JPH0650938A - 毛細管式電気泳動法の泳動電極及びこれを用いた電気泳動法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 毛細管式電気泳動法において、試料の分取を
連続、かつ、迅速に行うこと。 【構成】 泳動電極を構成する毛細管カラムの中途部に
亀裂部を形成し、該亀裂部分を被覆物質、例えば、電解
質緩衝液を含有するポリアクリルアミドゲルの被覆剤で
被覆して電極液接続部を形成して毛細管式電気泳動法に
おける泳動電極を構成した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、各種の荷電物質、特
に、ＤＮＡ断片やタンパク質・ヘモグロビン・アミノ酸
等の生体高分子や有機物質を分離・分析或は濃縮するた
めに用いられる毛細管式電気泳動法の泳動電極及びこれ
を用いた電気泳動法に関する。

【０００２】

【従来技術とその課題】周知のように、ＤＮＡ断片やタ
ンパク質等の生体高分子や有機物質を分離・分析或は濃
縮する場合には、一般的には電気泳動法が用いられる。

【０００３】そして、近年では、より高分離性能を求め
るため、泳動槽に毛細管を用い、高電圧下で電気泳動を
行なう毛細管式電気泳動法が公知である。

【０００４】この毛細管式電気泳動法は、一般的には、
０．０５ｍｍ〜０．１ｍｍ程度の内径を有する長さ５０
ｃｍ程度の毛細管の一端に試料を数ｎｌ注入した後、上
記毛細管の両端に数１００Ｖ／ｃｍの電圧を印加して行
なわれる。

【０００５】このような一版的な毛細管式電気泳動法に
よれば、通常の電気泳動法に比べて、高分離能が得ら
れ、かつ、分析時間を短縮することができると共に、微
量の試料でも分析することができるという利点を有して
いる（文献名「生化学」第６３巻第７号，第５２９頁〜
第５３４頁，１９９１年）。

【０００６】しかしながら、上記従来の一般的な毛細管
式電気泳動法にあっては、資料を毛細管内に収容した状
態で高電圧を印加し試料の分取を行うように構成されて
いるため、試料分取までの工程が複雑で、しかも、多く
の時間を必要とする、という問題を有していた。

【０００７】この発明は、かかる現状に鑑み創案された
ものであって、その目的とするところは、毛細管式電気
泳動法において、試料の分取を連続、かつ、迅速に行う
ことができる泳動電極及びこれを用いた全く新規な電気
泳動法を提供しようとするものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するた
め、この発明にあっては、泳動電極を構成する毛細管カ
ラムの中途部に亀裂部を形成し、該亀裂部分を被覆物
質、例えば、電解質緩衝液を含有するポリアクリルアミ
ドゲルの被覆で被覆して電極液接続部を形成すること
で、毛細管式電気泳動法に用いられる泳動電極を構成し
たことを特徴とするものである。

【０００９】また、この発明に係る毛細管式電気泳動法
にあっては、泳動電極を構成する毛細管カラムの中途部
に亀裂部を形成し、かつ、該亀裂部分を被覆物質で被覆
して電極液接続部を形成してなる泳動電極を用いて泳動
精製物を連続分取することを特徴とするものである。

【００１０】

【実施例】以下、添付図面に示す一実施例に基き、この
発明を詳細に説明する。

【００１１】図１に示すように、この実施例に係る毛細
管式電気泳動装置は、１本の毛細管２から構成されてな
るカラム１と、該カラム１に電圧を印加する高電圧発生
用電源４と、該電源４に一端が導電接続された電極線用
白金線５，５と、上記カラム１を泳動時に浸漬する電極
液槽６，７と、上記カラム１と電極液槽７とを電気的に
接続する電極液接続部８と、泳動により分離された試料
を光学的に検出する検出装置９と、この検出装置９によ
って検出され分析された結果を記録し表示する制御装置
（図示せず）と、から構成されている。

【００１２】電解質緩衝液で充填されている毛細管２
は、その内径寸法が０．０５ｍｍ〜０．１ｍｍ程度とな
るように溶融石英シリカで形成されるが、これに代え
て、一般の毛細管式電気泳動装置のカラムに用いられる
材質のものであれば、いずれの材質で形成されていても
構わない。

【００１３】この毛細管２の断面形状は、体積に対する
表面積ができるだけ大きくなるような形状で、かつ、成
型性が容易な、例えば、円形が望ましい。勿諭、断面形
状を多角形とすることもできる。

