JPH06509945A - 酵素媒介三本鎖形成のための架橋性オリゴヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 酵素媒介二本鎖形成のための架橋性オリゴヌクレオチド本発明は、１９８８年９ 月２８日に出願された出願番号０７／２５０．４７４（現在、放棄されている） を部分的に継続するものであり、次に１９８９年３月１８日に出願された出願番 号０７／３５３．８５７を部分的に継続するものである。

発明の背景 本発明は、ヌクレオチド架橋剤に関し、かつオリゴヌクレオチドの製造における これらの化合物の使用に関する。本発明はまたオリゴヌクレオチド製造のための 核酸塩基として有用なピラゾロ［３，４−ｄｌ　ピリミジンの誘導体に関する。

オリゴヌクレオチドは、“ターゲットのＤＮＡまたはＲＮＡ配列を検出するため の診断的なプローブとして有用である。従来、このようなプローブはプリン、ピ リミジン、または７−ジアザプリンヌクレオチド塩基を含有する核酸配列から成 り立っていた（Ｕ、　Ｓ、特許４゜７１１．９５５；ロビンス等、Ｊ−カナディ アン・ジャーナル・オブ・ケミストリー（Ｊ、　Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｃｈｅｗ、　 ）、６０巻、５５４頁（１９８２年）：ロビンス等、ジャーナル・オブ・オーガ ニック・ケミストリー（Ｊ、Ｏｒｇ。

Ｃｈｅａ＋、）　、４８巻、１８５４頁、（１９８３年））。化学的部分（ｃｈ ｅｍｉｃａｌ　ｍｏｉｅｔｉｅｓ）をこれらの塩基に結合させる方法は、アセト キン水銀化反応を介するものであり、これによって水銀原子をピリミジン環の５ 位、プリン環のＣ−８位または７−デアザプリン環のＣ−７位に共有結合的に結 合させるか（ダール等、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オ ブ・サイエンシイズ・ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ）　、７０巻、２２３８頁（１９７３年）：ダール等、ノくイオケミストリー（ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　、１４巻、２４４７頁（１９７５年））、または 有機水銀化合物をバランラム触媒存在下ですレフイン化合物と反応させることに よるもの（ルス等、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー、４３巻、 ２８７０頁（１９７８年）、ベルゲストロム等、ツヤ−ナル・オブ・アメリカン ・ケミカルバッサイエティー　（Ｊ、　Ａｍ、　ＣｈｅＩｌ、　Ｓｏｃ、　）　 、１００巻、８１０６頁（１９７８年）、ビノジ等、ジャーナル・オブ・アメリ カン・ケミカル・ソサイエテイー（Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓａｃ、　）　 、１０２巻、２０３３頁（１９８０年）である。

オリゴヌクレオチドプローブの糖組成は、目下の所、リボースまたはデオキシリ ポース、または、ある場合においては天然のβ−アラビノースを含有する核酸か ら構成される（特許公開公報ＥＰ２２７．４５９）。

この度、新しいグループのヌクレオチド塩基、即ち３．４−ジ置換および３，４ ゜６−トリ置換ピラゾロ［３，４−ｄｌ−ピリミジンが見い出され、これは従来 技術に数種の利点をもたらすものである。ピラゾロピリミジンのデ・ノボ（封」 四９）化学合成とそれにより生じたヌクレオチドにより、ヌクレオチド塩基上の 様々な異なる位置に広範囲の官能基を組み込むこと、および様々な糖部分を使用 することを可能にする。またアデニン、グアニンおよびヒポキサンチン類似体も 単一のヌクレオシド前駆体から得られる。更に、該合成は有毒な重金属または高 価な触媒の使用を必要としない。類似のピラゾロ１３．４−ｄコービリミジンが 知られている（コバヤン、ケミカル・アンド・ファーマシューティカル・ブレテ ィン（Ｃｈｅｍ、　Ｐｈａｒｍ、　Ｂｕｌｌ、　）　、　２１巻、９４１頁（１ ９７３年））が、しかしながら、本発明の化合物とは置換基が異なり、またそれ らの用途はキサンチンオキシダーゼ阻害剤としてのみである。

架橋可能なヌクレオチドプローブを治療的および診断的施用において用いる概念 は、ＢＲ，ベーカー、“活性部位指向性不可逆的酵素阻害剤の設計”、ライレイ 、ニューヨーク、（１９６７年）の先駆的研究と関連があり、彼は、化学療法的 施用において“活性部位指向性酵素阻害剤（ａｃｔｉｖｅ−ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅ ｃｔｅｄ　ｅｎｚｙＩＩｌｅ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）”の用語を使用した。

近年、オリゴヌクレオチドに架橋を組み込む概念は、より優れた配列プローブを 開発するための労力と言う点で時々議論が起こるものである。ノーレおよびヴラ ソフ、プログレス・イン・ニュークリアイック・アシッド・リサーチ・オブ・モ レキュラー・バイオロジー（Ｐｒｏｇ、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　Ｍ ｏｌ、　Ｂｉａｌ、　）　、３２巻、２９１頁（１９８５年）は、オリゴヌクレ オチドの３′−または５゛−末端に付与されたＮ−（２−クロロエチル）−Ｎ− メチルアニリン基を使用して配列指向的に架橋すること（“相補性に対応した修 飾（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ａｄｄｒｅｓｓｅｄ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉ ｏｎ）”）について議論している。サマートンおよびバートレット、ジャーナル ・オブ・モレキュラー・オブ・バイオロジー（ＪｏＭｏｌ、Ｂｉｏｌ、）　、１ ２２巻、１４５頁（１９７８年）は、Ｃ−４位にノドノン残基が結合し、末尾に 高反応性ブロモメチルケトン基がある８−原子鎖が、グアノシンのＮ−７に架橋 し得ることを示した。

ウェブおよびマチラッチ、ニューフレインク・アンラド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅ ｉｃ＾Ｃｉｄ　Ｒｅｓ、）　、１４巻、７６６１頁（１９８６年）は、５−メチ ル−Ｎ、Ｎ−エタノントノン塩基を含有するオリゴヌクレオチドを調製しており 、これは相補鎖と緩やかに架橋することが出来るものである。概念的には関連し ている、ＤＮＡハイブリッド内でリンカ−アーム（１ｉｒ＋ｋｅｒ　ａｒａ）を 介するアルキル化において、イヴアーソンおよびデルヴアン、プロノーディング ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンンイズ・Ｕ　Ｓ　Ａ　（Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）、８５巻、４６１５頁（ １９８８年）は、反対側の鎖のメチル化を示しており、メチルチオエーテルのＢ ｒＣＮ活性化により、結合物（ｌｉｎｋｅｒ）を支える塩基から２対離れた位置 のグアニジノ塩基上で優位に引き起こされる。

オリゴヌクレオチドは、化学療法剤として用いられることもあり、侵入してきた 生物体、例えばウィルス、菌、寄生体または細菌に特有の遺伝子配列の発現を制 御する。天然では、細菌において“アンチセンス”ＲＮＡにより制御されるＲＮ Ａの発現もあり、相補的なターゲットＲＮＡとＲＮＡ：　ＲＮＡハイブリッドを 形成し、それらの生物学的活性を調節または不活性化することによりその効果を 発揮するものである。アンチセンスＲＮＡを真核細胞に導入するのにプラスミド ベクターを用いる最近の多様な研究から、真核細胞に導入されたアンチセンスＲ ＮＡがターゲットであるｒｎＲＮＡの発現をイン・ビボで効果的に阻害すること が示されている（グリーン等、アナル・レビュー・オブ・バイオケミストリー（ Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　ＢｉｏｃｈｅＩｌ＋、　）　、５５巻、５６９−５９７頁 （１９８６年）で概説）。加えて、多数のｍＲＮＡの中から特定のｍＲＮＡを相 補的ＤＮＡ制限フラグメントと共にハイブリダイゼーションすることによりタン パク質合成を選択的に不活性化すること力咄来、これは、ｍＲＮＡと結合するこ とによってリボゾーム上でｍＲＮＡがタンパク質へ翻訳されるのを妨ぐものであ る（ベーターノン等、ブロン−ディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ ・サイエンンイズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。＾ｃａｄＳｃｉ、）、７４巻、４３ ７０−４３７４頁（１９７７年）：ノ１ステイー等、プロノーディング・オブ・ ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシイズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）　、７５巻、１２１７−１２２１頁（１９７８年）。

配列特異性アンチセンスオリゴヌクレオチドを遺伝子発現の調整剤および化学療 法剤として用いる概念を最初に立証したものとして、ツアメクニクおよびステフ エンソン、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエン ンイズ・ＵＳＡ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）　、７５ 巻、２８０頁（１９７８年）は、小さいアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチ ドプローブが、細胞培養におけるラウス肉腫ウィルス（ＲＳ　Ｖ）の複製を阻害 ６来ること、およびＲ３Ｖウィルス性ＲＮＡの翻訳がそれらの条件下で阻害され ることを示すものであった（ステフエンソン等、プロシーディング・オブ・ナシ ョナル・アカデミ−・オブ・サイエンンイズ−Ｕ　Ｓ　Ａ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）、７５巻、２８５頁（１９７８年）） 。ツァメクニク等、ブロン−ディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・ サイエンシイズ−Ｕ　Ｓ　Ａ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、１ ＪｓＡ）　、８３巻、４１４３頁（１９８６年）は、ＨＩＶゲノムと部分的に相 補的なオリゴヌクレオチドが細胞培養においてタンパク質発現およびウィルス複 製を阻害する能力を有することも示している。阻害の９５％までが、約７０μＭ のオリゴヌクレオチド濃度で得られた。重要なことに、彼らはオリゴヌクレオチ ドが無傷で細胞に入り、代謝に対して適度に安定であることを標識ホスフェート 研究と共に示した。

ウサギグロビンｍＲＮＡの開始コドン領域に相補的な配列を持つ非電荷のメチル ホスホネートオリゴデオキシヌクレオチドは、無細胞系およびウサギ網状赤血球 の両方においてｍＲＮＡの翻訳を阻害した（ブレイク等、バイオケミストリー（ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　、２４巻、６１３９頁（１９８５年））。別の非 電荷メチルホスホネートオリゴヌクレオチド類似体、単純ヘルペスウィルス１型 のｍＲＮＡのアクセプタースプライス部位に相補的な８−ヌクレオチド配列は、 無傷のベロ細胞におけるウィルス複製を阻害出来る。しかしながら、この阻害に はかなり高濃度（＞２５ｍＭ）のこれら非イオン性プローブが必要であった。

架橋性オリゴヌクレオチドの影響力は、化学療法分野において非常に重大なもの であるかもしれないが、ＤＮＡプローブを基礎とする診断剤におけるこれらの影 響力も同様に非常に重要なものである。共有結合的にプローブ−ターゲットのハ イブリッドを架橋する能力は、診断剤アンセーにおけるバックグラウンド（ｂａ ｃｋｇｒｏｕｎｄ）および感受性の限界を劇的に改善し、同様に新規のアッセー 形式を可能にする潜在能力を持つ。具体的な革新（ギャンパー等、ヌクレイツク ・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）　、１４巻、９９４ ３頁（１９８８年）により以前議論された）は、以下である： （ａ、　）変性洗浄工程を組込み、バックグラウンドを除くこと；（ｂ）識別の ために付加する段階として架橋を使用すること。

（Ｃ）鋭敏な特異性を確実にし、ターゲットの２次構造を実質的に変形する、所 望のハイブリッドの融点温度またはその付近で架橋を起こし、それによりハイブ リッド形成の効果を増加すること、および（ｄ）逆すザンブロトコールにより例 示されるような新規溶液ハイブリダイゼーション形式。

しかしながら、架橋する概念は、回避されなければならない潜在的な問題を示唆 している。例えば、架橋手（ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ　ａｒｍ）を含有するオ リゴヌクレオチドは共有結合的にターゲットの配列と非常に容易に結合すること があるため、配列の不適当な組合せが起こり、宿生毒性（ｈｏｓｔ　ｔｏｘｉｃ ｉｔｙ）が生じる可能性がある。他方で、架橋反応は十分に迅速でなければなら ず、正確に組み合わせた配列が分離し得る前に反応が起こらなければならない。

この結論を出すには、ハイブリダイゼーション時に、結果としてそのＴ、がちょ うど３７℃の生理学的温度以上である二本鎖を生じるオリゴヌクレオチドを作成 すればよい。そうすれば、ただ一つの不適当な組合せの塩基でもハイブリッド形 成を妨げ、更に架橋を妨げるであろう。オリゴヌクレオチドの長さと塩基組成、 同様にプローブ内で塩基を修飾する場所をうまく選択すれば、最大限の効果を達 成することが出来る。しかしながら、プローブは十分長くし、唯一の部位を特異 的にターゲツトとすることを確実にしなければならない。

ヨーロッパ特許出願８６３０９０９０．８号は、５−！換つリジニルのような化 学的に修飾したＤＮＡプローブの形成を記載しており、その中で！換基は架橋し ないが、化学的または物理的リポータ−基を含有している。Ｗ○８７０７６１１ はＤＮＡフラグメントの標識方法を記載しており、フラグメントを化学的に修飾 し、続いて蛍光色素と反応させること等によるものである。ヤブサキ等、Ｕ。

Ｓ、特許４，５９９．３０３号は、共有結合的に架橋するオリゴヌクレオチドの 機構を開示しており、光励起時に他のヌクレオチドと共有結合的に結合して成る チミジンのフロクマリン−付加物の形成などによる。ＥＰ　０２５９１８６は架 橋性核酸ハイブリダイゼーションブローブとして用いられ得る高分子とビオチン の付加物を開示している。Ｗ○８５０３０７５は核酸フラグメント化剤として有 用な架橋性ジスルホン酸エステルを開示している。ＤＥ３３１０３３７は、タン パク質などの高分子に対する一本鎖ポリヌクレオチドの共有結合的架橋を記載し ており、生じる複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）は、引き続き外来ポリヌクレオチドに おける相補的配列の調査時にハイブリダイゼーション実験のマーカーとして使用 される。

プローブオリゴヌクレオチドは、高い特異性を持つターゲット配列を同定するの に十分な塩基配列から成る必要があり、それは特定の相補塩基と容易に共有結合 を形成する１またはそれ以上の架橋手を与えられる。このようなオリゴヌクレオ チドは、ハイブリダイゼーションアッセーにおいて高選択的プローブとして使用 されることがある。オリゴヌクレオチドＲＮＡのアンチセンス剤として、例えば 化学療法において使用されることもある。

発明の要約 本発明は、近接している複数のオリゴヌクレオチド鏡上の特定の部位間の架橋を 成し得る架橋剤に関する。観察された架橋反応は、非常に優れた特異性を持つも のである。本発明は、これら架橋剤の少なくとも１種から成るオリゴヌクレオチ ドおよび生じた新規オリゴヌクレオチドを診断的および治療的目的に使用するこ とにも関する。

より詳細には、本発明の架橋剤は、架橋手を持つヌクレオチド塩基の誘導体であ り、以下の式（Ｉ′）である・ Ｒ，−Ｂ−（ＣＨ２）、−（Ｙ）、−（ＣＨ２）、−Ａ’　（１’）式中、 Ｒ１は、水素、または所望によりその３°または５°位で、酸素により糖部分と 結合しており、基Ｑ１、Ｑ２およびＱｓを含んでいるいるリン誘導体、または、 ヌクレオチド結合形成に適切なそれらの反応性前駆体で置換されていることもあ る糖部分またはその類似体であり。

Ｑ、は、ヒドロキシ、ホスフェートまたはジホスフェートであり：Ｑ２は、＝０ または＝Ｓであり。

Ｑｓは、ＣＨ２−Ｒ’、Ｓ−Ｒ’、Ｏ−Ｒ’、またはＮ−Ｒ’Ｒ”であり。

ＲｏおよびＲ”のそれぞれは、独立して水素またはＣ１−６アルキルであり。

Ｂは、核酸塩基またはそれらの類似体であって、オリゴヌクレオチドの構成部分 であり。

Ｙは、機能的な連結基であり： ｍおよびｑのそれぞれは独立してＯから８までであり。

ｒは０または１であり； Ａ゛は離脱基である。

本発明は、上記式（Ｉｏ）のヌクレオチド塩基誘導体の少なくとも１種から成る 新規オリゴヌクレオチドを提供するものでもある。

本発明のヌクレオチドおよび該ヌクレオチドが組み込まれているオリゴヌクレオ チドはプローブとして使用することも可能である。プローブバイブυダイゼーン ヨンは緩慢ではあるが可逆であるから、プローブを正確なターゲット配列とハイ ブリダイズする時間毎に、プローブが不可逆的にその配列と結合することを確実 にするのが望ましい。本発明のヌクレオチド塩基の共有結合架橋手は、ターゲッ ト鎖を永久に修飾するかまたは脱プリンを引き起こすと思われる。本発明のオリ ゴヌクレオチドは、それ自体、無細胞系、および細胞系において対象となる相補 的核酸配列の同定、分離、位置測定および／または検出に有用である。従って、 本発明は更にターゲットの核酸配列を同定する方法を提供するものであり、その 方法は、標識した本発明のヌクレオチド塩基の少なくとも１種から成るオリゴヌ クレオチドプローブを利用することから成る。

