JPH06509471A - リボソーム不活性化タンパク質をコードするヌクレオチド配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 リポソーム不活性化タンパク質をコードするヌクレオチド配列本発明は植物カー ネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ　ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）中に存在するタン パク質をコードするＤＮＡ配列、該配列を含有する発現ベクターおよび該ベクタ ーによって形質転換された宿主に関するものである。

種々の植物から抽出されたタンパク質が、動物のリポソームを阻害することによ って動物細胞のタンパク質合成を阻害できることは広く知られている。

このタンパク質群は、構成されているポリペプチド鎖の数に従って、リポソーム 不活性化タンパク質タイプ１およびタイプ２（ＲＩＰ　１およびＲＩＰ２）とし て分類されている。ＲＩＰ　１はリポソームの修飾を引き起こす酵素活性を有す る１本のポリペプチド鎖を有しており、ＲＩＰ２はこの鎖に加えて、特定のレセ プター分子を有する細胞と結合する第２の鎖を有している。

ＲＩＰ　２は、大部分の無傷細胞に結合できるため非常に毒性である。ＲＩＰ　 ２の例はりシン、アブリン、モデクシン、ビスクミンである。ＲＩＰ　ｌは細胞 表面に結合できないので、実際上非毒性である。ＲＩＰ　ｌは、タンパク質合成 を阻害する酵素活性を発揮するためには細胞質に入らなければならない。ＲＩＰ 　１の例はサポリン、ゲロニン、モモルジン、ジアンシン（ｄｉａｎｔｈｉｎ） 　３０および３２である。最後の２つのものは植物カーネーションの種々の組織 から抽出することができ、その際それらはそれぞれ３００００および３２０００ ダルトンの異なる分子量を有する２つの形態で存在する。決定的な明確な結論は 引き出されていないが、上記分子は２つの異なるタンパク質であるように思われ る。

これらはそれらの分子量に従って、ジアンシン３０および３２と命名された（Ｓ ｔｊｒｐｅ等、Ｂｒｏｃｈｅｔｒｒ、　Ｊ、、１９８１年、否、３９９〜４０５ 頁；　Ｆａｌａｓｃａ等、Ｂｉｏｃｈｅｔ　Ｊ、、１９８２年、工、５０５〜５ ０９頁）、、これら２つのタンパク質の生化学的特徴は類似している。ｐＩは両 者共に非常に塩基性であり（＞９．５のｐＨ単位）：ウサギ網状赤血球溶解物で 計算したｋｍｓは同一であり、一方ｋｃａｔは僅かに異なっており、ジアンシン ３２のｋｃａｔはジアンシン３０より高い。

幾つかのタンパク質は１１種々の細胞内器官へのタンパク質の標的化を制御する シグナルペプチドと一緒に発現されることが知られている。い（つかのシグナル ペプチドは、それらの標的化の役割を一旦果すと裂けて、も早、完成した蛋白質 中に存在しない。

ジアンシン３０の場合には、タンパク質は分泌タンパク質に特徴的なシグナルペ プチド（これはタンパク質を内質細網に対して標的化させる）に先行された活性 配列を有するプリカーサ−、プレージアンシンとして合成される。

このシグナル配列はポリペプチド鎖のＮ−末爾に位置しておりそしてタンパク質 の転移を助ける疎水性アミノ酸の存在が特徴的である。

本願発明者はカーネーションのＲＩＰ　Ｌジアンシン３０ｔｉｒよびそのプリカ ーサ−であるプレージアンシン３０をコードするｃ　ＤＮＡ配列をクローン化し そして発現させた。

本発明のＤＮＡ配列は配列表Ｎｏ、１および２に報告する。

本願発明はまた、上記ＤＮＡ配列とハイブリッド形成しそしてジアンシン様活性 を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列にも関するものである。この文脈 で、用語「ハイブリッド形成」とは慣用のハイブリッド形成状態を言うつ 最も好ましくは、用語「ハイブリッド形成」とは緊縮ハイブリッド形成状態を言 う。

