JPH06509703A - α−シアリル化オリゴサッカロイドグリコシドの酵素的合成方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｉ、　発明の分野 本発明は、α−シアリル化オリゴサツカライドグリコシドの酵素的合成法にむけ られている。具体的には、本発明の方法においてはシアリルトランスフェラーゼ を使用して、そのＣＭＰ−ヌクレオチドとして使用されるシアル酸の類縁体を、 オリゴサツカロイドグリコシドにトランスファーさせる。本方法で使用されるシ アル酸類縁体とオリゴサツカライドグリコシドは、使用されるシアリルトランス フェラーゼと両立するように選択される。

２、　参考文献 以下の参考文献は、本出願の関係する部分に、肩付き数字として、本出願中に引 用されている。

２、　Ｒａ）ｃｏＩｌｌｏｒｉ、Ａｄｄ、Ｃａｎｃ＠ｒ　Ｒ＠ｊ、、乏ｚ：２５ ７−ココ１　（１９８９）４−　ｋｈ＠ｎｑｒｕｎｄ　ａｔ　ａＬ−、Ｊ、Ｂｉ ｏｌ、Ｃｈｅｗ、、ｚｉ生＝１３２３３−１ゴ２コフ６、　Ｆ＊ｉｚｉ、τＩＢ Ｓ、　ｌ：１Ｉ４−８６　（１９９１）７＋　Ｂｒａｎｄｌ＠ｙ　ａｔ　ａｌ、 、（：ａｌｌ、ｊｌｔＪＩ６１−１１６３　（１９９０）１２、Ｆ′ｕＩ′Ｉｑ 　ａｔ　ａｌ、、　Ｃａｎｃ＠ｒ　Ｒｅｓ、、　区ｔ４３０８−４３１４　（１ ９９０）１３、Ｌｉｖｌｎｇｓｔｏｎ　ａｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｅａｄ、　Ｓｅｉ、　（ＵＳＡ）。

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Ｍｉｔｏｒ、　Ｖｏｌ、　１０　（１９８２）コ２＋　０ｋａｙｓｔｏ　ａｔ　 ａｌ、、丁ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、Ａｇｅ　Ｎｏ、ｘ７．ｐｐ−５＠３５−５８ ３７　（１９９０）。

ココ、　Ｒａｔｃｌｉｆｆ＠＠ｔ　ａｌ、、υ＋８−　ｓ＠ｒｉａｌ　！ｉｏ、 ０７７１２７，９０５゜（１９虐））。

コ５．　Ｐａｕｌｓｅｎ、　＾ｇｎ＠ｗ、Ｃｈ鶴、工ｎｔ、ｕ、Ｉｎｇ、、２五 ２１５５−４７３（１９−２）。

３ｇ−！Ｉｅｈｍｉｄｔ、Ａｑｎｆｉ、ｌ：ｈｗ、Ｉｎｔ＋　ｇ−ｋｓｑ、ｔ　 Ｘ乏＝２１２−２３５（ｘｓｓｓ）。

３フ、　Ｆｆｉｇｅｄｉ　ａｔ　ａｌ、、　Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ、Ｊ、、４ｔ９ １−１０８　（１９１７）。

３ｓ−ＲａＪａ＠ｙａＭ　ａｔ　ａｌ、、　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、Ｒｅｓ＋、２ 立２：Ｃｔ−Ｑ・　（１９９１）。

３９、ａｒｏｓＯ＠ｒ　ａｔ　ａｌ−、Ｂ１０ｃｈａ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａ ｃｔａ、、　［：１２ａ２−１２１９　（１９８Ｇ） ４０、Ｇｒｏｓｓ　ａｔ　ａｌ、、　ム「、　Ｊ、　ＢｉｏｃｈｃＩｍ、、　」 這：５９５−６０２　（１９１１？）４１、　Ｚｂｉｒａｌ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎ ｏｎａｔｓｈ、Ｃｈｍ−、ｍ＝Ｌ２フー１４１　（１９４１８）４２、５ｈａｒ ｓａ　ａｔ　ｍｌ＋、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、ｋｓ−、２コ１＝２５−３４　（１ ’３＄１９）４４−　Ｚｂｉｒａｌ　ａｔ　ａｌ−、Ｍｏｎａｔｓｈ−ｃｈａｍ −、、λ１蚤＝８７−９８　（１９８５）４フ−ｃｒｏｓｓ　・ｔ　ａｌ＋、Ｂ ｉｏｃｈａｍｉｓｔｒｙ、スヱ：４２７９−４２８３　（１９８９）４８、Ｚｂ ｉｒａｌ　ａｔ　ａｌ、、ｃａｒｂｏｈｙａｒ＋ａ＠ｓ、、　月ｌ：Ｃ１５−Ｃ １！１　（１９８９）４９−　Ｇｒｏｓｓ　ａｔ　ａｌ−、ＦＥＢＳ　Ｌａｔｔ 、、３ＪＪ１４５−１４７　（１９１１８）５３、Ｂｅａｕ　ａｔ　ａｌ−、Ｅ ｕｒ＋Ｊ、Ｂｉｏｃｈａｍ−、２ＪＬＱ！５３１−５４０　（１９８０）５４＋ 　Ｈａｃｋ　ａｔ　ａｌ−、丁５ｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｉａｔｔ、、λ監：１９ １−１９４　（１９８７）５１　Ｇｒｏｓｓ　ａｔ　ａｌ、、Ｅｕｒ−Ｊ＋　Ｂ ｉｏｃｂｆｉ、、λ’ＬＺｔ５８コー５＠９　（１９１１５１）５６−　Ｃｈｒ ｉｓｔｉａｎ　ａｔ　ｍｌ−、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ＋Ｒａｇ、、　遍Ｉ：４９− ６ｘ（１９Ｊ１９） ５７−　Ｃｏｎｒａｄｔ　ａｔ　ａｌ、、ＶＥＲＢ　Ｌａｔｔ、、】ｊシ１ｔ２ ９５−３００　（１９８４）５ｓ、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ　ａｔ　ａｌ、、　Ｃａ ｒｂｏｈｙｄｒ＋論、ｅ　第４＝１−１１　（１９８７）６（Ｌ　Ｇｒｏｓｓ　 ａｔ　ａｌ、、ＧＩＹｃｏｃＯｎｊ、Ｊ、、ム：１４５−１５６　（ｘｓｓ〕） ６６−　Ｐｉｎｔｏ　ａｔ　ａｌ、、Ｃａｒｂｏｈｙｃ！ｒ、Ｃｈｍ、、ｌｚ圭 ：コ１コー３１１１　（１９８３）Ｂ７．　Ｂ＠ｒｎｇｔａｉｎ　＠セ　ａｌ＋ 、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、Ｒ＠ｔｓ、、’１ＪｌｔｃＬ＜コ　（１９ａｏ）６Ｂ、 　Ｌａ＠　ａｔ　ａｌ＋、ｃａｒｂｏｈｙａｒ、Ｒ＠＠、、ユニ：１９３−２０ １　（１９７４）　。

フＯ，ｌ＠ａｎ　ａｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、、ｚ１工：５６４３ −５６５０　（１９６０）７１、Ｇｒｏｓｓ　ａｔ　ａｌ−、Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ　３Ｊｌニア３８６−フコ９２　（１９１１９）７２、　１ｊ８支−ｕ ｘ　ａｔ　ａｌ、、υ、、Ｓ＋　Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ、４．！３７，４０１　（ １９７６）。

７３、１１＠ｍ１ｅｕｘ　ａｔ　ａｌ、、υ、Ｓ、Ｐａｔ＠ｎｔ　Ｎｏ−４，１ ９５，１７４（１９７８）。

７４、Ｐａｕｌｓｅｎ　ａｔ　ａｌ、、　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、　Ｗ＠ｓ、、　 Ｌｕ：２１−４５　（１９１１４）。

フ５．　Ｓｎｂ＊ｍａｎ　ａｔ　ａｌ、、Ｃａｎ、Ｊ、Ｃｈｍ、、ｆ４＝６４４ −ｆｉ５２　（１９８４）。

７６、＾１ａｉｎ　ａｔ　ａＬ、　ｅａｒｂｏｈｙｄｒ、　Ｒ＠ｍ、、　」Ｄｌ ｌ−３１（１９９０）。

フッ、　Ｌ１虱Ｌ＊ｕｘ　ａｔ　ａＬ、、ｔＪ、ｓ、Ｐａｔａｎｔ　Ｉｔｏ、４ ，７６７．８４５　（１９１７）ＩＬ　Ｒｌｔｔｍ　ａｔ　ａｌ、、Ｉｎｔ、Ｊ 、Ｃａｎｃｅｒ、４３１：３７９−３８５　（１９９１）。

Ｂ２−　Ｒｌｔｔｅｒ　ａｔ　ａｌ＋、　Ｉｍｗｕｎｏｂｌｏｌｏｇｙ、　」１ ＝３２−４３　（１９！ｌ）Ｂ１３．　Ｂ＠ｙ＠ｒ　ａｔ　ａｌ、、　Ａｄｖ、 　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　、３：２４−１５１１　（１９１１１）３、　技術の現 況 炭水化物、そして／またはオリゴサ・ツカロイドは、様様な天然、及び病理学的 グリコ抱合体上に存在している１゜ことのほか興味深いのは、特にシアル酸残基 を糖の非還元末端に含んでいる炭水化物とオリゴサツカライドである３１゜この ようなシアル酸を末端に有する炭水化物は、一部は、炭水化物の構造とそれらの 特異的リガンドに対する結合によって担われている認識シグナルの概念に基づい て、広い範囲の生物学的現象に関わっている多数の産物中に存在している。

具体的には、このようなシアル酸を末端に有する炭水化物とオリゴサツカロイド は、トキシン４、ウィルスのような病原体５の結合のためのりセブターであると 考えられ、特に細胞の接着＠７などに関与するような様々なレクチンに対する認 識部位であると考えられる。

同様に、シアル酸を末端に有するオリゴサツカロイドをはじめとする、あるオリ ゴサツカロイドは、抗原に対する細胞を媒介とする免疫応答を抑制することかで きることか確認されている。このようなオリゴサツカロイドが、抗原に対する細 胞媒介免疫応答を抑制する能力は、１ｐｐｏｌｉｔｏら３によって記述されてい る。その参考文献は、その全体か、参照によって本発明に組み込まれている。

その上、腫瘍関連抗原中に、ある種のシアル酸を末端にもつオリゴサツカライド の存在がこの技術分野で報告されており１、一般的にこのような抗原上に存在す るオリゴサツカライドの構造は、腫瘍関連抗原の発現につながるように、正常な オリゴサツカライドからなんらかの方法で改変されている２゜メラノーマの患者 におけるガングリオシドＧＤ２　、ＧＤａとＧ　Ｍ　２のような、あるシアリル 化腫瘍関連抗原にむけられたモノクローナル抗体での受身免疫療法か期待され、 検討されつつあるＬ９゜しかし、大部分の腫瘍関連抗原は、このような腫瘍の成 長を阻害するか、予防するであろう腫瘍特異抗体の産生に導くことはできない。

いかなる理論にも制限されることなく、これは、真の腫瘍特異抗原か存在しない ためであり、そして、このような抗原の構造は、限られた数の正常組織中に発現 される同様な構造のそれと交差反応すると考えられている。その上、炭水化物の 抗原は、活性免疫において役割を演することか期待されているＴ細胞媒介免疫応 答につながることはないと、一般的に考えられている１０゜しかし、最近の若干 の研究により、腫瘍関連炭水化物が、ある場合には抗がんＴ細胞免疫１１１２、 または細胞傷害性抗体口の産生を促進することかあることが示唆されている。

炭水化物の腫瘍関連抗原か、一般的に細胞傷害性腫瘍特異的抗体を産生ずること ができないという観点から、それらの抗原性を改良するように、天然に存在する 弱い抗原を化学的に修飾することか提案されている１４゜この点に関して、炭水 化物腫瘍関連抗原状の特異的群の化学的修飾の方法が報告されており、シアリル 化オリゴサツカライド抗原におけるシアル酸の基の重要性のために、非免疫性、 または弱免疫性、または天然に存在する抗原の化学的修飾の多くは、このような 修飾は、抗原性の改善という結果になるであろうという期待の下に、シアル酸残 基を誘導化することに絞られた。

具体的には、天然のシアル酸上に存在する若干の構造的修飾により、選択された 宿主において、相当するオリゴサツカライドが免疫原性になることがこの分野の 技術によって認められている。例えば、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１ポリサツカライド 〔Ｎ−アセチルノイラミン酸のα（２−８）結合ポリマー〕は弱い免疫原である か、シアル酸の部分的な、そして無作為的な０−アセチル化から生ずる抗原性の 変動により、免疫原的性質が増加したボリサ、ｙカライドか得られた１５゜ウサ ギトランスフエチンのシアル酸部分の化学的修飾により、ウサギにおける交差反 応性自己抗体を産生ずる修飾抗原が与えられた１＠。同様に、Ｂ、　ｍｅｎｉｎ ｇｏｃｏｃｃｉのポリサッカライドのシアル酸の化学修飾による、より抗原性の 高いエピトープの創製は、Ｎ−アセチル基をＮ−プロピオニル基で置換すること によって達成された。その結果上した抗原は、増強効果を与えたばかりか、高レ ベルの交差反応性抗体を産生した１７゜他の参考文献により、ンアル酸基の化学 修飾によって得られたガングリオシｌ’　Ｇ　Ｍ　、　’　”・１９とＧ　Ｍ　 、　＄　２についての免疫原的性質か明らかにされている１８１ｇ。

人工的抗原についての最近の研究により、化学的に修飾されたソアロシト（メラ ノーマ関連グリコリピド抗原）はヒトにおいて抗原性であるが、これらの修飾シ アロシドは、天然物質と交差反応を起さないことが示唆されている８１０他方、 マウスに注射したときは、化学的に修飾されたシアリル化抗原は、天然物質と確 かに交差反応を起す抗体を産生ずる。従って、マウスにおいて発生された交差反 応性モノクローナルまたはポリクローナル抗体は、ヒトの宿主における天然物質 の存在、そして、またはその量を決定するための診断的アッセイのための基礎と して、または治療薬に任意的に結合されることができる抗体により、天然物質が 攻撃される疾患条件のための抗体療法の基礎として役立ってあろう。

シアリル化オリゴサツカロイドグリコシドの化学的修飾の結果、抗原に対する細 胞−媒介免疫応答の抑制における改善された活性を有するオリゴグリコシドを生 ずる可能性があるとも考えられる。

しかし、使用される化学的反応は、抗原、またはオリゴサツカライドか、ある意 図されないやり方で変化しないように、意図された修飾に特異的でなければなら ないという事実によって、このような抗原、またはこのようなオリゴサツカライ ドのシアル酸の化学的修飾は、実際的レベルにおいては、実行不可能である。明 らかなように、このような制限によって、オリゴサツカライド、または抗原上で 行うことができる化学的修飾の程度と型が非実際的となっている。

代替法として、先に、シアル酸を修飾してから、シアル酸類縁体を含むα−シソ アリル化オリゴサツカライド与えるように、化学合成によって、これをオリゴサ ツカライドグリコシドに結合させることも可能である。この方法においては、修 飾されたシアル酸残基は、化学的に発生され、次に、オリゴサツカライドの特異 的部位に化学的に付加される。修飾されたオリゴサツカライドは、免疫応答の抑 制のための方法において使用されるか、または、適切なアグリコン基か使用され るならば、修飾されたオリゴサッカライトは、担体に結合され、人工的抗原を含 む抱合体を発生できる可能性かある。

しかし、この方法は、このような化学合成には、常に一般的に最終生成物におい て、全般のせいぜい中程度の収率に導かれる多数のスラップの操作手順が含まれ るという事実によって複雑になる。それに加えて、α−シアロシド結合を、立体 選択的に化学合成することに内在する困難は、α−シアルリル化オリゴサツカラ イドの完全な化学合成は、修飾シアル酸については、長々しく、特に困難な工程 であろうことが示される。

上記の観点から、シアル酸の類縁体を含むα−シアリル化オリゴサッノｙライド の容易な調製のための方法を開発することは、特に有益であろう。本発明は、そ のＣＭＰ−ヌクレオチド誘導体（下記に定義される人工的供与体）としての活性 化されたシアル酸の類縁体を、サツカライドグリコシド、またはオリゴサツカラ イドグリコシド（下記に定義される人工的受容体）と効率的に結合させるために 、シアリルトランスフェラーゼを使用することによって、これを達成する。

一般的に認められるところては、シアリルトランスフェラーゼ酵素は、そのシチ ジンモノホスフェ−）　（ＣＭＰ）誘導体として活性化されたＮ−アセチルノイ ラミン酸（天然供与体）を、グリコリピッドと糖蛋白質（天然受容体）にトラン スファーさせることか知られているが、Ｎ−アセチルノイラミン酸（人工的供与 体）の類縁体のオリゴサツカライドグリコシド（人工的受容体）、及び他の人工 的受容体の非還元糖末端へのトランスファーにおけるこのようなトランスフェラ ーゼの使用は、これまでに明らかにされていない。せいぜい、技術は、シアリル トランスフェラーゼは、供与体か受容体のいずれかにおいて修飾を受入れること ができ、それでもトランスファーを生ずることが明らかにされているが、シアリ ルトランスフェラーゼは、供与体と受容体の両者において修飾を受入れることが でき、それでもなお、効率的にシアル酸の類縁体をトランスファーさせる結果と なることは示唆できていない。酵素触媒作用を含めて、触媒作用が予知できない ことを考えると、シアリルｌ−ランスフェラーゼが、人工的供与体を人工的受容 体に転移させるに足りるだけの認識の融通性を有しているという知見は、ことの ほか驚くべきことである。

発明の要約 本発明は、非還元糖の末端にＮ−アセチルノイラミン酸を存するオリゴサツカラ イドグリコシドの融通が効く合成のための方法にむけられている。特に、本発明 の方法は、それらのＣＭＰ−ヌクレオチド誘導体として活性化されたシアル酸の 類縁体を、オリゴサツカライドグリコシド受容体にトランスファーさせるために シアリルトランスフェラーゼを使用する。

したがって、その方法の局面の１つにおいて、本発明は、その方法が、以下のス テップからなるシアル酸の類縁体を含むα−シアリル化オリゴサツカライドグリ コシドの酵素的合成の方法にむけられている。すなわち、ａ）　シアリルトラン スフェラーゼを選択する：ｂ）ステップａ）において選択されたシアリトランス フェラーゼと両立するシアル酸の類縁体を選択する：Ｃ）該類縁体とそのＣＭＰ −ヌクレオチド誘導体へと変換する。

ｄ）　シアル酸類縁体を含むα−シアリル化オリゴサツカライドを形成するよう に選ばれた酸を、ＣＭＰ−ヌクレオチド誘導体から、オリゴサツカライドグリコ シドの非還元糖末端にトランスファーさせる条件下で、該ＣＭＰ−ヌクレオチド を、式 オリゴサツカライド−Ｙ−Ｒ のすリボサツカライドグリコシド受容体と、シアリルトランスフェラーゼの存在 下、シアル酸の類縁体を含むα−シアリル化オリゴサツカライドを形成するよう に選ばれた酸か、ＣＭＰ−ヌクレオチド誘導体からオリゴサツカライドグリコシ ド受容体の非還元糖末端へトランスファーされる条件下で接触させる。但し、式 中Ｒは少くとも１個の炭素原子を含むアグリコン部分を表し、Ｙは、０、ＮＨ， 及びＳからなる群から選択され、そして、オリゴサツカライドは、その非還元末 端における末端のユニットか選ばれたシアリルトランスフェラーゼと両立する２ から約１０個のサツカライドユニットのオリゴサツカライドである。

より好ましい態様においては、シアル酸の類縁体は、酵素ＣＭＰ−シアル酸シン ターゼの使用によって、そのＣＭＰ−ヌクレオチド誘導体に変換される。

さらに別のより好ましい態様においては、アグリコン部分は、−（Ａ）−Ｚ’か らなる群から選ばれる。但し、Ａは１つの結合、２から１０個の炭素原子のアル キレン基、及び＝（ＣＨ２−ＣＲ，Ｇ）。−の形の部分を表す、但し、ｎは１か ら５の整数であり：Ｒ７は、水素、メチル、またはエチルからなる基から選ばれ 、そしてＧは、水素、酸素、イオウ、窒素、フェニル、及びアミン、ノ１イドロ キシル、ハロゲン、ｌから４の炭素原子のアルキル、及び１から４個の炭素原子 のアルコキシルからなる基から選ばれる１から３個の置換基で置換されたフェニ ルからなる群から選ばれ：そしてＺ′は、水素、メチルからなる群から選ばれ： そしてＧが酸素、イオウ、窒素ではなく、Ａか結合てないときは、そのときはＺ ′も−ＯＨ。

−３Ｈ，−ＮＨ，、−Ｎｌ（Ｒ，、−Ｎ（Ｒｉ）ｔ、−Ｃ（０）ＯＨ，−Ｃ（０ ）ＯＲ，。

−Ｃ（０）ＮＨ−ＮＨ２，−Ｃ（０）ＮＨ，、−Ｃ（０）ＮＨＲ２，−Ｃ（０） Ｎ（Ｒ，）、。

及び−ＯＲ，からなる群から選ばれる。但し、各Ｒ３は独立して１から４個の炭 素原子のアルキルであり、Ｒ４は３から１０個の炭素原子のアルケニル基である 。

好ましくは、アグリコン基は少くとも２個の炭素原子、そしてより好ましくは、 少くとも４個の炭素原子の疎水性基である。最も好ましくは、アグリコン部分は 、−（ＣＨ２）、ＣＯＯＣＨ２，−（ＣＨｆｆ）ＩＯＣＨ，ＣＨ＝ＣＨ２，及び −（ＣＨ，）、ＣＨ，ＯＨからなる群から選ばれる疎水性基である。

アグリコン基が、抗原性の担体のような担体と結合することができるものである ときには、本発明の方法は、その基か抗原に対してたれ下っているシアル酸の類 縁体を含む１個以上のα−シリアル化オリゴサツカライドを有する人工的抗原の ような人工的抱合体を調製するのに有用である。人工的抗原は、非修飾抗原（す なわち、天然物質）と交差反応するモノクローナル抗体をはじめとする抗体の調 製のための抗原性決定基（少くともマウスにおいては）として役立つ。

このような方法の１つの態様は、担体に対してたれ下っているシアル酸の類縁体 を含む１つ以上のα−ソリアル化オリゴサツカライド基を有する人工的抱合体を 調製する方法であり、以下のステップからなる：ａ）　シアリルトランスフェラ ーゼを選ぶ。

ｂ）　ステップａ）において選択されるシアリルトランスフェラーゼと両立する シアル酸の類縁体を選択する；Ｃ）該類縁体をそのＣＭＰ−ヌクレオチド誘導体 に変換する。

ｄ）　シアル酸の類縁体を含むα−シアリルオリゴサッカライドを形成するよう に、選ばれた酸をＣＭＰ−ヌクレオチド誘導体からオリゴサツカライドグリコシ ド受容体の非還元糖末端へトランスファーさせる条件下で、該ＣＭＰ−ヌクレオ チド誘導体と以下の式のオリゴサツカライドグリコント受容体とを、 オリゴサツカライド−Ｙ−Ｒ。

シアリルトランスフェラーゼの存在下で接触させる。式中Ｒ１は、担体に結合さ せることができるアグリコン部分を表し、Ｙは、Ｏ，ＮＨ及びＳからなる群から 選ばれ、オリゴサツカライドは、オリゴサツカライドの非還元末端における末端 ユニットが選ばれたシアリルトランスフェラーゼと両立する２から約１Ｏ（Ｉｌ のサツカライドユニットである： ｅ）上記ステップｄ）において産生されるα−シアリル化オリゴサツカライドの アグリコン部分に結合することができる１個以上の官能基を存する担体を選び： そしてｆ）ステップｄ）で産生されたシアル酸類縁体を含む該α−シアリル化オ リゴサツカライドグリコシドの１個以上を、人工的抱合体を形成するように担体 に結合させる。

このような方法の別の態様は、担体に対してたれ下っているシアル酸類縁体を含 む１個以上のα−シアリル化オリゴサツカライド基を有する人工的抱合体の調製 のための方法であり、その方法は以下のステップからなる：ａ）　シアリルトラ ンスフェラーゼを選択する；ｂ）下の式のオリゴサツカライドグリコシド受容体 を選択する。

