JPH06510196A - 肝炎デルタウイルスのゲノムｒｎａに由来するリボザイム構造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はＤＮＡ又はＲＮＡ標的分子をトランス開裂できる新規リボザイム構造に 関する。

詳しくは、この新規リボザイム構造はヒト肝炎デルタウィルスのゲノムＲＮＡに 由来するＲＮＡ分子である。

ヒト肝炎デルタウィルスのゲノムＲＮＡは自己触媒活性を示す。自己触媒開裂活 性を保存してゲノムウィルスＲＮＡから誘導される減少サイズのＲＮＡ断片を用 いて、触媒部分及び基質部分が以下で説明されるように独特なやり方で本発明に 従いうまく分離された。

結果的に、開裂は触媒活性を有するリボザイム構造を異種ＲＮＡ又はＤＮＡ基質 と混ぜることにより二元反応で行える。触媒開裂活性を有する断片のこの特徴化 により肝炎デルタウィルスのゲノムＲＮＡのこれらリボザイム構造を実験、治療 又は予防目的のためにインビトロ又はインビボで標的ＲＮＡの開裂用の“ヒト２ タイプリボザイム構造として使用させることができる。

リボザイムは触媒活性、特にＲＮアーゼ活性を自然に働かせることができるＲＮ Ａ分子である。このような天然リボザイムを用いて、特定の標的ＲＮＡで酵素開 裂を行える人工リボザイム構造を確立することが試みられた。

このため、このようなりボザイムは特に病原性タイプ標的ＲＮＡを特異的に分解 するために“アンチセンス”オリゴヌクレオチドタイプのアプローチ内で使用で きる治療手段を提供する。

リボザイム活性は広いようであり、触媒ＲＮＡは細菌、原生動物、植物及び動物 系について記載されている。最初のりボザイム活性はまず第一にクラスＩイント ロンをスプライシングする系で、次いでＲＮアーゼＰで示された。更に最近にな り、多数のＲＮＡウィルス、植物又は更には哺乳動物のゲノムてもウィルス増殖 サイクル時に出現するりボザイム活性を有することが発見された。最後に、トリ トン中でサテライトＤＮＡ領域から転写されたあるＲＮＡもコンカテマー転写物 を開裂する天然リボザイム活性を示す。

ある植物ウィルスのゲノムリボザイムの構造の分析では特定のＲＮＡ配列向けに 仕立てられた開裂剤として作用できるリボザイムを組み立てられる共通反応性配 列及び二次コンセンサス構造を明示した。これらの開裂に関′与する領域の分析 からヌクレアーゼ反応を起こす上で必要及び十分である“ハンマーヘッド°又は “Ｔ゛と呼ばれる共有構造について明らかにした。

更に植物ウィルスに由来する第二クラスのりボザイムは触媒“ヘアピン”構造又 は“Ｌ″構造示す。

これらの異なるリボザイムタイプはインビトロで機能するが、但し動物又はヒト 細胞でのインビボ開裂に関する効力は相対的に無効である。この相対的無効はこ れらすべてのりボザイムが動物でも又は更にはヒトウィルスでもなくて植物ウィ ルスに由来するという事実に少くとも一部起因しているのであろう。

肝炎デルタウィルスはＢ型肝炎ウィルスに系統上関連したヒトＲＮＡウィルスで ある。このウィルスのゲノム及びアンチゲノムＲＮＡは双方とも自己触媒開裂活 性を有する。非常に短い鎖長を有してリボザイム活性を表すＲＮＡ断片の配列は 既に知られるどの“Ｔ″及び“Ｌ“タイプ触媒モチーフとも類似性をもたない。

肝炎デルタウィルスはヒト肝細胞で複製し、そのリボザイム活性はそれらの細胞 で完全に機能する。そのリボザイム活性はこれらのヒト肝細胞で機能するために 当然に選択されたが、このモデルはヒトで活性リボザイムであるものの完全な例 を提供する。

１７００ヌクレオチドの長さを有する肝炎デルタウィルスのゲノムＲＮＡは自己 触媒開裂を行える領域を実際に含む。この自己触媒開裂は長さ８９ヌクレオチド であるサブ断片で行うことができ、その二次構造は図１で示された形で略記でき る。

