JPH06509116A - 修正されたｐｆ４組成物及び使用方法 - Google Patents

修正されたｐｆ４組成物及び使用方法

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称　蕎毎→修正されたＰＦ４組成物及び使用方法 関連出願のクロスリファレンス この出願は１９８９年７月６日出願の係属する出願０７／３７６．３３３の一部 継続出願である。
発明の背賢 新しい毛織血管の発達である血管形成（脈管形成：アンギオゲネシスａｎｇｉｏ ｇｅｎｅｓｉｓ）は発達しつつある胎児及び成長する人に於いて重要な過程であ る。しかし、健康な成人に於いては、血管形成は傷の治癒及び月経サイクルにお いてのみ有意義に生じる。
現在では、成人に起っている血管形成の多くは性質上病理学的なものであること が広く認識されている０例えば、血管内皮細胞の増殖及び新しい毛細血管の形成 は、容量が数立方ミリメーターを越えるような充実性腫瘍の成長に必須のもので ある（フォークマン等、［１９８３］Ｃ１ｂａＦｏｕｎｄ、　Ｓｉｇ＋ｐ、　１ ００：　１３２〜１４９）　、本発明者等は、発達しつつある腫瘍は周りの内皮 細胞を刺激して分裂させ腫瘍に向って移行させる成長因子を分泌すると理解して いる。
充実性腫瘍の成長の他に、血管形成の機能不全を伴う他の症状には、糖尿病性網 膜症、水晶体後の線維増殖、新生血管緑内障、乾癖、線維性血管腫、免疫性及び 非免疫性炎症（調節リウマチを含む）、アテローム性動脈硬化症プラーク内での 毛細血管の増殖、血管Ｌカボジ肉腫を含んでおり、これらは最近制御が損われた 内皮細胞分裂及び毛管成長を特徴とする病気と認められている。
これらの症状並びに充実性腫瘍の成長は、血管形成病として総称されている（フ ォークマン　ジェー、及びエム。
クラスバーン　［１９８７１５ｃｉｅｎｃｅ　２３５：４４２〜４４７）　。
血管形成病に加えて、内皮細胞の増殖が病原となっているか、少なくとも望まれ ないものとなっている他の症状がある０例えば子宮内膜症は通常は子宮の内壁を なしているある種の内皮細胞の異常な増殖及び配置に特徴付けられる。血管形成 過程の抑制は、子宮内膜症を防止又は軽減するのに役立ち得る。また子宮の内皮 細胞成長の防止は、避妊を意味し得る。
内皮細胞の成長は傷の治癒と関連している。この成長は広範囲な外科手術の進行 の問、そして過剰な庸痕形成が起きる場合には望ましくない。従って内皮細胞の 増殖を抑制することは、望まれない庸痕形成を防止又は減少することを助ける。
血管形成及び内皮細胞の増殖の機構は完全には特性が決定されていない、新たな 毛細血管の成長が生しる前にマスト細胞が腫瘍の位置に於て蓄積する。しかし、 マスト細胞単独では血管形成を開始出来ない、マスト細胞の生成物であるヘパリ ンは、血管形成に必要な毛細血管の内皮細胞の移動を有意義に刺激することが示 されている（フォークマン　ジｘ　−、［１９８４］　Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉ ｓ：開始と調節、癌の新人と転移：生物的及び治療的な面、ジー。
エル、ニコルソン及びエル、ミラス編、ニューヨークのラヘンブレス　２０１〜 ２０８頁）。
幾つかの物質がインビトロで内皮細胞の成長を抑制する能力があることが知られ ている。内皮細胞成長の最もよく研究された抑制剤の一つは、プロタミンであり 、これは精子のみに見出される蛋白質である。プロタミンは腫瘍の血管形成を抑 制し、その後のＩｌｇＮの成長を抑制することが示されている（ティラー　ニス 、及びジエー、フォークマン［１９８２］　Ｎａｔｕｒｅ　２９７：　３０７〜 ３１２）　、プロタミンの抗血管形成活性はその良く知られたヘパリン結合能力 によるものであるとされてきた（ティラー及びフォークマン［１９８２］上記参 ！Ｉｌ！り、プロタミンでの臨床的な実験は、プロタミン注射に関連する毒性の 為に行なわれていない、鮭の精子から通常単離されるプロタミンは人に於て抗原 性であることが知られており、そして２回目の暴露の時にこの蛋白質に対するア ナフラキシー反応が観測されている。
少なくとも二つの他の化合物がそれらのヘパリン結合活性に関して研究されてい る。即ち、血小板ファクター４　（ＰＦ４）及びメージャーヘーシツクプロテイ ン（＋ｍｊｏｒ　ｂａｓｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ）である、メージャーベーシック ブロテインはヘパリン結合活性を示すが、それが非常に毒性であるために実用的 な有用性は殆ど熾い。
血小板ファクター４は完全に配列が決定される良く知られた蛋白質である（トイ エル、ティー、エフ１、ビー。
ニス、ケイム、エム、ファーマー、及びアール、エル、ヘインリクソン［１９７ ７］　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４（６）：２２ ５６−２２５８）。これは７０個の残基の分泌できる血小板蛋白質であり、分子 量が約７．８Ｋｄである。ヘパリン結合活性の証拠が存在し、幾らかの抗血管形 成活性の徴候があるが（フォークマン［１９８４］上記参照）　、ＰＦ４は決し て臨床的に有用性を有することが示されていない。
ｒオンコスタチンＡ」と記載され、元々のＰＦ４と同じか又は類似しているよう である化合物が腫瘍の成長に影響を与えることが示されている（米国特許第４６ ４５８２８及び４７３７５８０．両者ともトワードジツク等に発行されている） 。しかし、これらの特許に報告された効果は免疫不全マウスに於けるゆっくりと 増殖している人の癌細胞に関するものである。これらの実験の結果は宿主動物に 元来存在する急速に成長している腫瘍への効果を予測する為には容易に外挿する （あてはめる）ことが出来ない。
更に、これらの特許に報告されている実験は、全くどんなアンギオスタチックな （血管形成を抑制する）性質も予測又は開示していない。
種々のＰＦ４からのペプチドが精製され、それらの性質が研究されている。どれ もが血管形成の抑制に於けるどんな役割も示していない、ＰＦ４のＣ−１３ペプ チドは好中球及び単球に対し、走化性であることが知られている（トイエル　テ ィー、エフ３、アール、エム、シニア、ディー　チャン、ジー、エル、グリフイ ン、アール、エル、ハインリクソン、イー、ティー、カイザー　Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳ＾７８：４５Ｂ５〜４５８７　；オスタ ーマン　ディー、ジー１、ジー、エル、グリフイン、アール、エム、シニア、イ ー、ティー、カイザー及びエイチ、ティー、トイエル［１９８２］Ｂｉｏｃｈｅ ｗ、ａｎｄ　８ｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｗｓ’、　１０７　（１）：＋ ３Ｏ−１３５）＊単球の浸透が血管形成因子の分泌によって局部的な内皮細胞の 増殖及び移行を刺激することが予測されることに注目するのが重要である。従っ てＰＦ４のペプチドは血管形成を抑制しないで刺激することが予測される。
血管形成及び内皮細胞増殖の有効かっ篇毒の抑制物を見つけ出す必要性は有意義 で非常に長い間待望されている。血管形成は癌を含めた広くみられる悲劇的な病 気の開始及び進行に主要な役割を果す、これらの病気を処置する為に、局所的及 び／又は全身的に投与できる有効で憲壽の薬剤は非常に有益であり得、そして長 い１見つけることができなかったものである。
