JPH06508986A - 診断及び治療目的のためにラベル保持性細胞の活性を同定し、そして調節するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 診断及び治療目的のためにラベル保持性細胞の活性を同定し、そしてｍｓするた めの方法 発明の分野 本発明は、幹細胞集団の活性をａｌｌ！ｆｆする方法及び幹細胞により影響され る、異常な髪の成長又は髪の損失及び皮膚癌のような条件の診断及び処理方法に 関する。本発明は、ＮＩＨグラン）　ＡＲ３９６７４，ＥＹ０６７６９、　ＡＲ ３４５１１及びＥＹ４７２２により支持される研究において行なわれた。政府は 本発明の一定の権利を有する。

発明の背景 幹細胞はすべて自己再生する組成に存在することにより定義される。それらの細 胞は長期生存し、細胞分裂のための多くの可能性を存し、そして定常状態の恒常 性を究極的には担当すると思われる。

幹細胞は、それらが通常、遅い周期であることを示す、−回のパルスラヘル化の 後、放射性同位体をめったに組込まない、しかしながら、それらは、一定の増殖 刺激に応答して増殖プールに入るように誘発され得る。幹細胞が時々の細胞分裂 を受ける場合、それらは−回の暴露の後、放射性ラベル、たとえばトリチウム化 されたチミジン（３Ｈ−ＴｄＲ）を組込む“一時的な増幅細胞”（“ＴＡ″）を 急速に増殖を引き起こす。

幹細胞は、次の多くの性質を存する：それらは部構造学的及び生化学的に比較的 未分化であり；それらは大きな増殖可能性を有し、そして組織の長期の維持及び 再生を担当し；それらは、たぶんそれらの増殖可能性を保持し、そして複製の間 に生じるＤＮＡ誤差を最少にするために通常“遅い周期”であり；それらは創傷 及び一定の増殖刺激に応答して増殖するように刺激され得；　（１）幹細胞〜（ ２）ＴＡ細胞〜（３）最終的に分化された細胞のスケムにおいて、その一時的な 増幅細胞（“ＴＡ”）に対応する急速に増殖する細胞の集団近くにしばしば位置 し；そしてそれらは十分に保護され、高く血管化され、そして神経支配された領 域に通常見出される。

幹細胞の陽性同定は、上皮幹細胞に対して特異的な既知の免疫学的又は生化学的 マーカーが存在しないので、困難である。それらは通常遅い周期”であるので、 それらは、活性的に増殖するＴＡ細胞を検出するために典型的に使用される放射 性物質の一回のパルス投射によりラベルされ得ない、幹細胞のラベリングは長期 間の連続したラベリングを必要とすることが見出された。いったんラベルした後 、それらの遅い周期細胞は長期間、同位体を保持する。そのような細胞は“ラベ ル保持性細胞１又は“ＬＲＣ！　”と称される。

Ｃｏｔｓａｒｅｌｉｓなど、、　Ｊ、　Ｉｎｖｅｓｙ、　Ｄｅｒｖｉｏｌ、　９ ２　（３）　（１９８９ａ）は、増殖性刺激に応答して増殖するように補充され るべき遅い周期の細胞の能力に基づいてＬＲＣ，の検出を促進する方法を開示す る。　Ａｌｚｅｔ（商標）浸透ミニポンプが、１４日間、１日当たり２０μＣｉ のトリチル化されたチミジン（’　Ｈ−ＴｄＲ）を送出すために成熟した５ＥＮ ＣＡＦＩマウスに腹腔内に移植された。このラベリング期間、石油（Ｐｅｔ）中 、０．０１％の○−テトラデカノイルホルボールＢ−アセテート（ＴＰＡ）を、 ４日間、１日１度、右側腹部に局部的に適用した。逆の側面をＰｅｔのみにより 処理した。動物は、ラベリングの間及び後で殺害された。

ＴＰＡ及びＰｅｔ処理された皮膚を、光顕微鏡及び組織断片オートラジオグラフ ィーにより試験した。　ＴＰＡ処理は、著しい表皮及び小包過形成を引き起こし 、そしてＰｅｔ処理された部位は形態学的に変更されたように思われなかったこ とが見出された。　１４日間の連続した３Ｈ−ＴｄＲは、ＴＰＡ及びＰｅｔ処理 された部位においてすべての核化された表皮及び小包上皮細胞の９０％以上のラ ベリングをもたらした。