本発明のＤＮＡ配列は次の方法に従って得ることかできる：（１）植物カーネー ションの組織からｍＲＮＡの単離。

（ｉｉ）ｍＲＮＡからｃＤＮＡの合成。

（ｉｉｉ）得られたｃＤＮＡをクローニングベクター中に挿入することによるｃ ＤＮＡライブラリーの入手。

（ｉｖ）放射性リンで標識された、同定すべきタンパク質の特定領域をコートす るオリゴヌクレオチドまたはウサギで生じた抗−ジアンシンポリクローナル抗体 でｃＤＮＡライブラリーを分析することによる、発現タンパク質含有クローンの 同定、および最後に（ｖ）上記で同定されたクローン中に存在する特異的ＤＮＡ 配列の単離：゛ （ｖｉ）プレージアンシン３０かまたは天然タンパク質のいずれかをコードする 領域のみを増幅するために（Ｖ）で単離された配列をＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反 応）に付すこと。

ｍＲＮＡはカーネーションの葉から抽出される。

ｃＤＮＡは市販のキットを使用して合成することができる。

ｃＤＮＡをクローニングベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを取得する。

クローニングベクターはプラスミドまたはバクテリオファージであることができ る。

本願発明では、ラムダｇｔｌｌファージをクローニングベクターとして使用し、 その際、７アージに通常存在するベータガラクトシダーゼとクローン化すべきタ ンパク質問に融合タンパク質を発現させるようにライブラリーの種々のｃＤＮＡ 配列をそのゲノムに挿入する。

発現はこのファージに特に感受性である大腸菌株を使用することが可能である。

次に、たとえタンパク質がファージのベータガラクトシダーゼと融合してもその 存在を容易に検出できる、ウサギ特異性の抗−ジアンシンポリクロナール抗体を 用いてライブラリーを分析する。

このようにして、標的タンパク質をコードする所望のＤＮＡ配列か存在する１つ またはそれ以上のクローンを同定することができる。

この配列またはこの配列からなるより長い配列は特異的なエンドヌクレアーゼ酵 素を使用して単離することができる。

かくして、単離したＤＮＡ配列は、ベーターガラクトシダーゼを有さない非融合 タンパク質として特異的に発現させることができる。

タンパクｉｎ生物を得るためには、所望のタンパク質をコードする領域の両末端 に適当な制限部位を挿入して所望の領域だけを増幅するように、単離したＤＮＡ 配列をＰＣＲに付す。

このようにして得られたＤＮＡ配列は、発現系の制御要素に特異的に結合するよ うに発現ベクターに挿入する。

このベクターは複製起源および表現型マーカーを有している。開始および停止コ ドンは翻訳すべきＤＮＡ配列に提供される。本発明によるプラスミドベクターは ブタペスト条約に従ってＮ　ＣＴ　Ｃ１２４７７およびＮ　ＣＴ　Ｃ１２６９３ の受理番号で国立菌培養収集所（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃ０ｆｆｅｃｔｉｏｎ　Ｏ ｒ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ）に寄託されている。

１９９１年６月２０日に寄託されたＮ　ＣＴ　Ｃ１２４７７は、配列表Ｎｏ、２ からなるプラスミドｐＫＫ−ＤＩＡ３０を含有しており、一方１９９２年６月２ 日に寄託されたＮ　ＣＴ　Ｃ１２６９３は配列表Ｎｏ、ｌからなるクローニング ベクター、ＧＥＭ−ｐＤＩＡ３Ｑを有している。

本発明は添付の図面を参照して記載する。その際、図１はクローン化されたｃＤ ＮＡ配列の制限マツプを示す。

図２は、シグナルペプチドを含有する配列から始まる天然タンパク質の最初のア ミノ酸の同定を可能にする、７オンハイジン（ｖｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ）アルゴリ ズムから推論した図面を示す（ｖｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ　Ｇ、　ＮＡＲ。

１９８６年、１４．４６８３〜４６９０頁）。

図３は発現プラスミドｐＫＫ−ＤＩＡ３０を示す。

図４はインビトロ発現プラスミドｐＧＥＭ−ｐＤＩＡ３０を示す。

図５はインビトロ発現プラスミドｐＧＥＭ−ＤＩＡ３０を示す。

冷凍したカーネーション葉２０ｇは、６０■ｌの２００ｍＭ　）リス−酢酸、１ ２０ｍＭ酢酸カリウム、５０ｍＭ酢酸Ｍｇ、３．４％のショ糖、０．０４％ホモ ジネートした後、得られた混合物は４℃で２０分間遠心し、次に上清液を同容量 の１：１のフェノール：クロロホルム溶液を用いて３回抽出した。最後に、この 連続抽出物をクロロホルムで更に抽出しそしてその混合物を再度遠心した。