オリゴサツカライド−Ｙ−Ｒ。

式中、Ｒ１は、担体に結合させることができるアグリコン部分を表し、Ｙ（↓、 Ｏ，ＮＨ，及びＳからなる群から選ばれ、オリゴサツカライドは、オリゴサツカ ライドの非還元末端における末端ユニットが、選ばれたシアリルトランスフェラ ーゼと両立する２から１０個のサツカライドユニットのオリゴサツカライドであ る；Ｃ）選択されたオリゴサツカライドグリコシドのアグリコン部分に結合する ことができる１個以上の官能基を有する担体を選択する： ｄ）担体に対してたれ下っている１個以上のオリゴサツカライドグリコシドを有 する人工的抱合体を形成するように、該担体に１個以上の該オリゴサツカライド 受容体を結合させる： ｅ）　ステップａ）において選ばれるシアリルトランスフ１ラーゼと両立するシ アル酸の類縁体を選択する：ｆ）該類縁体を、そのＣＭＰ−ヌクレオチド誘導体 に変換する。

ｇ）該抱合体に対してたれ下っているシアル酸の類縁体を含む１個以上のαニジ アリル化オリゴサツカライド基を有する人工的抱合体を形成するように、選ばれ た酸がＣＭＰ−ヌクレオチド誘導体から、人工的抱合体に対してたれ下っている オリゴサツカライド基の非還元糖末端へトランスファーされる条件下で、シアリ ルトランスフェラーゼの存在において、該ＣＭＰ−ヌクレオチド誘導体を、ステ ップｄ）において製造される人工的抱合体と接触させる。

これらの態様においては、Ｒ１は、好ましくは−（Ａ）−Ｚ“からなる群から選 ばれ、但し、Ａは２から１０個の炭素原子のアルキレン基、及び−（ＣＨ２−Ｃ Ｒ８Ｇ）　、−の形の部分からなる群から選ばれる。

但し、ｎは、■から５までの整数であり；Ｒ５は水素、メチル、またはエチルか らなる群から選ばれ：Ｇは、水素、酸素、イオウ、窒素、フェニル、及びアミン 、ハイドロキシル、ハロ、ｌから４の炭素原子のアルキル、及びｌから４個の炭 素原子のアルコキシルからなる群から選ばれたｌから３個の置換基で置換された フェニルからなる群から選択され：Ｚ“は、水素からなる群から選ばれ、Ｇが酸 素、イオウ、または窒素でないときには、Ｚ＃はまた一ＯＨ，−３Ｈ，−ＮＨ， 、−ＮＨＲ＠、　、−Ｃ（０）ＯＨ。

−Ｃ（０）ＯＲ，、−Ｃ（０）ＮＨＮＨ，、及び−ＯＲ，からなる群からも選ば れる。但し、各Ｒ６は、独立して、ｌから４個の炭素原子のアルキルであり、Ｒ ７は、３から１０個の炭素原子のアルケニル基である。但し、Ａが結合であると きは、Ｚが水素でないことを条件とする。このような場合に、−（Ａ）−Ｚ“基 は、担体に結合させることが出来る基、または担体に結合させることができる基 に誘導することかできる基を明確にする。

最も好ましくは、アグリコン部分は、　（ＣＨｚ）−ＣＯＯＣＨｓ。

−（ＣＨ，）、ＯＣＨ，ＣＨ＝ＣＨ，、及び−（ＣＨ２）　１ｃＨ２０Ｈからな る群から選ばれる疎水性基である。特に、疎水性の基、そして最も特別に−（Ｃ Ｈ２）　、Ｃ００ＣＨ，、または−（ＣＨ，）６ＣＯＯＣＨ，。

または−（ＣＨり５ＯｃＦ（２ＣＨ＝ＯＨ，、または−（ＣＨ２）　、ＣＨ２０ ８基は、シアリルトランスフェラーゼによるシアル酸のトランスファーにおける 速度を、若干促進することができる。

より好ましい態様においては、シアル酸の類縁体は、ＣＭＰ−シアル酸シンター ゼ酵素の使用によって、そのＣＭＰ−ヌクレオチド誘導体に変換される。

図の簡単な説明 図１には、Ｎｅｕ５Ａｃの若干の類縁体の合成のために使用される一般的合成の 模式図が図解されている。

図２には、オリゴサツカライドグリコシド受容体３ｂから７ａの構造が図解され ている。

図３には、例８において特定化されたオリゴサラカラ応模式図か図解されている 。

図４には、Ｎｅｕ５Ａｃ、及びその類縁体のＢＧａｌ（１→３／４）ＢＧＩｃＮ Ａｃα（２→３′）シアリルトランスフェラーゼによるＢＧａｌ　（１−３）Ｂ ＧＩｃＮＡｃ−末端構造への酵素的トランスファーが図解されている。図４には 、また、Ｌ−フコースのシアリル化オリゴサツカライドグリコシド上への酵素的 トランスファーが図解されている。

図５には、Ｎｅｕ５Ａｃとその類縁体のＢＧａｌ（１→３／４）ＧＢＩｃＮＡｃ 　ａ　（２−３’　）シアリルトランスフェラーゼによるＢＧａｌ　（１−”４ ）ＢＧＩｃＮＡｃ−末端構造への酵素的トランスファーが図解されている。図５ には、Ｌ−フコースのシアリル化オリゴサツカライドグリコシド上への酵素的ト ランスファーも図解されている。

図６には、Ｎｅｕ５Ａｃとその類縁体のＢＧａｌ（１→４）ＢＧｌｃＮＡｃ　ａ 　（２−６’　）−シアリルトランスフェラーゼによるＢＧａｌ　（１→４）Ｂ ＧＩｃＮＡｃ−末端構造への酵素的トランスファーが図解されている。

図７には、Ｎｅｕ５Ａｃとその類縁体のＢＧａｌ（１−＋３／４）ＢＧＩｃＮＡ ｃ　ａ　（２−”３’　）−シアリルトランスフェラーゼによるＢＧａｌ　（１ →４）　ＢＧｌｃ　−（ラクトース）末端構造への酵素的トランスファーが図解 されている。

図８には、Ｎｅｕ５Ａｃとその類縁体のＢＧａｌ（１→３）ＧａｌＮＡｃα（２ →３′）−シアリルトランスフェラーゼによるＢＧａｌ　（１→３）　αＧａ１ ＮＡｃ　−（”Ｔ”）末端構造への酵素的トランスファーが図解されている。

図９と図１０には、シアリル化ハブテンの化学修飾による５ｉａｌｙｌ　Ｌｅｗ ｉｓ’の類縁体の合成に関与する反応の模式図が図解されている。

図１１には、シアリル化ハブテンの化学修飾によって、５ｉａｌｙｌ　Ｌｅｗｉ ｓ”の類縁体の合成に関与する反応の模式図が図解されている。

図１２には、人工抗原に対してたれさがっている１個以上のαシアリル化オリゴ サツカライド基を有する人工抗原の合成に関与している反応の模式図が図解され ている。

図１３には、１個以上のαシアリル化オリゴサツカライドグリコシドを、抗原性 担体へ結合させることによる１個以上のαシアリル化オリゴサツカライド基を含 む人工的抗原の合成に関与する反応の模式図が図解されている。

図１４には、ＢＧａｌ　（１−３／４）ＢＧｌｃＮＡｃα（２→３′）シアリル トランスフェラーゼを使用することにより、コポリマーにたれさがっている１個 以上のαシアリル化すリボサツカライド基を含むコポリマーの合成に関与してい る反応模式図が図解されている。

図１５には、ＢＧａｌ　（１→４）　ＢＧｌｃＮＡｃ　ａ　（２→６′）ノアリ ルトランスフエラーゼを使用することによって、コポリマーにたれさがっている １個以上のαシアリル化オリゴサツカライド基を含むコポリマーの合成に関与す る反応模式図か図解されている。

好ましい態様の詳細な記述 本発明は、シアリルトランスフェラーゼがシアル酸の両立する類縁体をこのよう なシアリルトランスフェラーゼの天然受容体ではないある種のオリゴサツカロイ ドグリコシド誘導体へトランスファーするという発見にむけられている。この発 見により、異なったシアル酸類縁体をきむ一連のα−ノンアリル化オリゴサツカ ライドグリコシド融通性のある合成が可能となる。この発見により、担体にたれ さがった１個以上のα−シアリル化オリゴサツカライド基を存する人工担体の融 通性のある合成も可能となる。

しかし、本発明をさらに詳細に考察する前に、まず以下の用語を定義することに する。

Ａ　定義 本発明において使用されるように、以下の用語（よ、以下に与えられた定義を有 する。

“シアル酸″という用語は、５−アセトアミド−３゜５−ディデオキシ−Ｄ−グ リセロ−〇−ガラクトーノヌロビラノシイロニック酸（“Ｎｅｕ５Ａｃ”）をは じめとする天然に存在するシアル酸の構造のすべて、及びＮ−グリコリルノイラ ミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）と９−〇−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５　、　９　 ＡＣ２）をはじめとする天然に存在するＮｅｕ５Ａｃの類縁体を意味する。これ らは、選択されたシアリルトランスフェラーゼと両立する。今日までに知られて いる天然に存在するシアル酸の完全リストは、５ｃｈａｕｅｒによって提供され ている３１゜酵素と結合し、次に適当な受容体オリゴサツカライドの構造へのト ランスファーに利用されるように、特別なシアリルトランスフェラーゼによって 認識される天然に存在するシアル酸は、そのシアリルトランスフェラーゼと両立 するといわれ、本発明においては、時折、　“両立する天然に存在するシアル酸 ”と呼ばれる。

“シアル酸の類縁体”という用語は、シアル酸ユニットが、このような構造から １個以上の官能基を導入し、修飾し、そして／または除去するように、シアル酸 の単位か化学的に修飾されたものを含むシアル酸の天然に存在する構造の類縁体 のことをいう。例えば、このような修飾は、−ＯＨ官能基の除去、アミン官能基 の導入、ハロ官能基の導入なとの結果を生ずる。

この技術分野で、シアル酸のある類縁体か知られており、例をあげれば、９−ア ジド−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−アミノ−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃ 、９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃ、９−ブロモ−Ｎｅｕ５Ａｃ、８−デオキソ−Ｎ ｅｕ５　Ａｃ　、８−エビーＮｅｕ５Ａｃ、７−ゾオキシーＮｅｕ５　Ａｃ　、 ７−ニビーＮｅｕ５Ａｃ、７．８−ビス−エピーＮｅｕ５Δｃ、４−０−メチル −Ｎｅｕ５Ａｃ、４−Ｎ−アセチル−Ｎｅｕ５Ａｃ、４．７−ゾイーデオキシー Ｎｅｕ５Ａｃ、４−オキソーＮｅｕ５Ａｃ、３−ヒドロキシ−Ｎｅｕ５Ａｃ、３ −フルオロ−Ｎｅｕ５ＡＣ酸、ならびにＮｅｕ５Ａｃの６−チオ類縁体が含まれ る。本発明において、シアル酸の類縁体を記述するのに用いられた命名法は、Ｒ ｅｕｔｅｒらによって公にされた如くである２００シアリルトランスフエラーゼ か両立する天然に存在するシアル酸をトランスファー、あるいは供与するように デザインされている限り、Ｎｅｕ５Ａｃの類縁体は、時々、本発明では“人工的 供与体”と呼ばれ、一方、両立する天然に存在するシアル酸は、本発明では、時 々、　“天然供与体”と呼ばれる。

“シアリルトランスフェラーゼという用語は、そのシチジンモノホスフェート（ ＣＭＰ）誘導体として活性化された天然に存在し両立するシアル酸を、グリコリ ピッド、またはグリコプロティン（まとめてグリコ抱合体）の末端構造にトラン スファーする酵素のことを指し、そして哺乳動物の起源を含む別の資源から得ら れるシアリルトランスフェラーゼ遺伝子のすべてか、一部を組み込み発現するよ うに遺伝学的に改良した微生物から産生された酵素を含む。数多くのシアリルト ランスフェラーゼが、文献において、トランスフェラーゼを受容するグリコ抱合 体との末端サッカライトユニットによって、一般的に識別される異なるシアリル トランスフェラーゼとして同定されている１３゜例えば、以下の末端オリゴサツ カライド構造を、グリコ抱合体上に構築するシアリルトランスフェラーゼの特性 か明確化されている：ａＮｅｕ５Ａｃ（２−３）　Ｂｇａｌ（１−３／４）ＢＧ ｌｃＮＡｃ−”ｅＮｅｕｓ人ｃ（２−６）ＢＧａｌ（１−４）ＢＧｌｃＮＡｃ− ”−″ｅＮａｕｓ人ｃ（２−３）ＢＧａｌ（１−３）ａＧａｌＮＡｃ−””ａＮ ｅｕｓ人ｃ（２−６）ａＧａｌＮＡｃ−””ａＮｅｕ５Ａｃ　（２−６）　ＢＧ ｌｃＮＡｃ−Ｗｊｏ。

様々な特異性をもった他のシアリルトランスフェラーゼが、様々な資源から単離 されている。

酵素に結合し、適切な受容体オリゴサツカライド構造にトランスファーされるよ うに、特別なシアリルトランスフェラーゼによって認識されるそれらのシチジン モノホスフェート誘導体として活性化されたシアル酸の類縁体は、そのシアリル トランスフェラーゼと両立すると言われ、本発明中においては、時々　“シアル 酸の両立する類縁体”と呼ばれる。トランスファー反応は、あるシアリルトラン スフェラーゼを使用するので、このような反Ｇにおいて使用されるシアル酸の類 縁体は、シアル酸の両立する類縁体でなければならないことは論をまたない。

Ｎｅｕ５ＡｃのＣＭＰ−ヌクレオチド誘導体は、下記の構造式の化合物を指す。

シアル酸の類縁体のＣＭＰ−誘導は、Ｎｅｕ５Ａｃ残基がシアル酸の類縁体で置 換されていることを除けば、上記に類似した構造を有する化合物のことである。

“オリゴサツカライドグリコシドという用語は、下記の化合物を指す。

０ＬＩＧＯ３ＡＣＣＨＡＲＩＤＥ　−Ｙ　−Ｒ式中、オリゴサツカライドは、オ リゴサツカライドの非還元末端における末端基が、選択されたシアリルトランス フェラーゼと両立する２から約１０個のサツカライドユニットの炭水化物構造を 表す；Ｙは、Ｏ，Ｓ、−ＮＨ。

及び結合からなる群から選択される。そしてＲは、少くとも１個の炭素原子を含 むアグリコン部分を示す。

アグリコン部分が水素や、ミセル、または他の大きな集合構造を形成することが できる蛋白質やリビッドでないので、上述のオリゴサツカライドグリコシドは、 オリゴサツカライド、及びグリコ抱合体とは異なる。

このような天然に存在するオリゴサツカライドとグリコ抱合体は、シアリルトラ ンスフェラーゼに対する既知の受容体であり、ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるシアリル トランスフェラーゼの受容体であると考えられているので、これらオリゴ−サツ カライドとグリコ抱合体は、本発明においては、時々、　“天然受容体”と呼ば れる。これに反して、本発明に用いられたオリゴサツカライドグリコシドは、こ のような”天然受容体とは異なるので”、本発明では、それは、時々、“人工的 受容体“と呼ばれる。つまり、人工的受容体は、還元糖のアノマー炭素原子に置 換基を存し、その置換基か、ヒドロキシル、ミセル、または他の巨大分子量の集 合体を形成することかできる蛋白質、またはリビッド以外であるオリゴサツカラ イドグリコシドである。したかって、この受容体は、　”人工的”ユニット、す なわち、アグリコンに結合した基を含んでいるのでオリゴサツカライドグリコシ ドの還元糖のアノマー炭素原子に、そのアグリコン部分を通じてつなげられたあ る蛋白質は、人工的受容体であろう。

随意に、本発明のオリゴサツカライドグリコシドは、オリゴサツカライドグリコ シドのサツカライドユニットの１個以上に対する化学修飾によって、このような 天然受容体からさらに区別することができる。例えば、このような化学修飾は、 １個以上のサツカライドユニットにおける１個以上の官能基の導入、そして／ま たは、除去を含むことかできるであろう。例えば、このような修飾の結果、−Ｏ Ｈ官能基の除去、サツカライドユニット（複数）の除去、アミン官能基の導入、 ハロ官能基の導入、１個以上のサツカライドユニットの導入などを生ずることか できる。

より好ましい態様においては、アグリコン部分、Ｒ１は、−（Ａ）−Ｚ’からな る群から選択される。但し、Ａは結合、２から１０個の炭素原子のアルキレン基 、及び−（ＣＨ２ＣＲ２Ｇ）ローの部分を表す。但し、ｎは、ｌから５迄に等し い整数であり：Ｒ２は水素、メチル、またはエチルからなる群から選ばれる：そ して、Ｇは、水素、ハロゲン、酸素、イ才つ、窒素、フェニル、及びアミン、ヒ ドロキシル、ハロ、ｌから４個の炭素原子のアルキル、そして、１から４個の炭 素原子のアルコキシからなる群から選ばれる１から３個の置換基で置換されたフ ェニルからなる群から選ばれる。そしてＺは水素、メチル、またはエチルからな る群から選ばれ、Ｇが酸素、イオウ、または窒素でなく、Ａかボンドでないとき は、Ｚ″も、−ＯＨ，−３Ｈ，−ＮＨ，、ＮＨＲ，、−Ｎ（Ｒ，）２．　Ｃ（０ ）ＯＨ。

−Ｃ（０）ＯＲ，、−Ｃ（０）ＮＨ−Ｎｌ（、、−Ｃ（０）ＮＨ，、−Ｃ（０） ＮＨＲ，。

ｃ（０）Ｎ　ＣＲ，）２　、及び−０Ｒ４からなる群から選ばれる。但し、各Ｒ ２は、ｌから４個の炭素原子の独立したアルキルであり、Ｒ４は、３から１０個 の炭素原子のアルケニル基である。

α−シアリル化オリゴサツカライドグリコシドが、人工抱合体を調製するために 使用されるときには、オリゴサツカライド−Ｙ−Ｒ上のアグリコン、Ｒ１はＲ３ であり、担体と結合させることができる基である。好ましくは、Ｒ１は−（Ａ） −Ｚ″からなる群から選ばれる。但し、Ａは２から１０個の炭素原子のアルキレ ン群と（ＣＨ＝　ＣＲｓＧ）ｎ−の部分からなる群から選ばれる。但し、ｎは、 ｌから５まての整数であり、Ｒ６は、水素、メチル、またはエチルからなる群か ら選ばれ：そして、Ｇは、水素、酸素、イ才つ、窒素、フェニル、及びアミン、 ヒドロキシル、ハロ、ｌから４個の炭素原子のアルキル、そして、ｌから４個の 炭素原子のアルコキシからなる群から選ばれるｌから３個までの置換基で置換さ れたフェニルからなる群から選択される；そして、Ｚ“は、水素、及びＧか酸素 、イオウ、または窒素でないときには、Ｚ＃　も、−ＯＨ，−３Ｈ，−ＮＨ２， −ＮＨＲ，、−Ｃ（０）ＯＨ。

Ｃ（０）Ｒｓ、Ｃ（０）ＮＨＮＨ２、及び−０Ｒｉからなる群から選ばれる。但 し、各Ｒ８は、独立に、ｌから４個の炭素原子のアルキルてあり、Ｒ７は、３か ら１０個の炭素原子のアルケニル基である。但し、Ａが結合であるときは、Ｚが 水素でないことを条件とする。このような場合には、−（Ａ）−Ｚ“基は、担体 に結合させることができる基、または担体に結合させることができる基に誘導す ることができる基を明確にする。適切な担体の選択は、免疫原特性を増強するの に有用であると考えられる。

担体は、蛍光標識、放射線標識との結合、または光分解性の結合アーム、または 標的部分を含む低分子量か高分子量の非免疫原性か、抗原性の担体である。好ま しくは、担体は抗原性の担体であり：したがって、人工的抱合体は、人工的抗原 である。ある場合には、非免疫原性担体を使用するのが有利なこともある。

他方、担体は、エチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、トリス（２−アミ ノエチル）アミン、Ｌ−リジルリノン、ポリーＬ−リジン、及び種々の分子量の ポリマーのような担体であることができる。

」上記のオリゴサッカライトグリコシトにおいて有用なサッカライ１へユニット （すなわち糖類）には、例をあげれば、グルコース、ガラクト−ス、Ｎ−アセチ ルグルコサミン、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、フコース、シアル酸、３−デ オキシ−〇、Ｌ−オクッロソン酸などの全天然、及び合成誘導体が含まれる。ピ ラノース形であることに加えて、Ｌ形であるフコースを除いては、オリゴサツカ ライドグリコシドにおけるサツカライドユニットは、すべてＤ形である。

上記で注意したように、本発明において開示された工程において、有用なオリゴ サツカライドグリコシドは、選ばれたシアリルトランスフェラーゼと両立する末 端ユニットを含んでいる。すなわち、このような両立する末端ユニットは、シア リルトランスフェラーゼが、オリゴサツカライドグリコシドと結合するように、 オリゴサツカライドの特別なシアリルトランスフェラーゼによる認識かできるよ うにし、更に、シアル酸の両立類縁体のオリゴサツカライドグリコシド上へのト ランスファーができるようになる。

より好ましい態様においては、本発明において記述された方法によるα−シアリ ル化オリゴサツカライドグリコシドを調製するために使用されるオリゴサッカラ イトグリコシト（ＯＬ［ＧＯ３ＡＣＣＨＡＲ［ＤＥ　ＧＬＹＣＯ３ＩＤＥＳ−Ｙ −Ｒ）は、血液型決定因子と関連しており、３から９個のサツカライドユニット を含み、該オリゴサツカライドの非還元糖部分上にシアル酸のアナログを有して いる。

“血液型物質”という用語は、免疫学的両立によって、血液を種々の型に分類す るための基礎として役に立つ赤血球細胞上の特異的グリコ抱合体抗原のことであ る。

”血液型決定因子”は、天然に存在する非還元−末端のオリゴサツカライドの部 分すべて、すなわち、血液型物質のグリカン鎖を構成している３−９ｇ１のグリ コジル残基のことである。

“血液型決定因子に関連するオリゴサツカライドグリコノド”は、（ａ）３から ９個のサツカライドユニットのすりゴサッ力うイト基を有し、（ｂ）それは、還 元糖上のアグリコン基で終っている。そして、（Ｃ）すりゴサッカライド基が（ 上に定義されたように）血液型決定基であるαシアリル化オリゴサツカライドグ リコシド、またはその類縁体のことである。

血液型決定因子の類縁体は、１つ以上のサツカライド単位において、１つ以上の 官能基を導入し、そして／または、除去するように血液型決定因子の１つ以上の モノサッカライドユニットが、化学的に修飾されている類縁体を含んでいる。例 えば、このような修飾の結果、−ＯＨ官能基の除去、サツカライド単位の除去、 または置換、アミン官能基の導入、ハロ官能基の導入、１つ以上のサツカライド ユニット（Ｓ）の導入などを生ずる。　“抗原性担体”という用語は、非還元糖 末端において、シアル酸の類縁体を含むオリゴサツカライドグリコシドの担体へ の結合かできるようにする１つ以上の官能基を含み、特別な該担体が、それにと って内生物質ではない動物に注射したとき、抗原性応答を生じる担体のことであ る。このような担体は、蛋白質〔例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　、ヒト 血清アルブミン（Ｈ３Ａ）　、ジフテリア、または破傷風Ｆ・キソイド、Ｓ−レ イヤーズなど〕であることかでき、本発明においては、時々、略号で“Ａｇ”と 呼ばれる。

人工の抗原を調製する上で、使用するために選ばれる特別な抗原性担体は、それ か、このようなオリゴサツカライドグリコシドの担体に結合することができるよ うにする１個以上の官能基を含むか、含むように誘導化できるとすれば、さほと 重要ではない。例をあげれば、適切な官能基には、カルボン酸基、アミン基（第 一級、及び第二級アミンを含む）、ヒドロキシル基、チオ基なとがある。このよ うな官能基は、抗原担体上に普通に見出され（例えば、蛋白質は多数のこのよう な官能基を含んでいる）、そして／または、技術によって認められている方法に よって、このような担体に導入することができる。