４週後、少数の細胞のみがラベルされたまま存続した（ＬＲＣ，）。それらの細 胞は、ＴＰＡ一対Ｐｅｔ−処理された上皮においてより高い頻度で検出された。

最っとも著しい濃度のＬＲＣｓは、小包上皮に生じることが見出された。

トリチウム化されたチミジン（”Ｈ−ＴｄＲ）ラベリングを用いて、縁（ｌ　ｉ ＊ｂｕｓ）と呼ばれる領域における周辺角膜に位置する副集団の角膜上皮基底細 胞が、Ｃｏｔｓａｒｅｌｉｓなど、、　Ｃｅ１ｌ　５７：２０１〜２０９　（１ ９８９ｂ）により同定された。それらの細胞は通常、遅い周期であるが、しかし 創傷及びＴＰＡの投与に応答して増殖するように刺激され得る。角膜上皮は、例 外情況を示すように思われる。ＬＲＣ，は、縁上皮の基底層に検出された。その ような細胞は、中央の角膜上皮には検出されなかった。縁上皮は、中央の角膜上 皮における創傷がら１〜２閣離れて導入することによって増殖を選択的に刺激さ れ得ることが見出された。縁上皮の増殖の好ましい刺激はまた、ＴＰＡが眼の前 方表面に局部的に適用される場合に観察された。従って、縁上皮が中央の角膜上 皮よりも高い増殖可能性を有することが結論づけられた。

ラベル保持性細胞は、７日間、皮下注射を用いて３Ｈ−ＴｄＲにより連続してラ ベルすることによってマウス上皮に同定された。この方法はほとんどすべての上 皮細胞をラベルした。４週間、追跡した後、副集団の上皮基底細胞はラベルされ たーＬＲＣｓを維持することが見出された。

他の実験において、Ａｌｚｅｔ　（商標）浸透ミニポンプが１４日間、”Ｈ−Ｔ ｄＲを送出すためにマウスの腹腔内に移植された。９５％以上の角膜上皮細胞及 び８０％以上の縁上皮細胞の放射性核が観察された。

４週間の休止期間の後、すべての放射性ラベルされた細胞は角膜がら消出し、そ してもしあったら、少々の細胞が縁上皮に同定され、これは、角膜−縁上皮のＬ ＲＣ＄が１４日以上の平均周期時間を有し、そして従って、それらの実験条件下 でのラベリングに耐性であることを示唆する。

それらの幹細胞をラベリングする機会を改良するために、それらを、創傷及びＴ ＰＡの適用により増殖相中に補充した。それらの実験は、通常遅い周期ではある が、しかし適切な刺激の後、増殖及びラベル化を誘発される副集団の縁基底細胞 の存在を示した。

種々の上皮の幹細胞は、Ｃｏｔｓａｒｅｌｉｓなど、　（１９８９ｂ）の図７に 要約される通常の特徴を共有する。角膜上皮細胞、並びに多くの他の上皮、たと えば掌側（ｐａｌ＋ｗａｒ）上皮、表皮幹（ｔｒｕｎｋ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ） 、毛のう、舌の背部上皮及び腸上皮の幹細胞特定の位置及び生物学的性質が論ぜ られている０図７（ｅ）においては、毛のうにおいて、濃く色素化された幹細胞 が乳頭胞及び関連する血管に近い付近における基底に位置することが示されてい る。

続く研究において、Ｃｏｔｓａｒｅｌｉｓなど、　（１９９０）は、毛のう幹細 胞が誤って同定された（Ｃｏｔｓａｒｅｌｉｓなど、　（１９８９ｂ）　）こと を示す。実際、ラベル保持性細胞は、毛のうの“膨張（ｂｕｌｇｅ）”部分と称 する小包毛（ａｒｒｅｃｔｏｒ　ｐｉｌｉ）筋肉結合部位でのその毛のうの中間 部分に独占的に存在することが見出された（Ｃｅｌｌ　６１：１３２９〜１３３ ７）　。

発明の特定の記載 本発明者は毛のうの膨張領域に毛のう及び皮脂腺及び表皮の推定幹細胞を最近配 置した。遅い周期の細胞（ラベル保持性細胞、　ＬＲＣｓ）を検出するように企 画されたオートラジオグラフィー技法を用いて、表皮にひじょうに少数のＬＲＣ ３が存在することが驚くべきことには見出された。さらに、毛のうが調査される 場合、本発明者は、最近小包幹細胞を含むと思われている領域である篭球（ｂｕ ｌｂ）を含んで成るマトリックス細胞にＬＲＣｓが存在しないことを決定した。

