JPH06510189A - 免疫抑制剤のためのスクリーニング法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫抑制剤のためのスクリーニング法 発明の背景 免疫応答は、活性化されたＴリンパ球から生成されるサイトカインの作用により 調整される。広範囲の抗原レセプターを育するＴリンパ球は、選択及び分化の工 程の生成物として胸腺において生成される。それらのＴ細胞が末梢リンパ球器官 に移動し、そして抗原に遭遇する場合、それらは、それらが効果的な免疫応答を 生せしめるようにそれらの挙動を調整するために免疫システムの他の細胞に対し て作用する多くのサイトカインを生成するその工程の間、活性化を受ける。

Ｔリンパ球活性化は、抗原が遭遇した後数分から少なくとも１０日後まで多くの 遺伝子の特異的調節を包含する。Ｔ細胞はまた、刺激、たとえばカルシウムイオ ノフオア（たとえばイノマイシン）及びタンパク質キナーゼＣの活性化因子、た とえばホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）の組合せにより活性化され 得る。いくつかのレクチン、たとえば植物凝集素がまた、Ｔ細胞を活性化するた めに使用され得る（Ｎｏｗｅｌｌ、　Ｐ、Ｃ，（１９９０）　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒ ｅｓ、　２０　：　４６２〜４６６）。

Ｔ細胞活性化遺伝子は、個々の遺伝子が調節される刺激の後の時間に基づいてお おまかにグループ分けされる。初期遺伝子は、活性化路において続く遺伝子の調 節のきっかけになる。

Ｔ　ＩＪンバ球の臨床的役割のために、初期活性化遺伝子を妨害する剤、たとえ ばシクロスポリンＡ及びＦＫ５０６が効果的な免疫抑制剤である。これらの初期 活性化遺伝子は、抗原レセプターとの相互作用を通して調節される転写因子、た とえばＮＦ−ＡＴにより調節される。

それらの転写因子は、それらの転写速度を変性するために初期活性化遺伝子上の エンハンサ−及びプロモーター要素を通して作用する。

典型的な初期遺伝子エンハンサ−要素は、インターロイキン２遺伝子の開始部位 の上流の初めの３２５個の塩基対に位置する。この領域は、Ｔ　ＩＪンパ球球性 性化ための必要条件を広範に調べるために使用されて来た。この領域は、ＮＦ− ＡＴ、　ＮＦＫＢ、　ＡＰ　−１，Ｏｃｔ　−１、及びＯＡＰ　−４０と称され る、ｏｃｔ　−１に関連する新しく同定されたタンパク質を包含する一連の転写 因子を結合する。それらの異なった転写因子は、Ｔリンパ球活性化のための複雑 な必要条件を一緒に組込むように作用する。

ＮＦ−ＡＴは、損なわれていないトランスジェニック動物に関して、いづれかの 遺伝子の転写を活性化されたＴ細胞に向けることができることにおいて、上記グ ループの間で最っとも主要な要素であるように思える（Ｖｅｒｗｅｉ　ｊなど、 　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６５：　１５７８８〜１５７９５．１９９０） 。

ＮＦ　ＡＴはまた、ＮＦ−ＡＴによる転写の活性化のために抗原レセプターを通 して生理学的活性化を必要とする唯一の要素でもある。たとえば、前記要素は、 ＭＭＣ−適合性抗原を提供する細胞による、正確に正しい配列の抗原の適切な提 供の後でのみ活性化される。この効果は、臨界的初期遺伝子を通してＴ細胞をま た活性化できる、イオノマイシン及びＰＭＡの組合せを包含する、薬理学的剤に より模倣され得る。

ＩＬ−２エンハンサ−内の他の要素、たとえばＮＦＫＢ部位又はＡＰ−１部位は 、低い特異的刺激、たとえば腫瘍壊死因子α又は単にＰＭＡ自体に応答して転写 を活性化する。それらの化合物はｒＬ−２遺伝子及び他の初期活性化遺伝子を活 性化せず、そしてＴ細胞活性化に導ひかない。そのような観察は、ＮＦ−ＡＴが ある初期遺伝子、たとえばインターロイキン−２遺伝子の発現をそれらの適切な 生物学的関係に制限する結論を導ひいた。予備データはまた、ＮＦ−ＡＴの選択 的遺伝子欠失が重度の組合された免疫欠損（ＳＣＩＤ）を生成することを示して いる（Ｃｈａｔｉｌｌａ、　Ｔ、など、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、　３ ２０　：　６９６〜７０２゜１９８９）。

上記のように、シクロスポリンＡ　（ＣｓＡ）及びＦＫ５０６は免疫抑制剤とし て作用することができる。それらの剤は、Ｔ及びＢ細胞の活性化、肥満細胞脱顆 粒化及び効果的な免疫応答に不可欠な他の工程を阻害する（参照文献１〜３）。

Ｔリンパ球において、それらの薬物は、免疫応答を調整するサイトカイン遺伝子 へのＴ細胞抗原レセプターからのシグナルの伝達において未知の段階を破壊する （参照文献４〜６）。

ＦＫ５０６及びＣｓＡのための推定上の細胞内レセプターはすでに記載されてお り、そしてシストランスプロリルイソメラーゼであることか見出されている（参 照文献７〜１１）。薬物の結果はイソメラーゼ活性を阻害しく参照文献８．１０ ．１１）　；ところが他のプロリルイソメラーゼインヒビター（参照文献１２） 及び酵母におけるシクロスポリン−耐性変異体の分析は、対応する生物学的活性 が薬物とイソメラーゼとの間で形成される阻害複合体であり、そしてそれ自体イ ソメラーゼ活性自体ではないことを示唆する。

転写因子ＮＦ−ＡＴは、シクロスポリンＡ及びＦＫ５０６の特異的標的であるよ うに思いえる。なぜならば、このタンパク質により指図される転写はそれらの薬 物により処理されるＴ細胞において完全にブロックされ、そして他の転写因子、 たとえばＡＰ−１及びＮＦ−ｋＢに対してほとんど又はまったく効果を及ぼさな いからである（参照文献１５〜１７）。しかしながら、薬物の作用の実際の機構 は不明確である。

不運なことに、両者は可能性ある免疫抑制剤であるが、シクロスポリンもＦＫ５ ０６も理想的な薬物ではない。

たとえばシクロスポリン逆反応は、腎機能障害、身震い、吐き気及び高血圧症を 包含する。実際、長年、研究者は、卓越した交換体の開発を試みてきており、そ してＦＫ５０６が最つども最近の候補体である。シクロスポリン（又はＦＫ５０ ６）が細胞内レベルでいかに機能するかを理解しないでは、改良された免疫抑制 剤の開発は、ひじように制限された成功の可能性を伴って、ひじょうに困難な研 究努力を示す。

従って、シクロスポリン及びＦＫ５０６効果の機能的基礎を理解する有意な必要 性が存在する。そのような知識により、研究工程を劇的に増強できる薬物候補体 をスクリーニングするための改良されたアッセイが達成可能になるであろう。本 発明はそれらの及び他の必要性を満たす。

発明の要約 本発明は、免疫抑制剤についてのスクリーニングにおいて有用な新規方法及び組 成物を提供する。本発明は、ＮＦ−ＡＴが核及び細胞質サブユニットから細胞内 に形成される全体の機構の開発に一部基づかれる。

本発明の１つの観点によれば、新規組成物は、ＮＦ−ＡＴ、ポリペプチド、ＮＦ 　−ＡＴ、ポリペプチド、前記ポリペプチドの混合物及び前記ポリペプチドを含 む細胞抽出物を含む。ＮＦ−ＡＴ、及びＮＦ−ＡＴ、サブユニットは、免疫応答 遺伝子の転写調節ＤＮＡ配列に配列特異的態様で結合する天然のＮＦ−ＡＴ複合 体を形成できる。ＮＦ−ＡＴ、サブユニットは、 ｉ、約４５ｋｄの分子量； ■、Ｔ細胞（たとえばＪｕｒｋａｔ細胞）における誘発性発現；伍、タンパク質 キナーゼＣを活性化できる剤（たとえばＰＭＡ）にＨｅＬａ細胞を暴露すること によるＨｅＬａ細胞における誘発性発現：神、Ｔ細胞におけるＮＦ−ＡＴ、合成 に対してのシクロスポリン及びＦＫ５０６による効果の欠失；及び ｖ、ＮＦ−ＡＴｃへの特異的結合により特徴づけられる。

ＮＦ−ＡＴ、サブユニットは、 ｉ、約９０ｋｄの分子量； ｉ、Ｔ細胞における構成的発現； 伍、細胞におけるＣａ１流れの後、核中に輸送されるべき能力；汁、シクロスポ リン及びＦＫ５０６により阻害される核輸送：及びＶ、　ＮＦ−ＡＴ、への特異 的な結合により特徴づけられる。

本発明のもう１つの観点においては、単離された又は精製された核酸配列（又は それらの相補的配列ＸＮＦ−ＡＴ複合体に結合できる）が提供され、ここで前記 配列は、エンハンサ−１たとえばＩＬ−２及びＩＬ−４エンハンサ−１特に配列 ＡＡＧＡＧＧＡＡＡＡＡに対して実質的に相同である。

もう１つの観点において、本発明は、ＮＦ−ＡＴ、ポリペプチド、ＮＦ−ＡＴ、 ポリペプチド及びそれらの混合物から成る群から選択された成分と免疫調節剤と を組合し；そして前記調節剤が選択された成分に結合するかいづれかを測定する ことを含んで成る、免疫調節剤についてのスクリーニングするための方法を包含 する。

一般的に、免疫調節剤についてのスクリーニング方法は、ｉ、細胞の細胞質にＮ Ｆ−ＡＴｃを含む真核細胞の収集を調製し一註、前記細胞を剤により処理し： 伍、　ＮＦ−ＡＴゆの核トランスロケーションについてアッセイし、ここで核輸 送のブロッキングが前記剤の免疫抑制活性に相互関係する段階を含んで成る。核 トランスロケーションについてアッセイする段階は好ましくは、検出可能なマー カーによりラベルされるＮＦ−ＡＴｃの核存在を測定することを含んで成る。他 方、核トランスロケーションについてアッセイする段階は、好ましくは前記剤に より前もって処理された核を用いて、ＮＦ−ＡＴ、とＮＦ−ＡＴ、との間の核関 連を測定することを含んで成る。

アッセイ段階はまた、細胞におけるｍＲＮＡ転写レベルを決定することによって 、細胞におけるＤＮＡ配列へのＮＦ　−ＡＴの結合を測定することを含んで成り 、ここで前記ｍＲＮＡは免疫応答剤をコードする。

別の態様においては、免疫調節剤についてスクリーンする方法は、ｉ、レポータ ー遺伝子（たとえばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ ）遺伝子）に結合される、ＮＦ−ＡＴ調節されたエンハンサ−領域を含んで成る キメラ遺伝子を構成し；■、Ｔ細胞中に前記キメラ遺伝子を挿入し；蚤、前記剤 の存在又は不在下でＴ細胞活性化化合物により前記Ｔ細胞を処理し；そして 話、前記レポーター遺伝子の発現に対しての前記剤の効果を測定することを含ん で成る。レポーター遺伝子の発現の阻害は、前記剤が免疫抑制剤候補体であるこ とを示す。

さらにもう１つの態様においては、免疫抑制剤候補体についてのアッセイ方法は 、ＮＦ−ＡＴを形成するために、ＮＦ−ＡＴ、及びＮＦ−ＡＴ。

の二量体化を包含する特定の多量体化を可能にする条件下でＮＦ−ＡＴ。

及びＮＦ−ＡＴｃと共に前記剤を混合し、そして前記二量体化（及び／又は他の サブユニットとの多量体化）が生じたかどうかについて決定することを含んで成 る。典型的には、ＮＦ−ＡＴ、又はＮＦ−ＡＴｃが固定され、そして少なくとも １種のサブユニットか検出可能なマーカーによりラベルされ、最つども通常には 、非固定化ＮＦ−ＡＴサブユニットがラベルされる。

図面の簡単な説明 第１図。増殖、クローナル・イクスバンション（ｃｌｏｎａｌ　ｅｘｐａｎｓｉ ｏｎ）および免疫機能に導くか、あるいは細胞の死（アポブトシス）、クローン 検出および寛容性に導く、前期活性化遺伝子に対するＴリンパ球抗原レセプター からの情報を運ぶシグナル伝達経路の表示。Ｔ細胞抗原レセプター（ＴＣＲおよ びＣＤ３複合体を包含する）と主要な組織適合性複合体（ＭＭＣ）により結合さ れた抗原との相互作用から、−次シグナルは発生する。補助シグナル発生分子、 例えば、ＣＤ２．ＣＤ４、およびＬＦＡ−１は一部シグナルを増強する。１９２ ８球を完全に活性化するために要求される二次シグナルは、インターロイキンｌ およびインターロイキン６により提供される。これらの初期のシグナルは、第２ メツセンジヤー、例えば、チロシンホスファターゼ（ＣＤ−４５）　、チロシン キナーゼ（ｌｃｋおよびｆｙｎ）により、ならびにタンパク質キナーゼＣ（ＰＫ Ｃ）および細胞内カルシウムにより提供される。概略的に描写されているように 、免疫抑制薬物、例えば、ＦＫ５０６およびシクロスポリン（ＣｓＡ）ならびに 免疫不全疾患（ＳＣｒＤ）は、ＴＣＰから核へのシグナルの適切な伝達を妨害す る。

第２図。−３２６〜＋４７塩基対のヒトルー２エンハンサ−の線図。ＤＮアーゼ ■保護された領域は、ボックスならびに部位（Ａ−Ｅ）の識別およびこれらの部 位と複合化する１または２以上のタンパク質の名称により記載されている。ボッ クスで示す領域の中に導入された突然変異は、１９２８球の活性化後のＩＬ−２ の転写を著しく減少し、そして残留する野生型（完全な）発現の百分率として示 されている。

矢印は転写開始部位を識別する。

第３図。この線図は、インターロイキン−２遺伝子からのＮＦ−ＡＴ結合部位を 示す。接触グアニンの残基は下のケースの文字により示され、そしてＮＦ−ＡＴ 依存性転写活性の測定に使用する結合部位の構成を３つのＮＦ−ＡＴ結合部位の 列として示す。

第４図。ＮＰ−ＡＴはＴ細胞に冨んでおり、モしてＴリンパ球の活性化後に形成 される。異なる細胞系の中のＮＦ−ＡＴの表示。核抽出物は次のものからである ；　Ｊ、　Ｊｕｒｋａｔ細胞；に、ＫＢ細胞（ＨｅＬａ細胞の誘導体）　；　Ｆ 、　Ｆａｚａ細胞（ラット肝細胞系）：　ＨＳＨｅｐ　Ｇ２細胞（ヒト肝細胞系 ）；　Ｔ、　ＴＥＰＣネズミＢ細胞系；Ｅ、ＥＬ−４ネズミＴ細胞系）：Ｃ，Ｃ ２Ｃｌ２ネズミ筋芽細胞。ｒ−）Ｊと表示するレーンは、ＰＨＡ（２μｇ／ｍｌ ）およびＰＭＡ（５０ｎｇ／　ｍｌ）で２時間処理した細胞からの核抽出物と形 成された複合体である。

第５図。ＮＦ−ＡＴ複合体の核成分はタンパク質合成を必要とするか、ＮＦ−Ａ 、Ｔの細胞質成分はＴ細胞の中に前以て存在している。レーン１および２．１０ ０μＭのアニソマイシンの存在（＋）および不存在（−）下の刺激し／Ｆに５０ ６処理した（Ｓ＋Ｆ）細胞からの核抽出物（１０μｇ）を使用するゲル移動度シ フトアッセイ。レーン３〜６、刺激し／　ＦＫ５０６処理した細胞（アニソマイ シンで前処理したか、あるいはしていない）からの核抽出物と、アニソマイシン で前処理したか、あるいはしていない非刺激細胞から調製した細胞質抽出物との 相補性。矢印は再構成したＮＦ−ＡＴのＤＮＡ結合性複合体の移動度を示す。

