ２およびＩ）ＴＫＥＮＤＢに結合させたヒトＤＮＡを用いて、ＡＲＧ４ 、ＴＲＰ　１．ＵＲＡ３およびＬＥＵ２に対して染色体欠失を有するハブロイド のニス、セレビシェ菌株を、アルギニンおよびトリプトファン原栄養性（ｐｒｏ ｔｏｔｒｏｐｈｙ）に形質転換するために用いることができ、実質的にはバーガ ーとパーシバル（Ｂｕｒｇｅｒｓ　ａｎｄ　Ｐｅｒｃｉｖａｌ（１９８７））に より記載された通りに行われるが、下記の修正が施される、ＤＮＡを保持する低 温溶解性のアガロースの１０−２０μｍを３から５分間、６８℃で溶解する。キ ャリアーＤＮＡ　（分断した鮭精子またはウシ胸腺ＤＮＡ）を細胞２００μｌに 溶解したゲル　スライスを添加する直前に、３０−４０℃ｇ／ｍｌの最終濃度に なるように、その細胞に添加する。

人工染色体を育する酵母細胞のプレイティングと選択のために形質転換された細 胞をトップアガー（１モル　ソルビトール、２％　デキストロース、０．５％　 硫酸アンモニウム、０．１７％　イースト　ナイトロジェン　ベース（ディフコ 社）、２．５％　バクトーアガ−（ディフコ社）、０．００５％　硫酸アデニン およびウラシルおよびオースベル（Ａｕｓｂｅ　Ｉら）の表１３．１．ｌにリス トされた全アミノ酸をリストされた濃度で補給するが、選択のためにはアルギニ ンとトリプトファンを除く）と混合する。細胞とトップアガーの混合物をアガー の最終濃度がプレート中で２％であることを除き、トップアガーと同様に作られ たアガープレートの表面上に注ぐ。プレートを３０℃で５−７日インキュベート する。

ライブラリー２に構築するために、ｐＴＫＥＮＤＣおよびるために用いられる。

トップアガーとプレートを上述のとおり調製するが、ウラシルとロイシンだけを 除く。

Ａ、３．ｃ）　クローンのプール 人工染色体上に存在するマーカーに対して選択可能なプレート上に成長する酵母 コロニーを、滅菌したツマヨウジを用いて選択培地２００μｌで満たした９６六 マイクロタイタープレートの各大中に移植する。プレートを浸透しながら２日間 室温でインキュベートし、そして４℃で１週間静置する。

ヒトゲノムを完璧に代表するＹＡＣライブラリーは、平均クローンサイズを３０ ０ｋｂと仮定すれば、ｓｏ、ｏｏｏ個の独立クローンからなるはずである。クロ ーンのこの数は、５２１個のマイクロタイタープレートを満たし、そして１０個 の別々のサブプールとして貯蔵される。約５２個のプレートを満たす時は、各穴 から１００μｌを抜き取り、プールし、そして３０％の滅菌グリセロールの等量 （約５００ｍ１）と徹底的に混合する。グリセロール中の細胞の細胞密度は、約 ２．５Ｘ１０７細胞／ｍｌとすべきであり、グリセロール添加に先立って細胞計 測することにより、この密度に調節することができる。プールされた細胞は、次 いで、０．１から１ｍｌの量でミクロ遠心分離管中に分注し、急速凍結するため に、ドライアイス上に置き、そして−７０℃で貯蔵される。

これは、１０個の別々のサブプールの各々に対して、繰り返される。

相同組換えによるＤＮＡ　ＹＡＣの分離は、図４のステップｌおよび２に示され る。

Ｂ、１．）　標的捕捉プラスミドの構築ヒトゲノム中でユニークなもの、または 低コピー数であるとして以前に同定されたヒトＤＮＡの目的の断片（標的捕捉配 列）で、ｐＴＫＥＮＤＣの置ドメインおよびシュドファードメインを置換する。

その結果得られるサブクローンの５０℃ｇを調製し、そして、それを標的捕捉Ｄ ＮＡの少なくとも１５０塩基対が、しかしより少な（でもよいが、切断またはギ ャップのいずれかの側に残り、そしてｐＴＫＥＮＤＣベクター　バックボーンが 完全であり、かつ標的捕捉ＤＮＡと隣接しているように、標的捕捉配列中に二本 鎖切断またはギャップを有する線状分子を形成するところの制限エンドヌクレア ーゼで完全に消化する。消化されたＤＮＡをフェノール抽出およびエタノール沈 澱によって精製し、２０μｌに再懸濁する。

１０個のサブプールの各々の０．１ｍｌを０．０５ＸＹＰＤに追加される１００ ｍ１のＣＭ−ａｒｇ、ｔｒｐ選択培地中で混合する。細胞を激しく撹拌しながら ２Ｘ１０’細胞／ｍｌの密度になるまで３０℃で、−夜成長させる。細胞は、実 質的に記述されたとおり〔アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　 Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｇｒｅｅ ｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓ５ｏ＋ｊａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ−１ ｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　＋９８９））リチウム　アセ テート法〔イトウ（［ｔｏ）ら、１９８３）による形質転換のために調製され、 そして２×ＩＯ−細胞／ｍｌで６個の２００μｌ分別量に分注する。線状化され た標的捕捉プラスミドの各５０μｇ（２０μｌ中）を超音波処理をしたウシ胸腺 ＤＮＡのｌＯμｇ（２μりと混合し、それを細胞２００μｍの分別部分に添加す る。形質転換後、細胞をＣＭ−ａｒｇ、ｔｒｐおよびウラシル寒天プレートの表 面に塗り広げ、そして３０℃で３−５日間インキュベートする。この培地からウ ラシルを除くとｐＴＫＥＮＤＣ由来の標的捕捉プラスミドを安定に挿入された細 胞を選択できる。

アルギニン、トリプトファン、およびウラシルに対し、原栄養性である酵母コロ ニーは、標的捕捉プラスミド上の標的捕捉配列に同等な領域をもつヒトのＤＮＡ 　ＹＡＣ中に挿入された標的捕捉プラスミドを有するクローンのための候補であ る。標的捕捉プラスミドが、ＹＡＣ中に挿入されたコロニーは、マーカー分離試 験によって同定される。３つのマーカーの喪失パターンは、非選択性培地上で成 長させたのち、ＹＡＣを喪失した選択クローン由来の細胞中で分析される。細胞 をＹＰＤプレート上に塗りつけ、２日間非選択的に成長させ、第２のＹＰＤプレ ート上にレプリカし、そしてさらに２日間成長させる。第２のＹＰＤプレートか ら得られる細胞を、単一コロニーについて第３のＹＰＤプレート上に塗りつける 。３日後に単一コロニーを塗布したプレートをＣＭ−アルギニン、トリプトファ ンのプレートおよびＣＭ−ウラシルのプレート上にレプリカする。標的捕捉プラ スミドがＹＡＣ中に挿入されるクローンは、３つのマーカーすべての同時喪失と いうその特徴的なパターンにより同定される。これらの場合には、アルギニンお よびトリプトファンに対して栄養要求性を有するすべてのコロニー（ＹＡＣを同 定するマーカーを失ったコロニー）は、ウラシルに対してもまた栄養要求性です べてのＤＮＡを、アルギニン、トリプトファン、およびウラシルに対し、原栄養 性である酵母コロニーから調製する。このＤＮＡを、標的捕捉配列中に二本鎖切 断を形成するために用いられるものと同一の制限酵素で消化する。消化されたＤ ＮＡのｌｎｇを、アガローズ電気泳動およびサザーン移動に付し、そしてｐＴＫ ＥＮＤＣ中に保持されるＵＲＡ３遺伝子の断片に相当する３２−Ｐ標識化ＤＮＡ を用いてプローブする。コントロールとして、上のＢ、ｌ）で作成された消化プ ラスミドのｌｎｇを、酵母のＤＮＡ試料と同時に電気泳動にかける。正しく標的 化された現象は、純粋な線状化された標的捕捉プラスミドと正確に同一距離を移 動するオートラジオグラフ上のバンドによって特徴づけられる。

