JPH06510431A

JPH06510431A - ジェロニン・ポリペプチドをコードするｄｎａ配列

Info

Publication number: JPH06510431A
Application number: JP5505226A
Authority: JP
Inventors: ロウゼンブラム，マイクル，ジィ．; ビーティ，ケニス，エル．
Original assignee: Research Development Foundation
Current assignee: Research Development Foundation
Priority date: 1991-09-06
Filing date: 1992-08-21
Publication date: 1994-11-24
Also published as: DE69227519T2; IL103057A0; IL103057A; US5624827A; RU2142015C1; CA2115049C; NO940736L; NZ244220A; WO1993005168A1; EP0602144B1; RU94034733A; NO317659B1; EP0602144A4; KR100270195B1; CN1047402C; ZA926705B; DK0602144T3; DE69227519D1; FI113547B; AU2547692A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称　ジェロニン・ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列遣ＪＦと１反１、且豆五立互本発明は一般的には免疫毒素ジエロニンに関し、より具体的には、ジェロニンに関する合成遺伝子を生産するためのプロセスを含む、ジエロニンの分子生物学に関するもの細胞毒性物質に関する本発明は、特定の標的腫瘍細胞に対するその使用の可能性を含んでいる。植物毒素であるジエロニンは非常に注目されている。

ジエロニンはＧｅｌｏｎｉｕｍｍｕｌｔｉｆｏｒｕｍの種子から精製された糖蛋白質（分子量＝２９−３０．０ＯＯＫｄ程度）である。ジエロニンは強力リボゾーム不活性化植物毒素のクラスに分類されている。このクラスの他のりボゾーム不活性化植物毒素としてはアルビン、リチン、およびモーフシン　ｍｏｄｅｃｃ　ｉ　ｎ　の鎖である。ジエロニンは、アルビンやりシンと同様、は乳類リボゾームの６ＯＳサブユニツトを破壊することにより、蛋白質合成を抑制する。リシン（ＲＴＡ）のＡ鎖は免疫毒素としては広く使われているが、ジエロニンはＰＴＡより化学的および物理的取り扱いに対してより安定的であるように思われる（ＢａｒｂｉｅｒｉらＣａｎｃｅｒ　５ｕｒｖ　１　：　４８９−５２０　（１９８２）　）　。さらに、ジエロニン自体は細胞と結合せず、したがって、毒性がなく（濃度が非常に高い場合は除いて）、実験室で安全に取り扱うことができる。リボゾームの不活性化は不可逆的で、補助因子を含むようには思われず、ジエロニンが酵素的にふるまうことを示唆する効率で行われる。

ジェロニンとりシンとは蛋白質重量ベースで蛋白質合成を抑制する最も活性のある毒素のうちに含まれるものである。ジェロニンは蛋白質の抑制においてはりシンＡ鎖より１０倍から１０００倍は強力である。リシンおよびアルビンのようなペプチドは、毒性ユニットであるＡ鎖と、細胞に結合することにより作用を発揮するＢ鎖との２つの鎖により構成されている。リシンおよびアルビンの場合と違って、ジェロニンはひとつの鎖で構成されており、細胞に結合するためのＢ鎖を欠いているので、それ自体の毒性は比較的低い（Ｓｔｉｒｐｅ、らＪ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、　２５５　：　６９４７−６９５３（１９８０）　）。哺乳動物の細胞は天然のジエロニン分子に結合したり、または内部化する能力を明らかに欠いている。

ジェロニンと黒色腫細胞など一定の腫瘍細胞上の抗原に向けられたモノクローナル抗体ＺＭＥなとの腫瘍標的モノクローナル抗体との結合体は、ジエロニンを細胞と結合させるための具体的な方法やジエロニン抗体複合体の内部化のためのルートを提供する。リシンＡ鎖などの毒素より毒素ジエロニンの使った方がよいことのひとつは、リシンＡ鎖と比較して、正常な組織に対する毒性が上に述べたように低いことである。抗腫瘍関連抗原に向けられたモノクロ−ナル抗体と結合したジェロニンは腫瘍治療のための有効で、選択性のある免疫毒性剤である。

何人かの研究者は、ジェロニンをモノクローナル抗体、あるいはペプチド・ホルモン細胞標的リガンドと化学的に結合された細胞毒性剤として用いている。しかしながら、ジェロニンおよび細胞標的成分の化学的な修正は標的効率を低下させ、さらに、ジェロニン自体の細胞毒性自体を低下させる可能性がある。さらに、ジエロニンの天然供給源は、ジェロニンの細胞毒性活性に影響を及ぼす可能性がある取り入れや植物の成長条件などにより変化しやすい。化学的な方法で、あるいは遺伝子組み替え技術を用いて合成ジェロニン毒素をつくりだす能力は、この毒素の、豊富で再現性のある供給源を提供する。したがって、ジエロニンのための合成遺伝子と、遺伝子組み替え技術を用いて合成遺伝子をつくる方法を提供することは、非常に望ましいことである。

１訓り旧１紅本発明はジエロニン用合成遺伝子に関するヌクレオチド配列とその調製法を提供するものである。ジエロニン用合成遺伝子のＤＮＡ配列はＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　１　：に示す通りである。本発明はまた、これらＤＮＡ配列を含む表現ベクトルと、これらのベクトルで形質変換された細胞を提供するものである。

本発明のひとつの実施例によれば、ジェロニンをコード表現する合成遺伝子をつくりだし、クローンし、そして表現するだめの方法が提供される。先ず、精製ジェロニンから確認される一部アミノ酸配列をコード表現する二本鎖ＤＮＡフラグメントが作成された。このフラグメントを操作して、その遺伝子の合成、クローニング、表現、および生化学的操作をやりやすくした。次に、−緒に合体して望ましい遺伝子を作り上げることができる一組の合成オリゴヌクレオチドを設計、合成、精製、そして５′−ホスホリル化した。その後、これらのオリゴヌクレオチドをアニールし、ライゲネーションして、完全な遺伝子を作成した。この合成遺伝子を適切なりローニング・ベクターを結びつけて、クローンされた遺伝子のヌクレオチド配列を判定した。そのクローンされた遺伝子のすべての望ましくない突然変異を終生するために特定の部位に向けた突然変異生成を実施した後、その遺伝子を適切な表現ベクターにサブクローンした。この合成ジェロニン遺伝子を含んでいる表現ベクターを適切な表現ホストに挿入した。その後、その表現ホストをジェロニン遺伝子生成物およびジェロニン蛋白質の生成に適した条件の下で保持して、ジェロニン蛋白質をその遺伝子を表現している細胞から分離、精製した。