第６図。刺激し／　ＦＫ５０６処理したおよびＣｓＡ処理したＪｕｒｋａｔ細胞 の核および細胞質の画分から、ＮＦ−ＡＴ結合活性を定量的に再構成することか できる。（ａ）レーン１〜６において、ＰＭＡ／イノマイシンで非刺激の（ｎｓ ）　、刺激した（Ｓ）細胞、および刺激し／　ＦＫ５０６処理した（ｓ＋Ｆ）細 胞からの核抽出物（１０μｇ）および細胞質抽出物（１０μｇ）を、電気泳動ゲ ルの移動度シフトのアッセイを使用して、ＮＦ−ＡＴ結合活性について試験した 。レーン７〜１０において、核抽出物および細胞質抽出物を混合することによっ て、ＮＦ　−ＡＴを再構成した。刺激し／　ＦＫ５０６処理した（ｓ十Ｆ）核抽 出物（５μｇ）に、下記のものからの細胞質抽出物（５μｇ）を補充した：レー ン７、非刺激（ｎｓ）　：レーン８、刺激した（Ｓ）、レーン９、刺激し／ＦＫ ５０６処理した（ｓ＋Ｆ）：およびレーン１０、刺激し／ラバマイモレ処理した （ｒａｐ）　＠胞。すべての場合において、矢印はＮＦ−ＡＴタンパク質ＤＮＡ 複合体を示す。（ｂ）レーン１〜３において、非刺激細４〜９において、再構成 したＮＦ−ＡＴ結合活性はＤＮＡ結合の特異性を証明する：刺激し／ＦＫ５０６ 処理した細胞（ｓ＋Ｆ）からの核抽出物（５μｇ）を細胞質抽出物（５μｇ）と 混合し、そして１０ｎＨの非標識化ＮＦ−ＡＴまたは突然変異ＮＦ−ＡＴのオリ ゴヌクレオチドを使用して競争を実施した。（ｃ）　ＦＫ５０６の効果をネズミ Ｔ細胞ハイブリドーマ、ＪＫ１２／　９０．１　（ｒａｆ、　２３）について試 験した。レーン１〜３において、非刺激の／　ＦＫ５０６処理した（　ｓ　＋　 Ｆ　）　Ｊｕｒｋａｔ細胞からの核抽出物（１０μｇ）を、ＮＦ−ＡＴ結合活性 について試験した。レーン６は、刺激し／　ＦＫ５０６処理した（　Ｓ　＋　Ｆ 　）　ＪＫ１２／９０．１細胞からの核抽出物中のＮＦ−ＡＴ結合を示す。レー ン４〜５および７〜８において、刺激し／　ＦＫ５０６処理したＪｕｒｋａｔ細 胞またはＪＫ１２／９０．１細胞からの核抽出物（５μｇ）、を、非刺激Ｊｕｒ ｋａｔ細胞またはＪＫ１２／９０．１細胞からの細胞質抽出物（５μｇ）と混合 することによって、ＮＦ−ＡＴを再構成する。（ｄ）レーン１〜３において、非 刺激（ｎｓ）　、刺激した（Ｓ）、および刺激し／シクロスポリンＡした（ｓ＋ Ｃ）細胞からの核抽出物（５μｇ）。刺激し／シクロスポリンＡした（ｓ＋Ｃ） 核抽出物（５μｇ）を、下記のものからの細胞質画分（５μｇ）で補充した・レ ーン、非刺激（ｎｓ）　：レーン５、刺激した（Ｓ）；およびレーン６、刺激し ／シクロスポリンＡした（ｓ−）−Ｃ）細胞。

第７図。ＮＦ−ＡＴの核成分はＨｅＬａ細胞の中に存在し、そしてＪｕｒｋａｔ 細胞質で補足して、ＮＦ−ＡＴ結合活性を再構成することかできるか、ＨｅＬａ 細胞では不可能である。（ａ）レーン１〜６、非刺激（ｎｓ）、刺激した（Ｓ） 、および刺激し／　ＦＫ５０６処理した（ｓ＋Ｆ）細胞からのＨｅＬａの核（１ ０Ｌｔｇ）および細胞質（１０μｇ）抽出物はＮＦ−ＡＴタンパク質’−ＤＮＡ 複合体を形成しない。レーン７〜９において、刺激し／　ＦＫ５０６処理した（ ｓ＋Ｆ））ＩｅＬａ細胞からの核抽出物（５μｇ）とＨｅＬａ細胞質抽出物（５ μｇ）との相同的混合は、ＮＦ−ＡＴを再構成しない。（ｂ）ＮＦ−ＡＴ結合活 性はＨｅＬａ核およびＪｕｒｋａｔ細胞質の抽出物で再構成される。下記のもの から細胞質抽出物（５μｇ）により補足された刺激し／　ＦＫ５０６処理したＨ ｅＬａ細胞からの核抽出物（５μｇ）：Ｉノーン１、非刺激（ｎｓ）　；および レーン３、刺激し／ＦＫ５０６処理した（　ｓ　＋　Ｆ　）　Ｊｕｒｋａｔ細胞 。レーン４〜９において、再構成されたＮＦ−ＡＴ結合性複合体は、１０ｎｇの 非標識ＮＦ−ＡＴまたはＮＦ−ＡＴオリゴヌクレオチドと競争したとき、ＤＮＡ 結合の特異性を証明する。

（ｃ）レーン１〜３、刺激し／ＦＫ５０６処理した（ｓ＋Ｆ）からＪｕｒｋａｔ 核抽出物（５μｇ）と）ｌｅＬａ細胞質抽出物（５μｇ）との異種混合は、ＮＦ −ＡＴ結合活性を再構成しない。

第８図。ＮＦ−ＡＴの核成分はＰＭＡにより誘発されるが、カルシウム仲介シグ ナルはＮＦ−ＡＴの前以て存在する細胞質サブユニットのトランスロケーソヨン を可能とする。（ａ）レーン１および２、ＰＭＡ刺激した（ｐ）およびイノマイ シン刺激した（ｉ）細胞からの核抽出物（１０μｇ）を使用するゲル移動度シフ トアッセイ。レーン３〜８において、ＰＭＡ刺激細胞およびイノマイシン刺激細 胞からの核抽出物（５μｇ）と、非刺激（ｎｓ）　、刺激した（Ｓ）、および刺 激し／ＦＫ５０６処理した（ｓ＋Ｆ）細胞からの細胞質抽出物（５μｇ）との相 補性。刺激し／　ＦＫ５０６処理した（ｓ＋Ｆ）核抽出物（５μｇ）を、下記の ものからの細胞質抽出物（５μｇ）で補足した：レーン９、非刺激（ｎｓ）　； レーン１０、ＰＭＡ刺激（ｐ）；イノマイシン刺激（ｉ）；およびレーン１２、 刺激（Ｓ）細胞。矢印はＮＦ−ＡＴタンパク質ＤＮＡ結合性複合体を示す。

第９図。異なる条件下に刺激された核抽出物の中の［Ｌ−２エンハンサ−または ３つの直列に連鎖したＮＦ−ＡＴ結合部位により指令されたｉｎ　ｖｉｔｒｏ転 写。（ａ）ＩＬ−２指令転写：レーン１１非刺激、レーン２、　ＰＭＡ／イノマ イシン／　ＦＫ５０６処理細胞：およびＰＭＡ／イノマイシン刺激細胞、レーン ３゜ＮＦ−ＡＴ指令転写：レーン４、クデスクブチオンデ（ｃｄｅｓｃｒｉｐｔ ｉｏｎｄｅ）非刺激：レーン５、ＰＭＡ／イノマイシン／　ＦＫ５０６処理細胞 ：レーン６、ＰｌｉｌＡ／イノマイシン刺激細胞。ＩＬ−２エンハンサ−および ＮＦ−ＡＴのＧ欠損（Ｇ−１ｅｓｓ）鋳型からの発現は、それぞれ、４０１およ び３８３ヌクレオチド（ｎｔ）転写体を発生する。アデノウィルスの主要な後期 プロモーター（ＡｄＭＬＰ）の内部対照は２８０ｎ　ｔの転写体を発生する。折 りたたみ誘発（ｆｏｌｄ　１ｎｄｕｃｔｉｏｎ）は、ＡｄＭＬＰ転写に対して基 準化後に計算する。（ｂ）ＮＦ−ＡＴ推進１ａｃＺ　ｍＲＮＡのリボヌクレオチ ド保護アッセイ。レーンｌ、非刺激；レーン２、　ＰＭＡ／イノマイシン刺激； レーン３、ＰＭＡ／イノマイシン／　ＦＫ５０６処理細胞。

第１０図。トランスジェニックマウスの組織におけるＮＦ−ＡＴ依存性Ｔ抗原転 写レベル。Ｔａ、ｇ８系統（Ｖｅｒｗｅｉ　ｊら、ＪＢＣ２６５：　１５７８８ −１５７９５（＋９９０）の６週齢のマウスの組織から、全体のＲＮＡを調製し た。肺臓、胸腺および骨髄細胞をイノマイシン（０，６μＭｌ）およびＰＭＡ（ １０ｎｇ／［＋１１）の存在下に２４時間培養した。１０μｇの各ＲＮＡ試料を ＲＮアーゼ保護アッセイにおいて使用した。プローブとして、１７６ヌクレオチ ドのＰ−３２［識化アンチセンスＮＦ−ＡＴ−Ｔａｇ　ＲＮＡプローブを使用し た。正しく開始されたｍＲＮＡは、４７ヌクレオチドの保護された断片を生ずる 。断片（Ｔｌ）の位置を矢印で示す。

第１１図。ＮＦ−ＡＴの脱リン酸化はＤＮＡの結合を阻害する。レーン１〜５、 ゲル移動度シフトアッセイ。ＰＭＡ／イノマイシン刺激Ｊｕｒｋａｔ細胞からの 核抽出物（１０μｇ）を、仔つシ腸ホスファターゼの存在または不存在下にいく つかのタンパク質ホスファターゼインヒビターとともにインキュベージタンした 。下記の物質の存在下の特性ＮＦ−ＡＴ移動度シフトニレーンｌ、２００μＭの バナジン酸ナトリウム（Ｎａ＊ＶＯ４）　：レーン２．２００μＭのモリブデン 酸ナトリウム（Ｎａ２Ｍ０．４）　；レーン３．１０ｍＭのフッ化ナトリウム（ ＮａＦ）　；レーン４、■単位の仔つシ腸ホスファターゼ＋２００μＭのバナジ ン酸ナトリウム、２００μＭのモリブデン酸ナトリウムおよび１０ｍＭのフッ化 ナトリウム。方法については第６図を参照のこと。矢印はＮＦ−ＡＴタンパク質 ＤＮＡ複合体を示す。

好ましい態様の説明 定義 用語「転写の増強」は、ここにおいて、機能的プロモーターを含有する連鎖した 配列の転写速度を増加する機能的性質を意味するために使用する。

用ＮＦ因子Ｊは、ここにおいて、化合物、化合物の混合物、生物学的高分子、あ るいは生物学的材料、例えば、細菌、植物、菌類、または動物（とくに哺乳動物 ）の細胞または組織から作られた抽出物を意味するために使用する。因子は、後 述するスクリーニングアッセイの中に含めることによって、免疫抑制因子として の潜在的活性について評価する。

用語「免疫抑制因子」および「免疫抑制剤」は、ここにおいて、ヒトにおける免 疫応答、とくに活性化されたＴ細胞により仲介される免疫応答を阻害する機能的 性質を有する因子を互換的に意味するために使用する。

用語「候補の免疫抑制因子」および「候補の免疫抑制剤」は、ここにおいて、Ｔ 細胞の活性化の推定上のインヒビターとして本発明の１または２以上のスクリー ニング法により同定される因子を互換的に意味するために使用する。いくつかの 候補の免疫抑制因子は治療的可能性を有することができる。

用語ｒＮＦ−ＡＴ依存性遺伝子」は、ここにおいて、（１）１０キロ塩基の第１ のコーティングエクソン前記遺伝子内にＮＦ−ＡＴ認識部位を育し、そして（２ ）前記遺伝子のための主要なまたは小さい転写開始部位からの、増加または減少 した、転写の変更された速度を発現する（ここでこのような転写の変更された速 度はＮＦ−ＡＴヘテロダイマーの存在と相関関係をもつ）遺伝子を意味するため に使用する。

用語「変更した変調能力Ｊは、ここにおいて、遺伝子の転写を増強するか、ある いは転写を阻害する能力を意味するために使用する；このような増強または阻害 は特定の事象、例えば、Ｔ細胞の刺激の発生に依存的であることがある。例えば 、限定されないが、ＮＦ−ＡＴ。

タンパク質の発現を妨害する因子は、抗原の刺激に応答してＩＬ−２遺伝子の転 写を変調するＴ細胞の能力を変更するであろう。この変更は、通ｔＴ細胞の刺激 後に続いて起こるルー２遺伝子の転写の増強の阻害として発現されるであろう。

転写の増強または阻害を変調する能力の変更は、遺伝子、例えば、ちょうど記載 したＩＬ−２の誘発可能な転写に影響を与えるか、あるいは遺伝子の基礎的レベ ルの転写に影響を与えるか、あるいは両者であることがある。

好ましい態様の説明 本発明は、連鎖したシスー作用性ＮＦ−ＡＴ部位の存在に依存する転写を変調す る手段ならびに転写的に活性なＮＦ　−ＡＴ複合体の形成を引き起こしかつ防止 し、前期１１２８球活性化遺伝子の発現をコントロールし、そしてヒト免疫不全 ウィルスの転写をコントロールする方法に関する。本発明は、また、新規なメカ ニズムによる核および細胞質のサブユニットからの活性なＮＦ−ＡＴの形成、Ｎ Ｆ−ＡＴの核前駆体の誘発のコントロール、ならびにＮＦ−ＡＴの細胞質前駆体 の核の取り入れのコントロール、ＮＦ−ＡＴの核の取り入れを変調することがで きる方法およびＮＦ−ＡＴの核サブユニットの誘発を防止または増強することが できる方法に関する。本発明の方法は、前期１１２８球活性化遺伝子の発現を決 定またはコントロールするとき、ならびにＴリンパ球の中で有利に発現されるこ とができる選択した構成遺伝子の発現を決定またはコントロールするとき有用で ある。さらに、本発明は、また、ＮＦ−ＡＴの細胞質のサブユニットの核の取り 入れまたはＮＦ−ＡＴの核のサブユニットの誘発を変調する因子のスクリーニン グアッセイの開発に関し、このような因子はこれにより候補の免疫抑制剤として 同定される。

ＩＬ−２遺伝子より上流のＮＦ−ＡＴ　ＤＮＡ結合性部位の特色ある特徴は、そ のプリンに富んだ結合部位５　’　−ＡＡＧＡＧＧＡＡＡＡＡ　−３’である。

Ｔ細胞活性化シグナルに対して応答するいくつかの遺伝子のプロモーター／エン ハンサ−領域のＤＮＡ配列の比較は、推定上のＮＦ−ＡＴタンパク質結合部位を 同定した。このような比較は、ＮＦ−ＡＴまたは関係する族の構成員が他のＴ細 胞活性化依存性遺伝子のプロモーター／エンハンサ−の領域内で結合することが できることを示唆する。これらの遺伝子の大部分は、免疫抑制因子、例えば、Ｆ Ｋ５０６およびシクロスポリンに対して感受性である。推定上のＮＦ−ＡＴ結合 部位のリストを表■に記載する： 表■ ＧＡＡＡＧＧＡＧＧＡＡＡＡＡＣＴＧＴＴＴ　（−２８９〜−２７０）　ヒトＩ Ｌ−２ＣＣＡＡＡＧＡＧＧＡＡＡＡＴＴＴＧＴＴＴ　（−２９３〜−２７４）　 ネズミＩＬ−２ＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡＡＡＴＧＡＡＧＧ　（−１４３〜−１ ２４）　ヒトＩＬ−２ＴＣＣＡＧＧＡＧＡＡＡＡＡＡＴＧＣＣＴＣ（−１４３〜 −１２４）　ヒトｒ［、−４ＡＡＡＡＣＴＴＧＩＧＡＡＡＡＴＡＣＧＴＡ　（− ７１〜−５２）　ヒトｇ−■ＦＮＴＡＡＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＡＣＣＡＧＣＴ　 （−２７０〜２５１）　ＨＩＶ−ＬＴＲＧＣＡＧＧＧＴＧＧＧＡＡＡＧＧＣＣＴ ＴＴ　（−２４１〜−２２２）　ネズミＧＭ−ＣＳＦ（略号：　ＩＬ−２、イン ターロイキン２．ＩＬ−４、インターロイキン４　；　ＨＩＶ−ＬＴＲ、ヒト免 疫不全ウィルスの長い末端の反復、ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球−マクロファージのコ ロニー刺激因子。）他のＮＦ　−ＡＴ特異的核酸結合部位、通常少なくとも約Ｉ Ｏ〜１５０ヌクレオチド（非常に長い配列の一部分であることができる）、とく にｒＬ−２エンハンサ−のＮＦ−ＡＴ　ＤＮＡ結合部位はこれらの配列に対して 実質的に相同的である。通常、このような配列は連鎖した（すなわち、１〜７５ ｋｂ内の）プロモーターにＮＦ−ＡＴ依存性転写の増強を付与し、そしてＮＦ− ＡＴ　ＤＮＡ結合部位に対して少なくとも約８０％相同性、好ましい９０％以上 相同性であり、最も好ましくは同一である。