−アームに対するクローン化挿入物の方ＹＡＣクローニングベクターであるｐＴ ＫＥＮＤＣ中、ｐＴＫＥＮＤＢ、ｐＴＫＥＮＤＣおよびｐＴＫＥＮＤＤは、簡単 な微生物学的技法によって、ＤＮＡ　ＹＡＣの末端からのクローン化ＤＮＡのレ スキューを容易にするために、特に設計されたものである。比較的頻度高く（約 ０．５−１．５ｋｂごとに１回）、哺乳類ＤＮＡを切断する制限酵素の認識部位 の一つ以上が、細菌プラスミドレプリコンと酵母末端小粒（置）または酵母の複 製起点（ＡＲ３）および動原体（ＣＥＮ）配列の間の結合に位置している。四つ の末端のどの一つに対しても、そのような酵素の組に対する認識部位は、その末 端上のプラスミドレプリコンまたは酵母の選択可能なマーカー中の他のどの位置 においても見出されない、従って、これらの酵素の一つによる特定のＤＮＡ　Ｙ ＡＣをもつ細胞から単離された全酵母ＤＮＡの切断は、酵母の選択可能なマーカ ーおよび細菌のレプリコンに共有結合しているクローン化挿入物からＤＮＡをレ スキューする（図４のステップ３で示すように）、シかし酵母の染色体複製およ び安定化要素（末端小粒、動原体、および酵母の複製起点）は、レスキューを免 れる。「レスキュー」されたこのＤＮＡは、第２のＤＮＡ　ＹＡＣライブラリー に対する標的捕捉プラスミドとして用いられる。表のカラム２（レスキュ一部位 ）は、この２つのＤＮＡ　ＹＡＣライブラリー中の４つの末端の各々に隣接する クローン化ＤＮＡのレスキューに対して有用な制限酵素をリストする。カラム３ （付加的酵素）は、クローンの相同組換えによりＤＮＡ　ＹＡＣ選択の有用性を 妨害しつる繰り返し反復ＤＮＡ要素を含む非常に長い配列を、レスキュ一部位の 酵素がレスキューするという現象においてレスキュ一部位の欄にリストされた酵 素と組み合わせて用いることができる付加的な酵素の一部をリストする。

５ｐｈｒ　（４５２２）　ＥｃｏＲＩ　（２６６９）Ｂａａ＋ＨＩ　（５６０４ ） Ｋｐｎ［（８９０２） Ｓｔｕｒ　（３８７２） Ａｖａｉｌ　（７９０） Ｈｐａ［（４２４０） ｐＴＫＥＮＤＢ　Ｈｉｎｃ目　（１４３３）　Ｘｈｏｌ　（２１４６２）ＩＥｃ ｏＲ［（２６６９）　Ｔｔｈ［Ｉ［１（１０７０）ｓｔｙｔ　（７８５） Ｂａａ＋Ｈ（５６０４） Ｋｐｎｌ　（８９０２） Ｓｔｕｌ　（３８７２） Ｈｐａ［（４２４０） ＥｃｏＲｒ　（２６６９）　ＢａｍＨＩ　（５６０４）Ｋｐｎｌ　（８９０２） Ｈｐａｌ　（４２４０） ｐＴＫＥＮＤＤ　Ａｈａ目１　（１１９２）　Ｈｇ１Ａ［（１３４８）ＢｓｔＹ Ｉ　（９３０）　Ｈｐａ［（４２４０）ＢａｍＨ［（５６０４）　５ｐｈｌ　（ ４５２２）括弧の中の数字は、哺乳類ＤＮＡについて計算された制限部位間の塩 基対の平均数を表わす。

組換え歩行のためのクローン末端の回収、分析、および利用については、図４の ステップ３−６に示す、Ｕは酵母ＵＲＡ３遺伝子を、Ｘは標的捕捉切断を作るた めに用いられる制限酵素切断部位を、縞四角は標的捕捉配列を、太線は大腸菌中 での増殖および選択のためのプラスミド配列を、Ａｐはアンピシリン耐性遺伝子 を、Ｃｍはクロラムフェニコール耐性遺伝子を、Ｔは酵母のＴＲＰＩ遺伝子を、 Ａは酵母のＡＲＧ４遺伝子を、黒丸と水平矢印はそれぞれ酵母の動原体／複製起 点および末端小粒を、細線はライブラリー１中のクローン化ヒトＤＮＡを、Ｙは 末端−レスキューに用いられる制限酵素切断部位を、Ｌは酵母のＬＥＵ２遺伝子 を、Ｋｍはカナマイシン耐性遺伝子を、Ｔｃはテトラサイクリン耐性遺伝子を、 Ｚは末端−レスキューされたＤＮＡ中に標的捕捉切断を作るために用いられる制 限酵素切断部位を、斜線を付した太線はライブラリー２中のクローン化ヒトＤＮ Ａを表わす。ライブラリー２ＤＮＡ中の細線はライブラリー１から末端−レスキ ューされたＤＮＡに相同な配列を表わす。

この討論の残りは、ＹＡＣの左手末端の単離（レスキュー）に関係する、しかし この原理は２つのＤＮＡライブラリー中の４つの末端の各々を用いる相同組換え 歩行に外挿されつる。ｒＹＪ　とマークされた垂直の矢印は、ヒトＤＮＡ　（＋ ’ｉｉ乳類ゲノムに対しては、Ｈｉ　ｎ　ｃ　Ｉｔ部位は、１．４キロ塩基当た り、１部位の期待分布を有する）全体にわたって種々の位置に存在するＨ　ｉ　 ｎ　ｃ　ＩＩ部位の位置を表わす。最左端の垂直の矢印は、ＴＲＰＩ−ｐＢＳΔ 要素から置要素を、分離するＨ　ｉ　ｎ　ｃ　ＩＩ部位の位置を示す。図示され たＹＡＣを有する酵母菌株の全ＤＮＡを切断すると、左側の置配列からＴＲＰＩ −ｐＢＳΔ断片が遊離する、しかし右側は、その挿入物内の第１のＨｉ　ｎ　ｃ 　１１部位に延びているクローン化ＤＮＡの断片に結合したままである。この全 ＤＮＡを、断片の環状化を促進する条件のもとで結合させる。このＤＮＡの画分 は、細菌細胞を形質転換してアンピシリン耐性プラスミドを単離するために用い られる。

プラスミドＤＮＡの約６０μｇを精製し、そして数マイクログラムをＨｉ　ｎ　 ｃ　ＩＩおよびこのライブラリーを構成するゲノムＤＮＡを消化するために用い られる酵素（ＳｎａＢＩ。

ＡｐａＩ、またはＮｓ　ｉ　Ｉ）で消化する。ライブラリー１が、ゲノムＤＮＡ をＳｍａｌで切断することにより構築され、そして５ｎａＢＩ消化ｐＴＫＥＮＤ Ｂに結合された時は、クローニング部位の側面に位置するＳｍａｌまたは５ｎａ ＢＩ以外の酵素が用いられなければならない（例えば、ＡｐａＩまたはＮｓ　ｉ 　Ｉ）。消化物をアガロースゲル上で分画し、そして非ＹＡＣベクター断片（レ スキューされた挿入物）を精製し、そして両分を、３２Ｐまたは発色性ヌクレオ シド三リン酸で標識する。このＤＮＡは、３つの異なった方法で用いられる。

■、このＤＮＡを、ＴＲＰＩ　ｐＢＳΔ配列内で切断しないことが知られている 制限酵素を選択して切断する（中でも表中の付加的酵素が用いられうる）。消化 産物をゲル電気泳動によって分析し、ＹＡＣの末端から単離されたクローン化Ｄ ＮＡを切断する制限酵素を同定する。

２、標識化されたＤＮＡは、ＹＡＣの末端が、ヒトゲノムの単一コピー配列に相 当するものか、あるいは酵母ゲノムに相同的なものであるかを決定するために、 ヒトおよび酵母のＤＮＡのサザーンプロットフィルターをプローブするために用 いられる。単一コピーまたは低コピーであって酵母ＤＮＡに相同的でないヒトの 配列が標的捕捉のために好ましい。

３、標識化されたＤＮＡは、ドツト−プロットをプローブするために用いられる 、そこでは、ＹＡＣを有する酵母細胞の全ＤＮＡを分離し、ナイロン膜に固定す る。この膜は、それから標識化ＤＮＡ　（ＹＡＣ−Ｚ）が由来するＹＡＣ，先の 組換え選択ステップでＹＡＣ−Ｚを単離するために用いられているＹＡＣ−Ｚと 重なり合っているＹＡＣ（ＹＡＣ−Ｙ）、および先の組換え選択ステップでＹＡ Ｃ−Ｙを単離するために用いられたＹＡＣ−Ｙと重なり合っているＹＡＣ（ＹＡ Ｃ−Ｘ）（すなわち、歩行において単離された最後の３つのＹＡＣ）のＤＮＡで スポットされる。それから誘導されるＹＡＣ（この場合には、ＹＡＣ−Ｚ）にの みハイブリダイゼーションすることは、ＹＡＣ−ＺのＴＲＰ　１−ｐＢＳΔ末端 が正しい方向に延びており、ＹＡＣ−ＹおよびＹＡＣ−Ｘから離れる方向に延び ていることを示す。このことは、ＹＡＣ−Ｚの他の末端について同様の分析をす ることにより確認され、この場合は、ＹＡＣ−ＺおよびＹＡＣ−Ｙおよび／また はＹＡＣ−Ｘとハイブリダイズするに違いない。