本発明の別の実施例によれば、ヌクレオチドおよびそのフラグメントや誘導体の配列を含み、細胞蛋白合成は抑制するが、細胞表面レセプターには結合しない蛋白ジェロニンまたはポリペプチドを表現する合成りＮＡが提供される。なお、このヌクレオチド配列はＳＥＱ、　ＩＤ、　Ｎｏ、１に示す形を有している。また、合成りＮＡを含む表現ベクターと、合成ジェロニン遺伝子を含み、それを表現するホスト細胞も提供される。

本発明のさらに別の実施例によれば、植物毒素蛋白ジェロニンに接合した抗体により構成される免疫毒性も提供される。

本発明の目的に則して、「フラグメント」という用語は細胞蛋白合成は抑制するが、細胞表面レセプターには結合しないＳＥＱ、　ＩＤ、　Ｎｏ、　１のいずれかの部分を意味するものと定義する。「誘導体Ｊとは同じ蛋白質またはポリペプチドがつくりだされるような、ひとつ、あるいは複数の核酸の置換基を有するものと定義する。

本発明は上に述べたような、これまで長い間感じられてきたニーズに対応するものであり、それらのニーズの解決法およびその種々の実施例を提供するものである。本発明の教示あるいは開示から利益を得られる当業者にとっては、他の、そしてさらなる目的や利益、あるいはそれらに本質的に付随する目的や利益も、自ら明らかであろう。以下に、現時点での好ましい実施例を、関連図面と共に、開示の目的で示す。

これらの説明は正確に理解できる程度に詳細に示されているが、これは他の人がそのバリエーションや形態、あるいは改良を加えるなどの方法でどのように装おうとも発明の権利を請求できるという特許の目的を損うものではない。

皿工立囚皇皇盈玉上に述べた本発明の特徴、利点および目的、および以下に明らかにされる他の特徴、利点および目的をより詳しく理解できるように、上に要約的に述べた本発明を、以下に、添付図面に示される実施例とともに、更に詳しく説明する。これらの図面は本明細書の一部を形成するものである。なお、添付図面は本発明の好ましい実施例を示すものであって、発明の範囲の限定を意図したものではない。本発明においては、他の、同様に有効な実施例も可能であろう。

図１はオリゴヌクレオチドを化学的に合成するためのプロセスの概要図である。

図２は固体層遺伝子形成プロセスの説明図である。

図３はジエロニン遺伝子形成プロセスの概要図である。

図４はジェロニン遺伝子形成におけるオリゴヌクレオチド配列の概要図である。

図５はジェロニン遺伝子を形成するために用いられるオリゴヌクレオチド配列を示す図である。

の　な分子生物学の分野における最近の発展により、生物医学および農業において重要な蛋白質をコード表現する多数の遺伝子のクローニング、表現、および遺伝子工学が可能になってきている。この分野における最近の重要な成果は合成遺伝子の設計と生産が可能になったことである。合成遺伝子は知られているアミノ酸配列の蛋白質と同様に自然には存在しない新しい蛋白質をコード表現することができる。このことはジェロニンなど医療上重要な蛋白質の場合、特に有益である。

ひとつの蛋白質のアミノ酸配列に基づいて、特定の遺伝子を設計、合成、クローン、そして表現することが可能である。

自然の遺伝子に関する具体的な情報がなくても、例えば、その遺伝子がこれまでクローンされたことがなかったとしても、設計、配列、クローニング、および表現が可能である。さらに、遺伝子合成は、自然につくりだされる蛋白質には見られない特性をもった変種遺伝子生成物のエンジニアリングは容易にしてくれる。

例えば、通常は植物や動物でだけ見いだされる蛋白質をコード表現する遺伝子を設計、合成し、微生物ホスト細胞内でその蛋白質を大量につくりだすベクター内にクローンすることも可能である。

合成遺伝子のひとつの利点は、遺伝子コードの重複性に関連している。はとんどのアミノ酸はひとつの遺伝子内部の複数の３−塩基「コドンＪによりコード表現することが可能である。異なった生物は自分の蛋白質のためにコドンの異なった組み合わせを用いる傾向がある（Ｓ、　Ａｏｔａら、　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、、　ｖ、１６．　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、　ｐｐ、　ｒ３１５−ｒ３９１　（１９８７）　）。

言い換えると、ひとつの生物によって「好まれる」コドンは他の生物は好むものとは異なっているようなのである。この現象は、特定のアミノ酸に関する特殊同位受容転移ＲＮＡ分子の相対的な豊富さの差によるものと考えられている。合成遺伝子は、その遺伝子生成物が一定のアミノ酸に関する好ましいコドンの異なった組み合わせを用いる「異種」ホスト生物からのものであったとしても、一定の表現システムのための好ましいコドンを組み込むことが可能である。哺乳動物の蛋白質をコード表現する合成遺伝子は、遺伝子設計で選択されたコドンが微生物ホストによってもっとも一般的に用いられるものと対応していれば、その微生物ホスト内でがなり大型の蛋白質生成物をつくりだすことが示されている。この現象は大腸菌表現ホスト内に導入することを目的としたジェロニン遺伝子（最初は植物から得られた）の構造に関係していると考えられた。異なったホスト・システム内での表現のためには、その異なったホストのために最適なコドンを組み込むために、ジェロニン遺伝子を再設計することは当業者により容易に行うことが可能であろう。

このケースでは遺伝子コードの重複によって実際に可能になる合成遺伝子のもうひとつの利点は、対象となる遺伝子をコード表現するＤＮＡ配列を（コード表現されたアミノ酸配列を変えずに）修正して、遺伝子全体に最大数の均一に分布した制限酵素認識分の１を含めることが可能な点である。ひとつの遺伝子全体に多数の単一切断制限部位が存在していると、その遺伝子の生化学的操作が非常に簡単になる。例えば、ひとつの遺伝子のあるセグメントを切開して、それを別のＤＮＡ配列と取り替えることができれば（これは小さな間隔を置いて分布している制限部位によって可能になる）、組み替えＤＮＡ技術によって、その遺伝子に新しい遺伝情報を組み入れることができる。こうした方式で可能になる有益な操作としては、ひとつの遺伝子の決められた場所への突然変異の導入、遺伝子合成、組み立て、およびクローニング中に発生する突然変異の修正、および別個の蛋白質の機能領域を組み合わせた蛋白質をコード表現しているキメラ性または融合遺伝子の作成などがある。