シアル酸の類縁体を含む１個以上のオリゴサツカライドを、抗原担体に結合させ ると、動物に注射するとき、この抗原は、１個以上の天然に存在しないオリゴサ ツカライドグリコシド決定因子を保有するので、本発明において、　“人工的抗 原”として記述される生成物を生ずる結果となる。このようにして作られた人工 抗原は、次式によって表すのか好ましい。

〔α−シアル酸′−オリゴサッ力ラうドーＹ−Ｒ１）ｐ−Ａｇ 式中、オリゴサツカライド、Ｙ、　Ｒ＋　、及び−Ａｇは、上に定義された如く であり、α−シアル酸′はシアル酸の類縁体を指し、モしてｐは１以上の整数で ある。この態様においては、人工的抗原、Ａｇは、抗原上の官能基を通じてオリ ゴサツカライドグリコシドに結合されており、アグリコン基、すなわちオリゴサ ツカライドのＲ１基上の相補的な官能基と結合する。

”抗体”という用語は、表面、または窩洞内に面積を占め、割分子の特殊な空間 的極性的組織体と特異的に結合し、それによって、相補的であると定義される。

抗体は、モノクローナル、またはポリクローナルであることができ、例えば、宿 主を免疫し、血清を集めるか、ハイブリット細胞系技術のようなこの分野の技術 においてよく知られた技術によって調製することができる。

この点に関して、上述の人工的抗原は、抗原上の抗原決定基を認識し、抗原決定 基に対し相補的であり、また天然物質と交差反応する抗体を発生するのに有用で ある。

“天然物質”という用語は、その物質が１個以上のα−ノリアル化オリゴサツカ ライドを含み、その物質が、その病気の動物において非免疫原性であるか、弱く 免疫原性であるか明確にされた病気の状態（例えば、腫瘍関連炭水化物抗原）と 関連した天然に存在する物質のことンアル酸類縁体か、酵素的に結合されるべき オリゴサツカライドグリコシドは、完全化学合成か、化学／酵素的合成のいずれ かによって容易に合成される。後者の場合には、グリコジルトランスフェラーゼ （シアリルトランスフェラーゼ以外の）が用いられ、サツカライドかオリゴサツ カライド上への１個以上の糖のユニットの逐次的付加が行われる。このような方 法は、この技術分野で十分知られていることであり、本発明の一部とはならない 。例えば、化学合成は、完全なオリゴサツカライドグリコシドを調製するか、次 に化学的、または酵素的にオリゴサツカライドグリコシドに結合させることがで きるサツカライドグリコシドを調製するためか、または、それに対し、１個以上 のサツカライドユニットが、酵素的に結合させることができるオリゴサイドグリ コシドを、化学的に調製するために便利な方法である。

サツカライドユニットの化学修飾は、この技術分野においてよく知られており、 その方法は、合成されるへき各個の構造のため適応され、最適化されている。一 般的には、オリゴサツカライドグリコシドのすへて、または一部の化学合成は、 まず還元糖のアノマー炭素原子上にグリコシド結合の生成を含む。具体的には、 適切に保護された天然に存在するか、化学的に修飾されたサツカライド構造（グ リコジル供与体）は、ハライド、ｌ・リクロロアセチミデート、チオグリコシド なとの脱離基を導入するように、還元ユニットのアノ゛７−中心において、選択 的に修飾される。次に、供与体は、触媒条件下で（例えば、シルバードリフルオ ロメタンスルホネートのような可溶性銀塩、ホロントリフルオライドエーセレー ト、またはトリメチルシリルトリプルオロメタンスルホネートのようなルイス酸 、またはメチルトリフルオロメタンスルホネート、またはジメチル（メチルチオ ）スルホニウムトリフルオロメタンスルホネートのようなチオグリコシド促進剤 ）、アグリコンかグリコシド結合が樹立されるへき位置に、１個の遊離ヒドロキ シル基を有する適切な形の炭水化物受容体と反応させる。この技術分野で、多様 なアグリコン部分か知られており、還元ユニットの了ツマー中心に対して、正し い立体配置で結合させることかできる。炭水化物合成の技術においてよく知られ ている両立する保護基の適切な使用により、合成された構造の選択的修飾、また は、追加糖のユニット、または糖ブロックの受容体構造への更なる付加ができる ようになる。

グリコシド結合の生成の後、サツカライドグリコシドを用いてさらなるサツカラ イドユニットの結合を行うか、選ばれた位置において、化学的に修飾を受けるか 、常法による脱保護の後、酵素的合成に使用される。一般的には、天然に存在す るか、または化学的に修飾されたサツカライドユニツｌ−のサツカライドグリコ シドへの化学的結合は、文献においてよく報告されている確立された化学を使用 することによって達成される。例えば、Ｏｋａｍｏｔｏら３２、Ｒａｔｃｌｉｆ ｆｅ　ら３３、Ａｂｂａｓ　ら３４、Ｐａｕｌｓｅｎ３Ｓ、　Ｓｃｈｍｉｄｔ” 　、　Ｆｕｇｅｄｉら２７．及びＫａｍｅｙａｍａら３１を参照のこと。これら の参考文献の各々の開示は、その全体において参考文献によって、本発明中に組 み込まれている。

他方において、酵素的結合は、それらの適切なヌクレオチドの供与体として活性 化された糖単位を、特異的なサツカライド、またはオリゴサツカライドの受容体 へ、一般的には、サツカライド、またはオリゴサツカライドの非還元糖部分にト ランスファーするグリコジルトランスフェラーゼの使用によって達成される。例 えば、Ｔｏｏｎｅら６２を参照のこと。さらに構造に修飾し、または、さらなる 修飾を導入するように、糖供与体、または酵素的反応生成物のサツカライド、ま たはオリゴサツカライドの選択された化学修飾を行うことが可能である。

Ｂ２．シアル酸の類縁体の調製 シアル酸のある特定の類縁体は、この分野においてよく知られており、十分報告 されている手順を使用した、シアル酸の化学的修飾によって調製される。例えば 、９−アジド−Ｎｅｕ５Ａｃ”、種々の９−アミノ−Ｎｅｕ５Ａｃ誘導体４０． ９−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃ”　、９−フルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃ”　、９−ブロ モ−Ｎｅｕ５Ａｃ”　、８−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃ”　、ｇ−エビーＮｅｕ５ Ａｃ４４．７−デオキシＮｅｕ５Ａｃ”　、７−ニビーＮｅｕ５Ａｃ”　、７． ８−ビス−エピ−Ｎｅｕ５　Ａｃ’６．４−０−メチルＮｅｕ５Ａｃ”。

４−Ｎ−アセチル−Ｎｅｕ５　Ａｃ”、　４−ｘビーＮｅｕ５Ａｃ”。

４．７−ゾイーデオキシーＮｅｕ５Ａｃ”　、４−オキソ−Ｎｅｕ５Ａｃ”　、 ４−デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃ”　、３−ヒドロキシ−Ｎｅｕ５Ａｃ”　、３−フ ルオロ−Ｎｅｕ５Ａｃ”酸を含む化学的に修飾されたＮｅｕ５Ａｃ誘導体、側鎖 のＣ−８またはＣ７４＠の開裂産物、ならびにＮｅｕ５　Ａｃ”の６−チオ類縁 体が報告されている。他のシアル酸類縁体に導く化学的修飾は、このような、樹 立された手順に従うであろう。

Ｂ３．シアル酸の類縁体のＣＭＰ−ヌクレオチド誘導体への活性化 シアル酸の類縁体の酵素的ｌ・ランスファーには、それらのヌクレオチド（ＣＭ Ｐ）誘導体を、あらかじめ合成（すなわち、活性化）することが必要となる。シ アル酸の誘導体の活性化は、通常、酵素、−ＣＭＰ−シアル酸ソンターゼを使用 することによって行われる。この酵素は容易に入手でき、文献には、９−置換Ｎ ｅｕ５Ａ　Ｃ２＠、　３Ｌ　４０．５ｆｉ−５７、７、ピーＮｅｕ５Ａｃ”　、 ７．８−ピスーエビーＮｅｕ５Ａｃ”　４−０−メチル−Ｎｅｕ５Ａｃ”、４− デオキシ−Ｎｅｕ５Ａｃｓ０．４−アセタミド−Ｎｅｕ５Ａｃ”　、７−ジオキ シ−Ｎｅｕ５Ａｃ”　、４．７−ゾイデオキシーＮｅｕ５　Ａｃ”　、　Ｎｅｕ ５　Ａｃ”の６チオ誘導体、及びＮｅｕ５０Ｈ（Ｋ　Ｄ　Ｎ）などの様々なシア ル酸類縁体の活性化の例か提供されている。

Ｂ４．シアル酸の類縁体のオリゴサツカライドグリコシシアル酸の両立する類縁 体のヌクレオチド誘導体と、その両立する受容体（すなわち、選ばれたシアリル トランスフェラーゼによって認識される非還元末端上に末端サツカライドユニッ トを有するサツカライドグリコシドかオリゴサツカライドグリコシド）は、シア ル酸の類縁体が受容体にトランスファーされる条件下で、選ばれたシアリルトラ ンスフェラーゼの存在において、互に結合される。当然のことだが、使用される サツカライド、またはオリゴサツカライドは、使用される特殊なシアリルトラン スフェラーゼの基質として機能しなければならない。

この点に関して、技術は、通常シアル酸は天然の受容体へ酵素的にトランスファ ーされ、若干のシアリルトランスフェラーゼは、受容体の構造におけるある修飾 に耐えることかできるか、他のシアリルトランスフェラーゼは、１つの型の受容 体に対して厳格な特異性を示す６３ということを認識している。技術は、また修 飾が構造のアグリコン部分であるときには、殊に、ある場合には、人工的受容体 は、シアリルトランスフェラーゼによって耐えられるが、糖の部分の修飾は、よ り予告しにくい結果に導かれるということを認識している。例えば、受容体の糖 部分におけるすへての化学的修飾が耐えられることは必ずしもてきない。例えば 、ＢＧａｌ（１→３／４）ＢＧ１ｃＮＡｃα（２→３′）シアリルトランスフェ ラーゼは、末端のＢＧａ　１　（１→３／４）ＢＧＩｃＮＡｃ−構造にＮｅｕ５ Ａｃをトランスファーできる。しかし、この状況下で、β−ガラクトースの４と ６の位置における水酸基は、この酵素の認識にとって掩めて重要であり、従って 、これらの位置の１個以上の化学的修飾は、酵素による修飾オリゴサツカライド を認識てきないという結果を生ずることになり得る。他方、ＧＩｃＮＡｃユニッ トの２及び６の位置における広汎な修飾は受入れられ、そして若干の修飾は、β −ガラクトースの２の位置と、ＧｌｃＮＡの３の位置において受け入れられる。

同様に、シアル酸の類縁体（すなわち、人工的供与体）が、酵素的にトランスフ ァーされようとするならば、その類縁体のＣＭＰ誘導体も、シアリルトランスフ ェラーゼによって認識されることが必要である。この点に関して、技術は、ある シアリルトランスフェラーゼは、天然に存在するシアル酸に対する若干の修飾に 耐えることかでき、依然として、これらのシアル酸の誘導体を、適切な末端受容 体構造を有するグリコプロティン、またはグリコリビットに対して、なおトラン スファーすることを認識している。

驚くべきことに、シアリルトランスフェラーゼは、人工的受容体に対して、人工 的供与体をトランスファーするのに足りるだけの認識の柔軟性をもっていること が見出された。このような柔軟性のために、オリゴサツカライドグリコシドの非 還元糖末端において異なるシアル酸類縁体を含む一連のオリゴサツカライドの容 易な合成かできるようになる。

上で注目されたように、シアル酸の両立できる類縁体のヌクレオチド誘導体は、 両立する受容体（すなわち、選ばれたシアリルトランスフェラーゼによって認識 される非還元糖末端上に、末端サツカライドユニットを存するサツカライドグリ コシド、またはオリゴサツカライドグリコシド）と該類縁体が、該受容体にトラ ンスファーされる条件下で、シアリルトランスフェラーゼの存在において結合さ れる。この技術分野において知られている適当な条件には、両立する受容体と両 立するシアル酸類縁体のＣＭＰ−誘導体の０．１Ｍナトリウムカコジレートのよ うな適切なバッファー中の混合物に、適切なシアリルトランスフェラーゼを添加 し、ｐＨ６，５から７．５、及び２５°Ｃから４５°Ｃの間の温度、好ましくは 、３５−４０°Ｃて１２時間反応させることか含まれる。その結果得られたオリ ゴサツカライドは、ＨＰＬＣ、イオン交換−、ゲル−１逆相−１または吸着クロ マトグラフィーを含む常法により、分離精製されることかできる。

形成されたならば、α−シリル化オリゴサツカライドグリコシドは、さらに、こ の化合物を誘導化するために、化学的、そして／または酵素的手段によってさら に修飾することができる。例えば、本発明の下記の例において説明されるように 、ある場合では、Ｌ−フコース、またはトランスフェラーゼによって認識される し一フコースの両立する類縁体は、末端シアリルＬｅｗｉｓ”またはソアリルＬ ｅｗｉｓ“部分を表す構造を提供するように、酵素的にフコシルトランスフェラ ーゼによってトランスファーすることかできる。この例は、他のグリコジルトラ ンスフェラーゼか、グリコジル基をトランスフェラーゼによって認識されるαシ アリル化オリゴサツカライドグリコントに付加するために使用することができる 限り、それに制限されるわけてはない。この後者の面は、オリゴサツカライドグ リコシドに対してなされる修飾が、望ましい酵素的トランスファーと両立しなけ ればならない限り重要である。

さらに、α−シアリル化オリゴサツカライドグリコシドは、これらの化合物のさ らなる誘導化を提供するために、化学的に修飾することができる。例において説 明されるように、このような化学的修飾には、シアル酸の類縁体上の９−アジド 基のアミン基への還元が含まれ、この基は、９−アセタミド誘導体のような別の 誘導体へとさらに官能基化することができる。同様に、シアル酸の類縁体上に見 出されたカルボキシル基は、α−シアリル化オリゴサッカライトグリコシドに関 して、ラクトン化、還元、またはアミドへの変換を経て選択的に変換することか できる。

上に引用された１つ以上の酵素的段階において、酵素は、試薬の反応と酵素から の生成物の回収を容易にするように、固体の支持体に結合させることかできる。

Ｂ５．オリゴサツカライドグリコシドの抗原性担体への結合 １、α−シアリル化オリゴサツカライドグリコシドの人工的担体への結合 人工的抗原を形成するように抗原担体に結合することかできる官能基を有するア グリコンを含むα−シアリル化オリゴサツカライドを結合（連結）させるための 手順は、文献に報告されている６３＠４゜一般的には、このような抗原性の担体 は、アグリコン（またはその誘導）上の官能基と反応する少くとも１個の相補的 反応性官能基を含む。官能基と使用される結合手順か、使用されるオリゴサツカ ライドグリコシドの性質と、そして特にオリゴサツカライドグリコシド上に存在 する官能基（例えばシアル酸類縁体上のカルボキシル基）と確実に両立するよう 注意を払うへきである。本分野の技術において報告されている１つの適切な結合 手順は、アグリコン上のエステル官能基（ＣＯＯＲ’　、Ｒ’は脱離基であるか 、または、ｌから６個の炭素原子のアルキルのような脱離基に変換しうる基）を 使用し、それは、既知の手段を経てアシルアジド（−ＣＯＮ、）に変換される。

次に、アシドは、既知の手順にしたかって抗原担体に結合することかてきる＠５ ＠６゜ 別の適切な手順は、末端エチレン基、好ましくは、アリロキシ基−０−ＣＨ２Ｃ Ｈ＝ＣＨ２のような活性化されたエチレニノク基をもつアグリコン部分を使用し 、次に、担体に対して結合させるために既知の方法によって活性化することがで きる６７１゜ ひと度、α−シアリル化オリゴサッカライトグリコシドのアグリコンの官能基か 活性化されると、結合反応は一般的に、アグリコン上の官能基または活性化官能 基（活性化が必要ならば）が、担体上の相補的な反応性官能基と反応する条件下 で、モル等量、または実質上１モル過剰のこのオリゴサツカライドグリコシドを 担体を含む粗生物に加えることによって行われる。担体上の反応部位の数と関連 して加えられたα−シアリル化オリゴサッカライトグリコシドの量は、各担体に 付いているα−シアリル化オリゴサッカライトグリコシドの置換基の数を示す。

そして、この数は選ばれた担体とともに変化する。一般的には、担体あたり少く とも１個のこのような置換基を提供するのに足りるだけのオリゴサツカライドグ リコシドか加えられる。好ましくは、置換基の数は、各担体あたりＩから約６０ であり、より好ましくは、置換基の数は、各担体あたり約１から約２０である。

本発明における下記の例は、反応性の官能基を有する担体の、アグリコン部分上 の相補的な反応性官能基か、アグリコン部分上の相補的反応性官能基へ活性化（ 誘導される）することかできる官能基を有するα−シアリル化オリゴサッカライ トグリコシドへの結合のための特異的手順を提供する。これらの例によって、本 発明は、制限を受けない。

２、人工担体に対するオリゴサッカライ！・グリコシドの結合に続くシアリルト ランスフェラーゼによるシアル酸の類縁体の付加 上記で注意したように、α−ソアリル化すりゴサッカライドグリコントを人工的 抗原へ結合させるのに有用な結合反応は、使用した結合反応が意図されていない やり方で（例えば、その−ＣＯＯＨ基において）シアル酸類縁体に影響してはな らないという事実によって制限される。

この制限をさけるために、オリゴサツカライドの還元糖末端において、シアル酸 の類縁体を含む抗原に対してたれ下っている１個以上のオリゴサツカライド基を 含む人工的抗原を供給するために、まずアシアロオリゴサツカライドグリコシド を、そのアグリコンの官能基によって抗原性担体へと結合させ、それからシアル 酸の類縁体を１個以上のアシアロオリゴサツカライド基を含む人工的抗原へ酵素 的にトランスファーすることが育苗である。

この態様においては、１個以上のアシアロオリゴサツカライドを含む人工抗原は 、人工受容体（本発明において、その用語か定義された如く）である。その理由 は、アシアロオリゴサツカライド基は、還元糖のアノマー炭素原子のヒドロキシ 基を通じて抗原につながっているのではなく、アグリコンの官能基を通じてつな がっているからである。

本態様においては、アシアロオリゴサツカライドグリコシドの抗原性担体への結 合は、上記のセクションＢ５（Ａ）に記述されたのと同じように達成される。同 様に、シアル酸の類縁体の１個以上のアシアロオリゴサツカライド基を含む基を 含む人工的抗原への酵素的トランスファーは、上記のセクションＢ４に記述され たのと同じように達成される。同様に、シアル酸の類縁体の１個以上のアシアロ オリゴサツカライド基を含む人工的抗原への酵素的トランスファーは、上記セク ションＢ４において記述されたのと同じようにして達成される。

Ｂ６．α−シアリル化オリゴサツカライドグリコシドの抗原性担体以外の担体へ の結合 低分子量の担体は、阻害能の増加を伴って、ジー、トリー、または多価性ノ１ブ テンを提供する可能性かある。

適切にシアリル化されたポリマーの担体、またはシアリル化モノマーと適切なモ ノマーとの共重合は、非免疫原性またはバイオコンパチブルな生成物につながる 可能性かある。人工的リポソーム、またはミセルは、抗原、薬物の担体、または 多価性阻害剤として使用できるであろう。したかって、抗原性担体へ結合させる ことに加えて、本発明において記述されたα−シアリル化オリゴサ・ツカライト グリコシトは、他の担体に結合されるか、組み込まれることかできる。例えば、 このようなオリゴサツカライドグリコノド らば、オリゴザツカライトグリコシドは、そのとき、ミセル、及びリポソームに 組み込まれることかできる。

（２−ノアリル化オリゴサツカライドを含むリポソームとミセルは抗原として、 または細胞性粘着現象／ターゲツティングの阻害剤として有用である。

同様に、使用される担体は、１個以上の反応性官能基を含む固相粒子であること ができる。そして、アグリコン上に、相補的な反応性官能基を含む１個以上のα −シアリル化オリゴザツカライドグリコシドは、固相と結合させることができる 。このような結合は、上記セクションＢ５と似たやり方で進行するであろう。こ の態様においては、その結果得られる固相粒子は、このようなトランスフェラー ゼを含む水溶液から、酵素（シアリルトランスフェラーゼではない）、レクチン 、または他の生物学的リセプターを分離するのに有用であろう。反応性官能基を 含む固相粒子は、本技術分野で十分よく知られており、セファロース、アミノプ ロピルーツリカ、アミノプロピル−ＣＰＧ　（穴の大きさを制御した多孔性ガラ ス）、アミノエチルセルローズ、トリサクリル’　−ＮＨ、ガラスピーズ、ポリ アクリルアミド、粒子などを含む。

α−シアリル化オリゴサツカライドグリコシドは、また、非抗原性、バイオコン パティビリティ、そして担体の分子あたり多数のα−シアリル化オリゴサツカラ イドグリコシド基を組み込む能力のような、それらの特性によって選択されるポ リマーの性質をもった高分子量担体と結合させることもできる。このようなポリ マーの担体の調製を説明する例は、本発明中に以下に示される例において提出さ れる。

１個以上のαシアリル化オリゴサツカライドグリコシドを含む、固相、またはポ リマーの担体は、例えば、固相またはポリマー担体が天然物質を含むことが疑わ れた検体に加えられる拮抗的イムノアッセイにおいても有用である。修飾された αシアリル化オリゴサツカライドグリコシドに対して産成され、そして天然物と 交差反応する抗体を、次に検体に加える。このような抗体は、検出し得るシグナ ルを提供するように、適切に標識される。

標識された抗体の固相、またはポリマーの担体に対する結合の程度は、検体中に 見出された天然物の量に依存している。インキュベーションの後、固相、または ポリマーの担体は次に検体から単離され、担体に結合した抗体の量かシグナルの レベルを測定することによって突き止められる。標準に対する測定シグナルの相 関により、検体中の天然抗原のレベルの評価が行われる。

その上、非免疫原性抱合体は、多価抱合体が、−価ハブテンよりももっと効果的 な阻害剤であると考えられる細胞の粘着現象の阻害剤として有用であろう。

Ｃ１有用性 本発明の方法は、α−結合を経て、オリゴサツカライドグリコシドの非還元糖末 端に結合したシアル酸の類縁体を含むオリゴサツカライドグリコシドを調製する のに有用である。次には、このようなオリゴサツカライドグリコシドは、抗原に 対する細胞性免疫応答を抑制するのに有用である３゜ さらに本発明の方法は、人工抗原を産生するように、抗原性担体に結合させるこ とかできるオリゴサツカライドグリコンドの非還元糖末端にα−結合を経て結合 したシアル酸の類縁体を含むオリゴナツカライトを調製するのに作用である。し たかって、このようなオリゴサツカライドグリコントは、人工抗原の調製におけ る中間体として作用する。

人工抗原は、天然物質と交差反応する抗体を産生するように、例えば、マウスに 注射することができる（すなわち、物質、例えばシアリル類縁体か、一般に天然 物質のオリゴサツカライドのシアル酸基と比較して、人工抗原のすりゴサッカラ イドの末端２−４糖においてのみ変化するように、人工的抗原のそれと類似した αシアリル化オリゴサッカライＦ基を有する抗原）。このような抗体は、天然物 質を含むことか疑われる検体において、天然物質の存在、そして／またはレベル を定量する目的のためのイムノアッセイ技術において使用することができる。

上記に加えて、抗体（特にモノクローナル抗体）は、特別な天然抗原（すなわち 天然物質）のだめの抗体療法において使用することがてきる。具体的には、人工 的抗原は、天然抗原における抗原性決定基に類似した１個以上の抗原性決定基を もつように、人工抗原は合成できる。

このような人工的抗原の決定基は、その非還元末端に、α−結合を経て結合した シアル酸の類縁体を含むすりゴサッ力ライドグリコシドである。マウスに注射す ると人工的抗原は、天然抗原と交差反応する抗体を産生ずる。