本発明は更に、遺伝子機能を不活性化する方法を記載しており、それは架橋可能 な抗遺伝子○ＤＮと組換え酵素の結合を必要とする。ＯＤＮを組換え酵素で被覆 することにより、ターゲット遺伝子内での類似性の調査、および続いて起こる二 本鎖形成を助長する。結果として生じる二本鎖複合体（ｔｒｉｐｌｅ　５ｔｒａ ｎｄ　ｃｏａ＋ｐｌｅｘｅｓ）を架橋すると、遺伝子機能が不活性化する。架橋 可能な抗遺伝子核タンパク質繊維についても記載しており、（１）遺伝子内で、 ターゲットＤＮＡ配列に相補的なあるオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）に共有結合 的に連結するヌクレオシド架橋剤、および（１１）ＯＤＮと非共有結合的に結合 する組換え酵素を含んでいる。

本発明は、新規置換ピラゾロｒ３．４−ｄ〕ピリミジンを提供するものでもあり 、これはヌクレオシドおよびヌクレオチドの調製時にヌクレオチド塩基として、 通常のプリンまたはピリミジン塩基またはデアザプリン類似体よりも有用である 。

図面の簡単な説明 図１は、アセトアミドプロピル側手（ｓｉｄｅａｒｍ）を介して、相補塩基から ５′方向に２部位離れて位置するデオキシグアノノン残基に架橋したオリゴヌク レオチドの修飾チオキシウリジン残基を表している。

図２は、！！ｐ−標識ＨＰＶターゲットおよび架橋した生成物で、グアノノンの ３′側で切断したもののオートラジオグラムを表している。レーン１３２Ｐ−標 識１５−ｓｅｒサイズマーカー。レーン２・２４時間２０℃で反応。レーン３ニ ア２時間２０℃で反応。レーン４：２４時間３０℃で反応。レーン５ニア２時間 ３０℃で反応。反応は、２−アミノエタノチオールで停止し、ピペリジン溶液で 処理して効果的に切断した。

図３は、Ｕｐ−標識ＨＰＶターケソトおよび架橋した生成物のオートラジオグラ ムを表しており、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動による／Ｘイブリッド分 離を示している。レーント対照の３２Ｐ−標識ＣＭＶターゲット。レーン２：２ 時間２０℃で反応。レーン３ニア２時間２０℃で反応。レーン４：２４時間３０ ℃で反応。レーン５ニア２時間３０℃で反応。反応溶液を２−アミノエタノチオ ールで処理し、これはヨードアセトアミド基を消滅させる。

発明の詳細な説明 Ａ、架橋性オリゴヌクレオチド 本発明は、架橋手を持つ新規置換ヌクレオチド塩基を提供するものであって、ヌ クレオシドおよびヌクレオチドの調製に有用であり、架橋剤としても有用である 。買換塩基は以下の式（Ｉｏ）である：Ｒ＋　Ｂ　（ＣＨ２）−（Ｙ）、（ＣＨ ２）、、Ａ’　（１’）式中、 Ｒ１は、水素、または所望によりその３′または５°位で、酸素により糖部分と 結合しており、基Ｑ３、Ｑ２およびＱｓを含んでいるリン誘導体、または、ヌク レオチド結合形成に適切なそれらの反応性前駆体で置換されていることもある糖 部分またはその類似体であり； Ｑｌは、ヒドロキシ、ホスフェートまｔこはジホスフェートであり：Ｑ２は、＝ ０または＝Ｓであり。

Ｑｓは、ＣＨ２−Ｒ’、Ｓ−Ｒ’、○−Ｒ′、またはＮ−Ｒ’Ｒ”であり。

ＲｏおよびＲ”のそれぞれは、独立して水素またはＣ１−６アルキルであり：Ｂ は、核酸塩基またはそれらの類似体であって、オリゴヌクレオチドの構成部分で あり。

Ｙは、機能的な連結基であり。

ｍおよびｑは独立して０から８までであり：ｒは０または１であり。

八゛は離脱基である。

本発明の実施において、糖部分またはその類似体は、ヌクレオチドの構成部分と して有用なものから選択される。そのような糖部分は、例えば、リボース、チオ キシリボース、ペン［・−ス、デオキシベントース１、ヘキソース、デオキシヘ キソース、グルコース、アラビノース、ベントフラノース、キシロース、リキソ ースおよびンクロベンチルから選択され得る。糖部分は、好ましくは、リポース 、チオキシリポース、アラビノースまたは２°−○−メチルリボースであり、ア ノマー、αまたはβのいずれかも含む。

糖部分に結合するリン誘導体は、例えばモノホスフェート、ジホスフェート、ト リホスフェート、アルキルホスフェート、アルカンホスフェート、ホスホロチオ エート、ホスホロ／チオエート等から適宜選択される。

ヌクレオチド内結合形成に適切な反応性前駆体は、オリゴヌクレオチド合成にお けるヌクレオチド鎖伸長時に有用なものの一つである。本発明において、特に有 用な反応性基はリンを含有するものである。ヌクレオチド内結合形成に適切なリ ン含有基は、好ましくはアルキルホスホルアミダイト、アルキルホスファイトま たはアルキルホスホルアミダイトである。代替として、活性化ホスフェ−トンエ ステルが本目的に使われることもある。

核酸塩基またはそれらの類似体（Ｂ）は、プリン、ピリミジン、デアザプリンお よびピラゾロピリミジンから選ばれることもある。それは、好ましくはウラシル −５−イル、ノドノン−５−イル、アデニン−７−イル、アデニン−８−イル、 グアニン−７−イル、グアニン−８−イル、４−アミノピロロ−［２，３−ｄ］ ピリミジン−５−イル、２−アミノ−４−オキソピロロ［２，３−ｄ］ピリミジ ン−５−イル、４−アミノピラゾロ［３，４−ｄ］　ピリミジン−３−イルまた は４−アミノ−６−オキソピラゾロ［３，４−ｄ］　ピリミジン−３−イルから 選択され、そこで、プリンは９位を介してオリゴヌクレオチドの糖部分に結合し 、ピリミジンは１位を介して、ピロロピリミジンは７位を介して、ピラゾロピリ ミジンは１位を介してオリゴヌクレオチドの糖部分に結合する。

機能的な連結基Ｙは、オキ７、チオ、アミノまたはそれらの化学的に保護された 誘導体、例えば、トリフルオロアセトアミド、フタルイミド、Ｃ０ＮＲ’、ＮＲ ’ＣＯ，および５Ｏ２ＮＲ’、式中Ｒ’＝Ｈ＊たはＣｌ−６フル＋ルである、な どの核性基から選ばれる。これらの脂肪族または芳香族アミンを含むものの機能 性は請求核特性を示すこと、および−（Ｃｌ２）　、−Ａ’基の結合点として働 く能力を持つ二とである。アミノ基および保護されたそれらの誘導体が好ましい 。離脱基Ａ′は、例えば、クロロ、ブロモ、ヨード、５０２Ｒ’″またはＳ″Ｒ “Ｒｏなどの基から選ばれることもあり、ここで、ＲｏおよびＲ”はそれぞれ独 立してＣし６アルキルまたはアリルであり、またはＲｏおよびＲ”は−緒になっ てＣｌ−６アルキレン橋かけを形成する。クロロ、ブロモおよびヨードが好まし い。離脱基は、その離脱能力によって変更する。特定の離脱基の性質および反応 性に依存して、用いる基を各場合で選び、不可逆的に結合するプローブの望まし い特異性を得る。

二本鎖ＤＮＡのボール・アンド・スティックモデル（Ｂａｌｌ−ａｎｄ−ｓｔｉ ｃｋ　ｍｏｄｅｌｓ）による考察および高分解能コンピューターグラフィックは 、プリンの７位、ピリミジンの５位が二本鎖核酸のＢ型二本鎖構造のメジャーグ ローブ（ｔｈｅ　ｍａｊｏｒ　ｇｒｏｏｖｅ）に存在することを示している。こ れらの位置は、かなりの量の側鎖で置換され得るが、塩基のハイブリダイゼーシ ョン特性で影響を受けることはない。これらの倒毛は、ｄＴｈｄまたはｃｉｃｙ ａの誘導化、またはへテロ環状塩基の直接の全合成、続くグリコリル化のいずれ かにより導入されることもある。これらの修飾ヌクレオチドは自動ＤＮＡ合成機 でオリゴヌクレオチドに組み込むために適切な活性化ヌクレオチドに転化するこ ともある。アデニンの類似体であるピラゾロ［３，４−ｄｌ−ピリミジンと架橋 手を３位で結合させるが、これはプリンの７位に対しても同等である。

架橋性側鎖は、プリン７−または８−位、ピリミジン５−位、ピロロピリミジン ５−位またはピラゾロピリミジン３−位からメジャーグローブを横切って届くた めに、充分長く、修飾類似体を含有する塩基対の（オリゴマー３゛側）上に位置 するプリン（好ましくはグアニン）のＮ−７と反応するものでなければならない 。従って、側鎖は、長さにして、少なくとも３原子のものであるべきであり、好 ましくは、少な（とも５原子のもの、より好ましくは少なくとも６原子のもので ある。一般的に好ましい側鎖の長さは、約５から約９炭素原子である。

鎖を最大限に架橋するには、架橋手を含むオリゴヌクレオチドにおいて修飾塩基 の３°側上にある第一または第二の塩基と攻撃されているターゲット鎖塩基を対 合することが望ましいと思われる。例えば、攻撃下のターゲット鎖塩基がグアニ ンである場合、修飾ウラノルを含有するプローブに対するターゲット配列は、Ｕ ＺＣ（好ましくはＵＣＣ）の見は５位で架橋手で置換されたｄＵｒｄであるもの を含有するブローブオリゴタクレオチドと相補のＧＺＡ　（好ましくはＧＧＡ） でＺはいずれかの塩基であるものを含有すべきである。架橋性アデニン誘導体を 含有しているオリゴヌクレオチドにおいて、例えば、三つ組のアデニン修飾ΔＺ 】Ｃは、ＧＺ’Ｔで２１はいずれかの塩基であるものをターゲットとするだろう 。

架橋手を育する修飾塩基がウラシルであり、ターゲット配列がＧＧＡである場合 、架橋剤（ｃｌｏｓｓｌｉｎｋｅｒ）で修飾された塩基対のターゲット配列５° 側の二番目のグアニンのアルキル化は（図１で示したように）観察された唯一の 作用である。

架橋反応は、非常に特異的であり請求核分子に親電子分子が“最適に一致する（ ｂｅｓｔ　ｆｉｔ）”と思われる。即ち、アルキル化部位を見つけるには、２ま たはそれ以上のグアニン残基が、修飾された塩基の相補に近接する必要があり得 る。

修飾した２種類の２′−チオキンヌクレオシドは、本発明において配列指向性架 橋剤としてオリゴヌクレオチドに組み込むための特定の宵月性を示すものである 。第一種は、５−置換−２′−チオキシウリジンであり、その−膜構造は以下に 示す： ５−置換−２′−デオキシウリンンはスキーム１および２で示した経路により調 製され得る。

ｆＸＥ） 例えば、ロビン等の一般的方法（Ｊ　カナディアン・ジャーナル・オブ・ケミス トＪ）−（Ｊ、　Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｃｈｅｍ、　）　、５　Ｑ巻、５５４頁＜１ ９８２年）、ツヤ−ナル・オブ・オーカニ、り・ケミストリー（Ｊ、Ｏｒｇ、Ｃ ｈｅｏ、）　、４８巻、１８５４頁（１９８３年））を、スキーム１て示したよ うに応用して、直換１−アルキン（ＸＸＩ）を５−ヨード−２゛−チオキシウリ ノン（ＸＸ）とパラジウム媒介カップリングして、アセチレン結合生成物（ＸＸ ＩＩ）を得る。アセチレンのｄＵｒｄ類似体ＸＸＴｌを、例えば、ラネー・ニッ ケルで還元して、飽和化合物（ＸＸＩＩＩ）を得、これを次に直接用いて、下記 のＤＮＡ自動合成機で使用する反応物イこ転化した。

（ｘｘｖ’ｒ） （ＸＸＶＴ＋１ （ＸＸ７ＴＩ） ５−クロロメルク）フォー２゛−デオキシウリノン（ＸＸ　Ｉ　Ｖ）を出発化合 物として用いる場合、直接オレフィンを結合させて、機能化したオレフィンとの パラジウム触媒化カップリングにより、オレフィン化合物（ＸＸＶＴＩ）を得る ことは出来ない。代わりに、スキーム２で示したように、置換アルケン（ＸＸＶ ）および５−タロロメルクリオー２′−デオキシウヮシン（ＸＸ　Ｔ　Ｖ）をメ タノールと一緒に反応させて、アルファーメトキン付加物（ＸＸＶＩ）を得、こ れをトリフルオロ酢酸および無水１リフルオロ酢酸によりオレフィン化合物ＸＸ ＶＩＩに転化する。下記のようにＤＮＡ合成合成試用試薬化させるために、還元 して飽和化合物（ＸＸｒｌｌ）を得る。

Ｂ　ピラゾロ［３，４−ｄｌ　ピリミジン第二種の修飾ヌクレオチドは２゛−チ オキシ−４−アミノピラゾロ［３，４，−ｃｊ］ピリミジン誘導体の群である。

これらの誘導体の一般的な構造を以下に表す上記化合物は、３．４−二置換およ び３．４．６−三置換ピラゾロ［３，１−ｄ］ピリミジンの新規誘導体群から誘 導される。３，４−二置換および３．４．６−三置換ピラゾロ［３，４−ｄｌ　 ピリミジンおよびそれらの合成は、出願人自身の別出願第２５０．４７４号に開 示されており、その全体を本明細書に参照して組み込んでいる。それらは以下の 式（１）を待つ式中、 Ｒ，は、水素、または糖部分またはそれらの類似体であり、所望によりその３′ または５゛位で、酸素により糖部分と結合しており、基Ｑ１、Ｃ２およびＣ３を 含んでいるリン誘導体、または、ヌクレオチド結合形成に適切なそれらの反応性 前駆体で置換され、但しＲ３が水素である場合、Ｒ１は水素であり得ない：Ｑ、 は、ヒト七キノ、ホスフェートまたはジホスフェートであり。

Ｃ２は、二〇または＝Ｓであり。

Ｃ３は、ＣＨａ　Ｒ’、Ｓ−Ｒ’、Ｏ−Ｒ’、またはＮ−Ｒ’Ｒ”であり：Ｒ“ およびＲ”のそれぞれは、独立して水素またはｃｌ−６アルキルであり。

Ｒ３は、水素または基−ｗ−（Ｘ）、−八であり；ＷとＸのそれぞれは、独立し て化学リンカ−アーム（ｃｈｅｍｉｃａｌ　１ｉｎｋｅｒ　ａｒｍ）であり。

Ａは、インターカレーター（ｊ、ｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒｓ）　、金属イオンキ レータ−１求電子性架橋物、光活性可能架橋物、またはリポータ−基でありＳＲ ，およびＲ６それソレハ、独立してＨｌＯＲ，ＳＲ，ＮＨＯＲ，ＮＨ２まタハＮ Ｈ（ＣＨ２）　１ＮＨ２でありＳ Ｒは、ＨまたはＣ１−６アルキルであり。

