JPH06509178A - 遺伝子奇形の出生前診断のための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （７）染色体特異性のＤＮＡゾンデを用いる蛍光インサイチュハイブリダイゼー ションによる胎児染色体障害の検出を特徴とする、上記各請求の範囲のいずれか の方法。

（８）胎児細胞数の予備富化を、三重フィコール勾配法により行うことを特徴と する。上記各請求の範囲のいずれかの方法。

（９）標識された胎児細胞の敷の富化を、磁気的に活性かされたセルソータ（Ｍ ＡＣ３）によって行うことを特徴とする、上記各請求の範囲のいずれかの方法。

性が上記影響に基づいて約１％上昇することが示Ａれ遺伝子奇形の出生前診断の ための方法 本発明は遺伝子奇形の出生前診断のための方法に関する。

フランス特許ＦＲ２６５７１６７から、非診断的スクリーニング法が公知であり 、この方法ではスクリーニング検査のために母体の血清のみを用いている。その ようにして年齢的に制約されたダウン性疾患の危険を計算により修正することは できるが、但しその際これらの検査によってはダウン症候群の相対的危険性だけ しか評価できない。

また、遺伝性奇形を出生前に診断することは既に約２０年前から可能であった。

妊娠の間に子供の組織を吸引生検するための現在利用できる方法は羊水穿刺及び いわゆる絨毛膜絨毛生検である。絨毛膜絨毛生検は既に８妊娠週以降に、そして 羊水穿刺は１４妊娠週以降に行うことができる。しかしながらこのような従来の 方法の侵入性は、胎児に影響する危険性（例えば流産や負傷）のみならず、妊婦 にも影響をもたらす危険性（例えば妊婦の炎症）があることを伴う。無作為的な 照合群の検査によって、多くの人がより安全な吸引法と認めている羊水穿刺によ ってさえ自然流産の危険た（Ｈｏｌｔｇｒｅｖｅ　Ｌ、ＭｉａｙＰ、：５ｅＬｏ ｉｎ　Ｐｅｒｉｏａｊａ！”！３．２６０　（１９８９）　ｒ胎児疾病の遺伝的 眺望」〕。従って現在、自然に生ずるいわゆる子供のトリソミー（染色体数過剰 ）についての検査は、例えば母親の高齢のような比較的危険性の高い母親におい てのみ行われている。ドイツでは侵入的処置は３６オ以降の妊婦において初めて 行われ、と言うのは侵害の危険性が通常は相対的に若い妊婦における子供のトリ ソミーの自然発生の確率よりも高いからである。そのため、かなり以前から、出 生前診断のための侵入性の少ない方法を開発することについて強い動機があった 。過去においてこのような希望を実現するために多くの研究が行われたけれども 、これまで研究された方法はいずれも成功を収めていない。

推測するに、妊娠の経過とともに胎児−妊婦間の輸液の結果として母体循環に僅 がばかり子供の細胞が到達するものと考えられる。妊婦の血液の中の胎児の核保 有細胞の母体の核保有細胞に対する割合は極端に少なくて、現在、約１０９個当 り１個ないしＩＱ！１個当り１個と評価されている［Ｈｏｌ！ｇ＋ｅｖｅ　ｗ、 、　Ｇ！５ｃｈｉｒ＋−Ａｂｌｅｒｌ　Ｄ、　Ｂｕｒｓｃｂｋ７　Ｍ等：　”　 Ｌａｎｃｅｔ”　３３５．１２２０（１９９０）　ｒ　Ｐ　ＣＲによる妊婦の血 の中の胎児ＤＮＡの検出」〕。胎児細胞のこのような高い希釈度のためにこれま では、予め富化することなしには母体血液から再現性をもって胎児の遺伝物質を 検出することはできなかった（ｌ（ｏｌＢ＋ｅｖｅ　Ｗ、、　Ｇａｒｒｉｔｓｅ ｎ　Ｈ５Ｎ、、　Ｇｊｓｅｈｉｒｌ−＾ｈｌｅ＋＋　Ｄ　：　”　Ｊ、　Ｒｅｐ ｒｏｄ、　Ｍｅｄ、”　３７（５）、　４１０　（１９９２）　；「妊婦循環の 中の胎児の細胞」−未だ刊行されていない〕。