このようにして得られた水性溶液に１／２０容量の７Ｍ酢酸アンモニウムを加え 、混合しそして２．５容量の無水エタノールを加え、そしてこのようにして得ら れた溶液を一８０℃で少なくとも１時間インキュベートした。得られた混合物は ４℃で３０分間２５００ｒｐｍで遠心し、そして沈殿物を７５％のエタノールで 洗滲しそして再度遠心した。

沈殿物を乾燥し、そして水に懸濁し、そしてこれに１７４容量の１０Ｍ塩化リチ ウムを加えた。インキュベーション後、溶液を４℃で３０分間４０００ｒｐ−で 遠心した。次に、これを７５％のエタノールに２回再懸濁し、各懸濁毎に続いて ４℃で１５分間１０００ｒ四で遠心した。沈殿物を乾燥し、そして水に再懸濁し た。

３ｍＭのトリス−ＭＣＩ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＳＤＳ、４００ｍＭの ＮａＣＬ　ｐＨ８，５の緩衝液を水性溶液に加え、そしてその後混合物を６０℃ で５分間加熱した。インキュベーンタン後、溶液をオリゴチミジン酸−セルロー スのカラム（Ｓｉｇ■ａ１米国）で溶出した。

カラムに結合したポリアデニル化ｍＲＮＡを８ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭの ＥＤＴＡ、０．１％のＳＤＳ、ｐＨ７，９溶液で溶出した。

このようにして精製されたポリアデニル化ＲＮＡは７Ｍの酢酸アンモニウム１／ ２０容量および無水エタノール２．５容量を用いて４℃で１２〜１６時間沈殿さ せ、そして４℃で１５分間１０ＱＯＯｒｐｗ１で遠心し、７５％のエタノールで ２回洗浄しそして最後に水に懸濁しそして一８０℃で貯蔵した。１Ｍｇの総ＲＮ Ａから２０μｇのＲＮＡポリ（Ａつを得たパ ｃＤＮＡの合成 ｃＤＮＡは市販のキット（「ｃＤＮＡ合成系プラス」、Ｎｏ、ＲＮＰ　１２５６ 　Ｙ　／　Ｎ　ＳＡｍｅｒｓｈａｍ、英国）を使用して合成した。

９−Ｌ、ｆｇｔ　ＩＩへのｃＤＮＡライブラリーの挿入ｃＤＮＡライブラリーは 、商業的に入手可能なキット（「ｃＤＮＡクローニング系−ラムダｇｔ　Ｉｌｌ 　、カタログ番号ＲＰＮ、　１２８Ｇ、　Ａｗｅｒｓｈａｍｓ英国）を使用して ラムダｇｔｌｌに挿入した。

ラムダｇｔｌｌに挿入されたｃＤＮＡライブラリーの分析は実質的には、サムプ ルツク（Ｓａ＋ｏｂｒｏｏｋ）　Ｊ　、等の分子クローニング：実験最初の抗体 の結合後のニトロセルロースフィルターの処理を除いて）実施した。この工程は 市販のキット（「プロトプロット免疫スクリーニング系」、カタログ番号Ｐ　３ ７７１、Ｐｒｏ■ｅｇａ、米国）を使用して実施した。

ＤＮＡの配列内寞 単離されたクローンのＤＮＡはキットｒｃＤＮＡクローニング系−ラムダｇｔ　 ＩＩＪの指示書に従って単離した。挿入物はＥｃｏＲｒまたはＢａｍＩで交互に 除去し、そしてそれぞれ、ｐＵＣ８またはｐＵＣ９プラスミドのＥｃｏＲＩまた はＢａｍＨ１部位で結合させた。得られたクローンの制限マツプは図１に示す。