ｎは、ゼロまたは１であり。

ｔは、ゼロまたは１２である。

３．４−二置換および３．４．６−三置換ピラゾロ［３，４−ｄｌ　ピリミジン ヌクレオノドの合成および酵素的にまたは化学合成を介してのいずれかで核酸に 組み込むための試薬としてのそれらの使用は、現状手段に幾つかの利点を与える ものである。ヌクレオチドのデ・ノボ（ｄｅ　ｎｏｖｏ）化学合成は、広範囲の 官能基（例えば、ＮＨ２、ＳＨ，ＯＨ，ハロケン、Ｃ０ＯＨ，ＣＮ、Ｃ０ＮＨ２ ）の組み込みと様々な糖部分の使用を可能にする。アデニン、グアニン、および ヒポキサンチン類仰体も単一ヌクレオチド前駆体から得られる。更に該合成は、 有毒な重金属または高価な触媒の使用を必要としない。

本発明の実施において、糖部分またはその類似体はヌクレオチドの構成部分とし て有用なものから選択される。該部分は、例えば、ペントース、デオキシペント ース、ヘキソース、チオキシヘキソース、リボース、チオキシリホース、グルコ ース、アラビノース、ベントフラノース、キンロース、リキソースおよびンクロ ベンチルから選択され得る。糖部分は、好ましくは、リボース、チオキシリポー ス、アラビノース、または２′−〇−メチルリボースであり、アノマーαまたは βのいずれかを含む。

糖部分に結合しているリン誘導体は、例えば、モノホスフェート、ジホスフェー ト、トリホスフェート、アルキルホスフェート、アルカンホスフェート、ホスホ ロチオエート、ホスホロンチオエートなどから適宜選択される。

ヌクレオチド内結合形成に適切な反応性前駆体は、オリゴヌクレオチドの合成に おけるヌクレオチド鎖伸長に役立つものの１種である。本発明において特に有用 な反応性基は、リンを含有するものである。ヌクレオチド内結合形成に適切なリ ン含有基は、好ましくはアルキルホスホアミダイト、アルキルホスファイト、ま たはアルキルホスホアミダイトである。代替として、活性化ホスフェ−トンエス テルを本目的に使用することもある。

上記式■において、化学リンカ−アーム（Ｗ単独またはＸと一緒）は、例えば抗 体、ディテクタータンパク質（ｄｅｔｅｃｔｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ）　、また は化学試薬とより容易に相互作用出来る官能基（Ａ）を作るために働く。その結 合は、塩基が二本鎖複合体内のもう一つの塩基と対をなす場合、塩基から離れて いる官能基を支える。結合手は、工ないし１２炭素原子のアルキレン基、２ない し１２炭素原子のアルケニレン基および１つまたは２つのオレフィン結合、２な いし１２炭素原子のアルキニレン基および１つまたは２つのアセチレン結合、ま たは、末端てオキ／、チオ、アミノまたは化学的に保護されたそれらの誘導体（ 例えば、トリフルオロアセトアミド、フタルイミド、Ｃ０ＮＲ’、ＮＲ’ＣＯお よび５Ｏ２ＮＲ’、式中Ｒ“＝ＨまたはＣ１−６アルキル）などの核性基で置換 されるような基を含むこともある。このような機能性は、脂肪族または芳香族ア ミンを含んでおり請求核特性を示し、かつ官能基（Ａ、）の結合点として働く能 力がある。

リンカ−アーム部分（Ｗ単独またはＸと一緒）は、好ましくは、少なくとも３原 子のもの、更に好ましくは、少なくとも５原子のものである。末端の核基は、好 ましくは、アミノまたは化学的に保護されたそれらの誘導体である。

インターカレーターは、平面の芳香族二環式、三環式、多環式分子であり、核酸 の二本鎖らせん構造において、それ自身を２つの近接した塩基対の間に挿入でき るものである。インターカレーターは、ＤＮＡおよびＲＮＡにおけるフレームノ ット変異を引き起こすのに用いられて来た。インターカレーターを結合手を介し て（つなぎ鎖でつなげて）デオキシオリゴヌクレオチドの端に適宜結合すると、 それはオリゴヌクレオチドとそのターゲット配列との結合親和性を増加し、結果 をエキソヌクレアーゼから保護するものもあるが、エンドヌクレアーゼに対して ではない。サン等、ヌクレイツク・アノッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ １ｄｓ　Ｒｅｓ、　）、１５巻、６１４９−６１５８頁（１９８７年）：し・ト ーン等、ヌクレイツク・アンッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ ｅｓ、　）　、１５巻、７７４９−７７６０頁（１９８７年）参照。つなぐこと が出来る挿入剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ　ａｇｅｎｔｓ）の例として、オ キサゾロピリドカルバゾール、アクリノンオレンジ、プロフラビン、アクリフラ ビンおよびプロフラビンの誘導体、および３−アジド−６−（３−ブロモプロピ ルアミノ）アクリジン、３−アミノ−６−（３−ブロモペンチルアミン）アクリ ジンおよび３−メトキン−６−クロロ−９−（５−ヒドロキシペンチルアミノ） アクリジンなどのアクリジンがある。

ターゲットの核酸の相補配列に対して架橋する能力のあるオリゴヌクレオチドを 増加するからである。このことは、オリゴヌクレオチドに共有結合的に結合させ た架橋剤により達成することが出来、次に化学的に活性化して架橋を形成し、タ ーゲットの相補配列において鎖切断（ｃｈａｉｎ　ｂｒｅａｋ）を誘発し、それ により該配列に不可逆的な損傷を引き起こす請求電子性架橋部分の例として、ア ルファーハロカルボニル化合物、２−クロロスチルアミンおよびエポキシドがあ る。

本発明のヌクレオチド塩基部分の少なくとも１種から成るオリゴヌクレオチドが 、核酸アソセーにおけるプローブとして利用される場合は、標識を付けて、ハイ ブリッドポリヌクレオチドの存在を検出する。このような標識はリポータ−基と して挙動し、またターゲットのヌクレオチドとそれらの相補的なオ゛リゴヌクレ オチドプローブの間の二本鎖ホーメーションの検出手段として挙動する。

ここで使用されるようなリポータ−基は、測定または検出可能な物理的または化 学的特徴を持つ基である。検出能は、変色、発光、蛍光、または放射能などの特 徴により与えられることもあり、または配位子認識部位として働くリポータ−基 の能力により与えられることもある。

本発明の式Ｉの式中、Ｒ１は水素であるピラゾロピリミジンは、以下に概略した 方法およびコバヤノ、Ｃｈｅｍ、　Ｐｈａｒｍ、　Ｂｕｌｌ、２１巻、９４１− ９５１頁（１９７３年）により記載されたのと同じ方法により調製することが可 能であり、その開示は、本明細書に参考として組み込んでいる。

一般に、マロノニトリル（Ｉ　Ｉ　Ｉ）を塩基の存在下、アルキルライド（Ｉ　 Ｉ）で処理し、アノルマロノニトリル（ＩＶ）を得、これを引き続き、例えばジ メチルサルフェートまたはジアゾメタンでメチル化し、置換されたメトキシメチ レンマロノニトリル（Ｖ）を得る。この化合物を次にヒドラジンヒトレートと嶌 沸アルコール中で反応させ、３−置換−５−アミノピラゾール−４−カルボニト リル（Ｖｌ）を得、これを冷濃硫酸で処理し、３−置換−５−アミノピラゾロ− ４＝カルボキシアミド（Ｖｌｌ）を得る。

カルボキシアミド（Ｖｌｌ）は、代替法として、ノアノアセトアミド（Ｘｌｌ） を酸ハライド（Ｉ　Ｉ）で処理してアシルンアノアセトアミド（Ｘｌｌｌ）を得 ることにより調製されることもあり、これを次にメチル化し、生じたメトキシ化 合物（ＸＩＶ）をヒドラジンヒトレートで処理する。

よびＶｌｌから行われる。従って３，４−二置換ピラゾロ［３，４−ｄｌ　ピリ ミジン（ＶＩＩＩおよびＸ）は、対応するＶＩおよびＶｌｌを煮沸ホルムアミド で処理することにより得られる。代替法として、Ｖｌを室温または室温以上でカ ルボン酸のノアルコキノメチルエステル、次にアンモニアで処理してＶＩＩＩを 得ることもあり、またＶＩＩを室温または室温以上でカルボン酸のジアルコキシ メチルエステルで処理して（続いてアンモニアで処理しない）、化合物Ｘを得る こともある。３．４．６−三置換ピラゾロ［３，４−ｄｌ　ピリミジン（ＩＸお よびＸＩ）は、対応するＶＩおよびＶｌｌを尿素およびチオ尿素（Ｈ２Ｎ）２Ｃ ＝Ｒ６（式中、Ｒ６はＯまたはＳである）と融合することにより得られる。代替 として、ＶＩおよびＶＮをカリウムエチルキサンテートなどのアルキルキサンテ ート塩およびヨー化メチルなどのアルキルハライドで、室温以上の温度で処理し 、次にニークロロ過安息香酸（ＭＣＰＢＡ）などのベルオキシドにより酸化して 、続いてアンモニアで処理してＩＸおよびＸＩを得ることもあり、それぞれ、式 中Ｒ６はＮＨ２である。

式Ｉの化合物は、反応混合物から回収することが可能であり、その中では、それ らの化合物が確立した方法により形成されている。

式Ｉの、式中Ｒ１が糖部分である化合物において、糖は、更に処理する前のピラ ゾールＶ■またはＶＩＩの１位に付加するか、またはピラゾロ［３，４−ｄコビ リミジンＶＩＪＬＪＸ、ＸまたはＸＩの１位に付加するかのいずれかであり得る 。糖を付加するには、ピラゾールまたはピラゾロピリジンを水素化ナトリウム、 次に保護された糖のグリコリルノ＼ライドで処理する。

不発明のオリゴヌクレオチドは、式１の置換ピラゾロ［３，４−ｄｌ　ピリミジ ン由来のこれらヌクレオチドの少なくとも１つおよびほぼ全部、および／または 式１′の置換ヌクレオチド塩基由来のこれらヌクレオチドの少なくとも１つおよ びほぼ全部から成ることもある。

オリゴヌクレオチドを調製するには、保護基を式Ｉまたは式■′のヌクレオシド に導入し、ヌクレオシドを活性化してオリゴヌクレオチドの合成に用いる。保護 活性化した形への転化は、数種の論評に詳細に記載された２′−チオキシヌクレ オシドについての方法に従う。ソンベイクス（Ｓｏｎｖｅａｕｘ）　、バイオオ ーカニ・ツク・ケミストリー（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　 、１４巻、２７４−３２５頁（１９８６年）、ジョーンズ、“オリゴヌクレオチ ド合成、実用的方法“、Ｍ、Ｊ　ゲイト出版、ＩＲＬプレス、２３−３４頁（１ ９８４年）参照。

活性化ヌクレオチドを、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドに対する方法と類似の 方法でオリゴヌクレオチドに組み込み、その中で適切なヌクレオチドが連続して つながり、ターゲットのＤＮＡまたはＲＮＡのヌクレオチド配列に相補的である ヌクレオチド鎖を形成するであろう。ヌクレオチドは、酵素的にまたは化学合成 を経るいずれかで組み込むこともある。該ヌクレオチドは、それらの５°−〇− ７メトキシトリチルー３′〜（Ｎ、Ｎ−ンイソプロピル）ホスホルアミダイトシ アノエチルエーテル誘導体に転化し、上記の“オリゴヌクレオチド合成、実用的 方法”における方法に従い、合成オリゴヌクレオチドに組み込むことが可能であ る。次にＮ−保護基を、他のオリゴヌクレオチド保護基と一緒に、合成後のアミ ツリシスにより、当技術分野では一般に知られている方法で除去する。

好ましい態様においては、活性化ヌクレオチドを直接、ＤＮＡ自動合成機にかけ ることもあり、使用する特定の合成機の手順および指示に従うものである。オリ ゴヌクレオチドは標準的な工業規模のホスホアミダイトまたはＨ−ホスホネート 化学作用を用いて、合成機で調製することも可能である。

別の好ましい態様においては、アミノピラゾロピリミジンヌクレオチドトリホス フェートをランガー等、プロン−ディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オ ブ・サイエンシイズ・Ｕ　Ｓ　Ａ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　ＵＳＡ）、７８巻、６６３３−６６３７頁（１９８１年）により記載さ れたニック・トランスレーション法を用いてアデニンの代わりに用いることも可 能であり、この開示は本明細書に参考として組み込んでいる。

ハロアンル基などの離脱基をアミノアルキル尾部（−ＣＨ，）、−Ｙ）に付加し 、続いてオリゴヌクレオチドに組み込み、幾つかの保護基を除去することもある 。

例えば、α−ハロアセトアミドの付加は、修飾化合物のＨＰＬＣの移動度を変え てアミン基の正の電荷を除去し、続いて２−アミノエタンチオールと反応させて 、正の電荷を再付加することにより、本来のアミノアルキルオリゴヌクレオチド に類似の逆相ＨＰＬＣ移動度を有する誘導体を得ることで立証されることもある 。

特定の実施態様においては、以下の電子性離脱基それぞれをヒト・パピローマウ ィルス（ＨＰＶ）プローブ上のアミノプロピル基・ブロモアセチル、ヨードアセ チルおよび反応性は落ちるが配座的により順応性のある４−ブロモブチリルを結 合させた。ブロモアセチルおよびヨードアセチルは架橋時に等しい反応性をもつ ものであると分かった。

本発明に従うオリゴヌクレオチドプローブは、式Ｉの標識された置換ピラゾロ［ ３，４−ｄｌ　ピリミジンヌクレオチド部分の少なくとも１つぉよび／または式 ｒ゛の標識された置換ヌクレオチド塩基の少なくとも１つを含んで、いる。

プローブは当技術分野で典型的に用いられている数種の方法のいずれが１つによ り標識することが可能である。通常の検出方法は、３Ｈ１＋２５）、　３５ｓＳ １４（：または３２ｐ標識プローブなどを用いるオートラジオグラフィーの使用 である。他のリポータ−基は蛍光試薬、化学ルミネセンス試薬および酵素で標識 された抗体に結合する配位子を含んでいる。代替法として、プローブを直接、蛍 光試薬、化学ルミネセンス試薬、酵素および酵素基質などの標識とコンシュケー トすることが出来る。代わりに、同じ組成物を標識とコンジュゲートした配位子 と反応性の抗体などの配位子−抗配位子コンプレックスを通して間接的に結合さ せることもある。標識の選択は、必要とされる感受性、プローブとのコンジュゲ ートの容易さ、安定性要求性および入手できる器具類に依存している。

標識の選択により、標識をプローブ内に組み込む方法を決定する。放射性プロー ブは、典型的に商業的に入手可能で、所望の放射性アイソトープを含有するヌク レオチドを用いて作成される。放射性ヌクレオチドは、例えばＤＮＡ合成機の使 用、ニック・トランスレーション、放射性塩基を末端基トランスフェラー七とで プローブの３゛側につなく二と、放射性ｄＮＴＰ’ｓの存在下、ＤＮＡポリメラ ーゼのフレノウフラグメントによる特定の挿入物を有するＭ１３プラスミドの複 製、または放射性ｒＮＴＰ’ｓの存在下、ＲＮＡボリメラーセを用いて鋳型がら ＲＮＡを転写することによりプローブ内に組み込むことが出来る。

非放射性プローブは、直接的にノブナル（例えば、蛍光試薬、化学ルミネセンス 試薬または酵素）で標識することが出来、または間接的に配位子とのコンジュゲ ーンヨンにより標識することが出来る。例えば、配位子分子をプローブと適宜結 合させる。その後、この配位子は、本質的に検出可能な化合物であるか、または 酵素または光反応性化合物などの検８可能なノブナルと適宜結合するかのいずれ かである受容体分子とつなげる。配位子および抗配位子は広く変化に冨んでいる 。配位子が天然の″抗配位子（ａｎｔｉｌｉｇａｎｄ）”、即ちビオチン、チロ キノンおよびコルチゾールなどの配位子を有している場合は、その標識された天 然に生じる抗配位子と合同して使用することが出来る。代替として、ハプテンま たは抗原化合物のいくつかを適切に標識した抗体と組み合わせて用いることが出 来る。好ましい標識方法では、（ランガー等、プロン−ディング・オン・ナショ ナル・アカデミ−・オン・サイエンスイズ・ｔＪ　Ｓ　Ａ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）　、７８巻、６６３３−６６３７頁（１９８１ 年）に記載されているように）オリゴヌクレオチドのビオチン標識類似体を利用 し、これは本明細書に参考として組み込んである。