これら胎児の細胞を母体循環から分離することが可能になったとすれば簡単な血 液採取によって出生前診断へのアプローチが可能となるであろう。これによって 、従来の侵入に伴う母体及び胎児に対する危険性がなくなるであろう。更に、血 液採取は今日通常的である羊水穿刺や絨毛膜絨毛生検に比して著しく費用の現象 を意味する。羊水穿刺はそのために特に訓練された婦人科医によってしか行われ ず、そして比較的最近の絨毛膜絨毛生検は、現在ドイツにおいて特にそれに対応 できる僅かなセンターでしか提供されない。有核細胞はすべて全遺伝子情報を含 んでいるので、胎児の血液細胞から、母体血液より分離することができた後で。

従来の胎児細胞の吸引法によると同様にそれらの遺伝子変体を検出することがで きる。

本発明は遺伝子奇形を出生前に検出することを課題とするものである。

この課題の解決手段は、下記の各段階、すなわちａ）多重比重勾配法により母体 の完全血から胎児の細胞の数を予備富化する段階、 ｂ）胎児の細胞を成るモノクローナル抗体で標識し、及び／又は母体の細胞を磁 気ビーズの含まれた対応する特異性抗体で標識し、そして磁気的分離により、そ の標識された胎児の細胞数を富化させるか、又は母体細胞数を枯渇させる段階、 及びＣ）分子遺伝子検出法により胎児の遺伝子に基づく奇形を検出する段階 の組み合わせよりなる。

すなわち胎児細胞の濃縮はその富化によるか、又は母体細胞の枯渇によって行う ことができる。

有利には胎児の細胞をトランスフェリン受容体に対するモノクローナル抗体で標 識することができる。

好ましくは胎児細胞として、有核赤血球の数を富化させ、そしてモノクローナル 抗体として”抗−ＣＤ７１　”を使用する。

胎児細胞としてはまた、栄養胞の数を富化させるか又は、本発明のもう１つの提 案に従い、リンパ細胞（リンパ球）の数を富化させることができる。

遺伝に基づく胎児奇形の検出は好ましくは染色体特異性ＤＮＡゾンデを用いる蛍 光インサイチニハイブリダイゼーション（Ｆｌｕｏｒｅｓｚｅｎ！ｉｎ　ｓｉ＋ ｕ　Ｈ７ｂ＋ｉｄｉｓｉｅｒ−ｕｎｇ）による胎児染色体障害の検出として行わ れる。

母体完全血からの胎児細胞の数の予備富化は良好な結果が得られた三重フィコー ル勾配法により行うことができる。けれども、例えば三重パーコール勾配法のよ うな他の三重又は四重の勾配法の使用も考λることができる。

磁気的に活性化されるセルソータ（ＭＡＣＳ）による標識された胎児細胞数の富 化は良好な結果をもたらし、かつ経費的に有利である。しかしながらこれは、そ れに代えて例えばいわゆる「ダイナビーズ」を用いても行うことができるが、こ の場合は開放した試薬用容器及びこの試薬用容器の外部に取りつけられた磁石を 用いて作業する。

胎児の血液の細胞構成の研究により、比較的早期の発育段階（２０妊娠週齢まで ）における有核赤血球が胎児循環の中の有核細胞の主要部分を占めることが示さ れている。妊娠のより後の段階において初めて白血球（リンパ球）の数が上昇す る。これは、妊娠中に異なった器官の種々の発育段階において起こる胎児の血液 形成の特殊な個体発生に基づくものである。

出生前診断は、対象となる妊娠中絶のためにはできるだけ早期に行うべきである ので、出生前診断法の開発のためには有核赤血球の分離が最も見込みがあると考 えられる。

正零の成人の血液は有核のものではな（て、無核の赤血球のみを含み、従って有 核赤血球は胎児血液に特有であることも知られている（ＨｏｌＩｇｒｅｖｅ　Ｗ 、、Ｇａｒｒｉｌｓｅｎ　Ｈ２Ｎ、ＧＩｎｓｈｉｒ＋−ＡｈｌｅＮ　Ｄ　：　” 　Ｊ、　Ｒｅｐｒｏｄ。