ＮＦ−ＡＴｃ成分が核へトランスロケーションするのを防止する化合物をスクリ ーニングする方法は、好ましくは、ＮＦ−ＡＴ、がＦＫ５０６およびＣｓＡ処理 したＴ細胞の核の中に入るのを免疫抑制因子、例えば、ＦＫ５０６およびＣ８Ａ が阻害することを観察することに基°づく。この阻害は、ＮＦ−ＡＴ、が核の中 に入るやかことができないようにＮＦ−ＡＴｅ成分を修飾することによって起こ させることができる。こうして、アッセイは典型的にはＴ細胞活性化のとき修飾 されるようになる（例えば、リン酸化により’）　ＮＦ−ＡＴｃのペプチド領域 からなるボリペプチドを包含し、ここでこのポリペプチドを使用してＮＦ−ＡＴ ｅの修飾を阻害または増強する化合物をスクリーニングし、すべては標準的手順 に従い、このような標準的手順は、例えば、Ｔ細胞活性化引き続いて得られた試 料についてポリアクリルアミドゲルの電気泳動を実施し、そして免疫反応性（例 えば、ウェスタンブロッティング）および／またはオートラジオグラフィー（例 えば、修飾かリン酸化である場合３２Ｐ）によりＮＦ−ＡＴ。の相対的移動度を 同定することによって修飾が起こったかどうかを決定することである。

あるいは、Ｔ細胞の核の孔を変更してＮＦＡＴｅが核の中に入るのを防止するこ とができる。このようなアッセイは、核の孔構造を通るＮＦ−ＡＴｅのトランス ロケーションまたはそれとのアソシエーションが起こることができないようにＴ 細胞の核の孔を変更する化合物で前以て処理した核の中に、ＮＦ−ＡＴｅまたは 対応するペプチドかトランスロケーションすることを分析することを包含する。

これらのスクリーニングの方法は、無数の適当なマーカー、例えば、放射線標識 （例えば、　１２５■または”Ｐ）　、種々の蛍光性標識および酵素（例えば、 グルタチオン−３−１ランスフエラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ）の任意の ものてＮＦ　−ＡＴｅまたは対応するペプチドを標識化することを包含すること かできる。基本的な結合アッセイについて望む場合、成分の１つを標準的技術に より固定化することかでき、非固定化成分は典型的には標識化されている。

本発明のスクリーニングアッセイは、単離または精製した形態のこれらのアッセ イ成分を利用することができる。これは、自然の環境（例えば、細胞の細胞質ま たは核の画分）から少なくとも約ｌＯ〜５０％の純度に分離された本発明の核酸 のセグメント、ポリペプチドなどを意味する。実質的に純粋な組成物は、均質性 に近づく、すなわち、約８０〜９０％、好ましくは９５〜９９％の純度のこのよ うな化合物粒球およびマクロファージの前駆体の間の増殖および細胞の寿命のを 包含する。

治療的候補の因子の任意の標準的製剤学的源を使用することができるが、本発明 のスクリーニングアッセイにおける使用に適当な因子の好ましいクラスはマクロ ライド、とくにねじれたアミドペプチジルプロリル結合を示すものである。側毘 、５ｃｈｒｉｅｂｅｒ、　５ｃｉｅｎｃｅ。

２５１、２８３−２８７（１９９１）およびＢａｎｅｒｊｉら、Ｍａｔ、　ａｎ ｄ　Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、　１１゜４０７４−４０８７　（１９９１）。また 、これらの化合物は、好ましくは、細胞溶解性レセプターＦＫＢＰ−１２および ＦＫＢＰ−１３に結合しそしてそれをブロックすることができる。！興、Ｊｉｎ ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ。

Ａ、、　８８．６６７１−６６８１　（１９９１）。本発明の方法を使用してス クリーニングする因子を引き続いて生物学的に試験して、化合物が所望の１ｎｖ ｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏの活性を有するかどうかを決定することができる 。究極的治療的剤は処置すべき宿主に直接投与することができる。治療用配合物 は任意の普通の投与の配合物で投与することができる。活性成分は単独で投与す ることができるが、好ましくは、それは製剤学的配合物として提供される。配合 物は、上に定義した少なくとも１種の活性成分と１種または２種以上の製剤学的 に許容される担体からなる。各担体は、他の成分と適合性でありかつ患者に対し て無障害性であるという意味において、製剤学的および薬理学的に許容されなく てはならない。配合物は治療的に有効な投与量の経口的、経直腸的、経鼻的、ま たは非経口的（皮下、筋肉内、静脈内および皮内を包含する）投与に適当なもの を包含する。配合物は便利には単位投与量の形態で提供することができ、そして 薬学の分野においてよく知られている方法により調製することができる。

Ｔ細胞活性化におけるＮＦ−ＡＴの役割抗原との特別の接触によるＴリンパ球の 中のサイトカインの誘発は、免疫応答と協調する働きをする。サイトカインは、 Ｂ細胞、顆ンスロケーションをブロックする。これらの研究および従来の研究決 定に関係する。

インターロイキン−２遺伝子は、Ｔ細胞の増殖および免疫学的活性化の両者のた めに必須である。ＩＬ−２遺伝子および代表的かつ重要な前期遺伝子をＴ細胞表 面上の抗原レセプターと接続するシグナル発生経路およびそれらの間の伝達経路 は、第１図に図解されている。ＮＦ　ＡＴタンパク質のための結合部位は、イン ターロイキン−２遺伝子および他の前期活性化遺伝子の発現を活性化されたＴリ ンノく球の関係に制限するように思われる。この情報は、Ｄｕｒａｎｄら、１去 の研究に基づく。ＩＬ−２エンハンサ−からのＮＦ−ＡＴ部位の排除は、エンハ ンサ−か機能する能力を著しく減少する。さらに、ＮＦ−ＡＴタンパク質のため の結合部位の列は、連鎖した配列（例えば、リポータ−または毒素遺伝子）の発 現を特定の生物学的環境、顧著には転写的に活性なＮＦ−ＡＴ複合体か形成され る活性化されたＴリンノく球に向けるであろう。

インターロイキン−２エンハンサ−（第２図）内に、２つのＮＦ−ＡＴ部位、近 位および末梢のＮＦ−ＡＴ部位が存在する。これらの配列は第３図に詳細に示さ れている。メチル化の妨害により判定された必須の残基は、下のケースの文字に より示されている。

本発明の基礎は、抗原レセプターからのシグナルが前以て存在する細胞質ＮＦ− ＡＴサブユニット（ＮＦ−ＡＴｅ）を誘発して核にトランスロケーションさせか つ核ＮＦ−ＡＴサブユニット（ＮＦ−ＡＴ、　）と結合させるとき、ＮＦ−ＡＴ （すなわち、ＮＦ−ＡＴｅおよびＮＦ−ＡＴ、からなる複合体）が形成されると いう発見である。シクロスポリンＡおよびＦＫ５０６は、核のサブユニットに影 響を与えないで細胞質成分のトラのもっともらしい合成は、プロリルイソメツー で、ｌ”ｌＸコリｈａ百社クりバク質（ＦＫ−ＢＰ）およびシクロフィリンが、 また、タンノくり質を核に輸送機能をすることを断定する。

ＮＰ−ＡＴ、　、　ＮＦ−ＡＴア、またはタンパク質分解的切断により生産され るそれらの断片をヘテロダイマー化アッセイにおいて使用してＮＦ−ＡＴ複合体 の形成を崩壊する因子を同定することかでき、前記因子はこれにより候補の免疫 抑制薬物として同定される。あるいは、これらのポリペプチドは、ヘテロダイマ ーＮＦ−ＡＴのＮＦ−ＡＴ認識配列への結合を測定するｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセ イにおいて、および／または少なくとも最小のプロモーターおよびＮＦ−ＡＴ認 識配列に連鎖した配列の転写速度を増強するＮＦ−ＡＴの能力を測定するｉｎ　 ＶｉｔｒＯ転写ア・ソセイとともに使用することができる。典型的には、ＤＮＡ へのＮＦ−ＡＴの結合を測定するｉｎ　ＶｉｔｒＯアッセイは、１または２以上 のＮＦ−ＡＴ認識部位の列を含有する二本鎖ＤＮＡを使用する。ＤＮＡは、典覆 的には、当業者に知られている種々の手段の任意のものにより固体の支持体に連 鎖される；このような連鎖は非共有結合（例えば、高度に帯電した合成、例えば 、ナイロン６６）であるか、あるいは共育結合（例えば、典型的にはヌクレオチ ド塩基の中の窒素の位置を含む化学連鎖、例えば、ジアゾ化）であることができ る。典型的には、ＮＦ−ＡＴｅおよび／またはＮＦ−ＡＴ、は放射線標識化アミ ノ酸の組み込みにより標識化される。Ｉ　Ｘ　１０＠Ｍ−’またはそれより大の 対照結合反応において特異的結合を可能とする水性条件（例えば、２０〜１５０ ｍＭのＮａＣ１および５〜１００ｍＭのＴｒｉｓ　ＨＣＩ　ｐＨ６〜Ｂ　）下に 、標識化ＮＦ　−ＡＴタンノくり質を固定化ＤＮＡと接触させる。典型的には、 非標識化競争相手を実施者の指示において選択された種々の濃度で添加すること によって、結合の特異性は確立される。非標識タンパク質競争相手は、次のもの を包含するが、これらに限定されない：非標識化ＮＦ−ＡＴ、ポリペプチド、非 標識化ＮＰ−ＡＴ、ポリペプチド、ウシ血清アルブミン、および咳タンパク質抽 出物。１種または２種以上の因子を添加する結合反応は、因子を含まない対照結 合反応と平行に実施する。対照反応に比較して、ＤＮＡへのＮＦ−ＡＴタンパク 質の特異的結合を阻害する因子は、候補の免疫抑制因子として同定される。また 、ＮＦ−ＡＴへテロダイマーの形成をｉｎ　ｖｉｔｒｏで防止するおよび／また はＮＦ−ＡＴによる転写の増強をｉｎ　ｖｉｔｒｏで防止する因子は、これによ り、候補の免疫抑制薬物として同定される。

本発明の基礎は、抗原レセプターからのシグナルが前板て存在する細胞質のサブ ユニットを誘発して核にトランスロケーションさせかつＮＦ−ＡＴの新しく合成 されたサブユニットと結合させるとき、マルチマーの複合体が形成するという実 験的発見である。次いで、（ＮＰ−ＡＴ、・ＮＦ−ＡＴ、　）ヘテロダイマーを 包含する、機能的マルチマーの複合体の形成は、特定の構造遺伝子、例えば、Ｉ Ｌ−２遺伝子に近い特定のＮＦ−ＡＴ認識配列との相互作用により転写の増強を 促進する。前期遺伝子、例えば、ｒＬ−２遺伝子の転写の増強はＴリンパ球活性 化のプロセスにおいて重要な段階であるので、機能的ＮＦ−ＡＴヘテロダイマー の形成を妨害するおよび／または特定のＮＦ　−ＡＴ認識配列と相互作用するＮ Ｆ−ＡＴを伴う転写の増強を阻害する因子をスクリーニングすることによって、 候補の免疫抑制因子を同定することができる。

本発明のスクリーニングアッセイは、単離または精製された形態のこれらのアッ セイ成分を利用できる。これは、自然の環境（例えば、細胞の細胞質または核の 両分）から少なくとも約１０〜５０％の純度に分離された本発明の精製されたポ リペプチドなどを意味する。

実質的に純粋な組成物は、均質性に近づく、すなわち、約８０〜９０％、好まし くは９５〜９９％の純度のこのような化合物を包含する。

ヘテロダイマー化をアッセイする方法 ＮＦ−ＡＴｃサブユニットへのＮＦ−ＡＴ、サブユニットの結合を減少する因子 、よりとくにこれらの２つのサブユニットの特定のへテロダイマー化を防止する 因子をスクリーニングする方法は、また、新規な候補の免疫抑制因子を同定する ことができる。ヘテロダイマー化のアッセイは、ＮＦ−ＡＴ、およびＮＦ−ＡＴ 、ポリペプチド（天然、断片、または類似体）からなる結合アッセイを包含し、 ここで被験因子を１種または２種以上の結合反応に添加し、そしてヘテロダイマ ーの形成を阻害するか、あるいは結合の親和性を減少するそれらの能力について 試験することができる。これにより、ＮＦ−ＡＴ、サブユニット（またはその断 片）とＮＦ−ＡＴ、サブユニット（またはその断片）との間の分子間結合を妨害 する因子は候補の免疫抑制因子として同定される。

これらのスクリーニング法は、ＮＦ−ＡＴ、　、　ＮＦ−ＡＴ、　、または対応 する断片または類似体を多数の適当なマーカー、例えば、放射線標識（例えば、 　１ｕｌｌまたは０Ｐ）、種々の蛍光性標識または酵素（例えば、グルタチオン −３−１−ランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、及びβ−ガラクトシダーゼ）の 任意のもので標識化することを含むことができる。基本的アッセイについて望む 場合、成分の１つを標準的技術により固定化することができる。例えば、限定さ れないが、このような固定化は固体の支持体、例えば、クロマトグラフィーのマ トリックスに結合するか、あるいは帯電した表面、例えば、プラスチックの９６ ウエルのマイクロタイター皿に結合することによって実施することができる。

態様の１つのクラスにおいて、平行のへテロダイマー化反応を実施し、ここで１ 組の反応は対照として働き、そして少なくとも１つの他の組の反応は種々の量の 因子、因子の混合物、または生物学的抽出物を包含し、それらはＮＦ−ＡＴｅポ リペプチド（天然または断片）およびＮＦ−ＡＴ、ポリペプチド（天然または断 片）との間の対のへテロダイマー化を阻害する能力について試験される。これに より、１種または２種以上の対照反応に関するヘテロダイマー化を阻害する因子 は候補の免疫抑制因子として同定される。

好ましい態様は、リンパ球、とくにＴリンパ球（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞）か ら精製により生産される、ＮＦ−ＡＴ、およびＮＦ−ＡＴｅポリペプチドを使用 するヘテロダイマー化アッセイを包含する。

ＤＮＡ結合アッセイを包含する方法 候補の免疫抑制因子はＮＦ−ＡＴのＤＮＡ結合アッセイにより同定することがで きる。多少の候補の免疫抑制因子は、アセンブリングしたＮＦ−ＡＴ複合体およ び、ある場合において、個々のＮＦ−ＡＴポリペプチドがＤＮＡに結合するのを 阻害する能力を有し、とくにこれはＤＮＡが二本鎖でありそして少なくとも１つ のＮＦ−ＡＴ認識部位の配列を育する場合である（例えば、表■に示すように） 。ＮＦ−ＡＴ複合体またはＮＦ　−ＡＴサブユニットのポリペプチドと標的ＤＮ Ａとの間の特異的結合を検出する種々の手段を使用することができる。ＮＦ−Ａ Ｔ複合体またはＮＦ−ＡＴサブユニットのポリペプチドと標的ＤＮＡとの間の特 異的結合を阻害する因子は、候補の免疫抑制因子として同定される。

