JPH06510367A - アッセイ法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アッセイ法 本発明は、分析物の存在が固体光学表面における屈折率の変化をめることによっ て検出され、その変化が夫々屈折率を増大する種の光学表面への結合又はそれか らの放出に関係するか又は影響する分析物によって起こされる型のアッセイの改 良に関する。

光学表面における前記の屈折率の変化をめる方法の一つの型は、表面プラズモン 共鳴（ｐｌａｓＩｌｏｎ　−ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）　（以下ＳＰＲと呼ぶ）を基 にしている。ＳＰＲの現象は周知である。短くいうと、ＳＰＲは光学的に透明な 材料、例えばガラスと通常銀又は金である薄い金属フィルムとの界面から特定の 角度において反射する光の強度のディップ（ｄｉｐ）として観察され、なかんず く金属表面に近い媒体（例えば試料溶液）の屈折率によって決まる。金属面にお ける屈折率の変化、例えばそれへの材料の吸着又は結合によるものは、ＳＰＲが 起こる角度の対応するシフトを起こす。ＳＰＲが生じるように界面に光をカップ ルさせるために、金属化回折格子（ｆｏｏｄの効果）か、又は金属化ガラスプリ ズムもしくは金属化ガラス基材に光学的に接触しているプリズム（Ｋｒｅｔｓｃ ｈ＋＋ａｎｎ効果）の二つのうちのいずれかの配置が使用される。ＳＰＲについ てこれ以上の詳細については、本発明者らの１０９０１０５２９５が参照される 。ＳＰＲに基づ（免疫アッセイにおいては、リガンドをこの金属面に結合させる ことができ、そしてこの面と接触している水性試料の分析物とのその相互作用が モニターされる。

水及び希水性緩衝液は約１．３３の唄折率を有するが、大部分のタンパク質は約 １．５〜１６の領域の屈折率を有する。ＳＰＨの測定応答は、例えばタンパク質 分子が表面に吸着され、そして表面から水を置換する時に起こされる屈折率の変 化に比例するので、タンパク質と緩衝液との屈折率の差は得ることができる応答 の強さに理論的限界を置く。

例えばハプテンのような、低分子量又は低濃度で存在する物質の場合、分析物が 抗体で被覆された検出面に結合するか、又はそれから解離するとき起こされる屈 折率の変化が極めて小さいために、ＳＰＲを基にする免疫アッセイは問題がある 。

ＳＰＲ免疫アッセイにおける、この問題を除く試みは、ＥＰ−Ａ−２７６１４２ 及びＴｏ　９０／１１５２５　（特定すると前者はｆｏｏｄの効果を利用し、後 者はＫｒｅｔｓｃｈ＊ａｎｎ効果を利用する）に記載されている。

両刊行物は、屈折率を増大する種又はプローブの試薬（例えば競合アッセイにお ける分析物又は分析物類縁体）の複合を開示している。前記のプローブは、例え ば高い屈折率及び（又は）大きいサイズを有する分子又は粒子であってよい。可 能性がある物質は、重い物質（例えば金属イオン又は高級ハロゲン）、高度に電 子が脱分極されている種（例えば多環性芳香族物又は色素）、金属又は金属酸化 物粒子（例えばチタニア粒子）、又は高屈折率有機種（例えばフェリチン）を包 含する。別種のものとして、この物質は、検出面に近い環境より低い屈折率のも のであってよい。この物質は又、検出面上析出され、そして検出面の薄い層中に 存在する材料より高いか又は低い屈折率を有する反応生成物の産生を起こす酵素 であってもよい。

しかし、有機種の中では約１．６〜１．７より高い屈折率を有する分子を見出す ことは困難である。一方、無機種は、約２〜３の屈折率を有することがあるが、 その代わりにタンパク質と化学的に組み合わせることが困難なことがある。した がって二つの引用刊行物により提案されているようなＳＰＲ信号を有意に増大さ せる可能性は、勿論、極度に大きく、かつそれによって実際的でないプローブが 使用されない限り、むしろ限定されている。したがって上記の型のアッセイにお いて、ある種の分析物に対する感度が十分でない問題は尚残っている。

したがって、本発明は、上記の問題を克服すること、並びに検出面における屈折 率の変化の測定を基にするＳＰＲアッセイ及びいずれかの他のアッセイにおいて 感度を実質的に増大させることを目的とする。

本発明によれば、このことは屈折率が波長に高度に依存するという事実を利用す ることによって達成される。この事実は、屈折率が対照的に中立的な材料の定数 として取り扱われている上の二つの既述の先行技術文献にははっきり理解又は示 唆されていない。