このような抗体は、採取し、天然抗原の抗体治療に使用することができる。より 好ましくは、抗体は、モノクローナル抗体である。人工的抗原の抗原決定基を認 識し、天然の抗原上の類似した抗原決定基と交差反応するモノクローナル抗体を 発生するハイプリドーマ系を単離する方法は、この分野の技術において十分よく 知られている。

随意的に、このような抗体は、治療薬と組み合せて、それらの治療効果を増強す ることができる。

同様に、人工的抗原以外の有用性は、上に述へられている。

以下の例は、本発明をはっきり説明するために提供され、いかなる方法において もこの発明の範囲を制限するものと解釈されるへきてはない。

これらの例では、以下に、特に他にことわりかなけれは、使用される略号は、そ れらの一般的に受け入れられた意味を存している： ＡＢ＝ＡＢパターン Ａｇ０ＴＦ＝ンルハートリフルオロメタンスルホネートａＸ−アキシアル ＢＳＡ−ウソ血清アルブミン ＣＭＰ−フチジン−５−モノホスフエートｄ＝ダブレツト ｄｄ−ダブレソ［・のダブレット ｄｄｄ＝ダブレットのダブレットのダブレットＤＴＨ＝遅延型過敏反応 ｅｑ＝エカトリアル ＦｕｃＴ＝フコシルトランスフェラーゼＧ　Ｄ　Ｐ　−Ｆ　ｕｃ＝グアノソン− ５−ジホスフォーし一フコース ｉ、　ｒ、　＝赤外 ｍ−多重線 ｐｈｔｈ＝フタルイミド ＳＴ＝シアリルトランスフェラーゼ ｔ＝Ｉ−リブレット ｔ、　１．ｃ、　＝薄層クロマトグラフィーＡＧＩＸ８（ホルメート型）　＝Ｂ ｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｒｉｃｈｍｏ口ｄ、　ＣＡから入手のイオン交換樹脂ＡＧＩＸ８（ホルメート型 ） Ｄｏｗｅｘ　５０Ｗ　ｘ　８　（Ｈ’″型）　＝Ｄｏｗ　ＣｈｅＩＴｌｉｃａｌ 、　Ｍｉｄｌａｎｄ、Ｍ［から入手のイオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ　５０Ｗ　ｘ　 ８　（Ｈ“型） ＩＲ−Ｃ５０樹脂（Ｈ＋型）　＝Ｒｏｈｍ　＆　Ｈａａｓ。

Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ、　ＰＡから入手のイオン交換相ＨＷ　Ｉ　Ｒ−Ｃ５ ０樹脂（Ｈ＋型） 市販の成分は製造業者によって列挙されており、適切な場合は注文番号。引用さ れた若干の業者は以下の通りである・ ｒａｔｒｏｎ＝Ｉａｔｒｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐ ａｎＭｅｒｃｋ＝Ｅ、Ｍｅｒｃｋ　ＡＧ、　Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、　Ｇｅｒｍａ ｎｙＭｉｌｌｉｐｏｒｅ＝Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ、、Ｂｅｄｆｏｒｄ、 　ＭＡ。

Ｗａｔｅｒｓ−Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｍｉｌｆ ｏｒｄ、　ＭＡ。

例 以下の例において、例１−１３では、多数のオリゴサッカライトグリコントの合 成か説明されており、それに対して例１４〜１６では、αシアリル化オリゴサツ カライドグリコシドの抗原担体、ポリマー担体なとのような担体への結合か説明 されている。

下記に述へられる例の若干は、それらが、シアル酸の類縁体（“人工的供与体” ）てはなく、シアル酸の天然に存在する構造（“天然供与体”）を使用している ので、本発明の真の例ではない。しかし、これらの例は、適切なシアリルトラン スフェラーゼによるシアル酸のオリゴザツカライトへのトランスファーを例証す る目的でここに組み込まれている。

例１−１６において、引用されたオリゴサツカライドグリコシドは、アラビア数 字て呼ばれ、それらは、図１−５に描かれている。

例１−１６の１つ以上において、あらかじめ被覆されたシリカゲルプレート（Ｍ ｅｒｃｋ、　６０　Ｆ　２６４）が、分析用１：、１．ｃ、のために使用され、 スポットはエタノール中５％硫酸溶液でスプレーした後に加熱することによって 検出された。シリカゲル６０　（Ｍｅｒｃｋ、　４０−６３　ａｍ）かカラムク ロマトグラフィー用に使用された。イアトロンビーズは、イアトロン社から入手 しく注文番号６Ｒ３−８０６０）　。Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶフィルター（０，２２ μｍ）はミリポアー社から入手した。Ｃ＋ｓＳ　ｅｐ　−Ｐａｋカートリッジと バルクＣ＋ｓニアリカゲルはＷａｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓから入手した 。

市販の試薬か化学反応において使用され、溶剤は、常法にしたかって精製乾燥し た。他にことわりがなければ、反応混合物は、ジクロロメタンで希釈し、重曹水 の希薄液、続いて水で洗浄することによって処理した。硫酸マグネシウム上で乾 燥した後、溶剤は浴槽温度３５°Ｃまたは必要ならばそれ以下で蒸発させること によって除去した。

’Ｈ−ｎ、ｍ、ｒ、は、内部標準としてｃｔ＋ｃｔｓ中テトラメ中小トラメチル シラン２．２２５にセラ１へされたアセトンとともに、特にことわりがなければ 、環境温度で３００　ＭＨｚ（Ｂｒ’ｕｋｅｒ　Ａ　Ｍ　−３００）で記録した 。ケミカルシフトとカップリングコンスタント（観察されたスプリッティング） は、ファーストオーダーであるとして報告され、部分的ｎ、　ｍ、　ｒ、データ ーのみ報告する。目Ｃ−ｎ、ｍ、ｒ、スペクトラは、ＣＤＣｌ５中で、参照とし てテトラメチルシランを７、５　ＭＨｚに、Ｄ２０中ジオキサンを６７．４にセ ットして記録した。

特に他に注意がなければ、シアル酸の類縁体は、出発物質の必要な場所に、適切 な置換を行って既知の手順にしたがって調製された。以下の誘導体は、文献に報 告された手順の便利な改変によって調製された：図１には、シアル酸の類縁体に 使用される一般的合成模式図か図解されている。

以下の例！−４において、アンダーラインを引いたアラビア数字によって参照さ れた化合物は、表１と図１中に描かれている。

例１−−５−アセタミドー９−アジド−３，５，９−）リープオキシ−Ｄ−グリ セロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロビラノンロニック酸（−９Ｎ２−Ｎｅｕ５Ａｃ ）Ｉｂの合成。

乾燥ジクロロメタン（１３ｍｌ）中のグリコジルクロライド３８（２，８３ｇ、 ５．５７　ｍ　ｍｏｌ）をジクロロメタン（８ｍｌ）中のヘンノルアルコール（ ５、Ｏｍｌ、４８．２ｍｍｏｌ’）、モレキュラーシーブ４人（１８，５ｇ、粉 砕した）、乾燥ノルバーカーボネート（４，２ｇ、１５．２ｍ　ｍｏｌ）の混合 物に加えた。混合物は、暗所で４時間攪拌し、ジクロロメタン（５０ｍｌ）で希 釈し、セライトを通して濾過した。常法通りのワークアップの後、残渣をヘキサ ンとエチルアセテートの３二２の混合物を溶出液として使用し、シリカゲル上の クロマトグラフィーにかけた。次に、生成物を同じ溶剤の４＝５の混液で溶出し 、（１，９６ｇ、６０％）の純粋物質と小量の不純物質を含む０．３３ｇ（１０ ％）の物質を得た。’Ｈ−ｎ、ｍ、ｒ、　：　５．４３６（ｄｄｄ、　ＩＨ，Ｊ ７．ｇ　８．５．　Ｊ−、ｍ　２．５Ｈｚ、　Ｈ−８）　、　５．３１７Ｃｄｄ 。

ＩＨ，Ｊｓ、、　１．８Ｈｚ、　Ｈ−７）、　５．１１０　（ｄ、　ＩＨ，Ｊ、 、、、　９．５１１ｚ。

ＮＨ）、　４．８４９（ｄｄｄ、ＩＨ，Ｊ２ａ１１．４１２．０．　Ｊｓ−，４ ４，５，Ｊ４．８９．５Ｈｚ、　Ｈ−４）、　４．７８８　ａｎｄ　４．３９７ （ＡＢ、　２Ｈ，Ｊ、、、　１２．０Ｈｚ。

ｂｅｎｚｙ−１ｉｅｓ）、　３．６４２（ｓ、　Ｃ０ｚＣＨａ）、　２．６２９ （ｄｄ、　ＩＨ。

Ｊｚ、、、、、、　１２．５Ｈｚ、　Ｈ−３ｅｑ）、　２．１４０．２．１＋３ ．２．０＋７．１．９９７、１．８５７．　（５ｓ、　１５Ｈ，４０Ａｃ、　Ｉ 　ＮＡｃ）、　１．９８６（ｄｄ、　ＩＨ，Ｈ−３ａｘ）。

上記物質（１，５ｇ、　２．５８ｍ　ｍｏｌ）は、触媒量のナトリウムメトキサ イドを含む乾燥メタノール（２０ｍｌ）中で、２２°Ｃて５時間、脱−〇−アセ チル化された。Ｄｏｗｅｘ　５０ＷＸ８　（Ｈ’型）で脱イオン化した後、溶剤 を除去し、生成物−３９（１，０ｇ、９４％）を与え、それを次のステップに使 用した；　’Ｈ−ｎ、ｍ、ｒ、　（ＣＤＣＬ）：　４．８１５　ａｎｄ　４．６ １９（ＡＢ、　２Ｈ，Ｊ、。１１．５Ｈｚ、、ｂｅｎｚｙｌｉｃｓ）、　３．８ ０２（ｓ。

Ｃ０ｔＣＨ，）、　３．５８２（ｄｄ、　ＩＨ，Ｊ、、、　９．０．　Ｊｓ、ｔ 　０．５Ｈｚ、　Ｈ−６）。

２．７５２（ｄｄ、　Ｉｔ（、Ｊｓ、、、ｓ、、　１２．５．　Ｌｅｌｌ、４　 ４．５Ｈｚ、　Ｈ−３ｅｑ）。

２．０３９（ｓ、　３Ｈ，Ｎ　Ａｃ）、　１．８６］、（ｄｄ、　ＩＨ，Ｊ、、 、、、　１１．０Ｈｚ、　Ｈ−３ａｘ）。

ピリジン（０，１ｍ１）中のパラートルエンスホニルクロライト（０，ｌ　２５ 　ｇ、　０．６５ｍ　ｍｏｌ）の溶液を、０″Ｃにおいて、ピリジン（１，１ｍ ｌ）中（７）３９　（０，２４８ｇ、　０．６０ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミ ノピリジン（０，０１ｇ）の１　溶液へ注射筒で加えた。０°Ｃて４時間攪拌し た後、メタノール（０，ｌ　Ｏｍｌ）を加え、混合物を、乾燥トルエンと共に共 蒸発させた。残渣は、溶出液としてアセトニトリルを使用し、速やかにクロマト グラフィーを行い、まだ若干の不純物を含んでいるトシレート（０，２１ｇ、６ ２％）を与えた。ナトリウムアジド（０，１９ｇ＋　２．９２ｍ　ｍｏｌ）を、 この物質のジメチルホルムアミｔ”　（０，５ｍｌ）溶液（０，２１ｇ、　０． ３７ｍ　ｍｏｌ）に加えた。混合物を、６５°Ｃて１８時間撹拌した後、セライ トを通して濾過し、溶剤を真空中で蒸発させた。残渣を、エチルアセテートとア セトニトリルの６．１の混合物を溶出液として使用し、シリカゲル」二のクロマ トグラフィーにかけ、生成物±０　（１，１３６ｇ、８５％）を与えた；ｉ、ｒ 、シｃｍ−’　２１１０（Ｎｓ）：　’Ｈ−ｎ、ｍ、ｒ、：　５．７７５（ｄ、 　ＩＨ，Ｊａ、ＮＨ９，０Ｈｚ、　ＮＨ）。

４．８１６　ａｎｄ　４．４７０（ＡＢ、　２Ｈ，Ｊ　、、、　ｌ］、５Ｈｚ、 　ｂｅｎｚｙｌｉｃｓ）。

’　３．７３８（Ｓ、　Ｃ０２ＣＨ２）、　２．８７１（ｄｄ、　ＩＨ，、＋３ −、．４４．８゜Ｊ　３ａａ、３ａｘ　１３．叶ｚ、　Ｈ−，３ｅｑ）、　２． ０８６．（ｓ、　３Ｈ，ＮＡｃ）、　１．９６４（ｄｄ、　ＩＮ、　Ｊｚ、、４ １１．５Ｈｚ、　Ｈ−３ａｘ）。

上述の化合物上０　（０，ｌ　０５　ｇ、　０．２４ｍ　ｍｏｌ）を０．２５Ｎ 水酸化ナトリウム（２ｍｌ）中２２°Ｃて３時間放置した。Ｄｏｗｅｘ　５０　 Ｗｘ　８　（Ｈ＋型）の添加によって、ｐＨを６とし、濾過した後、凍結乾燥し て回収した物質を、クロロホルム、メタノール、水の６５：３５：５の混合物を 溶出液として使用し、イアトロビーズ上のクロマトグラフィーにかけた。適切な 画分は、生成物（０，０８７ｇ。

８６％）を与えた。この化合物（０，１００ｇ、０．２３５ｍ　ｍｏｌ）を、０ ．０２５Ｎの塩酸（３ｍｌ）中８０°Ｃで６時間加熱した。溶液を、水酸化ナト リウムで中和し、凍結乾燥した。生成物を、クロロホルム、メタノール、水の６ ５：３５：５の混液を使用して、イアトロビーズ（０，６ｇ）上のクロマトグラ フィーにかけ、−Ｌ±−（０，０６７ｇ。

８５％）を与えた；　’Ｈ−ｎ、ｍ、ｒ、　：　４．１０６−３．８９５軸、　 ５）＋）。

３．６３９（ｄｄ、　Ｉｌ−１，ＪＬＩ　３．０．　Ｊ、、、、１３．ＯＨ２， Ｈ−９）、　３．５２８（ｄｄ、　Ｉｔ（、Ｊ、、Ｉ　６．ＯＨｚ、　Ｈ−９’ ）、　２．２４９（ｄｄ、　ＩＨ，Ｊ、、。４４．５．　Ｊｓ、、、ａ、、　１ ２．５Ｈｚ、　Ｈ−３ｅｑ）、　２．０９０（ｓ、　３Ｈ，ＮＡｃ）。

１．８５２（ｄｄ、　ＩＨ，Ｌ、、、４１１．ＯＨ２，Ｈ−３ａｘ）。

例２−−５−プロピオナミド−３，５−ディデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラ クト−２−ノヌロビラ０、１８　ｍ　ｍｏｌ）の溶液を、２２°Ｃて０．５時間 放置し、続いて９５°Ｃて７時間処理した。次にｐＨをＩＲ−Ｃ５０の樹脂（Ｈ ＋型）の添加により７．５に調節した。樹脂を濾過した後、濾液を真空下で蒸発 させ、残渣を５酸化燐上て乾燥した。

次に、プロピオン酸無水物（０，Ｉ　２　ｍｌ、　０．９４　ｍ　ｍｏｌ）を、 乾燥メタノール（１，５ｍｌ）とトリエチルアミン（０゜２ｍ１）の混液中にお ける上述の生成物の懸濁液へ注射筒で加え、０°Ｃて攪拌した。３時間後に、さ らにプロピオン酸無水物（０，０２５ｍｌ、　ｏ、　Ｉ　９５ｍ　ｍｏｌ）を加 え、混合物を０°Ｃてさらに２時間攪拌した。混合物は、メタノールと共蒸発さ せ、残置の水（２ｍｌ）溶液を、Ｄｏｗｅｘ　５０ＷＸ８　（Ｈ’型、６ｇ）を 通過させた。回収された両分を、真空中て蒸発させ、残置をクロロホルムとメタ ノールの３．１混液を溶出液として使用し、イアトロビーズ（５ｇ）上のクロマ トグラフィーにかけ、４１（０，０６４６ｇ、８６．５％）を与えた；　’Ｈ− ｎ、ｍ、ｒ、　：　４．８００．４．５７８（ＡＢ、　２Ｈ，Ｊ、、　Ｉｌ、Ｏ Ｈｚ、　ｂｅｎｚｙｌｉｃｓ）、　３．５８０（ｄｄ、　ＩＨ。

Ｊｓ、ｓ　９．０．　、Ｊｇ□１．ＯＨｚ、　Ｈ−６）、　２．７７６（ｄｄ、 　ＩＨ，、Ｌ。４４．５．　ＪＳ、、、３．、　＋２．５Ｈ２，ｔ（−３ｅｑ） 、　２．３１６（ｑ、　２Ｈ，Ｊ　７．５Ｈｚ。

上記のヘンシルグリコシド（０，１１５ｇ、　０．２７８ｍｍｏｌ）の水（５ｍ ｌ）溶液を、炭末上５％パラジウムの存在下で、大気圧下で、２２°Ｃ５時間水 素添加した。セライトを通して濾過し、次にミリポアーフィルターにより濾過し て得られた濾液を凍結乾燥して、化合物１ｆ（０゜０７４　ｇ＋　８２．５９６ ）を得た；　’Ｈ−ｎ、ｍ、ｒ、：　３．７２−４．１０（叱　Ｈ−・Ｌ　−５ ，−７，−８，−９）、３．６１＝１（ｄｄ、ＩＨ，Ｊｌ、１ｍ　６．５゜Ｊ、 ０．、ｂｌｌ、７５）１ｚ、　Ｈ−９ａ）、　３．５３０（ｄｄ、　ＩＨ，Ｊｓ 、ｓ　９．０゜（ｑ、２．３１５．　Ｊ　Ｔ、５Ｈｚ）　ａｎｄ　Ｈ−３ｅｑ　 （ｄｄ、＋３．、．２．、　１１．５Ｈｚ、Ｊｓ、＊、４４．５Ｈｚ）］、１． ８８０（ｔ、ＩＨ，＋３．、．２．、Ｉｌ、５Ｈｚ。

Ｈ−３ａｘ）、１．１３０　（ｔ、３Ｈ，ＣＨｓ）。

例３−−５−アセタミドー３，５−ジデオキシ−Ｄ−ガラクト−２−オクツロソ ニック酸（Ｃ８−Ｎｅｕ５Ａｃ）１　＊の合成 ３９からの１１の合成は、Ｈａｓｅｇａｗａら４＠による発表された手順に従う が、報告されたのと異なる出発物を使用した。詳細を述べれば、２．２−ジメト キシプロパン（３ｍｌ）中の−３９（０，５２ｇ、　０．１２５ｍｍｏｌ）の懸 濁液を、パラトルエンスルホン酸（０，５ｍｇ）の存在下で２２℃で１．５時間 攪拌した。若干量のトリエチルアミンで中和した後、混合物を蒸発させ、残渣を 、クロロホルムとメタノールの１６：１の混合物を使用して、シリカゲル上のク ロマトグラフィーにかけ、４２　（０，０４９ｇ、８８％）を与えた。

４２　（０，０５４ｇ、０．１８５ｍｍｏｌ）を無水酢酸（１ｍｌ）とピリジン の２ｚ１混合物中で５０°Ｃて５時間保ってアセチル化した。常法のようにワー クアップした後、溶出液としてエチルアセテートを使用して、残渣をシリカゲル 上でクロマトグラフィーにかけ、アセチル化生成物（０，０９１ｇ、９２％）を 与えた；　’Ｈ−ｎ、ｍ、ｒ、　：　５．４２０（ｄｄ、　ＩＨ，Ｊ、、、　１ ．５．　ＪＬｓ　３．５Ｈｚ、　）ｌ−７）、　５．１９６（ｄ、　ＩＨ。

Ｊ、Ｎ、　９．０Ｈｚ、　ＮＨ）、　５．００９　（ｄｄｄ、　ＩＨ，＋４．３ ．、１３．０゜＋４．３ｅ。５．０．　、Ｌ、ａ　ｌｏ、０ｆ（ｚ、１（−４） 、　４．７９７　ａｎｄ　４．４９８（ＡＢ。

２Ｈ，Ｊ　、、、１１．５ｔ（ｚ、ｂｅｎｚｙｌｉｃｓ）、３．７７６　（ｓ、 ３１４゜ＣＬＣＨｓ）、２．７２４（ｄｄ、ＩＨ，Ｊ３−、、ｚ、、１３．０Ｈ ｚ、Ｈ−３ｅｑ）−２，１５１，２，０３２，１，８９５（３ｓ、９Ｈ１２０Ａ ｃ、ｌ　ＮＡｃ）、２．０３２（ｔ、ＩＨ，Ｈ−３ａｘ）、１．３６３　ａｎｄ 　１．３５０　（２ｓ、６Ｈ，ｍｅｔｈｙｌｓ）。

」１記の生成物（０，０９１ｇ、　０．１６９ｍ　ｍｏｌ）を７０％酢酸中、４ ０°Ｃて４時間加熱した。混合物を真空中でｌ・ルエンて共蒸発させた。乾燥残 渣を、無水メタノールに溶解し、ナｌ−リウムメタパーアイオデート（０，０５ ９ｇ、−０、２７５ｍ　ｍｏｌ）の存在において、２２°Ｃて２時間攪拌した。

混合物を、セライトのパッドを通して濾過し、メタノールで洗浄した。合体した 濾液をナトリウムポロハイドライド（０，０３６ｇ、　０．９５ｍ　ｍｏｌ）の 存在下で、０℃で２５分間攪拌した。次に、混合物を、０°Ｃて若干の酢酸（０ ，２ｍ１）とともに０°Ｃて攪拌し、その後、溶剤を蒸発させ残渣を得、真空下 で１５分乾燥し、ピリジンと無水酢酸（６ｍｌ）　５　：　Ｉの混液中、２２° Ｃて２０時間アセチル化した。常法通りワークアップした後、回収した残渣を、 エチルアセテ−１〜を溶出液どして使用し、シリカゲル上のクロマトグラフィー にかけ、生成物を与えたか、未だ若干の分離されない不純物を含んでいた。乾燥 した物質（０，０７４ｇ、未だ若干の不純物を含んでいる）を、乾燥メタノール （５ｍｌ）に溶解し、ナトリウム（３ｍｇ）の存在下、室温で３時間攪拌した。

Ｄｏｗａｘ　５０　Ｗｘ　８（Ｈ＋型）で脱イオン化し、濾過した後、溶剤を真 空で蒸発させ、クロロホルムとメタノールの１５＝１の混合物を使用して、残渣 をシリカゲル上でクロマｌルブラフィーにかけ、純粋な生成物上４　（０，０４ ７ｇ、７８％）を与えた；　’ｆ（−ｎ、ｍ、ｒ、　：　（ＣＤ、ＯＤ）：　４ ．７２４　ａｎｄ　４．４１６（ＡＢ、　２３．４５６　（ｄｄ、　ＩＨ，Ｊｌ 、　９．５．　Ｊｌ、、　１．ＯＨｚ、　Ｈ−６）、　２．６４２（ｄｄ、　Ｉ Ｈ，Ｊｌ、、、４４．５．　Ｊ＋、、、！、、　１２．５Ｈｚ、　Ｈ−３ｅｑ） 、　１．９３８（ｓ、　３Ｈ，ＮＡｃ）、　１．６９９（ｔ、　ＩＨ，Ｌ、、、 ４１２．５Ｈ２，Ｈ−３ａｘ）。

上記の物質（０，０２２ｇ、０．０５７ｍｍｏｌ）を、０．２５Ｎの水酸化中、 ２２°Ｃて５時間攪拌し、溶液をＤｏｗｅｘ　５０ＷＸ８　（Ｈ＋型）で中和し 、濾液を凍結乾燥して白色固形物（０，０１９ｇ、９０％）を得た。この生成物 を、水（２ｍｌ）に溶解させ、成木上の５％パラジウム（４ｍｇ）の存在下で、 ２２°Ｃて３時間水素添加した。混合物は、最初にセライトを通して、次にミリ ボアーフィルターを通して濾過した。濾液は凍結乾燥して、望ましい生成物上± （１３，３ｍｇ、　、９４％）を得た；　夏Ｈ−ｎ、　ｍ、　ｒ、：３．４６２ −４．０９３　（叱　６Ｈ）、２．２８７　（ｄｄ、ＩＨ，Ｊ、、、、４４．５ ゜Ｊ、、、、１．、１２．５Ｈｚ、　Ｈ−３ｅｑ）、　２．０５２（ｓ、　３８ ．　ＮＡｃ）、　１．８５３（ｔ、　ＩＨ−Ｌ−ａ、＜　１２．５　Ｈｚ、Ｈ− ３ａｘ）。