ＮＦ−ＡＴ結合アッセイは一般に２つの形態の１つを取る：固定化された標的Ｄ ＮＡを使用して１種または２種以上の標識化ＮＦ−ＡＴタンノくり質を結合する ことができるか、あるいは１種または２種以上の固定化されたＮＦ−ＡＴタンパ ク質を使用して標識化標的ＤＮＡを結合することができる。各場合において、標 的ＤＮＡへの１種または２種以上のＮＦ　−ＡＴタンパク質の特異的結合を可能 とする水性条件下に、標識化高分子（タンパク質またはＤＮＡ）を固定化された 高分子（それぞれ、ＤＮＡまたはタンパク質）と接触させる。特定の水性条件は 普通の方法に従い実施者が選択することができ、このような普通の方法ラン−オ ン転写において使用される方法を包含する（　Ｄｕｎｎら、ＬＢｉｏｌ、Ｃｈｅ ｍ、、　２６３　：　１０８７８−１０８８６　（１９８８）、これをここに引 用によって加える）。しかしながら、好ましい態様は下記の緩衝化水性条件を利 用する：２０−１５０ｍＭのＮａＣ１，５〜５０ｍＭのＴｒｉｓ　ＨＣｌ１ｐＨ ５〜８゜当業者は理解するように、標的ＤＮＡへの１種または２種以上のＮＦ− ＡＴタンパク質の特異的結合か起こるかぎり、これらの基本的結合反応条件つい て付加、欠失、修飾（例えば、ｐＨ）および置換（例えば、ＫＣＩとＮａＣ１と の置換または緩衝液の置換）を行うことができる。対照反応（因子を含まない） を可能としない条件は、ＤＮＡ結合アッセイにおける使用に不適当である。

標的ＤＮＡを固定化する態様において、少な（とも１つのＮＦ−ＡＴ認識部位の 配列を含有する好ましくは二本鎖のＤＮＡを支持体に共有結合的または非共有結 合的に結合する。例えば、限定されないが、ＤＮＡをジアゾ化支持体、例えば、 ジアゾ化セルロース、とくにジアゾフェニルチオエーテルセルロースおよびジア ゾベンジルオキシメチルセルロースに共有結合することができる（Ａｌｗｉｎｅ ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（Ｕ、Ｓ、Ａ、）、　７４：５３５０　（１９７７）　：　 Ｒｅ５ｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、　、　８５　：　Ｓｔｅｌｌｗａｇお よびＤａｈｌｂｅｒｇ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、、８　：　２９ ９　（１９８０）、これらをここに引用によって加える）。あるいは、ＤＮＡを 支持体に部分的紫外線誘発架橋によりナイロン６６またはニトロセルロース支持 体に共有結合することができる（　ＣｈｕｒｃｈおよびＧ１１ｂｅｒｔ、　Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　（Ｕ、Ｓ、Ａ、）、　８１　：　１９９ １（１９８４）、これをここに引用によって加える）。また、例えば、限定され ないが、ＤＮＡをナイロン６６または他の高度に帯電したアニオン性支持体に非 共有結合的に結合することができる（　ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ。

オルニア州）。いくつかの態様において、リンカ−またはスペーサーを使用して 支持体からの潜在的立体的障害を減少することか好ましい。固定化されたＤＮＡ を１種または２種以上の標識化ＮＦ　−ＡＴタンパク質、例えば、ＮＦ−ＡＴ、 　、　ＮＦ−ＡＴｅ、またはＮＦ−ＡＴ、およびＮＦ−ＡＴｅの断片、またはそ れらの複合体（（ＮＦ−ＡＴ、：ＮＦ−ＡＴａ）へテロダイマーを包含する）と 接触させる。

好ましくは、少なくとも１つのＮＦ−ＡＴタンパク質またはＮＦ　ＡＴポリペプ チドの種を検出可能なマーカーで標識化する。適当な標識化は次のものを包含す るが、これらに限定されない：放射線標識化アミノ酸（例えば、Ｃ１４標識化ロ イシン、Ｈ８標識化グリシン、Ｓ　”標識化メチオニン）の組み込みによる放射 線標識化、■Ｉ２ｓまたは１３１　ｒを使用する翻訳後の放射線標識化による放 射線標識化（例えば、Ｂｏｌｔｏｎ　Ｈｕｎｔｅｒ反応およびクロルアミンＴ） 、Ｐ３２を使用する翻訳後のリン酸化（例えばホスホリラーゼおよび無機放射線 標識化リン酸塩、カルシネウリン）、蛍光性標識（例えば、フルオレセインまた はローダミン）の組み込みによる蛍光性標識化、または他のこの分野において知 られている普通の方法による標識化。標識ＤＮＡを支持体への結合により固定化 する態様において、ＮＦ−ＡＴポリペプチドの少なくとも１つの種を検出可能な マーカーで標識化する。

ＮＦ−ＡＴポリペプチドの２またはそれ以上の種、例えば、ＮＦ−ＡＴ。

ポリペプチドおよびＮＦ−ＡＴｅポリペプチドを同時に使用するＤＮＡ結合アッ セイにおいて、少なくとも１つのＮＦ−ＡＴサブユニットのポリペプチドの種を 標識化する。さらに、１より多いＮＦ−ＡＴ種を使用するいくつかの態様におい て、異なる標識を各ポリペプチドについてできるようにすることか好ましい。例 えば、限定されないが、ＮＦ−ＡＴｅポリペプチドをフルオレセインで標識化し 、そして異なる励起波長または放射波長、あるいは両者で蛍光を発する蛍光性マ ーカーでＮＦ−ＡＴ、ポリペプチドを標識化することができる。あるいは、二重 標識のシンチレーションカラターを使用することかでき、ここで１つのＮＦ−Ａ Ｔサブユニットのポリペプチドを１つのアイソトープ（例えば、Ｈ３）で標識化 し、そして弁別技術を使用するシンチレーションカウンティングにより区別する ことかできる異なるアイソトープ（例えば、Ｃｌ４）で第２のＮＦ−ＡＴサブユ ニットのポリペプチドを標識化する。

標識化されたＮＦ−ＡＴサブユニットのポリペプチドを、前述の水性条件下に、 固定化されたＤＮＡ標的と接触させる。選択した条件が因子が存在しない対照反 応において特異的結合を起こさせるかぎり、結合反応のインキュベーションの時 間および温度を変化させることができる。好ましい態様において、少なくとも２ ０°Ｃ１より好ましくは３５〜４２°Ｃの反応温度、および少なくとも１５秒の インキュベーション時間を使用するが、ある態様において、結合の平衡か達成さ れるように、より長いインキュベーション期間が好ましい。結合したＮＦ−ＡＴ ：　ＤＮＡ複合体の結合の反応速度論および熱力学的安定性は、時間、温度、塩 、ｐＨ１および他の反応条件を変化させるとき有効な寛容度を決定する。しかし なから、特定の態様において、所望の反応条件はこの分野において普通の方法を 使用して容易に目盛り定めすることができ、このような方法はスキャッチャード 分析、ヒル（Ｈｉｌｌ）びＣｏｍｐａｎｙ、ニューヨーク）。

固定化ＤＮＡへの標識化ＮＦ−ＡＴタンパク質の特異的結合は、１種または２種 以上の非標識化競争相手のタンパク質（例えば、アルブミン）および／または非 標識化競争相手のＤＮＡまたは競争相手のオリゴヌクレオチドを含めることによ って決定される。結合反応が完結した後、固定化標的ＤＮＡへ特異的に結合する １種または２種以上の榎識化ＮＦ−ＡＴタンパク質が検出される。例えば、限定 されないか、結合のために適当なインキュベーション期間後、非固定化タンパク 質および核酸を含有する水性相を除去し、そして標的およびＤＮＡに結合した標 識化タンパク質を含有する支持体を、必要に応じて１種または２種以上の非標識 化ブロッキング因子を含有する、適当な緩衝液で洗浄し、そしてｌまたは２以上 の洗浄緩衝液を除去する。洗浄後、固定化ＤＮＡに特異的に結合した残留する検 出可能な標識の量を決定する（例えば、光学的、酵素的、オートラジオグラフィ ー、または他の放射線化学的方法により）。

いくつかの態様において、非特異的結合を阻害する非標識化プロスキング剤の添 加を含む。このようなブロッキング剤の例は、次のものを包含するか、これらに 限定されない・仔ウシ胸腺ＤＮＡ、サケ精子ＤＮＡ、酵母ＲＮＡ、混合配列（ラ ンダムまたはシュードランダム配列）種々の長さのオリゴヌクレオチド、ウシ血 清アルブミン、非イオン性洗浄剤（ＮＰ−４０、ツイーン、トリトンＸ−１００ など）、非脂肪ドライミルクのタンパク質、デンハルト試薬、ポリビニルピロリ ドン、フィコール、および他のブロッキング剤。実施者は、彼らの判断において 、ＤＮＡ結合アッセイに含めるべき適当な濃度でブロッキング剤を選択すること ができる：しかしながら、反応条件は対照結合反応においてＮＦ　ＡＴタンパク 質と標的ＤＮＡとの間の特異的結合を可能とするように選択される。固定化ＤＮ Ａへの標識化ＮＦ−ＡＴタンパク質の非特異的結合を阻害するためにおよび／ま たは固定化ＮＦ−ＡＴタンパク質への標識化ＤＮＡの非特異的結合を阻害するた めに、ブロッキング剤を含める。

タンパク質を固定化する態様において、支持体への共有結合または非共存結合を 使用することができる。共有結合の化学は、この分野において知られているよく 特徴づけられた方法を包含するが、こ加える）。１つの例は、限定されないが、 臭化シアンで誘導化された支持体（例えば、ＣＮＢｒ誘導化セファローズ（Ｓｅ ｐｈａｒｏｓｅ）　４　Ｂ）　ヘの共有結合である。支持体への非共有結合は、 帯電した表面へのタンパク質の結合および特異的抗体との結合を包含するか、こ れらに限定されない。典型的には、ＤＮＡは放射線標識化ヌクレオチド（Ｈ３゜ Ｃ”、Ｓ”、Ｐ”）または標識化アビジン（例えば、蛍光性マーカーまたは酵素 的活性を含有するアビジン）により検出可能なビオチニル化ヌクレオチドの組み 込みにより標識化される。

ＮＦ−ＡＴタンパク質は少なくとも３レベルの特異的結合性質を示すことかでき る：（１）ＤＮＡへの結合、（２）二本鎖ＤＮＡへの結合、（３）少なくとも１ つのＮＦ−ＡＴ認識部位の配列を含有するＤＮＡへの結合。各レベルの特異性は 候補の免疫抑制因子のための潜在的標的であることができる。必要に応じて、前 述のＤＮＡアッセイ系を調整して各タイプの結合の特異性をアッセイすることが できる。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写を包含する方法 少なくとも１つのＮＦ−ＡＴ認識配列を含む鋳型ポリヌクレオチドのｉｎ　ｖｉ ｔｒｏ転写を阻害する因子についてスクリーニングする方法は、また、候補の免 疫抑制因子を同定するために使用することができる。

機能的ＣＮＦ−ＡＴ、：ＮＦ−ＡＴｅ）へテロダイマーの存在に依存する１ｎｖ ｉ　ｔｒｏ転写反応は、このようなスクリーニングアッセイのための基礎として 働きをすることができる。このようなアッセイは精製されたＮＦ−ＡＴ、および ＮＦ−ＡＴｃのサブユニット、またはそれらの断片を使用し、これらはＮＦ−Ａ Ｔ認識配列と相互作用しそして連鎖したＮＦ−ＡＴ認識配列および少なくとも最 小のプロモーターからなる鋳型ポリヌクレオチドのｉｎ　ＶｉｔｒＯ転写を増強 することができる機能的ＣＮＦ−ＡＴ、：ＮＦ−ＡＴｅ）へテロダイマーを形成 する能力を保持する。

ＮＦ−ＡＴ依存性ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ転写反応は、有効量のＮＦ−ＡＴへテロダイ マーの添加が１または２以上の転写生産物の量の測定可能な増加を生成しおよび ／またはＮＦ−ＡＴを含有しない平行の対照反応に比較して、転写開始の精度ま たは頻度を増加する反応として定義される。こうして、ＮＦ−ＡＴ依存性転写は 、ＮＦ−ＡＴの存在に起因する全体の転写の部分である。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写 アッセイのための実験条件は、この分野において知られている方法に従い実施者 の判断で選択することができるか、あるいはＦｌａｎａｇａｎおよびＣｒａｂｔ ｒｅｅ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２６７　：９１５　（１９９２）（こ れをここに引用によって加える）に従い実施することができる。

このようなｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写アッセイにおいてＮＦ−ＡＴ依存性転写を阻害 する因子は、これにより、候補の免疫抑制因子として同定される。

例えば、限定されないが、このようなｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写アッセイの１つの態 様は、最小のプロモーターに連鎖した少なくとも１つのＮＦ−ＡＴ認識部位およ びいくつかの追加の下流の転写された配列からなるポリヌクレオチドである転写 鋳型を使用する。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写反応のカクテルは、鋳型のポリヌクレオ チド、ＮＦ−ＡＴｃポリペプチド種（天然または断片）　、ＮＦ−ＡＴ、ポリペ プチド種（天然または断片）、ＲＮＡポリメラーゼ種、好ましくはヒトＲＮＡポ リメラーゼ■、リボヌクレオチド、および転写反応に典型的に含められる他の構 成成分からなる。Ｈｅ１ｎｔｚおよびＲｏｅｄｅｒ、　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇ ｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９８２）、　ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ、ニューヨーク、を 参照のこと。この反応はＦｌａｎａｇａｎおよびＣｒａｂｔｒｅｅ、　Ｊ、Ｂｆ ｏｌ、Ｃｈｅｆｆｌ、、　２６７　：　９１５　（１９９２）に記載されている ように実施することができる。少なくとも１つのりボヌクレオチド種を放射線標 識化する場合、この反応の転写生産物をポリアクリルアミドゲルの電気泳動にか け、そしてオートラジオグラフィーを実施して１種または２種以上の転写生産物 のサイズおよび相対量を同定する。平行のｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写反応を実施し、 ここで反応の１組は対照として働き、そして反応の少なくとも１つの他の組は種 々の量の因子、因子の混合物、または生物学的抽出物を含み、これらは鋳型の１ ｎＶｉｔｒｏ転写を阻害（または増強）する能力について試験される。これによ り、１または２以上の対照反応に関係してｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写を阻害する因子 は候補の免疫抑制因子として同定される。転写を増強する因子は、新規な転写因 子またはＮＦ−ＡＴ仲介の転写の増強に参加する追加のタンパク質因子である。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写アッセイの１つの好ましい態様は、ヒトＩＬ−２遺伝子の 転写開始部位から直ぐ上流の３２５ヌクレオチドであるヌクレオチド配列からな る。

他の好ましい態様は、最小のプロモーターおよび３つのＮＦ−ＡＴ認識配列の連 鎖した直列の列からなる転写鋳型を使用する。

さらに、好ましい態様は、リンパ球から精製により生産されるＮＰ−ＡＴ、およ びＮＦ−ＡＴｃのポリペプチドからなる。ＮＦ　−ＡＴサブユニットのポリペプ チドの生物学的活性は、翻訳後の修飾、例えば、リン酸化を変更することによっ て修飾することができる。ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて、Ｃａ”−およびカルモジュ リン−依存性ホスファターゼ活性、例えば、カルシニューリン（Ｌｉｕら、Ｃｅ １ｌ、　６６　：　８０７−８１５　（１９９１）　；加える）をＮＦ−ＡＴの 生物学的活性を変調するとき含める。したがって、いくつかの態様において、翻 訳後の修飾、例えば、リン酸化（例えば、キナーゼを使用する）または脱リン酸 化（例えば、ホスホリラーゼを使用する）によりＮＦ−ＡＴポリペプチドを変更 することが望ましい。

例えば、限定されないが、ＮＦ　−ＡＴサブユニットをホスホリラーゼおよび無 機リン酸塩とこの分野において知られている普通の反応条件下にインキュベージ コンすることによって、部分的にリン酸化することができる。あるいは、ＮＰ− ＡＴサブユニットのポリペプチドを仔つシ腸アルカリ性ホスファターゼと普通の 反応条件下にインキュベーションすることによって、部分的にリン酸化すること ができる。