Ｍｅｄ、”　３７．４１０　（１９９２）　；　ｒ妊婦の循環の中の胎児細胞」 〕。

比較的最近になって、胎児の完全血から２段階勾配法を用いることによって重積 の白血球を有核赤血球と分離できる方法の一つが公表された［ＢｈＮ　ＭＭ、、 Ｂｉｅｂｅｔ　Ｍ、、Ｔｅｎｇ　ＮＮＨ：”Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ、　Ｍｅｓｈ、” 　１３１．１４７（１９９０）　、ｒ人の胎児のリンパ球を有核赤血球と分離す る一段階法」〕。この方法を変法して、本発明では母体血液から有核赤血球数を 予備濃縮するために、効果的な三重勾配法を用いる。この場合、完全血の遠心分 離の後に、フィコールよりなる三重勾配液によって３つの明瞭な細胞層が生じ、 これらのうち、中央の細胞層が有核赤血球を含んでいる。本発明者等は、これら の細胞の数を富化させるにはこれらの細胞の数が遠心分離前の完全血の中で希薄 であればあるほど効果的であることを確認することができた。

赤血球の有核前駆細胞を含む成人の骨髄細胞についての研究から、これらが細胞 膜の上に、いわゆるトランスフェリン受容体を発現することが明かになった［Ｈ ｏｒ＋ｏｎ　ＭＡ　：ＥＸＰ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、”　１４４．３６１　（１ ９８３）　；「赤血球成熟の間におけるトランスフェリン受容体の発現」〕。こ のトランスフェリン受容体は細胞内への鉄の移送を司る膜蛋白質であり、そして これは特殊なモノクローナル抗体（抗−ＣＤ　７１）を用いて検出することがで きる。細胞混合物から抗体で標識された細胞の数を富化するための従来法の１つ は、蛍光で活性化されるセルソータ（ＦＡＣＳ）４使用するものである。

ここでは抗体による槽重に加えて、細胞を蛍光染料で標識する。このＦＡＣＳ装 置は蛍光放射している細胞を標識されていない細胞と区別することができ、そし て互いに分離することができる。この方法を用いて比較的最近、母体血液から胎 児細胞の数を富化させることに成功した［Ｂｉａｎｃｈｉ　Ｄｌ、、Ｆｌｉｎｔ 　ＡＲ，、ＰｉｚｚｉｓｅｎｔｉＭＦ、等：　”ＰＮＡＳ”虹、　３２７９　ｆ １９９０）；　ｒ妊婦血液中の有核赤血球からの胎児ＤＮＡの分離Ｊ　、Ｐｒ１ ｃｅ　ＪＯ，。

Ｅｌｉａｓ　Ｓ、、Ｗａｃｈｔａｌ　ＳＳ：　”Ａｍ、　Ｊ、　０ｂｓｔｅｔ　 Ｇｙｎｅｃｏｌ”出、　１７３１　（１９９１１；　ｒ多重パラメータ流動サイ トメトリーによる妊婦血液から分離された胎児細胞を用いる出生前診断Ｊ１．い ずれにしてもＦＡＣ３装置は非常に高価であり（約８００．０００　ドイツマル ク）、そしてそれにスペシャリストとして長年月訓練された共同作業者によって しか取り扱うことができない。

このような著しい経済的及び人件的な要求条件により、ＦＡＣ３装置を出生前診 断的ルチーン検査において使用することには著しい不利が伴うであろうから、本 発明によれば、比較的最近開発された磁気的に活性化されるセルソータ［Ｍｉｌ ｔｅｎｙｉ　Ａ、　、　Ｍｕｅｌｌｅｒ　Ｗ、、Ｗｅｉｃｈｅｌ　Ａ、：　Ｃｙ ｔｏｍａｔｒｙ″　１１．　２３１　［１９９０１；　ｒＭＡＣ８による高勾配 の磁気的な細胞分離」１により抗体で標識された細胞の数を富化させることが提 案される。

この方法においては、抗体で標識された細胞に追加的に磁気ビーズを担持させる 。ＭＡＣＳは強い磁石よりなり、その磁場の中へ鋼鉄ウールで満たされた注射器 を導入する。これを用いて、抗体及びビーズで槽重した後で、その細胞混合物を 加え、そして磁気ビーズを担持していないマイナス細胞を洗い流し、一方プラス 細胞のフラクションはその鋼鉄ウールの上に付着したままにとどまる０次にその 注射器を磁場から取り出してその標識された細胞の含まれているプラスのフラク ションをすすぎ出す、磁気的に活性化されるセルソータの使用は、これが非常に 取り扱いが簡単であり、かつその購入費用（約１０．０００　ドイツマルク）が ＦＡＣ８ＡＣ８装置をはるかに下回ると言う利点をもたらす。