合成遺伝子の設計では、遺伝子のクローニングや表現を容易にする非コーディング「フランキング（ｆｌａｎｋｉｎｇ）　ｊＤＮＡ配列の取り込みも可能である。例えば、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をその遺伝子のフランキング領域に組み入れて、遺伝子の特定の望ましいクローニング・ベクターへの特定の結合を可能にすることができる。さらに、遺伝信号をイン・ビボで遺伝子表現の制御に役立つ合成遺伝子に組み入れることも可能である。

加えて、実際的にデノボ（ｄｅ　ｎｏｖｏ）の遺伝子設計により、遺伝子生成物を特定の組織または細胞器官に向かわせて、その遺伝子生成物の治療作用を強化することができる。例えば、特に標的細胞の表面のレセプターに結合するポリペプチド領域をコード表現する配列を関連遺伝子に組み込むことによって治療剤を特定の細胞タイプに向かわせることが可能になる。

合成遺伝子の設計は、さらに、短いＤＮＡ配列の化学的合成およびオリゴヌクレオチドのより長い二重ＤＮＡ配列への組み込みに関連した考慮も含まれている。

ＤＮＡの化学的な合成においては、多数のＧまたはＣ残基をひとつの鎖に連続的に付加することに関連した結合効率が低くなることを避けるのが有利である。また、成分オリゴヌクレオチドのアニーリング中に遺伝子の正しい組み込みを妨害する可能性がある、領内二次構造（ヘアピン構造）または分子内相補性を有するＤＮＡ配列を避けるのが望ましい。こうした課題は、通常、遺伝子設計内に交互にコドンを選択することによって実現することができる。

遺伝子組み込みのプロセスは以下のステップで構成される。

まず第一に、望ましいコーディング領域の２つの鎖に対応するヌクレオチド配列を作成して、２つの鎖の間に完全に相補的な塩基ベアリングを実現する。次にいずれかの望ましいフランキング配列を追加する。例えば、コーディング配列に隣接して制限エンドヌクレアーゼ認識部位を組み込むために、フランキング配列を追加することができる。次に、その遺伝子を一本鎖・フラグメントの重複した部分（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇｓｅｔｓ）に分割する。この一本領・フラグメントは自動化ＤＮＡ合成機器によって化学的に合成される。合成遺伝子の長さ方向での連続するオリゴヌクレオチド間の相補重複の程度は自由に選択できるが、通常は６−２０塩基である。その合成遺伝子に必要なすべてのオリゴヌクレオチドが化学的に合成されたら、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動または高性能液体グロマトグラフィーによって精製するのが好ましい。そして、精製したオリゴヌクレオチドをポリヌクレオチド・キナーゼおよびアデノシン５′−トリフオスフェートの作用によって５′−フオスフォリル化する。そしてそれらの鎖を、単一混合体か、３−１０重複オリゴヌクレオチドのブロックのいずれか、あるいは、固体相基質へのオリゴヌクレオチドの段階的追加によって、アニールする。そして組み込まれた遺伝子の末端に遺伝子のクローニングで用いられる制限部位を組み込む。組み込まれた遺伝子は、通常、ＤＮＡ配列決定をやり易くするために、最初に一本鎖・ベクターＭ１３にクローンされる。必要であれば、オリゴヌクレオチド指向変異を行って、突然変異体を修正する。

合成遺伝子の望ましい特徴（コドンの最適な使い方、独特な制限部位の出現、二次構造の排除など）は、マイクロコンピュータで使える市販のＤＮＡ配列分析プログラムを使って設計することができる。

いずれも本発明で用いられている最近の２つの開発では、遺伝子をより迅速に、そしてより経済的に合成し、さらに、蛋白質エンジニアリングの新しい可能性を提供する（Ｋ、Ｌ。

Ｂｅａｔｔｉｅ　ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　Ａｐｐｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１０．　５１０−５２１（１９８８）　；　Ｋ、　Ｌ、　ＢｅａｔｔｉｅおよびＲｏＦ、Ｆｏｗｌｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、　３５２゜５４８−５４９　（＋９９１）　）。図１に示す第一の開発成果は、多数のオリゴヌクレオチドを迅速、かつ経済的に合成するための技術である。この技術は、遺伝子への一日での組み込みに必要なすべての合成りＮＡの調製を可能にしてくれる。図１で、ヌクレオシド誘導制御多孔性ガラスがウェハーの堆積を通じて液体が流れるようにするための多孔性端部を有するテフロン製シリンダーでできた個々の合成ウェハー内に置かれる。

ＣＰＧに取りつけられ、ウェハー内に保持されるＤＮＡ鎖へのＡ、Ｇ、ＣまたはＴの同時追加はホスホルアミド化法によってカラムを通じて試薬を連続的に流すことによって達成される（Ｌ、Ｊ、　ＭｃＢｒｉｄｅおよびＭ、Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、　ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ、、　２４．２４５−２４８　（１９８３）　）　、各化学反応サイクルの終了後、ウェハーを個々のカラム別に分けて、各ウェハー内で異なったヌクレオチド配列の合成を行う。４つのサイクルを通じてのひとつのウェハー（黒くした部分）の配列位置がされており、これにＡＧＣＴを追加すると、そこに含まれている成長ＤＮＡ鎖ができる。

遺伝子合成を可能にする第二の技術は、遺伝子を形成するために、固体相基質への合成オリゴヌクレオチドの段階的組み込みの手段を提供する。図２で、望ましい遺伝子は重複相補性オリゴヌクレオチドの組み合わせから形成されるように設計されている、この形成は末端で固体相基質に結合されたオリゴヌクレオチドにより開始される。５′−ホスホリル化オリゴヌクレオチドが基質結合鎖に（モル過剰で）連続的に追加される。遺伝子形成の各ステップで、未結合ＤＮＡは、次のアニーリング反応を開始するまえに洗い流される。完成した組み合わせは刻み目をつけるためにＤＮＡリガーゼで処理し、その後、基質結合オリゴヌクレオチド内に含まれている独自の制限部位での切断により基質から切り離される。切り離されたＤＮＡは配列決定および表現のために適切なベクターに結びつけられる。