発明の短いまとめ 本発明はＰＦ４又は組替えＰＦ４（ｒＰＦ４）の化学修飾によって得られた組成 物に間するものである０例えば、ＰＦ４はその遊離アミノ基を通じてフルオレス セインーイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−１ｓｏｔｈｉｏｃｙａ ｎａｔｅ）で修飾出来、血管形成の活性及び内皮細胞の増殖を抑制する能力を保 持することが出来る。
本発明の更に別の面は、活性が必要とされている特定の場所をＰＦ４の生物活性 の標的にすることである。これはＰＦ４　（又は適当な断片、類似体又は突然変 異体）をモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キャリア蛋白質、細胞レセ プター分子、又は他の結合蛋白質配列と結合することによってなされうる。
本発明の更に別の面は、ＰＦ４を重合体化合物にコンジュゲートさせることによ り生物活性ＰＦ４　（又は適当な断片、類似体、又は突然変異体）の半減期を延 長させることである。その重合体は例えばポリグルタメートなとのポリアミノ酸 、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリサッカライド（多糖類）で ある。
血管形成病の処置及び内皮細胞増殖抑制に加えて、修飾されたＰＦ４はまた毒素 を特定細胞個体群の標的にするのにも使用できる。ＰＦ４及び関連化合物の種々 の他の修飾が本明細書に記載されている。これらの修飾は生物活性を増強する為 又はＰＦ４化合物の有用性をそれ以外の点で強化する為に行なうことが出来る。
図面の簡単な記載 第１図はｒＰ　Ｆ　４及び種々の間違するペプチドでの処理から生じる血管形成 の抑制を示すグラフである。
＄２図はｒＰ　Ｆ　４のアミノ配列とｒＰ　Ｆ　４−２４１のものとの比較を示 す図である。
第３図はｒＰ　Ｆ　４とｒＰ　Ｆ　４−２４１のα−へリックス立体配置を描い た略図である。
第４図はｒＰ　Ｆ　４とｒＰ　Ｆ　４−２４１で処理することから生じる血管形 成の抑制を比較するグラフである。
第５図はｒＰ　Ｆ　４又はｒＰ　Ｆ　４−２４１による人の内皮細胞増殖の抑制 を示すグラフである。
第６図はｒＰ　Ｆ　４又はｒＰ　Ｆ　４−２４１の処置から生じる人の膀血管内 皮細胞増殖の抑制を比較するグラフである。
第７図はｒＰ　Ｆ　４が腫瘍成長を抑制する能力を示すグラフである。
第８図はＦｒＰ　Ｆ　４のＣ−末端の可能性の高い化学構造を示す図である。
第９図はＦｒＰ　Ｆ　４による入内皮細胞増殖の抑制を示すグラフである。
第１０図はＦｒＰ　Ｆ−２４１による入内皮細胞増殖の抑制を示すグラフである 。
第１１図はＦｒＰ　Ｆ　４による腫瘍成長の抑制を示すグラフ本発明はＰＦ４、 ｒＰ　Ｆ　４及びこれらの化合物の断片及び類似体を化学的に修飾することによ って非常に望ましい特性を有する新しい化合物を造ることが出来るという発見に 間するものである０例えばｒＰ　Ｆ　４及びその断片の化学的な修飾は、驚くべ き、血管形成活性を抑制する能力並びに内皮細胞増殖を抑制する能力を示す化合 物の同定を生した。変更された生物的な性質を生じる一つの特定の化学的修飾は ｒＰ　Ｆ　４の遊離アミノ基をフルオレスセインーイソチオシアネー）（ＦＴＴ Ｃ）で修飾することを含む。生じるアダクトＦｒＰ　Ｆ　４はヘパリン結合領域 内でのりジン残基の修飾の為にヘパリン結合活性を欠いているが、驚くことに血 管形成を抑制する能力、並びにインビトロでのＨＵＶＥＣ増殖を抑える能力を保 持する。
アンギオスタチック活性も嵩ばった疎水性のフルオレスセイン部分て修飾された ＰＦ４断片及び突然変異体中で見出される。それらの生物活性に加えてＦＩＴＣ 標識ＰＦ４配列はＰＦ４分子の視覚的な検出に有用である。
更に関連する生物活性を消失することなく、ＰＦ４及びその断片を大きな部分で 修飾することが出来るこ°とは、ＰＦ４、その断片、突然変異体又は誘導体を、 毒素、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、発螢光団、細胞レセプター分 子、非蛋白質性生物エフェクター分子、キレータ−、キャリア蛋白質、ポリサッ カライド（多糖類）、ポリアミノ酸、及び他の大きな物質に結合させる基礎を提 供する。コンジュゲート化は、例えば、ＰＦ４又はＰＦ４の変形の遊離アミノ、 カルボキシル、スルフヒドリル、又はグアナシニウム（アルギニン）基などの蛋 白質上の官能基の修飾を通じて発生する。所望のコンジュゲート化を達成するの に必要なこれらの部分の修飾は、当業者に良く知られた化学的手順によって実施 できる。
本明細書に記載した化合物の用途の一つは、血管形成病の治療である０本明細書 で使用される血管形成病という用諸は、充実性腫瘍の成長、及び糖尿病性網膜症 、水晶体積繊維増殖、新生血管緑内症、乾癖、繊維性血管腫、免疫性及び非免疫 性炎症（関節リウマチを含む）、アテローム性動脈硬化症プラーク内での毛細血 管増殖、血管■及びカボジ肉踵を含めた血管形成不全を伴う他の症状をさしてい る０本発明はまた、制御不全の内皮細胞増殖の病気の処置の為に、ｒＰ　Ｆ　４ 及びＰＦ４断片、類似体、及び突然変異体を使用することにも間するものである 。
本明細書で使用する類似体という用語は、別の化合物と実質的に同じであるが、 例えば追加的なアミノ酸又は側鎖基を付加することによって修飾されているもの でありうる化合物をさしている０本明細書で「突然変異体」及び「変異体（ｖａ ｒｉａｎｔ）Ｊとは、別の配列と実質的に同じであるが、アミノ酸配列中にある 場所でアミノ酸置換を有しているアミノ酸配列をさす、断片とはより長いアミノ 酸配列の部分をさしている。
本発明は特定のアミノ酸配列及び特別に例示した他の組成物を包含している０本 発明は更にこれらの配列の類似体及び突然変異体、並びにその配列の断片、及び その断片の類似体及び突然変異体を包含している。これらの類似体、突然変異体 及び断片は、類似体、断片又は突然変異体がもともとの例示した化合物と同じ関 連する生物活性を実質的に保持する限り、本発明内に包含されている０例えば当 業者にはコンザーバティブなアミノ酸置換を行なうことが容易である。これらの 置換は以下により詳しく議論する。これらの置換が関連する生物活性を実質的に 変更しない範囲で、生じる化合物は本発明の範囲内にある。「関連する生物活性 」という用語は、化合物の特定の応用についての問題となる活性をさしている。
例えばＰＦ４の幾つかの用途は以下に議論される。これらの用途には、血管形成 の抑制及び内皮細胞増殖の抑制が含まれる。ＰＦ４がこれらの方法で使用される ときは、「類似体」とは、血管形成の抑制又は内皮細胞増殖の抑制をする化合物 の能力を実質的に変えること無＜、ＰＦ４が変更されている（例えばコンザーバ ティプなアミノ酸置換によって）化合物類をさしている。コンザーバティブなア ミノ酸置換は、本発明の主題の範囲内にある修飾の形態のほんの一例にすぎない 。
本発明は化学的に修飾されたｒＰ　Ｆ　４が、生体内での毛細血管形成及び胎児 性新生血管新生を抑制するという予期しない発見から生じている。Ｉａ替えＰＦ ４の完全な長さのものがインビトロで成長因子に依存した人の内皮細胞増殖を抑 制することも決定されている。有意義なことには、ＰＦ４の血管形成抑制活性は 、長さが１０個のアミノ酸にすぎない小ささのＰＦ４の配列に対応している合成 ペプチドによって保持されることも決定された。特に、ＰＦ４（Ｃ−１３）のカ ルボキシ末端に対応する１３個のアミノ酸の合成ペプチドは強力なアンギオスタ チツク（血管形成抑制）活性を示した。ＰＦ４のカルボキシ末端に対応する４１ 個のアミノ酸のペプチド（Ｃ−４１）もアンギオスタチック活性を示した。