即ち、大部分の物質の場合には、屈折率は可視及び近赤外領域の中で波長の増大 と共に極めてゆっくり減少する（正常分散）。しかし、共鳴波長の付近において は、即ち光の吸収ピークにおいては、屈折率は大きく変動する（異常分散と称さ れる現象）。この領域においては、屈折率は、およそ波長に関して吸光率（吸光 係数）の負の導関数（ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）の関数である 。即ち、共鳴波長よりわずかに高い波長において、即ち吸光率の負の導関数がそ の極大を有する場合、屈折率は極大に達する。

本発明によれば、したがって、測定波長が特定のアッセイ中使用される屈折率を 増大する種の吸光率極大とマツチする、更に特定すれば測定波長がその波長につ いて吸光率の負の導関数の極大に対応するような場合には、アッセイ感度のかな りの増大が得られる。このことは屈折率を増大する種が特定の機器もしくは適用 の測定波長と一致するように選択されるか、又は測定波長が特定の屈折率を増大 する種と一致するように選択される方式で行うことができる。

ＳＰＲを基にするオプトケミカルセンサー中の色素原クラウンエーテルの極光率 極大におけるか又はその近くでの測定の使用が、Ｊ。

ｖａｎ　Ｇｅｎｔら、５ｅｎｓｏｒｓ　ａｎｄ　Ａｃｔｕａｔｏｒｓ、　１７（ １９８９）により提案されていることを、この関係で挙げることができる。しか し、この先行技術の場合には、色素原クラウンエーテル分子（クラウンエーテル と発色団との間の複合体）は、金属イオンとのコンプレックス形成の際起こる大 きい色の変化を検出することによって、カルシウム及びバリウムイオンに対する 検出分子として使用することが意図されている。即ち、次のことから明らかなよ うに、本発明とは完全に異なった構想である。

即ち本発明は、分析物の存在が、夫々屈折率を増大する種の光学表面への結合又 はそれからの放出に関係するか又は影響する分析物によって起こされる、試料と 接触している固体光学表面において得られる屈折率の変化をめることによって検 出される、流体試料中の分析物のアッセイ法であって、該屈折率を増大する種の 波長に関して吸光率の負の導関数の極大におけるか又はそれに近い波長を有する 光線を用いて該測定が行われることを特徴とするアッセイ法を提供する。

即ち本発明によれば、この測定は、波長に関して吸光率の負の導関数の極大にお いてか又はそれになるべく近くで行われるべきである。波長に関して吸光率の負 の導関数の極大の高い波長側で測定波長が選ばれる場合には、測定波長と該極大 波長との間の距離は、好ましくは１００１未満（吸光率によって、質量を基にし て少な（とも約５倍の可能性のある増大に相当する）、そして更に好ましくは５ Ｑｒ＋ｍ未鵬（質量を基にして、少なくとも約１０倍の可能性のある増大に相当 する）であるべきである。波長に関して吸光率の負の導関数の極大の低い波長側 で測定波長が選ばれる場合には、吸光率極大の波長に接近するとき、屈折率は再 び減少するので、測定波長は該極大に極めて近くでなければならない。

更に屈折率を増大する種の吸光率（吸光係数）は、できるだけ高く、好ましくは ２０１ｇ−’ｃｍ−’より高く、更に好ましくは５０１ｇ−’ｃｍ−’より高く 、そして特に１０１００ｌ’ｃｍ−’であるべきである。

即ち屈折率を増大する種又はプローブの正しい選択により、極めて高い屈折率を 得ることができる。特定の屈折率を増大する種又はプローブについて、どの特定 の測定波長を選ぶか、又はその逆は勿論、なかんずくその特定のプローブによっ て決まり、本発明の知識を持ちさえすれば当業者は容易に確立することができる 。

本発明の目的のためには、屈折率を増大する種又はプローブは、好ましくは色素 又は発色性分子であるか、又はそれらを包含する。

通常色素分子はタンパク質又はポリペチチド等（例えば抗体又はそのフラグメン ト）の他の分子に複合されている。色素の例は、アジン、チアジン、オキサジン 、シアニン、メロシアニン、スチリル、トリフェニルメタン、クロロフィル及び フタロシアニン型のものである。