コード表現された蛋白質の生産に結びつく合成遺伝子の表現にはベクター−ホスト環境において多数のオプションが存在する。これらについては、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ。

１５２、１９８７．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、に詳しく述べられている。要約的にいえば、特殊化された表現ベクターを微生物、菌類、動物、または植物ホストに組み込むために用いることができる。「外来」遺伝子の表現のためには、大腸菌が最もよく使われている。真菌であるサツカロミセスももうひとつのよく使われる表現ホストである。上にも述べたように、問題のクローンされた遺伝子が化学的に合成される場合、望ましい表現ホストのための最適コドン使用法を遺伝子設計で規定することができるので、表現のレベルが増大する。はとんどの表現ベクターは、高レベルの遺伝子表現を発現するクローニング部位に隣接した場所に配置された遺伝制御要素を含んでいる。表現ベクターの誘発可能プロモーターは、通常、バクテリア（ｔａｃ、　Ｌｒｐなと）、またはウィルス（ｌａｍｂｄａ、　ＳＶ４０など）から誘導される。「信号配列Ｊ要素がベクターに含まれている場合も時々あり、そうした場合、遺伝子生成物がホスト細胞の外に送り出される。これら信号配列要素は精製を容易にすると同時に、蛋白質分解による劣化を減少してくれる。合成遺伝子の場合、どのような望ましい遺伝子制御も形成される二重ＤＮＡの内部に取り入れることが可能である。いくつかの表現ベクターはクローニング部位にすぐ隣接してコーディング配列を含んでいるので、外来コーディングのフレーム内での挿入によって融合蛋白質がつくりだされる。

合成遺伝子の場合、形成された配列内にさらにコーディング配列を組み込むことも可能である。融合蛋白質としてひとつの遺伝子を形成すると、表現レベルの増大、安定性の向上、追加ポリペプチド成分に結合する基質結合リガンドを用いての迅速な親和精製、そして遺伝子生成物の細胞標的（例えば、その追加ポリペプチド成分に対する細胞表面レセプターを保有する細胞タイプへの）など、いくつもの利点が得られる。この最後の特性を組み込むための遺伝子工学は、今後のジェロニンに基づく医療において活用される可能性がある。

植物毒素ジェロニンをコード表現するＤＮＡ配列のクローニングおよび表現においては、広範なベクターを用いることができる。これらには、例えば、バクテリア性プラスミドとして知られているＳＶ４０の種々の公知の誘導体、例えば、ｃａｌＥｌ、　ｐｃＲｌ、　ｐＢＲ３２２，ｐＭＢ９およびそれらの誘導体を含む大腸菌からのプラスミド、例えば、ＲＰ４、ファージＤＮＡなどのより広い範囲のプラスミド、ＮＭ９８９およびＤＮＡファージ、例えばＭ２Ｓおよびフィラメント性一本領ＤＮＡファージ、２ｍｕプラスミドまたはその誘導体などのイースト・プラスミド、およびファージＤＮＡあるいはその他の表現制御配列を用いるように修正されたプラスミドなどのプラスミドとファージＤＮＡの組み合わせからの誘導されるベクターなど、グロモゾーム性、非グロモゾーム性および合成りＮＡ配列のセグメントで構成されているベクターが含まれている。

それぞれのクローニングまたは表現媒体の内部で、本発明のＤＮＡ配列を挿入するために種々の部位を選ぶことができる。これらの部位は、通常、それらを切断する制限エンドヌフレアーゼによって指定されるもので、当業者には公知である。組み替えＤＮＡ分子を形成するためにこれらの部位にＤＮＡ配列を挿入するための種々の方法も公知である。これらには、例えば、ｄＧ−ｄＣまたはｄＡ−ｄＴティリング、直接ライゲーション、合成リンカ−、エグゾヌクレアーゼおよびポリメラーゼ修復反応を行いその後でライゲーションする方法、またはＤＮＡポリメラーゼおよび適切な一末鎖テンプレートによってＤＮＡストランドを伸長させ、その後でライゲーションする方法などがある。もちろん、本発明で有益なりローニングまたは表現媒体は選択されたＤＮＡフラグメントの挿入のための制限エンドヌクレアーゼを保有している必要はない。その代わりに、その媒体は別の手段によってフラグメントに結合することは可能であろう。

本発明のＤＮＡ配列を表現するために、これらＤＮＡ配列は表現ベクター内でひとつ、あるいは複数の表現制御配列に操作的に結合される。選択されたＤＮＡ配列をクローニング媒体内に挿入する前でも後にでも行うことができるこうした操作的結合によって、表現制御配列が挿入されたＤＮＡ配列の表現の制御と促進を行うことができるようにする。

ＤＮＡ配列の表現を制御するための表現制御配列のさまざまな変種のいずれでも、本発明のＤＮＡ配列を表現するためにこれらのベクターで用いることができる。こうした有益な表現制御配列としては、例えば、ＳＶ４０の初期および後期のプロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣまたはＴＲＣシステム、フェーズ・ラムダの主要オペレータおよびプロモーター、ｆｄコート蛋白質の制御領域、３〜ホスホグリセレート・キナーゼまたはその他の解糖性酵素、Ｐｈｏ　５などの酸ホスホツーゼのプロモーター、イースト・アルファーメイティング・ファクターなどのプロモーター、そして、原核または真正核細胞またはそのウィルスの遺伝子の表現を制御することが知られている他の配列や、その種々の組み合わせなどがある。哺乳動物の細胞に、さらに遺伝子をデヒドロフオレート・リダクターゼをコード表現する遺伝子と結合させ、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞に対する選択を利用して、表現単位を増幅することが可能である。

表現媒体のベクターと、特に、本発明で選択される特定のＤＮＡフラグメントと表現制御配列を挿入するためにその内部で選ばれる部位は、いろいろなファクターによって決定される。これらのファクターには、例えば、特定の制限酵素に対して反応する多数の部位、表現されるべき蛋白質のサイズ、ベクター配列に関する開始および停止コドンの位置などの表現特性などが含まれる。他のファクターは当業者に公知であろう。ベクター、表現制御配列、および特定のホスホリパーゼ抑制因子蛋白質配列の挿入箇所は、これらのファクターのバランスによって決められ、すべての選択が与えらえた条件で等しい有効性を持つわけではない。