上の２）および３）で既述した基準に合致する標的捕捉プラスミドを、（上のｌ から同定され、そして図４でＺと記されたような）適当な制限酵素で切断し、そ して上のセクション８．２で記述されたように、ライブラリー２からクローンを 分離するための標的捕捉プラスミドとして用いる。

実施例ＩＩＩにおいて記述されたベクターには、染色体歩行を容易にするように 特に設計された新しい特徴が組み込まれている。まず、人工染色体の二つの末端 は、二つの異なるプラスミドに由来し、その各々は、酵母の末端小粒形成を開始 するそれ自体の配列、細菌の複製起点、大腸菌で選択するだめの抗生物質耐性の ための遺伝子、および酵母でのクローン選択のための選択可能な遺伝子を有する 。この系は、既存のＹＡＣベクターでは、ただ１つの末端が分離される可能性が あるに過ぎないのに対して、ＹＡＣのいずれかの末端を、増幅および各歩行ステ ップにおける利用のための細菌プラスミドとして単離することを可能とする。

歩行戦略の好ましい態様においては、クローンの最末端が、歩行において重なり 合っているクローンを単離するためのプローブとして使用される。このようなプ ローブの有用性は、ライブラリー内の無数のクローンに相同的である繰り返しＤ ＮＡの存在によって限定される。高度に繰り返し散らばりている、といわれる一 群のＤＮＡ配列のメンバーは、ヒトゲノムの全体にわたって数千の不連続な位置 に見出される。特に繰り返しＤＮＡ配列のＡｌｕ群のメンバーは、平均としてゲ ノム全体にわたって１〜３ｋｂの間隔で見出される〔モイジス（Ｍｏｙｚｉｓ、 　Ｒ，に、）ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４　：２７３−２８８．１９８９）。

実施例ＩＩＩに記述された方法およびベクターは、ヒトＤＮＡ　ＹＡＣベクター ライブラリー中のＤＮＡクローン挿入物の末端で繰り返しＤＮＡが出現するのを 最小にするよう設計されている。ベクターライブラリーの設計中に組み込まれた 第一の特徴は、ヒトＤＮＡを切断するための特定の群の制限エンドヌクレアーゼ の利用である。繰り返しＤＮＡのＡｌｕおよびＬｌ群の無数のＤＮＡ配列を、制 限エンドヌクレアーゼの認識部位を同定するコンピュータープログラムを用いて 解析した。この解析の結果は、制限酵素Ａｐａｌ、Ｎｓ　ｉ　Ｉ、および５ｃａ ｌの認識部位がＡｌｕ群のいずれに対する公表されたコンセンサス配列中にも見 出されず、そしてＬｌ群の配列の決定されたメンバー中には、稀にのみ見出され る（分析されたＬｌ−ＤＮＡの配列の約３０，０００塩基対の中で、上にリスト した３つの酵素に対する切断部位は僅か５つしかなく、ヒトＤＮＡで見出された ジヌクレオチド頻度に基づき期待される切断部位は、２３となる）、ということ を示した。ヒトゲノムのマスの中でこれら２つの群のみで約ｌＯ％を占め、そし てこのことは、１０個のクローン末端のうちの１つ（５個のクローンの中の１つ ）程度が、これらの繰り返し配列の１つにおいて末端を生じることを示している 。ヒ）ＤＮＡを切断するために上に開示した酵素を用いることにより、クローン の末端にあるこれらの２つの繰り返し配列の出現に対する固有のバイアスが創出 される。

歩行に用いられる標的捕捉プローブ中への繰り返しＤＮＡの出現を最小にするた めにＹＡＣクローニングベクターの設計中に組み込まれた第２の特徴は、ＤＮＡ クローン末端からレスキューされたＤＮＡプローブ断片のサイズを制限すること である。ＤＮＡ断片が小さければ小さい程、繰り返しＤＮＡを含む確率は小さく なる。実施例ＩＩＩで記述されたベクターは、ＹＡＣクローンの１個の制限酵素 切断により、長さｌ−２ｋｂのオーダーでヒトＤＮＡの断片をレスキューするよ うに設計されている。これは、平均して０．５−１．５ｋｂごとに１回切断する 多重制限酵素認識部位を有するポリリンカーの挿入によって達成される。ＹＡＣ を有する酵母の全ＤＮＡを、これらの酵素の１つで切断すると、プラスミドの複 製起点および薬物耐性マーカー（大腸菌中で増殖および選択をするための）なら びに酵母中で選択するための遺伝子を有するＤＮＡの断片および約１−２ｋｂの ヒトＤＮＡが遊離される。この断片を環状化し、そして細菌中に形質転換するこ とができる。予期されるように、このステップに極めて有用な酵素の認識部位は 、提案されたＹＡＣクローニングベクターの構築に用いられるい（つかの要素の 中に見出される。制限酵素切断部位を欠失させるための±２・ビトロの突然変異 生成が、２つのプラスミド複製起点の組み合わせの賢明な選択、４個の薬物耐性 マーカー、および４個の酵母の選択可能なマーカーと共に、表中にリストされた 高頻度切断制限酵素切断部位（レスキュ一部位）を欠落するベクターを創出する ために用いられる。

相同組換えスクリーニング法を用いて、ライブラリー中に存在することが知られ ているクローンをそのライブラリーから抽出した。ｐＹＡＣ４で構築したＹＡＣ 中にＴＲＰＩ遺伝子を含有するベクターアームはプラスミドレプリコンと選択可 能なマーカー（アンピシリン耐性をもたらすベーターラクタマーゼ遺伝子）を含 有しているので、「プラスミドレスキュー　（ｐｌａｓｍｉｄ　ｒｅｓｃｕｅ） Ｊ技術を用いて、ベクターｐＹＡＣＪ中に構築した２個のＹＡＣから末端断片を 単離した。制限酵素ＸｈｏｌはＴＲＰＩベクターアーム内部の単一部位、すなわ ち末端小粒配列とｐＢＲ３２２配列の間の接合部で切断を行なう。ＹＡＣＤＮＡ をＸｈｏｌで完全に消化すると、末端小粒配列を欠く制限断片が得られるが、こ の制限断片は、機能性プラスミドレプリコンとＡｍｐ・標識を含有するとともに 、元のＹＡＣクローン中ではベクターアームに隣接していてヒトＤＮＡ挿入断片 中では末端Ｘｈｏ　１部位に延びているヒトＤＮＡセグメントを保持している。

宿主酵母菌株ＭＧＤ１３１−１０ｃ（遺伝子型ａ　１ｅｕ２−３．１１２　ＡＤ Ｅ２　ｃｙｈ２’　ｈｉｓΔ１　ｔｒｐｉ−２８９ａｒｇ４Δ　ｕｒａ３−５２ ）を用いて、１６１個のＹＡＣの１群をライブラリー内に構築した。この群の２ 個のクローンに由来する全ＤＮＡを消化し、分子内環状化を促進する希釈条件下 で連結し、大腸菌に形質転換した（全ステップはアラシュベル（Ａｕｓｕｂｅｌ 　）ら、１９８８　（上記］）に述べられているのと実質的に同じやりかたで行 なった］。

プラスミドＤＮＡをアンピシリン耐性コロニーから単離し、制限酵素分析に付し た。これら２個のレスキュープラスミドのそれぞれに由来する１個のヒトＤＮＡ 断片をＴ４ポリメラーゼ処理により平滑末端化させ、ｐ　１８４ＤＬＡＲＧのＳ ｍａＩ部位に連結した。得られた断片１０Ｂと８Ａは、それぞれｌｋｂと４ｋｂ のヒトＤＮＡ断片であり、２個の異なるＹＡＣの中のＴＲＰＩベクターアームに 隣接していた。得られた構築物（プラスミドｐ１８４−１０Ｂおよびｐ　１８４ −８Ａ）を、ｐ　１８４ＤＬＡＲＧを切断しない複数の制限酵素で消化してヒト ＤＮＡ内で切断を行なう酵素を同定して、標的化を促進した。各構築物の２０μ ｇずつを適当な標的捕捉（【ａｒｇｅｔｊｎｇ）酵素で消化し、実施例■と実質 的に同じやりかたでライブラリースクリーニングに用いた。断片８Ａは一方の末 端から２−８ｋｂの位置に単一のＫｐｎ１部位を有する。