ＮＦ−ＡＴポリペプチドまたは凝集したＮＦ−ＡＴ複合体とカルシニューリンと のインキュベーションを、また、使用することができる。このような酵素的処理 により達成されるリン酸化または脱リン酸化の程度は、下記の条件の１または２ 以上を変更することによって実施者の判断において決定することができる：酵素 の濃度、基質の濃度、無機リン酸塩の濃度、インキュベーションの温度および期 間、および当業者に知られている他の反応のパラメーター。

候補の免疫抑制因子 治療的候補の因子の標準の製剤学的源の任意のものを使用できるが、本発明のス クリーニングアッセイにおける使用に適当な因子の好ましいクラスは、マクロラ イド類、とくにねじれたアミドのペプチジルプロリル結合を示すものである。参 照、５ｃｈｒｉｅｂｅｒ、　５ｃｉｅｎｃｅ・２５１　：　２８３−２８７　（ １９９１）。これらの因子は、また、好ましくは細胞溶解性レセプターのＦＫＢ Ｐ−１２およびＦＫＢＰ−１３に結合しかつそれらをブロックすることができる 。参照、Ｊｉｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、、Ａｃａｄ、Ｓｃｆ、　Ｕ。

本発明の方法を使用してスクリーニングする因子を引き続いて生物学的に試験し て、因子が所望のｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏの活性を有するかどう かを決定することができる。究極的治療的因子は処置の投与の配合物で投与する ことができる。活性成分は単独で投与することができるが、好ましくは、それは 製剤学的配合物として提供される。配合物は、上に定義した少なくとも１種の活 性成分と１種または２種以上の製剤学的に許容される担体からなる。各担体は、 他の成分と適合性でありかつ患者に対して無障害性であるという意味において、 製剤学的および薬理学的に許容されなくてはならない。

配合物は治療的に有効な投与量の経口的、経直腸的、経鼻的、または非経口的（ 皮下、筋肉内、静脈内および皮肉を包含する）投与に適当なものを包含する。配 合物は便利には単位投与量の形態で提供することができ、そして薬学の分野にお いてよく知られている方法により調製することができる。

ＮＦ−ＡＴサブユニットに結合するタンパク質の同定および単離ＮＦ−ＡＴ、　 、　ＮＦ−ＡＴ、、（ＮＦ−ＡＴ、：　ＮＦ−ＡＴ、　）へテロダイマー、およ び／またはＮＦ−ＡＴへテロダイマー−ＤＮＡ複合体に結合するタンパク質は、 潜在的に重要な転写調節タンパク質である。このようなタンパク質は新規な免疫 抑制因子のための標的であることができる。

これらのタンパク質はここにおいて補助タンパク質と呼ぶ。補助タンパク質は種 々のこの分野において知られている方法により単離することができる。

補助タンパク質を単離する１つの好ましい方法は、ＮＦ　−ＡＴポリペプチドに 結合する抗体とＮＰ−ＡＴポリペプチドを接触させ、そして生ずる免疫複合体を 単離することによる。これらの免疫複合体は、ＮＦ−ＡＴポリペプチドに結合し た補助タンパク質を含有することができる。補助タンパク質は、免疫複合体を変 性剤、好ましくは、還元剤で変性することによって同定しそして単離することが できる。変性された、好ましくは還元されたタンパク質はポリアクリルアミドゲ ルの電気泳動にかけることができる。推定上の補助タンパク質は、ポリアクリル アミドゲル上で、種々のよく知られている方法（例えば、クーマツシー染色、ウ ェスタンブロッティング、銀染色なと）の１または２以上により同定し、そして 関係する同定されたポリペプチドを含有するポリアクリルアミドゲルの部分の切 除および前記ゲル部分からのポリペプチドの溶離によって単離することができる 。

推定上の補助タンパク質は、このタンパク質がＮＦ−ＡＴ。、　ＮＦ−ＡＴｅ、 ＮＦ　−ＡＴへテロダイマー、および／または（ＮＦ−ＡＴ複合体−ＤＮＡ）集 合体に結合することを証明することによって同定できる。このような結合は、ｉ ｎ　ｖｉｔｒｏで種々の手段により示ことかでき、このような手段は、ポリアク リルアミドゲルの電気泳動法により単離した後、復元された推定上の補助タンパ ク質を使用する結合アッセイを包含するが、これに限定されない。あるいは、組 換えまたは化学的に合成された推定上の補助タンパク質を使用する結合アッセイ を用いることができる。例えば、推定上の補助タンパク質を単離し、そしてその アミノ酸配列のすべてまたは一部分を化学的配列決定、例えば、エドマン分解法 により決定することができる。このアミノ酸配列の情報を使用して、推定上の補 助タンパク質を化学的に合成することができる。また、アミノ酸配列を次のよう にして使用して組換え推定上の補助タンパク質を生産することができる：（１） ｃＤＮＡライブラリーを縮重オリゴヌクレオチドのプローブでアミノ酸配列のデ ータに従いスクリーニングすることによって、推定上の補助タンパク質をエンコ ードするｃＤＮＡクローンを単離する、（２）宿主細胞の中でｃＤＮＡを発現さ せる、および（３）推定上の補助タンパク質を単離する。ＮＦ−ＡＴｃ、　ＮＦ −ＡＴ、　、ＮＦ−ＡＴへテロダイマー、および／またはＮＦ−ＡＴへテロダイ マー−ＤＮＡ複合体にｉｎ　ｖｉｔｒｏ結合する推定上の補助タンパク質は、補 助タンパク質として同定される。

また、補助タンパク質は、２官能性架橋試薬（例えば、ジメチルスペルイミデー ト、グルタルアルデヒドなど）とｉｎ　ｖｉｖｏ架橋し、そしてＮＦ−ＡＴポリ ペプチドを含む架橋された生産物を引き続いて単離することによって同定するこ とができる。好ましくは、２官能性架橋試薬は、架橋した複合体の単離後、特定 の条件下に復帰して、ＮＦ−ＡＴポリペプチドからの補助タンパク質の単離を促 進する架橋体を生成するであろう。ＮＦ−ＡＴポリペプチドを含む架橋した複合 体の単離は、好ましくは、ＮＦ−ＡＴポリペプチドに少なくともＩ　Ｘ１０’Ｍ −’の親和性で結合する抗体を架橋した複合体の集団に結合させ、そしてその抗 体に少なくともＩＸ　１０７Ｍ−’の親和性で結合する複合体のみを単離するこ とによって達成される。ＮＦ−ＡＴポリペプチドに架橋するポリペプチドは、補 助タンパク質として同定される。

ＮＦ　−ＡＴサブユニットの抗体の生産および応用ＮＦ−ＡＴ、およびＮＦ−Ａ Ｔａのサブユニット、またはそれらの断片を使用して動物を特異的抗体の生産の ために免疫化することができる。

これらの抗体はポリクローナル抗血清からなるか、あるいはハイブリドーマ細胞 により生産されるモノクローナル抗体からなることがＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、コ ールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク（これをここに引用によって加え る）これらをここに引用によって加える）を参照のこと。

例えば、限定されないが、精製したＮＦ−ＡＴ、タンパク質をアジュバントと一 緒にマウスに注射して免疫応答を発生させることかできる。組換え断片に少なく ともＩ　Ｘ　ＩＯ”Ｍ−’の親和性で結合するネズミ免疫グロブリンを免疫化し たマウスから収穫し、そしてアフイニティクロマトグラフィーまたは他の手段に よりさらに精製することかできる。さらに、牌細胞をマウスから収穫し、そして 骨髄腫細胞１毒に融合して抗体分泌ハイブリドーマ細胞のバンクを生産すること かできる。組換え的に生産された断片に少なくともＩ　Ｘ　１０”Ｍ−０の親和 で免疫グロブリンを分泌するクローンについて、ハイブリト−マのこのバンクを スクリーニングすることができる。

これらの抗体のいくつかの応用、例えば、免疫抑制転写生産物の同定ために、所 望の抗血清または１種または２種以上のモノクローナル抗体は単一特異性てはな い。これらの場合において、抗原として全サブユニットを使用するよりむしろＮ Ｆ−ＡＴサブユニットの断片を使用することが好ましい。さらに詳しくは、目的 か特定の構造の部分、例えば、ＤＮＡ結合性ドメインからなる免疫交差反応性ポ リペプチドを同定することである場合、抗原として関係するＮＦ−ＡＴサブユニ ットの中の同程度の構造的ドメインの一部分またはすへてに相当する断片を使用 することが好ましい。ＮＦ−ＡＴサブユニットの構造的ドメインに相当する特定 の断片の生産は、精製した天然サブユニットのタンパク質分解的消化により達成 される。

本発明の広い範囲は以下の実施例を参照すると最もよく理解されるであろう。こ れらの実施例は本発明を限定しない。

実施例Ｉ ＮＦ−ＡＴは活性化されたＴ細胞の中で濃縮されるＤＮＡ結合アッセイを使用し て、いくつかの刺激した細胞系および非刺激の細胞系からの核抽出物の中に存在 するＮＦ−ＡＴの量を決定したＮＦ−ＡＴ結合部位に相当する放射線標識化オリ ゴヌクレオチドのプローブを、濃縮した核抽出物に対してハイブリダイゼーショ ンして、存在するＮＦ−ＡＴのＤＮＡ結合活性を決定した。

手順 核抽出物は０ｈｌｓｓｏｎおよびＥｄｌｕｎｄ　（Ｃｅｌｌ　４５　：　３５　 （１９８６））の手順に従いつくった。簡単に述べると、核を０．３Ｍの（ＮＨ ４）２Ｓ０４で抽出し、そして核タンパク質を含有する画分を０．”ｇ／ｍ＋Ｉ の（ＮＨ，）２ＳＯ。

で沈澱させ、そして４℃において４時間透析した。ＩＬ−２エンハンサ−のＮＦ −ＡＴ結合部位（−２９０および−２６３）を結合アッセイのためのプローブと して使用した。結合実験は、Ｓｈａｗ、　Ｊ、Ｐ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４　： ２０２−２０５　（１９８８）に本質的に記載されているようにして実施した。

結果 第４図に示すように、簡単なゲル移動度シフトアッセイを使用して、複合体はＮ Ｆ−ＡＴのＤＮＡ結合性配列活性化Ｔ細胞の核抽出物の中に存在するおよびタン パク質と形成するが、非活性化Ｔ細胞または他のタイプの細胞の抽出物と形成し ない。Ｔ細胞活性化因子のＰＭＡおよびＰＩ（Ａで刺激されたＪｕｒｋａｔ　Ｔ 細胞系からの核抽出物のみは、検出可能な量のＮＦ−ＡＴ特異的ＤＮＡ結合活性 を含有した。

実施例■ タンパク質合成はＮＦ−ＡＴ複合体の核および細胞質の成分の形成に必要である かどうか、あるいはタンパク質が細胞の中に絶えず存在するかとうかを決定する ために、タンパク質合成のインヒビターの存在または不存在下に活性化された細 胞からの核抽出物および細胞質抽出物から再構成されたＮＦ　−ＡＴ複合体を使 用して、ＮＦ−ＡＴ特異的ＤＮＡ結合アッセイを実施した。

手順 ＮＦＡＴＺ　Ｊｕｒｋａｔ細胞を、　１００μＭのアニソマイシン（Ｓｉｇｍａ ）　、すなわち、タンパク質合成のインヒビターで３０分間前処理した後、細胞 を刺激した。細胞を活性化しそして核抽出物および細胞質抽出物を調製する条件 は、実施例■に記載されている。

結果 第５図に示すように、タンパク質合成のインヒビターは活性化Ｔ細胞の中のＮＦ 　−ＡＴ複合体の出現を完全に阻害した（レーン２，４゜６）。これにより証明 されるように、ＮＦ−ＡＴ複合体の核成分はＴ細胞の活性化のとき新しく合成さ れる。対照的に、タンパク質合成のインヒビターの存在または不存在下に成長し た細胞から調製された細胞質抽出物は、ＮＦ−ＡＴ複合体を再構成することがで きた（レーン３〜６）。こうして、ＮＦ−ＡＴ複合体の細胞質は刺激前に細胞の 中に前以て存在し、そしてＮＰ−ＡＴｃの追加の新規のタンパク質合成は不必要 である。

インターロイキン−２遺伝子ならびにほとんどの前期Ｔ細胞活性化遺伝子の活性 化はタンパク質合成をまた必要とするので、これらの観察は前期遺伝子の活性化 におけるＮＦ−ＡＴについての優勢の役割と一致する。

実施例■ ＮＦ−ＡＴは細胞質および核のサブユニットから再構成することができ胞内に封 鎖または隔離され、そして細胞を破壊すると、多少の転写的に活性なＮＦ　−Ａ Ｔが形成される。この仮説を試験するために、刺激したＴ細胞および非刺激のＴ 細胞からの細胞質抽出物および核抽出物から、ならびにちょうど刺激前にＦＫ５ ０６で処理した細胞から、再構成されたＮＦ−ＡＴ複合体のＤＮＡ結合能力を試 験した。

手順 ＮＦＡＴＺ　Ｊｕｒｋａｔ細胞およびＪＫ１２／９０．１細胞（Ｎ、　５ｈａｓ ｔｒｉから提供された）を、２０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡおよび２μＭのイノマイシ ンで２時間刺激した。ＮＦ−ＡＴの形成を定量的にブロックするために、　１１ ００ｎ／ｌｌｌ１のＦＫ５０６または５００μｇ／ｍｌのＣ５Ａ（Ｓａｎｄｏｚ ）を、毒性効果を細胞を与えないで、　ＰＭＡおよびイノマイシンの添加の５分 前に、使用した。核抽出物を前述したように変更を加えて調製した。細胞質抽出 物を核抽出物と同一の細胞からつくった。細胞を緩衝液Ａ　Ｃ１００ｍＭのＨｅ ｐｅｓ（ｐＨ７，８）　、１５ｍＭのＣＫＩ、２ｍＭのＭｇＣ１ｔ、１ｍＭのＤ ＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ｍＭのＰＭＳＦ）　＋０．０５％のＮＰ− ４０で溶解しそして核を沈澱した後、細胞質両分を取り出し、そして１０％（Ｖ 　／　Ｖ　）のグリセロールおよび１／１０体積の緩衝液Ｂ　（０，３ＭのＨｅ ｐｅｓ（ｐＨ７，８）、１．４ＭのＫＣＩおよび３０ｍＭのＭｇＣ１ｚ）で安定 化した。細胞質抽出物を２００．０００ｇにおいて１５分間遠心した。等しい体 積の３Ｍの（ＮＨ，）、ＳＯ，（ｐＨ７，９）を上澄み液に添加し、そして沈澱 したタンパク質を１００．０００　ｇにおいて１０分間遠心沈降させた。沈降し た細胞質タンパク質を緩衝液Ｃ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＦｌ　７．８）　、 ５０ｍＭのＫＣＩ、ｌｄのＤＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ。

０．１ｄのＰＭＳＦ、　１０％（ｖ／ｖ）のグリセロールコノ中に再懸濁サセ、 モしてＰ６ＤＧカラム（ＢｉｏＲａｄ）上に脱塩した。タンパク質の濃度をバイ オラド（ＢｉｏＲａｄ）のタンパク質アッセイキットを使用して決定した。核お よび細胞質の分画の完結を評価するために、０ｃｔ−１（構成釣橋はＤＮＡ結合 性タンパク質を配置する）結合活性およびβ−ガラクトシダーゼ（局在化した細 胞質）酵素活性について評価した。