例４−−５−アセタミド−３，５，７−１−リゾオキシ−β−Ｄ−ガラクトー２ −ノヌロビラノシロニック酸（７−ｄ−Ｎｅｕ５Ａｃ）　ｌ　ｄの合成上４の合 成は、事実上Ｚｂｉｒａｌら４′によって発表された手順に従うが、異なる出発 物を用いて行う。詳細に述へれば、イミダゾール（０，１３ｇ、１．９３ｍ　ｍ ｏｌ）とｔｅｒｔ　−ブチル−ジメチルシリルクロライド（０，１３５ｇ、　０ ．８９ｍｍｏｌ）を４２　（０，１１ｇ、　０．１９ｍｍｏｌ）のジメチルホル ムアミド（２ｍｌ）中の溶液に加えた。室温で４時間放置した後、溶剤を真空で 除去し、残渣をクロロホルムに溶解し、常法により、ワークアップした。エチル アセテートとヘキサンの１１混合物を使用して、生成物をシリカゲルのクロマト グラフィーにかけると、モノシリル化誘導体か与えられた（０．ｌ０１ｇ、９２ ％）：〔α）　ｏ　”　２．６６　（Ｃ，０，６，クロロホルム）：’Ｈ−ｎ、 ｍ、ｒ、：　５．＋９５（ｄ、　ＩＨ，Ｊａ　Ｎ、　７Ｈｚ、　Ｎ）Ｉ）、　４ ．８５３ａｎｄ　４．６０３（ＡＢ、　２Ｈ，Ｊ　、、、　１１．５Ｈｚ、　ｂ ｅｎｚｙｌｉｃｓ）、　３．７３６（Ｓ、　Ｃ０２ＣＨ３）、　２．６９２（ｄ ｄ、　ＩＨ，Ｊｌ、、、４４．５．　Ｊ３．、．３．、１３．０Ｈｚ、　Ｈ−３ ｅｑ）、　２．０２２．（ｓ、　３Ｈ，ＮＡｃ）、　１．８８４（ｄｄ、　Ｉｔ （。

Ｊｏ。４　１１．０Ｈｚ、　Ｈ−３ａｘ）、　１．４０５．１．３７５（２Ｓ、 　６Ｈ。

ｍｅｔｈｙｌｓ’）、０．８６８（ｓ、９Ｈ，ｔ−ｂｕｔｙｌ）、０．０９３　 ａｎｄ　０．０８４（２ｓ、　６Ｈ，ｍｅｔｈｙｌｓ）。

５ｅｅ−ブチルリチウム（シクロヘキサン中１．３Ｍ、０゜６５ｍｌ、　０．８ ５ｍ　ｍｏｌ）、続いて二硫化炭素（１，２５ｍ１゜２０、８　ｍ　ｍｏｌ）を 、無水テトラヒドロ’７ラン（２０ｍｌ）中の」二足化合物（０，４３７ｇ、　 ０．７７ｍ　ｍｏｌ）の溶液に、−３０°Ｃて滴下して加えた。−２５°Ｃて０ ．５時間攪拌した後、ヨウ化メチル（１，６ｍｌ、２５．６ｍ　ｍｏｌ）を除々 に室温にまであたためた。蒸発後、残渣やヘキサンとエチルアセテートの４．１ 混合物を溶出液として、シリカゲル上のクロマトグラフィーにかけ、サンテート （０，３２７ｇ。

６５％）を与えた　〔α）　Ｄ　９３．９　（Ｃ，０，６５５，クロロフォルム ）　；　’Ｈ−ｎ、ｍ、ｒ、　：　６．３８８（ｄｄ、　ＩＨ，Ｊｌ、７１．０ ゜Ｊ７．＊　２．５１（ｚ、Ｈ−７）、５．６１０（ｄ、ＩＨ，Ｊ６ＮＮ　７． ０ＦＩＺ、　Ｎ）Ｉ）、４゜７７８、　４．４６６（ＡＢ、２Ｈ，Ｊ、、、　１ １．５Ｈｚ、ｂｅｎｚｙｌｉｃｓ）、３．７７８（ｓ、　Ｃ０２Ｃ旦、）、　２ ．６６２（ｄｄ、ＩＨ，Ｊ、、、、４４．５．　Ｊ、、、、２．、１２．５Ｈｚ 、Ｈ−３ｅｑ）、２．５８４（ｓ、３）１．　ＣＨ２）、１．８８３（ｓ、３Ｈ 。

ＮＡｃ）、１．６９３（ｄｄ、ＩＨ，Ｌ、、、４１１．５Ｈ２，Ｈ−３ａｘ）、 １．３１．５（ｓ。

６Ｈ，ｍｅｔｈｙｌｓ）、０．８２５（９Ｎ、ｔ−ｂｕｔｙｌ）、０．０２５． 　０．０９２（２ｓ。

６Ｈ，ｍｅｔｈｙｌｓ）。

アゾビスイソブチロニトリル（０，００４ｇ）とトリーｎ−ブチルチンハイトラ イｌ”　（０，５ｍｌ、　１．８６　ｍ　ｍｏｌ）を、上記のザンテー１−　（ ０，３２ｇ、　０．４８ｍ　ｍｏｌ）の乾燥トルエン（３ｍｌ）の溶液に加えた 。１００″Ｃて７時間加熱した後、溶剤は乾燥１〜ルエンて共蒸発させ、残基を 、ヘキサンとエチルアセテートの３：２、続いて、１：１の混合物を溶出液とし て使用して、シリカゲル上のクロマトグラフィーにかけ、７−デオキシ生成物（ ０，２６０ｇ。

７０％）を与えた；　’Ｈ−ｎ、ｍ、ｒ、　：　５．３３４（ｄ、　ＩＨ，Ｊｓ Ｎｕ　７゜ＯＨｚ、　ＮＨ）、　４．７４０．４．４５５（ＡＢ、　２Ｈ，、Ｊ 、、、　１１．６Ｈｚ。

ｂｅｎｚｙｌｉｃｓ）、　３．６９０　（ｓ、　ＣＯ□ＣＨ，）、　２．６２８ （ｄｄ、　ＩＨ。

Ｊｌｅａ、４４．２．　Ｊｌ。ｊａｙ　、Ｉ２．９ｔ（ｚ、　Ｈ−３ｅｑ）、　 １．９１４（ｓ、　３Ｈ。

ＮＡｃ）、　１．８０５（ｄｄ、　Ｉｔ（、Ｊｒ、、、４１０．９Ｈｚ、　Ｈ− ３ａｘ）、　１．７１８ａｎｄ　！　、　５９７（ｍ、　２Ｈ１Ｈ−７ａｎｄ　 Ｈ−７’）、　１．３２５（ｓ、　６ｔ（。

ｍｅｔｈｙｌｓ）、　０．８０４（９Ｈ，ｔ−ｂｕｔｙｌ）、　０．０１０．０ ．００９（２ｓ、　６Ｈ。

ｍｅｔｈｙｌｓ）。

上記化合物（０，２６０ｇ、　０．４７ｍ　ｍｏｌ）を７０９３酢酸中、７５° Ｃて７．５時間加熱した。トルエンと共蒸発させた後、残渣をクロロホルムとメ タノールの１０１の混合物を使用して、ノリ力ゲル上のクロマトグラフィーにか け、４３　（０，１５７ｇ、８４％）を得た；　’Ｈ−ｎ、ｍ、ｒ４．８６０　 ａｎｄ　４．６５５（ＡＢ、２）１．　Ｊ　、、、１１．５Ｈｚ、ｂｅｎｚｙｌ ｉｃｓ）。

３．８３４　（Ｓ、　Ｃ０２Ｇ　Ｈｚ）、　２．８０６（ｄｄ、　ＩＨ，Ｊ３ｓ ｏ、４４．５゜Ｊ、、、、３．ｘ１２．５Ｈ２，Ｈ−３ｅｑ）、　２．０６９（ ｓ、　３）１．　ＮＡｃ）、　１．８８１　（ｄｄ、ＩＨ，Ｊ２ａｍ、４１２． ５Ｈｚ、　Ｈ−３ａｘ）、　１．６９８（ｍ、　２Ｈ，Ｈ−７１０ａｎｄ　Ｈ− ７’）。

化合物４３　（０，１５７ｇ、　０．３９６ｍ　ｍｏｌ）を０．２５Ｎ水酸化す １−リウム（６ｍｌ）中、室温で５時間保持した。

Ｄｏｗｅｘ　５０ＷＸ　８　（Ｈ”型）で中和、及び濾過後、生成物（０，１４ ９ｇ、９７％）を溶液の凍結乾燥の後回収した。この生成物（０，ｌ　４６　ｇ 、　０．３８ｍ　ｍｏｌ）を水中（５ｍｌ）で炭末上の５％パラジウム（０，０ ＩＯｇ）の存在下で室温で５時間水素添加した。混合物を、セライトとＭｉｌｌ ｅｘ−ＧＶ　（０，２２、ｃｚｍ７４ルターを順次通させて、濾過した。濾液は 、凍結乾燥してＩｄ　（０，ｌ０５ｇ、９４％）を得た。’Ｈ−ｎ、　ｍ、　ｒ 、　：　Ｃｈｒｉｓｔｉａｎによって報告された通りであるｓｏ。

表１は、調製されたシアル酸の類縁体を要約している。

Ｂ、シアル酸類縁体のＣＭＰ誘導体の合成例５−−Ｎｅｕ５ＡｃのＣＭＰ誘導体 の合成ＣＭＰ−シアル酸シンターゼは、仔牛の脳から抽出し、Ｈｉｇａら１のも との手順の僅かな改良方法によって部分精製した。ルーチン作業として、約２０ ０ｇの組織をＣｕ１ｓｉｎａｒｔブレンダー（１分間に３つの３０秒のバースト ）中で４００ｍ１の２５ｍＭトリス／塩酸、ｐＨ７，５，１０ｍＭマグネシウム クロライド、１０ｍＭの食塩、２．５　ｍＭジチオエリトリトール、０．５　ｍ Ｍフェニルメチルスルホニルフルオライドとともにホモジナイズした。ホモジネ ートは、１時間攪拌し、次に２３．ＱＯＯＸｇで１５分間遠心分離した。上清を デカントし、ペレットを一回上記と同じバッファー２００ｍ１で再び抽出した。

上清は、合体し、２８．０００Ｘｇて遠心分離した。上清をガラスウールで濾過 し、粗抽出物を得た（　５１５ｍ１．４．７ｍｇ蛋白質／ｍｌ。

約９０単位の酵素）。

塩の濃度を、固形塩化カリウムで０．４Ｍに調製した後、粗抽出物を攪拌し、固 形アンモニウムサルフェートを、１５分間にわたって３５％飽和（２０８ｇ／ｌ ）まで加えた。溶液は、さらに１５分間攪拌し、氷上に１時間保ち、２８，００ ０Ｘｇて３０分間遠心分離した。沈澱物は捨て、上清は固形アンモニウムサルフ ェート（１６３ｇ／ｌ）を１５分間にわたって添加することによって、６０％飽 和まで調節した。さらに１５分間攪拌した後、懸濁液を氷上に一夜放置し、次に 、上記のように遠心分離した。結果として得られたペレットは、共沈澱物を除く ために１５０ｍ１の６０％アンモニウムサルフェートで洗浄した。洗浄したペレ ットは、０．００８　Ｕ／ｍｇの比活性を有する７０−８０単位の酵素を含む。

酵素は、Ｋｅａｎら７０によって記述されたようにアッセイされた。そして、１ 単位の酵素活性を３７°Ｃで１分間あたりに形成される１Ｍモルの生成物として 定義した。

ペレット中に存在する酵素は、低温室で数週間貯蔵することができた。合成のた めに酵素を使用する前に、ペレットを５０ｍＭ）リス／ＨＣＩ　、　ｐＨ９，０ 、３５ｍＭマグネシウムクロライド、３ｍＭ２−メルカプトエタノール（活性化 バッファー）の最小量中に懸濁させ、１００容量の同じバッファーに対して、− 夜透析した。透析された酵素は、９．０００Ｘｇで１０分間遠心分離した。酵素 活性の９０％以上を含む上清を直接に合成用に使用した。

シアル酸類縁体のＣＭＰ−誘導体を、上記の如く合成し、Ｈｉｇａら１とＧｒｏ ｓｓら７′によって報告された手順の改変方法によって精製した。例えば、７− ｄ−Ｎｅｕ５Ａｃｌｄ（表１　、　２０ｍｇ、６９ｍ　ｍｏｌ）を１５Ｕの上記 の透析酵素を使用して、４倍過剰のシチジントリホスフェートの存在下で、１２ ｍ１の活性化バッフチー中活性化した。

適切な場合は、シアル酸類縁体の変換は、Ｋｅａｎら７０によるナトリウムボロ ハイドライドでの還元の後、シアル酸のための常用のチオバルビッール酸アッセ イによって推定された。生成物をＧｒｏｓｓら７１による冷アセトンで抽出した 。真空下（−１５°Ｃにおいて）でアセトンを蒸発させた後、濃縮溶液を４０° Ｃで１０ｍＭ水酸化アンモニウムで平衡させたＢｌｏ−Ｇｅ１のＰ−２（２，５ Ｘ９１ｃｍ）のカラムにかけ、固液で６０ｍ１／ｈの流速で溶出した。両分（１ ｍｌ）を２７３ｎｍにおける吸収によるノチジンについてアッセイし、最初のピ ークに相当する画分をプールし、真空中で濃縮し、残香を凍結乾燥してＣＭＰ− ７−ｄ−Ｎｅｕ５Ａｃ　（２ｄ、３０ｍｇ、約９４％）を得た。この物質は、　 ’Ｈ−ｎ、ｍ、ｒ、　（表ＩＩ）による微量の不純物を示したが、直接シアリル トランスフェラーゼでの反応に使用した。ある場合には、（２ｅ、２ｇ、２ｈ） 、　’Ｈ−ｎ。

ｍ、　ｒ、スペクトルは、ＣＭＰ−誘導体か、未反応のシアル酸の若干を含んで いることを示した。

以下の表２は、表１に述べられたＮｅｕ５Ａｃの類縁体から調製されたＮｅｕ５ Ａｃの類縁体のＣＭＰ−誘導体、ならびに、これらの化合物に関する　’Ｈ−ｎ 、ｍ、ｒ、の一部か図示されている。

ＣＭＰ−シアル酸誘導体についての１Ｈ−〇、ｍ、ｒ、データとＣ，オリゴサツ カライドグリコシド受容体の合成例６−７は、オリゴサツカライドグリコシド受 容体の合成を説明しており、それは、次に、α−シアリル化オリゴサツカライド グリコシドを提供するように、両立するシアリルトランスフエラーゼと共に使用 できる。３ｂから７ａの構造か、図２に図解されている。

オリゴサツカライドグリコシド−４ｂ、Σｂ、５ｆ、６ａと７ａは、それぞれ、 Ｌｅｍｉｅｕｘら７２．　Ｌｅｍｉｅｕｘら７２゜Ｐａｕｌｓｅｎ　ら”、　５ ａｂｅｓａｎ　ら７６、及びＬｅｍｉｅｕｘ　ら７７の手順に従って合成された 。

オリゴサツカライドグリコシド−４ｄ−と１旦は、オリゴサッカライトグリコシ ド±亙と１互の合成のために報告された手順に従って合成したか、８−メトキシ カルボニルオクチルの代りにメタノールを使用した。オリゴサツカライドグリコ ツト５ｅと５ｇを、Ｐａｕｌｓｅｎら７４とＡｌａｉｓら７６の手順にしたがっ て合成したか、メタノールの代りに、８−メトキソカルボニルオクタノールを用 いた。すへての場合において、オリゴサツカライドグリコントは、適切な溶媒混 合物で、イアトロピーズ上のクロマトグラフィーによって精製し、回収した物質 を、Ｂｉ。

−Ｇｅｌ　Ｐ２、またはＳ、ｅｐｈａｄｅｘ　Ｌ　Ｈ２０上でクロマトにかけ、 水で溶出した。回収された物質は、水から凍結乾燥し、さらに５酸化燐上て真空 て乾燥した。

例６−−２−ヒドロキシノニル２−アセタミド−２−デオキシー〔β−Ｄ−ガラ クトピラノシル−（１−３）−０１−β−Ｄ−グルコピラノシド４酢酸ナトリウ ム（０，２００ｇ）とナトリウムボロハイドライド（０，０６０ｇ）を、＋４° Ｃに冷却した水とメタノールの１０：ｌの混合物（２０ｍｌ）中のジサッカライ ド４ｂ　（０，１００ｇ、０．１８９ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。

２４時間後に、さらにナトリウムボロハイドライド（０゜０２０ｇ）を、＋４° Ｃに維持された反応混合物に加えた。

同じ温度で４８時間後に、ｐＨは酢酸の添加によって、５−６とした。次に、溶 液は、過剰のメタノールとともに共蒸発された。残渣を水（１０ｍｌ）に溶解し 、Ｃ１ｌシリカゲルのカラムを通過させ、さらに水で洗浄した。メタノールで溶 出した後、溶媒を真空中で蒸発させた。残渣を水とメタノールの１０．１の混合 物に溶解させ、ＩＮ水酸化ナトリウムの添加によって、ｐＨを１３−１４とした 。混合物を、ｔ、１．ｃ、（６５：３５：５−クロロホルム、メタノールと水） によって未反応物質４ｂの消失が示されるまで室温で放置した。次に、Ｄｏｗｅ ｘ　５０　Ｗ　Ｘ　８（Ｈ″″型）の添加によって混合物を中和し、樹脂を濾過 して除いた。得られた溶液を濾過して取除いた。その結果得られた溶液を、ＡＧ ＩＸ８（ホルメート型）のカラムを通過させた。溶出液を凍結乾燥し、残渣を、 水とエタノールの１１ａ合物を使用して、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｌ　Ｈ２５４５（ ｄ、ＩＨ，ｔｌｌ、ｔ　８．ＯＨｚ、Ｈ−１）、４．４３０（ｄ、ＩＨ，Ｊｌ２ ゜７．５Ｈｚ、Ｈ−１’）、２．０２５（ｓ、３Ｈ，ＮＡｃ）、１．５４３（ｍ 、４Ｈ）、ａｎｄｌ、３０４（ｍ、　ｌ０Ｈ）：　ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｓ　；　 １２Ｃ−ｎ、ｍ、ｒ、　（ＤｚＯ）　：　１７５゜３（Ａｃ）、１０４．３６　 （Ｃ−１°）、　１０１．７２　（Ｃ−１）、　６７．７２．６１．８５゜６１ ．６０　（ｔｈｒｅｅ　Ｃ）１．０ｔ（）。

例７−−９−ハイドロキシノニル２−アセタミド−２−デオキシ−〔β−Ｄ−ガ ラクトピラノシル−（１４）−０−）−β−Ｄ−グルコピラノシ５２０（ｄ、　 ＩＨ，Ｊｌ、２７．５Ｈ２，Ｈ−１）、　４．４７３（ｄ、　ＩＨ，、＋２７． ６）１ｚ、　Ｈ−１’）、　２．０３３（ｓ、　３Ｈ，ＮＡｃ）、１．５４３（ ｍ、　４Ｈ）　ａｎｄｌ、３０２（ｍ、ｌ０Ｈ）：　ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｓ　： 　”Ｃ−ｎ、ｍ、ｒ、（ＤＪ）　：　１７５゜２３（Ａｃ）、１０３．７１　ａ ｎｄ　＋０１．８８（Ｃ−１ａｎｄ　Ｃ−１’）、　６０．９３．６１゜８５　 ａｎｄ　６２．７１　（ｔｈｒｅｅ　ＣＨ２０Ｈ）。

例８−−５−アリルオキシペンチル２−アセトアミド−２−デオキシ−〔β−Ｄ −ガラクトピラノシル−（１−３）−０−）−β−Ｄ−グルコピラノシド４Ｃの 合成 この例と例９のための合成経路は、図３中に述べられアリルプロ？イド（２，５ ｍｌ、　０．０２９モル）を、乾燥ツメチルホルムアミド中、１．５−ベンタン ジオール（３ｇ、　０．０２９ｍｏｌ）とナトリウムハイドライド（１，２ｇ、 オイル中８０％に分散）の混合物に滴下して加えた。

攪拌は、室温で一夜継続された。ｔ、１．ｃ、　（２：　１−トルエンと酢酸エ チル）は、未だ若干の未反応ベンタンジオールの存在を示した。未反応のナトリ ウムハイドライドは、メタノールの添加によって分解された。混合物は、真空蒸 発によって５０ｍ１に濃縮した。メチレンクロライド（１５０ｍｌ）で希釈した 後、溶剤を水で洗い（３回）、硫酸マグネシウム上で乾燥し、真空下で蒸発させ た。残渣を、トルエンと酢酸エチル２：１の混合物を溶出液として使用し、シリ カゲル上のクロマトグラフィーにかけた。適切な画分から、化合物２９　（０， ９３１ｇ、３０％）が得られた。

ａｌｌｙｌｉｃｓ）、３．６６　ａｎｄ　３．４６（ｔｗｏ　ｔ、２）１　ｅａ ｃｈ、Ｊ＝６．５Ｈｚ。

０−ＣＨ２）、　１．６４（ｍ、４Ｈ）　ａｎｄ　１．４４（ｍ、２Ｈ）　：ｍ ｅｔｈｙｌｅｎｅｓ）　：　”Ｃ−ｎ、ｍ、ｒ、　（ＣＤＣｈ）　：　１３４． ７　ａｎｄ　１１６．６（ｅｔｈｙｌｅｎｉｃｓ）、　７１．６　、７０．１（ ＣＨ２−０−ＣＨ２）、　６２．１（ＣＨｘＯＨ）　３２．２．２９．２　ａｎ ｄ　２２．２　（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｓ）。

ｂ、５−アジロキンペンチル２−デオキシ−２−フタルイミド−β−Ｄ−グルコ ピラノシド１１の合成ジクロロメタン（５ｍｌ）中の３．４．６−１−ジ−０− アセチル−２−フタルイミド−Ｄ−グルコビラノシルブメタン（１０ｍｌ）中の アルコール２９　（１，３３ｍｌ、１０ｍ　ｍｏｌ）、シルバードリフルオロメ タンスルホネート（２，５７ｇ、Ｉ　Ｏ，Ｏｍ　ｍｏｌ）、及びコリジン（１， ２３ｍ１゜９、０　ｍ　ｍｏｌ）の混合物に、−７０°Ｃで滴下して加えた。− ７０°で３時間攪拌した後、ｔ、１．ｃ、（２・１−トルエンと酢酸エチル）に より、出発物のブロマイドと反応生成物が同じＲ７をもつことが示唆された。若 干のトリエチルアミンの添加の後、反応混合物を、ジクロロメタンで希釈し、常 法通りワークアップした。シラツブ状の残渣を、トルエンと酢酸エチルの５．１ 混合物を使用して、シリカゲル上のクロマトグラフィーにかけ、化合物３１（４ ，０ｇ、７１％）を得た。

’Ｈ−ｎ、ｍ、ｒ、（ＣＤＣ１３）：　５．８０　（ｍ、２Ｈ，−ＣＨ＝ａｎｄ 　Ｈ−３）。

５．３６　（ｄ、　ＩＨ，Ｊｌ、２８．５Ｈ２，Ｈ−１）、　５．１８　（ｍ、 　３Ｈ。

＝ＣＨ，ａｎｄ　Ｈ−４）、　２．＋３．２．０６．１．８７　（３ｓ、　３Ｈ ｅａｃｈ、３０Ａｃ）、　１．４０　（２Ｈ）ａｎｄ　１．１５　（ｍ、　４Ｈ ）：　ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｓ。