配列決定は、シークエナーゼ（５ｅｑｕｅｎａｓｅ）キット（ｌｌｎｉｔｅｄ　 ５ｔａｔ従って実施した。

ｃＤＮＡは両方向で配列決定され、２９３アミノ酸の読み取り枠を示している。

害廊り艷− 図工乞乞４東三−ドするクローンの大腸菌でｑＲ厚フジアンシンコードする部分 が存在する実施例２のクローンから出発して、フォンハイジンアルゴリズム（図 ２）で推論される天然タンパク質コード化領域だけを増幅させるように特定のプ ライマーを使用してＰＣＲ（キットＧｅｎｅＡ＠ｐ”）を実施し、その際更に適 当な制限部位を両末端に、例えばＮｃｏＩを５′−末端にそしてＨｉｎｄＩＩ工 およびＰｓｔＩを３゛−末端に挿入した（配列表Ｎ０１３および４）。

これはタンパク質の配列決定で確認した。

反応混合物は１％のアガロースゲルで分析し、その際８４３ｂｐの単−バンドが 検出された。このバンドは予め活性化されたＤＥ８１によってゲルから溶出され た。ろ紙溶出は１．５ＭのＮａＣ１／ＴＢのような強度の緩衝液中３７℃で２時 間実施し、そして得られた溶液に２容量のエタノールを加え、そしてこれを−２ ０℃で１２〜１６時間インキュベートした。

次に、この溶液を１３５０Ｏｒｐｍで５分間遠心しそして沈殿物をＴＨに再懸濁 した。使用した発現プラスミドは、そのポリクローニング部位に３つの制限部位 、即ち開始コドンＡＴＧを提供するＮｃｏｌ、ＰｓｔｌおよびＨｉｎｄｌＩＩを 有するｐＫ　Ｋ　−２３３，２であった。フラグメントおよびプラスミドはＮｃ ｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで順次消化させ、そしてその後結合させて適当な大腸 菌株を形質転換した。

得られたプラスミドはｐＫＫ−ＤＩＡ３０と命名し、そのマツプは図３に示す。

大腸菌株ＪＭ１０９をプラスミドｐＫＫ−ＤＩＡ３０で形質転換し、そして１ｍ Ｍのチミジンおよび１００μｇ／■１のアンピシリンを補充した最少培地Ｍ９中 でＯＤ、。。が０．５になるまで培養した。

次に、培養物は１ｍＭの最終濃度のイソプロピル−１βＤ−ガラクトピラノシド を用いて３０℃で３時間誘導した。音波処理した細胞は４℃で１０分間５０００ ｒｐｓ＋で遠心して無傷の細胞を除去した。上清液を２℃で１時間１００．００ ０　ｇで遠心した。可溶性タンパク質を含有する十清液を回収し、そして不溶性 タンパク質のペレットを１００ｍＭのトリＸ　ＨＣＬ　５　ｍＭのＥＤＴＡ、ｐ Ｈ１１，ｓに再懸濁した。

２つの溶液は５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスターンプロット法で分析し、そして 組換え体ジアンシンに相当する約３００００ダルトンの分子量のバンドの存在を 調べた。

」 ＰＣＲは、特異的プライマーを使用して、プレージアンシン３０の完全な配列を 含有するクローンのファージＤＮＡ鋳型で実施した。

更に詳細には、ｐＤｉａ　５’と命名された配列表Ｎｏ、５のプライマーは、プ レージアンシン３０の領域の特異的増幅用の３８塩基長のオリゴヌクレオチドで ある。これは、増幅すべき配列には存在しない２つの単独の制限部位、５ａｉｌ およびＢｇｌＩＩ並びにそれらの下流の、ポリペプチドの最初の６アミノ酸をコ ードする配列からなる。

第２のオリゴヌクレオチドは制限部位ＮｃｏＩを含有する３８塩基長のＤｉａ５ ’（配列表Ｎｏ、３）であり、開始コドンＡＴＧおよびその直ぐ下流の、天然の ジアンシン３０の最初の８アミノ酸をコードするＤＮＡ配列を提供する。両タン パク質をコードするＤＮＡフラグメントの増幅には配列表Ｎ００４のプライマー を使用した。３９塩基のＤｉａ３’（配列表Ｎｏ、４）と命名されたこのプライ マーは２つのタンパク質の最終６アミノ酸、続いて２つの停止コドンＴＧＡ並び に制限部位ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩをコードするヌクレオチド配列に特異 的である。