次に、表現制御配列に操作的に結合される好ましい遺伝子を含んだ組み替えＤＮＡ分子を用いて、広範な多数の適切なホストの形質変換を行って、それらのホスト（形質転換体）が遺伝子やそのフラグメントを表現したり、そのハイブリッドＤＮＡがコード表現するポリペプチド、またはその一部を表現させることができる。

本発明の抗原およびＤＮＡ配列の作成においては、広範なホストを有用に使用することができる。こうしたホストには、例えば、大腸菌、バランス、およびストレプトマイセスなどのバクテリア、イーストなどの菌類、組織培養中のＣＨＯ細胞などの動物および植物細胞などがある。適切なホストの選択は、これまでに知られている多数のファクターによって制御される。これらのファクターには、例えば、選択されたベクターとの両立性、共生酸物の毒性、望ましいポリペプチドの回収の容易さ、表現特性、生物学的安全性およびコストなどが含まれる。これらのファクターだけから、特定の組み替えＤＮＡ分子またはポリペプチドに対するホストの絶対的な選択は行い得ない。その代わりに、特定の遺伝子組み替えＤＮＡ分子を表現するためにすべてのホストが等しく有効ではないという認識に基づいて、これらのファクターのバランスを考えるべきである。

なお、上にも示したように、クローニングまたは表現媒体の選択された部位に挿入されるＤＮＡ配列は望ましいポリペプチドをコード表現する実際の遺伝子の部分ではないヌクレオチドを含んでいてもよいし、その蛋白質に関する遺伝子のフラグメントだけを含むようにしてもよい。ただし、どのようなりＮＡ配列を用いようと、形質変換されたホストは蛋白質ジェロニンまたはジエロニンと基本的には同じ構造活性を有するポリペプチドをつくりだすことが必要である。例えば、本発明のＤＮＡ配列を、同じ解読フレームで、ひとつの表現ベクター内の、少なくともひとつの真正核または原核、または原核担体蛋白質をコード表現するＤＮＡ配列、または、少なくともひとつの真正核信号配列をコード表現するＤＮＡ配列、またはそれらの組み合わせのひとつの部分に融合することができる。こうした構造は、望ましいＤＮＡ配列の表現を促進し、精製効率を向上したり、ホスト細胞からの望ましいポリペプチドの分泌および好ましくは成熟を可能にしてくれる可能性がある。このＤＮＡ配列はＡＴＣ開始コドン単独か、あるいは他のコドンと組み合わされ、望ましいポリペプチドの第一アミノ酸をコード表現する配列に直接に融合されたＡＴＣ開始コドンを交互に含んでいる場合がある。こうした構造は、本発明の一部である、メチオニールまたはペプチジル・ポリペプチドの生産を可能にしてくれる。そして、メチオニンまたはペプチドのこのＮ−末端を種々の公知のプロセスで、あるいは、本発明の組成物および方法においてメチオニンまたはそれに取りつけられた他の融合物と共に用いられるポリペプチドによって、細胞内または細胞外によって切断することができる。

ＪＪＬ外ジェロニン゛　のム　゛よびノ　Ａｓｓｅｍｂｌス１」ロエ５′−ビオチニル化オリゴヌクレオチドのス　レプ　ビジン・ラーツクスハ　への７ＡＤＹＮＡＢＥＡＤＳ　Ｍ２８０ストレプトビジン（Ｄｙｎａｌ　Ｃｏｒｐ、）　０．２ｍｌを１．５ｍｌエッペンドノド管に入れた。このチューブを磁石板（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ、　Ｉｎｃ、）に数分間押しつけて常磁性ラテックス小球をチューブの側面に引きつけさせ、次に、流体を流出した。この小球を室温で０．２ｍｌアニーリング緩衝液で二度洗浄し、次に、０．２ｍｌアニーリング緩衝液に懸濁させた。

この小球懸濁液に対して、１　ｎ＠ｏｌの５′−ビオチニル化オリゴヌクレオチドを加えた。室温で３０分間放置した後、これらの小球を０．２ｍｌのアニーリング緩衝液で洗浄してから、０．２ｍｌアニーリング緩衝液内に懸濁させた。この洗浄された未結合オリゴヌクレオチドを分光分析した結果、３００ｐｍｏ１程度のオリゴヌクレオチドが小球に結合していることが分かった。

ＩＬ五主゛　オリゴヌグレオチ゛を゛１加　るための　アニーリング′サイクル遺伝子形成で用いる前に、オリゴヌクレオチドをポリアクリルアミド・ゲル電気泳動と、さらに、Ｔ４ポリヌクレアーゼ・キナーゼを用いての５′−ホスホリル化によって精製した。

１５０ｐｍｏｌの基質結合オリゴヌクレオチドに対して、７５０ｐｍｏｌの重複相補性オリゴヌクレオチドが追加され、０．１０ｍ１５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，５，ＩＭ　ＮａＣ１（アニーリング緩衝液）内で、５分間、４５℃の温度下でアニーリングを行い、その後で、混合物を室温で７分間以上冷却した。そして小球を室温で、同じ緩衝液０．２ｍｌで２度洗浄した。形成物（ａｓｓｅｍｂｌｙ）内の最後のオリゴヌクレオチドが追加されるまで、このサイクルが繰り返された。

１舅五立のライゲーション゛よゞ化による　からの形成終了後、小球を洗浄して、リガーゼ緩衝液０．０４ｍ１に再懸濁した。０．００５ｍ１　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ、　Ｂｉｏｌａｂｓ。

高特殊活性グレード）、その混合物を室温で２時間培養し、その後、０．０４ｍ１制限消化緩衝液に再懸濁した。制限酵素Ｅｃｏ　ＲＩをｌＯ単位追加した後、その混合物を３７℃の温度下で９０分間培養した。この液体を取り出し、遊離されたＤＮＡをエタノールで沈析し、０．０１ｍ１リガーゼ緩衝液に再懸濁した。