細胞質の両分の中に結合アッセイは発見されず、そしてβ−ガラクトシダーゼ活 性は細胞質ゾルの中に核の画分の中より３．７倍高い濃度で存在することが発見 された。電気泳動の移動度シフトのアッセイを本質的に従来記載されているよう に実施した。Ｆｒ１ｅｄ、　Ｍ、およびり、Ｍ、Ｃｒｏｔｈｅｒｓ　ＮＡＲ９： 　６５０５−６５２６　（１９８１）。結合反応を従来記載されているように実 施した。Ｐｉｅｒｉｎｇ、　Ｓ、ら、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｉｖ、　４１８２３−１８ ３４　（１９８１）。各結合反応において使用したタンパク質の合計量はＩＯμ ｇであった。ＮＦ−ＡＴのための末端標識化された結合部位をヒトｒＬ−２エン ハンサ−から誘導化した（　−２８５〜−２５５ｂｐ）。オリゴヌクレオチド配 列は５　’　−ｇａｔｃＧＧＡＧＧＡＡＡＡＡＣＴＧＴＴＣＡＴＡＣＡＧＡＡＧ ＧＧＧＴ　−３’である。突然変異のＮＦ−ＡＴプローブはＮＦ−ＡＴのオリゴ ヌクレオチドと４つの接触グアノシン残基において本質的に異なる。この配列は ５　’　−ｇａｔｃＡＡＧＡＡＡＧＧＡＧｔＡＡＡＡＡａＴｔＴＴＴａＡＴＡＣ ＡＧＡＡ　−３’である。より低いケースの文字は突然変異した残基を示す。１ ０ｎｇの非標識化オリゴヌクレオチドとの競争は、標識化プローブを越えた１０ ０〜２００倍モル過剰を表す。

結果 刺激し／　ＦＫ５０６処理した細胞から調製した核抽出物において、ＮＦ−ＡＴ 結合活性は実質的に減少し、そして細胞質の画分の中に観察されない（第６Ａ図 、レーン３および６）。顕著なことには、刺激し／　ＦＫ５０６処理した細胞か らの核抽出物を、非刺激の、または刺激し／　ＰＫ５０６処理した細胞（それら のいずれもＮＦ−ＡＴ結合活性をもたない）からの細胞質の画分と混合すること によって、結合活性は完全に再構成された（第６Ａ図、レーン７お！び９）。再 構成されたＤＮＡ−タンパク質複合体の移動度はＮＦ−ＡＴ複合体の特性移動度 よりわずかに速いが、ＤＮＡ結合の特異性は同一である（第６Ｂ図、レーン４〜 ９）。非刺激細胞からの核抽出物はいずれの細胞質抽出物によっても補足されず （第６Ｂ図、レーン１〜３）細胞の刺激がＮＦ−ＡＴの核成分の合成に必須であ ることを示唆する。

非刺激細胞および刺激し／　ＦＫ５０６処理した細胞からの細胞質抽出物はＮＦ −ＡＴ複合体を再構成することができるが、刺激した細胞からの細胞質抽出物は ＮＦ−ＡＴ結合活性の部分的再構成のみを示しく第６Ａ図、レーン８）ＮＦ−Ａ Ｔの細胞質成分か非刺激細胞質抽出物の中に前以て存在し、そしてＦＫ５０６の 不存在下の刺激後に核にトランスロケーションされることを意味する。

ＦＫ５０６の非特異的効果についての対照としてラバマイシンをわれわれは使用 した。ラバマイシンはＦＫ５０６の構造的類似体であり、そしてＦＫ５０６に似 て、ねじれたロイシル−プロリルアミド結合の構造的類似性を含存し、ＰＫ−Ｂ Ｐに結合し、そしてそのイソメラーゼ活性を阻害する（参考文献１２．１２．２ ０）。ラバマイシンはイソメラーゼ活性を阻害するという事実にかかわらず、そ れはＮＦ　−ＡＴ特異的転写へのＦＫ５０６の作用ＩＬ−２遺伝子の活性化、Ｔ 細胞の活性化、およびプログラミングされた細胞の死に拮抗する（参考文献１３ ．２１．２２）。

ラバマイシンは活性後の核へのＮＦ−ＡＴの細胞質成分のトランスロケーション をブロックしない（第６Ａ図、レーン１０）。これはそれがＮＦ−ＡＴ特異的転 写をブロックできないことと一致する（参考文献１７）。

障害された核の取り入れかまた免疫抑制的プロリルイソメラーゼインヒビターＣ ｓＡの性質であるかどうかを決定するために、われわれはＣｓＡの効果を試験し た。免疫応答へのＦＫ５０６およびＣｓＡの生物学的作用は本質的に同一である （参考文献２３）。ＣｓＡはＴ細胞の中のＮＦ−ＡＴ特異的転写を完全にブロッ クし、そしてＣｓＡの存在下に刺激された細胞の抽出物は刺激された対照よりす くないＮＦ　−ＡＴ結合活性を含有する（参考文献１６）。したがって、刺激さ れたＣｓＡ処理細胞からの核抽出物と同一細胞または非刺激細胞からの細胞質抽 出物との混合はＮＦ−ＡＴ結合活性を再構成する（第６Ｃ図、レーン４〜６）。

再び、非刺激核抽出物はいずれの細胞質抽出物によっても補足されない（第６Ｃ 図、レーン１〜３）。こうして、これらの結果が示唆するように、ＣｓＡおよび ＦＫ５０６の両者はＮＰ−ＡＴのＤＮＡ結合性複合体の一部分を構成する前以て 存在する細胞質成分のトランスロケーションをブロックする。

実施例■ ＮＦ　−ＡＴ（ＮＦ　−ＡＴｃ）の細胞質形態はＴ細胞の中で選択的に発現され るＣｓＡおよびＦＫ５０６の作用は組織特異的であるという事実にかかわらず、 これらの結合性タンパク質は偏在する（参考文献２７〜３１）。

この明らかな苦境は、薬物−イツメラーゼがＴ細胞特異的分子に作用した場合、 理論的に説明できるであろう。ＮＦ−ＡＴ複合体の成分かＴ細胞以外の細胞のタ イプの中に見いだされるかどうかを決定するために、ＨｅＬａ細胞の核抽出物ま たは細胞質抽出物を単独であるいはＪｕｒｋａｔ細胞からの抽出物と組み合わせ て使用して、ＮＦ−ＡＴ複合体を再構成できるかどうかをわれわれは試験した。

手順 ＨｅＬａ　Ｓ３細胞を、スピンナーフラスコの中で３７°Ｃにおいて、５％の胎 児仔ウシ血清、ペニシリン（１，ＯＯＵ／ｍｌ）および１００ストレプトマイシ ンを補充したＳ−ＭＥＭ　（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）中で成長させた。ＨｅＬａ　 Ｓ３を刺激し、核抽出物および細胞質抽出物を調製し、そしてゲル移動度シフト アッセイを第６図に記載する条件と同一の条件下に実施した。

結果 ＨｅＬａ細胞質抽出物はＮＦ−ＡＴを含有せず、そして核抽出物および細胞質抽 出物の相同的混合はＮＦ−ＡＴを含有せず、モしてＨｅＬａ細胞からの核抽出物 および細胞質抽出物の相同的混合はＮＦ−ＡＴ結合活性を再構成することかでき なかった（第７Ａ図、レーン１〜９）。対照的に、Ｊｕｒｋａｔ細胞質抽出物と ＨｅＬａ細胞からの核抽出物の異種混合はＮＦ−ＡＴ結合活性を再構成した（第 ７Ｂ図、レーン１〜３）。さらに、再構成されたＮＦ−ＡＴ結合活性は、オリゴ ヌクレオチドの競争により証明されるように、特異的である（第７Ｂ図、レーン ４〜９）。これらの結果はオリゴヌクレオチドの競争を示唆する（第７Ｂ図、レ ーン４〜９）。これらの結果か示唆するように、ＮＦ−ＡＴの核成分はＨｅＬａ 細胞の中に存在する。対照的に、ＨｅＬａ細胞の細胞質抽出物は、刺激し／　Ｆ Ｋ５０６処理したＪｕｒｋａｔ細胞からの核抽出物と混合したとき、ＮＦ−ＡＴ 結合活性を再構成することができず（第７Ｃ図、レーン１〜３）細胞質成分がＴ 細胞特異的であるが、ＮＦ−ＡＴの核成分はそうではないことを意味する。

実施例Ｖ ＦＫ５０６およびＣｓＡの作用の１つにする特徴は、それらかＣａ２＋移動化を 必要とするプロセスを阻害するということである（参考文献１７゜２４〜２６） 。ＮＰ−ＡＴ結合および転写活性の誘発は、細胞内Ｃａトを増加しかつタンパク 質キナーゼＣ（ＰＫＣ）を活性化する因子がまねると信じられる生理学的刺激を 必要とする（参考文献１５）。

ＮＦ−ＡＴの核および細胞質のサブユニットの誘発のための要件を検査するため に、ＰＭＡ単独またはイノマイシン単独で刺激した細胞から抽出物を調製し、そ してＤＮＡ結合活性を再構成するそれらの能力について試験した。

手順 ゲル移動度シフトおよび核抽出物および細胞質抽出物の調製を、実施例■に記載 するように実施した。

結果 イノマイシン処理した細胞からの細胞質抽出物は、刺激しＦＫ５０６処理した細 胞の核抽出物に添加したとき、非刺激細胞からの細胞質抽出物、ＰＭＡ刺激した 細胞からの細胞溶解性抽出物またはＰＭＡおよびイノマイシンの両者で刺激した 細胞からの細胞溶解性抽出物よりも低い、ＤＮＡ結合を再構成する能力を示す（ 第８図）。ＦＫ５０６処理は、ＰＭＡ／イノマイシン刺激した細胞がＮＦ−ＡＴ の核成分を合成するのを阻害しなかった（第８図、レーン９〜１２）。さらに、 ＰＭＡ刺激細胞またはイノマイシン刺激細胞からの細胞質抽出物と刺激し／ＦＫ ５０６処理した細胞からの核抽出物との混合はＮＦ−ＡＴのＤＮＡ結合活性を再 構成することができず（第８図、レーン４および７）、前以て存在する細胞質の サブユニットは核にトランスロケーションした。

こうして、ＣｓＡおよびＦＫ５０６はＮＦ　ＡＴの細胞質成分のＣａ”依存性ト ランスロケーションを阻害するように思われる。

実施例■ ＦＫ５０６はＮＦ　ＡＴ依存性転写ｉｎ　ｖｉｔｒｏを阻害しない刺激した細胞 または刺激し／　ＦＫ５０６処理した細胞からの核抽出物を調製し、そして転写 が合成プロモーター内に位置する３つのＮＦ−ＡＴ部位に依存するＧ欠損カセッ トを転写する能力を試験することによって、ＮＦ−ＡＴの転写を指令する能力へ のＦＫ５０６の作用を試験した。

手順 プロモーターの構成体、核抽出物および転写反応を記載したように調製した。ヒ トＴ細胞白血病から誘導化されたＮＦＡＴＺ　Ｊｕｒｋａｔ細胞を、２０ｎｇ／ ｍｌのＰＭＡ　（Ｓｉｇｍａ）　、２　ｕＭのイノマイシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈ ｅｍ）で２時間刺激した。ＦＫ５０６をＩＯｎｇ／ｍｌで使用し、そしてＰＭＡ およびイノマイシンの添加の５分前に添加した。ＮＦ　−ＡＴ／　ｌ　ａｃＺの ｍＲＮＡのリボヌクレアーゼ保護アッセイを、従来記載されているように実施し た。放射線分析画像形成システム（ＡＭＢＩＳ）を使用して、転写体を定量した 。

ヒトＪｕｒｋａｔ　Ｔ細胞系（１８）を使用して、われわれは活性化依存性Ｔｍ 胞特異的ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写システムを開発し、このシステムは［Ｌ−２転写 およびより一般的にＴ細胞活性化のための複雑な要件を正確に反映する。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写プロトコル 手順 細胞培養および刺激の条件 Ｌ−グルタミンを含まず、８％の胎児仔ウシ血清（ＦＣＳ）（ｌｒｖｉｎｅＳｃ ｉｅｎｔｉｆｉｃ）　、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）およびストレプトマイ シン硫酸（１００μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭ１１６４０の中で、５％のＣＯ□濃 度において、Ｊｕｒｋａｔ細胞を成長させた。細胞を刺激の３６時間前に１＝３ に分割した。刺激の朝、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＩＸＩＯ’細胞／　ｍ　Ｉ　）を３ ５０Ｏｒｐｍ（２００Ｘｇ）においてＧＳ−ローターの中で１０分間遠心し、次 いで新鮮な培地の中に２Ｘ１０”細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させた。一般に、２ μＭのイノマイシン（Ｃａｔｂｉｏｃｈｅｍ）および２０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ　 （Ｓｉｇｍａ）を使用して細胞を刺激した。２時間の刺激の間に、細胞を絶えず 震盪してフラスコの底上に細胞が層状になるのを防止した。

８％のＧＣＳ、ペニシリン（１００単位／ｍｌ）およびストレプトマイシン硫酸 （１００μｇ／ｍｌ）および２ｍＭのし一グルタミンを含むＳ−ＭＥＭ（Ｇｉｂ ｃｏ）中で、ＨｅＬａ　Ｓ３を成長させた。

プラスミドの構成 ポリメラーゼ連鎖反応オーバーラツプ伸長技術（Ｈｏｒｔｏｎ、　Ｒ，Ｍ、ら、 Ｇｅｎｅ　７７　：　６１−６８１９８９　；　Ｈｏ、　Ｓ、Ｎ、ら、Ｇｅｎｅ 　７７　：　５１−５９１９８９）を使用して、ＩＬ−２エンハンサ−（−３２ ６〜＋２４）をＲ，Ｒｏｅｄｅｒ（Ｓａｗａｄｏｇ。

およびＲｏｅｄｅｒ、　１９８５）により提供された３７７塩基対（ｂｐ）のＧ 欠損カセットに融合することによって、ＩＬ−２Ｇ欠損プラスミドを構成した。

Ｘｈｏ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ断片上に含有された［Ｌ−２エンハンサ−〇欠損カセ ットを、ポリリンカーの中にＸｈｏ　ｒ部位を含有するｐＵＣ誘導体の中に挿入 した。ＰＣＲ人工物を回避するために、全体のＩＬ−２エンハンサ−Ｇ欠損カセ ットを配列決定した。ｒＬ−２エンハンサ−Ｇ欠損転写体の全体のサイズは４０ １ヌクレオチド（ｎｔ）である。１）Ｅ３．１およびｐＡ４．１（Ｄｕｒａｎｄ ら、１９８８）を、それぞれ、Ａｓｐ７１８およびＢａｍＨＩで消化し、そして 断片をＡｓｐ７１８−　ＢａｍＨＩ消化τ−フィブリノゲンＧ欠損カセット構成 体に結合することによって、３つのＮＦＡＴ結合部位（−２８６〜−２５７）を 含有するＮＦ−ＡＴマルチマーおよび４つのＮＦ−ＩＬ−２Ａ結合部位（−９４ 〜−６５）Ｇ欠損カセットを含有するＮＦ−ＩＬ−２Ａマルチマーを作った。τ −フィブリノゲンプロモーターの−５４〜＋　ｌ　（Ｇｒａｂｔｒｅｅ、　Ｇ、 Ｒ，およびＫｅｎｔ、　Ｊ、Ａ、　Ｃｅ１ｌ　３１　：　１５９−１６６１９８ ２　；Ｄｕｒａｎｄら、１９８７）を３７７ｂｐのＧ欠損カセットにＰＣＲオー バーラツプ伸長技術を使用して融合することによって、τ−フィブリノゲンＧ欠 損を構成した。セクエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）　ＤＮＡ配列決定キット（ Ｕ、　Ｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を使用して、ＰＣＲ技術により作った構 成体のすべての領域を配列決定して点突然変異を回避した。τ−フィブリノゲン プロモーターは、Ｓｐｌ結合およびＴＡＴＡボックスを含有する最小プロモータ ーである。τ−フィブリノゲンプロモーターの＋１とＧ欠損カセットとの間に、 Ｓｓｐ　Ｉ制限酵素部位を挿入した。両者のＡＴＴＥ−２およびＡＴＴＥ−１の Ｇ欠損構成体は３８３ｎｔの転写体を発生する。

ラットβ−フィブリノケンプロモーター（−７７〜−６５）（Ｃｏｕｒｔｏｉｓ ら、１９８７）からの直列に連鎖されたＮＦ−１結合部位をτ−フィブリノゲン Ｇ欠損構成体の中のＸｈｏ−Ｓａｌポリリンカ一部位の中に挿入することによっ て、ＩＮＦ−１（肝細胞核因子１）Ｇ欠損プラスミドを構成した。アデノウィル スの主要な後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）　Ｇ欠損構成体は、Ｍ、　Ｓａｗａ ｄｏｇａおよびＲ，Ｒｏｅｄｅｒ博士により提供された。