リポータ−基として対象となる酵素は、主としてヒドロラーゼ、特にホスファタ ーゼ、エステラーゼ、ウレアーゼおよびグリコンダーゼ、またはオキシドレダク タ′−ゼ、特にベルオキシダーゼである。蛍光化合物は、フルオレセインおよび その誘導体、ロダミンおよびその誘導体、ダンンル、ウンベリフェロン、希土酸 化物などである。化学ルミネセンスは、ルシフェリン、アクリジニウムエステル および２，３−ジヒドロフタルアンネジオン、例えばルミノールを含む。

特定のハイブリダイゼーション条件は、決定的なものではなく、研究者の好みお よび要望に従い、変わるであろう。様々なハイブリダイゼーション溶液が用いら れることもあり、極性有機溶媒を約２０％から約６０％容量、好ましくは約３０ ％容量含んでいる。普通のハイブリダイゼーション溶液は、約３０−６０％Ｖ／ Ｖホルムアミド、約０．５ないし１Ｍ塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ト リスＨＣＩ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳなどの約０．０５ないし０．ＩＭｌｆ ｉｌＩ液、ドブノル硫酸ナトリウムなどの約０．０５％ないし０５％洗剤、およ び１〜１０ｒｎＭの間のＥＤＴＡ、０．０１％ないし５％フィコール（約３００ −５００ｋｄａｌ）、０，１％ないし５％ポリビニルピロリドン（約２００−５ ００ｋｄａｌ）および０゜０１％ないし１０％ウソ血清アルブミンを用いる。ま た典型的なハイブリダイゼーション溶液に含まれるものは、例えば、部分的に断 片化した子牛胸腺またはサケ精子、ＤＮＡおよび／または部分的に断片化した酵 母ＲＮＡの約０．１から５１１１ｇ７ｍｌの非標識担体核酸、および所望により 約０．５％から２％ｗｔ、／ｖｏｌのグリツツである。別の付加物として、様々 な極性水溶性または膨張可能な試薬を含む容量除外剤など、アニオンポリアクＩ Ｊレートまたはポリメチルアクリレートなどが含まれることもあり、デキストラ ンサルフェートなどの糖類ポリマーて満たされていることもある。

特定のハイブリダイゼーション技術は、本発明の木質的な要素ではない。ハイブ リダイゼーション技術は、一般に“核酸ハイブリダイゼーシヨン、実用的方法” 、ヘイムスおよびピシンズ、出版、ＩＲＬプレス、１９８５年：ガールおよびバ ルデュ、プロノーディング・オン・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンス イズ・Ｕ　Ｓ　Ａ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ）　、 ６３巻、３７８−３８３頁（１９６９年）：およびジョン等、ネイチ＋　−（Ｎ ａｔｕｒｅ）　、２２３巻、５８２−５８７頁（１９６９年）に記載されている 。ハイブリダイゼーション技術について改良が為されているので、それらを容易 に適用することが出来る。

ハイブリダイゼーション溶液中にある標識プローブの量は広範に変化することが ある。一般には、ターケノト核酸の化学量論的量を越える実質的に過剰なプロー ブが使用されており、プローブとターゲットＤＮＡの結合速度を高めるためであ る。

ハイブリダイゼーシヨンの様々な度合いのストリン／エレン−（ｓｔｒｉｎｇｅ ｎｃｙ）を採用することが出来る。ハイブリダイゼーションの条件がより厳重に なる程、安定な二本鎖を形成するためのプローブとターゲット間の相補性の度合 はより強くなければならない。ストリンジエンノーの度合は、温度、イオン強度 、極性有機溶媒の封入などにより３１節され得る。例えば、用いられる温度は、 正常は約２０℃ないし８００Ｃの範囲てあり、通常は２５℃ないし７５℃であろ う。５０％ホルムアミド中１５−５０ヌクレオチドのプローブにとって、最適温 度範囲は、２２−６５℃の間で変化し得る。慣例の実験を行うことにより、室温 で満足にハイブリダイゼーションさせるある１つの条件を定めることが出来る。

ハイブリダイゼーシヨンのストリンジエンノーも、ホルムアミドの濃度を約２０ ％ないし約５０％の範囲で操作して反応物溶液のイオン強度および極性を変える ことにより適宜変えられる。

商業的に入手可能な超音波浴中に反応容器を浸けて超音波処理すると、ハイブリ ダイゼーション速度が加速することが度々ある。

用いる特定のハイブリダイゼーション溶液に適切な時間および室温でハイブリダ イゼーションした後、プローブ−ターゲットハイブリッドが付着しているガラス 、プラスチック、またはフィルター支持体を一般的にハイブリダイゼーション溶 液と同様の試薬（例えば、塩化ナトリウム、緩衝液、有機溶媒および洗剤）を含 んでいる洗浄溶液に入れる。これらの試薬はハイブリダイゼーション媒質と同様 の濃度であるが、より１１ＦＷな洗浄条件が望まれる場合は、それより低い濃度 であることがしばしばある。支持体を洗浄溶液に浸けておく時間は、数分から数 時間またはそれ以上で変わることもある。

ハイブリダイゼーシヨンまたは洗浄媒質のいずれかは厳ｆｉｔ　（ｓｔｒｉｎｇ ｅｎｔ）であっても良い。適度に厳重に洗浄した後に、正確なハイブリダイゼー ション複合体が標識の性質と一致してすぐに検出されることもある。

プローブが直接標識とコンツユゲートすることもある。例えば、標識が放射性で ある場合、結合したハイブリダイゼーション複合体基質を有する支持体表面はＸ 線フィルムで露光する。標識が蛍光である場合は、試料は、まずそれを特定の波 長の光にさらすことにより検出される。試料はこの光を吸収し、その後、検出器 でとらえられる異なる波長の光を発する（“物理生物化学”、フレイフェルダー 、Ｄ０、Ｗ、Ｈフリーマン＆ＣＯ０，１９８２年、５３７−５４２頁）。標識が 酵素である場合、その酵素に対する適切な基質と共にインキュベーションするこ とにより試料を検出する。生じたノブナルは、着色沈殿、着色または蛍光溶解物 、または生物ルミネセンスまたは化学ルミネセンスにより生じる光子であり得る 。

計深棒アッセーに好ましい標識は、着色沈殿を生じるものであり、正の読み値を 指す。例えば、アルカリホスファターゼは、インドキンルホスフエートを脱リン 酸化し、その後、還元反応に参入して、テトラゾリウム塩を非常に着色された不 溶性のホルマザンに転化する。

ハイブリダイゼーション複合体の検出には、シグナル発生複合体がターゲットの 二本鎖とプローブポリヌクレオチドまたは核酸に結合していることが要求される こともある。典型的には、このような結合は、配位子−コンンユゲートプローブ およびシグナルとコンシュケートした抗配位子の中間として配位子と抗配位子の 相互作用により起こる。シグナル発生複合体の結合もまた、超音波エネルギーに さらすと容易に加速しやすい。

標識は、ハイブリダイゼーション複合体の間接的な検出を可能にすることもある 。例えば、標識がハブテンまたは抗原である場合、抗体を用いることにより試料 を検出することが出来る。これらの系において、ラジカルは蛍光または酵素分子 を抗体により結合することにより、ある場合においては、放射性標識に結合させ ることにより発生する（チセン（Ｔｉｊｓｓｅｎ）　、　Ｐ、、′生化学および 分子生物学における酵素免疫アッセーの実施および理論、実験室的技術”、ブル ドン、Ｒ，Ｈ，、ヴアン・ニラペンバーブ、Ｐ、Ｈ，、出版、エルスヴイア、１ ９８５Ｌ　９−２０頁）。

ハイブリダイゼーション溶液に存在する標識プローブ量は、広範に変化すること もあり、標識の性質、細胞のターゲット核酸に適度に結合出来る標識プローブの 量、およびハイブリダイゼーション媒質および／または洗浄媒質の正確な厳重さ に依存している。一般に、ターゲットの化学量論的量を越える実質的に過剰なプ ローブがプローブとターゲット核酸の結合速度を高める目的で用いられる。

本発明は、ターゲット核酸配列を同定する方法を指向するものでもあり、その方 法は、式■および／または式Ｉ゛の標識かつ置換されたヌクレオチド部分の少な くとも１つを含むオリゴヌクレオチドプローブを利用することから成る。

−態様において、その方法は以下の工程から成る：（ａ、　）核酸を試料中で変 性し、試験する（ｂ）ターゲット核酸を式Ｉまたは式Ｉ′の標識された置換ヌク レオチド部分の少なくとも１つを含むオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダ イゼーションし、その中のプローブはターゲット核酸の配列と相補的な配列から 成る（Ｃ）試料を洗浄し、未結合のプローブを除去する（ｄ）試料を検出試薬と 共にインキュベートする（ｅ）試料を検査する。

上記方法を当技術分野でよく知られている手順に従い実行することもある。

式Ｉおよび／または式■′の標識された置換ヌクレオチド部分の少なくとも１つ を含むオリゴヌクレオチドプローブを利用し、かつ上記方法から成る、ターゲッ トの核酸配列を同定するアッセーは、本発明を実行することに企図されるもので ある。このようなアッセーには、キットになっているものもある。例えば、代表 的なキットは、式Ｉまたは式Ｉ′のｍ識された置換ヌクレオチド部分の少な（之 も１つを含むオリゴヌクレオチド、即ちターゲットの核酸配列に相補的な配列を 持つオリゴヌクレオチド；二本鎖核酸を一本鎖核酸に変える変性試薬：および） １イブリダイゼ−／コン反応混合物から成るプローブ試薬構成物を含有している だろう。該キットは、例えば酵素などのシグナル発生系およびその系のための基 質を含むものもあり得る。

Ｃ０酵素媒介三本鎖形成 性薬剤として大きな可能性を持つ。例えば、化学的に合成された○ＤＮｓは、相 補的なメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）とのハイブリダイゼーションで二本 鎖を形成することにより特定の遺伝子産物の発現を阻害することもある。より具 体的には、これらの“アンチセンス”○ＤＮｓは主としてＲＮＮアーゼ−媒介さ れるターゲットｍＲＮＡ配列の切断によりメツセージ（伝達暗号）のプロセシン グまたは翻訳を阻害すると信じられている。これらの阻害効果のため、アンチセ ンス０ＤＮｓは、抗ウィルス剤、抗寄生物剤、および抗ガン剤として有用である こともある。更に、アンチセンス○ＤＮｓは合理的な薬剤開発に唯−無二の機会 を与えるものであり、それは遺伝子ターゲットが、可能性のあるターゲット配列 に関して素晴らしい特異性と万能性の両方を提示するためである。

しかしながら、“アンチセンス”技術には、ある基本的な不利点がつきまとう。

土な難題の１つは、アンチセンス０ＤＮｓの開発には、イン・ビトロでの試験を 許可するに十分な効能が必要であるということである。ヌクレアーゼ抵抗性、細 胞内への迅速な取込み、およびターゲットＲＮＡ配列に対する効率的で安定な／ Ｘイブリダイゼー／ヨンを示すアンチセンスＯＤＮ処方が望まれている。これら 特性の１つまたはそれ以上を他の特性に有害効果を与えることなく改良するのは 、困難である場合がある。例えば、オリゴヌクレオチドメチルホスホネートおよ びホスホロチオネートなどのバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅｓ）を修飾したア ンチセンス０ＤＮｓは、非修飾０ＤＮｓに比例して卓越したヌクレアーゼ抵抗性 を示すが、メチルホスホネート０ＤＮｓはＲＮＮアーゼ一対して屈折性であるＤ ＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成し、ホスホロチオネート０ＤＮｓは細胞内に不 十分にしか取り込まれない。

アンチセンス○ＤＮｓの有効性を改良する別の方法は、○ＤＮｓにある部分を結 合させて、それらのアンチセンス活性を強化するものである。例えば、！−イブ リダイゼーンヨン時に直接ＲＮＡターゲットと相互作用する部分（ＯＤＮ−ター ゲットハイブリッドを安定化するペンダント挿入基（ｐｅｎｄａｎｔ　ｉｎｔｅ ｒｃａｌａｔｉｎｇ　ｇｒＯυｐｓ）　、遊離ラジカルに基づ＜ＲＮＡ切断活性 をもつ０ＤＮｓ、またはハイブリダイゼーンヨン時にそれらのターゲットと共有 結合的に結合する能力のある０ＤＮｓなど）がこの点においては役立つ場合があ る。ＯＤＮによるｍＲＮＡターゲットの直接切断または架橋により、ＲＮＡは不 活性になる。

アンチセンス０ＤＮｓの細胞内取り込みは、また別の墾念領域である。荷電した ０ＤＮｓがエネルギー依存経路を通り活発に哺乳類細胞に取り込まれる可能性が ある間に、この経路を拡大し、アンチセンスＯＤＮの細胞内濃度を高くするのが 望ましい。°エンドサイトーシスの近接（Ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ　ａｐｐｒｏａｃ ｈｅｓ）　”は、受容体を介した細胞のターゲント化を高めるものであり、アン チセンス○ＤＮに対し脂肪親和性アンカーとして挙動するコレステリル基をコン ジュゲーノヨンし：０ＤＮｓをリポゾーム内に入れ；および０ＤＮｓを可溶性の 高分子複合体１こ結合するものである。

上記方法を単独で、または組み合わせて適用すると、アンチセンスＯＤＮの能力 を１０００倍まで増強し、かつ重大なことにＯＤＮ合成の費用を減少すること合 理的な薬剤デザインに対する“アンチセンス゛アプローチの別のものを“抗遺伝 子（ａｎｔｉ−ｇｅｎｅ）”と名付ける。アンチセンス０ＤＮｓは一本鎖ｍＲＮ Ａをターゲットとするのに対し、抗遺伝子０ＤＮｓは、二本鎖ＤＮＡとノ＼イブ １ノダイズして、その機能を阻害する能力を持つ。より明確には、抗遺伝子０Ｄ Ｎｓｌｔ、二本鎖ＤＮＡターゲットと共に配列特異性二本鎖複合体を形成し、そ うして選択したターゲット遺伝子の複製または転写を妨害する。ある種のＲＮＡ ウィルスおよび核酸を持たないウィロイドを除いて、ＤＮＡは、全ての遺伝情報 の宝庫であり、調節制御配列および休止状態のプロウィルスＤＮＡゲノムなどの 非発現遺伝子を含んでいる。反対に、アンチセンス０ＤＮｓのタープ・ントであ るｍＲＮＡ１ｔ、ＤＮＡにコード（暗号化）されている情報の非常に小さいサブ セットを表現するものである。従って、抗遺伝子０ＤＮｓは、より広い適応性を もっており、また、能力的にも単にｍＲＮＡのプロセシングや翻訳を阻害するア ンチセンス○ＤＮｓよりも強力である。

抗遺伝子０ＤＮｓは生きている細胞の核内で、染色体ＤＮＡと配列特異性複合体 を形成することが出来る。生じた二本鎖は、タープ・ットの二本鎖ＤＮＡのｉｌ ＋限および／または転写を阻害することが出来る。２種のターゲット核酸（即ち 、ＤＮＡとＲＮＡ）について知られている安定性に基づき、ＤＮＡの機能を妨害 する抗遺伝子は、対応するｍＲＮＡ機能のアンチセンス阻害より長い持続効果を 持っている。哺乳類細胞ＤＮＡはターンオー／＜　−（ｔｕｒｎｏｖｅｒ）　Ｌ 、ｒなＬｌ；事実、細胞（ま、環境障害または自発発生的転位から発生し得るＤ ＮＡの損傷を修復する能力のある非常に複雑な経路を持っている。反対に、ｍＲ ＮＡは一過性であり、細胞内に数分しか存在しない場合もある。ｍＲＮＡ種の一 定のターンオーツく−および該ｍＲ，Ｎ　Ａ種の潜在的に高い複写数は、アンチ センス○ＤＮｓが比較的短期間の効果を与えるであろうことを示唆している。抗 遺伝子○ＤＮｓの細胞内取り込みを増加して充分な細胞内濃度に到達させる必要 がある場合もあるが、一方、一度細胞内に取り込まれると○ＤＮｓは自然に核内 で濃縮される。

抗遺伝子治療は、あるＤＮＡホモポリマーは二重鎖複合体を形成することが出来 るという観察に基づくものである。これらの二重鎖複合体において、第三の鎖は ワトソン・クリック型塩基対合二重らせん構造のメジャーグローブに存在し、そ こで観照の二本の一つと水素結合する。結合コードは、三番目の塩基（以下に与 えた三つ組（ｔｒｉｐｌｅｔ）塩基参照）による塩基対の認識を支配している。