Ｃ−１３ペプチドの活性は、それがヘパリンの抗凝固活性に影響する能力がない ことからして、特に驚くべきことである。Ｃ−１３ペプチドの使用は、全体のｒ Ｐ　Ｆ　４を使用することと比較して、幾つかの利点、例えば少ない投与量（重 量基盤）、抗原性である可能性が少ないこと、及びＦＴ境な投与形に於ける有効 性がより大きい見込であることなどを与える。
ＰＦ４のＣ・１３ペプチドはまた、マウスに於けるＣｏｎ−＾で誘発された免疫 抑制を防止する能力を保持しているが、この活性はヘパリンに影響されず、ペプ チドが血管形成を抑制する能力とおそらく独立している活性である。
血管形成は数立方ミリメーターを越える充実性腫瘍の充実性腫瘍の処置に対し、 血管形成を抑制することによって腫瘍拒絶を生じる為に、ｒＰ　Ｆ　４又はその 修飾物を使用することは治療の新規かつ高度に有利な手段を与える。Ｃ−１３ペ プチドがヘパリンの抗凝固活性に影響すること無く血管形成を抑制するという事 実は、この小さなペプチドが同時に行う抗凝固治療を干渉しないという利点も有 するだろうということを実証するものである。更に小さなペプチドは一般により 大きな蛋白質よりも抗原を生じることが少なく、従ってＰＦ４断片は経口及び経 皮投与に有利に使用できる。この種の配達方法は特に胃腸の毛細血管の増殖（例 えばカボジ肉ＩＩＩ）及び皮膚の病巣の処置にそれぞれ有用である。病巣内並び に全身的なＰＦ４断片の投与も、これらの症状の処置に適当である。
ＰＦ４断片の局所的又はエロゾル投与は皮膚又は肺の病巣に夫々適している（例 えばカボジ肉腫及び肺癌）。
血管形成を抑制する能力を増強したＰＦ４の類似体が合成されている。このｒＰ 　Ｆ　４−２４１として知られる類似体は、α−ヘリックス二次構造を保ちつつ ヘパリン結合活性を除く為に、ＰＦ４のカルボキシ末端の４つのりジン残基が二 つのＧｌｎ−Ｇｌｕカブレットに変換されている合成ＰＦ４遺伝子のカセット変 異誘発によって造られた。
もしｒＰ　Ｆ　４−２４１（又はＦｒＰ　Ｆ　４−２４１）が病巣内投与される なら、投与量は薬１μｇ／病巣と薬４＋ｗｇ／病巣の閏であるように適用される ことができる。全身投与に対しては、ｒＰ　Ｆ　４−２４１（又はＦｒＰ　Ｆ　 ４−２４１）の投与量は、体重ｋｇあたり０．５ｍ３と約Ｉ　００＋ｗｇの閏で あり得る。ネイティブなｒＰＦ４（又はＦｒＰ　Ｆ　４　）の配列並びにペプチ ド断片の投与に対して類似の及びより高い投与量が使用できる０例えばｒＰＦ４ （又はＦｒＰ　Ｆ　４　）及びその断片の投与量は、ｒＰＦ４−２４１（叉はＦ ｒＰ　Ｆ　４−２４１）の２＠又はそれ以上であり得る。
本発明の化合物は適当な製薬担体と絹合せることが出来る。例えばＦｒＰ　Ｆ　 ４又はＦｒＰ　Ｆ　４−２４１は生理的に受入れられる担体、例えは燐酸緩衝化 塩水、蒸留水、賦形剤なとの中で処方出来、又は未希釈投与できる。
受精卵を静置させて３日前３７℃で７０〜８ｏｚ相対湿度で培養した。この閏、 胚が卵の内容物の上表面に上昇した。
４日のはしめに、卵は逆さまにすることなく割られ、注意深く滅菌プラスチック ベトリ皿に胚が上表面にあるままに置いた。殻のない卵を更に７２時閏３７℃で ２．５〜３．５ＩのＣ０２を含有している雰囲気下で培養し、その後成長する胚 は認め得るＣＡＭを発達させた。試験試料を！工（ν／■）メチルセルロースと 混合することによって造ったディスクを乾燥し、主要な血管と、胚からおよそ０ ．５ｃｍとの間に、ＣＡＭ上に置いた。３７℃で更に　４８時閏培養後（２，５ 〜３．５ＸＣＯ３）、試料を血管形成を抑制するそれらの能力について記録した 。抑制はインブラントを取巻く駆−帯域として見え、このディスクを避けている 静脈によって形成されたエルボ−及びインブラントの領域に於ける毛細血管の減 少した数を含んでいる場合が多い。
内皮細胞増殖検定 人の隋血管内皮細胞を、ＩＯＸ　（ｖ／ｖ）胎児牛血清（ＦＢＳ）、１５０■ｃ ｇ／ｍｌ内皮纏胞成長サブレメン）　（ＥＣＧＳ）及び５単位／−１ノヘパリン を含有している培地（Ｍｅｄｉｕｍ）１９９　（Ｇｉｂｃｏ）中で、３７℃で４ 〜５ＸＣＯ２で培養した。３〜４日毎に培養基をトリプシン処理で収穫し、希釈 して再プレートにし、集合体に生育させた。実験の開始前に細胞を遠心分離し、 ヘパリンのない培地中に再懸濁し、試験物質（ＰＦ４）と共に３８閏、標準の培 養条件下で培養した。培養期間の終りに細胞を収穫し、計数した。平均の閏の統 計的な有為性は、非対データに対する標準のスチューデン）　１−検定（Ｓｔｕ ｄｅｎｔ　ｔ−ｔｅｓｔ）で決定した。
ｒＰ　Ｆ　４生産 ＰＦ４配列直前のメチオニン残基を含有しているＮ−末端融合蛋白質として大腸 菌中で總替えＰＦ４を造った。
不溶性の融合蛋白質をシアノゲンブロマイド処理で開裂し、ヘパリンアガロース アフィニティークロマトグラフィーで精製した。単離した蛋白質を２０５Ｍ酢酸 ナトリウム、ｐＨ４，０中に緩衝交換し、貯蔵の為には凍結又は凍結乾燥した。
ペプチド生産 ペプチドを標準の同相合成手順で造り、固体支持体から開裂し、脱封鎖し、モし て逆相ＨＰＬＣで精製した。
次の実施例は最良の形態を含めた本発明の実施に対する手順を説明する。これら の実施例は制限するものと解釈されるべきでない、特に別途記載しない限り全て の％は重置、全ての溶媒混合物割合は容量による。
実施例１ 上記の様に製造した鶏の卵を種々の濃度の絹替えＰＦ４又はＰＦ４の配列に由来 するペプチドを含有しているディスクで処理した。ｒＰＦ４及び１３個のアミノ 酸しかないＣ末端ペプチドがＣＡＭに於いて血管形成を抑制した（第１図）、各 場合に於いて抑制は投与量依存性であり、応答はＰＦ４のＣ末端領域を含有して いる阻害剤とほぼ同等である（モル基盤）、ＰＦ４のＮ末端ペプチド（Ｎ−２９ ）は試験された最も高い濃度に於いてさえ血管形成を抑制せず、ＰＦ４の全ての 抗血管形成活性はおそらく分子のＣ末端部分と関連していることを示唆している 。ＰＦ４のＣ末端はリジンに富んでいるので、この検定系において、ポリリジン を試験し、６．５日モル投与量で抑制を生しないことが分った。
実施例２ ＰＦ４のリジンに冨んだ領域（６１〜６６の残基）もＰＦ４によるヘパリンの結 合と間違した領域である。ヘパリンは血管形成を調節する役割をすることが知ら れており、血管形成は別の良く特性が分っているヘパリン結合蛋白質であるプロ タミンによっても影響を受け得る。ＰＦ４に基づいた合成ペプチドがヘパリンに 結合する能力を評価する為に、本発明者等はヘパリンによって阻害される凝固カ スケード酵素の活性を検定した。プロタミンと血小板ファクー４はおよそ等モル 濃度に於いて、トロンビンとファクターＸａのヘパリン阻害を防止することが出 来る。ＰＦ４の４１個のアミノ酸Ｃ末端ペプチド（Ｃ−４１）はヘパリン阻害の 防止に効果がより小さかったが、Ｃ−１３ペプチドはｒＰ　Ｆ　４の有効水準の １０倍の濃度に於いてさえ、トロンビンの阻害を防止することが出来なかった。
この予想外の発見はＣ−１３ペプチドがヘパリン結合以外の何等かの方法によっ て血管形成を抑制することを示唆内皮細胞の分裂及び成長は成長因子の存在によ って厳密に制御され、そしてこれに厳密に依存している０本発明者等は、ｒＰ　 Ｆ　４及び間違するペプチドの、インビトロでの成長因子に刺激された入内皮細 胞増殖の抑制を評価した。ｒＰＦ４は１０ｍｃｇ／ｍｌという低さの濃度で、投 量量に依存して内皮細胞の成長を有意義に抑制した。抑制はここで使用したヘパ リン欠乏培地中で２５■ｃｇ／■１において完了した。