数の富化された細胞が胎児由来のものであることの検出のためには蛍光インサイ チュハイブリダイゼーションを用いた。この方法によれば、成る１つの染色体に 特異的な蛍光標識された遺伝子ゾンデが対象物支持体の上で、固定された核のＤ ＮＡとハイブリダイゼーションされる。このＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーシ ョンの特異性がそれらＤＮＡの含まれた核の中の遺伝子の特定的な検出を許容す る。蛍光顕微鏡の下で、それら核の中で明瞭に蛍光発生する信号によってハイブ リダイゼーションの起ったことを認識できる。正常な人の１組の染色体において は、常染色体（無性染色体）の成る染色体特異性プローブによってそれら核の中 に２つの異なった信号を認めることができる。過剰数の染色体を有する（異倍数 性）変体染色体の組の場合にはこの方法によって染色体特異性の遺伝子ゾンデに より３つの信号を検出することができる０本発明者等は蛍光インサイチュハイブ リダイゼーションを、妊婦の血液から胎児細胞の数を富化させた後、異倍数性の 検出のために用いた。

最もしばしば起こる遺伝子過誤形成の原因は異倍数性であり、従って妊娠におけ るこのような奇形の診断には大きな意義があるので、この方法が選ばれた。特に 重要なのは染色体１３　、１８　及び２１のトリソミー並びに染色体Ｘ及びＹの 異倍数性の検出である。これらは、いずれにしても３つの全ての場合において重 大な障害を含む胎児の出産に導くことのある固有のトリソミーである。従って、 母体の血液から胎児組織を吸引生検するための危険の少ない方法は、このような 最もしばしば現われる遺伝子病のスクリーニングを若い婦人の場合にも可能にす るであろうと考えられる。

以下、本発明を１実施例について表及び図面とともに説明する。

第１表には、妊娠の経過、試料採取及びその結果をあげる。

第２表は有核赤血球の数の富化の評価を示す。

第３表は母体血液からの細胞の中のハイブリダイゼーション信号の表である。

第１図は３つの信号を含む細胞の％割合を示す。

第２図は細胞鎌別計数の図表である。

血液試料 ヘパリン添加した４０１の完全血を９人の妊婦から採血した。これらの妊婦の３ 人はトリソミー１８を含む胎児を懐胎した（第１表）。

対照のために、追加的に４人の正常な新生児とトリソミー１８を含んだ１人の新 生児との、ヘパリン添加した肩帯血液各Ｌｏａｆずつを調べた。謄帯ｒｋＬｅは 常に胎児由来のものである。

対照群として３人の妊娠していない婦人と３人の男性との、それぞれ４０１ずつ の血液を検査した。

この血液は処理以前に１２時間以上経過していてはならなかった。

別に三重勾配法の有効性を測定するために成熟血液の中で慶帯血液を一連の試料 において有核細胞の比率が１：１０から１　：　５０，０００　まで低下するよ うに希釈し、そして次に三重勾配法を各個別の希釈度で実施した。

１三重ｍ ヘパリン添加した完全血各２１をそれぞれ４１のＰＢＳ緩衝液（蒸留水１．００ ０　ｍｌ　当りＮｉＣ１８，４２ｇ、ＫＣＩ　Ｏ，２ｇ　、　ＫＨ，Ｐｏ、　０ ．２９９　ｇ、ＮａＨＰｏ、　０．９２　ｇ　）　と混合し、そして１２０１１ 容量の遠心分離用管の中に入れた。長いカニユーレを用いて注意深く、下記の密 度のＦｉｃｏｌｌ−旧５ｔｏｐａｑｕｅ　（ミュンヘンのＳｉｇｍａ社）、すな わちＦｉｃｏｌｌ−ＨｉｓＬｏｐａｑｕｅ　１０７７、同！１１０及び間１１１ ９をそれぞれ２　ｍｌ　ずつ順に下方へ成層させる。密度＋１１０　ｆ７）フィ コールを、両方ともミュンヘンのＳ　ｒ　ｇｍａ社から入手できる密度１０７７ 及び１１１９の対応する部分量と混合する。これらの勾配液を５５０　Ｇにおい て３０分間遠心分屋する。このようにした後で、その透明な上澄液の中に下記の ３つの異なった細胞層を見出すことができる： Ｏリン３球及び単球類を含む上層 Ｏ有核赤血球を含む中間帯 Ｏ好中性顆粒球を含む下帯 妊婦からの血液の場合には、細胞数富化された細胞の数は目で見ることができな い程に僅かであるが、その位置は異なった密度の両方のフィコール層の移行部に おいて良好に認識できる。遠心分離用管の底に、無核の赤血球の厚い赤色の縁部 が見出される。それらフィコール層の上方に血清を含む黄色の層が存在する。