むしろ、本発明者は、“膨張”として知られている領域に小包の上方部分に副集 団のＬＲＣ，が存在することを決定した。

その膨張細胞は多くの幹細胞性質を有する。それらは、毛のうの永久部分の端を 特徴づける。それらは、比較的原始的な細胞質を有する。それらは通常、遅い周 期であるが、しかし腫瘍プロモーター、ＴＰＡにより増殖を刺激され得る。最終 的に、それらは物理的に十分に保護され、そして十分に栄養を与えられた部分に 位置する。膨張領域に独占的に位置する集団の推定上の幹細胞の本発明者の同定 は、それらが長期仮定されて来た多能性幹細胞であり、毛のうのみならず、また 皮脂腺及び表皮を引き起こすことと一致する。

前記膨張部分は、小包毛筋肉結合部位での小包の中間点に位置する副集団の外部 毛根鞘細胞である。従来の技術は、毛のう幹細胞が毛膨張部のマトリックス又は 低い膨張部分に存在することを教授した０本発明者の発見は、毛周期１１１！Ｉ ｆｆ及び皮膚発癌現象における毛のう幹細胞の改良への洞察力を提供し、そして 診断及び治療目的のために遅い周期の細胞の活性を同定し、そして調節し、そし て同定された幹細胞集団の活性を調節するための物質の効力を評価するための方 法の開発を導びいた。

幹細胞の最っとも識別できる特徴の１つは、それらの遅い周期性質である。放射 性同位体、たとえば’Ｈ−ＴｄＲの一回のパルスは幹細胞をラベルせず；ラベリ ングはその同位体の長期間の反復投与を要する。いったんラベルされると、ゆっ くり循環する細胞は長期間、同位体を保持する。

マウス毛のう細胞の別の集団が同定された。それらの細胞は遅い周期であるが、 しかし過増殖性刺激に応答して増殖相を誘発することができる。それらの細胞の 位置は予測できなかった。幹細胞は、小胞幹細胞が現在、存在すると思われてい る篭球のマトリックス部分には見出されなかった。むしろ、その細胞は、外部毛 根鞘の特定領域、すなわち膨張部分に同定された。その膨張構造体は、マウスの 毛のうに対してはユニークでない。外部毛根鞘はまた、ヒト毛のう、並びに表皮 幹及び首の皮膚にも見出された。その膨張部分は、これまでのテキストブックに もほとんど言及されていないほど従来の技術者には興味あるものではなかった。

毛のう幹細胞がその膨張部分に存在する現実は、毛の周期がいかに調節されるか 及び皮膚癌毛のうにおける遅い周期細胞の同定 生後７日間、１日２度、３Ｈ−ＴｄＲの皮下注射をマウスに与え、マウス表皮、 毛のう、皮脂腺、線維芽細胞及び内皮細胞のほとんど１００％のラベリングをも たらした。４週間の休止期間（“追跡′）の後、ＬＲＣ３は毛のうのマトリック ス領域には同定されず、これはマトリックスが遅い周期細胞を含まないことを示 唆する。意外には、ＬＲＣ，のグループが膨張部分の中央小包に見出された。

もう１つの組の実験においては、成熟マウスに、Ａｌｚｅｔ　（商標）浸透ミニ ポンプを移植し、’Ｈ−ＴｄＲを２週間、連続して送った。

４週間の追跡期間の後、ＬＲＣ，が膨張部分に独占的に見出された。

ＴＰＡの適用後、成熟マウスの膨張部分内の通常遅い周期細胞は増殖を刺激され た。外部刺激が取り除かれた後、その膨張細胞は、長期間それらのラベルを保持 する、それらの前の遅い周期状態に明らかに戻った。

膨張部分活性比論 毛周期は、３種の明らかな相を包含する二発育相（増殖する）、中間期（退行す る）及び休止期（休止する）０本発明者は、いかに毛周期をｔｌｉｉ節するかの 新しい理解を発見した。膨張部分幹細胞は、後期休止期の間、皮膚乳頭により活 性化される。これは“膨張部分活性化”と呼ばれる。皮膚乳頭は、中間発育期の 間、マトリックスによる皮膚乳頭により活性化される。マトリックス細胞は実際 、ＴＡ細胞であり；従って、従来技術の教授と反して、マトリックス細胞は制限 された増殖能力を有する。皮膚乳頭の上方への動きは、毛幹細胞の活性化のため に重要である。それらの要素のいづれかの欠陥が、異常な毛の成長又は毛の損失 をもたらす。