実施例４ 内皮細胞増殖の抑制に於けるＰＦ４のヘパリン結合活性の重要性を評価する為に ５単位／１のヘパリンを含有するか含有していない培地中で細胞を培養した。こ の実験の３日間の培養の閏ヘパリンの存在はこれらの細胞の増殖を刺激した。ｒ ＰＦ４は対照（１００′１）も、ヘパリン刺激（、４５％）内皮細胞の成長も、 両方とも有為に抑制した（表１）。
−＋　４　、４±２．５　ｂ６．０±０．６　〜１００５ｕ／ｓｔへ１１”リン 　１８．９±　１．２　ｂ１４．０±　０．４　４５ｅは８ｘｌＯ’纏１１ｉ＆ ／つＩルのシーディングに基づく。
ｂ適当な対照と有意義に異なる（　ｐ　＜　０．００５）実施ｆＭ５　ｒＰＦ４ −２４１の構築 ＰＦ４のカルボキシ末端に於ける４つのりジン残基を２つのＧｌｎ−Ｇｌｕ結合 体に変換するのに、合成ＰＦ４遺伝子のカセット変異誘発を使用したく第２図書 ｗｉ）、この構築物は明らかに、この分子のこの領域に対するαヘリックスの２ 次構造（第３図）を保持したが、同時にヘパリン結合活性を失った。
Ｐ　Ｆ　４−２４１に対する遺伝子を、大腸菌中で、親の「ＰＦ４分子と同じＮ −末端アミノ酸配列を有する融合蛋白として発現した。蛋白質をＣＮＢｒ及び蟻 酸で大腸菌融合ペプチドから開裂させ、ＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフ ィーによりほとんど均一に精製した。この蛋白質はＰＦ４に対するポリクローナ ル抗体と反応性であり、アミノ酸分析によって適当な修飾を有することが決定さ れた０重要なこととして、精製された突然変異体蛋白質はファクターＸａ抑制検 定に於いてヘパリン結合活性を欠いていた。
ここで記載した置換はペプチド断片並びに完全長のＰＦ４分子に対して行うこと が出来る０例えばＣ−１３−２４１は次の配列を有する。
Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−１１ｅ−ｌ　１ｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ −Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−５ｅ精製したｒＰ　Ｆ　４−２４１をメチルセルロ ースディスク中で乾燥し、鶏の絨毛尿膜（ＣＡＭ）検定に於いて、毛細血管成長 の抑制能力について試験した。試験した最も低い濃度に於いてさえ（１，２５ｒ ＋ｔル／テ゛イスク）　ｒＰ　Ｆ　４−２４１はＣＡＭ系に於ける血管形成を大 いに抑制した（第４図）。
この抑制は膜上のより大きな部面帯域によって示唆されるように、元々のｒＰ　 Ｆ　４の等しい濃度によって生じたものよりもいっそう有効であった。ｒＰ　Ｆ 　４−２４１の抑制効果はヘパリンによって逆転されなかった。
実施例７　ｒＰ　Ｆ　４−２４１による入内皮細胞増殖の抑制比々のｒＰ　Ｆ　 ４が完全に内皮細胞増殖を抑制する濃度で、変異体ｒＰ　Ｆ　４−２４１は少な くとも細胞成長を抑制するのに同し樟に有効である（第５図）、更に試験は元々 のｒＰ　Ｆ　４が殆ど又は全く効果を有しない水準である０、５＊ｃｇ／ｍｌの 低い１度でｒＰ　Ｆ　４−２４１が抑制することを示唆している。
元々のｒＰ　Ｆ　４及び変異体ｒＰ　Ｆ　４−２４１による人請静脈内皮細胞増 殖の抑制試験に於いて、これらの細胞の増殖抑制にはｒＰＦ４−２４１がネーテ イブなｒＰ　Ｆ　４よりもずフと有効であることが示された。この試験の結果は 第６図に示されている。
これらの結果は、ＰＦ４の効果がヘパリンの結合の為であったと仮定した血管形 成のｒＰ　Ｆ　４による抑制の以前の理論からすると注目すべき事である。我々 は蛋白質を、元々のＰＦ４の構造的な特徴のほとんどを保持するが、検出可能な ヘパリン結合活性を欠くものとして設計したが、これは生体内で血管形成を抑制 するのにそしてインビトロで内皮細胞増殖を抑制するのに元々のＰＦ４よりも明 らかにより活性である。更に我々が設計した変異体はヘパリン抗凝固剤療法に干 渉することが予想されない。
実施例日　インビボ（生体内）の腫瘍成長の抑制正常なＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウ ス（６〜８週の年齢）に皮下的に、Ｂ　１６−ＦＩＯ黒腫踵瘍系統の５　ｘ　１ ０’対数相の細胞を接種した。このプロトコルは進行的な腫瘍の成長に導き、大 きな（３００ｍｍ３）壊死腫瘍をおよそ１０日間の後に生じ、その後未処理動物 の死は、通常腫瘍の接種３週以内に生じた。
生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）での腫瘍の成長及び血管形成を抑制するｒＰ　Ｆ　４ の有効性の試験に対する実験に於いて、腫瘍を有している動物を二つの群に分割 した。一つの群には、腫瘍の接種後１８目から始めて、１００μｍの５０■門燐 酸ナトリウム、ｐＨ６，５中の５０μｇのｒＰＦ４（ネーティブな配列）、５０ ＩＩＭの塩化ナトリウムを初期の腫瘍に直接毎日注射した。対照群を同じ様にｒ Ｐ　Ｆ　４を欠いている担体緩衝液で処理した。腫瘍の容積を規則正しい前隅て ディジタルカリパス（ｃａ　ｌ　ｉ　ｐｅｒｓ）で、各主題の動物が受ける特定 の処置が教えられていない実験富貴によフて測定した。
ｍ瘍接種７日以内に対照動物は明らかな３次元的な腫瘍を有する一方、ｒＰ　Ｆ 　４処理動物は本質的に腫瘍が無かった（第７図）、ｒＰＦ４て続けて処置する ことは、これらの条件下、即ち対瞭動物の腫瘍が壊死を生じそして未処理マウス で以前に得られるように大きなものである条件下で、完全に腫瘍成長を抑制した 。同じ効果が「Ｐ　Ｆ　４−２４１が抑制剤として使用されたときにも観測され た。
この発見は、血管形成の抑制剤としてのｒＰ　Ｆ　４が悪性の黒腫及び他の癌の 克服に臨床的に有用であるとの提議を支持するものである。進行的な腫瘍の成長 は新しい血管の形成を要求し、このことは抑制されれば腫瘍成長を制限するのみ ならず、既存の血管の退化並びに悪性の侵入物に対する他の応答の増強を刺激す る。
生体内の腫瘍成長のｒＰ　Ｆ　４抑制が、最初の接種（ｒＰＦ４の）の三日以内 に明らかに存在したという発見は「ＰＦ４が長時間を要する免疫調整くイミュノ モジュレーション）によるものでなく、局所的な機構によって腫瘍成長を調整す る様に作用することを示している。更にｒＰＦ４はインビトロで贈瘍纏胞成長を 直接抑制しなかった。従ってこのことはｒＰ　Ｆ　４が成長しつつある腫瘍に対 する宿主の血管形成応答を変えたようである。
変更が蛋白質の二次構造を変更させないならばアミノ酸配列を変更することによ って同定された構造及び機能の蛋白質を構築出来ることが示されている（カイザ ーイー、ティー、及びエフ、ジェー、ケズディー［１９８４］５ｃｉｅｎｃｅ　 ２２３：　２４９−２５５）。従って本発明は蛋白質の二次構造を変えないか、 又は構造が変えられたとしても生物的な活性が保持されている、水明細書に描か れたアミノ酸配列の変異体を含んでいる。
我々はＰＦ４配列のカルボキシ末端に対しどのような突然変異がなし得るのか、 そしてそれでも生物活性を保持するのかを決定するために広範囲な研究を実施し た０表２はいくつかの突然変異配列の例及びそれらの生物活性のリストを提供し ている。