メタノール（０，５００ｍｌ）中のナトリウムメトキサイドの０．２Ｍ溶液を、 ０°Ｃに冷却した乾燥メタノール（３０ｍｌ）中の化合物３１　（４，ＯＯｇ、 ７１ｍｍｏｌ）の溶液に滴下して加えた。混合物を、ｔ、１．ｃ、　（ｌ　Ｏ： 　Ｉ−クロロホルムとメタノール）か出発物質の消失を示すまで、０°Ｃて２時 間攪拌した。反応混合物を、Ｄｏｗｅｘ　（Ｈ＋型。

乾燥）で、０°Ｃて脱イオン化した。溶剤の濾過と蒸発により、残清か残り、そ れをクロロホルムどメタノールの＋００：５の混合溶液を溶出液として用いて、 シリカゲル上のクロマトグラフィーによって精製し、化合物３２（２，３６ｇ、 ７６％）を得た。

’Ｈ−ｎ、ｍ、ｒ、（ＣＤＣＩｓ）ニア、７０　ａｎｄ　７．８０　（ｍ、　４ Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃｓ）。

５．８２　（［０，１８，−ＣＨ＝）　、５．１７　（ｍ、３Ｈ，＝ＣＨ＊　ａ ｎｄ　Ｈ−１）、１．３８　ａｎｄ　１．１０　（ｍ、６Ｈ，ｍｅｔｈｙｌｅｎ ｅｓ）；　’″Ｃ−ｎ、ｍ。

ｒ、（ＣＤＣＩｓ）＋　１３４．９　ａｎｄ口６．６（ｅｔｈｙｌｅｎｉｃｓ） 、　９８．３　（Ｃ−１）。

５６．６　（Ｃ−２）。

ｃ、５−アリロキシペンチル４．６−０−ベンジリデン−２−デオキシ−２−フ タルイミド−β−Ｄ−グルコピラノシド３３の合成 パラトルエンスルホン酸モノ水和物（０，０２５ｇ）を、乾燥ジメチルホルムア ミド中の３２　（１，０ｇ、　２．３ｍｍｏｆ）とα、α−ジメトキシトルエン （０，６９０ｍ１．４．６ｍ　ｍｏｌ　）の溶液に加えた。４０°Ｃで２時間攪 拌した後、ｔ、１．ｃ、　（１０：　ｌ−クロロホルムとメタノール）により、 反応の完了か示された。小量のトリエチルアミンを加えた後、溶剤の大部分を蒸 発させ、残渣を、ジクロロメタンで希釈し、いつものようにワークアップした。

溶剤を蒸発させた後、残渣をトルエンと酢酸エチルの９：ｌの混合物を使用して 、シリカゲル上のクロマトグラフィーにかけ、化合物３３　（１，３６ｇ、９０ ．１％）を得た。

〔α）　”、　＋２４．１　（ＣＯ，５クロロホルム）；’Ｈ−ｎ、ｍ、ｒ、（ ＣＤＣＩｇ）ニア、１５−７．９０　（ｍ、９８．　ａｒｏｍａｔｉｃｓ）、５ ゜５Ｈｚ）］、１．４０　（ｍ、　２Ｈ）　ａｎｄ　１．１７　（ｍ、　４８） ：　ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｓ。

ｄ、５−アリロキシペンチル４．６−０−ベンジリデン−２−デオキシ−（２， ３，４，６−チトラーＯ−アセチルーβ−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１−トリ メチルシリルトリフルオロメタンスルホネートの溶液（１，０ｍｌのジクロロメ タン中０．０５０ｍ１の試薬から作られた０、　１　ｍｌの溶液）を、化合物３ ３　（１，２０ｇ、　２゜２９ｍｍｏｌ　）　、２．　３．　４．　６−チトラ ーＯ−アセチルーα−Ｄ−ガラクトピラノシルアセチミデ−１−３４（１゜７０ ｇ、３５０ｍｍｏｌ）及び−２０°Ｃに冷却したトルエンとジクロロメタンのｌ ・ｌの混合物（３０ｍｌ）で破砕したモレキュラーシーヴの混合物に注射筒で加 えた。混合物は、−２０°Ｃて０．５時間攪拌し、１時間かけて徐々にＯ″Ｃに 温度を上げた。ｔ、１．ｃ、　（１：　１へキサン酢酸エチル）は、反応の完結 を示した。若干のトリエチルアミンを加え、メチレンクロライドで希釈し、濾過 した後、溶剤を常法通りワークアップした。蒸発後、残渣をトルエンを用いてシ リカゲルのカラムに適用し、ヘキサンと酢酸エチルの２１の混合物で溶出を続け た。適切な両分から、ジサッカライＦ’３５　（１，６３ｇ＋　７４％）を得た 。

Ｃａ）　”ｏ　＋４．　］　（ｃ、０．５．　ＣＨＣＩｚ）：’Ｈ−ｎ、ｍ、ｒ 、（ＣＤＣＩ２）ニア、４０−８．００（ｍ、９Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃｓ）、５ ．８５　（ｍ、ＩＨ，−Ｃ旦＝）　、５．５８　（ｓ、ＩＨ，ｂｅｎｚｙｌｉｄ ｅｎｅ）、５．０７−５．２５ＩＨ，Ｊ、２８．０．　Ｊ、　、、、１０．０Ｈ ｚ、Ｈ−２’）、２．１１．　１．９０゜１．８５．１．５８　（４ｓ、１２ｔ （、４０Ａｃ）、１．３７　ａｎｄ　１．＋２　（ｍ、６Ｎ。

ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｓ）；　”　Ｃ−ｎ、ｍ、ｒ、（ＣＤＣ１ｚ）：　１３４． ６　ａｎｄ　１１７゜０　（ｅｔｈｙｌｅｎｉｃｓ）、１０２．１．　＋０１． ２．９９．４　（ｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅ、　Ｃ−１ａｎｄ　Ｃ−１’　） ｅ、５−アリルオキシペンチル２−デオキシ−（２，３゜４．６−チトラーＯ− アセチルーβ−Ｄ−ガラクトピラノンルー（１−３）−０−）−２−フタルイミ （１，６３ｇ、　１．９１ｍｍｏｌ　）の溶液を、７０’Ｃで１時間加熱した。

そのときは、ｔ、１．ｃ、（１００：５−クロロポルムとメタノール）は、反応 の完了を示した。過剰のトルエンと共蒸発させると残渣が得られ、クロロホルム とメタノールの１００：２の混合物を溶出液として使用し、シリカゲル上のクロ マトグラフィーにかけ、化合物３６（１，１２ｇ、７６％）を得た。

（（Ｚ）　”ｏ　＋９．３　（ｃ、　０．５５　ＣＨＣｌｚ）；　’Ｈ−ｎ、ｍ 、ｒ。

（ＣＤＣＩ３）：　７．７０−７．９５　Ｇｍ、４Ｈ，ａｒｏｍａｔｉｃｓ）、 ５．８２　（ｍ、ＩＨ−２’）、　５．０７　（ｄ、　ＩＨ，Ｊｌ、２８．５Ｈ ２，Ｈ−１）、　４．８４　（ｄｄ、　ＩＨ。

Ｊ２　３１０．ＯＨｚ、　Ｈ−３’）、　２．１０．２．０８．１．９０　（３ ｓ、　９８．３ＯＡｃ）、１．０５−１．４７　（ｍ、９Ｈ，１ｎｃ１．　ｌ　 ０Ａｃ）、”Ｃ−ｎ、ｍ、ｒ。

（ＣＤＣＩｓ）：　１００．３　ａｎｄ　９７．５　Ｃ−１ａｎｄ　Ｃ−１’、 Ａｎａｌ、ｃａｌｃｄ：Ｃ，５６，８８；　Ｈ，６，１７；　Ｎ、１．８３．Ｆ ｏｕｎｄ：　Ｃ，５５，５９；　Ｈ，６゜２０；　Ｎ、１．８４゜ ｆ、５−アリロキシペンチル２−アセタミド−２−デオキシ−（β−Ｄ−ガラク トピラノシル−（１−３）−〇−〕−β−Ｄ−グルコピラノシド４Ｃの合成ナト リウムボロハイドライト（０，６９０ｇ、ｌ　８ｍｍｏｌ　）をイソプロパツー ルと水（２０ｍｌ）の５：ｌの混合物中のジサッカライド３６　（０，７００ｇ 、０．９１ｍｍ０１）に加えた。混合物を、室温で２４時間攪拌し、その後ｔ、 １．ｃ、　（６５：　３５　：　５．　クロロホルム、メタノールと水）は出発 物質の消失を示した。酢酸（８，２ｍ１）を添加した後、混合物を、１００°Ｃ て３時間加熱した。混合物を、大過剰のトルエンと共蒸発させ、乾個した残渣を 、ジメチルアミノピリジンの存在下で、ピリジンと無水酢酸（５ｍｌ）の３＝２ の混合物中で、２２°Ｃて２４時間アセチル化した。若干のメタノールを添加し た後、混合物は、ジクロロメタンで希釈し、いつものようにワークアップして残 渣を得、若干のトルエンと共蒸発させた。最終シラツブを、クロロホルムとメタ ノールの１００：２の混合物を使用して、シリカゲル上のクロマトグラフにかけ 、バーアセチル化ジサッカライド（０，５００ｇ、７１％）を得た。

’Ｈ−ｎ、ｍ、ｒ、（ＣＤＣＩｓ）：　５．９０　（ｍ、　ＩＨ，−ＣＨ＝）　 、　５．７７（ｄ、ＩＨ，Ｊｔ、ＮＨ７，５Ｈｚ、ＮＨ）、５．３７　（ｄｄ、 ＩＨ，Ｊｚｌ、ｒ３．５．　Ｊ４・、ｓ、１．ＯＨｚ、Ｈ−４’）、５．１５− ５．２３　（ｍ、２Ｈ，＝Ｃ旦！　）、１．９５−２．１８　（７ｓ、２１Ｈ， ６０Ａｃ、Ｉ　ＮＡｃ）、１．５８（ｍ、４Ｈ）　ａｎｄ　１．４１　（ｍ、２ Ｈ）：　ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｓ。

ナトリウムメトキサイド０．５　Ｎ溶液（０，３００Ｉｎ１）の０、５　Ｎ溶液 を、乾燥メタノール中（２０ｍｌ）上記化合物（０，５００ｇ、０．６２３ｍｍ ｏｌ　）の溶液中に注射筒で加えた。室温で一夜攪拌した後、混合物をＤｏｗｅ ｘ　５０ＷＸ（Ｈ“型、乾燥された）て脱イオンし、真空で蒸発した。

残渣を、メタノールに溶解し、溶媒を蒸発することによってセライト（３ｇ）上 に被膜させた。セライトをイアトロビーズ（３０ｇ）のカラムの頂端に適用し、 生成物をクロロホルム、メタノールと水の６５＋２５・ｌの混合液で溶出し、ジ サッカライド４Ｃ（０，２６６ｇ、８０％）を与えた。

（（Ｚ）　”ｏ　−０，１６４（ｃ、１．　ｗａｔｅｒ）；　’Ｈ−ｎ、ｍ、ｒ 、（ＤｔＯ）：５゜９５（ｍ、ＬＨ，−ＣＨ＝）　、５．３０　（ｍ、２Ｈ，＝ Ｃ月−ｔ　’）　、４．５４８　（ｄ、　１８．　、Ｌ、ｔ　７．７Ｈｚ、　Ｈ −１）、　４．４２６　（ｄ、　ＩＨ，Ｊｌ６．２゜７．７Ｆ（Ｚ、　Ｈ−１’ ）、　４．０３１　（ｄｄ、　Ｉｆｆ、　Ｊ　１．０．　Ｉｌ、５ｆ（ｚ。

ａｌｌｙｌｉｃｓ）、　２，０２３　（ｓ、　３Ｈ，ＮＡｃ）、　１．５８　（ ｍ、　４Ｈ）　ａｎｄ　１゜３８　（ｍ、　２Ｈ）：　ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｓ； 　目Ｃ−ｎ、ｍ、ｒ、（ＤｔＯ）’：　１７５．２４　（ｃａｒｂｏｎｙｌ）、 　１３４．７０　ａｎｄ　１１９．０５　（ｅｔｈｙｌｅｎｉｃｓ）、　１０４ ゜３３　（Ｃ−１’）、１０１．６８　（Ｃ−１）、　５５．４２（Ｃ−２）。

例９−−５−アリイロキシペンチル２−アセタミド−２＝デオキシ−β−Ｄ−グ ルコピラノシド３７の合成 させた。パーアセチル化の後、粗物質を、ヘキサンと酢酸エチルの１．１の混合 物を使用して、シリカゲル上のクロマトグラフィーにかけ、パーアセチル化誘導 体（０゜１８０ｇ、５５％）を得た。〔α）　！０ｏ　＋　１１．５　（ｃ。

０．７．クロロホルム）； ’Ｈ−ｎ、ｍ、ｒ、（ＣＤＣＩｓ）＋　５．９０　（ｍ、　ＩＨ，−Ｃ旦＝）、 　５．６４（ｄ。

ＩＨ，Ｊｘ、ｓｓ　８．５　Ｈｚ、　Ｎ旦）　、　４．６８　（ｄ、　ＩＨ，Ｊ 、、、７．５Ｈｚ。

Ｈ−１）、　１．９５．２．０３　（ｔｗｏ）、　２．０５　（３ｓ、　１２Ｈ ，３０Ａｃ。

ｌ　ＮＡｃ）、１．５８　（ｍ、４Ｈ）　ａｎｄ　１．４１　（ｍ、２Ｈ）：　 ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｓ。

Ａｎａｌ、ｃａｌｃｄ、：　Ｃ，５５，８＋　Ｈ，７，５；　Ｎ、　２．０５． 　Ｆｏｕｎｄ：　Ｃ。

５５．８２；　Ｈ，７，５３，Ｎ、　２．９８゜本物質は、メタノール（０，１ ００ｍｌ）中のナトリウムメトキサイドの０．５Ｎ溶液を加えたメタノール（５ ｍｌ）中で、脱−〇−アセチル化した。室温で一夜放置後、混合物をＩＲ−Ｃ５ ０樹脂（Ｈ″″型、乾燥）で脱イオン化し、溶媒を蒸発した。残渣を、クロロホ ルムとメタノールの７＝１の混合物を使用して、イアトロビーズを通過させ、純 粋な３７　（０，１０３ｇ、８０％）を得た。

（（Ｚ）　”ｏ　−０，１７（ｃ、１．　ｗａｔｅｒ）：’Ｈ−ｎ、ｍ、ｒ、（ ＤｔＯ）：　５゜８５　（ｍ、ＩＨｌ−Ｃ旦＝）、５．２９　（ｍ、２Ｈ，−Ｃ Ｈ＝）　、４．５０（ｄ、　１８．　Ｊｌ、２８．５Ｈ２，Ｈ−１）、　４．０ ３　（ｄ、　２Ｈ，Ｊ　６．ＯＨｚ。

ａｌｌｙｌｉｃｓ）、　２．０３３　（ｓ、　３Ｈ，ＮＡｃ）、　１．５８　（ ｍ、　４Ｈ）　ａｎｄ　ｌ。

３６　（ｍ、　２Ｈ）：　ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｓ：　”Ｃ−ｎ、ｍ、ｒ、（Ｄｔ Ｏ）＋　１７５．２（ｃａｒｂｏｎｙｌ）、１３４．７　ａｎｄ　１１９．１　 （ｅｔｈｙｌｅｎｅｓ）、１０１．９　（Ｃ−１）、６１．６　（Ｃ−６）、５ ６．４　（Ｃ−２）、２９．１．　２３．０　ａｎｄ　２２．６（ｍｅｔｈｙｌ ｅｎｅｓ）。

例１０−−シアル酸オリゴサツカライド構造のグリコジルトランスフェラーゼに よるトランスファーこの例は、Ｎｅｕ５Ａｃ及びその類縁体のオリゴサツカライ ドグリコシド構造へのシアリルトランスフェラーゼによる酵素的トランスファー を示す。本例の目的は、シアル酸の類縁体（人工的供与体）は、両立するシアリ ルトランスフェラーゼの使用によって、Ｎｅｕ５Ａｃと同じやり方で、オリゴサ ツカライドにトランスファーすることができることを示すことである。図４．５ ，６，７゜及び８は、これらのトランスファーを図解し、アンダーラインを引い たアラビア数字で同定される調製された化合物の構造を提供している。例１０ａ −１０ｅにおいては、調製的シアリル化は、以下の如く遂行された。

調製的シアリレーション それらのＣＭＰ−誘導体として活性化された（上記ｌ−５の例において述べられ たように）シアル酸は、βＧａ　ｌ　（＋−３）ＧｌｃＮＡｃ−、βＧａｌ　（ １−４）βＧｌｃＮＡｃ−，βＧａ　Ｉ　（１−３）ａＧａ　ｌＮＡｃ−。

及びβＧａｌ　（１−４）βＧｌｃ−末端配列を含む合成オリゴサツカライド構 造へと、３種の哺乳類のシアリルトランスフェラーゼ（Ｅｘ、ｌ　Ｏａ−ｅ）を 使用することによってトランスファーされた（例、１０ａ−ｅ）。

ラットの肝臓からのβＧａ１（１−３／４）βＧｌｃＮＡｃα（２−３”）シア リルトランスフェラーゼ（ＥＣ２，４，９９，５）とβＧａｌ　（１−４）βＧ １ｃＮＡＣα（１−６’　）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２゜４．９９． １）は、Ｍａｚｉｄらの手順１にしたがって、アフィニティークロマトグラフィ ーによって均一になるまで精製された。βＧａ　ｌ　（１−３）ａＧａ　ＩＮＡ ｃｃｚ（２−３’　）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２，４゜９９．４）は 、Ｇｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　、　Ｎｏｒｗａｌｋ　、ＣＴから 購入した。

すべての調製的シアリレーション反応において、受容体オリゴサツカライド（５ −２０ｍｇ）を、選ばれたＣＭＰソアル酸（５−２０ｍｇ）とともに、Ｕｎｖｅ ｒｚａｇｔ　ら７Ｉの手順のように、適切なシアリルトランスフェラーゼ（１０ −５０ｍＵ）と仔牛の小腸のアルカリ性ホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ 　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）の存在下で、５０ｍＭのナ トリウムカコジレートｐＨ６，５，０，５％ＴｒｉｔｏｎＣＦ−５４，Ｉｍｇ／ ｍ１．　ＢＳＡ　（”シアリルトランスファーバッファー”）中で３７°Ｃで２ ４−４８時間インキュベートした。例えば、シアリルすりゴサッカライド７−ｄ 　−ａＮｅｕ　５Ａｃ　（２−６）βＧａｌ　（１−４）βＧを、βＧａ　１　 （１−４）βＧ　１　ｃ　Ｎ　Ａ　ｃ　Ｏ（ＣＨｔ）ｓＮＡｃα（２−６’　） シアリルトランスフェラーゼ（５１ｍｌ）と仔牛小腸アルカリホスファターゼ（ ２，４Ｕ）の存在下で、２．５　ｍｌのシアリルトランスフェラーゼバッファー （例１−５参照）中、３７°Ｃで２８時間インキュベートすることによって合成 された。完了後、反応混合物を、１０ｍ１に希釈し、製造業者によって示唆され たように状態を整えた３つの５ｅｐ−Ｐａｋ　Ｃ＋ｍカートリッジを通過させた 。各カートリッジを、水（４ｘ５ｍｌ）で、続いてメタノール（３Ｘ　５　ｍｌ ）で洗浄した。メタノール溶出物を真空下で蒸発乾個し、残渣を、クロロホルム 、メタノール、及び水の６５：３５：３の混合物（０，５ｍ１−溶剤Ｉ）中に溶 解しく５００ｍｇ）、同じ溶媒中で平衡させたイアトロビーズ（５００ｍｇ）の 小さいカラムに適用した。

続いて、カラムは溶媒■で溶出し、次にクロロホルム、メタノール、水の６５： ３５・５の混液（溶媒ＩＩ）、そして、次にクロロホルム、メタノール、水の６ ５：３５：８の混液（溶媒ＩＩＨによって溶出した。シリカゲルプレート」二の ｔ、１．ｃ、　（クロロホルム、メタノール、及び０．２％の塩化カルシウム溶 液の６５：３５：８の混液を展開溶媒として）によって同定された如く、生成物 を含む適切な両分（３０滴）を−緒にプールし、真空下で蒸発乾個させた。次に 、残渣をＡＧ　５０Ｗ−Ｘ８（Ｎａ”型）の小さいカラムを通した。溶出液を凍 結乾燥し、回収した生成物を’Ｈ−ｎ、叱「、によって特徴づけた。それは、す べての場合によい純度を示した。

ある場合には、オリゴサツカライドグリコシドのシアル酸の類縁体でのシアリル トランスフェラーゼによるシアリル化の後、αシアリル化オリゴサツカライドグ リコシドは、別のサツカライドユニットの添加によって、さらに酵素的に修飾さ れることかできる。このようなす・ツカライドユニットの典型例は、Ｌ−フコー スであり、両立するフコシルトランスフェラーゼによって付加される。

図４．５と６には、これらのトランスファーが説明されており、アンダーライン を付したアラビア数字によって同定される調製された化合物に対する構造が与え られている。１ｏａ−１０ｅの例においては、調製的フコシル化は以下の如く行 われた。

調製的フコシル化 ■型、及びＨ型のオリゴサツカライドは、ヒトミルクβＧｌｃＮＡｃα（１−３ ／４）フコシルトランスフェラーゼによって、さらにフコシル化することかでき る。

本酵素は、Ｐａ１ｃｉｃら７Ｉによって記述されたＧＤＰ−ヘキサノイルアミン セファロース上のアフィニティークロマトグラフィーを用いた方法によって、人 乳から精製された。フコシル化オリゴサツカライドの合成と精製は、Ｐａ１ｃｉ ｃら７＠の手順の修飾によって行われた。例えば、フコシル化構造、９−Ｎ２− ａＮｅｕ　５Ａｃ　（２−３）βＧａ、］　（１−３）　−（ｃｒ−Ｌ　−Ｆｕ ｃ　（１−４）　）　−βＧ　Ｉ　ｃＮＡｃ−０−（ＣＨ２）、　−ＣＨ，ＯＨ ］　７ｂは、ＧＤＰ−フコース（２，５ｍｇ）と９−Ｎｓ　−ａＮｅｕ　５Ａｃ 　（２−３）βＧａｌ　（１−３）　βＧａ　Ｉ　ｃＮＡｃ−０−（ＣＨ２）− ＣＨ２０Ｈ８ｂ　（１，７ｍｇ）を１．３　ｍｌの１００ｍＭナトリウム力コジ レート（ｐｉ（６，５）　、ｌ　０ｍＭ塩化マンガン、１．６ｍＭ　ＡＴＰ、１ ．６ｍＭナトリウムアジド中で、アフィニティークロマトグラフィーで精製され たβＧｌｃＮＡＣα（１−３／４）フコシルトランスフェラーゼ（４，６ｍｕ） とともにインキュベートすることによって合成された。３７°Ｃて２７時間反応 させた後、２．５ｍｇのＧＤＰ−フコースと２．３　ｍｕのフコシルトランスフ ェラーゼが、反応混合物に添加され、３７°Ｃてさらに２１時間維持された。生 成物は、シアリル化反応について上述された如く単離された。組物質（上記の） のｔ、１．ｃ、は、フコシル化がほぼ完了していることを示した。精製、及びＡ Ｇ５０Ｗｘ８（Ｎａ＋型）上でのクロマトグラフィーの後、生成物＋　７　ｂ　 （１，０ｍｇ）の’Ｈ−ｎ、ｍ、ｒ、は、極めて良好な純度（表５）を示した。

フコシルトランスフェラーゼが高度に精製されなかった若干の場合には、結合ア ームのメチルエステルの部分的加水分解が起った。例１０ａ−１０ｅは以下の通 りである。

例１０ａ：この例は、１ａ−９のような修飾された酸の４ａと４ｂのようなβＧ ａ１（１−３）βＧ１ｃＮＡｃ　−（Ｌｅｗｉｓ・または１型）末端構造を有す る受容体の末端βＧａｌの３−ＯＨへのラット肝臓からのβＧａ１（１−３／４ ）−βＧｌｃＮＡｃα（２−３”）シアリルトランスフェラーゼのようなシアリ ルトランスフェラーゼによる上に報告された実験的手順に従ったトランスファー についてである。前に示したように、精製した反応生成物の’Ｈ−ｎ、ｍ、ｒ、 データが報告されている（表３と４）。