【００１４】電極液槽６内には、電解質溶液が収容され
ている。この電解質溶液には、通常リン酸緩衝液やトリ
ス塩酸緩衝液などが使用される。

【００１５】電極液接続部８は、図２に示すように、上
記毛細管２に、例えば、蹄鉄型固定プレート１５を接着
させ、毛細管２の外表面にポリイミド等の被覆がされて
いる時には、加熱した電熱線を毛細管２に接触させ、該
被覆を剥した後、例えば、キャピラリーチューブカッタ
ー（島津製作所製）で亀裂部を作成し、この亀裂部分１
６を電解質緩衝液を含有するポリアクリルアミドゲル１
７で被覆して形成されている。

【００１６】このように、電極液接続部８を毛細管２の
中途部に形成することで、毛細管２の一端部を電極液槽
７に浸漬する必要がなくなり、その結果、試料の分離・
回収および試料の検出を連続的に行なうことができる。

【００１７】検出装置９は、目的物質を分離して光学的
に紫外線吸収量を測定することでモニタリング・定量を
行なうもので、この測定器は公知であるので、その詳細
な説明をここでは省略する。勿論、これに代えて、公知
の電気化学的検出器・電導度検出器・発光検出器或はこ
れらを組み合わせたものを用いて目的物質のモニタリン
グ・定量を行なうこともできる。

【００１８】制御装置は、例えば、公知のマイクロプロ
セッサ（ＭＰＵ）１０などで構成されており、上記検出
装置９によって検出された結果をプリンタ（図示せず）
に出力し、或は、ＣＲＴ等の表示装置（図示せず）に表
示すると共に、上記結果を記録し保存するように構成さ
れている。

【００１９】

【実験例】次に、上記実施例に係る毛細管式電気泳動装
置の具体的な構成例及び実験結果を下記に示す。

【００２０】この実験に用いた毛細管式電気泳動装置で
は、高電圧発生用電源４として「松定プレシジョンディ
バイセズ社製 Ｍｏｄｅｌ ＨＳＲ−３０Ｎ−ＴＵ 負
高電圧電源を使用し、電極には白金線を使用した。

【００２１】カラム１は、全長７０ｃｍ，内径１００μ
ｍ，外径３７５μｍの溶融石英シリカ製カラム（ジーエ
ル サイエンス社製）からなるカラム１の毛細管２を用
い、アースされている毛細管２の試料注入端と、毛細管
の出口から３０ｃｍのところに形成された電極液接続部
８との間には、高圧電流が印加されている。

【００２２】検出装置９は、蛍光検出器 Ｍｏｄｅｌ
１８２０−ＦＰ検出器（日本分光社製）を用い、毛細管
２の出口端から１５ｃｍの部位に取りつけられている。

【００２３】フレームイオン化検出器が取りつけられた
島津製作所製 Ｍｏｄｅｌ ＧＣ−１４Ａ ガスクロマ
トグラフは、電極液接続部８の断面部から起こり得る試
料の漏れを測定するのに用いた。このＧＣガラス管は、
長さが３０ｍで、かつ、内径が２４８μｍであり、その
内壁に０．２５μｍ厚の液相を塗布した溶融石英シリカ
カラム ＤＢ−１（ジェイ アンド ダブリュ社製）を
使用した。

【００２４】本発明の方法は、毛細管２の断面（電極液
接続部）の亀裂を入れた部分に、更に被覆物質であるポ
リアクリルアミドゲルで囲んだ方法であり、試料を導入
するために亀裂を入れた公知の試料導入方法であるＬｉ
ｎｈａｒｅｓ ａｎｄ Ｋｉｓｓｉｎｇｅｒの文献（本
明細書に添付した証明書に添付されてなる文献の「Ｒｅ
ｆｅｒｅｎｃｅｓ」の欄に記載されたＮｏ．８の文献）
に記載された方法とは明らかに相違している。

【００２５】毛細管２の断面（電極液接続部）を作成す
るには、Ｓｃｏｍｂｕｒｇ ｅｔａｌ．の文献（本明細
書に添付した証明書に添付されてなる文献の「Ｒｅｆｅ
ｒｅｎｃｅｓ」の欄に記載されたＮｏ．９の文献）に記
載された装置を使用して、毛細管のポリイミドコーティ
ングされた短い部分（１ｍｍ）を加熱して被覆を剥し、
露出した部分をアセトンで拭き取った後、アクリル製の
Ｕ字型のプレートをエポキシ樹脂（チバガイギー社製）
で接着固定する。