インビトロでの転写実験で使用したプラスミドはｐＧＥＭｌであった。

プレージアンシン３０の配列を含有するｐＧＥＭ１プラスミドのクローニングの 場合には、ベクターはマルチクローニング部位に存在する部位、ＨｉｎｄｌＩＩ およびＢａｍＨＩで消化され、モしてＰＣＲ増幅で以前に得られたプレージアン シン３０をコードするフラグメントもＢｇｌｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで同時に 消化された。これによって、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下でｐ ＧＥＭｌベクター中でプレージアンシン３０フラグメントを結合させることがで き、その５°−末端はＢａ＋ｍＨＩ　／　Ｂｇｌ　Ｉ　Ｉで示されそして３゛− 末端はＨｉｎｄＩＩＩだけで示された。

ジアンノン３０をコードするフラグメントの場合には、消化Ｉｔ　Ｎ　ｃ。

ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの順序であり、そしてベクターを上記したようにして消 化した。これによって、配列Ｈ１０ｄＩＩ＋を有する３゛−末端にフラグメント を結合させることができ、一方５゛での結合はジアンシン：１０フラグメントの ｐＧＥＭｌおよびＮｃｏＩのＢａｇ＋ＨＩ末端の［末端充填（ｅｎｄ　ｆｉｌｌ ｉｎｇ）　Ｊ反応を先に行った。それぞれｐＧＥＭ−ｐＤ　１ａ３０およびｐＧ ＥＭ−Ｄｉａ３０と命名されたプレージアンシン３０およびジアンシン３０の２ つの構成物のマツプは図４および５に示す。

タンパク質産生物の生化学的特徴 プレージアンシン３０およびジアンシン３０の翻訳に特異的なｍ−Ｒ。

ＮＡは上記ベクターを使用して転写した。転写およびインビトロでの翻訳は以下 に記載するようにして実施した。

インビトロ転写 インビトロでの転写を実施するための反応混合物には次のものが含まれていた。

１２μｌのプレミックス溶液［（６ｍｌの総容量に対して）Ｔ−塩（２０ｍＭの スペルミジン、４００ｍ　ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７゜５．６０ｍＭの酢酸Ｍｇ） １ｍｌ；　２０ｍＭのＨＥＰＥＳ中それぞれ５０ｍＭのＣＴＰＳＡＴＰおよびＵ ＴＰの溶液１００μｌ：　２０ｍＭのＨＥＰＥＳ中５ｍＭのＧ　Ｔ　Ｐ２Ｏ０μ ｌ：　５００ｍＭのＤ　Ｔ７１００μｌ；　ｌＯ＋ａｇ／ｓ＋ｌのＢＳＡ溶液１ ００μｌ；滅菌蒸留水４．５１からなる］；０．５μｌのＲＮａｓｉｎ（ＲＮａ ｓｅの組換え体インヒビター）：　１μ！のＣＡＰ：０．５μｌの［３２Ｐ−Ｕ ＴＰ］　、２μｌの転写すべき直線状プラスミドＤＮＡ、２μｌのＲＮＡポリメ ラーゼ［ＳＦ３またはＴ７］。

次に、反応混合物は４０℃で３０分間インキュベートし、その後２０ｍＭのＨＥ ＰＥＳ中８ｍＭの溶液ＧＴＰ１μｌを加え、次に同じ期間および温度の第２のイ ンキュベーションを行った。

［”Ｐ−ＵＴＰ］の導入パーセントを計算するために次の方法を使用した＝１μ Ｉの転写混合物を試料採取し、そして３μｌの滅菌蒸留水を加えた。得られた溶 液２μｌをＤ　Ｅ　８１　（ｆｈａｔｍａ口、米国）の２つのフィルター丘に厘 き、そしてこれらを風乾した。２つのフィルターのうちの１つは、０．１５Ｍの Ｎａ２ＨＰＯｎ・１２ＨｚＯ溶液２０軸１を用いて室温で２分間４回洗浄した。