１上五土ジエロニン゛　のノこの遺伝子は図３および図４の両方に示されている方式で形成された。このオリゴヌクレオチドは図５に示されている通りである。この遺伝子の５′−末端（５００塩基対程度のＮ−末端コーディング領域）は基質と結合したＢｔｇｅｌｌで開始され、以下の順番でオリゴヌクレオチドが追加された（それぞれひとつをアニーリング／洗浄サイクルに関与している）ニゲル３９、ゲル１、ゲル３８、ゲル２、ゲル３７、ゲル３、ゲル３６、ゲル４、ゲル３５、ゲル５、ゲル３４、ゲル６、ゲル３３、ゲル７、ゲル３２、ゲル８、ゲル３１．ゲル９、ゲル３０、ゲルｌＯ、ゲル２９、ゲル１１、ゲル２８、ゲル１２、ゲル２７゜この遺伝子の３７−末端（３００程度の塩基によるＣ−末端コーディング領域）は基質結合Ｂｔｇｅ１２で開始され、以下の順番でオリゴヌクレオチドが追加されたニゲル２０、ゲル１９、ゲル２１、ゲル１８、ゲル２２、ゲル１７、ゲル２３、ゲル１６、ゲル２４、ゲル１５、ゲル２５、ゲル１４、ゲル２６、ゲル１３゜図３で、遺伝子の５′−末端（Ｎ−末端コーディング領域）は制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ　ＲＩによる消化によって基質から解放され、遺伝子の３′−末端（Ｃ−末端コーディング領域）は制限酵素Ｈｉｎ　ｄＩｎによる消化によって基質から解放される。

図４で、オリゴヌクレオチド・ゲル２７およびゲル１３内に相補性の２＝塩基対を含んでいる２つの遺伝子フラグメントを共にアニールし、ついで、ライゲーションして完全な遺伝子を作成した。

１直五旦ム　ジェロニン゛　のクローニング完成したＤＮＡ生成物をＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣＬｏｎｉｎｇ　：　Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ、　Ｅ、　Ｆ、　Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９に述べられている標準的な方法で、Ｅｃｏ　ＲＩおよびＨｉｎ　ｄＩ［Ｉによって切断されたＭ１３ｍｐ１９ＲＦＤＮＡとライゲーションされた。

１１目１［ム　ジエロニン゛　のＭ１３ｍｐ１９内の合成遺伝子の配列をジデオキシ配列決定によって確認された。クローンされた合成遺伝子に２つの突然変異体が確認されたが、両方とも５′ −末端（Ｎ−末端コーディング領域）に存在していた。

１五且ヱクローンされたＡ　゛　の　、を　正　るための　＼　ロイン・ビトロ変異発生試薬キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐ、　）を使って措置した後、ジェロニン遺伝子内部の２つの変異を修正するために、オリゴヌクレオチド指向変異誘発が行われた。

１舅且工４　゛　の　ベ　ターへのサブ　ローニング合成ジェロニンがＥｃｏ　Ｒ１およびＨＩＮ　Ｄｍの作用によってＭ１３ｍｐ１９から切断され、この遺伝子含有フラグメントがアガロース・ゲル電気泳動によって精製され、Ｅｃｏ　ＲＩ／Ｈｉｎ　ｄＩＩＩ切断表現ベクターｐＫＫ２２３−３　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にライゲーションされた。

１呈五主でのム　ジェロニンの　のｐＫＫ２２３−３にクローンされた合成ジェロニン遺伝子を含む大腸菌ＪＭ１０５５０ｍ１を培養して、ＩＰＴＧで誘発、溶離して、粗抽出物を得た。この抽出物をＳＤＳポリアクリルアミド・ゲル電気泳動によって分析した（同時に、外部からの挿入物を持たない表現ベクターを含んでいるホスト細胞からコントロール用抽出物を作成した）。蛋白質が表現され、生きた機能を有していることを確認するために、このジェロニンのウェスターン・プロット分析および機能アッセイも行われた。

結論として、本発明および本明細書に開示されている実施例は上に述べた目的および課題を達成するのに良く適合している０本発明の精神および範囲を逸脱せずに、方法や装置において一定の変更を行うことは可能であろう。さらに、以下の特許請求の範囲の範囲に述べられている要素や工程は本資料中に述べられているのと基本的には同じ方法で同じ結果を得るためのすべての要素や工程を意味していることも、当然である。本発明はこの原理が適用されるすべての形態をその対象とするものである。したがって、本発明は上に述べた課題を実行し、目的を達成するため、およびそれらに付随する課題や目的を達成するのに適している。

以下余白Ａツ１旦ジＬド（１）一般的情報（ｉ）　出願者：　Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ、　ＭｉｃｈａｅｌＢｅａｔｔｉｅ、　Ｋｅｎｎｅｔｈ　Ｌ。

（■）　発明の名称：ジェロニン・ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（ｉｉｉ）　配列数＝１（ｉｖ）　連絡住所：（Ａ）　住所：　Ｊａｍｅｓ　Ｆ、　Ｗｅｉｌｅｒ、　Ａｔｔｏｒｎｅｙ−ａｔ −Ｌａｗ（Ｂ）　ストリート：　Ｏｎｅ　Ｒｉｖｅｒｗａｙ、　５ｕｉｔｅ　１５６０（Ｃ）　市：　Ｈｏｕｓｔｏｎ（Ｄ）　州：　Ｔｅｘａｓ（Ｅ）　国：ＵＳＡ（Ｆ）　ＺＩＰ　：　７７０５６（Ｖ）　コンピュータ読み取り形式：（Ａ）　媒体形式：フロッピー・ディスク（Ｂ）　コンピュータ：　ＩＢＭ　ＰＣ互換機（Ｃ）　オペレーティング・システム：　ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）　’／フトウエア：　ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔ　５．１（■）　本願データ：（Ａ）　出願番号：　ＵＳ　０７／７５５，９４９（Ｂ）　出願口：　０６−３ＥＰ−１９９１（Ｃ）　分類：（憾）　弁理士／事務所に関する情報：（Ａ）　氏名：　Ｗｅｉｌｅｒ、　Ｊａｍｅｓ　Ｆ。