この酵素を用いて特異的二本鎖切断をｐ１８４−８Ａの挿入配列内に導入した。

断片１０Ｂは一方の末端から０．５ｋｂの位置に単一のＡｖａ１１部位を有する 。この酵素を用いて特異的二本鎖切断をｐ１８４−１０Ｂの挿入配列内に導入し た。

クローン８Ａによるスクリーニングで得られた１１個の８１ｇ０コロニーを単離 し、分析した。ＩＶ−１６ｄ菌株（実施例１およびＡＴＣＣ寄託番号７４０１０ ）同様、ＭＯＤＩ３１−１０ｃ菌株もＡＲＧ４遺伝子全体にまたがる２ｋｂの欠 失を育する。しかし、これら２つの菌株はＬＥＵ２遺伝子型が異なる。すなわち 、ＩＶ−１６ｄｌ！ｌｅｕ＋であり、ＭＧＤ１３１−１０ｃは１ｅｕ−表現型を 存する。１１個のコロニーのうち７個は１ｅｕ−表現型を示したことから、それ らはまさにクローン８Ａがそれから由来した元のＹＡＣの独立単離物であること が示唆された（ＭＧＤ　１３１−１０　ｃ菌株はライブラリー中の１１，６２５ 個のＹＡＣのうちわずか１６１個（１，４％）に対して宿主となることから、非 常に高い確率である）。クローンＩＯＢによるスクリーニングで得られた１７個 のａｒｇ”コロニーを単離、分析した。これら１７個のコロニーのうち３個は１ ｅｕ−表現型を示した。

Ｉｅｕ−標識の存在は、これらのクローンがクローンＩＯＢの由来元であるＹＡ Ｃの単離物であることを強く示唆している。

ｌｅｕ＋のコロニーのうちの１個と同様に、クローン８Ａによるスクリーニング で単離した７個の１ｅｕ−コロニーのそれぞれからＤＮＡを調製した。形質転換 用ＤＮＡ分子の線状化に使用したのと同じ酵素（ＫｐｎＩ）でＤＮＡを消化した 。これらの消化物のサザンプロットは、３２−Ｐ！識ＡＲＧ４　ＤＮＡでプロー ブした。実施例Ｉに述べたように、相同組込み現象は、線状化形質転換用ＤＮＡ 分子（実施例Ｉではユニット長線状断片またはＵＬＬと呼ぶ）とまったく同じサ イズの単一断片にハイブリダイズすることを明らかにする。

分析した８個のクローンのうちＭＯＤ１３１−１０ｃ菌株の７個のクローン（ｌ ｅｕ−コロニー）はいずれも相同現象を　−示したが、分析した単一のＩｅｕ“ 形質転換体（レーン８）は相同現象を示さなかった（図９）。したがって、単離 した１１個の候補クローンのうちの７個は正しく標的された現象であったことに なる。クローンＩＯＢを用いるスクリーニングで単離した３個のＩｅｕ−コロニ ーのそれぞれについて同様の分析を行なった。３個のクローンはいずれも、サザ ンプロット分析でＵＬＬを示したが、１４個のｌｅｕ＋形質転換体は示さなかっ た。

クローンＩＯＢによるスクリーニングで単離した３個の相同現象およびクローン ８Ａによるスクリーニングで単離した７個の相同現象は同じＹＡＣの独立単離物 であることを確認するために、これら１０個のクローン中のＹＡＣの末端の地図 を作成した。図１Ｏはこの分析の結果を示す。各レーンに３つのバンドが明白で あり、それぞれＵＬＬ、ＹＡＣの左アームおよび右アームに対応する。８Ａを用 いて単離した７個のＹＡＣのいずれにおいてもバンドは同一の位置に現われるが 、ＩＯＢで単離した３個のＹＡＣのいずれにおいてもこの位置とは異なるがそれ ぞれ同一の位置にバンドが現われる。

これらのデータは、７個の８ＡＹＡＣの各末端にある最も近いＫｐｎ　１部位へ の距離が同じであり、一方、３個のｌ０ＢＹＡＣは末端７１１．ｖａｌｒ部位の 位置に関して類似の挙動を示すことを示している。

実施例ＶＩ　ヒトアデノシンデアミナーゼ座位由来の酵母人工染色体クローンを 単離するための相同組換えによるヒト酵母人工染色体ライブラリーのスクリーニ ング 合成オリゴヌクレオチドｏ６およびｏ７−２をポリメラーゼ連鎖反応に使用して 、末梢血白血球から単離した全ヒトゲノムＤＮＡ由来の３４．２４３〜３５．６ １８位（ゲンバンク登＃ｔＨＵＭＡＤＡＧ）に対応するヒトＡＤＡ遺伝子１，３ ７６塩基対断片を増幅した。増幅断片をＰｓｔｌで消化し、ＨＵＭＡＤＡＧ位置 ３４．３４９〜３５．２０１に対応する８５２塩基対のサブ断片を単離し、プラ スミドｐ１８４ＤＬＡＲＧ　（実施例■）のＰｓｔ１部位にクローン化した。１ 個の挿入方向（ＨＵＭＡＤＡＧ位置３４，３４９がｐ１８４ＤＬＡＲＧ中の酵母 ＡＲＧ４遺伝子の３゛末端に隣接するような方向）を選んだ。得られたプラスミ ドを精製し、２０マイクログラムをヒトＡＤＡ挿入断片内部の特異的ＥｃｏＮ１ 部位（ＨＵＭＡＤＡＧ部位３４．６５７に対応）で線状化させた後、プールした ＹＡＣライブラリーに形質転換させた。プールしたＹＡＣライブラリーの形質転 換は、ゲノム約１．２個分に相当する合計１５，２１０個のクローンについて、 ＹＡＣライブラリーがさらに３，５８５個のクローンを含んでいること以外は実 施例Ｉに述べた方法とまったく同じやりかたで行なった。

４個のａｒｇ＋形質転換体を単離した。そのうちの３個を図１１に示すが、いず れもＥｃｏＮＩ制限酵素消化・サザンプロット分析にかけるとユニット長線状断 片を示した。第４のａｒｇ＋形質転換体を分析したところ、ＹＡＣ１８４ＡＤＡ 、Ｃおよび１８４ＡＤＡ、Ｄと同じ挿入断片を保持していることか確認された。

ＣＨＥＦゲル電気泳動で調べたところ、４個の形質転換体はいずれも約２００ｋ ｂという同様のサイズのＹＡＣを保持している。ＹＡＣ１８４ＡＤＡ、Ｂから調 製したＤＮＡ中のＵＬＬバンドの強度およびその他のデータは、ＹＡＣ１８４Ａ ＤＡ、Ｂは標的捕捉プラスミドの多重縦列組込みを受けていることがわかる。

多数のプローブと制限酵素消化物を用いる制限酵素・サザンハイブリダイゼーシ ョン分析によって代表的なＹＡＣであるＹＡＣｌ　８４ＡＤＡ、Ｃをヒトゲノム ＤＮＡと比較したところ、このＹＡＣはヒトＡＤＡ座位由来の配列を実際に含ん でいることが確認された。

オリゴヌクレオチドｏ６ ５’ＡＧＡＴＣＴＧＴＴＴ　ＧＡＧＧＣＴＧＣＴＧ　ＴＧＡＩ〜２４の番号を付 与した塩基はゲンバンク登録ＨＵＭＡＤＡＣ中の位置３４．２４３〜３４，２６ ６に対応する。

オリゴヌクレオチドｏ７−２ ７〜２９０番号を付与した塩基はゲンバンク登録ＨＵＭＡＤＡＧ中の位置３５， ６１８〜３５，５９６に対応する。１〜６の番号を付与した塩基は４個の可能な 制限酵素Ｂｓ　ｔＹＴ認識配列の一つに対応しており、クローン化促進のために 加えたものである。