ＡｄＭＬＰのＧ欠損転写体の全体のサイズは２８０ｎ　ｔである。

核抽出物の調製 多少の例外を育するが、Ｇｏｒｓｋｉら（Ｇｏｒｓｋｉら、１９８６　：　Ｍａ ｉｒｅら、＋９８９）により本質的に記載されているようにして、Ｊｕｒｋａｔ および肝臓のｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写核抽出物を作った。第１に、細胞を１．５Ｍ のスクロース−グリセロール溶液の中で破壊して、細胞溶解の間に発生する摩擦 熱の量を減少した。第２に、従来記載されているように（Ｍａｉｒｅら、１９８ ９）、０．５％（Ｖ／Ｖ）の脂肪不合ドライミルクをホモジナイゼーション緩衝 液に添加した。第３に、Ｊｕｒｋａｔ核を塩抽出前にただ１つの２．０Ｍのスク ロースのパッド上で分画した。簡単に述べると、すべての操作は冷い環境の中で 実施し、そしてすべての溶液、管、および遠心機を４°Ｃに冷却した。透析緩衝 液を除外したすべての緩衝液に、プロテアーゼインヒビター、アンチパイン（１ Ｍｇ／ｍｌ）　、ロイペプチン（ｌμｇ／ｍｌ）　０．１ｍＭのフッ化フェニル メチルスルホニル（ＰＭＳＦ）および０．１ｍＭのベンズアミジンを添加した。

１ｍＭのジチオスレイトールをすべての緩衝液に添加した。Ｊｕｒｋａｔの場合 において刺激後、細胞（１０’）をＧＳ−３ローターの中で３５０Ｏｒｐｍ（２ ０００ｘｇ）で１０分間遠心した。培地を注ぎ出し、そして細胞を４０ｍ１のリ ン酸塩緩衝液で洗浄した。次いで、再懸濁させたペレットをベックマン（Ｂｅｃ ｋｍａｎ）　ＧＲＰテーブルトップ遠心機で１１００Ｏｒｐ　（２００ｘ　ｇ　 ）で１０分間遠心した。細胞のペレットを１０ｍ１のホモジナイゼーション緩衝 液（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ　（ｐＨ７，６）　、２５ｍＭのＫＣＩ、０．１５ｍ Ｍのスペルミン、０゜５ｍＭのスペルミジン、１ｍＭのＥＤＴＡｌｌ、２５Ｍの スクロース、１０％のグリセロール（Ｖ　／　Ｖ　）、０．５％の脂肪不含ドラ イミルク（Ｖ　／　Ｖ　）の中に再懸濁させた。溶液への添加前に、水性０．１ ｇ／ｍ１ｌｌＷ肪不含ドライミルク溶液をＩＯ分間ＳＳ　−３４ローターの中で １１００Ｏｒｐ　（１１９５０ｘｇ）で遠心して未溶解のミルクの固体を除去し た。

細胞を１／２馬力のドリルプレス（Ｊｅｔ　Ｔｏｏｌｓ　Ｉｎｃ）により高速で 破壊するまでドウンス（ｄｏｕｎｃｅ）　Ｌ／た（テフロン　ガラスのホモジナ イザー）。一般に、細胞の８０％より多くが溶解した。溶解後、４６ｍ１の２Ｍ のスクロースのホモジナイゼーション緩衝液（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７， ６）　、　２５ｍＭのＫＣＩ、　０．１５ｍＭのスペルミン、　０．５ｍＭのス ペルミジン、１ｍＭのＥＤＴＡ、２Ｍのスクロース、１０％のグリセロール（ｖ ／Ｖ）、０．５％の脂肪不含ドライミルク（Ｖ　／　Ｖ　）をドウンスした細胞 に添加した。ホモジナイザーシヨンした細胞（２８ｍｌ）を１０ｍ１のスクロー スのパッド（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ　（ｐＨ７，６）　、　２５ｍＭのＫＣＩ、 ０．１５ｍＭのスペルミン、０．５ｍＭのスペルミジン、１ｍＭのεＤＴＡ、　 ２Ｍのスクロース、１０％のグリセロール（Ｖ　／　Ｖ　）上に層状にし、そし て５Ｗ２８０−ター（１０３，０００Ｘ　ｇ　）の中で２４．００Ｏｒｐｍにお いて６０分間遠心した。

沈澱した核を合計６ｍｌの核溶解緩衝液（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ　（ｐＨ７，６ ）、１００ｍＭのＫＣｌ１３　ｍＭのＭｇＣｌ　２、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、　 １０％のグリセロール（ｖ／ｖ））の中に再懸濁させた。１／９体積の３Ｍの（ ＮＨ４）２ＳＯ４ｐＨ７，９を添加し、そして３０分間絶えず混合した。粘性リ ゼイトをＴｉ５０ローター（１５０，０００ｇ）の中で４０．　ＯＯＯｒｐｍで ６０分間遠心して、クロマチンを沈澱させた。

遠心後、管を急速に取り出し、そして沈澱したクロマチンが再膨潤する前に、上 澄み液を他の管に移した。上澄み液に、０．３ｇ／ｍｌの固体の（ＮＨ４）２Ｓ Ｏ，を添加した。この管をすべての（ＮＨａ）２ｓＯ＜が溶解するまで１０分間 おだやかに混合した。管を氷上に４０分間置き、そして１０分毎におだやかに混 合した。次いで、沈澱したタンパク質をＴｉ５０ローター（１５０＝　０００　 Ｘ　ｇ　）の中で４０．０００ｒｐｍにおいて１５〜２０分間遠心した。この時 点において、ペレットを透析緩衝液（２５ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７，６）　、 ４０ｄのＫＣＩ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、　１０％のグリセロール（Ｖ／Ｖ）） の中に再懸濁させた。Ｉ　Ｘ　１０＠Ｊｕｒｋａｔ細胞からのタンパク質抽出物 を２００〜３００μｌの透析緩衝液の中に再懸濁させて、１０ｍｇ／ｍｌの最終 のタンパク質濃度が生じた。抽出物を冷時１００体積の透析緩衝液に対して２時 間２回透析した。透析の間、沈澱が形成し、それを透析の終わりに、マイクロフ ージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）（ＢｒｉｎｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）の中 の１４の設定において５分間遠心することによって除去した。標準としてＢＳＡ を使用してパイオーラド（ＢｉｏＲａｄ）タンパク質アッセイキットで、タンパ ク質濃度を決定した。タンパク質抽出物を小さいアリコートでドライアイス上で 凍結させ、そして直ちに液体窒素の中に貯蔵した。

ＨｅＬａ　Ｓ３の核抽出物は従来記載されているようにして作った（Ｓｈａｐｉ ｒｏ、Ｄ、Ｊ、ら、　ＤＮＡ　７　：　４４−４５１９８８）。

転写反応 一般に、転写反応（２０μＩ）は、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７，６）　、５ ０ｍＭのＫＣＩ、６ｍＭのＭｇＣ１ｚ、０．６ｍＭの各ＡＴＰおよびＣＴＰ、７ ｍＭのＵＴＰ、７μＣ１の（ａ　−”　Ｐ　）　ＵＴＰ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ、 ４００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、　０．５ｍＭの３′−〇−メチルＧＴＰ　（Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ）、　１５０単位のＲＮアーゼ（ＢＲＬ）　、１２単位のＲＮアーゼ インヒビター（Ａｍｅｒｓｈａｍ）および１２％のグリセロール（ｖ／ｖ）を含 有する緩衝液の中に４０Ｈｇ／ｍｌの環状ＤＮＡ鋳型〔４００ｎｇの被験構成体 、４０ＨｇのＡｄＭＬＰＧ欠損構成体、および３６０ｎｇのポリｄｉ−ｄＣ（Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ）　）および３〜５　ｍｇ／ｍｌの核タンパク質抽出物を含有 した。ＥＤＴＡおよびＤＴＴを抽出物により寄与された。肝臓またはＨｅＬａの 核抽出物を使用する転写反応は、４０Ｈｇ／ｍｌの環状ＤＮＡ鋳型（４００ｎｇ の被験構成体および４００ｎｇのＡｄＭＬＰ）を含有した。すべての他の反応条 件は一定に保持した。反応を３０℃において４５分間インキュベーションした。

転写反応を２８０μｌの停止緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣＩ　（ｐＨ７，６ ）、１％のＳＤＳ、　５ｍＭのＥＤＴＡ）の添加により停止させ、そしてフェノ ールで２回そしてクロロホルムで１回抽出した。ＲＮＡを１５Ｈｇのグリコーゲ ン、０．３Ｍの酢酸ナトリウム（１１Ｈ５，２）および２，５体積のＥＴＯＨで 沈澱させた。ベレットを７０％のエタノールで洗浄し、空気乾燥し、そして１０ μｌの負荷色素（ＩＸＴＢＥ中の９０％のホルムアミド、０．０１％のキシレン シアツール、および０．０１％のブロモフェノールブルー）の中に再懸濁させた 。転写体を６％の変性ポリアクリルアミドゲル上で分析した。一般に、ゲルを室 温においてＸＡＲ−５（Ｋｏｄａｋ）　Ｘ線フィルムを使用して一夜露出した。

ＡｄＭＬＰのＧ欠損構成体から観測された量に対して被験Ｇ欠損構成体の量を基 準化し、次いで刺激した核抽出物からの被験Ｇ欠損転写の量を非刺激核抽出物か らのＧ欠損転写の量で割ることによって、基準化折りたたみ誘発（ｎｏｒｍａｌ ｉｚｅｄ　ｆｏｌｄ　１ｎｄｕｃｔｉｏｎ）を計算する。アンビス（Ａｍｂｉｓ ）放射線分析画像形成システム（Ａｍｂｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、サンジエゴ。

カリフォルニア州）を使用して、オートラジオグラムを定量した。

結果 驚くべきことには、ＦＫ５０６　（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下にＰＭＡおよびイ ノマイシンで２時間刺激したＪｕｒｋａｔ細胞からの核抽出物は、これらの細胞 の中の内因性ＩＬ−２遺伝子の転写か完全に阻害されてさえ（データは示されて いない）、完全に刺激されたＪｕｒｋａｔ細胞からの抽出物にほぼ等しいレベル でＩＬ−２エンハンサ−〇欠損鋳型を転写する（第９Ａ図、レーン２および３を 参照のこと）。ＩＬ−２遺伝子の活性化へのＣｓＡ、およびＦＫ５０６の阻害作 用の大部分はＮＦ−ＡＴ機能の阻害のためであることが示されている（参考文献 １６．１７）ので、われわれはこのタンパク質により指令された転写を検査した 。ＮＦ−ＡＴタンパク質についてのマルチマー化された結合部位により指令され たｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写は、ＮＦ−ＡＴ依存性転写か抽出物の調製に使用した細 胞の中で完全にブロックされるという事実（第９Ｂ図）にかかわらず、刺激し／ 　ＦＫ５０６処理した細胞の核抽出物において２．５倍減少した（第９Ａ図、レ ーン５および６を参照のこと）。これらの抽出物において、ＮＦ−ＡＴのＤＮＡ 結合活性は一般に９９％を越えるｉｎ　ｖｉｖｏ　［Ｌ−２発現への阻害作用（ 参考文献１７）よりさらに約５０〜ｂ減少されるか、ＮＦ−ＡＴ依存性ｉｎ　ｖ ｉｔｒｏ転写への作用と釣り合う。こうして、刺激し／　ＦＫ５０６処理した細 胞はｉｎ　ｖｉｔｒｏで機能するが、１ｎｖｉｖｏで機能しないＮＦ　−ＡＴを 減少した量で含有するように思われる。

実施例■ 直列のＮＦ−ＡＴ結合部位はトランスジェニックマウスにおける活性化されたリ ンパ球に対するＴ抗原の発現を指令するＮＦ−ＡＴ調節部位のコントロール下に 転写のプロモーターが活性化されたリンパ球に対する連鎖した遺伝子の発現を特 異的に指令するかどうかを決定するために、直列のＮＦ−ＡＴ結合部位がＴ抗原 をエンコードする遺伝子の上流で連鎖されている構成体を含有する細胞系をわれ われは利用した（Ｖｅｒｗｅｉｊら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６５　：　 １５７８８−１５７９５）。

手順 グアニジニウムチオシアネートおよび熱フェノール抽出を使用して、種々の組織 および細胞から全体のＲＮＡを単離した。等しい量の１０μｇのＲＮＡを使用し た。Ｓｐ６／Ｔ７のＲＮＡポリメラーゼ系を使用するＲＮＡのマツピング実験を （Ｍｅｌｔｏｎ、　Ｄ、Ａ、ＮＡＲ１２＋　７０３５−７０５６（１９８４）） に従い実施した。正しく開始されたＮＦ−ＡＴ−ＴａｇのｍＲＮＡをマツピング するために、１１７ｂｐのＸｈｏ　ｌ−Ｈ１ｎｄＩＩＩ断片（ＮＦＡＴ　−Ｔａ ｇの−７０〜＋４７）を含有するＥｃｏＲＩ消化ｐＳＰ６１Ｌ−２ベクターから 、Ｓｐ６のＲＮＡプローブを転写した。ハイブリダイゼーションを４２°Ｃにお いて１６時間進行させ、そして試料を４μｇ／ｍｌのＲＮアーゼＡおよび１６０ 単位／ｍｌのＲＮアーゼＴ１で３０°Ｃにおいて１時間消化した。保護された断 片を、５％の変性ポリアクリルアミドゲル上で展開し、そしてＸＡＲ−５フイル ムに露出した。

結果 第１０図に示すように、リンパ系細胞のみは直列のＮＦ−ＡＴ結合部位のコント ロール下にある抗原遺伝子を転写した。こうして、ＮＦ−ＡＴ結合部位の列は活 性化リンパ系細胞に特異的に連鎖した遺伝子の発現の指令に青用である。

実施例■ ＮＦ　−ＡＴの活性化は多分リン酸化を必要とする核抽出物を仔ウシアルカリ性 ホスファターゼで処理し、そして非変性ゲル上てＮＦ−ＡＴのＤＮＡ結合性複合 体の移動度を検査することによって、ＮＦ−ＡＴのリン酸化についての証拠を得 た。第１１図に示すように、仔つシ腸ホスファターゼを使用するＮＦ−ＡＴの脱 リン酸化は、そのＤＮＡ結合部位とアソシエーションするその能力を減少する（ 第１１図、レーン４）。

ＦＫ５０６およびシクロスポリンへの作用についてのモデル：ＮＦ−ＡＴの核の 取り入れを防止するときのそれらの役割抗原により誘発されたカルシウムの刺激 は、ＮＦ　ＡＴのサブユニツトの核の取り入れに導く。いったん核の中に入ると 、細胞溶解性サブユニットは新しく誘発された核のサブユニットと結合して、　 ＤＮＡ結合アッセイおよび転写活性の両者を有する複合体を生産する。いずれの サブユニットの単独ではＤＮＡ結合アッセイをもたず、そしていずれのサブユニ ットも単独では転写活性をもたない。ＮＦ−ＡＴの細胞溶解性成分の核の転移に ついて競争の発生を防止するか、あるいはＮＦ−ＡＴのための核の取り入れのシ グナルの出現をブロックすることによって、シクロスポリンＡおよびＦＫ５０６ はＮＦ−ＡＴの細胞溶解性成分の取り入れを防止する。

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１５、　Ｓｈａｗ、　Ｊ、Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４１． ２０２−２０５　（１９８８）。

１６、　Ｅｍｍｅｌ、　Ｅ、Ａ、　ｅｔ　ａｔ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４６． １６１７−１６２０　（１９８９）。

１７、　Ｍａｔｔｉｌａ、　Ｐ、Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　ＥＭＢＯＪ、　９．４ ４２５−４４３３　（１９９０）。

１８、Ｗｉｓｋｏｃｉｉ、Ｒ，、Ｗｅｉｓｓ、Ａ、、Ｉｍｂｏｄｅｎ、Ｊ、、Ｋ ａｍｉｎ−Ｌｅｗｉｓ、Ｒ，＆５ｔｏｂｏ、Ｊ、Ｊ、ｒｍｍｕｎｏｌ、１３４． 　１５９９−１６０３　（１９８５）。