表　２　突然変異配列及びそれらの生物活性種々の突然変異体の構築を上の実施 例５に記載される合成遺伝子のカセット式変異誘発を経て達成した。この工程は 当業者によく知られている。この研究の結果は０Ｍ検定に於て高い割合の突然変 異体がアンギオスタティック活性を保持したことを実証している。この活性を全 ての突然変異体が保持するのではないが、ここの教えからは所望の突然変異を造 り、そのような活性が保持されたがどうかを決定することは当業者が容易になし 得ることである。
特にアミノ酸のコンザーバティブな置換が行われることが理解されるべきである ０例えば、アミノ酸は次のクラスに分けられ得る。塩基性、疎水性、酸性、極性 及びアミド、一つのクラスのアミノ酸が別の同じ種類のアミノ酸に置き換えられ るａｔｅはその置換が実質的に化合物の生物活性を変えない限り本発明の範囲内 にあるものである０表３は各クラスに属するアミノ酸の例を挙げている。
非極性　Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、　ｌｌｅ、　Ｐｒｏ、　Ｍｅｔ、　Ｐｈｅ、 　Ｔｒｐ極性　Ｇｌｙ、　Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、　Ｔｙｒ、　Ａｓｎ、　Ｇ ｌｎ負に荷電　Ａｓｐ、　Ｇｌｕ 正に荷電　しｙｓ、　Ａｒｇ、　Ｈｉｓある場合にはノンコンザーバティプな置 換もされうる。
例えばリジンは次のアミノ酸の任意のもので置き換えられ得る。即ち、Ｇｌｕ、 　Ｇｌｎ、　Ａｓｐ、＾ｓｎＳＭｅｔ、　Ａｌａ、　Ｌｅｕ及び１１ｅ０臨界的 な要因はこれらの置換がｒＰ　Ｆ　４又は「ＰＦ４断片の生物活性を有意義に減 少させるものであってはならないということである。
次の配列は種々の置換を行うのに当業者に対し追加的な指針を提供している。こ の配列は説明のためであり、全てを網羅するものではないこと、そしてヘパリン の結合を取除き、アンギオスタチック活性（抗血管形成活性）を保持する他の置 換が有り得ること、従ってそれが本発明の範囲内であることが認められるべきで ある。
Ａ−Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　ｔｙｒ　ａｌｏ　ａ９　ａｓ　ａＴ　ａｓ　＆＋Ｓ　ａａ 　ａ３Ｇｌｕ　５ｅｒ−ＣＯＯＨ式中Ａ式中Ｆ４の１〜５７の残基からなるポリ ペプチド配列の全部又は一部を表わし、Ａは存在しても存在しなくてもよく、式 中 ａ、ｏはＬｙｓ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎｔ　Ｍｅｔ＋　Ａｌ ａ、Ｌｅｕ。
又はｌｌｅであり； ａ９はＬｙｓ、　Ｇｌｕ、　Ｇｌｎ、Ａｓｐ、　Ａｓｎ、　Ｍｅｔ、　Ａｌａ、 　Ｌｅｕ、又は１１ｅてあり： ａ８はＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ｌｌｅ、Ｖａｔ、Ｐｒｏ、Ｐ ｈｅ。
Ｔｒｐ、又はＴｙｒてあり； ａ７はＧｌｕ、Ｍｅｔ＋　Ａｌａ、Ｌｅｕ、ｌｌｅ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、 Ｔｒｐ。
又はＴｙｒであり： ａ　８は　Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、ＧＩｎ＋　Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ａｌ ａ、Ｌｅｕ又はＩｌｅであり； ８％はＬｙｓ、　Ｇｌｕ、　Ｇｉｎ、　Ａｓｐ、　Ａｓｎ、　Ｍｅｔ、Ａｌａ、 　Ｌｅｕ、又はｌｌｅであり； ａ４はＬｙｓ、Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ＋　Ｖａｌ＋　Ｐｒｏ ＋　Ｐｈｅ＋Ｔｒｐ、又はＴｙｒであり； ａ３はＧｉｎ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔ ｒｐ＋又はＴｙｒであり、ここで最も好ましくはａ８はｌｌｅ、　Ｇｌｕ、又は Ｇｌｎであり；ａ７はｌｌｅ又はＧｌｕであり； ａ８はＬｅｕ、　Ｇｉｎ、又はＧｌｕであり；＆５はＬｅｕ又はＧｌｕである。
本発明の蛋白質のアミノ末端はまた本発明に対し基礎をなす生物活性を保持しつ つ種々の方法で修飾できる。
最も注目されるのはアミノ末端の長さがアンギオスタチック又は内皮細胞阻害活 性を保持しつつ修飾できることである。ここで「アミノ末端」というのは、ＰＦ ４のアミノ末端のアミノ酸１〜６０又はその変異体をさしている。
ここに示したように５７までのこれらのアミノ酸がアンギオスタチック活性を保 持しつつ除去することができる。
残りのペプチドは生物活性ｃ−１３ペプチドである。我々はＣ−４１ペプチドが 生物活性を有することを示している。
従ってＰＦ４の種々の活性断片は容易につくることができ、本発明に従って使用 できる。アミノ末端の他の修飾がなされ得ることが当業者には明らかであろう０ 例えば追加的なペプチド又は蛋白質がその末端に加えられることができ、そして 種々の標準化学誘導体が造られ得る。
そのような修飾は生物活性が保持される限り本発明の範囲内にある。
本発明の臨界的な特徴はアンギオスタチック活性又は抗増殖活性を有するが、ヘ パリンに結合しないポリペプチド及びポリペプチドのコンジュゲート（連結体／ 複合体）を提供することであることが強調されるべきである。
本明細書で使用する「アンギオスタチック活性」とはＰＦ４に特徴的なアンギオ スタチック活性の水準をさしている。アンギオスタチック活性のこの水準は、例 えばＯ同検定に於て測定されるようなＰＦ４により示されるアンギオスタチック 活性の、例えば少なくとも約７５％（そして好ましくは約９０％を越えるもの） である、アンギオスタチック活性を測定する方法は本明細書に記載され、そして よく知られかつ当業者に容易に実施され得る０本明細書で使用する「抗増殖活性 」とはＰＦ４に特徴的な抗増殖活性のある水準をさしている。この抗増殖活性の 水準は、ＨＵＶＥＣ検定によって測定されるＰＦ４により示される抗増殖活性の 少なくとも例えば約７５％（そして好ましくは約９０％を越えるもの）である、 抗増殖活性を測定するための方法は本明細書に記載され、当業者によく知られそ して容易に実施される０本明細書で使用される「ヘパリン結合活性の欠如」とは ＰＦ４と比較して正常な生理学的条件下でヘパリンに結合する能力が相対的に欠 如していることをさしている。このヘパリン結合活性の欠如は、例えばＰＦ４の ヘパリン結合活性の約２５％未満、そして好ましくはＰＦ４のヘパリン結合活性 の約１０％未満である。ヘパリンが結合する能力は本明細書に記載され、当業者 に知られる種々の検定方法によフて容易に測定できる。
実施例９　ＰＦ４とｒＰ　Ｆ　４−２４１のフルオレスセインーイソチオシアネ ート（ＦＩＴＣ）による修飾精製したｒＰ　Ｆ　４、又はｒＰ　Ｆ　４−２４１ 　（５（ｌｓＭ　Ｎ　ａ、、Ｃ０３、ｐＨ９，３，２５＊ＭＮ　ａＣＩ中の５− ｇ）を５１の容量中の５冒ｇのフルオレスセインーイソチオシアネートで処理し 、遊離アミノ基を修飾した。室温で暗所において、３時閏培Ｉ後、標識された蛋 白質（ＦｒＰＦ４又はＦｒＰ　Ｆ　４−２４１）をゲル濾過及び５０＊Ｍ酢酸へ の透析によって非結合ＦＩＴＣから分離した。　ＦｒＰ　Ｆ　４のＣ末端の可能 な構造を第８図に示す。
実施例１０　フルオレスセインーイソチオシアネートとコンジュゲート（連結又 は複合体化）したｒＰ　Ｆ　４による血管形成抑制 ＦｒＰ　Ｆ　４を上記の様にＣＡＭ検定で活性を試験した。
ＦｒＰ　Ｆ　４はヘパリン結合活性を欠いているが、ＣＡＭ上で血管形成の抑制 剤として完全な活性を保有していた。
これらの検定の結果を表５に示す。