１０ｍ１の注射器及び０．９Ｘ　１２０　のＴＳＫ　５ｕｂｒａ　１回カニユー レ（ガイスリンゲンのＥｈｒｈａｒｄｔ社）を用いて血清、上層、中間層及び下 層を勾配装置から取り出す、無核の赤血球を含む下層の細胞層は捨てる。数冨化 された有核赤血球を含む中間層に５　ｍｌのＰＢＳ緩衝液を加えてＰＢＳ緩衝液 で３回洗浄し、すなわち５５０Ｇにおいてそれぞれ８分間遠心分離し、そしてそ の細胞ペレットにあらためてＰＢＳ緩衝液を加える。

次にこの細胞懸濁液を約２１１に濃縮し、１００μｌを取り出し、そして血球遠 心分離器（フランクフルトの５ｈａｎｄｏｎ社）の中で５００　Ｇ　において対 象物載せガラスの上で５分間遠心分離する。この対象物載せガラスの上で各血液 細胞は鑑別的にＤｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ染色溶液（スイス国Ｄｕｅｄｉｎｇｅｎ　 のＭｅｒｚ＋Ｄａｄｅ　社）で染色する。この染色によって各異なった血液細胞 を互いに顕微鏡で区別することができる。このようにして、この勾配液による分 離の後で各１００　個の細胞を計数して中間の細胞層の中の有核赤血球の数の富 化の行われたことを調べることができる。

扱ｊ」組立 トーマチャンバーの中で三重勾配法により中間層の細胞数をめた。

線帯血液を用いた場合にこの数を富化させた細胞懸濁液の１部分量を抗体標識の ために用いたが、これは１０’個の細胞数に相当した。

これらの細胞を２００　Ｇ　において１０分間遠心分離し、そしてそのペレット を、１０％　の血清が含まれている　５０ｕｌのＰＢＳ緩衝液の中に取り込んだ 。この血清を三重勾配法の後で取り出し、そして使用の前に５６℃において４５ 分間インキュベーションする。この血清を抗体インキュベーションにおいて用い ることにより単球の非特異的標識が防止される。

この細胞懸濁液５０μｌに５０μｍの「抗−ＣＤ７１　Ｊ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉ ｃｋｅｎｓｏｎ）を加え、そしてこの混合物を８℃において　１０分間インキュ ベーションする０次にこれに２０ＬＬＬのラット−抗−マウスＩｇＧ　２（ａ＋ ｂｌの磁気的マイクロビーズ（ベルギーのグラ−ドパツバのＭｉｌｔｅｎｙｉ　 Ｂｉｏｔｅｃｈ　社）を加え、そしてこの混合物を８℃において更に　１５分間 インキュベーションする。

遠心分Ｍ　（２００Ｇ　、　１０　分間）の後、その上澄液を取り出してその細 胞を　５００ＬＬｌのＰＢＳｌｏ、５％ＢＳＡ（牛血清アルブミン、プクスのＦ ｌｕｋａ　社）の中に再び懸濁させる。

鋼鉄ウールで満たされ、そして約１０７　個の細胞の分離に適しているＭｉｌｅ ｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　社のＡ２カラムを細胞分離のために次のように予備処 理する・すなわちこのカラムの下端に３万弁を連結し、そしてその側方入口に７ ０％濃度のエタノールを満たした　１０　ｍｌ容量の注射器を取り付ける。この エタノールをその液面がこの人２カラムの上縁に到達してしまうまで圧入する。

３方弁を閉じ、そして上方から、蒸留水の入った１００　ｍｌ容量のねじ付き注 射器をこのカラムの上にねじ込む、このカラムから下方へ流下させることができ るように３方弁を開放し、そして蒸留水でよくすすぐ０次にこのカラムをＰＢＳ ｌｏ、５％ＢＳＡでよくすすぎ、そして弁の適正時期における閉鎖によって、鋼 鉄ウールの上方に約１　ｃｒａの緩衝液が存在するようにこのＰＢＳ／ＢＳＡ混 合液をカラムの中に保持する。