各場合において、第三鎖の塩基が最初にあり、次に塩基対が続き：最初の２塩基 の間の水素結合が三番目の塩基の相互作用を維持している。

この塩基対認識コードにはある種の制限があることは、与えた三つ組塩基から明 らかである。第一に、塩基対Ｔ−ＡおよびＣ−Ｇを認識する能力がない、従って 、二重鎖形成は、二本鎖上の一方のホモプリン塩基と他方のホモピリミジン塩基 の種類（ｒｕｎｓ）によって制限される。第二に、ノドノンが第三の鏡上にある （“Ｃ”）ならば、プロトン付加し、塩基対Ｇ−Ｃのグアニンと水素結合出来る ようにしなければならない。シトシンのプロトン付加のｐＫａは４６であり、生 理学的ＤＨでは、Ｃ−Ｇ−Ｃ三つ組（ｔｒｉａｄｓ）の安定性は恐らく損なわれ るであろうことを示唆している。５−メチルシトシンとの置換または多価カチオ ン（スペルミンまたはスペルミジンなど）の使用は、ｐＨ７，０で三つ組Ｃ−Ｇ −Ｃを安定化することもある。第三に、全ての場合において、三つ紐は、第三鎖 の塩基と塩基対のプリン残基の間の２つの水素結合により維持されている。故に 、二重鎖複合体は、一般に元の二本鎖ＤＮＡより安定ではなく、プリンとピリミ ジン対間の２つ（Ａ−Ｔ）または３つ（Ｇ−Ｃ）の水素結合の組合せにより維持 されている。

ントノン／チミンンー、グアニン／アデニン−およびグアニン／チミジン−含有 ０ＤＮｓは、配列特異的に二本鎖ＤＮＡにおけるホモプリンの連続（ｒｕｎｓ） と結合することが出来る。これらの認識モティーフ（ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　 ｍｏｔｉｆ）は、フーグスチーン型塩基対または逆フーグスチーン型塩基対に基 づいている。Ｃ／Ｔ認識モティーフにおいて、ＯＤＮは二本のホモプリン鎖に対 して平行であり：Ｇ／Ａ認識モティーフにおいては、ＯＤＮは二本のホモプリン 鎖に対して逆平行であり、第三鎖のＧ含量に依存している。これらの認識モテイ ーフは、配列依存性であることもある。Ｃ／Ｔ認識モチーフを用いる、抗遺伝子 ０ＤＮｓの配列特異性により、プラスミドＤＮＡおよび酵母染色体におけるホモ プリン形態（ｒｕｎｓ）に対する該０ＤＮｓのハイブリダイゼーンコンが可能に なる。ＯＤＮの結合はホモプリン種（ｒｕｎｓ）に制限されるため、残っている ２種の塩基対、即ち、Ｃ−ＧおよびＴ−Ａを認識出来る付加的な複素環を同定す るのは有利である。グアノシンを第三鎖で用いて塩基対Ｔ−Ａを認識することも あるが、一方、この相互作用は、１つの水素結合しか含まず、また相対的に不安 定である。

アンチセンス０ＤＮｓの類似体、抗遺伝子０ＤＮｓをこれらの活性を増加するよ うデザインされた様々なペンダント基（ｐｅｎｄａｎｔ　ｇｒｏｕｐｓ）で修飾 することも可能である。故に、挿入する基、切断試薬および架橋する部分を抗遺 伝子ＯＤＮの末端に追加することもある。二重鎖形成時に、これらの基は、近接 する二本鎖と相互作用し、それぞれ挿入、切断、架橋する。更に、Ｃ／Ｔ認識モ テイーフにおいては、第三鎖ＯＤＮにおけるシトシンを５−メチルシトシンで置 換すると、２Ｇ”の豊富なホモプリン形勢（ｒｕｎｓ）で形成される二重鎖を非 常に安定化する。

他にも、中軸（ｂａｃｋｂｏｎｅｓ）を修飾した○ＤＮｓのオリゴヌクレオチド メチルホスホネートおよびホスホロチオエートなどは、二重鎖複合体を形成する こともある。

酵素が媒介する二重鎖形成 上で議論した二重鎖形成において重要となる不利点は二重鎖形成速度が相対的に 緩慢であることである。本発明は、二重鎖形成の酵素触媒作用により、特に本目 的に好ましい酵素を組み合わせて、この不利点を克服するものである。より意味 深いことに、酵素触媒化二重鎖形成は、全体的な配列認識について（非酵素媒介 二本鎖形成に伴うＡ−ＴおよびＧ−Ｃ認識制限とは対照的に）計り知れない利点 を与えるものである。

要約すると、全ての生きている生物体の遺伝物質は、時折、相同的転位（ｈｏｍ 。

１Ｇｇｏｕｓ　ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を受け易い。類似の（または相同 的な）ＤＮＡ分子間でおこる組換えは、種内の遺伝的多様性を促進する重要な役 割を演じており、原核細胞および真核細胞のいずれもに共通の酵素により触媒さ れる。組換えは、ＤＮＡ修復および免疫応答における重要な役割も演じている。

Ｅ、　ｃｏｌｉにおける相同的組換えは、原核細胞および真核細胞のいずれもに おいて起こるプロセスの実例として役立つものである。規定された無細胞系にお けるＥｃｏｌｉ由来の精製組換え酵素の研究では、相同的組換えを３段階に分け ている。この実例の目的のためには、“侵入して来る”一本鎖は環状であり、タ ーゲツトの二本鎖は線状である。

第一段階、“ンナプンス（対合）前”では、一本鎖環状ＤＮＡは、ＡＴＰの存在 下、多機能性タンパク質ｒｅｃＡて被覆されている。その結果生じる核タンパク 質繊維は、１回転当たり１８塩基対および３．６ヌクレオチド当たりｒｅｃ、Ａ タンパク質１モノマーからなる右巻きらせん状にねじれた構造を持つ。

第二段階、“ノナプンス”では、一本鎖環状核タンパク質繊維は、線状二本鎖Ｄ ＮＡ鋳型に沿って相同的な配列の二次元的調査を行う。その調査は、らせんに絡 まった網状構造を持たない最初の複合体（その複合体は“互いに巻き込まない２ つの鎖の接合（ｐａｒａｎｅｍｉｃ　ｊｏｉｎｔ）”として引用されている）に おける、２つの分子の相同的配列で終結する。互いに巻き込まない２つの鎖の接 合は、非常に不安定であり、膜タンパク質化時に容易に分離する。ＤＮＡ二重ら せんは非常に迅速に繊維内に組み込まれ、同時に、２つのＤＮＡ分子は、互いに らせん状に巻き込んでコイル状になる（即ち、らせんに絡み合う）。この二重鎖 型では、新しく組み込まれた策三鎖が親の二本鎖の一つと（配列および極性にお いて）相同的であり、他の親の二本鎖と相補である。生じたノナプンス複合体に おいて、ＤＮＡの３つの鎖は実際に水素結合した二重鎖として存在し、ｒｅｃＡ と親密な関係を持つと信じられている。互いに巻き込まない２つの鎖の接合とは 対照的に、互いにらせん状に巻き込んでコイル状になった複合体は脱タンパク質 化（ｒｅｃＡの除去）時に安定である。

互いにらせん状に巻き込んでコイル状になったンナプンス複合体は、右巻きらせ ん１回転当たり１８の三つ組を含有する。ｒｅｃ　Ａは複合体の重大な部分であ り、配列特異性は、専ら塩基対間の水素結合部分にある。互いにらせん状に巻き 込んでコイル状になったノナブノス複合体には、代わりとなる２つのコンホーメ ーシコンが存在する。１つは、親ＤＮＡの負の線状鎖が正の線状鎖とワトソン・ クリック型塩基対をなすものであり；もう一方は、親ＤＮＡの負の線状鎖が正の 環状一本鎖とワトソン・クリック型塩基対をなすものである。いずれのコンホー メーシコンにおいても、第三鎖の塩基は、（上記の結合する部位のコードに従い ）他の２つの鎖のプリンに対してフーグスチーン型または逆フーグスチーン型に 水素結合すると仮定される。三本鎖核タンパク質繊維内の一本鎖の環状ＤＮＡは 、引き続き相同の線状鎖と置き換わる（“鎖交換″）。この置き換えは、ｒｅｃ Ａで触媒される、線状の正の鎖のエネルギー依存性放出を特徴とし、環状一本鎖 と相補線状鎖のハイブリダイゼーンコンで結合する。ンナブシスおよび鎖交換の いずれもの間、ｒｅｃ　Ａは複合体と関連した状態である。最終的に、ｒｅｃＡ は新しく形成された二重鎖から分離し、組換えが完成する。

ノナブシス複合体の膜タンパク質化時に、無タンパク質二本鎖ＤＮＡ複合体は、 本質的に一本鎖特異的ヌクレアーゼに抵抗性であり、非常に高いＴ、、を示す。

このことは、いわゆる“第三鎖”と観照の両方が水素結合することと同じ（、複 合体の非常にらせんになり易い状態に帰すると思われる。それ故に、非常にらせ んになり易い、脱タンパク質化したシナブンス複合体は、非常にらせんになり易 いｒｅｃ　Ａ含有複合体の類似体である。従って、ｒｅｃ　Ａは、他のものでは 達成できない、ＤＮＡ二重鎖複合体形成を触媒することもある。この複合体にお いて、２つの正の鎖は同一の配列および極性を持ち、正の鎖のいずれかは、負の 観照と二本鎖ハイブリッドを形成する能力を有する。

最近の証拠により、ｒｅｃＡが、鎖を交換させるなど、二重鎖のコンホーメーシ ョンを変えることが示唆されている。即ち、二本鎖の塩基は、二本鎖がプリン塩 基を含むことにかかわらず、適切なプリン塩基と水素結合出来るということであ る。

数種の因子が、ンナブンス複合体の安定性に影響を及ぼしており、（１）侵入す る一本鎖の長さ、（２）侵入する一本鎖とターゲット二本鎖の間で共有された相 同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）の程度（相同性の長さおよび特に重要な不適当な組合 せが無いこと）：　（３）ターゲット二本鎖の末端に関して、共有された相同性 領域の位置、および（４）あるとしても二本鎖のスーパーへり・ンクス性（ｓｕ ｐｅｒｈｅｌｉｃｉｔｙ）である。

抗遺伝子との安定な二本鎖形成のために最適な系を選択および設計する場合、以 下の因子が重要である場合がある： 長さ、オリゴマー５０−ｍａｒは、ｒｅｃＡと安定なプレシナブンス複合体を形 成させるに充分な長さを持つべきである。

共有された相同性：　ｒｅｃＡ−安定化シナプンス繊維の形成には、最低１３塩 基の共有された相同性部位が必要であると思われる。ＯＤＮを一付加したＭＴフ ラン側によるｒｅｃＡ−安定化二本鎖の光固定は、最小レベルまたは好ましいレ ベルの共有された相同性に、更に制限を加えることもある。光固定して、二本鎖 コンプレックス内のコンホーメーシコンが変化すると、侵入する第三鎖が、相同 二本鎖の位置に入れ変わることが可能になる。結果として第三鎖の塩基は、相補 鎖とワトソン・クリック型塩基対合することになる。従って、好ましい実施態様 では、ＯＤＮとターゲットは５０塩基の相同部位を共有している。

接合の型：共有された相同性領域と（あるとしても）ターゲット二本鎖ＤＮＡの 末端の位置的関係に依存して、生じるンナブシス複合体は、近接接合、中間接合 、または遠位接合として分類される。近接接合は、ｒｅｃＡ−安定化二本鎖複合 体が線状二本鎖の左手に位置するものであり、ｒｅｃＡが触媒する鎖交換のため に、不安定である。鎖交換の間、二本鎖複合体において、侵入して来る第三鎖に 相同である二本鎖は置き換えられ、結果として、浸入して来る鎖および遊離の一 本鎖を含有する新しい二本鎖となる。鎖交換は遊離の５゛末端を必要とし、５゛ から３′極性へと進行するため、このプロセスは、近接接合において容易に起こ る。

反対に、遠位接合および中間接合は適切な末端を欠いており、容易にｒｅｃＡが 触媒する鎖交換をうけない。結果として、これらの接合は、非常に安定な構造で ある。加えて、本発明の中では、中間または遠位接合を形成するためには、ｒｅ ｃ　Ａ安定化二本鎖複合体の形成が好ましい。

スーパーへりックス性（ＳｕｐｅｒｈｅＪ、ｊｃｉｔｙ）　ニス−パーへりック スのターゲットは、ｒｅｃＡ安定化三本鎖二末鎖の形成を助長することがある。

しかしながら、高効率二本鎖形成は（ＤＮＡターゲットおよび非常に小さい共有 相同性領域を有するＯＤＮを用いる場合でさえ）、線状ターゲットを用いて得ら れることもある。

モデル系におけるスーパーコイル状ターゲットに対する、合成、オリゴマー二末 鎖ターゲッ１−ＤＮＡの選択は、ターゲットの二本鎖ＤＮＡの特徴に伴い、変化 すると思われる。

本発明は、ｒｅｃＡが触媒する安定な二本鎖複合体形成と合成杭遺伝子ＯＤＮ　 ｓを組み合わせたものである。酵素触媒二本鎖形成は、迅速な速度論と全般的な りＮＡ配列認識を示している。ｒｅｃＡで被覆された抗遺伝子ＯＤＮは、ターゲ ットの二本鎖ＤＮＡ配列における相同性を探す“案内役（ｇｕｉｄｅ）”として 働き、この核タンパク質繊維の認識および結合時に、ｒｅｃＡは配列特異性二本 鎖複合体の形成を触媒する。本発明の中では、抗遺伝子ＯＤＮは長さにして少な くとも３０−４０ヌクレオチドであり、ターゲットＤＮＡの二本鎖の２つのいず れかと同一の塩基配列および極性を持っている。二本鎖形成の頻度および膜タン パク質化に追随する二本鎖複合体の安定性は、直接、抗遺伝子○ＤＮの長さと関 連することもある。（適切な極性の）抗遺伝子０ＤＮｓを、内性の組換え経路と 組み合わせて使用し、染色体ＤＮＡと配列特異性二本鎖複合体を形成させること もある。代替法として、様々な長さの抗遺伝子０ＤＮｓをターゲットの二本鎖Ｄ ＮＡと結合させる前に、組換え酵素とコンプレックスさせることもある。

細胞の組換え機構を用いて、水素結合させた二本鎖複合体の形成を触媒すること は、現状の抗遺伝子研究に付随する数種の不利益を克服するものである。第一に 、酵素で媒介される認識モティーフは、４塩基対全てを認識し、それにより、幾 つかの二本鎖ＤＮＡ配列をターゲットとすることを可能にする。第二に、ｒｅｃ Ａ被覆−末鎖抗遺伝子ＯＤＮ　（核タンパク質繊維）は、被覆されていない小さ い抗遺伝子○ＤＮよりも非常に効率良（ターゲットの二本鎖ＤＮＡと相同の部位 を探し、そうして、効率的な二本鎖複合体形成に必要な抗遺伝子ＯＤＮの濃度を 低減する。第三に、水素結合の型と酵素媒介認識に関連した新しいらせん状のね じれのため、生じた二本鎖コンプレックスは生理学的ｐＨで安定である。第四に 、細胞の組換え経路が活用されていることから、より高次のクロマチン構造にお けるＤＮＡは、ターゲットとして利用し易い。更に、第五に、生じた二本鎖複合 体は、抗遺伝子○ＤＮの長さの増大に伴い、安定性の増加を発揮する。

効果的な相同性調査を行う能力は、重大な有利要件である。予備的データでは０ ＤＮｓは二本鎖ＤＮＡの相補的なホモプリン配列を調査する効率が非常に悪いこ とかを示されている。例えば、イン・ビトロにおける非酵素触媒二末鎖形成は、 ３７℃で６０分後に分析されているＣＦ、Ｍオーソン等、ヌクレイツク・アシッ ズ・リサーチ（？１ｕｃ１．Ａｃ１ｄｓ　）７ｅｓ、　）　、１９巻、３４３５ −４１頁、１９９１年）。