（Ｂ）　登録番号：　１６，０４０（Ｃ）　参照／整理番号：　Ｄ−５３８５（ｉｘ）　通信に関する情報：（Ａ）　電話＋　７１３−６２６−８６４６（Ｂ）　ファックス：　７１３−９６３−５８５３（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　：　１に関する情報：（１）配列特性：（Ａ）　長さニア８３塩基対（Ｂ）　タイプ：核酸（Ｃ）　ストランド性：二重（Ｄ）トボロジー：不明（１１）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム性）（ｉｉｉ）　不確定性：あり（■）　オリジナル・ソース：（Ａ）　生物：ジェロニウム・マルチフォーラム（Ｄ）　発展段階：種子（Ｆ）　組織タイプ：ナツツ（ｘｉ）　配列説明：　ＳＥＱ　ＩＤ、Ｎｏ　：　１　：ταのｍ国史■品Ｔ漁ＴＧｒＴ　Ａ工ＡロσＡＣＧＴＡ工ロＡＴα皿Ｇ２４０ＣＧｒＡＡ（ＥＣＡ　ＧＣＴＡＣｒＴＣＴｒ　ＣＡＡＡＧＡＴ（ＩＴ　ＣＣＧＧＡＴＣＣＡＧ　ＣＧＴＡＣＧＡＡＧＧ　ｍ　３００ＴＧＡ　７＆３１へへＧ’ｌ　Ｓ補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の７第１項）平成６年２月２５日　ｉ