この処理によってこのカラムを気泡が含まれないようにＰ　Ｂ　Ｓ／Ｂ　Ｓ　Ａ 緩衝液で充填することができる。気泡の存在は後での細胞の鋼鉄ウールへの結合 を妨げるであろう、非特異的結合を防止するために、カラムがＢＳＡで飽和され るようにこのＰＢＳ／ＢＳＡの混合液をカラムの中に３０分間保っておかなけれ ばならない。

細胞の分離に先立ってこのカラムを磁石に固定し、そして３方弁の開放によって 液面が鋼鉄ウールの僅か上方へ来るまで緩衝液を流し出す、抗体染色の後で上方 から５００ＬＬ１の細胞懸濁液をピペットでこのカラムの上に注入し、そして弁 を液面の上縁が再び鋼鉄つ−ルに達してしまうまで開放する０次にそれぞれ５０ ０μｍのＰＢＳｌｏ、５％ＢＳＡの６つのフラクションを加えてカラムをこれで 洗浄する。このマイナスフラクションを２４　Ｇの太さの針で溶離させ、そして 遠心分離用管の中に捕集する。次に３万弁を閉じ、そしてこのカラムを磁石から 取りはずす、弁の下の側方にＰＢＳｌｏ、５％ＢＳＡを含む注射器を固定する。

この弁を開放した後で緩衝液を注射器により細胞懸濁液がカラムの上縁に達する までカラムの中へ圧入する。３方弁を閉じた後でこれを再び磁石に固定し、そし て２２　Ｇの太さの針を下方に取り付ける０次にこのカラムをもう一度それぞれ ５００μｌのＰＢＳｌｏ、５％ＢＳＡで６回溶離させ、このフラクションを洗浄 フラクションとして集める。３方弁を閉じた後でこの弁を磁石から取りはずし、 上縁までＰＢＳｌｏ、５％ＢＳＡ緩衝液で満たし、そして上方に同様に３　＋ｍ ｌのＰＢＳｌｏ、５％ＢＳＡ緩衝液で満たされた注射器を取り付ける。針を取り 除いた後でその注射器への圧力によって「プラスフラクション」を下方へすすぎ 出す。

これら３つの、「マイナス」、「洗浄」及び「プラス」のフラクションから細胞 数測定及び細胞遠心分離のためにいくつかの部分量を取り出した。細胞遠心分離 に引き続いて対象物載せガラスを鑑別的に着色し、そして富化が行われたことを 検査するために調帯血液においてそれぞれ１００　個の血液細胞を計数する。妊 婦の血液の場合には全細胞スピンの全ての細胞を計数した。

ＬＬｕサイチュハイプリダイゼーション磁気的な細胞分離のプラスフラクション を中間期の核の分離のために２００　Ｇ　において１０分間遠心分離し、そのベ レットを７５　ｍＭ　のＫＣＩ　の５１１の中に再懸濁させて３７℃において　 １０分間インキュベーションする。遠心針Ｍ　（１５０Ｇ、　１０分間）の徒、 細胞ベレットを注意深く５１のメタノール／酢酸（容積比３：１）の６１１の中 に再び懸濁させ、そして　２００　Ｇにおいて　１０分間遠心分離した。このベ レットをメタノール／酢酸の戻り流の中に再循環させ、そしてガラス製滅菌ピペ ットで対象物載せガラスの上に滴下した。

引き続く、染色体１８に対して特異性のＤＮＡゾンデによる蛍光インサイチュハ イブリダイゼーションは０ｎＣＯｒ社（米国Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ　）のキ ットを用いてこのメーカーの指示に従って行なった。

それぞれの核をインサイチュハイブリダイゼーションの後でＺｅｉｓｓ　社の蛍 光顕微鏡の下で評価し、そしてＫｏｄａｋ　Ｅｅｔａｃｈｒｏ＊　６４　ＡＳＡ フィルムを用いて撮影した。