反対に、２つの相補−末鎖の間の古典的なハイブリダイゼーションでさえ、数時 間もかからずむしろ数秒で起こるのである。ヒトのゲノムは３Ｘ１０”塩基対以 上を含有しいるため、特に、抗遺伝子０ＤＮｓを相対的に低い濃度で用いるなら ば、相同性調査には法外に長い時間がかかることになる。二本鎖ＤＮＡに対して 弱い非特異的親和性を発揮する、−末鎖ＤＮＡとｒｅｃ　Ａの間で形成されたよ うなプレンナブンス核タンパク質繊維を使用すると、相同性調査を３次元から２ 次元の工程に効果的に低減する。更に、二本鎖と相同的記録（ｈｏｍｏｌ、ｏｇ ｏｕｓ　ｒｅｇｉｓｔｒｙ）時に、核タンパク質繊維は、対応する二本鎖と裸の 一本鎖との相互作用より多くの二本鎖複合体を産生ずるようである。これらの因 子のために、ｒｅｃＡ被覆−末鎖ＯＤＮおよび相同的二本鎖間の二本鎖形成は、 標準的なハイブリダイゼーション条件下で、相補的−末鎖の自然復元速度の計算 値を１次または２次の大きさで上回る反応速度で起こるのである。

本発明は、（１）ターゲットＤＮＡ二本鎖の一方の一部と相同的であり、他方の 類似部分と相補であるＯＤＮ、および（２）ターゲットＤＮＡ配列の不活性化を 達成する酵素触媒二本鎖形成を組み合わせたものである。好ましい実施態様にお いては、ＯＤＮはそれと共有結合的につなぎ合わされる架橋部分を持つ。ターゲ ットＤＮＡ配列に対するハイブリダイゼーション時に、第三ＨＯＤＮ　（抗遺伝 子０ＤＮ）の親二末鎖の両方に対する架橋はターゲラ１４）ＮＡ配列を不活性化 する。ＯＤＮ、架橋する部分、ターゲットＤＮＡ配列およびターゲットＤＮＡ配 列の環境および特徴に依存して、親の二本鎖の不活性化は、永久的であることも ある。故に、１またはそれ以上の抗遺伝子０ＤＮｓの単一投与は、完全なレトロ ウィルスケツム、エビソームのへルベスウイルスゲノムまたは突然変異腫瘍形成 遺伝子の発現を阻止する可能性もある。

二本鎖形成および共有結合架橋に従って、修飾されたターゲットＤＮＡはもはや 複製または転写を支持するものではない。ＤＮＡにおける他の全ての損傷とは異 なるものであるが、しかしながら、この修飾は修復可能なものではない。通常、 架橋したＤＮＡは、除去修復および相同組換えの組み合わせにより修復される。

しかしながら、架橋した二本鎖複合体では、組換えに参入するターゲット遺伝子 の複製物で損傷を受けていないものは無いであろう。原核細胞モデルとの類比に より、架橋を除去するミスリペア（または５ＯＳ）経路を用いることを試みるこ ともあるが、真核細胞はその犠牲として突然変異を誘発する。このような場合、 遺伝子機能は、生じた突然変異により不可逆的に沈黙されらせるだろう。

組換え酵素を抗遺伝子○ＤＮｓと組み合わせて使用すると、意味深いことに、一 本ＭＯＤＮがその相補ターゲットＤＮＡ配列を“見つける′効率が高まる。従っ て、（例えば、核タンパク質複合体において）抗遺伝子ＯＤＮが組換え酵素と結 合する場合、二本鎖形成の効率が非常に増加する。

本発明の中で、適切なターゲットＤＮＡ配列は、構造遺伝子および上流と下流両 方の調節制御配列を含む。これらの調節配列は、転写または複製のいずれかに関 連していることもある。抗遺伝子ＯＤＮは、機能の変化を目的として選ばれるタ ーゲラ１−ＤＮＡ配列によって決定および設計され、選ばれたターゲラｌ−Ｄ　 Ｎ　Ａの２つの鎖のうち１つに相補的な配列を持つであろう。

本発明の中で使用するにふされしい架橋剤は、ソラレンなどの光化学試薬および 化学架橋剤である。好ましい化学架橋剤は、上記セクションＡで記載したもの、 ○ＤＮの３゛および／または５°末端に結合させた電子性部分：および○ＤＮに 結合させたマスクした電子性部分を含む。光架橋剤は、局所または体外への適用 、露光の影響を受けやすいターゲット、同じくイン・ビトロでの使用に有用であ ることもある。化学架橋物は、制限無く用いられることもあり、請求した本発明 の範囲での使用には特に好ましい。

好ましい組換え酵素は、ｒｅｃＡ、ヒト・リコンビナーゼおよびンヨウジョウバ エ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）　・リコンビナーゼなどの原核性および真核性組換 え酵素を含み、ヒト・リコンビナーセが特に好ましい。

特に好ましい実施態様では、抗遺伝子ＯＤＮを細胞または宿主に投与し、抗遺伝 子○ＤＮがターゲットの細胞核に入ると、核内にある組換え酵素と結合する。

代わりの実施態様においては、抗遺伝子ＯＤＮと組換え酵素をエクス・ビポ（竺 ｖｉｖｏ）で結合させ、その後、細胞または宿主に核タンパク質繊維として投与 する。

この実施態様では、リポソームにおいて核タンパク質繊維を投与するほうが有利 であることもある。

以下の実施例は、本発明を制限することなく説明するものである。“ＲＴ”は室 温を意味する。

婢 薄層クロマトグラフィーをシリカゲル６０Ｆ２５４プレート（アナルテ・ツク） で以下の溶媒を用いて行った：Ａ−９０％塩化メチレン、１０％メタノール：Ｂ −５０％酢酸エチル　５０％ヘキサン；Ｃ−７０％酢酸エチル　１０％メタノー ル：１０％水：１０％アセトン＋Ｄ−５０％エーテル、５０％ヘキサン。フラ・ ノ／ユクロマトグラフイーを６０Ｆ２５４シリカ（メルク）を用いて行った。オ リゴヌクレオチドはアプライド・バイオシステムズ・モデル・３８０Ｂ合成機で 合成した。オリゴヌクレオチドはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＢＲＬ）およ びγ−”Ｐ−ＡＴＰ　にニュー・イングランド・ニュークリア）を用いて同位元 素的に標識した。

実施例１ ６−（トリチルアミノ）カプロン酸 ６−アミノカプロン酸（２６ｇ、０．２モル）をトリエチルアミン（１００ｍｌ ）を加えてジクロロメタン（２００Ｉｌｌ）に溶解した。塩化トリチル（１２０ ｇ、０゜４５モル）を加え、溶液を３６時間撹拌した。生じた溶液をｌＮＨＣｌ で抽出し、有機層を蒸発させて乾燥した。残留物を２−プロパツール／　Ｉ　Ｎ ＮａＯＨ（３００＠ｔ／　１００　ｍｌ）に懸濁し、３時間還流した。溶液を蒸 発させて濃いシロップにし、ジクロロメタン（５００ｍｌ）を加えた。水を加え 、酸性化した。層を分離し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、更に蒸発乾固し た。残留物を熱２−プロパツールに懸濁し、冷却、濾過して中間化合物として有 用な６−（トリチルアミノ）５−（トリチルアミノ）ペンチルヒドロキシメチレ ンマロノニトリル水浴中６−（トリチルアミノ）−カプロン酸（２０，０ｇ、５ ３ミリモル）およびトリエチルアミン（２０ｍｌ）のジクロロメタン溶液に、３ ０分にわたり、イソブチルクロロホルメート（８，３ｍｌ、６４ミリモル）を滴 下した。混合物を水浴中で、２時間撹拌し、新しく蒸留したマロンニトリル（４ ，２ｇ、６４ミリモル）を１度に加えた。溶液を水浴で２時間、更に室温で２時 間撹拌した。ジクロロメタン溶液を水冷２ＮＨＣ１（３００ｍ１）で洗浄し、二 相の混合物を濾過して、沈澱してきた生成物（１３，２ｇ）を除いた。相を分離 し、有機相を乾燥して、更に蒸発させて、濃いシロップにした。シロップをジク ロロメタンをかけ、生成物のみごとな結晶を沈積した状態にした。結晶を濾過し て、乾燥し、生成物の総収量１９．５ｇ（８７％）に対し６．３ｇを得たが、こ れは中間体として有用である。

実施例３： ５−（トリチルアミノ）ペンチルメトキノメチレンマロノニトリルエーテル／ジ クロロメタン（９００Ｉａｌ／　１００１ｍ１）中、実施例２のマロノニトリル （１３ｇ、３１ミリモル）の懸濁液を水浴で冷却したものを、新しく調製したジ アゾメタン（ジアザルド（商標）（アルドリッチ・ケミカル・カンノ櫻ニー）５ ０ミリモルから）のエーテル溶液で処理した。溶液を６時間撹拌し、次；二、酢 酸（１０ｍｌ）で中和した。溶液を蒸発乾固し、残留物を／クロロメタン／アセ トン（４／１）を溶離剤として用いるノリカケルのクロマトグラフィー（＝付し た。生成物を含んでいる両分を集め、蒸発してノロノブにした。シロ・ンプをジ クロロメタンで粉砕し、結晶化した。結晶を濾過し、乾燥してクロマトグラフィ ー的（こ純粋であり、中間化合物として有用な生成物８．３ｇ　（６１％）を得 を二。

実施例４・ ５−アミノ−３−［（５−トリチルアミノ）ペンチル］　ビラ・ノール−４−カ ルボニトリル 水浴中、実施例３　（７，０ｇ、１６ミリモル）の生成物のメタノール溶液（１ ００ｍｌ）にヒドラジンモノヒトレート（７，８ｍｌ、１６０ミリモル）を１５ 分１こわたり滴下した。３０分水浴で撹拌後、溶液を蒸発乾固した。残留物を冷 メタノールに懸濁し、濾過して乾燥後、中間体として有用な、５−アミノ−３− ［（５−トリチルアミノ）ペンチル］ピラゾールー４−カルボニトリル７．１（ １００％）を得た。分析試料を水から再結晶して調製した。

実施例５： ５−アミノ−１−（２−チオキシ−３，５−）−〇−トルオイル−β−ｐ−工１ ノトロベントフラノノル）−３−［（５−トリチルアミノ）ペンチル］ビラ゛ノ ール−４−カルボニトリル 実施例４由来のカルボニトリル（３，５ｇ、８ミリモル）の水冷溶液を水素イヒ ナトリウムで処理し、０−４°Ｃで３０分間撹拌した。１−クロロ−１，２−’ ）チオキシ−３，５−ジーｏ−ｈルオイルリポフラノースを加え、溶液を０−４ °Ｃで１時間撹拌した。溶液を重炭酸ナトリウムの飽和溶液に注ぎ、ジクロロメ タンで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、更に蒸発乾固した。残留物 をトルエン／酢酸エチル（５／１）を溶離剤として用い、ノリカゲルのフラツシ ュクロマトグラフィーに付した。２つの主な生成物を単離し、Ｎ−１およびＮ− ２異性体として同定し、それぞれの収率は、Ｎ−１は５７％（３，６ｇ）および Ｎ−２ｉｔ２０％（１，２ｇ）であった。約１ｇのＮ−１およびＮ−２異性体混 合物も集めた。

グリコジル化した原料の全収量は、５．８ｇ（９２％）であった。Ｎ−１異性体 、５−アミノ−１−（２−チオキシ−３，５−ジー〇−トルオイル−β一旦−二 １ノトロペントフラノノル）−３−［（５−トリチルアミノ）ペンチル］ピラ゛ ／−ル−４−カルボニトリルを更に精製することな〈実施例６で使用した。

実施例６ ｌ−（２−チオキシ−β−且一エリトロペントフラノシル）　−３−［（５−（ ｈ’ノチルアミノ）ペンチル］ピラゾロ［３，４−ｄ］　ピリミジン−４−アミ ン実施例５　（３，５ｇ、　４．４ミリモル）のピラゾール−４−カルボニドＩ Ｊ　）しのトルエン（１００ｆｆ１１）溶液に、ンエトキシメチルアセテート（ １，１１１，６７ミ「ノモル）を加えた。溶液を８０−９．０℃で５時間保ち、 その後、蒸発させてシロ・ツブにした。シロップをジクロロメタン（１０ｍｌ） に溶解し、ガラス加圧瓶中の水冷メタノール性アンモニア（１００ｍｌ）に加え た。室温で２日後、瓶の中身を蒸発乾固した。残留物をメタノールに溶解し、新 たに調製したナトリウムメトキシドでｐＨ８に調整し、完全に脱保護した。−晩 撹拌した後、溶液をドウエ・ソクス（Ｄｏｗｅｘ）（商標）−５０Ｈ＋樹脂で処 理し、濾過し、更に蒸発乾固した。残留物をアセトン／ヘキサン（３／２）を溶 離剤として用し）で、シリカゲルのクロマトグラフィーに付し、分析的に純粋な 生成物２．０ｇ　（７７％）を得た。

実施例７゜ １−（２−デオキシ−β一旦−エリトロペントフラノシル）−３−［５−（トリ エチルアミン）ペンチルコピラゾロ［３，４−ｄ］　ピリミジン−４−アミン５ −モノホスフェート トリメチルホスフェート（５ｍｌ）中、実施例６のピラゾロビ１ノミジンー４− アミン（２５０ｍｇ、　０．４３ミリモル）の水冷溶液に、塩化ホスホｌＪ７し く５０μｍ）を加え、溶液を０−４℃に保った。反応は、水中Ｏから１００％の 直線勾配のアセトニトリルを用いる逆相ＨＰＬＣにより２５分にわたり追跡した 。５時間撹拌後、塩化ホスホリルの付加部分（２５μｍ）を加え、溶液を別１こ ３０分撹拌した。

２ｍｍＸ　５　ＱｃｍＣ１，８カラムを用いて逆相ＨＰＬＣで精製した。カラム を水で平衡化し、０から１００％勾配のアセトニトリルで２０分にわたり溶出し た。所望の物質を含有している画分を集め、凍結乾燥して、クロマトグラフィー 的に純粋なヌクレオチド１６０ｍｇ（５６％）を得た。

実施例８： １−（２−チオキシーβ−Ｄ−エリトロベントフラノノル）　−３−（５−［（ ６−ビオチンアミド）ヘキサンアミドペンチル）　ピラゾロ［３，４−ＣＩ］　 ピリミジン−４−アミン５゛−モノホスフェート実施例７のヌクレオチドのエタ ノール溶液（１０ｍｌ）、炭素中水酸化バラノウム（５０ｍｇＬおよびシクロへ キサジエン（１ｍｌ）を３日間還流し、濾過して蒸発乾固した。残留物をノクロ ロメタンで洗浄し、トリエチルアミン（１００ｍｌ）を含有するＤＭＦ　（１， ５ｍ１）に溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミンルビオチニルアミノカブロエ ート（５０ｍｇ）で処理した。−晩撹拌後、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル６ −ビオチンアミドカブロエート（５０ｍｇ）の付加量を加え、溶液を１８時間撹 拌した。反応混合物を蒸発乾固し、実施例７の方法に従いクロマトグラフィーに 付した。画分を集め、凍結乾燥して、クロマトグラフィー的に純粋なビオチンア ミド置換ヌクレオチド８０ｍｇを得た。

実施例９゜ １−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロペントフラノノル）−３−［５−（６− ビオチンアミド）ヘキサンアミドペンチル］　ピラゾロ［３，４−ｄｌ　ビリミ シン−４−アミン５’−ｈリホスフエート 実施例８のモノホスフェート（８０ｆｆｉｇ、約０１ミリモル）をトリエチルア ミン（１４μｍ）を添加してＤＭＦに溶解した。カルボニルジイミダゾール（８ １ｍｇ。

０．５ミリモル）を加え、溶液を室温で１８時間撹拌した。溶液をメタノール（ ４０μｍ）で処理し、３０分撹拌後、トリブチルアンモニウムピロホスフェート （０゜５ｍｌＤＭＦ中０．５ｇ）を加えた。２４時間撹拌後、もう一部のトリブ チルアンモニウムピロホスフェートを加えて、溶液を一晩撹拌した。反応混合物 を蒸発乾固し、実施例８の方法に従いクロマトグラフィーに付した。２つの生成 物を集め、５５℃で１８時間それぞれ別々に濃水酸化アンモニウム（ＩＪＩ）で 処理した。ＵＶおよびＨＰ　Ｌ　Ｃ分析では、アンモニア処理後は両方の生成物 は同一であることを示しており、これを集め、凍結乾燥して、ヌクレオチドトリ ホスフェート３５゜ニソクートランスレーンコン反応 実施例９のトリホスフェートをランガー等（上記）の二ツク・トランスレーンコ ンプロトコールを用いてｐＨＰＶ−１６に組み込んだ。実施例９のトリホスフェ ートで調製したプローブを商業的に入手出来るバイオ−１１−ｄＵＴＰ　（シグ マ・ケミカル・カンパニー）を用いて調製したプローブと比較した。フィルター ハイプリダイゼーンコンおよびイン・ントウ塗抹（ｉｎ　５ｉｔｕ　ｓｍｅａｒ ｓ）のいずれにおいても重大な違いは、見られなかった。