、酵母ＬＥＵ２遺伝子を保持するプラスミドのｐＢＲ３２２部分に二本鎖切断を 作っておくと、そのプラスミドからＤＮＡ１μｇあたり１．４〜１．７個の頻度 でｌｅｕ”形質転換体ができることを示した。この頻度は、ＬＥＵ２配列中の二 本鎖切断によってＬＥＵ２遺伝子を標的化した場合に１ｅｕ１形質転換体ができ る頻度（ＤＮＡ１μｇあたり１２〜１７個）の１０分の１に相当する。同様に、 ＨＩＳ３含有プラスミドをｐＢＲ３２２配列内で切断したところ、同じプラスミ ドをＨＩＳＳ内で切断したときに見られる頻度の６０分の１の頻度でｈｉｓ＋形 質転換体が出現した。いずれの場合も、非標的化原栄養要求体はプラスミドと染 色体１ｕｅ２−およびｈ　ｉ　ｓ　３”変異体遺伝子の間に組換えが起きた結果 出現したことが明らかになった。したがって、二本鎖標的捕捉切断をプラスミド の別の部分に作ったとしても、標的捕捉プラスミドがＬＥＵ２を保持していれば 、染色体ＬＥＵ２遺伝子を欠失させない相同組換えによるライブラリースクリー ニングによって５０．０００個のクローンから１個のクローンを選択すれば、酵 母ゲノムとの相同組換えによりｓ、ｏｏｏ個のｌｅｕ＋形質転換体ができるもの と期待された。しかし、この結果は、ＬＥＵ２およびＨＩＳ３の染色体コピーを 欠失させると、実質的にすべての非標的化現象が排除されることを示唆している 。

本発明の方法の目的のために宿主細胞から染色体を欠失させることの利点を次の ようにして定量した。ＡＲＧ４配列中の特異的Ｂｃ１１部位に二本鎖切断を作っ た後、酵母ＡＲＧ４（「標的」）遺伝子およびＵＲＡ３（ｒマーカー」）遺伝子 を保持するプラスミドを酵母細胞混合物に形質転換させた。混合物中のすべての 細胞はＵＲＡ３に対して相同性を有していたが、１．０００個のうちの１個また は１０．０００個のうちの１個だけがＡＲＧ４に対して相同性を育していた。

この種の希釈実験では、標的化現象と非標的化現象の相対頻度を測定する。例え ば、ｌμｇのＤＮＡと１対１．０００の希釈率を用いると、ＡＲＧ４での相同組 換えで５個の酵母コロニーが単離されるので、理論的には５，０００個の細胞が 標的化現象でありえることになるが、実際には５１５．０００個だけがＡＲＧ４ における必要な相同性を有していた。したがって、標的捕捉頻度は未希釈培養物 においてはｌμｇあたり５．０００回の標的化現象が起きる頻度に相当する。同 じ実験でＡＲＧ４における相同性と無関係に５個のコロニーを単離したとすれば （ＵＲＡ３その他の部位での組換え、非標的化現象）、これらの非標的化現象の 頻度は１μｇあたり５回となり、この実験における非標的化現象に対する標的化 現象の比率は１，０００対Ｉになる。

１．０００分の１の希釈の場合、７８個の標的化形質転換体が単離され（ＡＲＧ ４との組換えによる。７８，０００回の標的化現象に相当）、１７個はそれ以外 の部位における組換えによって単離された（非標的化現象）。１０，０００分の １の希釈の場合、４回の標的化現象（４０，０００回の標的化現象に相当）と７ 回の非標的化現象が単離された。したがって、非標的化現象に対する標的化現象 の比率は、（７８，０００＋４０，０００）を（１７＋７）で割った数字、すな わち４９１７対１となる。この比率は、ｓｏ、ｏｏｏ個のＹＡＣのうちの１個の ＹＡＣ上に存在する配列をめてライブラリーをスクリーニングする場合、正しい 現象１回につき約１０回の誤った現象が起きることになり、標的捕捉マーカーと してのＵＲＡ３の使用はこれまで標的捕捉の研究に使われていたＬＥＵ２やＨＩ ３３マーカーの使用より好ましいのは明らかであるとはいえ［オール−ライ−バ ー（０ｒｒ−Ｗｅａｖｅｒ）ら、１９８１］　、通常の許容水準より数倍も高す ぎる数字である。非標的化現象の８４％（分析した１９回のうち１６回）は、実 際にプラスミド上のＵＲＡ３マーカーと染色体ｕｒａ３−座位の間の組換えによ るものであった。標的捕捉プラスミドと染色体ｕｒａ３−座位の間に相同性がな ければ、ｕｒａ３−座位における相同性に起因する非標的化現象を分析対象から 除外する。そうすると、比率は３０．７２９対ｌに上がる。この比率では、５０ ．０００個のＹＡＣ中３回出現する配列が非標的化現象１回あたり１．８回の頻 度で正しく標的化されることになる。この比率は、ｓｏ、ｏｏｏ個のＹＡＣ中１ 個だけに存在する配列をめてライブラリーをスクリーニングする場合、誤った現 象１．６回あたり１回の頻度で正しい現象が起きるという好ましい比率でもある 。

これらの結果は、ＤＮＡ　ＹＡＣライブラリーから標的化クローンを選択するこ とが可能であって、標的捕捉ベクター上に存在する選択可能なマーカーに対して 相同性を有さない宿主酵母細胞中で特に効果的であることを示している。

ｊ・ ＦＩＧ、　４ マ ＦＩＧ、４（続き　） ８Ｓｍ ＵＲＡ３ ＳｃＡ　Ｎ　Ｈｃ ＦＩＧ、　７Ａ　ＦＩＧ、　７Ｂ オリゴヌクレオチド 苦　苦　苦　苦　Ｍ　苦　苦　苦 ・４５・−−ｍＬＪＬＬ ＦＩＧ、　１０ ＦＩＧ、ｌｌ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）１．特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　９１１０８６７９ ２、発明の名称 ライブラリースクリーニング法 ３、特許出願人 住所　アメリカ合衆国　マサチューセッツ　０２１３９ケンブリツジ、アルバニ ー　ストリート　１９５名称　トランス力すオティック　セラピーズ。

インコーホレイテッド ４、代理人 住所　〒５４０　大阪市中央区谷町２丁目８番１号大手前Ｍ２ビル　細円国際特 許事務所 ６、添付書類の目録 （１）補正書の写しく翻訳文）　１通 ライブラリースクリーニング法 ゲノムＤＮＡ　ｒライブラリー」は、特定の生物に由来するゲノムＤＮＡを適当 な制限酵素で消化し、得られたゲノムＤＮＡ断片をベクターに連結し、該ＤＮＡ 断片含有ベクターを宿主細胞群に導入することによって作成する。相補的ＤＮＡ （ｃＤＮＡ）は、ｍＲＮＡ鎖を鋳型として利用して相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ） 鎖を合成することができる、逆転写酵素と呼ばれる酵素によって産生されたＤＮ Ａである。ｃＤＮＡライブラリーは、得られたｃＤＮＡ断片をベクターに連結し 、該ｃＤＮＡ断片含有ベクターを宿主細胞群に導入することによって作成する。

ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリー中では、ＤＮ／ｌ−は数千または数百刃側 の無秩序（ｕｎｏｒｄｅｒｅｄ）断片として存在する。特定のＤＮＡ配列を保持 する宿主細胞（すなわち特定のＤＮＡクローン）を単離するためには、ライブラ リー全体をスクリーニングしなければならない。放射標識またはその他の方法で 標識した核酸プローブがＤＮＡやｃＤＮＡのライブラリーのスクリーニングに従 来から使われている。核酸プローブは、プローブ中の相補的ＤＮＡ配列とＤＮＡ クローンの間のイン・ビトロのハイブリダイゼーションのプロセスによって特定 のＤＮＡ配列を同定する。

ライブラリーの構築とスクリーニングのための一つのアプローチは、正常な染色 体機能に必要な全ての要素を含む線状プラスミドである酵母人工染色体、すなわ ちｒＹＡｃＪに依存している。マレ−（Ｍｕｒｒａｙ、　Ａ、Ｗ、）とシスタッ ク（Ｊ、Ｗ、　５ｚｏｓｔａｋ）、　Ｎａｔｕｒｅ、　３０５：　１８９−１９ ３（１９８３）。外来のＤＮＡをＹＡＣ内にクローン化することができ、次いで これをＹＡＣライブラリーを作成するために受容体酵母細胞に導入する。パーク （Ｂｕｒｋｅ、　Ｄ、Ｔ、）ら、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３６：　８０６−８１ ２　（１９８７）。例えば、５０Ｋｂより大きなりＮＡ大断片をＹＡＣに導入す ることができ、それを次に酵母内に移転させ、そこで人工染色体として保持され る。オルソン（Ｏｌｓｏｎ、　Ｍ、Ｖ、）とパーク（Ｄ、Ｔ、　Ｂｕｒｋｅ）、 　ＵＳＳＮ　４．８８９．８０６．表題「酵母人工染色体に基づく大きなりＮＡ のクローニング系（Ｌａｒｇｅ　ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｂａ ５ｅｄ　ｏｎＹｅａｓｔ　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ）Ｊ 　（１２／２６／８９）。このアプローチは、例えば、複製に必要な酵母配列を ヒトＤＮＡのような外来ＤＮＡに加え、それを次に宿主酵母細胞中で複製するこ とを可能にするので特別な価値がある。このような宿主酵母細胞は、各ＹＡＣが 大きなりＮＡ断片を含むことができるヒトゲノムＤＮＡライブラリーを調製する のに有用である。