この８９ヌクレオチド鎖長構造は“擬似結び目°タイプ形態を有する。自己触媒 開裂は図１で矢印により示されたホスホジエステル結合で行われる。

自己触媒活性を有するこのリボザイム断片を用いて、二元反応時に第二ＲＮＡ標 的分子で発揮できる触媒トランス活性を有したりボザイム構造が本発明により提 供された。本発明は治療又は予防目的のためにヒト、動物又は更に植物細胞でも ＤＮＡ又はＲＮＡ標的分子、特に病原性分子を有効に開裂できる新規リボザイム 分子を提供する。

これは新規のりボザイムトランス活性に関する。このトランス開裂に関与する分 子は以前に記載されたいがなる他のりボザイムトランス作用構造にも相当しない 構造及び配列を有する。

ＲＮＡの化学合成に関する技術を用いて、図１で示された分子の異なる領域に相 当するＲＮＡサブ断片を作製した。次いで、これ・ら様々な断片は触媒断片がら 基質断片を区別するために再組立て実験で試験した。

したがって、本発明は特定のＲＮＡ核酸配列を含む他の分子で触媒トランス開裂 活性を有することができる、肝炎デルタウィルスのゲノムＲＮＡの１以上の断片 からなる肝炎デルタウィルスのゲノムＲＮＡに由来するりボザイム構造に関する 。

“他の分子”とは肝炎デルタウィルスのゲノムＲＮＡ以外の分子が開裂されるこ とであると本出願では理解される。

特に適切な態様において、リボザイム構造は図２で示されたヌクレオチド１６− ８９を含む７４ヌクレオチドの配列からの１又は２つの断片から構成される。

試験された構造の中で好ましいりボザイム構造、即ち開裂活性に関して最も有効 なりボザイム構造は単一の断片を含む。

特に、本発明によるリボザイム構造はヌクレオチド１６−８９を含む７４ヌクレ オチド断片又はヌクレオチド５０−７７の一部のみが欠失されたこの同断片１６ −８９からなることができる。配列５０−７７のすべてが欠失された場合、断片 はその触媒開裂活性を失う。

本発明によるリボザイム構造は少くとも１２ヌクレオチドの配列を含むことが好 ましい。

本発明によれば、この他の分子のこの核酸配列はこの触媒トランス開裂活性の基 質である肝炎デルタウィルスのゲノムＲＮＡ断片に相当する。

特に、配列５”ＸＧＧＣＣ３−（Ｘ−Ｃ又はＵ）を含むことは触媒活性の基質で あるこの他の分子のこの核酸配列にとり可能であり、このリボザイム構造はＸと Ｇとのホスホジエステル結合でヌクレアーゼ又はリボヌクレアーゼ活性を有する ことができる。

−ｆｉ様において、図２で示されたヌクレオチド５−１２をカバーする８ヌクレ オチド断片を含むことはこの他の分子のこの核酸配列にとり可能である。

触媒開裂活性は二価金属イオン、特にマグネシウムの存在下で適切な様式で起き る。

□本発明の態様において、本発明によるリボザイム構造はこの他の分子中に挿入 され、それが挿入されたこの他の分子で自己触媒開裂活性を有することができる 。

示されたように、本発明によるリボザイム構造は特定配列のポリリボヌクレオチ ドを含む他の分子でリボヌクレアーゼ活性、特にエンドリボヌクレアーゼ活性を 有する。

本発明によるリボザイム構造は原核又は真核、動物又は植物細胞で治療又は予防 目的に使用でき、このためこの他の分子は動物又は植物細胞に対して異種である ことができる。

細菌又は真核、動物もしくは植物細胞中に本発明によるリボザイム構造を細胞内 送達する上で色層系又はいずれか他のベクターとして肝炎デルタのウィルス粒子 を用いることができる。