ＩｃＮＡｃ　（ＬａｃＮＡｃまたはＩＩ型）末端構造を有する受容体の末端βＧ ａｌの３−ＯＨへの、１０ａで用いられるそれのようなシアリルトランスフェラ ーゼによるトランスファーについてである。以前に示されたように、精製された 反応生成物の’Ｈ−ｎ、ｍ、ｒ、データが報告されている（表６，８）。ある場 合には、受容体を可溶化するために、ジメチルスルホキシド（５％容量）を加え ることかある。反応混合物は、以前に述へたようにワークアのようなβＧａｌ　 （１−４）βＧｌｃ−（ラクトース）末端構造を有する受容体の末端βＧａｌの ３−ＯＨ構造への、例１０ａにおいて使用されたようなシアリルトランスフェラ ーゼによる同し実験的手順にしたがったトランスファーについてである。以前に 示されたように、精製された反応生成物の’Ｈ−ｎ、ｍ、ｒ、データか報告され ている（表６）。

ｃ−（ＬａｃＮＡｃ、　または［１型）末端ユニットを有する受容体の末端βＧ ａｌの６−ＯＨへの、以前に報告されたβＧａｌ　（１−４）βＧｌ　ｃＮＡｃ −ａ　（２−６’　）シアリルトランスフェラーゼのようなシアリルトランスフ ェラーゼによるトランスファーについてである。以前に示されたように、精製さ れた反応生成物の’Ｈ−ｎ、ｍ、ｒ。

データが報告されている（表７．８）。

例１０ｅ：本例は、旦のような修飾シアル酸の７ａのようなβＧａ　Ｉ　（１− ３）ａＧａ　ＩＮＡｃ−（“Ｔ”）末端ユニットを有する受容体のβＧａｌ末端 のβＧａ１（１−３）αＣ０ＩＮＡＣ−α（２−３）シアリルトランスフェラー ゼ（Ｇｅｎｚｙｍｅ　）のようなシアリルトランスフェラーゼによる、以前に報 告された実験的手順にしたかったトランスファーについてである。以前に示され たように、精製された反応生成物の’Ｈ−ｎ、ｍ汀、データか報告されている（ 表９）。

に溶解し、５ｅｐ−Ｐａｃｋカートリッジを通過させ、さらに、カートリッジを 水、続いてメタノールによって洗浄した。

メタノール溶出物を蒸発させ、残渣を、クロロホルム。

メタノール、水の６５：３５：５の混液を溶出液として使用し、イアトロビーズ （２００ｍｇ）上のクロマトグラフィーにかけた。適切な両分をプールし、溶液 を蒸発させて、生成物ｓｍ（１ｍｇ）を得た；　’Ｈ−ｎ、ｍ、ｒ、　：上記表 ３を参照。

トリサツカライド−１凹、は、例１０において報告された手順にしたがって、酵 素的にフコシル化された。そして、生成物が同様にして精製された。回収された 粗物質のｔ。

参照のこと。

例１２−−９−ヒドロキシノニル（５，９−ジアセタミドー３．５．９−１リー プオキシ−α−Ｄ−グリセローＤ−ガラクトー２−ノヌローピラノシロニック酸 ）−（２−３）−０−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１−３）−０−〔α−Ｌ −フコピラノシル−（１−４）−０−〕−〕２−アセタミドー２−デオキシーβ Ｄ−グルコピラノシド１７にの合成 水（０，５ｍｌ）中のトリサツカライド８ｂ（１ｍｇ）の溶液を、リンドラ−の 触媒（１，０ｍｇ、　Ａｌｄｒｉｃｈ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ、　Ｍ ｉ　１ｗａｕｋｅｅ、　Ｗ　Ｓ　）の存在下、大気圧下で２２°Ｃで１５分間水 素添加した。ｔ、１．ｃ、　（６５：　３５　：　８−クロロホルム、メタノー ル、及び０．２％塩化カルシウム）は、完全な変換を示した。混合物は、セライ トを通して濾過し、固形物を十分水で洗浄した。濾液を濃縮し、ミリボアーフィ ルターを通じて濾過し、溶出液を凍結乾燥し、トリサツカライドｌユを得た；　 ’Ｈ−ｎ、ｍ、ｒ、　：上記の表３を参照のこと。

メタノール（１０μｌ）中の無水酢酸（約ｏ、　２　ｍｇ）を、０．００２Ｎ水 酸化ナトリウムとメタノール（０，３００ｍｌ）のｌ：ｌ溶液中にＯ″Ｃて加え た。ｔ、１．ｃ、　（溶媒は上記と同じ）は、完全な反応を示し、次に溶剤を蒸 発させた。

残渣を水（２ｍｌ）に溶解し、５ｅｐ−Ｐａｋカートリッジに適用した。カート リッジを水で洗い、生成物をメタノールで溶出し、トリサツカライド８ｋ（約１ 　ｍｇ）を得た。ＩＩ−ｎ、ｍ、ｒ、：上記表３を参照のこと。

トリサツカライド８ｋを、例１Ｏにおいて報告された手順にしたがってフコシル 化し、生成物を、同様にして精製した。回収された物質のｔ、１．ｃ、は、８に の変換は、はぼ完全であることを示した。精製により、１７ｋ（約ｏ、　５　ｍ ｇ）を得た；　’Ｈ−ｎ、ｍ、ｒ、　：上記の表５を参照のこと。

例１３−−８−Ｎ−メチルアミドオクチル（５−アセト−アミド−３，５−ディ オキシ−α−Ｄ−グリセローガラクトー２−ノヌローピラノシロニック酸Ｎ−メ チルアミド）−（２−３）−０−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１−３）−０−〔 α−Ｌ−フコピラノシル−（１−４）−Ｏ−）−２−アセタミド−２−デオキシ −β−Ｄ−グルコピラノシド１８Ｉ！の合成。

テトラサツカライド１８ａ（０，００３ｇ）をＤｏｗｅｘ　５０ｘ８（Ｎａ’″ 型）樹脂上に適用し、水で溶出した。適切な両分は凍結乾燥し、続いて、５酸化 リン上で乾燥した。

ヨウ化メチル（０，０５０ｍｌ）を、ジメチルスルホキシドに溶解した残渣に加 えた。暗所で２０時間攪拌した後、溶液を真空下で蒸発され、水（１１ｍｌ）で 希釈し、５ｅｐ−ＰａｋＣ＋＊カートリッジに適用した。水（ＩＯｍｌ）で洗浄 した後、生成物メタノールで溶出した。適切な両分の蒸発により、残清か得られ 、それを、クロロホルム、メタノール、水の６５：６３：５の混液を使用して、 イアトロビーズ（０，５ｇ）上のクロマトグラフィーにかけ、化合物＋８ａ（０ ，０２５ｇ）のメチルエステルを得た。

’Ｈ−ｎ、ｍ、ｒ、　：　５．０９９　（ｄ、　ＩＨ，Ｊｌ、２３．７５Ｈ２， Ｈ−１αＦＵｃ）。

４．５１７　（ｄ、２Ｈ，Ｊｌ、２　７．５Ｈ２，ｔ（−１βＧａｌ　ａｎｄ　 βＧｌｃ　ＮＡｃ）。

３．８６６　ａｎｄ　３．６８３　（２ｓ、Ｃｏｔ　ＣＨｓ　）　、　２．７８ １　（ｄｄ。

！Ｈ，Ｊｌ、、、３．、１２．５Ｈ２，Ｌｍ＠、４４．５Ｈ２，Ｈ−３ｅｑ　Ｎ ｅｕ５Ａｃ）。

２．０３２　ａｎｄ　２．０１８　（２ｓ、　６）１．２　ＮＡｃ）、　１．９ １３　（ｄｄ、　１８゜Ｊｆｆ、、４１２．５Ｈｚ、　Ｈ−３ａ、ｘ、Ｎｅｕ５ Ａｃ）、　１．１６０　（ｄ、３Ｈ，Ｊｓ、ｓ６、５Ｈｚ、　）ｌ−６ａ　Ｆｕ ｃ）。

この物質を、５０°Ｃて、Ｎメチルアミン（Ｉ　ｍｌ）の４０％溶液中で、３． ５時間加熱した。真空において蒸発した後、残渣を水に溶解し、５ｅｐ−Ｐａｋ カートリ・ソシに適用し、さらに水で洗浄した。生成物を、メタノールで溶出Ｆ 、該クシアリルトランスフェラーゼ両立する１つ以上のオリゴサツカライド群を 含む抗原性担体のシアリルトランスフェラーゼでのシアリル化による人工抗原の 合成 グリコシド部分における適切な官能基を含むオリゴサツカライドグリコシド部分 が、１つ以上の相補的官能基を含む抗原担体とこの技術分野で知られている手順 に従って抱合された。

具体的には、構造４ｂ、５ｂ、６ａ、及び７ａのようなオリゴサツカライドグリ コシドの、ＢＳＡ、ＫＬＨ。

または他の担体への抱合は、ＬｅｍｉｅｕｘらとＰｉｎｔｏらの“アシル−アジ ド“手順のような手順１６１“によって達成される。

抱合体は、次に、上記の例１Ｏにおいて報告されたものと類似した手順によって 、適切な特異性の酵素でシアリル化され、生成物は、限外濾過とゲル濾過の組合 せによって精製される。

図１２には、このような人工的抗原を調製するのに用いられる反応の模式図を図 解している。

例１４−−抗原性担体へのシアル酸類縁体の酵素的トランスファー ウシ血清アルブミンを、ＬｅｍｉｅｕｘらとＰｉｎｔｏら６Ｓ１６の“アシル− アジド”手順によるオリゴサツカライドグリコシドと、ＩｍｇのＢＳＡに対して 、０．２２　μｍｏｌのオ（２→３）シアリルトランスフェラーゼと組合せ、さ らに重量による０、５％のＴｒｉｔｏｎ　ＣＦ−５４（Ｒｏｈｍ　＆Ｈａｓｓ、 　Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈａ、　Ｐ　Ａから入手）とｌ　ｍｇ／ｍｌ　Ｂ　Ｓ　Ａ を含んでいるｐＨ６，５の２ｍｌのナトリウム力コジレート中において３７°Ｃ でインキュベートした。２４時間に、さらに３ｍｇのＣＭＰ−９−ｄ−Ｎｅｕ　 ５Ａｃ、２ｃとシアリルトランスフェラーゼ（５ｍｕ）を反応混合物に加えた。

その結果得られた混合物を、さらに２４時間インキュベートし、人工的抗原、２ １ｃを生じ、それは、ＢＳＡに結合した１つ以上のαシアリル化オリゴサツカラ イド基を含んでいる。この生成物は、次に、Ａｍ１ｃｏｎ　Ｐ　Ｍ　１０膜上の 限界濾過によって精製した。残渣を水（３ｍｌ）に溶解し、５ｅｐｈａｄｅｘ　 ＬＨ−２０（１，ｏ　ｘ　７０ｃｍ）のカラムに適用し、生成物を水で溶出した 。生成物２１ｃを含んでいる（２８０ｎｍにおける吸光度によって判断されるよ うに）画分をプールし、凍結乾燥して、１３ｍｇの生成物を与えた。

この例、ならびに例１４に類似した方法で調製された人工的抗原の他の例の結果 は、下記の表ＩＯ中に述へられている。

１、　フェノール硫酸アッセイ ２、　ミクロチオバルビッール酸アッセイ（ｍｇの人工抗原あたりのシアル酸の μｍｏｌ　） ３、　βＧａ１（１→３）βＧｌ　ｃＮＡｃ−ａ　（２→３）シアリルトランス フェラーゼ ４、　βＧａｌ　（１→４）βＧ　１　ｃＮＡｃ−ａ　（２→６）シアリルトラ ンスフェラーゼ ０１ｉｇｏｓａｃ、　ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ　＝オリゴサツカライドグリコシドＣ ｏ口」＝オリゴサツカライドグリコシドと抗原担体の抱合体 Ｉｎｃｏｒｐ　Ａ　＝　ｍｇの抱合体あたりの抗原性担体上へ組み込まれたオリ ゴサツカライドグリコシドのμｍｏｌＩｎｃｏｒｐ　Ｂ　＝人工抗原のｍｇあた りの抗原性担体上に組み込まれたシアル酸のμｍｏｌ Ｅｎｚ、　＝酵素 Ａｒｔｉｆ、　Ａｎｔｉｇ、　”人工的抗原同様に、上記の例１４において述へ られた手順に従うことによって、他の抗原性担体を用いて、ＫＬＨ、ヒト血清ア ルブミン（Ｈ３Ａ）　、ジフテリア、または破傷風トキシン、Ｓ−レイヤーズな とを含む人工的抗原を創製することができる。同様に、他の両立するオリゴサツ カライドグリコシド上で使用されたオリゴサツカライドの代りに使用される抗原 性担体に結合させることができるであろう。該オリゴサツカライドグリコシドと 両方するシアリルトランスフェラーゼも使用することができるであろう。さらに 、シアリルトランスフェラーゼと両立する他のシアル酸の類縁体のＣＭＰ該導体 も使用できるであろう。

Ｆ、１つ以上のシアリル化オリゴサツカライドグリコシドを抗原性担体へ結合さ せることによる人工抗原の合成 グリコシド部分に適切な官能基を含むαシアリル化オリゴサツカライドグリコシ ドは、１つ以上の相補的官能基を含む抗原性担体に、この分野の技術において知 られている手順にしたかって結合させることができる。例えば、−（ＣＨ２）。

ＣＯ，ＣＨ，のアグリコンを含むαシアリル化すリボサッカライトグリコシトは 、ヒドラジンとＮ２Ｏ４の反応によって修飾してエステル（ＣＯＯＣＨＩ）をカ ルボニルアジド（−Ｃ（０）Ｎ、）に変換することができる。このアジドは、次 に、抗原担体上のアミノ官能基て置換され、その結果、アミド結合を経ての担体 へのαシアリル化オリゴサツカライドグリコシドの結合を生じる。担体は、多数 のアミン基を含むことかできるので、担体は、１個以上のαシアリル化オリゴサ ツカライドグリコシドを付加することができる。図１３には、これらの人工的抗 原の生成に関与する反応模式図が図解されている。

Ｇ、αシアリル化オリゴサツカライドグリコシドを含む担体の合成 オリゴサツカライドグリコシドを組み込んでいるコポリマーは、この技術分野で 知られている方法によって、適切な官能基を存するグリコシドと重合し得るモノ マーから合成することができる８０゜以下の例においては、オリゴサツカライド グリコシド、または、サツカライドユを有するそれの活性化二重結合のような重 合可能な官能基を含むように合成することができる。このような化合物を用いて 、次に、１個以上のオリゴサツカライド基を組込むコポリマーを合成することが できる。

このようにして形成されたコポリマーを、両立するシアリルトランスフェラーゼ のための受容体構造として使用し、シアル酸の両立する類縁体を、１個以上のα シアリル化オリゴサツカライドグリコシドを含むコポリマーを与えるように、こ のような基にトランスファーさせる。

図１４と１５は、これらコポリマーの合成についての反応の模式図か図解されて いる。

例１５　１つ以上のαシアリル化オリゴサツカライドグリコシドを含むコポリマ ーの合成 Ａ、　化合物４Ｃの適切な量を、本技術分野において記述されたイニシエーター システムＩ０の存在下で、水中でアクリルアミドに加える。生成物は、ＰＭＩＯ の膜上の限外濾過や、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｌ　Ｈ２０上のゲルクロマトグラフィ ーのような適切な技術によって精製され、コポリマー２３へと導かれる： ’ｔ（−ｎ、ｍ、ｒ、　：　４．５５９　（ｄ、　ｌｄ、　Ｊ　７．７　）１ｚ ）　ａｎｄ　４．４４０　（ｄ。

Ｊ　７．５　Ｈｚ）：　Ｈ−１ａｎｄ　Ｈ−１’　、　２．０５３　（ｓ、　Ｎ Ａｃ）＋組み込み率０．４４μｍｏｌ　／ｍｇ。

］（１→３／４）βＧｌｃＮＡｃ−α（２→３′）シアリルトランスフェラーゼ （１０−１５ｍｕ）を、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ　ＣＦ−５４（Ｒｏｈｍ　＆　Ｈ ａｓｓ、　Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ。

ＰＡから入手）と血清アルブミン（１ｍｇ／ｍｌ）を含む５０ｍＭナトリウム力 コジレートバッファー（１）Ｈ６，５、２ｍ１）中、３７°Ｃてプラスチックチ ューブの中でインキュベートする。２４時間後に、さらなるＣＭＰ−誘導体（１ ，０当量）とシアリルトランスフェラーゼ（５−１０ｍＵ）が加えられる。４８ 時間後に反応は停止され、生成物は、α、２°＝−２．４３　（ｃ、　０．３７ ．　Ｈ２０）；　’１（−ｎ、ｍ、ｒ、　：　４．５６７　（ｄ、　Ｊ　７．５ 　）ＩＺ）　ａｎｄ　４．４９１　（ｄ、　Ｊ　７．７　Ｈｚ）：　Ｈ−１ａｎ ｄＨ−１’、　４．０７４　（ｄｄ、　ＩＨ，Ｊｔ−２１Ｏ，０，Ｌ４２．８　 Ｈｚ。

Ｈ−３’）、２．７６０　（ｄｄ、１８．　Ｊｉ−、、、ａ−４，３）　２．０ ３６　（ｓ。

２ＮＡＣ）。

コポリマー２７ｃと２７ｈは、βＧａ１（１−”４）βＧ１ｃＮＡｃ−α（２→ ６）シアリルトランスフェラーゼを使用して、それぞれ、２ｃと２ｈからのシア ル酸のコポリマー２６へのトランスファーによって、同様な方法で得られた。こ れらの化合物に対する物理的データは以下の如（である。

化合物２７ｃ・ ａＤ”＝−５，５２（ｃ、、　０．８７．’　ＨｚＯ）：　’Ｈ−ｎ、ｒｎ、ｒ 、　：　４．５７７（ｄ、Ｊｌ−＊ｑ、４−　４．５．Ｊｓ−＊、ｓ・−ｘ　１ ２．５Ｈｚ、　Ｈ−３”　ｅＱ）。

２．０５１　ａｎｄ　２．０７３　（ｔｗｏ　ｓ、　ＮＡｃ）、　１．２８５　 （ｄ、　Ｊｉ−、＊−６，０Ｈｚ、　Ｈ−９”）　； 化合物２７ｈ。

４．５８１　（ｄ、　Ｊ　７．５　Ｈｚ）：　Ｈ−１ａｎｄ　Ｈ−１’、　４． １４１　（ｓ、　２８゜ＣＨ２Ｃｏ）　、　２．７３１　（ｄｄ、　ＩＨ，Ｊｉ −、，２−、、１２，５Ｈｚ。

Ｈ−３”　ｄｑ）、　２．０７７　（ｓ、　ＮＡｃ）。

コポリマー２４ｂ、２７ｃ、及び２７ｈにおいては、組み込み率は、’Ｈ−ｎ、 ｍ、ｒ、の適切なシグナルの積分から計算され、そして、さらにシアル酸につい てのチオバルヒツール酸アッセイによって確認された。

例＋６−−１つ以上のαシアリル化オリゴサツカライドグリコシドを含むコポリ マーの合成 Ａ、　この分野の技術において、記載されているようなイニシエーターシステム ８０の存在において、適切な量の化合物３７を、水中のアクリルアミドに加える 。生成物は、膜ＰＭＩＯ上の限外濾過、及び５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｌ　Ｈ２０上の ゲルクロマトグラフィーのような適切な技術によって精製され、コポリマー２５ へと導かれる：ａｐ　”＝　６．０８　（Ｃ，１，４３，ＨＪ）：　’Ｉ　ｎ、 ｍ、ｒ、二　４．５１７（ｄ、　Ｊ　８．５　Ｈｚ　Ｈ−１）、　２．０４１　 （ｓ、　ＮＡｃ）：組み込み率０．５μＵＤＰガラクトース（２，０当量）、及 びウシミルクガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２，４，１，２２゜ＩＵ） をプラスチックチューブ中、２０醋塩化マンガンを含むナトリウム力コジレート バッフ−ｒ　（ｐＨ７，５、２゜０　ｍｌ）中で３０°Ｃでインキュベートする 。１０時間後に、もつとＵＤＰ−ガラクトース（１，０当量）を反応混合物に加 える。２４時間後に、反応混合液は、蛋白質をホスフすタングステン酸（２ｍｌ 、　０．５　Ｎ塩酸中０．１％）によって４°Ｃて沈澱させることによって停止 させ、遠心分離（Ｉｏ、０００ｇ、１０分）を行った。透明な上清は、ＰＭＩＯ 膜を通して濾過した。凍結乾燥を行った後、残渣を５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｌ　Ｈ２ ０上てクロマトグラフィーにかけ、コポリマー２６（２０ｍｇ）へと導いた・ａ Ｄ　”＝−１，０３（ｃ、１．０７．　Ｈ２０）；　’Ｈ−ロ、叱「、　：　４ ．５５１（ｄ、　Ｊ　７．ＯＨｚｌ　４．４９６　（ｄ、　Ｊ　７．７　Ｈｚ） ；　ｔ（−１ａｎｄ　ｔ（−１’。

２．０５３　（ｓ、　ＮＡｃ）：組み込み率０．５０　μｍｏｌ　／ｍｇ。

例１５△と１６Ａにおいては、炭水化物部分の組み込みは、’Ｈ−ｎ、ｍ、ｒ、 スペクトルにおける適切なシグナルの積分を使用することによって計算され、フ ェノール−硫酸アッセイによって確認された。

Ｇ、αシアリル化オリゴサツカライドグリコシドを含む集合体の合成 リポソームやミセルのような集合体は、オリゴサツカライドグリコシドを組み込 むように調製することができる。具体的には、オリゴサツカライドグリコシドの 、このような集合体への組み込みは、アグリコン部分が疎水性であることを必要 とする。適切な疎水性基には、少くとも４個の炭素原子のアルキル基、−（ＣＨ ，）　５ｃｏｏｎｓなどが含まれる。このような集合体においては、オリゴサツ カライドグリコシドの疎水性アグリコン基は、集合体の脂質部分に分配し、それ に対して、オリゴサツカライド基は、一般的に水層中に分配される。

このような集合体を調製する方法は、本技術分野において十分知られている。例 えば、本発明において、参照によって組み込まれている米国特許Ｎｏ、　４，５ ５２，８０３を参照のこと。

シアリル化基が、シアル酸の類縁体であるβＧａ１（１−４）βＧ１ｃＮＡｃ　 （１−３）βＧａ１（１−４）βＧ１ｃＮＡｃ−ＯＲの誘導体。このような誘導 体の調製の具体的例証は、本出願と同時に、代理人の証明書番号、Ｎｏ、００５ ８２４−００４として、そして、“ＭＥＴＨＯＤＳ　ＦＯＲＴＨＥ　５ＹＮＴＨ ＥＴ［Ｓ　ＯＦ　ＭＯＮＯＦＵＣＯ３ＹＬＡＴＥＤ０ＬＩＧＯＳＡＣＣ）ＩＡＲ ＩＤＥＳ　ＴＥＲＭＩＮＡＴＩＮＧ　ＩＮ　Ｄｉ−Ｎ−ＡＣＥＴＹＬＬＡＣＴＯ ＳＡＭＩＮＹＬ　５ＴＲＵＣＴＬＩＲＰ：Ｓ”　（ジ−Ｎ−アセチルラクトサミ ニル構造中で終っているモノフコシル化オリゴサツカライドの合成のための方法 ）という題で出願された米国特許、シアリルＮｏ、Ｏ７／７７１．２５９に述べ られている。その出願は、本発明に、参照によって、その全体について組込まれ ている。