これを蒸留水で２回メタノールで２回洗浄した。

フィルターを風乾し、そして２つのフィルターをカウンターで計数した。洗浄し たフィルターから得られた計数と洗浄しなかったちられた。

ヱ２ビトロ哩釈 ウサギ網状赤血球の系を使用した。反応混合物は１３７．５μｍの２ＭＫＣｌ　 ；　１１７．５μｌの４０ｍＭ酢酸マグネシウム；８０μｌの１０ｍＭ　トリス −ＨＣｌ溶液、ｐＨ７，４；　１２５μｌの各々２ｍＭの濃度の、メチオニンを 除くアミノ酸混合物；１５５μ■の「エネルギーミックス」混合物（０，４ｍｌ の０．５Ｍ　ｌ−リス−ＨＣｌ中４ｍＭのＧＴＰ、２０ｍＭのＡＴＰ、ｐＨ７， ５＋容量は滅菌蒸留水で１膳１に調整しそして８０■ｇのリン酸クレアチンを加 えた）および最後に４９２．５■ｌの滅菌蒸留水からなっていた。

次に、７μｍの反応混合物を２μｍのｆｆ５Ｓ−メチオニン、１μｍのＲＮＡ、 および１０ｕ＋のヌクレアーゼ処理または非処理ウサギ網状赤血球溶解物（Ｐｒ ｏｍｅｇａｓ米国）と混合した。混合物を３０℃で１時間インキュベートした。

放射性メチオニンで標識されて得られたりンバク質は５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析し た。

配列表 （１）一般的な情報・ （ｉ）出ｍ人　イタルファルマーコ、エスピーニー（Ｉｔａ１４ａｒｍａｃｏ％ ５ＰＡ） （１、発明の名称　リポソーム不活性化タンパク賀をコードするヌクレオチド配 列 （ｊｉｉ）配列の数、５ （ｉｖ）通信住所・ （Ａ）住所　ストウーディオコンスレンツ７プレペットウアーレ （Ｂ）街・ロブシー二　８ （Ｃ）都市・　ミラノ （Ｅ）国、イタリア （Ｆ）郵便番号＋　２０１２２ （ｖ）コンピューター読み取り様式： （Ａ）媒体タイプ　フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター・　ＩＢＭＰＣコ ンパティプル（Ｃ）操作システム　ＰＣ−ＤＯ８／ＭＳ−ＤＯ８（Ｄ）ソフト・ パテントイン　リリース＃１．０、バージョン＃１．２５ （ｖｉ）本願のデータ （Ａ）出願番号 （Ｂ）出願臼・ （Ｃ）分類： （ｖ　１ｉｉ）弁護士／代理人情報・ （Ａ）氏名、ミノ−ジャ　フアプリッツィオ（ｉｌｉｎｏｊａ、　Ｆａｂｒｉｚ ｉｏ）（１ｘ）電気通信情報・ （Ａ）電話：　２−７６０２１２１８ （Ｂ）テレファックス：　２−７８３０７８（Ｃ）テレックス＋　３１５６８１ （２）配列ＩＤＮｏ、１の情報・ （′ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ一８７９塩基対 （ＢＵタイプ：核酸 （Ｃ）ストランド：１本 （Ｄ）トポロジー：直線 （１１）分子タイプ：　ｃＤＮＡ （ｉｆｆ）仮定　無し くｉｖ）アンチ−センス・無し くｖｔ）起［： （Ａ）生物：カーネーション （ｘｉ）配列の記載：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１：ＣＴＴＧＣＡＡＴＧＣＡＴｋ ＡＣＧＣｋｋＡ　”Ｎ；ＴＴ入ＡＣＣＣ丁　ＧＣ入Ｔ＾ＴＴ入ＣＴＴ’ＣＡＡ入 ＡＡＣＣＡ　入ＡＴＣＡＣＴＴbＴ　）６０ （２）配列ＩＤＮｏ、２の情報・ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ・８１３塩基対 （Ｂ）タイプ　核酸 （Ｃ）ストランド　１本 （Ｄ）トポロジー　直線 （ｌり分子タイプ　ｃＤＮＡ （１ｉｉ）仮定　無し くｉｖ）アンチ−センス、無し くＶｌ）起源。