■ 三重勾配法及び７つの調帯血液試料のＭＡＣ３の後の鑑別的細胞計数の結果は第 ２表に示しである。両方法を組み合わせて使用したことによる強い富化を明かに 認めることができる。三重勾配法の分離効率は完全血試料の中の有核赤血球の数 が減少すると大きく上昇する。このことは、成人血液中での調帯血液の一連の希 釈シリーズを用いた三重勾配法の研究において証明することができた（第２表） 。また、妊婦血液の分離に際して三重勾配法の効率が著しく高く、そしてこれが 調帯血液からの富化に際して当てはまると言うことより出発することもできる。

第１表に９人の妊婦の血液から両方の分離方法の組み合わせによって分離するこ とのできた有核赤血球の数をあげる。

３つの男性対照群血液試料及び３つの非妊娠婦人血液試料の分離の後で、全く有 核赤血球は検出できなかった。

調べた３つの妊娠状態において胎児の公知のトリソミ−１８（第１表）の場合に 細胞分離に引き続き蛍光インサイチュハイブリダイゼーションを染色体１８に特 異的なりＮＡゾンデを用いて行った。３つの全部の場合において３つの信号を有 する細胞の％割合は対照群に比して著しく高かった（第３表）。３つの信号を有 する細胞の割合はトリソミ−１８を含む場合においてそれぞれ　１２％及び１４ ％であった。正常な新生児の４つの血液試料においてはトリソミー細胞のＦＩＳ Ｈによる平均％割合は２．５％であった。第１図は３つの妊娠状態からの、及び ４つの調帯血液対照群からのこのようなデータを示す。

両方の分布曲線はまった（重なりを示さず、そしてその差は極めて大きい。患者 ３の場合に、本発明者等はトリソミ−１８を有する胎児から子宮内で得られた調 帯血液を調べ、そして細胞の７０％が３つの信号を有することを見出した。

禮 ７さ ％ω画町９↓葦橡誉訃ωＣ８ 憇 Ｑ 的 く Σ 曹ｂ ○關 ミ男 棚ｇ？ 署網四 〇　虫１１囮 −Ｅｌ−Ｉ！！！ｎ回 壜 ％■窮耶″！Ｊｚ城 フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、ＡＵ、ＣＡ、ＪＰ、ＵＳ（７２）発明者　アーレルト　ドロチードイツ　デー ・４８１４９　ミュシスター　シエツビンゲンヴエーク　８ （７２）発明者　ホルッグレーフェ　ヴオルフガングドイツ　デー・４８１４９ 　ミュンスター　ヘートヴイヒシュトラーセ　５ （７２）発明者　ガリツェン　ヘントリクス　シュテファヌス　パウルス ドイツ　デー・４８１４９　ミュンスター　ザーテユルナー　シュトラーセ　１ ３

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の各段階、すなわち ８）多重比重勾配法により母体の完全血から胎児の細胞の数を予備富化する段階 、 ｂ）胎児の細胞を或るモノクローナル抗体で標識し、及び／又は母体の細胞を、 磁気ビーズを含む対応した特異性抗体で標識し、そして磁気的分離により、標識 された胎児細胞数を富化させるか、又は母体細胞数を枯渇させる段階、及び ｃ）分子遺伝子検出法により胎児の遺伝子に基づく奇形を検出する段階 の組み合わせを含む、遺伝子奇形の出生前診断方法。
2. （２）胎児細胞の標識をトランスフェリン受容体に対するモノクローナル抗体を 用いて行うことを特徴とする、請求の範囲（１）の方法。
3. （３）胎児細胞として有核赤血球の数を富化させることを特徴とする、請求の範 囲（１）又は（２）の方法。
4. （４）胎児細胞として栄養胞の数を富化させることを特徴とする、請求の範囲（ １）又は（２）の方法。
5. （５）胎児細胞としてリンパ細胞の数を富化させることを特徴とする、請求の範 囲（１）又は（２）の方法。
6. （６）モノクローナル抗体が「抗−ＣＤ７１」であることを特徴とする、上記各 請求の範囲のいずれかの方法。
7. （７）染色体特異性のＤＮＡゾンデを用いる蛍光インサイチュハイブリダイゼー ションによる胎児染色体障害の検出を特徴とする、上記各請求の範囲のいずれか の方法。
8. （８）胎児細胞数の予備富化を、三重フィコール勾配法により行うことを特徴と する、上記各請求の範囲のいずれかの方法。
9. （９）標識された胎児細胞の数の富化を、磁気的に活性かされたセルソーク（Ｍ ＡＣＳ）によって行うことを特徴とする、上記各請求の範囲のいずれかの方法。