本発明を使用することができるオプトケミカル法は、前記のとおりＳＰＲ法に限 定されず、分析物の存在を示すものとして屈折率の変化を測定するいずれの方法 にも拡大される。前記の方法は、内及び外反射法共、例えば楕円偏光法及び消波 分光法（ｅｖａｎｅｓｃｅｎｔｗａｖｅ　５ｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）を包含し 、後者はＢｒｅｗｓｔｅｒ角度反射測定法（ａｎｇｌｅ　ｒｅｆｌｅｃｔｏｍｅ ｔｒｙ）、角度反射測定法、消波楕円偏光法、散乱全白反射（Ｓ　Ｔ　Ｉ　Ｒ） 、光学導波路（ｏｐｔｉｃａｌ　ｗａｖｅｇｕｉｄｅ）センサー等を含む。

流体試料媒体と光学面との間の接触は、静的であってよいが、好ましくは動的、 即ち何らかの種類のフローセルにおける検定面を提供することによる。

本発明を利用するのに適しているアッセイ様式は、競合アッセイ、置換アッセイ 及びサンドイッチ型アッセイを包含する、前記の１０９０／１１５２５及びＥＰ −＾−２７６１４２に記載されているものを包含するが、決してそれらに限定さ れない。競合アッセイにおいては、検定面に結合する場合プローブは分析物と競 合するが、置換アッセイにおいてはプローブは検定面に結合し、そして分析物に よって置換される。

サンドイッチアッセイにおいては、分析物が検定面に結合される前か又は後に、 プローブが分析物に結合される。

即ちパブテン、例えばテオフィリン等のための競合アッセイは、テオフィリンに 適当なプローブを複合させ、そしてプローブの吸光率極大においてか又はその近 くでプローブと混合される時、試料が検定面への複合テオフィリンの結合に影響 する、即ちそれと競合する程度を測定することによって行うことができる。

本発明のアッセイの実施可能なことを実証するために、市販のＳＰＲを基にした バイオセンサー機器を用いて次の実験を行つた。

実施例　１ ５０％のエタノール及び５０％のクエン酸緩衝液（ｐＨ１３，０，１Ｍのクエン 酸、０．５ＭのＮａ（Ｊ、　０．０５％のＴｖｅｅｎ０２０）の混合物中色素Ｈ ＩＴＣ（ヨウ化１．１’、３．３．３’、３’−へキサメチルヨードトリカルボ シアニン、９４％の純度、Ｓｉｇ＋ｓａ　ｌ’１０３８７）を夫々０，０．２５ ．０．５及び０．７５ｍＭの濃度に溶解した。この溶液を７６００■の測定波長 を有するＢＩ八へｏｒｅＴｌ″機器（Ｐｂａｒ■ａｅｉａ　Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ 　ＡＢ、　Ｕｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）中に注入した。溶離剤として純ク エン酸緩衝液を使用し、各パルスについて屈折率応答を読んだ。同一の検定面（ Ｓｅｎｓｏｒ　Ｃｈｉｐ”　Ｃｌｌ５．　ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｓｅｎｓｏ ｒ　ＡＢ、　Ｕｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）に対して二つの試験系列を実施 した。再現性は良好であった。

図１において応答（共鳴単位、Ｒｕ）がＨＩＴＣ濃度に対してプロットされてい る。このグラフから明らかなように、直線適応度は良好である（　ｒ　＞　０． ９９９）。パルスの方形波の出現と組み合わせると、このことは、体積（ｂｕｌ ｋ）屈折率の変化のみが起こり、検定面へのＨＩＴＣの吸着は起こっていないこ とを示す。

モル屈折率増分は２５４０Ｒｕ／ｍＭであることが見出された。分子量は５３７ ９１モルであり、そしてＩＲｕ＝１０−’屈折率単位であるので、計算質量基準 屈折率増分は４．７３厘１／ｑ　（２，５４０４！・モルー電１５３７９・モル −１）である。タンパク質は一般に０゜１８５ｍ１／　９の値を有するので、こ の非最適化実験における増幅又は増大係数は、約２５Ｘである。したがって、そ れより高い増幅係数も可能であるように思われる。

エタノール／クエン酸で４ａＭに希釈したＩＩＩＭのＨＩＴＣについて５００〜 ９００ローの範囲の吸光スペクトルを測定した。吸光率極大は７４３ｎｍにおい て２５０．　ＯＯＯｃｍ−’Ｍ−’又は４１０ｈ−’ｃｍ−’であった。負の吸 光率導関数は７６０〜７７０ロｍにおいてその極大を有し、−７，５００ｃｍ− ’Ｍ−’ｎｒ’又は−１４１ｇ−’ｃｗｔ−’ｎ１１−’であった。得られたス ペクトルは、前に公表されたデータとよく一致していた。