３！Ｐ−標識ＤＮＡプローブを用いるフィルターハイブリダイゼーション（ブラ ウンスタイン（Ｂｒｏｗｎｓｔｅｉｎ、　Ｂ、Ｈ，）ら、江曇ｎｃｅ、　２４４ ：　１３４８−１３５１　（１９８９））あるいはポリメラーゼ・チェイン・リ アクションを用いる増幅（グリーン（Ｇｒｅｅｎ、　Ｅ、Ｄ、）とオルソン（Ｍ 、Ｖ、　０１ｓｏｎ）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ ＳＡ、　８７・１２１３−１２１７　（１９９０））などの標準的な方法を用い て目的配列を得るためにＹＡＣライブラリーをスクリーニングすることができる 。

ライブラリー中に存在する特定のＤＮＡクローンは、使用するプローブ配列に隣 接するＤＮＡを含むことができる。したがって、第一のＤＮＡクローンと重なり あっている配列を待っている第二のＤＮＡを得るために、このＤＮＡクローン末 端を同一または他のＤＮＡライブラリーを再スクリーニングするための新たなプ ローブとして使用することができる。

２９、下記のものを有するＹＡＣアームベクター、ａ）酵母の選択可能なマーカ ー遺伝子、ｂ）細菌の複製起点、 Ｃ）細菌の選択可能なマーカー遺伝子、およびｄ）酵母の末端小粒。

３０、さらに酵母の複製起点、酵母の動原体配列またはその両者を有する請求項 ２９記載のＹＡＣアームベクター。

３１、下記のものよりなる群から選択されるＹＡＣアームベクター、 ａ）ｐＴＫＥＮＤＡ　（ＡＴＣＣ寄託Ｎｏ、４０８３３）　；ｂ）ｐＴＫＥＮＤ Ａ２　； ｃ）ｐＴＫＥＮＤＢ　； ｄ）　ｐＴＫＥＮＤＣ、および ｅ）ｐＴＫＥＮＤＤ＋。

３２、下記のものを有する酵母の人工染色体、ａ）細菌中で複製するための二つ のＤＮＡ配列、ｂ）細菌中で選択するための二つの選択可能なマーカー遺伝子、 Ｃ）二つの酵母の末端小粒配列、 ｄ）酵母の動原体、 ｅ）酵母中で選択するための二つの選択可能なマーカー遺伝子、および ＮＤＣ； ｄ）ｐＴＫＥＮＤＡ２およびｐＴＫＥＮＤＣ；ｅ）ｐＴＫＥＮＤＣおよびｐＴＫ ＥＮＤＤ　；およびｆ）ｐＴＫＥＮＤＢおよびｐＴＫＥＮＤＤ。