【００２６】その部分にキャピラリーカッター（スペル
コ社製）で亀裂を入れ毛細管に亀裂部分を作成する。

【００２７】次に、アクリルアミドと４０ｍＭトリス酢
酸緩衝液（ｐＨ７．４）とＮ，Ｎ’−メチレンビスアク
リルアミド（ＢＩＳ）（１０〜１２％，Ｔ／３．６％
Ｃ）に過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）とＮ，Ｎ，Ｎ’，
Ｎ’−テトラメチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）を加えた
溶液を作成し、気泡が混入しないように注意し乍ら、図
３に示すように、上記亀裂部分が完全に浸漬するまで、
該溶液をシリンジで容器中に注ぎ、２０〜３０分後に少
量の水を加える。重合反応が完了した後、電極液接続部
となる上記亀裂部分は容器から出され、一定の厚さのポ
リアクリルアミドゲルが亀裂部分に残るように、余剰の
ゲルを切断し、高圧電源と接続された電極液槽に収容さ
れる。

【００２８】尚、以下の試験において、電気泳動用電解
質緩衝液にはタイプＩ（脱イオン蒸留水）の水で調整し
た１ｍＭリン酸塩（関東化学社製）溶液ｐＨ７．２を使
用した。また、ＤＮＳアミノ酸はシグマ社製のものを用
いた。ＴＥＭＥＤ，ＢＩＳ，ＡＰＳ，ＥＤＴＡはナカラ
イテスク社製のものを、さらに、トリスはメルク社製の
ものを、他の化学物質はキシグ社製のものを用いた。

【００２９】このように構成された毛細管式電気泳動装
置の性能を調べるため、試料としてＮε−ＤＮＳ−Ｌ−
リジンとＤＮＳ−Ｌ−バリン（各２５μｇ／ｍｌ）の混
合溶液を用いた。

【００３０】カラム１の一端を、上記試料の入った試料
瓶に浸漬し、その状態で電極液槽７よりも１０ｃｍ程度
高い位置に１０秒間持ち上げ、試料をカラム１内に導
く。

【００３１】次に、−２０ＫＶの電圧で分離を行った。
結果を表す典型的な電気泳動図を図４に示す。この時の
移動時間と検出されるピーク高さの変動係数（ＣＶ値）
は同一試料を繰り返し注入に対し、同じ供給電圧で実行
したとき、各々０．３％及び８％と少さい値であった。

【００３２】また、同じ長さで亀裂部分がある毛細管
と、これがない毛細管とでは、電気浸透流と電流に関し
て大きな差異はない。

【００３３】次に、ゲルを亀裂部分から剥離し、重力法
によって２５μｇ／ｍｌの濃度のＤＮＳ−Ｌ−リジンを
注入し、同様に行った。尚、このときの試料注入量と供
給電圧は、前記した条件と同様である。その結果、泳動
開始後３５分以内では電気泳動図上でピークは検出され
なかった。

【００３４】さらに、再び、ポリアクリルアミドゲルで
亀裂部分を被覆し、同条件下で実行したところ、泳動開
始後４．２分後に電気泳動図上にピークが検出できた。
このとき、ゲルがある毛細管と無い毛細管の電流値には
殆ど差がなかった。

【００３５】次に、毛細管の亀裂部分から出口の方向
（第２部分）に向かって３ｃｍのところで切断した。こ
の距離は非常に短く、蛍光検出器をこのライン中に設置
することは困難である。尚、毛細管の上記亀裂部分から
先の第２部分を短くすることにより、電気浸透流は異な
るいくつかの電圧において約３．５倍に増加したが、こ
のときの電流変化は無視できるものであった。

【００３６】電気浸透流が増加するのは、亀裂部分から
先の第２部分の長さが短くなることにより、流動抵抗が
低くなるためである。

【００３７】また、該電気浸透流が一定しているか否か
は、１０秒間（一定時間）、０．５ｍｌ容量の小型遠心
チューブ中に毛細管からの流出物を収集し、その重量を
繰り返し測定することで解るが、これを実際に行った結
果、収集した各フラクション重量は、平均３．７ｍｇで
あり、ＣＶ値は７％（ｎ＝６）以下であった。更に、上
記収集時間を５〜３０分と、変化を持たせて流出物を収
集したところ、その重量は収集時間に対してよい直線性
（相関件）を示した。これらの結果は電気浸透流が一定
であることを表している。