実施例　２ ヘプタンの標識化による増大の評価 Ｐ、Ｌ、　Ｓｏｕｔｈｗｉｃｋら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、　１１（１９９０）、 ４１８、色素Ｘ■に従って色素１．１′−ジ（４−スルフォブチル）　−３，３ ，３’、３’−テトラメチル−６−カルボキシメチル−インドトリカルボシアニ ン（以下“ビという）を合成した。この色素は水溶性であり、」二の実施例中使 用された色素ＨＩＴＣの反応性誘導体である。水中吸収極大は７４６止において であった。

３５−Ｍのアミノテオフィリン（８−（３−アミノプロピル）テオフィリン）（ ０，４２μモル）を含有するホウ酸緩衝液１２ｈＡ’にＴＳＵ　（テトラフルオ ロホウ酸０−（Ｎ−サクシンイミジル）　−Ｎ、　Ｎ、　Ｎ’　、　Ｎ’−テト ラフルオロホウ酸、Ｆｌｕｋａ）で活性化した。Ｉ　Ｏ，９８１１９（１，２１ １モル）で溶解した。この反応は透明な溶液を生じた。薄層クロマトグラフィー により、このアミノテオフィリンは完全に使い果たされたことが確かめられた。

この反応混合物の吸収スペクトルは、純粋な■のものに似ていた。後の実験にお いては、それ以上精製することなしにこの反応混合物を使用した。

純アミノテオフィリンと比較して、この複合体■−アミノテオフィリンのＳＰＲ 応答を実施例１中使用したのと同じＢＩＡｃｏｒｅ”機器で評価した。検定面は 、実施例中使用したように、センサー・チップＣ１１５であり、その上にＢＩＡ ｃｏｒｅ”アミンカップリングキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｓｅｎｓｏ ｒ　ＡＢ、　Ｕｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）を使用してモノクローナル抗体 が固定されていた。

最初に、複合体■−アミノテオフィリン３５μ菫を、いくらか異なった量の固定 化抗−テオフィリン抗体を持つ３つのセンサー・チップ上に注入した。応答は最 小量の抗体を持つセンサー・チップの場合の１１４０Ｒｕ　（共鳴単位）から最 大量の抗体を持つセンサー・チップの場合の１７５０Ｒｕまで変動した。試料を 含有するパルスが検定面を通過した時、複合体は抗体からゆっ（り解離した。

第二に、複合体■−アミノテオフィリン３５μ麗を、変性されていないセンサー ・チップ上及び固定化抗ＩｇＥ抗体を持つセンサー・チップ上に注入した。応答 は数百Ｒｕのオーダーであった。両方の場合共、試料パルスがこの面を通った時 、応答は直ちにゼロに戻り、応答が体積屈折率の増大のためであること、そして この面への吸着が起こらないことを示した。

第三に、純アミノテオフィリン３５ａｌｌを、固定化抗テオフィリン抗体を持つ センサー・チップ上に注入した。（抗体の量は、複合体が注入された時１１４０ Ｒｕを生じた上の実験のものと等しかった）。応答は６８Ｒｕであり、試料パル スがこの面を通った時、このアミノテオフィリンは抗体からゆっくり解離した。

純アミノテオフィリンと比較して複合体■−アミノテオフィリンを使用した時増 大係数は、このようにして１１４０／６８＝１７Ｘ　（体積屈折率の変化を無視 して）であった。アミノテオフィリンの濃度は、抗体の結合部位を完全に飽和す るように選ばれて、増大した応答が結合量の差のためでないことを確実にした。

第四に、アミノテオフィリン１６０ｈＭ及び■−アミノテオフィリン複合体３２ ｘＭの混合物を、固定化抗テオフィリン抗体（前の場合よりわずかに多い抗体） を持つ５ｅｎｓｏｒ　Ｃｈｉｐ上に注入した。試料パルスの間の応答は３４０Ｒ ｕであった。試料パルスがこの面を通過した時、免疫コンプレックスの解離のた めに、応答はゆっくり減少した。それにもかかわらず解離の間の応答は、純アミ ノテオフィリンの解離の間より有意に高かった。この実験は、アミノテオフィリ ン及び複合体■−アミノテオフィリンが抗体上同じ特異的部位について競合する こと、そして複合体Ｉ−アミノテオフィリンの増大した応答が非特異的結合によ って起こされていないことを示す。