ＦｒＰ　Ｆ　４及びＦｒＰ　Ｆ　４−２４１を内皮細胞増殖の抑制の能力を測定 する為に別個に試験した。［”Ｈ］−チミジンをＦ「ＰＦ４の添加２４時間後に 培養基に加えた以外は、上記の通りＨＵＶＥ細胞をそのＦｒＰ　Ｆ　４の感受性 について試験した。培養基を更に６時閏培養した。細胞を収穫し、洗浄し、ＤＮ Ａ中への放射性チミジンの取込を測定した。
第９図に示されるように、ＦＩＴＣコンジュゲート化ｒＰ　Ｆ　４は、低投与量 に於いてさえ、人の諌部静脈内皮細胞におけるＤＮＡ合成を、従って細胞の増殖 を抑制するのに、非常に有効である。　ＦｒＰ　Ｆ　４−２４１を用いて類似の 結果が得られた。この場合、ｒＰ　Ｆ　４−２４１の濃度の増加に対する、ＨＵ ＶＥ纏胞増細胞抑制を上記の様に内皮細胞増殖検定を用いて試験した。　ＦｒＰ 　Ｆ　４−２４１を用いる実験の結果を第１θ図に示す。
の抑制 Ｂ−１１１４腫腫瘍を前に記載したようにＣ５７ＢＬ６／Ｊマウス中で生育した 。処置は腫瘍細胞の移植（１８目）に続いて２４時閏で開始し、そして１００μ ｍの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４，０中の２５μｇ１日のＦｒＰ　Ｆ　４からな っていた。対照のマウスに同じ緩衝液中の２５μｇ１日のＦＩＴＣ標識チトクロ ームＣを注射した。　ＦｒＰ　Ｆ　４による腫瘍成長の統計的に有意な抑制す月 １日目までに観測されたく第１１図）。
実施例１３　ＰＦ４活性の特定の場所への分配ある種の症状を処置する為に、生 物活性を特定の場所に向けることが場合によっては有益である０例えば、充実性 腫瘍の生育を抑制する為に、アンギオスタチックな性質を有しているＰＦ４又は 類似体を直接腫瘍場所に送ることが望ましいものであり得る。これはＰＦ４　（ 又は類似体）を適当な抗体、好ましくはモノクローナル抗体に結合させることに よって達成できる。この技術で良く知られた方法を用いて造られ得るモノクロー ナル抗体は、標的場所を選択的に探し出す、抗体が所望の場所に移動するに従っ て、これはそれ自身と共にＰＦ４を以て行く。
従フてＰＦ４活性が特定の場所で濃縮され得る。
ＰＦ４なとのポリペプチドに対する結合抗体の一般的な手段が当業者に良く知ら れており、例えば米国特許４゜６７１．９５８　（ローウェル等）及び４，７９ ２．４４７（ウール等）によってｌｌ＆！されている。ＰＦ４はまた結合蛋白質 く例えばトロンポスボンジン又は繊維芽細胞成長因子）、細胞レセプター分子（ 例えばＣＤ４、リンパ球機能関連抗体−１ＣＬ　Ｆ　Ａ−１１、及びフォンウィ レブランド（ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子［ｖＷ　Ｆ　］）　、又は相 補的なりガント、及び非蛋白貢性の生物エフェクター分子（例えばＩＣＡＭ−１ ，腫瘍関連抗体、及びプロスタグランジン類〉と類似のコンジュゲートを経て、 特定の場所を標的にし得る。
例えばモノクローナル抗体又は他の部分はＰＦ４のカルボキシ末端の近くに位置 しているリジン残基の一方又は両方の対に於いてＰＦ４と連係させ得る。これら の残基で、モノクローナル抗体を連係させることによって、アンギオスタチック な活性は、ヘパリン結合が除去される一方で保持される。またこれら及び他の位 置に於いて適当な部分とコンジュゲートする前に、リジン残基を他のアミノ酸残 基で置換し得る。従って、本明細書に記載した化合物は以下によって表わすこと が出来る。
〔式中（ａ）ＡはＰＦ４の残基１〜５７ｂ）らなるポリペプチド配列の全部又は 一部を表し、Ａは該ハイブリッドポリペプチド上に存在しても存在しなくてもよ ＜、（ｂ）Ｂ、Ｃ１Ｄ及びＥは共有結合に適した官能基を有する任意のアミノ酸 でありえ、（ｃ）Ｆ、Ｇ、Ｈ及びＩはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体 、フルオレスセインーイソチオシアネート、発螢光団、毒素、細胞レセプター分 子、非蛋白質性生物エフェクター分子、ポリアミノ酸、ポリサッカライド（多糖 類）、及びキレータ−（ｃｈｅｌａｔｏｒ）からなる群から選ばれ、Ｆ、Ｇ、Ｈ 及び■と命名した部分の少なくとも一つは該ハイブリッドポリペプチド上に存在 しなければならない〕。
本明細書に記載した化合物の１記の表現において、縦の線は水平の線上のアミノ 酸の閏の２閏と同じ様に化学結合の相互作用を表わしている。Ｂ、Ｃ，Ｄ及びＥ に於ける特定して例示した部分の存在は、他の残基に於いて生しるコンジュゲー ションの可能性を除外するものでは腫瘍及び血管形成病の治療に対する全身的に 活性のアンギオスタチックな複合体として、その有効性を改良する為に循環する ＰＦ４の半減朋を増加することが望ましいものであり得る。例えばＰＦ４は大き なキャリア蛋白質、例えば人血清アルブミン（ＩＳＡ）　、又は免疫グロブリン に、ジサクシミジルスへレート（ＤＳＳ）により遊離第１級アミノ基（即ち、リ ジンε−アミノ基又はＮ−末端αアミノ基、モンテサノ等［１９８２］　Ｂｉｏ ｃｈｅｖ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　ｃｏａｍ、　１０９：　７−１３を 参照）を通して架橋することが出来る。
精製したｒＰ　Ｆ　４及びＩＳＡ（夫々ＩＯＢ及び１００ｍｇ）を室温で４時間 ２５ｍＭＤ　Ｓ　Ｓと共に培養した９反応をトリス緩衝液、ｐＨ８，０を最終濃 度１００−Ｍに添加して停止させた。生じる組成物はヘパリン結合活性を欠いて いるが、ＨＵＶＥＣ増殖を抑制する能力を保持している架橋した分子の不均一な 混合物であった。ＩＳＡがチトクロームＣに架橋している対照試料はＨＵＶＥＣ 成長を抑制しなかフた。
実施例１５−ＰＥＧ（７）ＰＦ４へのコンジュゲーションＰＦ４の半減基を延長 する別の方法は、ポリアミノ酸又はポリサッカライド（多糖類）等の重合体の１ 又はそれ以上のユニットに対するＰＦ４の共有結合によって達成できる。ポリア ミノ酸は例えばポリグルタメートであり得、一方ポリサッカライド（多糖類）は 例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
ＰＥＧは水溶性の非免疫原性の線状重合体であり、多くのよく定義された分子量 範囲で人手され得る（　２００〜２００００タールトシ）、ＰＥＧコンジュゲー トの劇的な分子量の増加は腎臓による蛋白質の糸球体濾過を有意義に減少させる 。またＰＥＧ重合体は蛋白質分解酵素及び免疫グロブリンによる攻撃に対し立体 的な障壁を与え、ここでも蛋白質の血漿中寿命を加えている。
ＰＥＧの活性化されたエステルは蛋白質上のりジンアミノ基と容易に結合される 。我々はｐＨＩＦＩｖｓアシル化（カトレ　Ｎ、Ｖ、、門、Ｊ、フナラフ、Ｗ、 Ｊ、ライルド　［１９８７］　Ｐｒｏｃ。
）ｌａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾８４：１４８７−１４９１）を、 ４個までの保護されていないリジンの存在下でのペプチドのＮ末端アミンの選択 的修飾に用いて成功している。ここに記載された教えを用いてｒＰＦ４−ＰＥＧ コンジュゲートの現在入手可能な試薬での合成は簡単である。
ＰＥＧはカトレ等（上記）により概略を示された手順の変法を用いて遊離アミノ 基によりｒＰＦ４に共有結合できる。