ｌコ ｌコ ｌ・ ＦＩＧ、　４ χ ＦＩＧ、４（続き　） ＦＩＧ、　５ ＦＩＧ、　６Ａ ＲＨＣＡＲ５ＣＸ　Ｈｄ ＬＪＲＡ３ ＣＡＭＨＣ 畳　畳ＭＭ　畳　畳　闘　簀　畳 ＦＩＧ、　７Ａ　ＦＩＧ、　７８ オリゴヌクレオチド ＦＩＧＵＲＥ　Ｂｅ ＦＩＧ、９ −掘１−＝　′−＊−Ｕ　Ｌ　Ｌ ””’　＃ＵＲＡ ＦＩＧ、　ＩＱ ＦＩＧ、ｌｌ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号／／（Ｃ１２Ｎ　１／１ ９ Ｃ１２Ｒ１：８６５） Ｉ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．隣接するＤＮＡ配列の位置地図（ｐｈｙｓｉｃａｌ　ｍａｐ）を作成するた めの下記ステップを有する方法、ａ）第一のＤＮＡ断片ライブラリーと第二のＤ ＮＡ断片ライブラリーとを作成すること、ここで、第一のライブラリーと第二の ライブラリーは、それぞれが真核生物宿主細胞中に導入されたＤＮＡ間の遺伝子 組換えが相同組換えによって生ずるような真核生物宿主細胞の集団中にあり、Ｄ ＮＡ断片は、真核生物宿主細胞中で複製可能なエピソームの中で、真核生物宿主 細胞中に存在し、そしてさらに次のものを含有する、１）細菌中で増殖するため に必要な配列、２）細菌中で選択するための二つの異なったマーカー遺伝子、お よび３）真核生物宿主細胞中で選択するための二つの異なったマーカー遺伝子、 そして第一のライブラリー中で選択可能なマーカーは第二のライブラリー中で選 択可能なマーカーと同一でないｂ）一方のＤＮＡ断片ライブラリー中へ、真核生 物宿主細胞中で非夜襲性の標的捕捉（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）ＤＮＡベクターを導 入すること、ここで標的捕捉ベクターは、真核生物宿主細胞中での選択のための マーカー遺伝子と標的捕捉ＤＮＡを含有し、この標的捕捉ＤＮＡは部分的に標的 （ｔａｒｇｅｔ）ＤＮＡ断片と相同であり、そのため真核生物宿主細胞の混合集 団を形成する、 ｃ）相同組換えが起こるのに適した条件下に、ステップ（ｂ）の生成物を保つこ と、これにより、標的ＤＮＡ断片を含む真核生物宿主細胞は、標的ＤＮＡ断片と 標的捕捉ＤＮＡ配列の間の相同組換えの結果として、真核生物宿主細胞中での選 択のためのマーカー遺伝子で安定に形質転換され、そして選択可能な表現型を有 し、標的ＤＮＡ断片を有する安定に形質転換された真核生物宿主細胞が作成され る、ｄ）安定に形質転換された真核生物宿主細胞の選択に適した条件下で前のス テップの生成物を培養することにより、安定に形質転換された真核生物宿主細胞 を選択すること、ｅ）安定に形質転換された真核生物宿主細胞から取得した全Ｄ ＮＡを制限酵素で消化すること、これによりエピソーム類から標的ＤＮＡ断片末 端、細菌中での選択のためのマーカー遺伝子、真核生物宿主中での選択のための マーカー遺伝子および細菌中での増殖のために必要な配列を含むエピソーム領域 を遊離させ、これによりエピソーム領域を単離する、ｆ）上のステップで作られ たエピソーム領域を環状化すること、これにより、次の標的捕捉ベクター（ａｓ ｕｂｓｅｑｕｅｎｔ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ）と呼ばれるステップ （ｅ）で作られたエピソーム領域を含む環状化されたＤＮＡ分子を得る、ここで エピソーム領域由来の標的ＤＮＡ断片は、次の標的捕捉ＤＮＡと呼ばれる、 ｇ）細菌中で、次の標的捕捉ベクターを選択し、増幅すること、 ｈ）他のＤＮＡ断片ライブラリー中に、次の標的捕捉ベクターを導入すること、 これにより真核生物宿主細胞の混合集団を作る、 ｉ）相同組換えが起こるのに適した条件下にステップ（ｈ）の生成物を保つこと 、これにより、標的ＤＮＡ断片を含む真核生物宿主細胞は真核生物宿主細胞中で の選択のためのマーカー遺伝子および次の標的捕捉ベクター中に存在する標的捕 捉ＤＮＡにより、標的ＤＮＡ断片と次の標的捕捉ベクター中に存在する標的捕捉 ＤＮＡとの間の相同組換えの結果として、安定に形質転換される、これにより、 次の標的捕捉ベクター中に存在する標的捕捉ＤＮＡ断片と相同的な標的ＤＮＡ断 片を含む、選択可能な表現型を有する、安定に形質転換された真核生物宿主細胞 を作成する、 ｊ）安定に形質転換された真核生物宿主細胞を選択するのに適した条件下で、前 のステップの生成物を培養することにより、安定に形質転換された真核生物宿主 細胞を選択すること、 ｋ）ステップ（ｅ）から（ｊ）までを必要なだけ繰り返すこと、 １）ステップ（ｋ）で得られたエピソーム領域に由来する標的ＤＮＡ断片を順に 並べることにより、位置地図を構成すること。 ２．標的捕捉ＤＮＡ分子が細菌プラスミドである請求項１記載の方法。 ３．細菌プラスミドが標的捕捉ＤＮＡ配列内に導入された二本鎖切断を有する請 求項２記載の方法。 ４．標的ＤＮＡ断片がｃＤＮＡである請求項１記載の方法５．真核生物宿主細胞 中に存在するエピソームが人工的染色体であり、そしてこの人工的染色体が、そ れが宿主細胞の複製および染色体分離に関与するために必要なＤＮＡ配列のすべ てをさらに含んでいる請求項２記載の方法。 ６．真核生物宿主細胞中に存在するエピソームが人工的染色体であり、そしてこ の人工的染色体が、それが宿主細胞の複製および染色体分離に関与するために必 要なＤＮＡ配列のすべてをさらに含んでいる請求項３記載の方法。 ７．標的ＤＮＡ断片が、哺乳類ＤＮＡ配列、ヒトＤＮＡ配列、植物ＤＮＡ配列、 哺乳類遺伝子、ヒト遺伝子および植物遺伝子よりなる群から選択される請求項１ 記載の方法。 ８．標的ＤＮＡ断片が、哺乳類ＤＮＡ配列、ヒトＤＮＡ配列、植物ＤＮＡ配列、 哺乳類遺伝子、ヒト遺伝子および植物遺伝子よりなる群から選択される請求項３ 記載の方法。 ９．選択可能なマーカー遺伝子が真核生物宿主細胞に対し選択可能な表現型を付 与する遺伝子よりなる群から選択され、そして選択可能な表現型が、抗生物質耐 性、栄養素原要求性、金属イオン耐性、細胞サイクル進行能力および細胞表層マ ーカーの発現よりなる群から選択される請求項５記載の方法。 １０．選択可能なマーカー遺伝子が真核生物宿主細胞に対し選択可能な表現型を 付与する遺伝子よりなる群から選択され、そして選択可能な表現型が、抗生物質 耐性、栄養素原要求性、金属イオン耐性、細胞サイクル進行能力および細胞表層 マーカーの発現よりなる群から選択される請求項６記載の方法。 １１．請求項７記載の方法により単離され、哺乳類ＤＮＡ配列、ヒトＤＮＡ配列 、植物ＤＮＡ配列、哺乳類遺伝子、ヒト遺伝子および植物遺伝子よりなる群から 選択されるＤＮＡ配列。 １２．請求項８記載の方法により単離され、哺乳類ＤＮＡ配列、ヒトＤＮＡ配列 、植物ＤＮＡ配列、哺乳類遺伝子、ヒト遺伝子および植物遺伝子よりなる群から 選択されるＤＮＡ配列。 １３．隣接するＤＮＡ配列の位置地図（Ｐｈｙｓｉｃａｌ　ｍａｐ）を作成する ための下記ステップを有する方法、ａ）第一のＤＮＡ断片ライブラリーと第二の ＤＮＡ断片ライブラリーとを作成すること、ここで、第一のライブラリーと第二 のライブラリーは、それぞれが酵母宿主細胞中に導入されたＤＮＡ間の遺伝子組 換えが相同組換えによって生ずるような酵母細胞の集団中にあり、ＤＮＡ断片は 、酵母細胞中で複製可能なエピソームの中で酵母細胞中に存在し、そしてさらに 次のものを含有する、１）細菌中で増殖するために必要な配列、２）細菌中で選 択するための二つの異なったマーカー遺伝子、および３）酵母細胞中で選択する ための二つの異なったマーカー遺伝子、そして第一のライブラリー中で選択可能 なマーカーは第二のライブラリー中で選択可能なマーカーと同一でない、 ｂ）一方のＤＮＡ断片ライブラリー中へ、酵母細胞中で非複製性の標的捕捉ＤＮ Ａベクターを導入すること、ここで標的捕捉ベクターは、酵母細胞中での選択の ためのマーカー遺伝子と標的捕捉ＤＮＡを含有し、この標的捕捉ＤＮＡはエピソ ーム領域由来の標的ＤＮＡ断片と部分的に相同であり、そのため宿主細胞の混合 集団を形成する、ｃ）相同組換えが起こるのに適した条件下に、ステップ（ｂ） の生成物を保つこと、これにより、標的ＤＮＡ断片を含む酵母細胞は、標的ＤＮ Ａ断片と標的捕捉ＤＮＡ配列の間の相同組換えの結果として、酵母細胞中での選 択のためのマーカー遺伝子および標的捕捉ベクター中に存在する標的捕捉ＤＮＡ で安定に形質転換され、そして選択可能な表現型を有し、標的ＤＮＡ断片を有す る安定に形質転換された酵母細胞が作成される、 ｄ）安定に形質転換された酵母細胞の選択に適した条件下で前のステップの生成 物を培養することにより、安定に形質転換された酵母細胞を選択すること、 ｅ）安定に形質転換された酵母細胞から取得した全ＤＮＡを制限酸素で消化する こと、これによりエピソーム類から標的ＤＮＡ断片末端、細菌中での選択のため のマーカー遺伝子、酵母中での選択のためのマーカー遺伝子および細菌中での増 殖のために必要な配列を含むエピソーム領域を遊離させ、これによりエピソーム 領域を単離する、ｆ）上のステップで作られたエピソーム領域を環状化すること 、これにより、次の標的捕捉ベクター（ａｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ ｔａｒｇｅｔ ｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ）と呼ばれるステップ（ｅ）で作られたエピソーム領域を 含む環状化されたＤＮＡ分子を得る、ここでエピソーム領域由来の標的ＤＮＡ断 片は、次の標的捕捉ＤＮＡと呼ばれる、 ｇ）細菌中で、次の標的捕捉ベクターを選択し、増幅すること、 ｈ）他のＤＮＡ断片ライブラリー中に、次の標的捕捉ベクターを導入すること、 これにより酵母細胞の混合集団を作るｉ）相同組換えが起こるのに適した条件下 にステップ（ｈ）の生成物を保つこと、これにより、標的ＤＮＡ断片を含む酵母 細胞は酵母細胞中での選択のためのマーカー遺伝子および次の標的捕捉ベクター 中に存在する標的捕捉ＤＮＡにより、標的ＤＮＡ断片と、次の標的捕捉ベクター 中に存在する標的捕捉ＤＮＡに相同的な標的捕捉ＤＮＡとの間の相同組換えの結 果として、安定に形質転換される、これにより、選択可能な表現型を有し且つ次 の標的捕捉ベクター中に存在する標的捕捉ＤＮＡ断片を有する、安定に形質転換 された酵母細胞を作成する、 ｊ）安定に形質転換された酵母細胞を選択するのに適した条件下で、前のステッ プの生成物を培養することにより、安定に形質転換された酵母細胞を選択するこ と、ｋ）ステップ（ｅ）から（ｊ）までを必要なだけ繰り返して標的ＤＮＡ断片 を単離すること、およびｌ）ステップ（ｋ）で単離された標的ＤＮＡ断片を順に 並べることにより、位置地図を構成すること。 １４．標的捕捉ＤＮＡベクターが細菌プラスミドである請求項１３記載の方法。 １５．細菌プラスミドが標的捕捉ＤＮＡ配列内に導入された二本鎖切断を有する 請求項１４記載の方法。 １６．真核生物宿主細胞中に存在するエピソームが人工的染色体であり、そして この人工的染色体が、それが宿主細胞の複製および染色体分離に関与するために 必要なＤＮＡ配列のすべてをさらに含んでいる請求項１４記載の方法。 １７．真核生物宿主細胞中に存在するエピソームが人工的染色体であり、そして この人工的染色体が、それが宿主細胞の複製および染色体分離に関与するために 必要なＤＮＡ配列のすべてをさらに含んでいる請求項１５記載の方法。 １８．標的ＤＮＡ断片がｃＤＮＡである請求項１３記載の方法。 １９．標的ＤＮＡ断片が、哺乳類ＤＮＡ配列、ヒトＤＮＡ配列、植物ＤＮＡ配列 、哺乳類遺伝子、ヒト遺伝子および植物遺伝子よりなる群から選択される請求項 １３記載の方法。 ２０．標的ＤＮＡ断片が、哺乳類ＤＮＡ配列、ヒトＤＮＡ配列、植物ＤＮＡ配列 、哺乳類遺伝子、ヒト遺伝子および植物遺伝子よりなる群から選択される請求項 １５記載の方法。 ２１．選択可能なマーカー遺伝子が酵母細胞に対し選択可能な表現型を付与する 遺伝子よりなる群から選択され、そして選択可能な表現型が、抗生物質耐性、栄 養素原要求性、金属イオン耐性、細胞サイクル進行能力および細胞表層マーカー の発現よりなる群から選択される請求項１６記載の方法。 ２２．選択可能なマーカー遺伝子が酵母細胞に対し選択可能な表現型を付与する 遺伝子よりなる群から選択され、そして選択可能な表現型が、抗生物質耐性、栄 養素原要求性、金属イオン耐性、細胞サイクル進行能力および細胞表層マーカー の発現よりなる群から選択される請求項１７記載の方法。 ２３．請求項１９記載の方法により単離され、哺乳類ＤＮＡ配列、ヒトＤＮＡ配 列、植物ＤＮＡ配列、哺乳類遺伝子、ヒト遺伝子および植物遺伝子よりなる群か ら選択されるＤＮＡ配列。 ２４．請求項２０記載の方法により単離され、哺乳類ＤＮＡ配列、ヒトＤＮＡ配 列、植物ＤＮＡ配列、哺乳類遺伝子、ヒト遺伝子および植物遺伝子よりなる群か ら選択されるＤＮＡ配列。 ２５．ステップ（ｂ）において、標的捕捉ＤＮＡに結合した酵母中で選択するた めの選択可能なマーカー遺伝子が、酵母細胞中に導入されたとき複製性プラスミ ド中に存在し、次いで、選択可能なマーカー遺伝子と標的捕捉ＤＮＡがその複製 性プラスミドから順に非複製性分子として遊離される請求項１３記載の方法。 ２６．隣接するゲノムＤＮＡ断片を地図化するために用いられるべき組換えＤＮ Ａライブラリー中への取り込みに適するヒトゲノムＤＮＡを断片化する方法、こ の方法は、ヒトゲノムＤＮＡを、ＡｐａＩ、ＮｓｉＩおよびＳｃａＩよりなる群 から選択される少なくとも一つの制限エンドヌクレアーゼで消化し、それにより 生成したＤＮＡ断片の末端におけるある種の繰り返しＤＮＡ配列の出現が起こら ないように選択する。 ２７．４個の選択可能なマーカー遺伝子中に染色体欠失を有するサッカロミセス ・セレビシェ。 ２８．４個の選択可能な遺伝子がＡＲＧ４、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２およびＵＲＡ３ である請求項２７記載のサッカロミセス・セレビシエ。 ２９．下記のものを有するＹＡＣアームベクター、ａ）酵母の選択可能なマーカ ー遺伝子、ｂ）細菌の複製起点、 ｃ）細菌の選択可能なマーカー遺伝子、およびｄ）酵母の末端小粒。 ３０．さらに酵母の複製起点、酵母の動原体配列またはその両者を有する請求項 ２９記載のＹＡＣアームベクター。 ３１．下記のものよりなる群から選択されるＹＡＣアームベクター、 ａ）ｐＴＫＥＮＤＡ； ｂ）ｐＴＫＥＮＤＡ２； ｃ）ｐＴＫＥＮＤＢ； ｄ）ｐＴＫＥＮＤＣ；および ｅ）ｐＴＫＥＮＤＤ。 ３２．下記のものを有する酵母の人工染色体、ａ）細菌中で複製するための二つ のＤＮＡ配列、ｂ）細菌中で選択するための二つの選択可能なマーカー遺伝子、 ｃ）二つの酵母の末端小粒配列、 ｄ）酵母の動原体、 ｅ）酵母中で選択するための二つの選択可能なマーカー遺伝子、および ｆ）一つまたはそれ以上の酵母の複製起点。 ３３．四個の選択可能なマーカー遺伝子の染色体欠失を有する酵母菌株、その中 に一対のＹＡＣアームベクターを取り込んだ酵母菌株、第一のＹＡＣアームベク ターおよび第二のＹＡＣアームベクターと名付けられる対のメンバーを有するＤ ＮＡ断片ライブラリー、そのＹＡＣアームベクターの各々は下記のものを有する 、 ａ）酵母菌株がそれに対する染色体欠失をもっている四つの選択可能なマーカー 遺伝子の一つである酵母の選択可能なマーカー遺伝子、 ｂ）細菌の複製起点、 ｃ）細菌の選択可能なマーカー遺伝子、およびｄ）酵母の末端小粒、 ここで、ａ）ＹＡＣアームベクターの対の１員が酵母の動原体として機能するＤ ＮＡ配列を含み、ｂ）ＹＡＣアームベクターの一つまたは両方が酵母中で機能す る複製起点を含み、ｃ）第一のＹＡＣアームベクターと第二のＹＡＣアームベク ターが各々非−酵母起源のＤＮＡ断片に結合しており、そして、ｄ）第一のＹＡ Ｃアームベクターと第二のＹＡＣアームベクターが各々この対の他のメンバー中 には存在しない酵母の選択可能なマーカー遺伝子を有している。 ３４．酵母菌株がＡＲＧ４、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２およびＵＲＡ３遺伝子において 染色体欠失を有する請求項３３記載のＤＮＡ断片ライブラリー。 ３５．非−酵母起源のＤＮＡ配列が哺乳類ＤＮＡ断片または植物ＤＮＡ断片であ る請求項３４記載のＤＮＡ断片ライブラリー。 ３６．哺乳類断片がヒトＤＮＡ断片である請求項３５記載のＤＮＡ断片ライブラ リー。 ３７．下記のものを有する一対のＤＮＡ断片ライブラリーａ）４個の選択可能な マーカー遺伝子染色体欠失を有し、かつ一対のＹＡＣアームベクターをその中に 取り込んでいる酵母菌株、その対のメンバーは第一ＹＡＣアームベクターおよび 第二ＹＡＣアームベクターと呼ばれ、その各々のＹＡＣアームベクターは下記の ものを有する、１）その酵母菌株がそれに対する染色体欠失を有する４個の選択 可能なマーカー遺伝子の中の一つである酵母の選択可能なマーカー遺伝子、 ２）細菌の複製起点、 ３）細菌の選択可能なマーカー遺伝子、および４）酵母の末端小粒、 ここで、ａ）その対のＹＡＣアームベクターの１員は酵母の動原体として機能す るＤＮＡ配列を含み、ｂ）ＹＡＣアームベクターの一つあるいは両者は酵母中で 機能する複製起点を含み、そしてｃ）第一のＹＡＣアームベクターと第二のＹＡ Ｃアームベクターが各々非−酵母起源のＤＮＡ断片に結合しており、 ｂ）第二の対のＹＡＣアームベクターをその中に取り込んでいるａ）の酵母菌株 、この対のメンバーは第三のＹＡＣアームベクターおよび第四のＹＡＣアームベ クターと呼ばれ、そのアームベクターの各々は下記のものを有する、１）その酵 母菌株がそれに対する染色体欠失を有する４個の選択可能なマーカー遺伝子の中 の一つである酵母の選択可能なマーカー遺伝子、 ２）細菌の複製起点、 ３）細菌の選択可能なマーカー遺伝子、および４）酵母の末端小粒、 ここで、ａ）ＹＡＣアームベクターの第二の対の１員が酵母で動原体として機能 するＤＮＡ配列を含み、ｂ）ＹＡＣアームベクターの一方または両方が酵母で機 能する複製起点を含み、およびｃ）第三のＹＡＣアームベクターと第四のＹＡＣ アームベクターが各々非−酵母起源のＤＮＡ断片に結合しており、そして第一、 第二、第三および第四ＹＡＣアームベクターの各々が他のＹＡＣアームベクター 中に存在しない酵母の選択可能なマーカー遺伝子を含んでいる。 ３８．ＡＲＧ４遺伝子、ＴＲＰ１遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子およびＵＲＡ３遺伝子 の染色体欠失をもつ酵母菌株を含有するＤＮＡ断片ライブラリー、その酵母菌株 はその中に一対のＹＡＣアームベクターを取り込んでおり、その対の各メンバー は非−酵母起源のＤＮＡ断片に結合しており、そしてその対は下記のものよりな る群から選択される、ａ）ｐＴＫＥＮＤＡおよびｐＴＫＥＮＤＢ；ｂ）ｐＴＫＥ ＮＤＡ２およびｐＴＫＥＮＤＢ；ｃ）ｐＴＫＥＮＤＡおよびｐＴＫＥＮＤＣ；ｄ ）ｐＴＫＥＮＤＡ２およびｐＴＫＥＮＤＣ；ｅ）ｐＴＫＥＮＤＣおよびｐＴＫＥ ＮＤＤ；およびｆ）ｐＴＫＥＮＤＢおよびｐＴＫＥＮＤＤ。 ３９．非−酵母起源ＤＮＡ断片が哺乳類ＤＮＡ断片または植物ＤＮＡ断片である 請求項３８記載のＤＮＡ断片ライブラリー。 ４０．哺乳類起源のＤＮＡ断片がヒトＤＮＡ断片である請求項３９記載のＤＮＡ 断片ライブラリー。