より具体的には、以下の材料および工程を含む手順である。

材料。

ＤＮアーゼ（ＩＣＮバイオメディカルズ）−４μｇ／ｍ１ＤＮＡポリメラーゼ１ （Ｕ、Ｓ、バイオケミカルズ）　−８Ｕ／ｍ１ｐＨＰＶ−１６−２，１６１１ｇ ／ｍｌ、これはヒト・パピローマウィルス１６型のゲノム配列を含有するプラス ミドである。

ヌクレオチド−ミックスＡ−ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰＳＴＴＰ各２ゴ４（ファルマノ ア） ミックスＵ−ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ各２哩バイオ−１１−ｄＵＴＰ−１ ，０ｍｇ／ｍｌ　（ＢＲＬ）バイオ−１２−ｄＡＰＦＴＰ−１，０ｍｇ／ｍｌ工 程。

１０Ｘ−ＤＰ　（４ｍｌ）　、ｐＨＰＶ−１６（２ｍｌ）　、ヌクレオチドミッ クスＡ（６ｍｌ）、バイオ−１２−ｄＡＰＰＴＰ　（２ｍｌ）およびＨ２Ｏ（２ ０ｍｌ）　０）水冷混合物にＤＮアーゼ（］、ｍｌ）とＤＮＡポリメラーゼ１． 　（２，４ｍ１）を加えた。反応混合物を１６℃で１時間インキュベートした。

バイオ−１２−ｄＡＰＰＴＰ　（実施例９のトリホスフェートから成る）および ヌクレオチドミックスＡの代わりにバイオ−１１−ｄＵＴＰおよびヌクレオチド ミックスＵを用いてこの手順を繰り返した。

核酸をエタノール沈澱により分離し、ニトロセルロース上にスロットした（ｓｌ ｏｔｔｅｄ）　ｐＨＰ　Ｖ−１６とハイブリダイズさせた。ハイブリダイズした ビオチニル化プローブをＢＣＩＰｌＮＢ丁とコンンユゲートするストレプトアビ ンンーアルカリホスファターでにより明視化した。ビオチニル化ヌクレオチドの いずれかを用いて調製したプローブは、同一の／エチルを与えた。プローブを頚 管塗抹（Ｃｅｒｖｉｃａｌ　ｓｍｅａｒｓ）においてイン・ノトウ形式でも試験 し、シグナルおよびバンクグラウンドにおいて質的な違いは無いことを示した。

実施例ＩＪ ５−アミノ−３−ｒ（５−トリチルアミノ）ペンチルコビラゾールー４−カルボ キノアミト ンアノアセトアミドをマロンニトリルの代わりに用いる以外は、実施例２の方法 に従い、５−（トリチルアミノ）ペンチルヒドロキノメチレンツアノアセトアミ ドを６−（トリチルアミノ）カプロン酸から調製する。これをその後、実施例３ の方法に従い、ンアゾメタンで処理して、メトキノ誘導体を得、これを次に実施 例４のようにヒドラジンモノヒトレートと反応させて、５−アミノ−３−［（５ −トリチルアミノ）ペンチル］ピラゾールー４−カルホキジアミドを得る。

実施例１２・ ４−ヒドロキシ−６−メチルチオ−３−口（５−トリチルアミノ）ペン・チルコ ビラゾローＣ３，４−ｄ″Ｊピ）ノミシン 実施例１１由来のカルボキシアミドをエチルキサントゲン酸カリウムおよびエタ ノールと高温で反応させ、４−ヒドロキシピラゾロ［３，４−ｄｌ　ピリミジン ＝６−チオールのカリウム塩を得る。この塩をその後、ヨードメタンと反応させ て４−ヒドロキシ−６−メチルチオ−３［（５−トリチルアミノ）ペンチル〕ピ ラゾロ［３，４−ｄｌ　ピリミジンを得る。

１−（２−チオキシ−β−ｐ−エリトロベントフラノノル）−４−ヒドロキシ− ３−［５−０リチルアミノ）ペンチル〕　ピラゾロ［３，４−ｄｌ　ピリミジン −６−アミン 実施例５の方法に従い、実施例１２のビラゾロピリミジンを水素化ナトリウムで 処理し、ｌ−クロロ−１，２−シブオキシー３．５−シー０−トルオイルリボフ ラノースと反応させる。生じた化合物をＭＣＰＢＡおよびメタノール性アンモニ ウムと反応させ、トルオイル保護基を除いて、生成物を得る。

実施例１４ １−（２−チオキシーβ−り一エリトロベントフラノ／ル）−４−ヒドロキソ＝ ３−Ｃ５（６−ビオチンアミド）ヘキサンアミドペンチル〕ピラゾロ「３，４− ｄ〕ピリミジン−６−アミン５“−モノホスフェート実施例７の方法に従い、実 施例１３のビラゾロピリミジンを塩化ホスホリルと反応させ、対応する５゛−モ ノホスフェートを得る。

実施例８の方法に従い、上記５°−モノホスフェートをパラジウム／吹素および クロロヘキサノエンと反応させ、残留物をＮ−ヒドロキシスクシンイミンルビオ チニルアミノカブロエートと反応させて、１−（２−チオキシーβ−ｐ−エリト 口ベントフラノシル）−４−ヒドロキシ−３−［５−（６−ビオチンアミド）ヘ キサンアミドペンチル］ピラゾロ［３，４−ｆｉ］　ビリミシン−６−アミン５ °−モノホスフエートを得る。

実施例１５゜ ■−（２−チオキシーβ−Ｄ−エエノトロペントフラノシル）−４−ヒドロキシ −３−Ｅ５−（６−ビオチンアミド）ヘキサンアミドペンチル］ピラゾロ［３， ４６１ピリミジン−６−アミン５゛−トリホスフェート実施例９の方法に従い、 実施例１４の５°−モノホスフェートをカルボニルジイミダゾールで処理し、そ の後、トリブチルアンモニウムピロホスフェートと反応させて、対応する５゛− トリホスフェートを得る。

実施例１６・ １−（２−チオキシ−β−且一エリトロペントフラノシル）−３−［５−（トリ チルアミノ）−ペンチル］ピラゾロ［３，４−ｄ］　ビリミジン−４−ベンゾイ ルアミン 実施例６由来の１−（２−チオキシ−β−見一エリトロペントフラノシル）−３ −［５−（トリチルアミノ）ベンチルコ　ピラゾロ［３，４−ｄ］　ピリミジン −４−アミンを塩化ベンゾイルおよびピリミジンと反応させ、１−（２−チオキ シ−３，５−ジーΩ−ベンゾイル−β−二一エリトロベントフラノノル）−３− Ｃ５−（トリチルアミノ）−ペンチル］ピラゾロ［３，４−ｄ］　ピリミシン− ４−ンベンゾイルアミンを得る。これを水性水酸化ナトリウムで処理して、部分 的に化合物を脱保護し、１−（２−チオキシ−β一旦−エリトロペントフラノシ ル）−３−［５−（トリチルアミノ）−ペンチル］ピラゾロ［３，４−ｃ＋３　 ピリミジン−４−ベンゾイルアミンを得る。

実施例８の方法に従い、実施例１６のベンゾイルアミンをを炭素中の水酸化）々 ラジウムで処理し、その後、無水トリフルオロ酢酸で処理して、１−（２−チオ キシ−β一旦−エリト口ベントフラノシル）−３−［５−（トリフルオロアセト アミド）ペンチル］ピラゾロ［３，４−ｄ］　ピリミジン−４−ベンゾイルアミ ン１−（２−チオキ／−５−０−ジメトキ７トリチルーβ−且−エリトロペント フラノノル）−３−［５−（トリフルオロアセトアミド）ペンチル］ピラゾロ［ ３゜４、−　ｄ　］　］ピリミシン−４−ベンゾイルアミン３°０−（Ｎ、Ｎ− ジイソプロピル）ホスホルアミダイトノアノエチルエステル実施例１７の化合物 を塩化シメトキノトリチルおよびピリミジンと反応させて、対応する５′−ジメ トキノトリチル化合物を得る。この化合物をその後ジアノエチルクロロ−Ｎ。Ｎ −ジイソプロピルホスホルアミダイトと反応させ（シンノ＼等、ヌクレイツク・ アンッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）　、１２巻、４ ５３９５−（４−フタルイミドブドー１−イン−１−イル）−２゛−デオキシウ リジン５−ヨード−２°−デオキシウリジン（３５４ｍｇ、１ミリモル）をジメ チルホルムアミド１０ｍ１に溶解した。ヨウ化第−銅（７６ｍｇ、０．４ミリモ ル）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（２３０ｍｇ、 ０．２ミリモル）およびトリエチルアミン（２００ｍｇ、　２．０ミリモル）を 加えた。４−フタルイミドブドー１−イン（３００ｍｇ、１５ミリモル）を一度 に加え、反応を６０℃で３時間保った。その後、透明な黄色反応物を蒸発し、塩 化メチレンを加えた。フラスコの内壁をこすって、生成物のほとんど全てを結晶 化し、これを濾過して９５％エタノールから再結晶して、標記化合物３３５ｍｇ （７８％）を細かい、羽毛のような針状として得た。

実施例２０： ５−（４−フタルイミドブドー１−イル）−２′−デオキシウリジン実施例１９ のデオキシウリジン１００グラムを９５％ＥｔＯＨに溶解し、中性ラネーニッケ ル約３ｇを加えた。４８時間後、触媒を用心して濾去し、濾液を蒸発して固体に し、メタノール−水から再結晶して、標記化合物９６０ａ＋ｇ（９７％）５−（ ３−ヨードアセトアミドプロピル）−２°−デオキシウリジン５−（３−トリフ ルオロアセトアミドプロブ−１−イル）−２−デオキシ−ウリジン（０，３ミリ モル）をアンモニア、次にＮ−ヒドロキシスクシンイミジルα−ヨードアセテー ト（０，５ミリモル）で処理した。反応混合物を蒸発乾固し、クロマトグラフィ ーにより精製して、５−（３−ヨードアセトアミドプロピル）−２′−デオキシ ウリジンを得た。

実施例２２ ５−（４−（４−ブロモブチルアミド）ブチル）−２゛−デオキシウリジン実施 例２１の方法に従い、実施例２０由来の５−（４−フタルイミドブドー１−イル ）−２′−デオキシウリジンをアンモニア、次に、Ｎ−ヒドロキシスフノンイミ ンルー４−ブロモブチレートで処理して、５−（４−（４−ブロモブチルアミド ）ブチル）−２°チオキシウリジンを得る。

ホスホルアミダイト調製およびＤＮＡ合成ヌクレオノドを知られている方法に従 って５゛−ジメメトキシトリチル化しておよそ８５％収率で得、３′−ホスホル アミダイトをジイソプロピルアミノパー／アノエチルクロロホスファイトを（上 記“オリゴヌクレオチド合成：実用的方法″のようにして）、塩化メチレン中の ジイソプロピルエチルアミンと共に用いて作った。ホスホルアミダイトをアセト ニトリルで０．２Ｎ溶液にし、ＤＮＡ自動合成機にかけた。これらの新規でかつ 修飾したホスホルアミダイトの組み込みは、通常のホスホルアミダイトと類似の ものの組込みを与えるものであった（ＵＶにより発色するトリチルのアッセーに より判断して９７−９９％）。

オリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成機からトリチル化型で除去し、３０％アンモニ アを用いて、５５℃で６時間脱保護した。０．５Ｍ重炭酸ナトリウム１０μｍを 加えて、濃縮時の酸性化を防いだ。オリゴヌクレオチドを真空下で蒸発乾固し、 水１０ｍｌに再溶解した。オリゴヌクレオチドをを０．ＩＮ酢酸トリエチルアン モニウムアセテート中１５−５５％アセトニトリルを用いるＨＰＬＣにより２０ 分にわたり精製した。非置換オリゴヌクレオチドは１０分で出てきた二アミノ誘 導体は１１−１２分間かかった。所望のオリゴヌクレオチドを集め、蒸発乾固し て、次に８０％水性酢酸に９０分間再溶解して、トリチル基を除去した。脱塩は 、Ｇ２５セフアデツクスカラムで行い、適切な画分を採取した。画分を濃縮して 特定の容量にし、希釈して全収量を確認し、分析ＨＰＬＣを行って純度を確かめ た。

オリゴヌクレオチドは、使用するまで一２０℃で凍結しておいた。

上記方法に従い、ヌクレオシド５−（３−トリフルオロアセトアミドプロブ−１ −イル）−２゛チオキシウリジンを５′−〇−ジメトキシトリチルー３’−（Ｎ 。

Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイトンアノエチルエステル誘導体に転化し た。これをＤＮＡ合成機に加え、以下の１４−ｍｅｒオリゴヌクレオチド配列を 調製した。

３’−ＣＴ　ＴＣＣＵ’ＴＧ　ＴＡＧ　ＧＴＣ−５’配列中、Ｕｌは５−（３− アミノプロプ−１−イル）−２゛−デオキシウリジン（オリゴＡ）である。

同じ方法で、５−（４−フタルイミドブドー１−イル）−２°−デオキシウリジ ンを５゛−〇−ジメトキシートリチルー３°−（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル）ホス ホルアミダイトシアノエチルエステル誘導体に転化し、ＤＮＡ合成機に加えて、 上記１４−ｍｅｒオリゴヌクレオチド配列でＵｌが５−（４−アミノブドー１− イル）−２′−デオキシウリジン（オリゴＣ）であるものを調製した。

対応する１４−ＩＩＩｅｒオリゴヌクレオチドでＵｌが非修飾デオキシウリジン であるものも調製した。

実施例２４： オリゴヌクレオチドの誘導化 一般に、架橋手をアミノアルキリオリゴヌクレオチドに加えるには、アミノアル キルオリゴヌクレオチドの１０μｇの溶液および０．１Ｍホウ酸塩緩衝液、ｐＨ ８，５，１０μｍ中α−中口−セテートまたは４−ハロブチレートなどの１００ Ｘモル過剰のｎ−ヒドロキシスクシンイミド！１０アシレートを周辺温度で３０ 分間暗所でインキュベートした。反応全体を滅菌水で平衡化したＮＡＰ−１０カ ラムに通して滅菌水で溶出した。ＵＶ吸収を基にした適切な画分を集め合わせ、 濃度を分光測光法的に測定した。

ハロアシル部分の導入については、ＨＰＬＣで調べた。ゾルパックス（商標）（ Ｚｏｒｂａｘ）オリゴヌクレオチドカラム（デュポン）は、組成りの６０％から ８０％勾配で２０分溶出した：Ａ（２０％アセトニトリル＝８０％０．０２　Ｎ 　ＮａＨ２ＰＯ４）およびＢ（２０％アセトニトリル中１．２Ｎ　ＮａＣ１：　 ｇＱ％０．０２ＮＮａ８２　Ｐ　Ｏｔ）。反応性α−ハロアノル部分が存在する ことが、ＩＮノステアミンにさらした後の対応するアミノアルキルオリゴヌクレ オチドに対するα−ハロアノルアミドアルキルオリゴヌクレオチドの保持時間の 応答により示される。ノステアミンを導入すると、アミノアルキルオリゴヌクレ オチドとα−７Ｘロアノルアミドオリゴヌクレオチドの間の電荷パターンが等し くなる。

以下の方法に従い、１４−ｍｅｒオリゴヌクレオチド３°−ＣＴ　ＴＣＣＵ’Ｔ Ｇ　ＴＡＧ　ＧＴＣ−５’配列中、Ｕ’が５−（３−アミノプロプ−１−イル） −２′−デオキシウリジン（オリゴＡ１実施例２３）であるものをｎ−ヒドロキ シスフノンイミドα−ヨードアセテートと反応させて、上記１．４−ｍｅｒオリ ゴヌクレオチドで配列中、Ｕ’が５−（３−ヨードアセトアミドプロブ−１−イ ル）−２′−デオキシウリジン（オリゴＢ）であるものを得た。