短くいうとＰＥＧ−グルタリル−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（分子量５００ ０、ポリサイエンスインコーホレイテッドＮ）がｐＨ９のＯ，１Ｍホウ酸ナトト リム中のｒＰＦ４に対し１００倍モル過剰で加えられる０反応は３７℃で４８時 閏進行される。このプロトコルを使用する実験は変化する程度のＰＥＧ添加でｒ Ｐ　Ｆ　４を精製した０反応の程度は５０５−ＰＡＧＥによって都合良くモニタ ーできる０反応生成物は、５０００分子量だけそれぞれ異なり、ｌ又はそれ以上 のＰＥＧ蜂飾修飾する種（スピーシーズ）をそれぞれ表わしている一連のバンド として明瞭にみることができる。
ＰＦ４のＣ末端の近くに位置する４つのりジン残基がＰＦ４末端のヘパリンへの 結合のために必須であることが示されている。これらの残基は表面の接近可能性 に基づいてＰＥＧ修飾の起りそうな場所であるからｒＰ　Ｆ　４−ＰＥＧ分子の サブポピユレーションがヘパリンに対する減少された親和性を有するものとして 合成される。ＰＦ４について観測される迅速なりリアランス（血液から尿へ単位 時閏あたり移行する量）の動力学についての一つの可能性ある機構（メカニズム ）は内皮細胞の表面上に存在するヘパリンサルフェートに対する結合である。従 って抗血管形成性を保持している減少したヘパリン結合を有する分子は、全身的 な効果に対し非常に有利である。結合反応生成物はヘパリンアガロース上でアフ ィニティークロマトグラフィーによって分画できる。異なる塩濃度で溶出する主 要な生成物は各プール中のＰＥＧ添加の範囲を測定するために５Ｏ５−ＰＡＧＥ によフて分析できる。所望により各塩フラクションをさらに他のクロマトグラフ ィ技術で分離して（ゲル濾過又は疎水性相互作用クロマトグラフィ）、定義され たＰＥＧ：　ｒＰ　Ｆ　４比を有する分子を分離することができる。
ｒＰＦ４コンジュゲートに対するヘパリン結合を保持することが望まれるときは 、コンジュゲーション工程はヘパリンの存在下で実施できる。ヘパリンの存在は ＰＦ４のヘパリン結合位置の修飾を防止し、なおヘパリンと結合するであろうコ ンジュゲートを生じる。
ＰＦ４を、毒素剤の活性を特定の細胞型に向ける標的化分子として使用すること が有益な場合がある０例えばＰＦ４は、毒素リシンＡ又はシイフチリア毒素に化 学的又は遺伝的に架橋することが出来る。
ＰＦ４及びリシンＡからなる融合蛋白質を原核生物宿主又は真核生物宿主中で組 替えによって造ることが出来る。生じる精製された毒素は内皮細胞、又は内皮細 胞に近接した細胞、例えば腫瘍細胞に高い特異性を有し得る。
別の方法としてＰＦ４及びリシンを架橋剤で結合することが出来る。ＤＳＳは、 ＰＦ４及びリシンＡの両方の活性を保有させたまま、ＰＦ４とりシンＡを架橋す ることが出来る。
ＰＦ４は光活性化可能な分子、例えばヘマトポルフィリン誘導体（ＨＰＤ）にも 架橋剤で共有結合出来る。水溶性のカルボジイミド（例えばＥＤＣ）はＰＦ４の アミノ基にＨＰＤの酸側鎖を連結するのに最も有用である。
生しる結合体は、内皮細胞に冨んだ場所、例えば充実性腫瘍に於いて濃縮し、そ して腫瘍の場所に直接焦点をあてた比較的毒性の無いレーザ又は光療法によって 活性化され得る。活性化されたＨＰＤは非特異的に近くの細胞を殺す活性の酸素 種を生じることが知られている。
実施例１７　ｒＰ　Ｆ　４のシスティン残基の修飾製造の閏、ｒＰ　Ｆ　４のジ スルフィドをジチオスレイトール（ＤＴＴ）によって遊離のスルフヒドリルに還 元するが、ヘパリン結合活性は保持される。ＰＦ４の生物活性を評価するために は、ＤＴＴの除去を必要とし、このことはジスルフィドの橋の再形成を許すこと によってこれらが活性に必須であるかどうかをわからなくする。
ｒＰ　Ｆ　４のスルフヒドリルをＤＴＴで予備還元し、続いてフルオレスセイン マレイミド（ＦＭ）で処理することによフて、特異的かつ非可逆的に修飾した。
還元され精製されたｒＰＦ４（炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８，５中−ｇ［ｓｃ Ｂ］）をｌ０ｍｇのＦＭで室温で３時閏処理した。残留するＦＭｔｔＳＣＢ中の ゲル濾過で除去し、次に同じ緩衝液で透析した。ＦＭ−ｒＰＦ４は部分的にヘパ リン結合活性を保有していた。ＣＡＭ中で試験したとき、モして内皮細胞増殖検 定で試験したときに、ＦＭ−ｒＰＦ４は抑制活性を示し、遊離のスルフヒドリル も正しいジスルフィド結合も何れもＰＦ４のアンギオスタチック活性に必要とさ れないことを示している。
このＦＭ修飾ｒＰ　Ｆ　４は別の内皮細胞標識又は抑制化合物としてのある有用 性を有するかもしれないが、最も重要なことは、ＰＦ４のシスティン残基がＰＦ ４を診断又は治療用途の為に他の分子にコンジュゲート又は架橋する為の適当な 標的でもあることをこれが示していることである。
本明細書に記載された実施例及び具体例は説明の目的のみのものであり、これに 鑑みて種々の変更及び修正が当業者に示唆され、本出願のそして特許請求の範囲 の精神及び範囲内に含まれるべきである。
φ＋ 腫渇容ｔ（姑仰り ＦＩＴＣ−ｒＨｕＰＦ−４壇＃　、　ｍｃｇ／ｍ１ＦＩＴＣ−ｒ　ＰＦ−４−２ ４１（ｕＭ　）、、、ｗｌ、、Ａ、、１．Ｉｌ−、ＰＣＴ／ＬＩＳ　９２１０５ ９０３国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　４７／４８　 Ｚ　７４３３−４ＣＣＯ７Ｋ　７１０８　８３１８−４Ｈ ７／１０　８３１８−４Ｈ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｃ８２１４−４Ｂ／／　Ｃ１２Ｎ　１／２１　７２３６ −４８１５／１２　ＺＮＡ （Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：１９） （Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：１９） Ｉ

Claims (31)

    【特許請求の範囲】
  1. １．（ａ）ＰＦ４を含んでいるか、又はＰＦ４のカルボキシ末端の少なくとも１ ３個のアミノ酸を含むＰＦ４断片を含んでいる、アンギオスタチックな活性又は 抗増殖活性を有している第一物質と、 （ｂ）該第一物質とコンジュゲートを形成する第二物質とを含んでいる、 実質的に純粋なポリペプチドのコンジュゲートであって、アンギオスタチックな 活性又は抗増殖活性を保持しているがヘパリンには結合しないコンジュゲート。
  2. ２．該第二物質がフルオレスセイン−イソチオシアネートを含むか又は該第一物 質をフルオレスセイン−イソチオシアネートで処理した生成物である請求項１に 記載のポリペプチドコンジュゲート。
  3. ３．該第二物質が発螢光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）である請求項１に記載の ポリペプチドコンジュゲート。
  4. ４．該第二物質が毒素である請求項１に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  5. ５．該毒素がジフテリア毒素又はリシンＡである請求項４に記載のポリペプチド コンジュゲート。
  6. ６．該第二物質が抗体である請求項１に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  7. ７．該第二物質がキャリア蛋白質である請求項１に記載のポリペプチドコンジュ ゲート。
  8. ８．該キャリア蛋白質が人血清アルブミンである請求項７に記載のポリペプチド コンジュゲート。
  9. ９．該第二物質がキレーターである請求項１に記載のポリペプチドコンジュゲー ト。