ム １図２４ 社ＬＬｍ 図、５ シし凱１ 工とｊ上−Ｕ 図、７ 図、８ ア　、９ 図、１０ 図、１１ 図、１５ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特陀第１８４条）８）平成５年１２月９日 １、特許出願の表示　ＰＣＴ／ＣＡ９２１００２４３３、特許出願人 氏名（名称）　グライカムド　インコーホレイテッド浄書ｊ′内音に変更なし） 表工 表ＩＩ シアリル化基か、シアル酸の類縁体であるβＧａ１（１−４）βＧｌｃＮＡｃ　 （１−３）βＧａ１（１−４）βＧｌｃＮＡｃ−ＯＲのシアリル化誘導体の調製 は、米国特許シリアルＮｏ、７７１．２５９において記述されている。その出− 願は、“ＭＥＴＨＯＤＳ　ＦＯＲＴＨＥ　５ＹＮＴＨＥＴ［Ｓ　ＯＦＭＯＮＯＦ ｔｌＣＯ３ＹＬＡＴＥＤ　０ＬＩＧＯ３ＡＣＣＨＡＲＩＤＥＳ　ＴＥＲＭＩＮＡ ＴＩＮＧ　ＩＮＤＩ−Ｎ−ＡＣＥＴＹＬＬＡＣＴＯ３ＡＭＩＮＹＬ　５ＴＲＵＣ ＴＵＲＥＳ”（ジ−Ｎ−アセチルラクトサミニル構造中で終っているモノフコシ ル化オリゴサツカライドの合成のための方法）という題名かついている。

請求の範囲 １、　シアル酸の類縁体を含むα−シアリル化オリコ゛サツカライドグリコシド の酵素的合成のための、以下のステップからなる方法。

ａ）　シアリルトランスフェラーゼを選択する：ｂ）　ステップａ）において選 択されたシアリルトランスフェラーゼと両立し、天然に存在するシアル酸の誘導 体であるＣＭＰ−シアル酸類縁体を選択する。

Ｃ）選択された該ＣＭＰ−シアル化類線類縁体次式のオリゴサツカライドグリコ シド受容体とオリゴサツカライド−Ｙ−Ｒ 選ばれたシアリルトランスフェラーゼの存在において、シアル酸の類縁体を含む α−シアリル化オリゴサ・ソカライドグリコシドを形成するように、シアル酸類 縁体か選ばれたＣＭＰ−シアル酸の類縁体から、オリゴサ・ツカライトグリコシ ド受容体の非還元糖末端にトランスファーされる条件で接触させる。式中、Ｒは 、Ｒが水素、脂質、または蛋白質でないことを条件として、少くとも１個の炭素 を含むアグリコン部分を表し、Ｙは、Ｏ，ＮＨとＳからなる群から選ばれ、そし て、オリゴサツカライドは、オリゴサツカライドの非還元糖末端における末端す ・ツカライドユニットが選択されたシアリルトランスフェラーゼと両立する２か ら約１０個のサツカライドユニットである。

２、ＣＭＰ−シアル酸類縁体が、酵素ＣＭＰ−シアル酸ノンターゼてシアル酸類 縁体を処理することによって得られる請求項１の方法。

３、　アグリコン部分、Ｒが、−（Ａ）−Ｚ’からなる群から選ばれる請求項１ の方法。但し、Ａは結合、２から１０個の炭素原子のアルキレン基、及び式、− （ＣＨ，−ＣＲ２Ｇ）。−の部分を表す。但し、ｎは１から５の整数であり：Ｒ ２は、水素、メチル、または、エチルからなる群から選択され、そして、Ｇは水 素、酸素、イ才つ、窒素、フェニル、及びアミン、ヒドロキシル、ハロ、１から ４個の炭素原子のアルキル、及びｌから４個の炭素原子のアルコキンからなる群 から選択されたｌから３個の置換基で置換されたフェニルからなる群から選択さ れ、Ｚ′は、水素、メチルからなる群から選ばれ、Ｇか酸素、イ才つ、または窒 素でなく、Ａが結合てないときは、Ｚ′はまた、−ＯＨ，−ＳＨ，−ＮＨ２，− ＮＨＲｌ、−Ｎ（Ｒ２）２゜−Ｃ（０）ＯＨ，−Ｃ（０）ＯＲ，、−Ｃ（０）Ｎ Ｈ−ＮＨ２，−Ｃ（０）ＮＨ２，−Ｃ（０）ＮＨＲ，。

−Ｃ（０）Ｎ（Ｒ，）２．及び−ＯＲ４からなる群から選択される。但し、各Ｒ １は、独立的に１から４個の炭素原子のアルキルであり、Ｒ４は、３から１０個 の炭素原子のアルケニル基である。

４、　アグリコン基か、少くとも炭素原子２個の疎水性基である請求項１の方法 。

５、　アグリコン部分か−（ＣＨ２）　、ＣＯＯＣＨ３と−（ＣＨ，）、　０Ｃ Ｈ２ＣＨ＝ＣＨ２、及び＝（ＣＨ，）ｓｃＨＯＨからなる群から選ばれる疎水性 基である請求項４の方法。

６、　該担体に対して、その基がたれ下っているシアル酸の類縁体を含む１つ以 上のα−シアリル化オリゴサツカライド基を有する抗原性担体の調製のための以 下のステップよりなる方法： ａ）　シアリルトランスフェラーゼを選択する；ｂ）ステップａ）において選択 されるシアリルトランスフェラーゼと両立し、天然に存在するシアル酸の誘導体 であるＣＭＰ−シアル酸類縁体を選択する；Ｃ）選択された該ＣＭＰ−シアル酸 類縁体を次式のオリゴサツカライドグリコシド受容体と オリゴサツカライド−Ｙ　Ｒ＋ 選択されたシアリルトランスフェラーゼの存在において、シアル酸の類縁体を含 むα−シアリル化オリゴサツカライドグリコシドを形成するように、シアル酸類 縁体が、選択されたＣＭＰ−シアル酸類縁体からオリゴサツカライドグリコシド 受容体の非還元糖末端へトランスファーされる条件で接触させる。式中、Ｒ３は 、Ｒ１が水素、脂質、または蛋白質でないことを条件として、該担体に結合する ことができるアグリコン部分を表し、Ｙは、０゜ＮＨ，及びＳからなる群から選 択され、オリゴサツカライドは、該オリゴサツカライドの非還元末端における末 端サツカライドユニットが、選ばれたシアリルトランスフェラーゼと両立する２ から約１０個のすリゴサソ力ライトである。

ｄ）上記ステップＣ）において産生されたα−シアリル化オリゴサツカライドグ リコシドのアグリコン部分に結合することかできる１個以上の官能基を有する抗 原担体を選択する。そして、 ｅ）ステップＣ）において産生されたシアル酸の類縁体を含む１つ以上の該α− シアリル化オリゴサツカライドグリコシドをステップｄ）で選択される抗原性担 体へ結合させる。

７、　該ＣＭＰ−シアル酸類縁体が、シアル酸類縁体を、酵素ＣＭＰ−シアル酸 シンターゼで処理することによって得られる請求項６による方法。

８、Ｒ１か、−（Ａ）−Ｚ’からなる群から選ばれる請求項６による方法。但し 、Ａは２から１０個の炭素原子のアルキレン基、及び式、−（ＣＨ，−ＣＲ，Ｇ ）、−の部分からなる群から選ばれ、但し、ｎは１から５の整数であり、Ｒ６は 、水素、メチル、またはエチルからなる群から選ばれ、Ｇは水素、酸素、イオウ 、窒素、フェニル、及びアミン、ヒドロキシル、ハロ、ｌから４個の炭素原子の アルキル、及びｌから４個の炭素原子のアルコキシからなる群から選ばれるｌか ら３個の置換基で置換されたフェニルからなる群から選ばれ：そして、Ｚ“は、 水素からなる群から選択され、Ｇか、酸素、イオウ、または窒素でないときは、 Ｚ“はまた、−ＯＨ，−３Ｈ，−ＮＨ２゜−ＮＨＲ，、−Ｃ（０）ＯＨ，−Ｃ（ ０）ＯＲ，、−Ｃ（０）ＮＨＮＨ□、及び−０Ｒｔからなる群から選択される。

但し、Ａか結合であるときは、Ｚが水素でないことを条件として、各Ｒ８は、独 立的にｌから４の炭素原子のアルキルであり、Ｒ，は、３から１０の炭素原子の アルケニル基である。

９、　アグリコン部分、Ｒ１が−（ＣＨｚ）−ＣＯＯＣＨｓ、（ＣＨりｌ０ＣＨ ２ＣＨ＝ＣＨＩ　、及び（ＣＨ，）　＊ＣＨ，ＯＨからなる群から選ばれる疎水 基である請求項８による方法。

１０、その基が該担体に対してたれ下っている、シアル酸の類縁体を含む１つ以 上のα−シアリル化オリゴサツカライド基を有する抗原性担体の調製のための以 下のステップからなる方法。

ａ）　シアリルトランスフェラーゼを選択する：ｂ）次式のオリゴサツカライド グリコシド受容体を選択する： オリゴサッカライト−Ｙ−Ｒ。

式中、Ｒ１は、Ｒ１が水素、脂質、蛋白質でないことを条件として、抗原性担体 に結合することができるアグリコン部分を表し、Ｙは、Ｏ，ＮＨ，及びＳからな る群から選ばれ、オリゴサツカライドは、該オリゴサツカライドの非還元末端に おける末端サツカライドユニットが選択されたシアリルトランスフェラーゼと両 立する２から約１０個のサツカライドユニットのオリゴサツカライドである。

Ｃ）選択されたオリゴサツカライドグリコシドのアグリコン部分に対して結合す ることかできる１個以上の官能基を有する抗原性担体を選択する。

ｄ）ステップＣ）において選択される該担体に対して、１個以上の該オリゴサツ カライドグリコシド受容体を結合させる： ｅ）　ステップａ）において選択されたシアリルトランスフェラーゼと両立し、 天然に存在するシアル酸の誘導体であるＣＭＰ−シアル酸類縁体を選択する：ｆ ）ステップｅ）で選択されたＣＭＰ−シアル酸類縁体を、上記ステップｄ）にお いて産生された抗原性担体と、選択されたシアリルトランスフェラーゼの存在下 で、該担体に対してたれ下っているシアル酸誘導体を含む１個以上のα−シアリ ル化オリゴサツカライド基を有する抗原性担体を形成するように、シアル酸類縁 体が、ＣＭＰ−シアル酸類縁体から、抗原性担体に対してたれ下っているオリゴ サツカライド基の非還元糖末端へトランスファーされる条件て接触させる。

Ｉｌ、該ＣＭ　Ｐ−シアル酸類縁体が、シアル酸類縁体を、酵素ＣＭＰ−ノアル 酸シンターゼで処理することによって得られる請求項１０による方法。

＋２．Ｒ，か、−（Ａ）−Ｚ″からなる群から選ばれる請求項１Ｏによる方法。

但し、Ａは２から１０個の炭素原子のアルキレン基、及び式、−（ＣＨ２−ＣＲ ，Ｇ）ゎ−の部分からなる群から選ばれる。但し、ｎは１から５までの整数であ り、Ｒ６は、水素、メチル、またはエチルからなる基から選ばれ、そして、Ｇは 、水素、酸素、イオウ、窒素、フェニル、及びアミン、ヒドロキシル、ハロ、ｌ から４個の炭素原子のアルキル、そして、１から４個の炭素原子のアルコキシか らなる群から選ばれるるｌから３個の置換基で置換されたフェニルからなる群か ら選ばれる。そして、Ｚ“は、水素からなる群から選ばれ、そして、Ｇか酸素、 イオウ、または窒素でないときは、Ｚ“はまた、−ＯＨ，−３Ｈ，−ＮＨ，、− ＮＨＲ，、−Ｃ（０）０１（。

−Ｃ（０）ＯＲ，、−Ｃ（０）ＮＨＮＨ２，及び＝ＯＲ，からなる群から選ばれ る。但し、Ａか結合であるときは、Ｚが水素でないことを条件として、各Ｒ６は 、■から４個の炭素原子のアルキル基であり、Ｒ７は、３から１０個の炭素原子 のアルケニル基である。

１３、アグリコン部分、Ｒ１が−（ＣＨ２）＊ＣＯＯＣＨ２、−（ＣＨ２）ｓＯ ｃＨ，ＣＨ＝ＣＨ，、及び＝（ＣＨＩ）　ｌＣＨ２０Ｈからなる群から　。

選ばれる疎水基である請求項１２による方法。

図　２ 知 亙 図　４ 図、５ シＬＬ】 ｙＬＪＬ二Ｕ 」し」１ 口、１２ 昌：１４ 釦、１５ 牛寺Ｗ￥＃−ｒ長官殿 １、事件のＦｉ示 甲Ｆ＃、４年特ｒｆｌｌｌｌｆｆｉ５　＋　０３　Ｆｉ　６号ｒ）ＣＴ／ＣＡ９ ２１００２４３ ２、発明の名称 ０−シアリル化オリゴサツカロイドグリコシドのｗＩＩ的合成方法 ３、補正上する者 ？＋ｆｆとの間係　特許出願人 氏名（名称）　クライカムド　インコーホレイテッド５、Ｗ４正命令の８１１ ６　補正により増加する請求項の数 ７　補正の対象 明嘲冑、請求の範囲及び要約書翻訳文 １　事件の表示 ２、発明の名称 ３、補正をする者 事件との間係　特幹出願人 氏名（名称）　グライヵムド　インコーホレイテッド６、補正により増加する請 求項の数 ７、補正の対象 補正書の翻訳文 １＋ｍ自＋＋＋−ＰＣＴ／Ｃ＾９２１００２４３国際調査報告 フロントページの続き （７２）発明者　カシエム、モハメッド、エイ。

カナダ国ティー６ケイ　１ブイ４　アルバ（７２）発明者　バード、ボール カナダ国ティー６イー　６ビー６　アルバ（７２）発明者　マジッド、エム０． アヴドウル

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．その方法が、以下のステップからなるシアル酸の類縁体を含むα−シアリル 化オリゴサッカライドグリコシドの酵素的合成のための方法： ａ）シアリルトランスフェラーゼを選択する；ｂ）ステップａ）において選択さ れたシアリルトランスフェラーゼと両立するシアル酸類縁体を選択する；ｃ）該 類縁体を、そのＣＭＰ−ヌクレオチド誘導体へ変換する； ｄ）該ＣＭＰ−ヌクレオチドを次式のオリゴサッカライドグリコシド受容体と、 オリゴサッカライド−Ｙ−Ｒ シアリルトランスフェラーゼの存在下で、シアル酸の類縁体を含むα−シアリル 化オリゴサッカライドを形成するように、選択された酸が、ＣＭＰ−ヌクレオチ ド誘導体から、オリゴサッカライド受容体の非還元糖末端にトランスファーされ る条件下で接触させる。式中、Ｒは少くとも１個の炭素原子を含むアグリコン部 分を表し、ＹはＯ，ＮＨ及びＳからなる群から選ばれ、そして、オリゴサッカラ イドは、オリゴサッカライドの非還元糖末端が選ばれたシアリルトランスフェラ ーゼと両立する２から約１０個のサッカライド単位のオリゴサッカライドである 。
2. ２．シアル酸の類縁体が、酵素ＣＭＰ−シアル酸シンターゼの使用により、その ＣＭＰ−ヌクレオチド誘導体へ変換される請求項１の方法。
3. ３．アグリコン部分、Ｒが、−（Ａ）−Ｚ′からなる群から選ばれる請求項１の 方法であって、但し、Ａは結合、２から１０個の炭素原子のアルキレン基、そし て、式−（ＣＨ２−ＣＲ２Ｇ）ｎ−の部分を表す。但し、ｎは１から５の整数で あり；Ｒ２は、水素、メチル、またはエチルからなる群から選ばれ；Ｇは、水素 、酸素、イオウ、窒素、フェニル、及びアミン、ヒドロキシル、ハロ、１から４ 個の炭素原子のアルキル基、及び１から４個の炭素原子のアルコキシからなる群 から選ばれた１から３個の置換基で置換されたフェニルからなる群から選ばれる ；そしてＺ′はまた、水素、メチルからなる群から選ばれ、Ｇが酸素、イオウ、 または窒素でなくＡが結合でないときは、Ｚ′はまた、−ＯＨ，−ＳＨ，−ＮＨ ２，−ＮＨＲ２，−Ｎ（Ｒ３）２，Ｃ（Ｏ）ＯＨ，−Ｃ（Ｏ）ＯＲ３，−Ｃ（Ｏ ）ＮＨ−ＮＨ２，Ｃ（Ｏ）ＮＨ２，−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ３，−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ２） ２，及び−ＯＲ４からなる群から選ばれる。但し、各Ｒ３は独立して１から４個 の炭素原子のアルキルであり、Ｒ４は、３から１０個の炭素原子のアルケニル基 である。
4. ４．アグリコン基が、少くとも２個の炭素原子の疎水基である請求項１の方法。
5. ５．アグリコン部分が、−（ＣＨ２）５ＣＯＯＣＨ２，及び−（ＣＨ２）５ＯＣ Ｈ２ＯＨ＝ＣＨ２，及び−（ＣＨ２）■ＣＨ２ＯＨからなる群から選ばれる疎水 基である請求項４の方法。
6. ６．以下のステップからなる、担体に対して、たれ下ったシアル酸の類縁体を含 む１個以上のα−シアリル化オリゴサッカライド基を有する人工的抱合体の調製 のための方法： ａ）シアリルトランスフェラーゼを選択する；ｂ）ステップａ）で選択されるシ アリルトランスフェラーゼと両立するシアル酸の類縁体を選択する；ｃ）該類縁 体を、そのＣＭＰ−ヌクレオチド誘導体へと変換する； ｄ）該ＣＭＰ−ヌクレオチドを、次式のオリゴサッカライドグリコシド受容体と 、 オリゴサッカライド−Ｙ−Ｒ１ シアリルトランスフエラーゼの存在下で、シアル酸の頬縁体を含むα−シアリル 化オリゴサッカライドを形成するように、選択された酸が、ＣＭＰ−ヌクレオチ ド誘導体から、オリゴサッカライドグリコシド受容体の非還元糖末端ヘトランス ファーされる条件下で接触させる。式中Ｒ１は、担体に結合させることができる アグリコン部分を表し、Ｙは、Ｏ，ＮＨ，及びＳからなる群から選ばれ、オリゴ サッカライドは、該オリゴサッカライドの非還元糖末端における末端ユニットが 、選ばれたシアリルトランスフェラーゼと両立する２から約１０個のサッカライ ド単位のオリゴサッカライドである。 ｅ）上記のステップｄ）で産生されたα−シアリル化オリゴサッカライドグリコ シドのアグリコン部分に結合することができる１個以上の官能基を有する担体を 選択する。そして、 ｆ）ステップｄ）において産生されたシアル酸の類縁体を含む１個以上の該α− シアリル化オリゴサッカライドを、人工的抱合体を形成するように、担体へと結 合させる。
7. ７．酵素ＣＭＰ−シアル酸シンターゼの使用により、シアル酸の該類縁体が、そ のＣＭＰ誘導体へと変換される請求項６による方法。
8. ８．Ｒ１が−（Ａ）−Ｚ′′からなる群から選ばれる請求項６による方法。但し 、Ａは、２から１０個の炭素原子のアルキレン基、及び式、−（ＣＨ２−ＣＲ５ Ｇ）ｎ−の部分からなる群から選ばれる。但し、ｎは１から５の整数であり； Ｒ５は、水素、メチル、またはエチルからなる群から選ばれ；そして、Ｇは、水 素、酸素、イオウ、窒素、フェニル、及びアミン、ヒドロキシル、ハロ、１から ４個の炭素原子のアルキル、及び１から４個の炭素原子のアルコキシからなる群 から選ばれる１から３個の置換基で置換されたフェニルからなる群から選ばれる ；そして、Ｚ′′は、水素からなる群から選ばれ、Ｇが、酸素、イオウ、または 窒素でないときは、Ｚ′′はまた、−ＯＨ，−ＳＨ，−ＮＨ２，−ＮＨＲ６，− Ｃ（Ｏ）ＯＨ，−Ｃ（Ｏ）ＯＲ６，−Ｃ（Ｏ）ＮＨ・ＮＨ２，及び−Ｒ７からな る群から選ばれる。但し、Ａがボンドであるときは、Ｚが水素でないことを条件 として、各Ｒ６は独立的に炭素原子が１から４個のアルキルであり、Ｒ７は、３ から１０個の炭素原子のアルケニル基である。
9. ９．アグリコン部分、Ｒ１が−（ＣＨ２）６ＣＯＯＣＨ２，−（ＣＨ２）６ＯＣ Ｈ２ＣＨ＝ＣＨ２，及び−（ＣＨ２）８ＣＨ２ＯＨからなる群から選ばれた疎水 基である請求項８による方法。
10. １０．担体に対してたれ下っているシアル酸の類縁体を含む１つ以上のシアリル 化オリゴサッカライド基を有する人工的抱合体の調製のための方法は、以下のス テップからなる。 ａ）シアリルトランスフェラーゼを選択する；ｂ）次式のオリゴサッカライドグ リコシド受容体を選択する オリゴサッカライド−Ｙ−Ｒ１ 式中、Ｒ１は担体に結合することができるアグリコン部分を表し、Ｙは、Ｏ，Ｎ Ｈ，及びＳ，からなる群から選ばれ、オリゴサッカライドは、該オリゴサッカラ イドの非還元末端における末端ユニットが、選択されたシアリルトランスフェラ ーゼと両立する２から約１０個のオリゴサッカライドユニットのオリゴサッカラ イドである。 ｃ）選択されたオリゴサッカライドグリコシドのアグリコン部分に対して結合す ることができる１個以上の官能基を有する担体を選択する； ｄ）それに対して、たれ下っている１個以上のオリゴサッカライドを有する人工 抱合体を形成するように、該オリゴサッカライドグリコシド受容体を該担体に結 合させる； ｅ）ステップａ）で選択されたシアリルトランスフェラーゼと両立するシアル酸 類縁体を選択する；ｆ）該類縁体を、そのＣＭＰ−ヌクレオチド誘導体に変換す る； ｇ）該ＣＭＰ−ヌクレオチド誘導体を、上のステップｄ）において産生された人 工抱合体とシアリルトランスフェラーゼの存在下で、該抱合体に対してたれ下っ ているシアル酸の類縁体を含む１個以上のα−シアリル化オリゴサッカライド基 を有する人工抱合体を形成するように、選ばれた酸が、ＣＭＰ−ヌクレオチド誘 導体から、人工的抱合体に対してたれ下っているオリゴサッカライド基の非還元 糖末端にトランスファーされる条件下で接触させる。
11. １１．シアル酸の該類縁体が、酵素ＣＭＰ−シアル酸シンターゼの使用によって 、ＣＭＰ−ヌクレオチド誘導体に変換される請求項１０による方法。
12. １２．Ｒ１が−（Ａ）−Ｚ′′からなる群から選択される請求項１０による方法 。但し、Ａは２から１０個の炭素原子のアルキレン、及び、式−（ＣＨ２−ＣＲ ５Ｇ）ｎ−の部分からなる群から選ばれる。但し、ｎは１から５の整数であり； Ｒ５は、水素、メチル、またはエチルからなる群から選ばれ；Ｇは、水素、酸素 、イオウ、窒素、フェニル、及びアミン、ヒドロキシル、ハロ、１から４個の炭 素原子のアルキル、そして、１から４個の炭素原子のアルコキシからなる群から 選ばれた１から３個の置換基で置換されたフェニルからなる群から選択される； そして、Ｚ′′は、水素からなる基から選ばれ、Ｇが酵素、イオウ、窒素でない ときは、Ｚ′′はまた、−ＯＨ，−ＳＨ，−ＮＨ２，−ＮＨＲ６，−Ｃ（Ｏ）Ｏ Ｈ，−Ｃ（Ｏ）ＯＲ６，−Ｃ（Ｏ）ＮＨ・ＮＨ２，−ＯＲ７からなる群から選ば れる。但し、Ａが結合であるときは、Ｚが水素でないことを条件として、各Ｒ６ は独立して１から４個の炭素原子のアルキルであり、Ｒ７は、炭素原子が３から １０個のアルケニル基である。
13. １３．アグリコン部分Ｒ１が−（ＣＨ２）６ＣＯＯＣＨ２，−（ＣＨ２）５ＯＣ Ｈ２ＣＨ＝ＣＨ２，及び−（ＣＨ２）８ＣＨ２ＯＨからなる群から選ばれる疎水 性基である請求項１２による方法。