１９、Ｆｉｅｒｉｎｇ、Ｓ、ｅｔ　ａｔ、、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｗ、４．　１８２ ３−１８３４　（１９９０）。

２０、　Ｒｏｓｅｎ、　Ｍ、に、、５ｔａｎｄａｅｒｔ、　Ｒ，Ｆ、、　Ｇａ１ ａｔ、　Ａ、、　Ｎａｋａｔｓｕｋａ、　Ｍ、＆５ｃｈｒｅｉｂｅｒ、　Ｓ、Ｌ 、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４８．８６３−８６６　（１９９０）。

２１、　Ｄｕｍｏｎｔ、　Ｆ、Ｊ、、　５ｔａｒｕｃｈ、　Ｍ、Ｊ、、　Ｋｏｐ ｒａｋ、　Ｓ、Ｌ、、　Ｍｅｌｉｎｏ、　Ｍ、Ｒ。

＆　Ｓｉｇｎａｌ、Ｎ、Ｈ，Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３４．　１５９９−１６０ ３　（１９８５）。

２２、Ｄｕｏｎｔ、Ｆ、Ｊ、ｅｔ　ａｌｌ、Ｊ、ｒｍｍｕｎｏｌ、１４４．　１ ４１８−１８２４　（１９９０）。

２３、Ｋａｒｔｔｕｎｅｎ、Ｊ、＆　５ｈａｓｔｒｉ、Ｎ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｎ 、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ。

８８、　３９７２−３９７６　（１９９１）。

２４、Ｋａｙ、Ｊ、Ｅ、、Ｄｏｅ、Ｓ、Ｅ、Ａ、＆　Ｂｅｎｚｉｅ、Ｃ，Ｒ，Ｃ ｅ１１．Ｉｍｍｕｎ、１２４゜１７５−１８１　（１９８９）。

２５、Ｃ１ｒｉｌｌｏ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４４．　３ ８９１−３８９７　（１９９０）。

２６、Ｇｕｎｔｅｒ、Ｋ、Ｃ，、Ｉｒｖｉｎｇ、Ｓ、Ｇ、、Ｚｉｐｆｅｌ、Ｐ、 Ｆ、、５ｉｅｂｅｎｌｉｓｔ、Ｕ。

＆　Ｋｅｌｌｅｙ、Ｋ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４２．　３２８６−３２９１　 （１９８９）。

２７、Ｋｏｌｅｓｔｓｋｙ、Ａ、Ｊ、、Ｈａｒｄｉｎｇ、　Ｍ、Ｗ、＆　Ｈａｎ ｄｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ、Ｒ，Ｅ、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３７．　１０５６−１０５９　（１９８６）。

２８、　Ｋｉｎｃａｉｄ、　Ｒ，Ｌ、、　Ｔａｋａｙａｍａ、　Ｈ，、Ｂｉｌｌ ｉＢｌｌｌｉｎ、　Ｍ几、　＆　５ｉｔｋｏｖｓｋｙ。

Ｍ、Ｖ、Ｎａｔｕｒｅ　３３０．　１７６−１７８　（１９８７）。

２９、Ｔｒｏｐｓｃｈｕｇ、Ｍ、、　Ｗａｃｔｅｒ、Ｅ、、Ｍａｙｅｒ、Ｓ、、 ５ｃｈｏｎｂｒｕｎｎｅｒ、Ｅ、Ｒ。

＆　Ｓｃｈｍｉｄ、Ｆ、Ｘ、　Ｎａｔｕｒｅ　３４６．　６７４−６７７　（１ ９９０）。

３０、　５ｉｅｋｌｅｒｋａ、Ｊ、Ｊ、、Ｈｕｎｇ、Ｓ、Ｈ，Ｙ、、Ｐｏｅ、Ｍ 、、Ｌｉｎ、Ｃ，Ｓ、＆　Ｓｉｇａｌ（Ｓｉｇｎａｌ　ｉｎ　＃２１　ａｂｏｖ ｅ）　、Ｎ、Ｈ，Ｎａｔｕｒｅ　３４１．　７５５−７５７　（１９８９）。

３１、）ｌａｒｄｉｎｇ、　Ｗ、Ｍ、、Ｇａ１ａｔ、Ａ、、Ｕｅｈｌｉｎｇ、Ｄ 、Ｅ、＆　５ｃｈｒｅｉｂｅｒ、Ｓ、Ｌ。

Ｎａｔｕｒｅ　３４１．　７５８−７６０　（１９８９）。

３２、Ｈｕｎｔ、Ｔ、Ｃｅ１ｌ　５９．　９４９−９５１　（１９８９）。

３３、　０ｈｔｓｓｏｎ、Ｈ，＆　Ｅｄｌｕｎｄ、Ｔ、Ｃｅ１ｌ　４５．　３５ −４４　（１９８６）。

３４、　Ｆｒ１ｅｄ、　Ｍ、Ｇ、　＆　Ｃｒｏｔｈｅｒｓ、　Ｄ、Ｍ、　Ｎｕｃ ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９．６５０５−６５２６　（１９８１）。

３５、　Ｇａｒｎｅｒ、　Ｍ、Ｍ、　＆　Ｒｅｖｚｉｎ、　Ａ、　Ｎｕｃｌｅｉ ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９．３０４７−３０５９（１９８１）。

すべての出版物、特許及び特許出願は、引用により本明細書に組込まれる。本発 明は十分に記載されて来たが、多くの変更及び修飾が本発明の範囲内で行なわれ 得る。

ＦＩＧ、　７ ３０′／１４０％　１００％　２４％　１２％　５％■し一２エンハンサ− ＦＩＧ、　２ ＦＩＧ、　３ ＮＦ−ＡＴタンパク質−［）ＮＡＩ合体はＴ細胞特異性でありかつＴ細胞活性化 に依存性である 細胞質抽出物　−−ｎｓ　ｍ３　ｎｓ　ｎｊ核油抽出物　ｇ＋Ｆ　ｓ十Ｆ　ｓ十 Ｆｓ＋Ｆ　ｓ十Ｆ　ｓ＋Ｆアニソマイシン　−　＋　−＋−＋ 相補性 杉油出物　ｎｓ　ｓ　ｓ＋Ｆ　−−＋　ｓ＋Ｆｓ＋Ｆｓ＋Ｆｓ＋ＦＦＩＧ、６Ａ 受容オリゴ 膚、ＡＴ突然変異ＮＦ−ＡＴ 杉油出物　ｎｓ　ｒＬｓｎｘ　ｓ＋Ｆｓ十Ｆ　ｓ＋Ｆｓ＋Ｆｓ＋Ｐ　ｓ＋ＦＩＩ ＋　１１１１１１ ◆　１、　Ｕ◆ ＦＩＧ、６Ｂ 杉油出物　Ｉ冒ｋａｔ　Ｊ’に１２／９０・ｌｎｓ　ｓ　ｓ＋Ｆ　ｓ＋Ｆｓ十Ｆ 　ｓ＋Ｆｓ＋Ｆｓ＋ＦＦＩＧ、　６Ｃ ＦＩＧ、　６Ｄ 異種混合 杉油出物　１１１ ＦＩＧ、　７Ｃ ＩＩ　ＩＩＩ　Ｉｌｌ　１１１１ ＦＩＧ、　８ ＩＬ−２ＮＦ−ＡＴ ＦＩＧ、　９Ａ ＩＩ　１ ＦＩＧ、　９Ｂ 杉油出物　５ｓｓｓｓ ＦＩＧ、１１

Claims (35)

【特許請求の範囲】
1. １．免疫応答を改変できる剤のスクリーニングに有用な組成物であって、少なく とも約２０個の塩基対の核酸配列を結合する単離されたＮＦ−ＡＴ、ＮＦ−ＡＴ ｎポリペプチド、ＮＦ−ＡＴｃポリペプチド及びそれらの混合物から実質的に成 る組成物。
2. ２．前記ＮＦ−ＡＴｃがＴ細胞ＮＦ−ＡＴｃである請求の範囲第１項記載の組成 物。
3. ３．前記ＮＦ−ＡＴｃがＪｕｒｋａｔ細胞ＮＦ−ＡＴｃである請求の範囲第１項 記載の組成物。
4. ４．前記ＮＦ−ＡＴｃがＨｅＬａ細胞ＮＦ−ＡＴｎである請求の範囲第１項記載 の組成物。
5. ５．前記ＮＦ−ＡＴｎがＴ細胞ＮＦ−ＡＴｎである請求の範囲第１項記載の組成 物。
6. ６．前記ＮＦ−ＡＴｎがＪｕｒｋａｔ細胞ＮＦ−ＡＴｎである請求の範囲第１項 記載の組成物。
7. ７．前記混合物が２種の異なった細胞からのＮＦ−ＡＴｃ及びＮＦ−ＡＴｎによ り形成されるＮＦ−ＡＴ複合体を含んで成る請求の範囲第１項記載の組成物。
8. ８．前記ＮＦ−ＡＴｃ及びＮＦ−ＡＴｎが異なった細胞系からである請求の範囲 第１項記載の組成物。
9. ９．核酸配列を結合する前記ＮＦ−ＡＴがエンハンサーである請求の範囲第１項 記載の組成物。
10. １０．核酸配列を結合する前記ＮＦ−ＡＴがインターロイキン−２エンハンサー に対して実質的に相同である請求の範囲第１項記載の組成物。
11. １１．免疫応答遺伝子の転写調節ＤＮＡ配列に配列特異的態様で結合する複合体 を形成できる精製されたＮＦ−ＡＴサブユニット組成物であって； 前記サブユニットが、 ｉ．約４５ｋｄの分子量； ｉｉ．Ｔ細胞における誘発性発現； ｉｉｉ．タンパク質キナーゼＣを活性化できる剤にＨｅＬａ細胞を暴露すること による前記細胞における誘発性発現；ｉｖ．Ｔ細胞におけるＮＦ−ＡＴｎ合成に 対してのシクロスポリン及びＦＫ５０６による効果の欠失；及び ｖ．ＮＦ−ＡＴｃへの特異的結合により特徴づけられるＮＦ−ＡＴｎであり；又 は 前記サブユニットが、 ｉ．約９０ｋｄの分子量； ｉｉ．Ｔ細胞における構成的発現； ｉｉｉ．細胞におけるＣａ２＋流れの後、核中に輸送されるべき能力；ｉｖ．シ クロスポリン及びＦＫ５０６により阻害される核輸送；及びｖ．ＮＦ−ＡＴｎへ の特異的結合により特徴づけられるＮＦ−ＡＴｃであることを特徴とする組成物 。
12. １２．前記核サブユニットがＨｅＬａ細胞ＮＦ−ＡＴｎである請求の範囲第１１ 項記載の組成物。
13. １３．前記核サブユニットがＪｕｒｋａｔ細胞ＮＦ−ＡＴｎである請求の範囲第 １１項記載の組成物。
14. １４．前記複合体が天然のＮＦ−ＡＴである請求の範囲第１１項記載の組成物。
15. １５．前記剤がタンパク質キナーゼＣの活性化因子である請求の範囲第１１項記 載の組成物。
16. １６．約２０〜１００ｈｐの長さであり、そしてＮＦ−ＡＴ複合体に特異的に結 合でき、且つ【配列があります】に対して実質的に相同である、精製された核酸 配列又は相補的配列。
17. １７．前記配列が、下記（ｉ）〜（ｖｉ）：ｉ．【配列があります】 ｉｉ．【配列があります】 ｉｉｉ．【配列があります】 ｉｖ．【配列があります】 ｖ．【配列があります】 ｖｉ．【配列があります】 から成る群から選択される請求の範囲第１６項記載の核酸配列。
18. １８．免疫抑制剤候補体についてのスクリーニング方法であって：ｉ．前記剤と 、核酸フラグメントを結合する単離されたＮＦ−ＡＴ、ＮＦ−ＡＴｎポリペプチ ド、ＮＦ−ＡＴｃポリペプチド及びそれらの混合物から成る群から選択された成 分とを組合し；そしてｉｉ．前記剤が前記選択された成分を結合するかいなかを 決定することを含んで成る方法。
19. １９．免疫調節剤についてのスクリーニング方法であって：ｉ．細胞の細胞質に ＮＦ−ＡＴｃを含む真核細胞の収集を調製し；ｉｉ．前記細胞を推定上の剤によ り処理し；そしてｉｉｉ．ＮＦ−ＡＴｃの核トランスロケーションについてアッ セイすることを含んで成る方法。
20. ２０．前記核トランスロケーションについてのアッセイ段階が、前記細胞の核に おけるＮＦ−ＡＴの存在を決定することを含んで成る請求の範囲第１９項記載の 方法。
21. ２１．前記剤又はＮＦ−ＡＴが検出できるマーカーによりラベルされる請求の範 囲第２０項記載の方法。
22. ２２．前記核トランスロケーションについてのアッセイ段階が、ＮＦ−ＡＴｃと 、ＮＦ−ＡＴｎとの間の核関連を決定することを含んで成る請求の範囲第１９項 記載の方法。
23. ２３．前記剤がねじれたアミドペプチジルプロリル結合を含んで成るマクロライ ドである請求の範囲第１９項記載の方法。
24. ２４．前記剤がＦＫＢＰ−１２又はＦＫＢＰ−１３を結合できる請求の範囲第２ ３項記載の方法。
25. ２５．前記剤がＦＫＢＰ−１２又はＦＫＢＰ−１３のプロリルイソメラーゼ活性 を阻害する請求の範囲第２３項記載の方法。
26. ２６．前記アッセイ段階が細胞におけるＤＮＡ配列へのＮＦ−ＡＴの結合を決定 することを含んで成る請求の範囲第１９項記載の方法。
27. ２７．前記アッセイ段階が細胞における、免疫応答遺伝子をコードするｍＲＮＡ 転写レベルを決定することを含んで成る請求の範囲第２６項記載の方法。
28. ２８．免疫調節剤についてのスクリーニング方法であって：ｉ．レポーター遺伝 子に結合される、ＮＦ−ＡＴ調節されたエンハンサー領域を含んで成るキメラ遺 伝子を構成し；ｉｉ．前記キメラ遺伝子をＴ細胞中に挿入し；ｉｉｉ．前記剤の 存在又は不在下でＴ細胞活性化化合物により前記Ｔ細胞を処理し； ｉｖ．前記レポーター遺伝子の発現に対しての前記剤の効果を決定し；そして ｖ．免疫抑制剤候補体として、活性化されたＴ細胞におけるレポーター遺伝子の 転写の増強を特異的に阻害する剤を同定することを含んで成る方法。
29. ２９．前記レポーター遺伝子がクロラムフェニコールアセチルトランスフェラー ゼである請求の範囲第２８項記載の方法。
30. ３０．前記Ｔ細胞がＰＭＡ／イオノマイシンにより活性化される請求の範囲第２ ８項記載の方法。
31. ３１．医薬的に許容できるキャリヤー及び請求の範囲第１８，１９、又は２８項 記載の方法により同定される剤を含んで成る医薬組成物の治療的有効量を患者に 投与することを含んで成る、免疫応答を調節するための方法。
32. ３２．免疫抑制剤候補体についてのアッセイ方法であって：前記剤とＮＦ−ＡＴ ｎ及びＮＦ−ＡＴｃとを、前記ＮＦ−ＡＴｎとＮＦ−ＡＴｃとの間でＮＦ−ＡＴ を形成するために特定の二量体化を可能にする条件下で混合し、そして前記二量 体化が生じたかどうかについて決定し；そして 免疫抑制剤候補体であるような、特定の二量体化を阻害する剤を同定することを 含んで成る方法。
33. ３３．ＮＦ−ＡＴｎ又はＮＦ−ＡＴｃが同定される請求の範囲第３２項記載の方 法。
34. ３４．前記剤、ＮＦ−ＡＴｎ又はＮＦ−ＡＴｃが検出可能なマーカーによりラベ ルされる請求の範囲第３２項記載の方法。
35. ３５．ＮＦ−ＡＴｃリン酸化を変性する剤をアッセイするための方法であって、 前記剤とＮＦ−ＡＴｃとを接触し、そして前記ＮＦ−ＡＴｃがリン酸化されたか 又は脱リン酸化されたかどうかを決定することを含んで成る方法。