実施例　３ サンドイッチ操作を使用するベーター２−ミクログロブリンについてのアンセイ 中二次抗体の標識化による増大の評価（ｉ）　標識化：後述するサンドイッチア ッセイ中使用されるいわゆる二次抗体、ベーター２−ミクログロブリンに対する ポリクローナルウサギ抗体を、実施例における色素物質Ｉで標識化した。物質■ （１７，ｂｇ）を乾燥ジメチルフォルムアミド（２，５譚ｌ）中ＴＳＵ（８，４ 譚ｇ）と３５分間反応させた。乾燥ジエチルエーテル（Ｌｏｇ／）を添加し、沈 殿を更に３譚ｌのジエチルエーテルで３回洗い、デシケータ−生乾燥した。次に このもの０．６厘９を、ベーター２−ミクログロブリンに対するポリクローナル ウサギ抗体の溶液（０，１Ｍのホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐｔ！８．５中２ｗｇ ／　ｖｓｌ）２００μＩと２時間室温において反応させた。

この反応溶液を燐酸緩衝液（０，１Ｍ塩化ナトリウムと共に０．１Ｍの燐酸すト リウム、ｐＨ７，０）　６００ａｌで希釈し、未反応の色素を除去するためにＮ ＡＰ−１ｏカラム（Ｐｈａｒｌｌａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ ｙ　ＡＢ、　Ｕｐｐｓａｌａ。

３ｗｅｄｅｎ）上溶離した。夫々抗体及び色素に対応する２８０ｎｍ及び７５０ ｎｍにおける吸収を測定することにより、修飾度を評価した。抗体あたり約６色 素分子の修飾が得られた。

（■）サンドイッチアッセイにおける評価：製造者の勧告に従ってＢＩＡｃｏｒ ｅ”アミン・カップリング・キットを使用するアミンカップリングにより、前に 使用したＢＩ＾Ｃ０ｒｅＴ１′機器中ベーター２−ミクログロブリンに対する抗 体をセンサー・チップＣＭ５に固定した。順次、ベーター２−ミクログロブリン の試料パルス（１２５ｎｇ／　ｄ、１分）及びベーター２−ミクログロブリンに 対する二次抗体のパルス（７分）を、センサーチップ面上通した。応答を記録し 、標識及び非標識二次抗体について比較した。標識抗体の場合２．２の増大係数 が得られた。前のベーター２−ミクログロブリンパルスなしにセンサーチップ面 上二次抗体溶液を注入することによって非特異的結合の量を測定するために、対 照実験を行った。標識及び非標識抗体は、この面への無視しつる結合を示した。

−０，２５００，２５０，５０，７５１）ｆＩＴｃ濃度（ｍＭ） Ｆ工Ｇ、１ 国際調査報告 １．１−Ｎ１．、、、、−１．、、Ｉ−、、ＰＣＴ／ＳＥ　９２１００５５１１ ＋国際調査報告 フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、ＡＵ 、ＣＡ、ＪＰ、ＵＳ

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．分析物の存在が、試料と接触する固体光学表面において得られる屈折率の変 化を求めることによって検出され、その変化が夫々屈折率を増大する種の光学表 面への結合又はそれからの放出に関係するか又は影響する分析物によって起こさ れる流体試料中分析物のアッセイ法であって、該屈折率を増大する種の波長に関 して吸光率の負の導関数の極大におれるか又はそれに近い波長を有する光線を用 いて該測定が行われることを特徴とするアッセイ法。
2. ２．該測定波長が該極大の高波長側にあるとき、測定波長と該極大との間の距離 が１００ｎｍ未満、更に好ましくは５０ｎｍであること、そして該測定波長が低 波長側にあるとき、測定波長が該極大に近いことを特徴とする請求項１の方法。
3. ３．該屈折率を増大する種が発色団又は色素に複合しているタンパク質又はポリ ペプチドよりなることを特徴とする請求項１又は２の方法。
4. ４．該屈折率を増大する種が発色団又は色素に複合しているハプテンよりなるこ とを特徴とする請求項１又は２の方法。
5. ５．該測定が内反射を基にすることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１つの 方法。
6. ６．該測定が表面プラズモン共鳴を基にすることを特徴とする請求項５の方法。
7. ７．該測定が外反射を基にすることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１つの 方法。
8. ８．該アッセイが競合アッセイ、置換アッセイ及びサンドイッチ型アッセイから 選択されることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１つの方法。
9. ９．該アッセイが免疫アッセイであること特徴とする請求項１〜８のいずれか１ つの方法。