Claims

【特許請求の範囲】

１．ジェロニン配列の各アミノ酸に対する３つの、第一のＤＮＡフラグメントを合成する表現ベクター内のＤＮＡフラグメントの表現、操作および安定性を最も好適にするような各アミノ酸のトリプレットのグループから選択した塩基コドン・トリプレットを含むジェロニンをコードする配列を含んでいる第一のＤＮＡフラグメントを設計するステップと、該第一のＤＮＡフラグメントに対する相補性ＤＮＡフラグメントを合成するステップと、そして該第一のＤＮＡフラグメントおよび相補性ＤＮＡフラグメントをアニールすることによってＤＮＡ二本鎖を形成するステップとで形成される、ジェロニンをコード表現する合成遺伝子をつくる方法。
２．該合成ステップが該ＤＮＡフラグメントをオリゴヌクレオチドの一本鎖・フラグメントの重複した、化学的に合成できる組み合わせに分割するステップと、該オリゴヌクレオチドを精製するステップと該オリゴヌクレオチドを５′末端でホスホリル化するステップと、そしてオリゴヌクレオチドの鎖を一緒にアニールするステップとで構成される、請求項１の方法。
３．ブランキング配列が該二本鎖ＤＮＡに取りつけられることを特徴とする、請求項１の方法。
４．さらに、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を該合成遺伝子またはブランキング配列に組み込むステップを含む請求項１の方法。
５．（ａ）線形複式形態で遺伝子をコード表現する二重鎖ＤＮＡを分離するステップと、（ｂ）制限エンドヌクレアーゼで表現ベクターを切断するステップと、（ｃ）該遺伝子を含む二本鎖ＤＮＡを該表現ベクターと結合するステップと、そして（ｄ）ステップ（ｃ）のＤＮＡを表現ホストに形質変換するステップとで構成される、請求項１の合成遺伝子をクローニングする方法。
６．請求項５のプロセスの生成物。
７．（ａ）遺伝子を表現ベクターにクローンするプロセスと（ｂ）受け入れ可能な量だけ遺伝子生成物の合成を誘発する条件下で、表現ベクターにクローンされた遺伝子を含むホスト細胞を成長させるステップと、（ｃ）該細胞から遺伝子生成物を精製するステップとで構成される、請求項１の遺伝子を表現する方法。
８．（ａ）請求項７のプロセスの生成物と、（ｂ）該生成物に接合された抗体とで構成される免疫毒素。
９．さらに、ＳＤＳゲル電気泳動、ウェスターン・ブロット分析、活性分析、または他の適切な手段により、遺伝子生成物を判定するステップで構成される請求項７の方法。
１０．請求項７の方法による生成物。
１１．適切なバクテリア・ホストで表現されるようにトリプレット・コドンを選択することを特徴とする、請求項１のプロセス。
１２．該ホストが大腸菌である、請求項１１のプロセス。
１３．請求項１１のプロセスの生成物。
１４．適切な菌ホストで表現されるようにトリプレット・コドンを選択することを特徴とする、請求項１のプロセス。
１５．請求項１４のプロセスの生成物。
１６．ホストがイーストである、請求項１４のプロセス。
１７．哺乳動物内で表現されるようにコドンが選択されることを特徴とする、請求項１のプロセス。
１８．請求項１７のプロセスの生成物。
１９．昆虫の細胞で表現されるようにコドンが選択されることを特徴とする、請求項１のプロセス。
２０．請求項１９のプロセスの生成物。
２１．植物細胞内で表現されるようにコドンが選択される、請求項１のプロセス。
２２．請求項２１のプロセスの生成物。
２３．遺伝子を形成するために、すべてのオリゴヌクレオチドを共にアニールすることを特徴とする、請求項１のプロセス。
２４．オリゴヌクレオチドがブロックでアニールされ、該ブロックが後で共にアニールされ、ライゲーションされて完全な遺伝子を形成することを特徴とする、請求項１のプロセス。
２５．ａ．合成オリゴヌクレオチドを、固体相基質物質の末端のひとつ、またはその近くに取りつけるステップと、ｂ．過剰な、結合していないオリゴヌクレオチドを洗浄して取り除くステップと、ｃ．その全長、あるいはその一部に基質と結合したオリゴヌクレオチドとの完全な塩基配列相補性を有するモル過剰のオリゴヌクレオチドを付加し、鎖を共にアニールして、その後で、過剰で、結合していないオリゴヌクレオチドを洗浄して取り去るステップと、ｄ．遺伝子全体が形成されるまで、ステップｃを繰り返すステップと、ｅ．完全な二本鎖ＤＮＡを形成するために、ＤＮＡリガーゼで形成された遺伝子を処理するステップと、ｆ．制限酵素または他の適切な手段で、基質から合成遺伝子を遊離するステップとで構成される、固体相形成プロセスによってジェロニン遺伝子が構成されることを特徴とする、請求項１のプロセス。
２６．細胞性蛋白質合成を抑制するが、細胞表面レセプターには結合しない蛋白質時にまたはポリペプチドをコード表現するヌクレオチドの配列を含んでいる合成ＤＮＡ。
２７．該ヌクレオチド配列が、ＳＥＱＩＤＮＯ．１およびそのフラグメント、およびその誘導体であることを特徴とする請求項２６の合成ＤＮＡ。
２８．該ＤＮＡが細胞蛋白質合成を抑制するが、細胞表面レセプターには結合しない、請求項２７の合成ＤＮＡ配列。
２９．請求項２６または２７のＤＮＡを含む表現ベクター。
３０．該ベクターがｐＫＫ２２３−３であることを特徴とする、請求項２９のベクター。
３１．該ベクターがｐＫＣ３０またはその誘導体のひとつである、請求項２９のベクター。
３２．請求項２６または２７の遺伝子組み替えＤＮＡ分子を含み、それを表現することができるホスト細胞。
３３．該ホストがバクテリア、菌類、昆虫細胞、動物および植物ホストで構成されるグループから選択される、請求項３２のホスト。
３４．該ホストが、大腸菌、シュードモナス、バシラス、およびイーストの株で構成されるグループから選択されることを特徴とする、請求項３２のホスト。
３５．該ホストがマウス、プタ、およびヒトの組織細胞で構成されるグループから選択されることを特徴とする、請求項３２のホスト。
３６．大腸菌がＥ．ＣｏｌｉＪＭ１０５であることを特徴とする、請求項３４のホスト。
３７．該ＤＮＡ配列が表現制御配列と操作的に結合される、請求項２７の合成ＤＮＡ。
３８．該表現制御配列が、原核または真正核細胞、またはそれらのウィルスの表現を制御することを特徴とする、請求項３７の合成ＤＮＡ。
３９．該表現制御配列が初期プロモーターＳＶ４０、後期プロモーターＳＶ４０、ｌｏｃシステム、ＴＡＣシステム、ＴＲＣシステム、フェーズ・ラムダの大型オペレーターおよびプロモーター、ｆｄコート蛋白質の制御領域、およびそれらの組み合わせで構成されるグループから選択される、請求項３７の合成ＤＮＡ。
４０．さらに、該遺伝子を、特に選択される標的細胞上に存在する細胞表面レセプターに結合するポリペプチド領域をコード表現するＤＮＡ配列に融合するステップを含む、請求項２７の合成ＤＮＡ。
４１．ａ．該ＤＮＡ配列が、遺伝子の合成、クローニング、表現、機能的、あるいは生化学操作を容易にする特徴を有するように、精製ジェロニン蛋白質から決められる一次アミノ酸に対応する３つの塩基の配列を含む二重鎖ＤＮＡフラグメントを設計するステップと、ｂ．共に、結合されて合成遺伝子を形成することができる一組の合成オリゴヌクレオチドを設計、合成、精製、そして５′−ホスホリル化するステップと、ｃ．オリゴヌクレオチドをアニール、ライゲーションして合成遺伝子を形成するステップ、とで形成される、請求項２６の合成ＤＮＡ配列をつくりだすプロセス。
４２．ａ．該ＤＮＡ配列が、遺伝子の合成、クローニング、表現、機能的、あるいは生化学操作を容易にする特徴を有するように、精製ジェロニン蛋白質から決められる一次アミノ酸に対応する３つの塩基の配列を含む二重鎖ＤＮＡフラグメントを設計するステップと、ｂ．共に、結合されて合成遺伝子を形成することができる一組の合成オリゴヌクレオチドを設計、合成、精製、そして５′−ホスホリル化するステップと、ｃ．オリゴヌクレオチドをアニール、ライゲーションして合成遺伝子を形成するステップ、とで形成される、請求項２７のＳＥＱＩＤＮＯ．１の合成ＤＮＡ配列およびそのフラグメントおよび誘導体をつくりだすプロセス。
４３．（ａ）請求項４２のプロセスの生成物、および（ｂ）該生成物に接合される抗体とにより構成される、免疫毒素。
４４．ａ．該ＤＮＡ配列が、遺伝子の合成、クローニング、表現、機能的、あるいは生化学操作を容易にする特徴を有するように、精製ジェロニン蛋白質から決められる一次アミノ酸に対応する３つの塩基の配列を含む二重鎖ＤＮＡフラグメントを設計するステップと、ｂ．共に、結合されて合成遺伝子を形成することができる一組の合成オリゴヌクレオチドを設計、合成、精製、そして５′−ホスホリル化するステップと、ｃ．オリゴヌクレオチドをアニール、ライゲーションして合成遺伝子を形成するステップ、ｄ．合成遺伝子を適切なクローニング・ベクターとライゲーションするステップ、ｅ．遺伝子の適切性を確認するために、クローンされた遺伝子の核酸配列を決定するプロセスと、ｆ．クローンされた遺伝子内の望ましくない突然変異体を修正するために、細胞指向変異発生を行わせるステップと、ｇ．遺伝子を適切な表現ベクターにサブクローニングするステップと、ｈ．その合成遺伝子を含む表現ベクターを適切な表現ホストに導入するステップと、ｉ．ジェロニン生成物の生産に適した条件下で、ジェロニン表現ベクターを含んだ表現ホストを成長させるステップと、ｊ．その遺伝子を表現する細胞からジェロニンを分離、および精製するステップとで構成される、ジェロニンをコード表現する合成遺伝子を作成、クローニング、および表現するためのプロセス。
４５．（ａ）請求項４４のプロセスの生成物と、（ｂ）該生成物に接合された抗体とで構成される免疫毒性。
４６．さらに（ａ）請求項１の遺伝子を含んでいるベクターＤＮＡを分離するステップと（ｂ）その遺伝子を含むベクターＤＮＡの配列決定を行うステップと、そして（ｃ）望ましいＤＮＡ配列を含んでいるクローンが確認されるまで、複数のクローンで、ステップａおよびｂを練り返すステップとで構成される、請求項１の形成、クローニングされた遺伝子の正確さを確認する方法。
４７．さらに（ａ）該突然変異体を含む遺伝子のＤＮＡを分離するステップと、（ｂ）該突然変異体の全体に広がっており、正しいＤＮＡ配列を含んだ合成修正オリゴヌクレオチド・プライマーによって突然変異体ＤＮＡ鎖をアニーリングするステップと、（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼの作用によって、該突然変異体を含む鋳型鎖にアニールされた修正オリゴヌクレオチド・プライマーを伸長させるステップと、（ｄ）トランスフェクションまたは形質変換によってステップｃのＤＮＡ生成物を適切な細胞に導入するステップと（ｅ）ベクターＤＮＡを分離するプロセスと、（ｆ）修正された遺伝子を表現ベクター内にサブクローンするステップとで構成される、細胞指向変異発生によって請求項１のクロンされた遺伝子内に発生した突然変異体を修正する方法。