【００３８】亀裂部分を通過する試料の損失の有無の可
能性はＧＣ分析で調べることができる。即ち、フェナセ
チン（１．０ｍｇ／ｍｌ）を毛細管内に注入した後、２
０分間、２５０Ｖ／ｃｍの電圧を印加して、毛細管の第
１部分（入口から亀裂部分の間）で電気泳動し、次い
で、そのままその流出物を毛細管の出口で小型遠心チュ
ーブ内に収集する。別に、同量の試料を毛細管内に注入
し、マイクロシリンジによって毛細管内の試料を含む緩
衝液を毛細管の出口端部から強制的に入口端部に押し出
し、別の小型遠心チューブ内に流出物を収集した。この
ようにして得られた両方の流出物を緩衝液で希釈し、ほ
ぼ同容量（７．８μｌ）とした。これら２つの溶液の一
部をＤＢ−１カラムを使用したＧＣ分析で定量した結
果、いずれも少なくとも９６％の試料が回収されている
ことが解った。

【００３９】以上の結果からも明らかなように、本実施
例に係る毛細管式電気泳動装置によれば、試料の分取が
可能であり、電気浸透流が安定で、試料の回収率も高
く、かつ、構成も簡単であり、故障も少ない、という優
れた効果が得られる。また、亀裂部分のポリアクリルア
ミドゲルの存在は、試料の漏れを最小限に止めるのに効
果的である。さらに、このポリアクリルアミドゲルを使
用する方法は、Ｗａｌｌｉｎｇ−ｆｏｒｄ ａｎｄ Ｅ
ｗｉｎｇの文献（本明細書に添付した証明書に添付され
てなる文献の「Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ」の欄に記載され
たＮｏ．１及びＮｏ．２の文献）に記載された方法の装
置中で使用されている多孔質ガラスを使用した方法と似
ているが、被覆剤としてポリアクリルアミドゲルを使用
する本発明では、自由に形状やサイズを成形することが
でき、しかも、何回もカラムを使用できるのでカラムの
寿命を延ばすことができる他、柔軟性や耐久性もあり、
操作性や分取性にも非常に優れている、という点で上記
多孔質ガラスを使用した方法とは著しく異なる特徴を有
している。

【００４０】また、上記多孔質ガラスを使用した従来の
方法では、亀裂をいれる場合にガラス管に傷をつけてガ
ス圧により破断しているのに対して、本発明ではキャピ
ラリーカッターで傷をつけた後、該部分を押圧して破断
しているため、クリアランスを自由に選択することがで
きる、という効果が得られる点において両者は大きく相
違している。

【００４１】

【発明の効果】以上説明したように、この発明によれ
ば、毛細管式電気泳動法において、試料の分取を連続、
かつ、迅速に行うことができ、しかも、取り扱いが簡便
で熟練性を必要としないので、この種の試料分離を容易
に行なうことができる、という優れた効果を得ることが
できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】この発明の一実施例に係る泳動電極が適用され
た毛細管式電気泳動装置の概略的な構成を示す説明図で
ある。

【図２】同泳動電極の部分拡大断面図である。

【図３】毛細管の電極液接続部の回りをポリアクリルア
ミドゲルで被覆する工程を示す説明図ある。

【図４】アミノ酸を電気泳動した分析データを示す電気
泳動図である。

【符号の説明】

１ カラム ２ 毛細管 ４ 電圧発生用電源 ６，７ 電極液槽 ８ 電極液接続部 １５ 固定プレート １６ 亀裂部分 １７ ポリアクリルアミドゲル

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 毛細管式電気泳動法に用いられる泳動電
   極において、泳動電極を構成する毛細管カラムの中途部
   に亀裂部を形成し、該亀裂部分を被覆物質で被覆して電
   極液接続部を形成したことを特徴とする毛細管式電気泳
   動法の泳動電極。
2. 【請求項２】 前記亀裂部分を被覆する被覆物質か、電
   解質緩衝液を含有するポリアクリルアミドゲルであるこ
   とを特徴とする請求項１に記載の毛細管式電気泳動法の
   泳動電極。
3. 【請求項３】 毛細管カラムの中途部に亀裂部を形成
   し、該亀裂部分を被覆物質で被覆して電極液接続部を形
   成してなる泳動電極を用いて泳動精製物を連続分取する
   ことを特徴とする電気泳動法。