さらに、毛のう間表皮よりもむしろ毛のうの幹Ｈ胞がマウス皮膚における実験的 な腫瘍形成に包含され、そして前記形成を大部分担当することが見出された。

サイトカインは、幹細胞活性を調節するために有用であることが本発明者により 決定された。腫瘍壊死因子、ＴＮＦは、上皮増殖に対して広く異なった効果を有 することが示された。細胞毒性皮膚病（移植対宿主の疾患）の場合、ＴＮＦは、 急速に増殖する上皮細胞に対して細胞毒性であり得る。同様に、ＴＮＦは、角化 細胞培養に対して抗増殖効果を有することが示された。しかしながら、培養にお ける角化細胞は一般的に過増殖するので、それらの研究は、ＴＮＦが遅い周期（ 幹細胞）又は通常の周期（ＴＡ）細胞のいづれに影響するのか区別できなかった 。逆に言えば、炎症性皮膚病（遅められた過敏性反応）において、マスト細胞に より生ぜしめられるＴＮＦは、上皮増殖を強める二次効果を有する。たとえば、 ＴＮＦは、組織への白血球の侵入を促進する、皮膚の後毛細管小静脈上でのＥＬ ＡＭ　−１の発現を誘発する。それらの白血球はひじょうに多くのサイトカイン を生ぜしめ、それらの多くは上皮の増殖を強めることが知られている。

特に興味あるサイトカインは次のものを包含する：腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）一体 止マスト細胞は、正常な皮膚においてこのサイトカインの主な予備形成された源 である。急性移植対宿主疾患における細胞標的は、幹細胞性質を有する角化細胞 であることが推定される。幹細胞は通常遅い周期であるが、しかし誘発性刺激に 基づいて急速に増殖するので、それらはサイトカイン、たとえばＴＮＦのための 好ましい標的であり得る。

上皮増殖因子（ＥＧＦ）−二のサイトカインは広い生物学的効果を有することが 示されている。最っとも有意には、それは基底角化細胞の増殖を誘発する能力を 有する。さらに、それは胎児成長の間、成長を支持し、そして創傷治癒の間、再 上皮化を促進することが示されている。

トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）　−ＴＧＦは上皮細胞の増殖及び分化 の両者の調節に包含されることが示されている。これはインビトロで角化細胞の 増殖を刺激することが知られている。

インターロイキン−１（ＩＬ−１’）　−ＩＬ−１は表皮細胞において増殖活性 を誘発することが知られている。

サイトカイン／増殖関係のこれまでの研究は、単離された細胞の精製された集団 に対して行なわれた。器官培養及び相当するインビボモデルを用いてこの次の実 験は、損なわれていない微環境における上皮増殖に対するサイトカイン効果を評 価することが企画されている。

サイトカインレセブターの局在化 サイトカインのためのレセプターの局在化を決定するために企画された研究にお いて、ビオチニル化されたサイトカインを、０．５〜５０ｎｇ／ｄの範囲でネズ ミの皮膚の外植片に添加する。組織を、サイトカインと共に６０分間インキュベ ートし、十分にすすぎ、そして次に培地のみにおいて１０分間インキュベートす る。サイトカインの免疫組織化学的局在化を、標準技法に従って、感受性アビジ ンビオチン免疫ペルオキシダーゼ又は免疫アルカリホスファターゼ染色を用いて 達成する。

遅い周期細胞に対するサイトカインの効果種々の増殖細胞集団に対するサイトカ インの効果を決定するために企画された研究において、選択されたサイトカイン をネズミ皮膚の外植片に添加する。外植片培養物を、暴露の初めの４日間、毎日 連続的に収穫し、そして３Ｈ−ＴｄＲｍ込みに対するサイトカイン効果を標準技 法に従って評価する。

他の一連の実験において、一群のマウスを、”Ｈ−ＴｄＲにより２週間、連続し てラベルし、そして次に、４週間休止する。いったんラベルされれば、ゆっくり 循環する細胞は、長期間、同位体を保持し、そして従って、ラベルを保持する細 胞として同定される。サイトカインを皮膚内注射により連続してラベルされ／追 跡された動物に導入する。殺害する４時間前、コルセミド（４■／ｋｇ）を腹腔 的注射する。動物を、サイトカイン注射の後２，６．１２及び２４時間で殺害し 、そして注射された部分からの皮膚を固定し、そして通常の方法に従ってオート ラジオグラフィーのために加工する。ラベルされた有糸分裂型の出現は、遅い周 期細胞が増殖を誘発されたことを示唆する。

幹細胞集団の活性を調節するための物質の効力を評価する方法が提供される。本 発明の方法は、試験されるべき物質に細胞を暴露し；選択された放射性ラベルに より選択された期間、前記試験細胞を連続的にラベルし；前記試験細胞を増殖相 に誘発し；前記試験細胞をラベルについて観察し；そして前記試験細胞のラベリ ングと確立された対照とをラベルされた幹細胞について比較することを含んで成 る。そのような方法は、たとえば毛の成長を刺激し又は毛の損失を妨ぐ物質を評 価するために有用である。さらに、そのような方法は、皮膚癌の処理のために有 用な物質を同定するために有用である。