  10. １０．該第二物質が細胞レセプター分子又はその相補的リガンドである請求項１ に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  11. １１．該第二物質が非蛋白質性生物エフェクター分子である請求項１に記載のポ リペプチドコンジュゲート。
  12. １２．該第二物質が嵩高い疎水性部分である請求項１に記載のポリペプチドコン ジュゲート。
  13. １３．該第二物質が、該第一物質のカルボキシ末端近くに位置するリジン残基の 一方又は両方の対の修飾を通じて、該第一物質と連係している請求項１に記載の ポリペプチドコンジュゲート。
  14. １４．該第二物質が光活性化可能な分子である請求項１に記載のポリペプチドコ ンジュゲート。
  15. １５．該光活性化可能な分子がヘマトポルフィリン誘導体である請求項１４に記 載のポリペプチドコンジュゲート。
  16. １６．該第二物質がポリアミノ酸又はポリサッカライド（多糖類）である請求項 １に記載のポリペプチドコンジュゲート。
  17. １７．該第二物質がポリエチレングリコールである請求項１６に記載のポリペプ チドコンジュゲート。
  18. １８．（ａ）ＰＦ４、Ｃ−１３、及びＣ−４１からなる群から選択される第一物 質、 （ｂ）モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、フルオロレスセイン−イソチ オシアネート、発螢光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）、毒素、細胞レセプター分 子、非蛋白質性生物エフェクター分子、キレーター、ポリアミノ酸、ポリサッカ ライド（多糖類）、及びキャリア蛋白質からなる群から選ばれ、該第一物質とコ ンジュゲートを形成する第二物質、 を含んでいる、請求項１に記載の実質的に純粋なポリペプチドコンジュゲート。
  19. １９．（ａ）次のアミノ酸配列 【配列があります】 の変形を含んでおり、ＰＦ４の特徴的なアンギオスタチックな又は抗増殖性質を 有している第一物質と、（ｈ）該第一物質とコンジュゲートを形成する第二物質 とを含む、 実質的に純粋なポリペプチドコンジュゲート。
  20. ２０．該第一物質が、 （ａ）【配列があります】、 （ｂ）【配列があります】、 （ｃ）【配列があります】、及び （ｄ）【配列があります】 からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載のポリペプチ ドコンジュゲート。
  21. ２１．（ａ）ＰＦ４を含んでいるか、又はＰＦ４のカルボキシ末端の少なくとも １３個のアミノ酸を含むＰＦ４断片を含んでいる、アンギオスタチックな活性又 は抗増殖活性を有している第一物質、及び （ｂ）該第一物質とコンジュゲートを形成する第二物質、 を含んでおり、アンギオスタチックな活性又は抗増殖活性を保持しているがヘパ リンには結合しない、ポリペプチドのコンジュゲートを含む組成物の有効量を投 与することからなる、内皮細胞増殖を抑制する方法。
  22. ２２．該第一物質がＰＦ４、Ｃ−４１、及びＣ−１３からなる群から選択される 請求項２１に記載の方法。
  23. ２３．（ａ）ＰＦ４を含んでいるか、又はＰＦ４のカルボキシ末端の少なくとも １３個のアミノ酸を含むＰＦ４断片を含んでいる、アンギオスタチックな活性又 は抗増殖活性を有している第一物質、及び （ｂ）該第一物質とコンジュゲートを形成する第二物質、 を含んでおり、アンギオスタチックな活性又は抗増殖活性を保持しているがヘパ リンには結合しない、実質的に純粋なポリペプチドのコンジュゲートを投与する ことからなる、ＰＦ４が相互作用をする場所に毒素を配達する方法。
  24. ２４．該第一物質がＰＦ４、Ｃ−４１、及び、Ｃ−１３からなる群から選択され る請求項２３に記載の方法。
  25. ２５．（ａ）配列【配列があります】 の変形を含み、ＰＦ４に特徴的なアンギオスタチックな活性又は抗増殖活性を有 している第一物質、及び、（ｂ）該第一物質とコンジュゲートを形成する第二物 質、 を含んでおり、アンギオスタチックな活性又は抗増殖活性を保持しているがヘパ リンには結合しない、ポリペプチドのコンジュゲートを含む組成物の有効量を投 与することがらなる、内皮細胞増殖を抑制する方法。
  26. ２６．該第一物質が、 （ａ）【配列があります】、 （ｂ）【配列があります】、 （ｃ）【配列があります】、及び （ｄ）【配列があります】 からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の方法。
  27. ２７．（ａ）配列【配列があります】 の変形を含み、ＰＦ４に特徴的なアンギオスタチックな活性又は抗増殖活性を有 している第一物質、及び、（ｂ）該第一物質とコンジュゲートを形成する第二物 質、 を含んでおり、アンギオスタチックな活性又は抗増殖活性を保持しているカーヘ パリンには結合しない、実質的に純粋なポリペプチドのコンジュゲートを投与す ることからなる、ＰＦ４と相互作用する場所に毒素を配達する方法。
  28. ２８．該第一物質が、 （ａ）【配列があります】、 （ｂ）【配列があります】、 （ｃ）【配列があります】、及び （ｄ）【配列があります】 がらなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の方法。
  29. ２９．（ａ）配列【配列があります】 の変形を含み、ＰＦ４に特徴的なアンギオスタチックな活性又は抗増殖活性を有 している第一物質、及び（ｂ）該第一物質とアンギオスタチックな活性又は抗増 殖活性を保持しているがヘパリンには結合しないコンジュゲートを形成する第二 物質、 を含んでいる、ポリペプチドコンジュゲート、及び（ｃ）適当な製剤担体、 を含んでいる組成物からなる、血管形成病処置用製剤組成物。
  30. ３０．（ａ）ＰＦ４を含んでいるか、又はＰＦ４のカルボキシ末端の少なくとも １３個のアミノ酸を含むＰＦ４断片を含んでいる、アンギオスタチックな活性又 は抗増殖活性を有している第一物質、及び （ｂ）アンギオスタチックな活性又は抗増殖活性を保持しているがヘパリンには 結合しないコンジュゲートを該第一物質と形成する第二物質、 を含んでいる、実質的に純粋なポリペプチドコンジュゲート、及び （ｃ）適当な製薬担体、 を含んでいる、血管形成病処置用製剤組成物。
  31. ３１．次の式のハイブリッドポリペプチド：【配列があります】 〔式中 （ａ）ＡはＰＦ４の残基１〜５７からなるポリペプチド配列の全部又は一部を表 し、Ａは該ハイブリッドポリペプチド上に存在してもしなくてもよく、 （ｂ）Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥは任意のアミノ酸であり得、そして （ｃ）Ｆ、Ｇ、Ｈ及びＩはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、フルオレ スセイン−イソテオシアネート、発螢光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）、毒素、 細胞レセプター分子、非蛋白質性生物エフェクター分子、ポリアミノ酸、ポリサ ッカライド（多糖類）、キレーターからなる群から選ばれ、Ｆ、Ｇ、Ｈ及びＩと 命名した部分の少なくとも一つは該ハイブリッドポリペプチド上に存在しなけれ ばならない〕。
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