本発明の他の利点及び特徴は以下の詳細な記載から明らかになるであろう。この 記載では図１〜４を引用している。

一部１はゲノム肝炎デルタウィルスＲＮＡの自己触媒断片で可能な二次“擬似結 び目″様構造について示す。

−図２は肝炎デルタウィルスのゲノム鎖に由来するりボザイムによる二元トラン ス開裂複合体で可能な構造について示す。

図３は様々な時間後における本発明によるリボザイム構造とその基質とのインキ ュベート産物がランされた２０％ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフ について示す。

一部４は１０％ポリアクリルアミド／７Ｍ尿素における自己対合構造５０−７７ で欠失がある７１ヌクレオチド鎖長リボザイム構造との自己触媒開裂ランの産物 の分析について示す。

鯉１ 試験された組合せの中から、示されたように、例えば基質として図２の１３ヌク レオチド（１−１３）から構成される断片とりボザイム橋造として各々ヌクレオ チド１６−６２及び６３−８９を含む２断片又はヌクレオチド１６−８９を含む 単一の７４ヌクレオチド鎖長断片のいずれかから構成される分子を用いてトラン ス開裂を行えることが発見された。

この７４ヌクレオチドリボザイムはＲＮＡポリメラーゼＴ７による二本鎖ＤＮＡ マトリックスのインビトロ転写により得た。このマトリックスはＤＮＡ配列を化 学合成し、それらをハイブリッド形成し、しがる後得られた産物をＰＣＲ反応で 増幅させることにより得た。適切なプライマーを用いて、このＰＣＲ反応により ポリメラーゼＴ７を機能させうる転写促進配列を隣接させることができる。

図２は７４ヌクレオチドリボザイム構造とその１３ヌクレオチド基質の構造につ いて示す。

この７４ヌクレオチド鎖長リボザイムは基質を速やかに開裂することができる。

リボザイムを１０■ＭＭｇＣ１５０５Ｍトリス−ｐＨ８，０及び２ｓＭスペル２ ゝ ミジンを含有した緩衝液中で０〜６０分の様々な時間にわたり基質の存在下でイ ンキュベートしたときに、開裂が起きることがわかる（図３）。図３は様々な時 間後におけるリボザイムとその基質とのインキュベート産物がランされた２０％ ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラフについて示す。基質をＴ４ポリヌ クレオチドキナーゼによりγ−Ａ　Ｔ　Ｐ　”２Ｐで５′で標識し、使用される 前にポリアクリルアミドゲルで精製した。この基質の大部分は最初の数分間のイ ンキュベート時に開裂されることがわかり、その開裂はりボザイムが機能する条 件下で、即ちマグネシウムの存在下で急速に出現する標識化５ヌクレオチド鎖長 バンドにより示される。ＥＤＴＡの存在下で実施されたコントロールは陰性であ り、これはマグネシウム（又は他の二価イオン）の存在に依存する酵素反応が観 察されて、リボザイムの特徴であることを下記実験結果はヌクレオチド５０−７ ７に位置する対合二次構造の存在がこのリボザイムの触媒活性にとり部分的に不 可欠ではないことを示している。

図１で記載されたような８９ヌクレオチド鎖長リボザイムの構造から出発して、 これはある領域が欠失した、特にヌクレオチド５０−７７のヘアピン構造が欠失 した実験により追随される。実際に、このヘアピンはこのリボザイムの構造分析 に適用されるエネルギー最少化プログラムにより計算されたすべての可能な形態 で再びみられる極端に安定な二次構造であり、それは活性構造中でおそらく効果 的に存在している。

この対合二次構造が触媒的役割か又はそうでなくて構造的役割を果たすのかにつ いて調べるために、ヌクレオチド５３−６１及び６６−７４を欠失させた。これ らの欠失は７４ヌクレオチドリボザイムのケースで前記されたようにＤＮＡ断片 を望ましい配列で合成し、しかる後ＰＣＲによりこの断片を増幅させることで行 った。適切なプライマーを用いた増幅とＴ７ＲＮＡポリメラーゼによる転写の後 に、その触媒活性を保存して３７℃及び６０℃で機能する７１ヌクレオチド鎖長 リボザイム構造を得る（図４）。

そのリボザイムをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてγ−Ａ　Ｔ　Ｐ　３２ Ｐで５−で標識し、使用前にポリアクリルアミドゲルで精製した。それをＩ　Ｉ ＩＭＥ　Ｄ　Ｔ　Ａの存在下９５℃で１分間かけて変性させ、しかる後氷上で０ ℃まで急速に冷やす（急冷）。次いで反応媒体をｐＨ８，０の４０■Ｈトリス及 び１０５ＭＭｇ　Ｃ１２を加えることで修正し、しかる後３７℃（２〜７）又は ６０℃（８〜１３）でインキュベートする。様々な時間後に、一部のサンプルを 採取する＝１分間（２＆８）　、２分間（３＆９）、５分間（４〜１０）、１０ 分間（５＆１１）、２０分間（６＆１２）及び６０分間（７＆１３）。コントロ ール（１）では、反応を時間ｔｏ分後で１０　ｍＭＭ　ｇＣ１２添加前に停止さ せた。

天然リボザイム（８９ヌクレオチド鎖長）は１５秒のｔ　ｌ／２てそのＲＮＡを 開裂し、一方欠失すボザイムは３分のｔ１／２を有する。したがって、欠失は触 媒部位に直接影響せずに反応動態を変えるリボザイムの一般構造を変える。

したがって、このループ５０−７７の鎖長を一部減少させることで図２の機能性 リボザイム構造のサイズを減少させることが可能である。

図３の説明： Ｔ１−反応媒体中で６０分間インキュベートされた基質単独 Ｔ２−リボザイムＨΔＶの存在下及びＩＣ）＋ＭＥＤＴＡの存在下反応媒体中で インキュベートされた基質Ｃ−開裂動態−リボザイムＨΔＶの存在下でインキュ ベートされた基質 Ｍ−予想開裂バンド（５ｎｔ）の位置を示すサイズマーカー ３比　ｅｏ”ｃ； 国際調査報告

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．特定のＲＮＡ核酸配列を含む他の分子で触媒トランス開裂活性を有すること ができる、肝炎デルタウイルスのゲノムＲＮＡの１以上の断片からなる肝炎デル タウイルスのゲノムＲＮＡに由来するリボザイム構造。
2. ２．図２で示されたヌクレオチド１６−８９を含む７４ヌクレオチドの配列から の１又は２つの断片から構成される、請求項１に記載のリボザイム構造。
3. ３．図２で示されたヌクレオチド１６−８９を含む７４ヌクレオチド断片からな る、請求項２に記載のリボザイム構造。
4. ４．ヌクレオチド５０−７７の断片部分が欠失された、図２におけるヌクレオチ ド１６−８９から構成される７４ヌクレオチド断片から得られる断片からなる、 請求項２に記載のリボザイム構造。
5. ５．少くとも１２ヌクレオチドの配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記 載のリボザイム構造。
6. ６．他の分子の核酸配列が肝炎デルタウイルスのゲノムＲＮＡ断片に相当し、触 媒トランス開裂活性の基質である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のリボザ イム構造。
7. ７．配列５′ＸＧＧＣＣ３′を各々含む核酸配列又はＲＮＡ配列のＸ（Ｘ＝Ｃ又 はＵ）とＧとのホスホジエステル結合で触媒トランス開裂活性を有することがで きる、請求項６に記載のリボザイム構造。
8. ８．図２で示されたヌクレオチド５−１２をカバーする８ヌクレオチド断片を含 む他の分子の核酸配列で触媒開裂活性を有することができる、請求項６又は７に 記載のリボザイム構造。
9. ９．他の分子中に挿入され、それが挿入された他の分子で自己触媒開裂活性を有 することができる、請求項１〜８のいずれか一項に記載のリボザイム構造。
10. １０．ポリリボヌクレオチドを含む他の分子でリボヌクレアーゼ、特にエンドリ ボヌクレアーゼ活性を有することができる、請求項１〜９のいずれか一項に記載 のリボザイム構造。
11. １１．原核又は真核、動物又は植物細胞で治療又は予防処置法を実施するために 使用できる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のリボザイム構造。