幹細胞の活性を調節し、たとえば組織増殖を促進するように遅い周期細胞を刺激 する方法が提供される。本発明の方法は、選択された＆１ｌｔａにおける幹細胞 集団を同定し、そして前記幹細胞を増殖相に誘発することを含んで成る。そのよ うな方法は、毛の成長を刺激し、又は毛の損失を妨げるために有用である。同定 された幹細胞を増殖相に誘発するための有用な物質は、ＴＰＡ及びサイトカイン を包含する。そのような物質は、内部的に又は局部的に、単独で又は医薬的に許 容できるキャリヤーと一緒に投与され得る。

診断及び治療目的のための遅い周期細胞を検出するための方法がまた提供される 。遅い周期細胞を、同定し、選択された物質により増殖相に誘発し、そして次に 、確立された対照に対してのそれらの数及び／又は生存率を決定するために観察 する。幹細胞を増殖相に誘発するのに有用な物質は、ＴＰＡ及びサイトカインを 包含する。そのような方法は、異常な毛の成長又は毛の損失の診断及び処理のた めに有用である。さらに、そのような方法は、皮膚癌の診断及び処理のために有 用であることがわかっている。

多くの特定の態様が示されて来たが、それは本発明を限定するものではない。

国際調査報告 フロントページの続き （７２）発明者　ラブカー、ロバート　エム。

アメリカ合衆国、ペンシルバニア　１９３５５゜マルバーン、ピケランド　ロー ド　アールディー　６ｌ−１５５ （７２）発明者　スジ、トラン−ティエンアメリカ合衆国、ニューヨーク　１０ ５８３゜スカースデール、エツジモント　ロード：７２）発明者　コトサーリス 、ジョージアメリカ合衆国、ペンシルバニア　１９０８２゜アッパー　ダービイ 、パークビュー　ロード　７６１５

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．毛のうにおけるラベル保持性細胞を検出するための方法であって： （ａ）毛細胞を選択された期間、連続してラベルし；（ｂ）前記細胞を増殖相に 誘発し；そして（ｃ）前記細胞をラベリングについて観察することを含んで成る 方法。
2. ２．前記細胞を、少なくとも７日間、連続してラベルする請求の範囲第１項記載 の方法。
3. ３．前記細胞を、少なくとも１４日間、連続してラベルする請求の範囲第２項記 載の方法。
4. ４．前記細胞を、渦形性刺激に応答して増殖相に誘発する請求の範囲第１項記載 の方法。
5. ５．前記細胞を、ＴＰＡ又はサイトカインヘの暴露により増殖相に誘発する請求 の範囲第４項記載の方法。
6. ６．前記誘発された細胞をコルセミドに暴露し、そして次に前記細胞をラベルさ れた有糸分裂型について観察することをさらに含んで成る請求の範囲第１項記載 の方法。
7. ７．幹細胞集団の活性を調節するための物質の効力を評価するための方法であっ て： （ａ）評価されるべき物質に試験細胞を暴露し；（ｂ）前記試験細胞を選択され た放射性同位体により選択された期間、連続してラベルし； （ｃ）前記試験細胞を増殖相に誘発し；（ｄ）前記試験細胞をラベリングについ て観察し；そして（ｅ）前記試験細胞のラベリングと確立された対照とをラベル された幹細胞について比較することを含んで成る方法。
8. ８．前記試験細胞を、ＴＰＡ又はサイトカインの投与により増殖相に誘発する請 求の範囲第７項記載の方法。
9. ９．前記選択された放射性同位体はトリチウム化されたチミジンである請求の範 囲第７項記載の方法。
10. １０．遅い周期細胞の活性を調節するための方法であって：（ａ）選択された組 織における幹細胞集団に同定し；そして（ｂ）前記幹細胞を増殖相に誘発するこ とを含んで成る方法。
11. １１．前記幹細胞を、ＴＰＡ又はサイトカインヘの暴露により増殖相に誘発する 請求の範囲第１０項記載の方法。
12. １２．診断及び治療目的のために自己再生する組織におけるラベル保持性細胞を 検出するための方法であって：（ａ）同定された遅い周期細胞を選択された期間 、連続してラベルし； （ｂ）前記細胞を、有効濃度でのＴＰＡ又はサイトカインに選択された期間、暴 露することによって、増殖相に誘発し；そして（ｃ）前記ラベルされた細胞を、 確立された対照に対するそれらの数及び生存率を決定するために観察することを 含んで成る方法。