オリゴＡおよびオリゴＢを、上記１．４−ｍｅｒで’［Ｊｌが非修飾デオキシウ リジンであるものと同様、ゾルパックスカラムで分析し、全ての同一配列は、以 下の保持時間を有した。非修飾１４−ｍａｒ、９３１分；アミノプロピル１４− ｍａｒ　（オリゴＡ）、７．３６分、およびヨードアセトアミドプロピル１４− ｍｅｒ（オリゴＢ）、１０．０９分。

同じ方法で、アミノプロピル１４−ｍｅｒ（オリゴＡ）をｎ−ヒドロキシスクシ ンイミド４−ブロモブチレートと反応させ、１４−ｍｅｒでＵｌが５−（３−（ ４−ブロモブチルアミド）プロプ−１−イル）−２゛−デオキシウリジンである ものを得た。

アミノブチル１．４−ｍｅｒ　（オリゴＣ１実施例２３）をＮ−ヒドロキシスク シンイミドα−ヨードアセテートまたはＮ−ヒドロキシスフノンイミド４−プロ モブチレ−１・のいずれかと反応させ、１４−ｍｅｒでＵｌが５−（４−ヨード アセトアミドブト−１−イル）−２゛−デオキシウリジンまたは５−　（４−（ ４−ブロモブチルアミド）ブドー１−イル）−２゛−デオキシウリジンであるも のそれぞれを得た。

実施例２５ 架橋反応のアンセー ＤＮＡプローブをターゲット核酸配列と架橋する反応は、１μｇハロアシルアミ ドアルキルプローブおよび０，１ｌｖｆトリス、ｐＨ８，０，および０．９ＭＮ ａＣ１の２００μｍ中３２　ｐ−標識し、コルジセピンを末尾につけたターゲッ トＬｏｎｇを含有し、これを２０℃または３０℃でインキュベートした。一部を ２４時間間隔または７２時間間隔で取り出し、１Ｑｒｒ＋Ｍノステアミン２０μ ｍに希釈し、７１０アシルアミド基を消滅させた。これら溶液を室温で保存し、 １μｍを変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）分析に用いた。

上記方法に従い、オリゴヌクレオチド配列の２つのモデルを利用して、修飾プロ ーブがその相補と架橋する潜在能力を評価した。ヒト・パピローマウィルス（Ｈ ＰＶ）またはヒト・サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）から誘導される、該配列を ルアミド）−プロピル］−２゛−デオキシウリ／ン、またはＵ＝５−［３−（α −・ヨードアセトアミド）−または４−（４−ブロモブチアミド）−ブチル］− ２′−デオキシウリジン。

ＨＰＶに対するターゲットは３０−ｍｅｒであり、ＣＭＶに対するタープ・ブト は２４−ｍｅｒである。架橋するプローブはＨＰＶに対して１４−ｍｅｒ、　Ｃ ＭＶに対して１５−ｍｅｒであった。各プローブは、上記配列において旦として 示した単一修飾デオキシウリジンを含有した。

ＨＰＶターゲットを５−（３−ヨードアセトアミドプロピル）側手を持つ架橋す るプローブの限定量と反応させた結果を図２に示している。変性ＰＡＧＥケル上 の切断パターンの分析では、別々の低分子量バンドの出現に付随して、架橋した ハイブリッドが損失することを示していた。このバンドの強度は、最初の反応で どの程度架橋するかに依存している。ゲル上の２つの別個の／Ｘバンドノブナル があることは、ターゲットまたはプローブ鎖のいずれかで非配列指向性アルキル 化が起こっている（分子内プローブアルキル化を含む）ことを強く主張するもの である。

隣接レーンにおける実際の１５−ｍａｒ形態（ｒｕｎ）と比較すると、主要な切 断フラグメントが、９−ｍｅｒであることが示唆される。独自のオートラジオグ ラムによる精密な試験では、よりゆっくりと動き、非常に弱い強度を持つバンド が認識できた。このパターンは、Ｇ−２１での主要なアルキル化およびＧ−２０ での少量のアルキル化に一致するであろう。架橋可能なＨＰＶノ＼イブリッドの ドレイディングモデル（Ｄｒｅｉｅｎｇ　ｍｏｄｅｌ）の試験は、５−（３−ヨ ードアセトアミドプロピル）側手がらせん構造を少し歪めるだけで、ターゲット 鎖のＧ−２１残基と接触できることを示している。

アルキル化が修飾デオキシウリジン塩基対の５°側から２単位離れた位置にある ターゲット鎮のグアノンンで優位に起こるならば、ＣＭＶ配列は反応しないであ ろう。この結果は、実際に観察された。ＣＭＶと反応しないことは、更に本発明 の架橋機構の特異性を支持するものである。

実施例２６ 時間および温度依存性 時間および温度依存性の研究を実施例２５のＨＰＮｒ系で見が５−（３−ヨード アセトアミドプロプ−１−イル）−２′−デオキシウリジンであるもので行った 。

ターゲットを末尾に末端基トランスフェラーゼをつけたコルジセピンにより３２ ｐ−標識しくマニアティス等、“分子クローニング−実験マニュアル”、コール ド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−１１９８２年、２３９頁）、２０℃ま たは３０℃のいずれかで、ｐＨ８０トリス緩衝液中の過剰のプローブと共にイン キュベートした。一部分を０．２４または７２時間インキュベーション後に取り 出し、１０ｍＭメルカプトエチルアミン（ヨードアセトアミドと反応させる）の 等容量で反応を止め、続いて変性または非変性ＰＡＧＥで分析するために、室温 で保存した。

ハイブリッドの架橋形成は、変性Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅで追跡したが、これは、２４お よび７２時間の時点ていずれの温度でも明らかであった（図３参照）。架橋した ｌ＼イブリッド量はいずれの温度および時間でも増加した。／１イブリッドの約 ２０％カベ、３０℃で７２時間インキュベーノヨコンに架橋した。

別々の温度の範囲での実験では、３７℃での架橋の半減期は約２日であり、反応 は５８℃で２４時間後には完全であることを示していた。この時間依存性反応は 、ヨードアセトアミド部分が加水分解せず、または緩衝液と反応しなＬＮことを 暗示している。より高い温度での反応速度の増大は、／＼イブリ・ソドが維持さ れており、続いてアルキル化速度は温度によって所望の増大を示すことを指示し て０る。

実施例２７・ アルキル化の部位特異性 アルキル化の部位特異性を解明するために、実施例２５の架橋したＨＰＶ／−イ ブリッド（Ｕは、５−（３−ヨードアセトアミドプロブ−１−イル）−２′−デ オキシウリジンである）を９０℃で６０分、１０％ピペリジン溶液に付した。マ キシマム等（プロシーディング・イブ・ナショナル・アカデミ−・イブ・サイエ ンンイズ−Ｕ　Ｓ　Ａ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ）　 、７４巻、５６０頁（１９７７年）により示されたように、この処理は、アルキ ル化部位に対してタープ・ソト鎖３゜−を量的に切断するものである。結果とし て得られたデータは、上記架橋により修飾された塩基対の第二のグアニン（即ち 、上記タープ・ブト塩基のグアニン）のアルキル化が、観察された唯一の作用で あることを示しており、ＨＰＶモデル系における架橋反応が著しく特異的である ことを示していた。

化学的に修飾した架橋可能な０ＤＮｓ ソラレン修飾した光−架橋可能な○ＤＮｓを光化学的方法を用いて調製した。

要約すると、ＯＤＮを相補ＤＮＡ配列とハイブリダイズし、４′−ヒドロキシメ チル−４，５°、８−トリメチルソラレン（ＨＭＴ）の存在下、３６０ｎｍで照 射し、それによって配列特異的架橋架橋を唯一の５’−ＴｐＡ−３’配列で形成 した。２５Ｑｎｍの光りに短時間さらす、架橋の部分釣元反転（ｐａｒｔｉａｌ 　ｐｈｏｔｏｒｅｖｅｒｓａｌ）に従い、ＨＭＴフラン側−付加物○ＤＮを変性 ＰＡＧＥで分離した。

代替法として、ソラレン誘導体を化学的フンジュゲーノコンによりＯＤＮに結合 させることもある。これらの合成機構を用いて、ＯＤＮの５°末端とソラレンの ４′位にわたる結合手を介して４，５°、８−トリメチルソラレン（ＴＭＰ）と 結合した○ＤＮｓを得ることもある。１つの方法として、修飾ＴＭＰを、適切に ５′−活性化し脱保護したＯＤＮと反応させる（Ｂ、　Ｌ、り一等、バイオケミ ストリー　（Ｂｉｏｃｈｅ、　）、２７巻、３１９７−３２０２頁、１９８８年 ）。第二の方法として、ＴＭＰホスホルアミダイト結合化合物を固相合成の最後 に加える（Ｕ　ビールスおよびＵ、イングリッノエ、ヌクレイツク・アシッズ・ リサーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）　、１７巻、２８５−９９頁、 １９８９年）。類似の付加物を４′−アミノメチル−４，５’、８−トリメチル ソラレン（ＡＭＴ）のチオール化誘導体を用いて調製することもある（Ｊ、ティ アレおよびＰ、ウォーレンツィーエン、ヌクレイツク・アンッズ・リサーチ（Ｎ ｕｃｌＪｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　）　、１７巻、３３５９−７２頁、１９８９年） 。更に代替法として、ＴＭＰ修飾デオキシアデノシンホスホルアミダイトを固相 合成の間にＯＤＮの任意の位置に挿入することもある（Ｕ　ビールス等、ヌクレ イツク・アンソズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　）　、１７巻 、８９６７−７８頁、１９８９年）。このシントンでは、ＴＭＰはデオキシアデ ノンンの０８位に結合する結合剤（ｌｉｎｋｅｒ）でその４位を修飾される。

実施例２９゜ ターケソト二本鎖ＤＮＡに対する化学修飾０ＤＮｓの使用試作品、即ちｒｅｃ　 Ａ安定化二本鎖において相同的なりＮＡと複合した場合に、いずれのワトソンお よびクリック鎖とも効率的に架橋できるソラレン化したＯＤＮを用いる。末尾を ソラレン化した５゛修飾ＯＤＮを合成し、そうしてｒｅｃ　Ａ安定化二本鎖の側 面に接する５’　−ＴｐＡ−３’配列内で最大限に光架橋する。要約すると、ソ ラレン化したＯＤＮを組換え酵素の存在下で用いて、配列特異的架橋を二本鎖Ｄ ＮＡターゲットにおける相補部位に導入する。該ＯＤＮは、ＤＮＡターゲットと フーグスチーン型塩基対合しており、これを５−ヒドロキシソラレン部分または ４．５’、　８−　トリメチルンラレン部分でその５′末端を修飾する。ソラレ ンを５′位につなげることにより、フロクマリンを二本鎖のすぐ隣にある二本鎖 ５’−ＴｐＡ−３’配列に容易に挿入することができる。フラン環およびピロン 環のいずれもが、正確に位置して、チミジンと光反応する。ソラレン化した末尾 の長さを変えて、ソラレンを二本−二本鎖接合に最大限に挿入することもある。

図１ ・ｍｇｄ　”’Ｐ−１ｍＨＰＶターゲット＠　３２Ｐ　ｍｍ１５−ｍｅｒマーカ ー−−ψ　架橋生成物 ・・・嘲−３２ｐ−標識ＨＰＶターゲット図３ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５／１１ ／／Ｃｌ２Ｑ　１／６８　Ｚ　７８２３−４Ｂ（７２）発明者　メイヤー、リッ チ・ビー・ジュニアアメリカ合衆国９８０７２ワシントン州、ウディンヴイル、 エヌ・イー・ワンハンドレッドアンドセブンティシックスス・ブレイス１５４１ １番 Ｉ （７２）発明者　ティポーン、ジョン・シーアメリカ合衆国９８０１１ワシント ン州、ポウセル、エヌ・イー・ワンハンドレッドアンドシックスティシックスス ・ブレイス １２１１７番 （７２）発明者　バースト、ジェラルド・ディーアメリカ合衆国７７３８０テキ サス州、ザ・ウッドランズ、ウェスト・ハイ・オーウス８フ番 （７２）発明者　ギャンバー、ハワード・ビーアメリカ合衆国９８０７２ワシン トン州、ウディンヴイル、エヌ・イー・トゥハンドレッドアンドトゥエルスス・ ドライブ１４０４８番

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．構造遺伝子、遺伝子機能に影響を与える調節配列またはそれらの部分に相当 する、ターゲットの二本鎖ＤＮＡの一方の鎖に相同的であり、もう一方の鎖に相 補的なオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）に架橋剤を付けて架橋性ＯＤＮを形成させ 、当該架橋性ＯＤＮと組換え酵素を接触させて核タンパク質繊維を形成させ、当 該核タンパク質繊維とターゲットの二本鎖ＤＮＡを三本鎖複合体を形成させるに 充分な時間を要して結合せしめ、 当該三本鎖複合体を架橋させて遺伝子機能を変化せしめることから成る、遺伝子 機能を変化させる方法。
2. ２．架橋剤がヌクレオシド架橋剤である、請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．ヌクレオシド架橋剤が以下の式： Ｒ１−Ｂ−（ＣＨ２）ｑ−（Ｙ）ｒ−（ＣＨ２）ｍ−Ａ′（Ｉ′）式中、 Ｒ１は、水素、またはその３′または５′位において、酸素により糖部分と結合 し、基Ｑ１、Ｑ２およびＱ３を含んでいるリン誘導体、または、ヌクレオチド結 合形成に適切なその反応性前駆体で置換されていてもよい、糖部分またはその類 似体であり； Ｑ１は、ヒドロキシ、ホスフェートまたはジホスフェートであり；Ｑ２は、＝Ｏ または＝Ｓであり； Ｑ３は、ＣＨ２−Ｒ′、Ｓ−Ｒ′、Ｏ−Ｒ′、またはＮ−Ｒ′Ｒ′′であり；Ｒ ′およびＲ′′のそれぞれは、独立して水素またはＣ１−６アルキルであり；Ｂ は、オリゴヌクレオチドの構成部分である核酸塩基またはそれらの類似体であり 、； Ｙは、機能的な連結基であり； ｍおよびｑは独立して０から８であり；ｒは０または１であり； Ａ′は離脱基である により表される、請求の範囲第２項記載の方法。
4. ４．構造遺伝子、遺伝子機能に影響を与える調節配列またはそれらの部分に相当 するターゲットの二本鎖ＤＮＡの一方の鎖に相同的であり、もう一方の鎖に相補 的なオリゴヌクレオチドに共有結合的に結合した化学的架橋剤と、前記オリゴヌ クレオチドと非共有的に結合した組換え酵素から成る、化学的架橋性抗遺伝子核 タンパク質繊維。
5. ５．化学的架橋剤がヌクレオシド架橋剤である、請求の範囲第４項記載の化学的 架橋性抗遺伝子核タンパク質繊維。
6. ６．ヌクレオシド架橋剤が以下の式： Ｒ１−Ｂ−（ＣＨ２）ｑ−（Ｙ）ｒ−（ＣＨ２）ｍ−Ａ′　（Ｉ′）式中、 Ｒ１は、水素、またはその３′または５′位において、酸素により糖部分と結合 し、基Ｑ１、Ｑ２およびＱ３を含んでいるリン誘導体、または、ヌクレオチド結 合形成に適切なその反応性前駆体で置換されていてもよい、糖部分またはその類 似体であり； Ｑ１は、ヒドロキシ、ホスフェートまたはジホスフェートであり；Ｑ２は、＝Ｏ または＝Ｓであり； Ｑ３は、ＣＨ２−Ｒ′、Ｓ−Ｒ′、Ｏ−Ｒ′、またはＮ−Ｒ′Ｒ′′であり；Ｒ ′およびＲ′′のそれぞれは、独立して水素またはＣ１−６アルキルであり；Ｂ は、オリゴヌクレオチドの構成部分である核酸塩基またはそれらの類似体であり ； Ｙは、機能的な連結基であり； ｍおよびｑは独立して０から８であり；ｒは０または１であり； Ａ′は離脱基である により表される、請求の範囲第５項記載の化学的架橋性抗遺伝子核タンパク質繊 維。