（Ａ）生物　カーネーション （ｘｉ）配列の記載：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、２ＧＣＣＣＴｆ：ＡＴＴＯＧＴＧ ＣＣ−ＣＣＴＴＣＴＡＣ’ｒＡＣＴＣＡＴ　ＡＡＡ？！’ＣＣｒＴＡ　（：ＡＣ Ｔ’ｒＡＡＴＴＴ　ＣＣｋｋfＧＴＣｃｒ　１８０ ｃ＋ａｃａｙｃａａ　７ｇ　ＣＣＴ〒八ＣＧへＧｃ　Ｇ＾ＧλＡＣＴｒ入τ　入 ＣσＴＯσＴＣＧＣσ丁入↑ｃ’ｒｒｃｃ入　２４Ｇ（２）配列ＩＤＮｏ、３の 情報・ （ｉ）配列の特徴・ （Ａ）長さ　３８塩基対 （ｉｉｉ）仮定：無し ＣＧＣＧＴＣ＾ｃｃ八　Ｔ’ＧＧＣＣＡＣ八ｃｃ　λＴへへＡＣ＾ＴＴ＾　入＾ ＴＣＴＣＧＣ）８（２）配列ＩＤＮｏ、４の情報 （１）配列の特徴。

（Ａ）長さ　３９塩基対 （Ｂ）タイプ・核酸 （Ｃ）ストランド　１本 （Ｄ）トポロジー　直線 （ｉｉｉ）仮定：無し くｉＶ）アンチ−センス、有り （ｘｌ）配列の記載　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、４ＣＣＡＴＣＴＣＣＡＣ，ＡＡＧＣ ＴＴＣＡＴＣｋｋｋＧＣＡＣ入ＴＣ八ＧｅＣコ９（２）配列ＩＤＮｏ、５の情報 ・ （１）配列の特徴 （Ａ）長さ　３８塩基対 （Ｂ）タイプ　核酸 （Ｃ）ストランド　１本 （Ｄ）トポロジー　直線 （ｉｉｉ）仮定　無し くｉｖ）アンチ−センス、無し くｘｉ）配列の記載：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、５・Ｃ’ＣＧＴＣＧＡＣＡＧ　Ａ ＴＣＴＣＡＡＧＡ’ｒ　Ｃ；ＡＡＧＡＴｒＴＡＴ　ττ＾ＧＴＧＧＣ３６【図　 １１ （図　２１ ン′？ンンン　ｄ−１場ｊ乙刊 １図　５１ｊび阿−、ＤＩＡρ １．１−＋　ａｌｌ−に−ρＣＴ／ＥＰ　９２１０１７１１フロントページの続 き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号／／（Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：１９） （Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：１９） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＳＥ）、０Ａ（Ｂ Ｆ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、Ｔ Ｇ）、ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ３，ＦＩ、　ＨＵ、ＪＰ。

ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　Ｎｏ、　ＰＬ、　Ｒ○、　Ｒ Ｕ、　ＳＤ、　ＵＳ ＦＩ （７２）発明者　プロツケッティ　ディエゴイタリア国　２０１２６　ミラノ、 ヴイアレフルヴイオ　テスティ、３３０

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．カーネーションから得られ配列ＩＤＮｏ．１に示されるようなリボソーム不 活性化タンパク質をコードするＤＮＡ配列。
2. ２．カーネーションから得られ配列ＩＤＮｏ．２に示されるようなリボソーム不 活性化タンパク質をコードするＤＮＡ配列。
3. ３．請求項１または２のＤＮＡ配列とハイブリッドを形成しそしてジアンシン様 タンパク質をコードするＤＮＡ配列。
4. ４．請求項１〜３のＤＮＡ配列からなるクローニングベクター。
5. ５．請求項１〜３のＤＮＡ配列からなる発現ベクター。
6. ６．大腸菌株ＮＣＴＣ１２４７７から入手可能なプラスミドｐＫＫ−ＤＩＡ３０ である請求項５に記載のベクター。
7. ７．大腸菌株ＮＣＴＣ１２６９３から入手可能なプラスミドｐＧＥＭ−ｐＤＩＡ ３０である請求項５に記載のベクター。
8. ８．請求項６または７のベクターによって形質転換された宿主。
9. ９．請求項８の形質転換宿主の培養物からなるカーネーションのリボソーム不活 性化タンパク質を製造しそしてこのようにして製造されたタンパク質を回収する 方法。
10. １０．大腸菌株ＮＣＴＣ１２４７７またはＮＣＴＣ１２６９３を培養することに よって入手可能なタンパク質。
11. １１．大腸菌株ＮＣＴＣ１２４７７および１２６９３。